ES2798147T3 - Combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea, y utilización en procedimientos de detección y selección - Google Patents

Abstract

Utilización de una combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea, comprendiendo dicha combinación, respectivamente: a) un primer elemento genético de control (A/a) presente en dicha planta dicotiledónea, en forma de un alelo dominante (A) y un alelo recesivo (a), en el cual: - el alelo dominante (A) consiste en un ácido nucleico (NA) que permite la expresión de la proteína ACS (aminociclopropano-carboxilato sintasa) de secuencia SEQ ID Nº 3 - el alelo recesivo (a) se distingue del alelo dominante en que dicho alelo recesivo (a) es no funcional en dicha planta dicotiledónea, y b) un segundo elemento genético de control (G/g) presente en dicha planta dicotiledónea, en forma de un alelo dominante (G) y un alelo recesivo (g), en el cual: - el alelo dominante (G) consiste en un ácido nucleico (NG) que permite la expresión de la proteína CmWIP1 ("C. melo Zinc Finger Protein") de secuencia SEQ ID Nº 12, - el alelo recesivo (g) se distingue del alelo dominante en que dicho alelo recesivo (g) es no funcional en dicha planta dicotiledónea, entendiéndose que al menos el segundo elemento genético de control ha sido artificialmente introducido en dicha planta dicotiledónea.

Description

DESCRIPCIÓN

Combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea, y utilización en procedimientos de detección y selección

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la selección de variedades de plantas y, en particular, a la selección del tipo sexual de las plantas. Se refiere a la detección genotípica del sexo de las plantas mediante análisis del polimorfismo de un gen A y un gen G, así como a medios de utilización de esta detección en procedimientos de obtención de plantas cuyo fenotipo sexual es modificado.

Técnica anterior

La realización de plantas híbridas es de gran interés en agronomía y en agricultura. En efecto, las plantas híbridas, gracias al fenómeno de heterosis denominado también vigor híbrido presentan una superioridad en numerosos caracteres con respecto a la media de sus dos progenitores. Esta superioridad se puede utilizar, por ejemplo, para un mejor vigor, un mejor rendimiento, una mayor adaptación al medio en el que el híbrido es cultivado y una gran uniformidad de los híbridos con respecto a sus progenitores. Este vigor híbrido es tanto más importante cuanto más estén genéticamente alejados los progenitores.

La creación de líneas puras y estables, futuras progenitores del híbrido, es un paso obligado para la creación de variedades híbridas homogéneas y reproducibles que expresen el máximo de heterosis. Por tanto, es necesario crear líneas puras y estables, seguidamente hacer crecer estas líneas para obtener híbridos.

La creación de líneas puras implica la autofecundación de una planta de forma que se obtengan plantas que presenten un mismo patrimonio genético fijado por el conjunto de los caracteres de productividad, regularidad y rendimiento o incluso resistencia a las enfermedades, que se investigan.

Para crear líneas puras es necesario por tanto utilizar plantas cuyo tipo sexual permita la autofecundación, por ejemplo, plantas hermafroditas.

No obstante, muchas de las plantas dicotiledóneas y, en particular, las cucurbitáceas, pueden ser monoicas, andromonoicas, ginoicas o hermafroditas.

Una primera técnica utilizada para la obtención de líneas puras consiste en realizar un tratamiento químico de las plantas, de forma que se obtengan plantas adecuadas para autofecundarse, por ejemplo, plantas hermafroditas. En el caso del melón (cucumis meto) por ejemplo, la pulverización de inhibidores de la síntesis de etileno como nitrato de plata o tiosulfato de plata implica la aparición temporal de estambres en las flores hembras (Rudich et al., 1969; Risser et al., 1979). De esta forma, la transformación de plantas ginoicas en plantas hermafroditas se utiliza para el mantenimiento de líneas puras.

No obstante, la producción de líneas puras mediante este método está limitada por el coste de los agentes químicos, la duración de su acción y sus efectos citotóxicos. Además, estos agentes pueden no ser eficaces en los que se refiere a la realización de híbridos a partir de plantas cuya duración de floración es prolongada, ya que las nuevas flores aparecidas después del tratamiento podrían no estar afectadas por el tratamiento químico.

Por tanto, existe una necesidad de un sistema que permita controlar el desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea y obtener una planta de un tipo floral determinado.

Además, son necesarios crecimientos muy numerosos para obtener híbridos interesantes a partir de líneas puras y, en cada crecimiento, son retenidas las plantas que presentan el fenotipo más prometedor.

Durante el crecimiento de las líneas puras entre ellas, es indispensable poder escoger el sentido del crecimiento efectuado y evitar la autopolinización de las plantas que conduciría a plantas que no presentan el vigor híbrido buscado.

Todavía en este caso, debido a la diversidad del tipo sexual de las plantas dicotiledóneas, es necesario separar las flores machos y las flores hembras de una misma planta para evitar la autopolinización.

En una primera técnica, realizada particularmente para el maíz, consiste en utilizar medios mecánicos para realizar una emasculación de las plantas. No obstante, esta técnica demuestra ser extremadamente costosa ya que necesita la emasculación de cada planta de la que se quiere evitar la autopolinización para cada crecimiento efectuado. Otra técnica consiste en realizar una emasculación química de las plantas, bloqueando la formación de polen viable. Así, en el caso del melón (Cucumis meto), el tratamiento de plantas monoicas por etrel (precursor de etileno) implica la desaparición temporal de las flores machos.

Estos agentes químicos, denominados gematocidas, utilizados para provocar una esterilidad masculina transitoria, presentan varios inconvenientes como un coste elevado o una gran toxicidad, como ya se ha indicado con anterioridad.

Las técnicas mecánicas o químicas de control del tipo floral anteriormente descritas muestran ser muy costosas, en cuanto que son necesarios crecimientos muy numerosos para obtener plantas híbridas que presenten los caracteres buscados y que puedan ser comercializadas.

Para facilitar la creación de líneas puras y de híbridos, por tanto, existe también una necesidad de un sistema que permita controlar el desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea y obtener una planta de un tipo floral determinado.

Otra vía para obtener plantas capaces de autopolinización útiles para la creación de líneas puras, o no capaces de autopolinización, para la creación de híbridos podría consistir, respectivamente, en una selección de individuos exclusivamente hermafroditas, o exclusivamente hembras, presentes en una especie. No obstante, esta técnica se mostraría extremadamente costosa también, ya que necesitaría el cultivo de un número muy considerable de plantas, hasta el momento en que sea posible determinar el tipo sexual. Esta técnica sería además aleatoria, ya que los mecanismos de determinación del sexo de las flores dependen particularmente de factores medioambientales. Según todavía otra vía, se ha buscado identificar y caracterizar los determinantes genéticos que participan en el control del tipo floral en el melón. En el caso del melón, el control genético de determinación del sexo está gobernado por dos determinantes genéticos principales, respectivamente (1) el determinante genético andromonoico (“Andromoeocious” o “a”) y (2) el determinante genético genoico (“gynoecious" o "g”), poseyendo cada determinante al menos dos alelos y cuyas combinaciones producen una gran variedad de fenotipos sexuales. La solicitud internacional PCT publicada con el n° WO 2007/125264 describe la identificación y caracterización del determinante genético (a) que muestra que consiste en un gen que codifica una aminociclopropano-carboxilato sintasa (ACS). Por tanto, la solicitud PCT n° 2007/12564 proporciona medios de detección y control que permiten seleccionar o generar plantas dicotiledóneas que poseen el alelo (a) dominante o el alelo (a) recesivo. El determinante genético (g) continúa siendo totalmente desconocido. Además de ello, los datos preliminares sugerían que el determinante genético (g), de naturaleza y estructura desconocidas, podría estar localizado en una amplia región genómica de más de 2,4 megabases delimitada por marcadores denominados M8 y M30. Debido a que está comúnmente admitido que existe una media de 12 marcos abiertos de lectura (“ORFs”) en 100 kilobases de genoma vegetal, la región genómica delimitada entre los marcadores M8 y M30 podría contener aproximadamente 300 marcos abiertos de lectura.

No obstante, en ausencia de caracterización del segundo determinante genético ginoico (o “g”), no fue posible poner a disposición pública medios de selección o control del desarrollo del tipo floral que permitan, por ejemplo, discriminar o generar una población de plantas estrictamente hembras, ya que este fenotipo es controlado exclusivamente por el determinante genético (g). Igualmente, la selección o la obtención de una población de plantas exclusivamente hermafroditas solo sería posible después de la identificación y caracterización del determinante genético (g).

Por tanto, existe también una necesidad de un procedimiento que permita seleccionar plantas dicotiledóneas, por ejemplo, hermafroditas o hembras, sin que sea necesario por ello cultivarlas.

Este procedimiento debería permitir seleccionar plantas, particularmente útiles para la realización de líneas puras o híbridos, como se ha precisad con anterioridad.

Compendio de la invención

Según la invención, se ha identificado y caracterizado el determinante genético (g) ginoico para el control del desarrollo floral de una planta dicotiledónea que es un angioesperma y, más precisamente, una planta de la familia de las cucurbitáceas.

La identificación y caracterización del determinante genético (g) ginoico permitió por primera vez la puesta a punto de una combinación de los dos determinantes genéticos (a) andromonoico y (g) ginoico que permiten controlar en su totalidad el desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea, cualquiera que sea el fenotipo sexual que se considere.

La invención se refiere por tanto a una combinación de dos elementos genéticos (A/a) y (G/g) que permite controlar el desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea, en particular de una cucurbitácea como el melón.

Ya se ha mostrado en el estado de la técnica que, fisiológicamente, los dos alelos (A) y (a) se distinguen por proporciones de actividad enzimática diferentes de una proteína, la aminociclopropano-carboxilato sintasa, también denominada ACS.

Los inventores han mostrado ahora que fisiológicamente, los dos alelos (G) y (g) que han sido identificados y caracterizados según la invención, se distinguen por proporciones diferentes de una nueva proteína, la proteína CmWIP1.

La invención tiene por tanto por objeto la utilización de una combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea, comprendiendo dicha combinación, respectivamente: a) un primer elemento genético de control (A/a) presente en dicha planta dicotiledónea, en la forma de un alelo dominante (A) y de un alelo recesivo (a), en el cual:

- el alelo dominante (A) consiste en un ácido nucleico (NA) que permite la expresión de la proteína ACS (aminociclopropano-carboxilato sintasa) de secuencia SEQ ID N° 3,

- el alelo recesivo (a), se distingue del alelo dominante en que dicho alelo recesivo (A) es no funcional en dicha planta dicotiledónea, y

b) un segundo elemento genético de control (G/g) presente en dicha planta dicotiledónea, en forma de un alelo dominante (G) y un alelo recesivo (g), en el cual:

- el alelo dominante (G) consiste en un ácido nucleico (NG) que permite la expresión de la proteína CmWIPI de la secuencia SEQ ID N° l2

- el alelo recesivo (g) se distingue del alelo dominante en que dicho alelo recesivo (g) es no funcional en dicha planta dicotiledónea,

debiendo entenderes que al menos el segundo elemento genético de control ha sido artificialmente introducido en dicha planta dicotiledónea.

En ciertos modos de realización según la invención, para el segundo elemento genético de control (G/g), las características respectivas del alelo dominante (G) y el alelo recesivo (g) son las siguientes:

- el alelo dominante (G) consiste en un ácido nucleico (NG) que comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PG) funcional en una planta dicotiledónea y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión está regulada por el polinucleótido regulador (PG), en que dicho ácido nucleico codifica la proteína CmWlPI de secuencia SEQ ID N° 12,

el alelo recesivo (g) se distingue del alelo dominante (G) por un ácido nucleico no funcional y comprende:

(i) un polinucleótido regulador (Pg) cuya secuencia de nucleótidos comprende al menos una mutación, una inserción o una deleción con respecto al ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 13 conduciendo dicho ácido nucleico a una expresión reducida o nula de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12, o

(ii) un ácido nucleico (Ng) que codifica una proteína que difiere de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12 por la sustitución, la inserción o la deleción de uno o varios aminoácidos y que no posee la actividad biológica de dicha proteína CmWIP1 en dicha planta dicotiledónea.

El solicitante describe una proteína ACS que abarca la proteína de secuencia SEQ ID N° 3 o una proteína que tiene al menos un 90% de identidad en aminoácidos, preferentemente, al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad en aminoácidos, con la proteína de secuencia SEQ ID N° 3.

El solicitante describe una proteína CmWIP1 que abarca la proteína de secuencia SEQ ID N° 12 o una proteína que tiene al menos un 90% de identidad en aminoácidos, preferentemente al menos un 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad en aminoácidos con la proteína de secuencia SEQ ID N° 12. La proteína CmWIP1 puede abarcar también la proteína de secuencia SEQ ID N° 16 o una proteína que tiene al menos un 90% de identidad en aminoácidos, preferentemente al menos, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad en aminoácidos con la proteína de secuencia SEQ ID N° 16.

En ciertos modos de realización según la invención, para el segundo elemento genético de control (A/a), las características respectivas del alelo dominante (A) y del alelo recesivo (a) son las siguientes:

- el alelo dominante (A) consiste en un ácido nucleico (NA) que comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PA) funcional en una planta dicotiledónea, y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión es regulada por el polinucleótido regulador (PA), codificando dicho ácido nucleico la proteína ACS (aminociclopropano-carboxilato sintasa) de secuencia SEQ ID N° 3,

- el alelo recesivo (a) se distingue del alelo dominante (A) por un ácido nucleico no funcional y comprende:

(i) un polinucleótido regulador (Pa) cuya secuencia de nucleótidos comprende una inserción, una sustitución o una deleción con respecto al ácido nucleico que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 5907 de la secuencia SEQ ID N° 1 y que conduce a una expresión reducida o nula de la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3, o

(ii) un ácido nucleico (Na) que codifica una proteína que difiere de la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3 por la sustitución, la inserción o la deleción de uno o varios aminoácidos y que no posee la actividad biológica de dicha proteína ACS en dicha planta dicotiledónea.

La solicitud describe también polinucleótidos reguladores (PG) y (Pg) como tales.

La invención se refiere también a procedimientos de obtención de una planta transformada cuyo fenotipo sexual ha sido modificado, así como las partes de esta planta, particularmente sus semillas.

La invención tiene todavía por objeto la proteína CmWIP1 como se define más en detalle con posterioridad, o un fragmento de esta proteína, así como anticuerpos dirigidos contra la proteína CmWIP1.

La invención trata también de procedimientos para detectar la presencia de alelos (A), (a), (G) y (g) en una muestra.

Descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra la clonación posicional del lugar g.

La Figura 1A ilustra los mapas físicos y genéticos del lugar (g) sobre el cromosoma 4. El lugar está bordeado por dos marcadores M261 y M335. Las líneas discontinuas indican la posición de estos marcadores genéticos en los diferentes clones BAC.

La Figura 1B ilustra la representación de 8 marcos abiertos de lectura o ORFs (flecha larga) que se encuentran en el BAC 102, con su predicción de orientación. La referencia triangular representa la inserción del transposón de ADN denominada Gyno-hAT cuya secuencia se describe en la SEQ ID N° 14. La inserción de este transposón es lo que induce la metilación del promotor del gen CmWIP1 y conduce a su inactivación.

La Figura 1C es una cartografía de alta resolución de dos acontecimientos críticos de recombinación en las proximidades del lugar g. Los polimorfismos SNP están indicados y los recombinantes P63.2 y 87.94 determinaron una región final de 1,4 kb.

La Figura 2 ilustra los resultados de la amplificación mediante PCR semicuantitativa sensible a la endonucleasa McrBr sobre el ADN del transposón insertado en el lugar g.

El cebador de sentida está localizado en la secuencia del transposón y el cebador de antisentido está localizado en la secuencia genómica que bordea el transposón. La amplificación mediante PCR sin digestión mediante endonucleasa del ADN genómico Gynadou dio lugar a una fuerte amplificación, que significa la presencia del transposón en ese lugar. La amplificación mediante PCR con predigestión por endonucleasa McrBC no muestra amplificación alguna, lo que indica un nivel muy elevado de metilación del transposón. No se obtuvo ninguna amplificación para PI124112 cualquiera que fuera el soporte, debido a que el transposón no fue insertado en el lugar G.

La Figura 3 ilustra el análisis de metilación en el lugar g.

La Figura 3A ilustra la amplificación PCR semicuantitativa sensible a McrBR sobre tres marcos abiertos de lectura o ORF, los más próximos al lugar para el genotipo monoico (G-) PI1214112 y el genotipo ginoico Gynadou (gg). La ausencia de amplificación con predigestión con McrBC indica la presencia de metilación del ADN. Los oligonucleótidos fueron diseñados con el fin de generar un amplicón que bordea el sitio de inicio de la transcripción predicho para cada OFR, que incluye una parte del promotor y una parte del primer exón.

La Figura 3B ilustra la metilación del ADN y la estructura del gen CmWIP1. Las flechas negras representan el sitio de inicio en la transcripción determinada mediante la técnica “5'RACE”, los compartimentos negros representan dos exones, el símbolo después del segundo exón representa el fin de la secuencia “3'UTR”, determinada mediante la técnica de “3'RACE”.

La inserción del transposón está simbolizada en la zona sobre el extremo 3' del gen. La metilación del ADN en la secuencia completa de CmWIP1 se determinó mediante amplificación PCR cuantitativa sensible a McrBC. Cada valor corresponde a la media de al menos tres plantas, siendo realizada cada reacción PCR por triplicado.

La Figura 3C ilustra el análisis de metilación de las citosinas mediante secuenciado con bisulfito. Se amplificaron dos amplicones correspondientes a la parte altamente metilada del promotor después del tratamiento con bisulfito. El porcentaje de citosinas metiladas está indicado mediante barras verticales.

La figura 4 ilustra el análisis de metilación en el lugar g para diferentes fuentes genéticas de C. melo. W1998, Bulgarie14, Paul y Gynadou son homocigotos para el alelo g. PI161375 Vedrantais y PI124112 son homocigotos para el alelo G.

La Figura 4A ilustra el experimento mediante el cual la inserción del transposón en el lugar g fue seleccionada mediante amplificación por PCR en las diferentes fuentes genéticas. El cebador de sentido estaba localizado en la secuencia del transposón y el cebador de antisentido estaba localizado en la secuencia genómica que bordea el transposón con el fin de verificar la presencia de la inserción (línea superior), en la que los dos cebadores que bordean el sitio de inserción fueron utilizados con el fin de verificar la ausencia del transposón (línea inferior).

En la Figura 4A se representan los resultados de amplificación PCR semicuantitativa sensible a McrBr en el gen CmWIP1 en diferentes fuentes genéticas. La ausencia de amplificación después de una digestión con McrBc indica la presencia de la metilación del ADN.

La Figura 5 ilustra el análisis del perfil de expresión de ARN mensajero de CmWIP1. Los niveles de expresión de CmWIP1 se analizaron mediante PCR cuantitativa. Cada valor corresponde a la media de al menos tres plantas. Los niveles de expresión de CmWIP1 se normalizaron con los niveles de expresión de un gen unitario, el gen de actina. La Figura 6 ilustra los resultados del análisis de los niveles de expresión de CmWIP1 analizados mediante PCR cuantitativa en un conjunto de yemas florales hasta la fase 6. Cada valor corresponde a la media de al menos tres plantas. Los niveles de expresión de CmWIP1 se normalizaron con los niveles de expresión de un gen ubicuo, el gen de la actina.

La Figura 7 ilustra la observación de fenotipos florales identificados mediante la técnica de TILLING. Las flores del tallo principal del mutante S306F como la del mutante P193L se compararon con una flor macho y una flor hembra de tipo salvaje de progenitor monoico. Las flores mutantes S306F como la del mutante P193L muestran claramente un desarrollo del ovario en la cuarta espiral. El mutante L77F es un mutante débil. Ow: ovario; St: estambre.

La Figura 8A presenta una alineación de un fragmento del ARN mensajero del gen ACS procedente de una planta que tiene el fenotipo (A) [línea superior] y de una planta que tiene el fenotipo (a) [línea inferior] e ilustra una mutación puntual de un nucleótido que diferencia (A) y (a).

La Figura 8B representa una alineación de las secuencias de aminoácidos codificados por ácidos nucleicos de la Figura 8A, comprendiendo una planta que tiene un fenotipo (A) [línea superior] y una planta que tiene el fenotipo (a) [segunda línea] e ilustra una mutación puntual de un aminoácido que diferencia (A) y (a).

La Figura 9 representa micrografías de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que portan el alelo de melón A o a. En las figuras 9A y 9B se muestra que las silicuas de las plantas transformadas con el alelo A (Fig. 9A- Cm-A y Fig. 9B) son más cortas que las silicuas de las plantas salvajes (Col-0) y las plantas transformadas con el alelo (a).

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención, se ha identificado y caracterizado el determinante genético (G/g) que controla, en combinación con el determinante genético (A/a) anteriormente descrito en el estado de la técnica, el desarrollo del tipo floral en cucurbitáceas.

La identificación y la caracterización del determinante genético (G/g) proporciona por primera vez a un experto en la técnica la posibilidad de seleccionar o generar plantas dicotiledóneas que tienen un fenotipo sexual deseado, en particular cucurbitáceas como el melón que tiene el fenotipo sexual deseado.

Se debe recordar que el alelo (A) controla el carácter andromonoico de las plantas y el alelo (G) controla el carácter ginoico de las plantas, como se ilustra en la Tabla 1 siguiente.

Tabla 1

La Tabla 1 ilustra la correspondencia entre el genotipo y el fenotipo sexual de las flores de plantas dicotiledóneas. Los inventores han mostrado ahora que, fisiológicamente, los dos alelos (G) y (g), que han sido identificados y caracterizados según la invención se distinguen en las proporciones diferentes de una nueva proteína, la proteína CmWIP1. Realizando comparaciones de secuencias con proteínas conocidas, los inventores han mostrado que la nueva proteína CmWIP1 podía ser clasificada en la familia de las proteínas de dedos de zinc de tipo WIP que se encuentran en una gran variedad de plantas, comprendidas las dicotiledóneas, monocotiledóneas, gimnospermas y los musgos.

Desde un punto de vista genético, los inventores han mostrado que el alelo (g) se distingue del alelo (G) en el nivel reducido de proteína CmWIP1 en la planta, en comparación con una planta que porta un alelo (G) o bien por la producción de una proteína CmWIP1 mutada con respecto a la proteína CmWIP1 producida por una planta que porta un alelo (G).

Los inventores han mostrado también que el alelo (G) es dominante sobre el alelo (g).

Como ya se ha precisado con anterioridad, ya se había mostrado en el estado de la técnica que, fisiológicamente, los dos alelos (A) y (a) se distinguen en las proporciones diferentes de actividad enzimática de una proteína, la aminociclopropano-carboxilato sintasa también denominada ACS, que es una proteína implicada en la síntesis de etileno.

No obstante, diferentes estudios han mostrado que los genes de la biología floral de las cucurbitáceas codifican proteínas implicadas en la vía de biosíntesis o de regulación de etileno (Kamachi et al., 1997; Kahana et al., 2000). Se mostró también con anterioridad que el alelo (a) se distingue fisiológicamente del alelo (A) por el nivel reducido de actividad enzimática de proteína a Cs en la planta, en comparación con una planta que porta un alelo (A).

Se mostró también que el alelo (A) se expresa en los primordios de los carpelos y es esta expresión la que bloquea el desarrollo de los estambres. La ausencia de expresión del alelo A o la expresión de una forma mutada de la proteína procedente de selecciones TILLING, por ejemplo, o de la proteína procedente del alelo que porta la mutación A57V no bloquea el desarrollo de los estambres. Finalmente, se mostró también que el alelo (A) es dominante sobre el alelo (a).

Aunque no se desean vinculaciones teóricas, los inventores estiman que las síntesis de control del desarrollo del tipo floral mediante una combinación de alelos del gen (G/g) y (A/a) puede ser generalizado a la familia de las dicotiledóneas, comprendida la familia de las cucurbitáceas.

Por tanto, el solicitante describe una combinación de dos elementos genéticos y su utilización para el control del desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea, comprendiendo, respectivamente dicha combinación:

a) un primer elemento genético de control (A/a) presente en dicha planta dicotiledónea, en forma de un alelo dominante (A) y un alelo recesivo (a), en el cual:

- el alelo dominante (A) consiste en un ácido nucleico (NA) que permite la expresión de la proteína ACS (aminociclopropano-carboxilato sintasa), preferentemente la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3

- el alelo recesivo (a), se distingue del alelo dominante en un ácido nucleico (NA) no funcional en dicha planta dicotiledónea y

b) un segundo elemento genético de control (G/g) presente en dicha planta dicotiledónea, en forma de un alelo dominante (G) y un alelo recesivo (g), en el cual:

- el alelo dominante (G) consiste en un ácido nucleico (NG) que permite la expresión de la proteína CmWIP1, preferentemente la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12,

- el alelo recesivo (g) se distingue del alelo dominante en un ácido nucleico (NG) no funcional en dicha planta dicotiledónea,

debiendo entenderse que al menos el segundo elemento genético de control ha sido artificialmente introducido en dicha planta dicotiledónea.

El ácido nucleico (NA) no funcional que caracteriza el alelo (a) abarca (i) un ácido nucleico que codifica una proteína distinta de la proteína de SEQ ID N° 3, que comprende la proteína mutada A57V, (ii) o cualquier otra forma de proteína mutada con respecto a la proteína de secuencia SEQ ID N° 3 y que conduce a una enzima inactiva, (ii) o incluso otras ACS no funcionales (iv) o incluso un alelo no expresado.

Se describe particularmente según la invención la utilización de una combinación de dos elementos genéticos según la reivindicación 1, caracterizada porque:

- el alelo dominante (A), que consiste en un ácido nucleico (NA), comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PA) funcional en una planta dicotiledónea, y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión está regulada por el polinucleótido regulador (PA), codificando dicho ácido nucleico la proteína ACS (aminociclopropano-carboxilato sintasa) de secuencia SEQ ID N° 3,

- el alelo recesivo (a) no funcional se distingue del alelo dominante en un ácido nucleico no funcional y comprende: (i) un polinucleótido regulador (Pa) cuya secuencia de nucleótidos comprende una inserción, una sustitución o una deleción con respecto al ácido nucleico que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 5907 de la secuencia SEQ ID N° 1 y que conduce a una expresión reducida o nula de la proteína ACS de la secuencia SEQ ID N° 3,

(ii) un ácido nucleico (Na) que codifica una proteína que difiere de la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3 en la sustitución, la inserción o la deleción de uno o varios aminoácidos y que no posee la actividad biológica de dicha proteína ACS en dicha planta dicotiledónea, y

- el alelo dominante (G), que consiste en un ácido nucleico (NG), comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PG) funcional en una planta dicotiledónea, y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión está regulada por el polinucleótido regulador (PG), codificando dicho ácido nucleico la expresión de la proteína CmWIP1 («C. melo Zinc Finger Protein») de secuencia SEQ ID N° 12,

- el alelo recesivo no funcional (g) se distingue del alelo dominante (G) en un ácido nucleico no funcional y comprende:

(i) un polinucleótido regulador (Pg) cuya secuencia de nucleótidos comprende al menos una mutación, una inserción o una deleción con respecto al ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 13, conduciendo dicho ácido nucleico a una expresión reducida o nula de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12 o

(ii) un ácido nucleico (Ng) que codifica una proteína que difiere de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12 en la sustitución, la inserción o la deleción de uno o varios aminoácidos y que no posee la actividad biológica de dicha proteína CmWIP1 en dicha planta dicotiledónea.

La combinación de los dos elementos genéticos que se describe con anterioridad permite controlar y/o modificar el sexo de las flores de plantas dicotiledóneas y, por tanto, es muy ventajosa con respecto a los sistemas de control mecánicos, a menudo costosos, o químicos, a menudo tóxicos, utilizados en la técnica anterior.

Mediante “alelo” se entiende, en el sentido de la presente invención, una de las formas de un gen que ocupa un sitio o lugar en un par de cromosomas homólogos. Los alelos de un gen se refieren al mismo rasgo genético, pero pueden determinar fenotipos diferentes.

Un alelo dominante es un alelo cuyo nivel de expresión fenotípico es mucho más considerable que el del alelo homologo (denominado recesivo). El dominio puede ser completo o parcial.

Un alelo recesivo es un alelo que solo se expresa en el fenotipo cuando la planta recibe alelos idénticos de cada uno de sus dos progenitores. Por el contrario, la expresión del alelo recesivo es enmascarada si está presente el alelo homólogo dominante.

Por tanto, la combinación anteriormente definida existe en forma de diferentes estados que corresponde cada uno a un fenotipo.

Cuando el primer elemento genético de control (A/a) presente en una planta dicotiledónea está en forma de alelo (A) la planta es de fenotipo monoico o ginoico.

Cuando el primer elemento genético de control (A/a) presente en una planta está en forma de alelo (aa), la planta es de fenotipo hermafrodita o andromonoico.

Cuando el segundo elemento genético de control (G/g) presente en una planta dicotiledónea está en forma de alelo (G), la planta es de fenotipo monoico o andromonoico.

Cuando el segundo elemento genético de control (G/g) presente en una planta está en forma de alelo (gg), la panta es de fenotipo hermafrodita o ginoico.

La correspondencia entre alelos y fenotipos está resumida en la Tabla 1.

En ciertos modos de realización de la combinación según la invención, para el segundo elemento genético de control (G/g), las características respectivas del alelo dominante (G) y el alelo recesivo (g) son las siguientes:

- el alelo dominante (G) consiste en un ácido nucleico (NG) que comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PG) funcional en una planta dicotiledónea, y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión es regulada por el polinucleótido regulador (PG), codificando dicho ácido nucleico la proteína CmWIPI (“C. melo Zinc Finger Protein’’) de secuencia SEQ ID N° 12,

- el alelo recesivo (g) se distingue del alelo dominante (G) en:

(i) un ácido nucleico (NG) no presente en la planta, o

(ii) un polinucleótido regulador (Pg) no funcional en una planta dicotiledónea, o

(iii) un ácido nucleico (Ng) no funcional para la expresión de una proteína CmWIP1 activa.

En ciertos modos de realización de la combinación según la invención, para el primer elemento genético de control (A/a), las características respectivas del alelo dominante (A) y el alelo recesivo (a) son las siguientes:

- el alelo dominante (A) consiste en un ácido nucleico (NA), que comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PA) funcional en una planta dicotiledónea, y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión es regulada por el polinucleótido regulador (PA), codificando dicho ácido nucleico la proteína ACS (aminociclopropano-carboxilato sintasa) de secuencia SEQ ID N° 3,

- el alelo recesivo (a) se distingue del alelo dominante (A) en:

(i) un ácido nucleico (NA) no presente en la planta, o

(ii) un polinucleótido regulador (Pa) no funcional en una planta dicotiledónea, o

(iii) un ácido nucleico (Na) no funcional para la expresión de una proteína ACS activa.

Lo que sigue de la descripción expone variantes o modos de realización preferidos de los primero y segundos elementos genéticos de control que forman parte del sistema de control objeto de la invención.

Elemento genético de control G/g, en forma de alelo dominante (G), en la combinación de dos elementos genéticos según la invención.

De forma general, el elemento genético de control G/g, presente en una planta en forma de Alelo dominante (G), permite obtener un nivel más elevado de proteína CmWIP1, con respecto al nivel observado cuando no está presente el alelo (G) en dicha planta.

En lo que sigue de la descripción, se considera que un “nivel elevado” de proteína CmWIP1 corresponde al nivel medio de proteína CmWIP1 medida en una planta que comprende el alelo dominante G sin su genoma y un “nivel reducido” de proteína CmWIP1 corresponde al nivel medio de proteína CmWIP1 observada en una planta que no comprende el alelo dominante (G) en su genoma.

El alelo dominante (G) consiste en un ácido nucleico (NG) que comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PG) funcional en una planta dicotiledónea, y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión es regulada por el polinucleótido regulador (PG), codificando dicho ácido nucleico la proteína CmWIPI de secuencia SEQ ID N° 12.

- Polinucleótido regulador (PG) funcional

Un polinucleótido regulador o promotor (PG) funcional según la invención consiste en un ácido nucleico que permite la expresión de la proteína CmWIPI de secuencia SEQ ID N° 12 en plantas dicotiledóneas.

Un modo de ejemplo de este promotor comprende o consiste en el ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 13, que está localizado desde el nucleótido en posición 1 hasta el nucleótido en posición 2999 del ácido nucleico del gen CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 10.

Por tanto, en los modos de realización de la combinación de los dos elementos genéticos de la invención en los que el segundo elemento genético consiste en el alelo G, el polinucleótido regulador (PG) puede consistir en un polinucleótido que comprende o que consiste en (i) una secuencia de nucleótidos que va desde el nucleótido 1hasta el nucleótido 2999 de secuencia SEQ ID N° 10 o (ii) una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de nucleótidos con la secuencia 1-2999 de SEQ ID N° 10 y que es funcional o (iii) un fragmento de secuencias (i) y (ii) precedentes y que es funcional.

La invención tiene también por objeto el polinucleótido regulador (PG) como tal, definido con anterioridad, así como fragmentos de este ácido nucleico, como se describirá más en detalle en la parte titulada “ácidos nucleicos según la “invención”.

Un polinucleótido regulador (PG) funcional según la invención puede consistir también en un promotor conocido para digerir la expresión de las secuencias de ácido nucleico que codifica la proteína CmWIP1 de forma constitutiva o de forma de tejido específico.

Un polinucleótido regulador (PG) funcional según la invención puede ser escogido por tanto entre promotores de tejidos específicos como los de los genes de la familia de “MADS box” de clase A B C D y E, como se describe por Theipen et al., 2001 o cualquier otro promotor de genes homeóticos.

Un polinucleótido regulador (PG) funcional según la invención puede ser escogido entre:

- el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor o el promotor 19S o, ventajosamente, el promotor constitutivo doble 35S (pd35S) descritos en el artículo de Kay et al., 1987;

- el promotor de actina de ri3 seguido del intrón actina de ri3 (pAR-IAR) contenido en el plásmido pAct1F4 descrito por Mc Elroy et al., 1991;

- el promotor constitutivo EF-1a del gen que codifica el factor de alargamiento vegetal descrito en la solicitud PCT n° WO 90/02172 o incluso en el artículo de AXELOS et al. (1989);

- el superpromotor quimérico PSP (NI et al., 1995) constituido por la fusión de tres copias de elemento de actividad transcripcional del promotor del gen de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens y del elemento de activación de la transcripción del promotor del gen de la manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens;

- el promotor ubiquitina de girasol (BINET et al., 1991);

- el promotor de ubiquitina 1 del maíz (CHRISTENSEN et al., 1996).

Un polinucleótido regulador (PG) funcional según la invención puede consistir también en un promotor inducible. Por tanto, la invención tiene por objeto una combinación de dos elementos genéticos para el control del tipo floral de una planta dicotiledónea, como se define con anterioridad, en la que el polinucleótido regulador (PG) es sensible a la acción de una señal inductora y, preferentemente, en la que el polinucleótido regulador (PG) es un polinucleótido activador inducible de la transcripción o de la traducción.

Cuando el polinucleótido regulador activador de la transcripción o de la traducción es sensible, directa o indirectamente, a la acción de una señal inductora activadora, se trata de un polinucleótido “activador inducible” en el contexto de la invención.

Según la invención, un polinucleótido regulador de tipo “activador inducible” es una secuencia reguladora que solo es activada en presencia de una señal externa. Esta señal externa puede ser la fijación de un factor de transcripción, pudiendo ser inducida la fijación de un factor de transcripción bajo el efecto de la señal inductora activadora a la que el polinucleótido regulador es sensible de forma directa o indirecta.

Cuando esta construcción de ácidos nucleicos es utilizada en un hospedante celular, la expresión del polinucleótido que codifica la proteína CmWIPI según la invención puede ser inducida poniendo en contacto el hospedante celular transformado con la señal inductora activadora a la que el polinucleótido regulador es sensible de forma directa o indirecta.

Cuando se busca la ausencia de expresión del polinucleótido que codifica un polipéptido CmWIP1 en este hospedante celular transformado, es suficiente entonces eliminar o suprimir la presencia de la señal inductora activadora a la que es sensible el polinucleótido regulador de la transcripción o de la traducción.

El experto en la técnica podrá recurrir a sus conocimientos generales técnicos en el campo de los polinucleótidos reguladores, en particular los activos en plantas, para definir las construcciones que responden a la definición del modo de realización que antecede.

La secuencia reguladora capaz de controlar el ácido nucleico que codifica una proteína CmWIP1 puede ser una secuencia reguladora inducible por un metabolito particular, como:

- una secuencia reguladora inducible por glucocorticoides como se describe por AOYAMA et al. (1997) o la descrita por McNELLYS et al. (1998);

- una secuencia reguladora inducible por etanol, como la descrita por SALTER et al. (1998) o incluso la descrita por CADDICK et al. (1998);

- una secuencia reguladora inducible por tetraciclina como la comercializada por la empresa CLONTECH;

- una secuencia de promotor inducible por un agente patógeno o por un metabolito producido por un agente patógeno;

- una secuencia reguladora de genes de tipo PR, inducible por ácido salicílico o BTH o Aliette (Gorlach et al., 1996, Molina et al., 1998);

- una secuencia reguladora de tipo receptor Ecdysone (Martinez et al., 1999) inducible por tebufenozida (referencia de producto RH5992, comercializado por la empresa ROHM & HAAS), por ejemplo, perteneciente al grupo de las dibenzoilhidrazina.

- Ácidos nucleicos que codifican la proteína CmWIPI

Preferentemente, el ácido nucleico que codifica la proteína CmWIP1 comprende, en el extremo 5' hacia el extremo 3', al menos:

(i) una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 3000 hasta el nucleótido 3617 de la SEQ ID N° 10, y

(ii) una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 5458 hasta el nucleótido 5901 de la SEQ ID N° 10.

En otros modos de realización, el ácido nucleico que codifica la proteína CmWIP1 comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N° 11.

Elemento genético de control G/g en forma de alelo recesivo (g) del sistema según la invención

De forma general, el elemento genético de control (G/g) en forma de alelo recesivo (g), cuando está presente en una planta que no posee el alelo dominante (G) en su genoma, no permite obtener un nivel de proteína CmWIP1 tan elevada como la obtenida cuando está presente el alelo (G).

Por tanto, se puede definir el alelo (g) como cualquier alteración del genotipo correspondiente al alelo (G), que no permite obtener un nivel de CmWIP1 tan elevado como el alelo (G).

El alelo recesivo (g) se distingue del alelo dominante (G) en:

(i) un ácido nucleico (NG) no presente en la planta, o

(ii) un polinucleótido regulador (Pg) no funcional en una planta dicotiledónea, o

(iii) un ácido nucleico (Ng) no funcional para la expresión de una proteína de CmWIP1 no activa.

Como ejemplo, un modo de realización de un elemento de control G/g en forma de alelo recesivo (g) es ilustrado por el ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 15, que es un alelo de la secuencia que codifica CmWIP1 en el que está presente un ácido nucleico transposón denominado “Gyno-hAT”. En el ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 15, el transposón Gyno-hAT está localizado desde el nucleótido en posición 7167 hasta el nucleótido en posición 15412 de la secuencia SeQ ID N° 15.

En el ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 14, el transposón Gyno-hAT está localizado desde el nucleótido en posición 10 hasta el nucleótido en posición 8246 de la secuencia SEQ ID N° 14.

- Polinucleótido regulador (Pg) no funcional

Un polinucleótido regulador (Pg) o promotor no funcional según la invención es un ácido nucleico que:

(i) no permite la expresión de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12 en una célula hospedante, o (ii) permite la expresión de esta proteína a un nivel bajo en comparación con el nivel observado con el polinucleótido regulador (PG), o

(iii) permite la expresión de la proteína CmWIP1 en el transcurso de la vida de la planta, durante un período inferior, en comparación con el observado con el polinucleótido regulador (PG).

En ciertos modos de realización del polinucleótido regulador (Pg) no funcional, dicho polinucleótido (Pg) está metilado. Por ejemplo, el polinucleótido regulador (Pg) puede consistir en un polinucleótido regulador (PG) que se presenta en forma de un ácido nucleico metilado.

Mediante “ácido nucleico metilado” o “polinucleótido regulador metilado” se entiende según la invención el ácido nucleico correspondiente cuya relación (número de bases metiladas)/(número de bases no metiladas) es de al menos 5/1. Por tanto, según la invención, un ácido nucleico metilado abarca un ácido nucleico que posee una relación (número de bases metiladas)/(número de bases no metiladas) de al menos 6/1, 7/1, 8/1, 9/1, 10/1, 11/1, 12/1, 13/1, 14/1, 15/1, 16/1, 17/1, 18/1 y 20/1.

La determinación de la relación (número de bases metiladas) / (número de bases no metiladas) se puede realizar fácilmente por un experto en la técnica mediante cualquier técnica conocida. El experto en la técnica puede utilizar, en particular, el método de secuenciado con bisulfito, como se describe en los ejemplos de la presente descripción. Para comparar el nivel de expresión de varios promotores, una técnica sencilla, conocida por un experto en la técnica, consiste en colocar un gen marcador de selección bajo el control de los promotores que van a ser ensayados. Un gen marcador de selección puede ser, por ejemplo, el gen de resistencia al herbicida BASTA, bien conocido por un experto en la técnica.

Otra técnica puede consistir en medir el nivel de proteína CmWIP1 obtenida cuando la secuencia que codifica esta proteína está bajo el control de diferentes promotores, utilizando anticuerpos dirigidos al encuentro de esta proteína, y los procedimientos descritos en la parte “polipéptidos según la invención”.

Como ya se ha mostrado en los ejemplos, una ilustración de un promotor (Pg) no funcional consiste en un promotor que tiene una secuencia de nucleótidos igual a la secuencia de nucleótidos de un promotor funcional (PG) pero que se presenta in cellulo o in vivo bajo una forma metilada no funcional. En un modo de realización específico ilustrado en los ejemplos, el estado metilado del promotor (Pg) es provocado por la presencia de un elemento equivalente (TE) localizado a una distancia inferior a 1 kilobase del extremo 3' del gen CmWIP1.

Un polinucleótido (Pg) no funcional puede ser también cualquier polinucleótido derivado del polinucleótido (PG) como se define con anterioridad, cuya secuencia de nucleótidos comprende una inserción, una sustitución o una deleción de uno o varios nucleótidos, con respecto a la secuencia de nucleótidos del polinucleótido regulador.

Por tanto, la invención tiene también por objeto un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que porta al menos una alteración escogida entre una mutación, una inserción o una deleción, con respecto al ácido nucleico que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 2999 de la secuencia SEQ ID N° 10, conduciendo dicho ácido nucleico alterado a una expresión reducida de la proteína CmWIP1, cuando controla la expresión de dicha proteína, con respecto a la expresión de la proteína CmWIP1 controlada por el ácido nucleico que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 2999 de la secuencia SEQ ID N° 10.

La invención tiene también por objeto el polinucleótido regulador (Pg) como tal, como se define con anterioridad. La invención tiene también por objeto un ácido nucleico que comprende un polinucleótido regulador (Pg) y un ácido nucleico que codifica la proteína CmWIP1 de SEQ ID N° 12.

La invención tiene también por objeto una combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea como se define de forma general en la presente invención, en la que el polinucleótido regulador (Pg) es sensible a la acción de una señal inductora y, preferentemente, en que el polinucleótido regulador (Pg) es un polinucleótido represor inducible de la transcripción o la traducción.

Mediante polinucleótido regulador “represor” se entiende, según la invención, una secuencia reguladora cuya actividad constitutiva puede ser bloqueada mediante una señal externa. Esta señal externa puede ser la ausencia de fijación de un factor de transcripción reconocido por el polinucleótido regulador represor. La ausencia de fijación del factor de transcripción puede ser inducida bajo el efecto de la señal inductora represora a la que es sensible el polinucleótido regulador represor.

Según este primer modo de realización particular, la expresión de la secuencia que codifica de una proteína CmWIP1 es constitutiva en el hospedante celular escogido, en ausencia de la señal inductora represora a la que el polinucleótido regulador represor es directa o indirectamente sensible.

El contacto del hospedante celular con la señal inductora represora tiene como efecto, gracias a una acción directa o indirecta sobre el polinucleótido regulador represor, inhibir y/o bloquear la expresión del polinucleótido que codifica la proteína CmWIP1.

Para realizar las construcciones de ADN según la invención que comprenden un polinucleótido regulador represor, el experto en la técnica podrá recurrir a sus conocimientos generales técnicos en el campo de la expresión de genes en plantas.

Un procedimiento de obtención de una planta transformada, utilizando este tipo de polinucleótido regulador, se describe en la parte titulada “procedimientos de obtención de una planta transformada según la invención”.

- Ácido nucleico (Ng) no funcional para la expresión de una proteína CmWIPI activa

Un ácido nucleico (Ng) abarca los ácidos nucleicos que comprenden al menos una parte de una secuencia que codifica una proteína CmWIP1 activa pero que no permite, cuando son colocados bajo el control de un polinucleótido regulador funcional en células de plantas dicotiledóneas, la producción de dichas plantas de una proteína CmWIP1 activa.

Un ácido nucleico (Ng) abarca esencialmente los ácidos nucleicos (NG) en los que están presentes una o varias mutaciones en al menos un intrón o exón, siendo escogida cada mutación entre (i) la sustitución de un nucleótido o más de un nucleótido, (ii) la deleción de un nucleótido o de al menos dos nucleótidos consecutivos y (iii) la deleción de un nucleótido o de al menos dos nucleótidos consecutivos, con respecto al ácido nucleico (NG) de referencia. Un ácido nucleico (Ng) abarca en particular los ácidos nucleicos que codifican una proteína CmWIP1 no activa.

Por ácido nucleico que codifica una proteína CmWIP1 no activa se entiende, en el sentido de la presente invención, un ácido nucleico que codifica una proteína que difiere de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12 en la sustitución, la deleción o la inserción de uno o varios aminoácidos, y que no posee la actividad biológica de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12.

Está igualmente abarcado un ácido nucleico que codifica una proteína que difiere de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 16 en la sustitución, la deleción o la inserción de uno o varios aminoácidos y que no posee la actividad biológica de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 16.

En particular, esta proteína CmWIP1 no activa, cuando es expresada en una planta que no expresa proteína CmWIP1 activa, en particular proteína CmWIP1 de secuencia s Eq ID N° 12, o de proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 16, induce, respectivamente:

- un fenotipo de planta hermafrodita en combinación con la presencia en forma de homocigoto de alelos (a/a) en dicha planta,

- un fenotipo de planta hembra en combinación con (i) la presencia en forma de homocigoto de alelos (A/A) en dicha planta o en combinación con (ii) la presencia en forma de heterocigoto de alelos (A/a) en dicha planta.

Se ha mostrado en los ejemplos que plantas que poseen el alelo (g) del elemento genético (G/g) eran obtenidos con ácidos nucleicos que codifican una proteína CmWIP1 inactiva. En particular se ha mostrado en los ejemplos que plantas que poseen el alelo (g) del elemento genético (G/g) eran obtenidas con ácidos nucleicos que codifican una proteína CmWIP1 que posee una sustitución de un solo nucleótido con relación a la secuencia de nucleótidos SEQ ID N° 11 que codifica la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12.

Con carácter ilustrativo, se han mostrado en los ejemplos plantas que poseen el alelo (g) y cuyo ácido nucleico correspondiente codifica una proteína CmWIP1 mutada que posee una sustitución de un ácido escogido entre L77F, P193L y S306F, según la numeración de aminoácidos utilizadas para la SEQ ID N° 12.

El elemento genético de control A/a, en forma de alelo dominante (A) o en forma de alelo dominante (a) ha sido ya descrito en la solicitud de patente francesa n° FR 2900415 y en la solicitud PCT n° WO 2007/125264.

No obstante, debido a que el elemento genético de control (A/a) es un elemento importante de la combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral según la invención, sus características principales se describen nuevamente a continuación.

Elemento genético de control A/a, en forma de alelo dominante (A) de la combinación según la invención

De forma general, el elemento genético de control A/a, presente en una planta en la forma de alelo dominante (A), permite obtener un nivel más elevado de proteína ACS activa, con respecto al nivel observado cuando el alelo (A) no está presente en dicha planta.

En lo que sigue de la descripción, se considera que un “nivel elevado” de proteína ACS corresponde al nivel medio de ACS medido en una planta que comprende el alelo dominante (A) en su genoma y que un “nivel bajo” de proteína ACS corresponde al nivel medio de proteína ACS activa observada en una planta que no comprende el alelo dominante (A) en su genoma. Un nivel bajo de proteína ACS abarca un nivel nulo de proteína ACS activa, por ejemplo, en el caso de una expresión de a Cs no activa, comprendido el producto del alelo a que porta la mutación A57V.

El alelo dominante (A) consiste en un ácido nucleico (NA) que comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PA) funcional en una planta dicotiledónea; y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión es regulada por el polinucleótido regulador (PA) codificando dicho ácido nucleico la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3.

- Polinucleótido regulador (PA) funcional

Un polinucleótido regulador o promotor (PA) funcional según la invención consiste en un ácido nucleico que permite la expresión de la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3 en plantas dicotiledóneas.

Como ejemplo, este promotor comprende una secuencia de nucleótidos que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 5906 de la secuencia S^eQ ID N° 1.

Por tanto, en los modos de realización de la combinación de dos elementos genéticos de la invención en los que el primer elemento genético consiste en el alelo A, el polinucleótido regulador (PA) puede consistir en polinucleótido que comprende o consiste en (i) una secuencia de nucleótidos que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 5906 de la secuencia SEQ ID N° 1 o (ii) una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de nucleótidos con la secuencia 1-5906 de SEQ ID N° 1 y que está funcionalizada o (iii) un fragmento de las secuencias (i) y (ii) anteriores que es funcional.

Por tanto, en ciertos modos de realización de la combinación de dos elementos genéticos de la invención, el polinucleótido regulador (PA) comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 5906 de la secuencia SEQ ID N° 1.

Un polinucleótido regulador (PA) funcional que está incluido en una combinación de dos elementos genéticos según la invención puede consistir también en un promotor conocido para dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína ACS de forma constitutiva o de forma de tejido específico.

Un polinucleótido regulador (PA) funcional incluido en una combinación de dos elementos genéticos según la invención puede ser escogido por tanto entre uno cualquiera de los promotores constitutivos o específicos de tejidos descritos anteriormente para ciertos modos de realización del polinucleótido regulador (PG).

Un polinucleótido regulador (PA) funcional según la invención puede consistir también en un promotor inducible. Por tanto, la invención tiene por objeto una combinación de dos elementos genéticos como se definen con anterioridad, en la que el polinucleótido regulador (PA) es sensible a la acción de una señal inductora y, preferentemente, en el que el polinucleótido regulador (PA) es un polinucleótido activador inducible de la transcripción o de la traducción, que puede ser escogido entre uno cualquiera de los polinucleótidos activadores inducibles descritos en ciertos modos de realización del polinucleótido regulador (PG).

Cuando esta construcción de ácidos nucleicos se utiliza en un hospedante celular, la expresión del polinucleótido que codifica la proteína ACS según la invención puede ser inducida poniendo en contacto el hospedante celular transformado con la señal inductora activadora a la que el polinucleótido regulador activador es directa o indirectamente sensible.

Cuando se busca la ausencia de expresión del polinucleótido que codifica un polipéptido ACS en este hospedante celular transformado, es suficiente entonces con eliminar o suprimir la presencia de la señal inductora activadora a la que es sensible el polinucleótido regular de la transcripción o de la traducción.

El experto en la técnica podrá recurrir así a sus conocimientos técnicos generales en el campo de los polinucleótidos reguladores, en particular lo activos en vegetales, para definir las construcciones que se ajustan a la definición del modo de realización anterior y, en particular, las descritas para el polinucleótido regulador (PG).

- Ácidos nucleicos que codifican la proteína ACS

Preferentemente, el ácido nucleico que codifica la proteína ACS comprende, desde el extremo 5' hacia el extremo 3', al menos:

(i) una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 9507 hasta el nucleótido 6086 de la secuencia SEQ ID N° 1,

(ii) Una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 6181 hasta el nucleótido 6467 de la secuencia SEQ ID N° 1, y

(iii) una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 7046 hasta el nucleótido 7915 de la secuencia SEQ ID N° 1.

Elemento genético de control A/a, en forma de alelo recesivo (a) de la combinación según la invención

De forma general, el elemento genético de control (A/a) en forma de alelo recesivo (a), cuando está presente en una planta que no posee el alelo dominante (A) en su genoma, permite obtener un nivel de proteína ACS tan elevado como el obtenido cuando está presente el alelo (A).

Por tanto, se puede definir el alelo (a) como cualquier alteración del genotipo correspondiente al alelo (A), que no permite obtener un nivel de ACS activo.

El alelo recesivo (a) se distingue del alelo dominante (A) en:

(i) un ácido nucleico (NA) no presente en la planta, o

(ii) un polinucleótido regulador (Pa) no funcional en una planta dicotiledónea, o

(iii) un ácido nucleico que codifica una proteína ACS no activa, o

(iv) un polinucleótido regulador (Pa) no funcional en una planta dicotiledónea y un ácido nucleico que codifica una proteína ACS no activo.

- Polinucleótido regulador (Pa) no funcional

Un polinucleótido regulador (Pa), o promotor no funcional según la invención, es un ácido nucleico que:

(i) no permite la expresión de la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3 en una célula hospedante,

(ii) permite la expresión de esta proteína a un nivel bajo en comparación con el nivel observado con el polinucleótido regulador (PA), o

(iii) permite la expresión de la proteína ACS en el transcurso de la vida de la planta, durante un período inferior, en comparación con la observada con el polinucleótido regulador (PA).

En ciertos modos de realización del polinucleótido regulador (Pa) no funcional), dicho polinucleótido (Pa) está metilado. Por ejemplo, el polinucleótido regulador (Pa) puede consistir en un polinucleótido regulador (PA) que está presente en forma de un ácido nucleico metilado.

Mediante “ácido nucleico metilado” o “polinucleótido regulador metilado” se entiende según la invención, el ácido nucleico correspondiente cuya relación (número de bases metiladas)/ (número de bases no metiladas) es de al menos 5/1- Por tanto, según la invención, un ácido nucleico metilado abarca un ácido nucleico que posee una relación (número de bases metiladas)/(número de bases n metiladas) de al menos 6/1, 7/1, 8/1, 9/1, 10/1, 11/1, 12/1, 13/1, 14/1, 15/1, 16/1, 17/1, 18/1 y 20/1.

La determinación de la relación (número de bases metiladas)/(número de bases no metiladas) se puede realizar fácilmente por un experto en la técnica mediante cualquier técnica conocida. El experto en la técnica puede utilizar particularmente el método de secuenciado con bisulfito, como se describe en los ejemplos de la presente invención. Para comparar el nivel de expresión de varios promotores, una técnica sencilla, conocida por un experto en la técnica, consiste en colocar un gen marcador de selección bajo el control de los promotores que van a ser ensayados. Un gen marcador de selección puede ser, por ejemplo, el gen de resistencia al herbicida BASTA, bien conocido por un experto en la técnica.

Otra técnica puede consistir en medir el nivel de proteína ACS obtenido cuando la secuencia que codifica esta proteína está bajo el control de diferentes promotores, utilizando anticuerpos dirigidos al encuentro de esta proteína, y los procedimientos descritos en la parte “polipéptidos según la invención”.

Como ejemplo, un polinucleótido regulador (Pa) no funcional comprende una secuencia de nucleótidos que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 3650 de la secuencia SEQ ID N° 2.

También como ejemplo, un polinucleótido regulador (Pa) no funcional comprende ciertas secuencias de nucleótidos que comprenden una o varias sustituciones, deleciones o adiciones de bases, con respecto a la secuencia de nucleótidos que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 3650 de la secuencia SEQ ID N° 1.

Por tanto, en la combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral objeto de la invención, un polinucleótido regulador (Pa) no funcional puede comprender una secuencia de nucleótidos que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 3650 de la secuencia SEQ ID N° 2 alterado por uno de los métodos del experto en la técnica.

La invención tiene también por objeto una combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral como se define en la presente invención, y en la que el alelo (a) es un ácido nucleico que comprende la secuencia SEQ ID N° 2. Este ácido nucleico de secuencia s Eq ID N° 2 comprende un polinucleótido regulador (Pa) y un ácido nucleico que codifica la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3.

Un polinucleótido (Pa) no funcional puede ser también cualquier polinucleótido derivado del polinucleótido (PA) como se define con anterioridad, cuya secuencia de nucleótidos comprende una inserción, una sustitución o una deleción de uno o varios nucleótidos, con respecto a la secuencia de nucleótidos del polinucleótido regulador.

Por tanto, en ciertos modos de realización de la combinación según la invención, un polinucleótido (Pa) consiste en un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que porta al menos una alteración escogida entre una mutación, una inserción o una deleción, con respecto al ácido nucleico que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 5907 de la secuencia SEQ ID N° 1, conduciendo dicho ácido nucleico alterado a una expresión reducida de la proteína ACS, cuando controla la expresión de dicha proteína, con respecto a la expresión de la proteína ACS controlada por el ácido nucleico que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 5907 de la secuencia SEQ ID N° 1. La invención tiene también por objeto una combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral como se define con anterioridad, en la que el polinucleótido regulador (Pa) es sensible a la acción de una señal inductora y, preferentemente, en el que el polinucleótido regulador (Pa) es un polinucleótido represor inducible de la transcripción o de la traducción.

Según este primer modo de realización particular, la expresión de la secuencia que codifica una proteína ACS es constitutiva en el hospedante celular escogido, en ausencia de la señal inductora represora a la que es directa o indirectamente sensible el polinucleótido regulador represor.

El contacto del hospedante celular con la señal inductora represora tiene como efecto, gracias a una acción directa o indirecta sobre el polinucleótido regulador represor, inhibir y/o bloquear la expresión del polinucleótido que codifica la proteína ACS.

Para realizar las construcciones de ADN según la invención que comprenden un polinucleótido regulador represor, el experto en la técnica podrá recurrir a sus conocimientos generales técnicos en el campo de la expresión de genes en vegetales.

Un procedimiento de obtención de una planta transformada, utilizando este tipo de polinucleótido regulador, se describe en la parte titulada “procedimientos de obtención de una planta transformada según la invención”.

- Ácido nucleico (Na) no funcional para la expresión de una proteína ACS activa

Un ácido nucleico (Na) abarca los ácidos nucleicos que comprenden al menos una parte de una secuencia que codifica una proteína ACS activa pero que no permite, cuando se colocan bajo el control de un polinucleótido regulador funcional en las células de plantas dicotiledóneas, la producción en dichas plantas de una proteína CmWIP1 activa.

Un ácido nucleico (Na) abarca esencialmente los ácidos nucleicos (NA) en los que están presentes una o varias mutaciones en al menos un intrón o un exón, siendo escogida cada mutación entre (i) la sustitución de un nucleótido o más de un nucleótido (ii) la deleción de un nucleótido o de al menos dos nucleótidos consecutivos y (ii) la deleción de un nucleótido o de al menos dos nucleótidos consecutivos, con respecto al ácido nucleico (NA) de referencia. Un ácido nucleico (Na) abarca particularmente los ácidos nucleicos que codifican una proteína ACS no activa.

Mediante ácido nucleico que codifica una proteína ACS no activa se entiende, en el contexto de la presente invención, un ácido nucleico que codifica una proteína que difiere de la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3 mediante la sustitución, la deleción o la inserción de uno o varios aminoácidos y que no posee la actividad biológica de la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3. Un ejemplo ilustrativo de este ácido nucleico se presenta en la figura 8.

En particular, esta proteína ACS no activa no permite transformar la S-adenosil-metionina en ACC (1-aminociclopropano-1-carboxilato).

Ácidos nucleicos según la invención

Como se indicó con anterioridad, se caracterizaron dos variantes alélicas (G) y (g) del segundo elemento genético de control (G/g) incluidos en una combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo floral de la invención.

Los inventores han identificado el ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 10 como un ácido nucleico correspondiente a la variante alélica dominante (G) y su forma metilada in planta, como correspondiente a la variante alélica recesiva (g) del segundo elemento genético de control en forma de un gen (G/g).

En la combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo floral de la invención, al menos el segundo de los dos elementos genéticos de control fue construido artificialmente en una planta.

Como se expuso con anterioridad, esta introducción provoca un cambio de sexo de la flor de la planta, que es uno de los objetivos buscado según la invención.

En consecuencia, el ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 10 forma parte de los objetivos de la invención.

La presente invención por tanto tiene por objeto un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que posee al menos un 95% de identidad de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos SEQ ID N° 10, o con un fragmento de la secuencia SEQ ID N° 10, con la condición de que este ácido nucleico posea las características funcionales del alelo (G) como se define con anterioridad.

También forma parte de la invención un ácido nucleico de secuencia complementaria al ácido nucleico como se define con anterioridad.

Otro objeto de la invención es un ácido nucleico que consiste en un polinucleótido que posee al menos un 95% de identidad de nucleótidos con la secuencia SEQ ID N° 10, o con un fragmento de la secuencia SEQ ID N° 10, o un ácido nucleico de secuencia complementaria, con la condición de que este ácido nucleico posea las características funcionales del alelo (G) como se define con anterioridad.

La invención se refiere también a un ácido nucleico que comprende al menos 12, preferentemente al menos 15 y de forma muy preferida al menos 20 nucleótidos consecutivos del ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 10, debiendo entenderse que este ácido nucleico abarca en su definición los “fragmentos” de un ácido nucleico según la invención como se define en la presente descripción.

La invención se refiere también al ácido nucleico que comprende o que consiste en la secuencia SEQ ID N° 10. La invención se refiere también a un ácido nucleico que comprende al menos 12, preferentemente al menos 15 y de forma muy preferida al menos 20 nucleótidos consecutivos del ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 10, debiendo entenderse que este ácido nucleico abarca en su definición los “fragmentos” de un ácido nucleico según la invención como se define en la presente descripción.

El alelo (G) definido por la secuencia SEQ ID N° 10 comprende, en el extremo 5' hacia el extremo 3', respectivamente:

a) una secuencia no codificadora que porta elementos reguladores de la transcripción y/o de la traducción de este gen, localizada en sentido ascendente del primer exón, del nucleótido en posición 1 hasta el nucleótido en posición 2999 de la secuencia SEQ ID N° 10;

b) una región denominada “codificante” que comprende los dos exones y el intrón del gen (G/g), estando localizada esta región codificadora que va desde el nucleótido en posición 3000 hasta el nucleótido en posición 5901 de la secuencia SEQ ID N° 10; y

c) una región no codificadora localizada por debajo de la región codificadora, que va desde el nucleótido en posición 5902 hasta el nucleótido en posición 7621 de la secuencia SEQ ID N° 10.

Las características estructurales de los dos exones y del intrón del gen G/g se detallan en la tabla 2 siguiente. Las características estructurales de los dos exones y del intrón de los alelos (G) y (g) del gen (G/g) son muy parecidas, de forma que los exones de los alelos (G) y (g) pueden, en ciertos modos de realización, codificar una misma proteína de la secuencia SEQ ID N° 12. Como se ha indicado con anterioridad, la diferencia principal entre las secuencias de nucleótidos correspondientes a los alelos (G) y (g) se puede encontrar:

(i) ya sea en las secuencias reguladoras en dirección ascendentes correspondientes a estos dos alelos, que están no metilados in planta para el alelo (G) y que están metiladas in planta para el alelo (g),

(ii) ya sea en la secuencia de los exones, ya que una sola sustitución de nucleótido que provoque la sustitución de un aminoácido en la secuencia de la proteína CmWIP1 es suficiente para la obtención del alelo (g)

Tabla 2

La invención se refiere también a un ácido nucleico que comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos de un polinuclótido exónico del gen G/g, como los polinucleótidos 1 y 2 descritos en la tabla 2 siguiente, que están incluidos en el ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 10.

Este ácido nucleico codifica al menos una parte de la proteína CmWIP1 y puede ser insertado en un vector recombinante destinado a la expresión del producto de traducción correspondiente en una célula hospedante o en una planta transformada con este vector recombinante, con el fin de obtener una planta de genotipo (G).

Este ácido nucleico puede ser utilizado también para la síntesis de sondas y de cebadores de nucleótidos destinados a la detección o a la amplificación de secuencias de nucleótidos comprendidos en el gen (G/g) en una muestra.

En su caso, las secuencias anteriormente descritas pueden portar una o varias mutaciones, preferentemente una o varias mutaciones de naturaleza que induzca a la síntesis de una proteína CmWIP1 no activa y que modifique el tipo sexual de una planta que porta este gen (G/g) mutado. Estas secuencias responden a la definición de ácidos nucleicos que codifican una proteína CmWIP1 no activa, definidos de forma general con anterioridad.

Tabla 3

La invención se refiere también a un ácido nucleico que comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido intrónico del gen (G/g), descrito en la Tabla 3 anterior, que están incluidos en el ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 10.

Este ácido nucleico puede ser utilizado como sonda o cebador oligonucleótido para detectar la presencia de al menos una copia del gen (G/g) en una muestra o incluso para amplificar una secuencia diana determinada en el gen (A/a).

Este ácido nucleico puede ser utilizado también para amplificar una secuencia diana determinada en el gen (G/g) o para inhibirla mediante una aproximación de sentido o co-supresión, o mediante la utilización de ARN de cadena doble (Wassenegger et al. 1996; Kooter et al. 1999) para interferencia. Este ácido nucleico puede ser utilizado también para buscar variantes alélicas funcionales del gen (G/g), que podrían ser utilizadas en un método de selección de plantas que poseen un tipo sexual determinado.

Otros ácidos nucleicos según la invención, que codifican la proteína CmWIP1

La invención tiene también por objeto un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que posee al menos un 95% de identidad de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos partiendo del nucleótido en posición 3000 y terminando en el nucleótido en posición 5901 de la secuencia SEQ ID N° 10, así como un ácido nucleico de secuencia complementaria.

La invención se refiere también a un ácido nucleico que posee al menos un 95% de identidad en nucleótidos con la secuencia de nucleótidos partiendo del nucleótido en posición 3000 y terminando en el nucleótido en posición 5901 de la secuencia SEQ ID N° 10, así como un ácido nucleico de secuencia complementaria.

La invención tiene todavía por objeto un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos partiendo del nucleótido en posición 3000 y terminando en el nucleótido en posición 5901 de la secuencia SEQ iD N° 10 o un ácido nucleico de secuencia complementaria.

La invención trata también de un ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos partiendo del nucleótido en posición 3000 y terminando en el nucleótido en posición 5901 de la secuencia SEQ ID N° 10 o un ácido nucleico de secuencia complementaria.

Otro objeto de la invención consiste en un ácido nucleico que comprende, al menos:

(i) una secuencia que tiene al menos un 95 de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 3000 hasta el nucleótido 3617 de la secuencia SEQ ID N° 10,

(ii) una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 5458 hasta el nucleótido 5901 de la secuencia SEQ ID N° 10.

La invención tiene todavía por objeto un ácido nucleico que comprende, desde el extremo 5' hacia el extremo 3': (i) una secuencia que va desde el nucleótido 3000 hasta el nucleótido 3617 de la SEQ ID N° 10, y

(ii) una secuencia que va desde el nucleótido 5458 hasta el nucleótido 5901 de la SEQ ID N° 10.

Un ácido nucleico que codifica la proteína CmWIP1 puede comprender además secuencias líder y terminadoras, habituales para un experto en la técnica.

Productos de transcripción y de traducción del gen (G/g) y polipéptidos según la invención

La expresión del ácido nucleico genómico que codifica la proteína CmWIP1 conduce a la síntesis de un ARN mensajero cuyo ADNc es el ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 11, que es también uno de los objetos de la presente invención.

Por tanto, la invención tiene por objeto el polipéptido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID N° 12, también denominado “proteína CmWIP1” en la presente invención, así como un polipéptido que posee al menos un 95% de identidad de aminoácidos con la secuencia SEQ ID N° 12, un fragmento o variante de la mismo.

Una ilustración según la invención de una proteína CmWIP1 que posee al menos un 95% de identidad de aminoácidos con la secuencia SEQ ID N° 12 consiste en la proteína de secuencia SEQ ID N° 16, que difiere de la proteína de secuencia SEQ ID N° 12 por la deleción de un residuo de cerina.

Un fragmento de una proteína CmWIP1 según la invención comprende al menos 10, 50, 100, 200, 300, 320, 330, 340, 345 o 353 aminoácidos consecutivos de un polipéptido de secuencia SEQ ID N° 12.

La invención se refiere también a un polipéptido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos un 95% de identidad de aminoácidos con la secuencia de una proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12. Ventajosamente, forma también parte de la invención un polipéptido que tiene al menos un 96% 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% de identidad de aminoácidos con la secuencia de un polipéptido de secuencia SEQ ID N° 12, o un fragmento polipéptido de este último.

De forma general, los polipéptidos según la presente invención se presentan en forma aislada o purificada.

Un polipéptido según la invención puede ser obtenido mediante recombinación genética según técnicas bien conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, las técnicas descritas por AUSUBEL et al. (1989).

Un polipéptido según la invención se puede preparar también mediante técnicas clásicas de síntesis química, indiferentemente en solución homogénea o en fase sólida.

Con carácter ilustrativo, un polipéptido según la invención se podrá preparar mediante la técnica en solución homogénea descrita por HOUBEN WEIL (1974) o incluso mediante la técnica de síntesis en fase sólida descrita por MERRIFIELD (1965a; 1965b).

Preferentemente, los polipéptidos variantes de un polipéptido según la invención conservan su capacidad de ser reconocidos por anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos de secuencias SEQ ID N° 12.

Un polipéptido codificado por el gen (G/g) según la invención, como un polipéptido de secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 12, o incluso una variante o un fragmento péptido de este último es útil en particular para la preparación de anticuerpos destinados a la detección de la presencia y/o la expresión de un polipéptido de secuencias SEQ ID N° 12 o de un fragmento péptido de este último en una muestra.

Además de la detección de la presencia de un polipéptido codificado por el gen (G/g) o incluso de un fragmento péptido de este polipéptido en una muestra, los anticuerpos dirigidos contra estos polipéptidos son utilizados para cuantificar la síntesis de un polipéptido de secuencias SEQ ID N° 12, por ejemplo, en células de una planta y determinar así el sexo de la planta, sin que sea por tanto necesario cultivarla.

Mediante “anticuerpo” en el contexto de la presente invención, se entenderá en particular anticuerpos policlonales o monoclonales o fragmentos (por ejemplo, los fragmentos F(ab)'² , F(ab)) o incluso cualquier polipéptido que comprenda un dominio del anticuerpo inicial que reconoce el polipéptido o el fragmento de polipéptido diana según la invención.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados a partir de hibridomas según la técnica descrita por KOHLER y MILSTEIN (1975).

La presente invención se refiere también a anticuerpos dirigidos contra un polipéptido como se describe con anterioridad o un fragmento o variante de este último, como el producto en la técnica del trioma o incluso la técnica de hibridoma descrita por KOZBOR et al. (1983).

La invención trata también de fragmentos de anticuerpos de cadena única Fv (ScFv) como se describe en la patente US n° 4.946.778 o incluso por MARTINEAU et al. (1998).

Los anticuerpos según la invención comprenden también fragmentos de anticuerpos obtenidos por medio de bancos de fagos como se describe por RIDDER et al. (1995) o incluso anticuerpos humanizados como se describe por REINMANN et al. (1997) y ^lE^g ER et al. (1997). Las preparaciones de anticuerpos según la invención son útiles en ensayos de detección inmunológicos destinados a la identificación de la presencia y/o de la cantidad de un polipéptido de secuencias SEQ ID N° 3, o de un fragmento péptido del mismo, presente en una muestra.

Un anticuerpo según la invención podrá comprender isotopías un marcador detectable isotópico o no isotópico, por ejemplo, fluorescente, o incluso estar acoplado a una molécula como biotina, según técnicas bien conocidas por un experto en la técnica.

Por tanto, la invención tiene también por objeto un procedimiento para detectar la presencia de un polipéptido de acuerdo con la invención en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

a) poner en contacto la muestra que va a ser ensayada con un anticuerpo como se describe con anterioridad; b) detectar el complejo antígeno/anticuerpo formado.

La invención se refiere también a un estuche o equipo de ensayo de diagnóstico para la detección de la presencia de un polipéptido según la invención en una muestra, comprendiendo dicho estuche:

a) un anticuerpo como se define con anterioridad;

b) en su caso, uno varios reactivos necesarios para la detección del complejo antígeno/anticuerpo formado.

Otro objeto de la invención consiste en la utilización de un ácido nucleico o una variante alélica de un ácido nucleico como se define con anterioridad en programas de selección de plantas para la obtención de plantas cuyo tipo floral ha sido modificado.

Ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido regulador (PG) funcional

Un polinucleótido regulador o promotor (PG) funcional según la invención consiste en un ácido nucleico que permite la expresión de la proteína CmWIPI de secuencia SEQ ID N° 12 en plantas dicotiledóneas.

Este polinucleótido regulador (PG) funcional permite así, cuando es introducido artificialmente en una planta modificar el sexo de las flores de esta planta y, en particular, permite obtener plantas machos y hembras o machos y hermafroditas, capaces de una autopolinización.

Por tanto, la invención tiene también por objeto un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que posee al menos un 95% de identidad de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos partiendo del nucleótido en posición 1 y terminando en el nucleótido en posición 2999 de la secuencia SEQ ID N° 10, así como un ácido nucleico de secuencia complementaria.

La invención se refiere también a un ácido nucleico que posee al menos un 95% de identidad de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos partiendo del nucleótido en posición 1 y terminando en el nucleótido en posición 2999 de la secuencia SEQ ID N° 10, así como un ácido nucleico de secuencia complementaria.

La invención tiene todavía por objeto un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos partiendo del nucleótido en posición 1 y terminando en el nucleótido en posición 2999 de la secuencia SEQ ID N° 10 o un ácido nucleico de secuencia complementaria.

La invención trata también de un ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos partiendo del nucleótido en posición 1 y terminando en el nucleótido en posición 2999 de la secuencia SEQ ID N° 10 o de un ácido nucleico de secuencia complementaria.

El polinucleótido regulador que tiene el nucleótido en posición 1 hasta el nucleótido en posición 2999 de la secuencia SEQ ID N° 10 es también citado como el ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 13 en la presente descripción. La invención trata también de un ácido nucleico que comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido regulador, como se define con anterioridad.

Este ácido nucleico puede ser utilizado como sonda o cebador oligonucleótido para detectar la presencia de al menos una copia del alelo (G) o el gen (G/g) en una muestra, para amplificar una secuencia diana determinada en el gen (G/g). Este ácido nucleico puede ser utilizado también para buscar variantes alélicas funcionales del gen (G/g) o podrán ser utilizados en un método de selección de plantas que poseen un tipo sexual determinado.

Los procedimientos de detección que utilizan ácidos nucleicos como se describen con anterioridad están descritos en la parte titulada “procedimientos de selección según la invención”.

Este ácido nucleico puede ser utilizado para inhibir una secuencia diana determinada en el gen (G/g) mediante una aproximación antisentido o de co-supresión o mediante la utilización de ARN de cadena doble (Wassenegger et al.

1996; Kooter et al. 1999) para interferencia.

Ácidos nucleicos que comprenden un polipéptido regulador Pg no funcional

Un polipéptido regulador (Pa) o promotor no funcional según la invención es un ácido nucleico que:

(i) no permite la expresión de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12 en una célula hospedante, o (ii) permite la expresión de esta proteína a un nivel muy bajo en comparación con el nivel observado con el polinucleótido regulador (PG), o

(iii) permite la expresión de la proteína CmWIP1 en el transcurso de la vida de la planta, durante un período inferior, en comparación con el observado con el polinucleótido regulador (Pg).

Este polinucleótido regulador (Pg) no funcional permite, por tanto, cuando es introducido artificialmente en una planta, por ejemplo, en sustitución de un polinucleótido (G), modificar el sexo de las flores de esta planta y, en particular, permite obtener plantas hermafroditas, capaces de autopolinización o bien de plantas hembras.

Este ácido nucleico puede ser utilizado como sonda o cebador oligonucleótido para detectar la presencia de al menos un par de alelo (a) del gen (G/g) en una muestra o incluso para amplificar una secuencia diana determinada en el gen (G/g).

La invención se refiere finalmente a ácidos nucleicos que comprenden la asociación de uno o varios ácidos nucleicos como se definen con anterioridad, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína CmWIP1 funcional bajo el control de un promotor de tipo (PG) o (Pg).

Definiciones generales

Según la invención, puede ser utilizada cualquier técnica habitual de biología molecular, de microbiología y de ADN recombinante conocida por un experto en la técnica. Estas técnicas se describen, por ejemplo, por SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et HIGGINS (1984), BERBAL (1984) y AUSUBEL et al. (1994). De forma preferida, cualquier ácido nucleico y cualquier polipéptido según la invención se presenta en forma aislada o purificada.

El término “aislado” en el contexto de la presente invención indica un material biológico que ha sido sustraído de su entorno original (el entorno en el que está localizado de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido presente en estado natural en una planta no está aislado. El mismo polinucleótido separado de los ácidos nucleicos adyacentes en cuyo seno está insertado de forma natural en el genoma de la planta si está aislado. Este polinucleótido puede ser incluido en un vector y/o esté nucleótido puede ser incluido en una composición y no obstante permanecer en estado aislado debido a que el vector o la composición no constituye su entorno natural.

El término “purificado” no precisa que el material esté presente en una forma de pureza absoluta, que excluya la presencia de otros compuestos. Se trata mayormente de una definición relativa.

Un polinucleótido o un polipéptido está en estado purificado después de una purificación del material de partida o del material natural de al menos un orden de magnitud, preferentemente de dos o tres, y preferentemente, cuatro o cinco ordenes de magnitud.

Para los fines de la presente descripción, la expresión “secuencia de nucleótidos” puede ser empleada para indicar de forma indiferente un nucleótido o un ácido nucleico. La expresión “secuencia de nucleótidos” abarca el material genético en sí mismo y, por tanto, no está restringido a la información relativa a su secuencia.

Los términos “ácido nucleico”, “polinucleótido”, “oligonucleótido” o incluso “secuencia de nucleótidos” abarcan las secuencias de ARN, de ADN, de ADNc o incluso secuencias híbridas de ARN/ADN de más de un nucleótido, indiferentemente en forma de cadena única o en forma de dúplex.

El término “nucleótido” indica al mismo tiempo nucleótidos naturales (A, T, G, C), así como nucleótidos modificados que comprenden al menos una modificación como (i) un análogo de una purina, (ii) un análogo de una pirimidina o (iii) un análogo de azúcar, siendo descritos estos nucleótidos modificados, por ejemplo, en la solicitud PCT n° WO95/04064.

Para los fines de la presente invención, un primer nucleótido se considera que es “complementario” de un segundo polinucleótido cuando cada base del primer nucleótido está emparejada a la base complementaria del segundo polinucleótido cuya orientación está invertida. Las bases complementarias son A y T (o A y U) y C y G.

Según la invención, un primer ácido nucleico que tiene al menos un 95% de identidad con un segundo ácido nucleico de referencia, poseerá al menos un 95%, preferentemente al menos 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% de identidad de nucleótidos con este segundo polinucleótido de referencia, siendo determinado el porcentaje de identidad entre dos secuencias como se describe con anterioridad.

El “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de ácidos nucleicos, en el contexto de la presente invención, se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima, a través de una ventana de comparación. La parte de la secuencia de nucleótidos en la ventana de comparación puede comprender por tanto adiciones o deleciones (por ejemplo, “huecos”) con respecto a la secuencia de referencia (que no comprende estas adiciones o estas deleciones) de forma que se obtenga una alineación óptima entre las dos secuencias.

El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones en las que se observa una base nucleica idéntica para las dos secuencias comparadas, dividiendo seguidamente el número de posiciones a las que hay identidad entre las dos bases nucleicas por el número total de posiciones en la ventana de comparación, multiplicando seguidamente el resultado por 100 con el fin de obtener el porcentaje de identidad de nucleótidos de las dos secuencias entre ellas.

La alineación óptima de las secuencias para la comparación se puede realizar de manera informática por medio de algoritmos conocidos.

De forma especialmente preferida, el porcentaje de identidad de secuencias se determina por medio de la aplicación CLUSTAL W (versión 1.82) siendo fijados los parámetros como sigue: (1) CPU ^m O^d E = ClustalW mp; (2) ALIGNMENT = «full»; (3) OUTPUT FORMAT = «aln w/numbers»; (4) OUTPUT ORDER = «aligned»; (5) COLOR ALIGNMENT = «no»; (6) KTUP (word size) = «default»; (7) WINDOW LENGTH = «default»; (8) SCORE TYPE = «percent»; (9) TOPDIAG = «default»; (10) PAIRGAP = «default»; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = «none»; (12) MATRIX = «default»; (13) GAP OPEN = «default»; (14) END GAPS = «default»; (15) GAP EXTENSION = «default»; (16) GAP DISTANCES = «default»; (17) TREE TYPE = «cladogram» et (18) TREE GRAP DISTANCES = «hide».

Un ácido nucleico que posee al menos un 95% de identidad de nucleótidos con un ácido nucleico según la invención abarca las “variantes” de un ácido nucleico según la invención.

Por “variante” de un ácido nucleico según la invención se entiende un ácido nucleico que difiere del ácido nucleico de referencia en una o varias sustituciones, adiciones o deleciones de un nucleótido, con respecto al ácido nucleico de referencia. Una variante de un ácido nucleico según la invención puede ser de origen natural, como una variante alélica que existe de forma natural. Esta variante de ácido nucleico puede ser también un ácido nucleico no natural obtenido, por ejemplo, mediante técnicas de mutagénesis.

En general, las diferencias entre el ácido nucleico de referencia y la “variante” del ácido nucleico son reducidas, de forma que el ácido nucleico de referencia y la variante de ácido nucleico tienen secuencias de nucleótidos muy similares y, en numerosas regiones, idénticas. Las modificaciones de nucleótidos presentes en una variante de ácido nucleico pueden ser silenciosas, lo que significa que no afectan a la secuencia de aminoácidos que puede estar codificada por esta variante de ácido nucleico.

Las modificaciones de nucleótidos en la variante de ácido nucleico pueden resultar también de sustituciones, adiciones o deleciones de uno o varios aminoácidos en la secuencia de polipéptidos que puede ser codificada por esta variante de ácido nucleico.

De forma especialmente preferida, una variante de ácido nucleico según la invención comprende una fase de lectura abierta, código para un polipéptido que conserva la misma función o la misma actividad biológica que el polipéptido código por el ácido nucleico de referencia.

De forma especialmente preferida, una variante de ácido nucleico según la invención que comprende una fase de lectura abierta, código para un polipéptido que conserva la capacidad de ser reconocido por anticuerpos dirigidos contra el polipéptido codificado por el ácido nucleico de referencia.

Forman parte de las “variantes” de un ácido nucleico que codifica la proteína ACS los ácidos nucleicos de los genes ortólogos a la proteína CmWIP1 incluidos en el genoma de plantas y que poseen una identidad de nucleótidos de al menos 95% con un ácido nucleico que codifica la proteína CmWIP1. Mediante “Fragmento” de un ácido nucleico según la invención se entiende una secuencia de nucleótidos de longitud reducida con respecto al ácido nucleico de referencia, poseyendo el fragmento de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos idéntica a la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de referencia sobre la parte común.

Estos fragmentos de un ácido nucleico según la invención poseen al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 o 3000 nucleótidos consecutivos del ácido nucleico de referencia, debiendo entenderse que la longitud máxima de nucleótidos de un fragmento de un ácido nucleico según la invención está limitada por la longitud máxima de nucleótidos del ácido nucleico de referencia.

Sondas y cebadores

Los ácidos nucleicos según la invención y, en particular, las secuencias de nucleótidos SEQ ID N° 10 y SEQ ID N° 11, sus fragmentos de al menos 12 nucleótidos, los polinucleótidos reguladores (PG) y (Pg), así como los ácidos nucleicos de secuencia complementaria, son útiles para la detección de la presencia de al menos una copia de una secuencia de nucleótidos del gen (G/g) o incluso de un fragmento o de una variante alélica de este último en una muestra.

En particular, las sondas y cebadores anteriores derivados de la secuencia SEQ ID N° 10 y, en particular, derivados del polinucleótido regulador (PG) pueden ser utilizadas para detectar la presencia del alelo (G) en una planta dicotiledónea.

Forman parte de la invención también las sondas y cebadores nucleótidos hibridantes, en condiciones de hibridación de elevada astringencia, con un ácido nucleico escogido entre las secuencias SEQ ID N° 10 y SEQ ID N° 11 o con un polinucleótido regulador (PG) o (Pg).

Por tanto, la invención tiene también por objeto un ácido nucleico utilizado como sonda o cebador, que se hibrida específicamente con un ácido nucleico como se define con anterioridad.

Las condiciones de hibridación posteriores se utilizan para la hibridación de un ácido nucleico, sonda o cebador, de 20 bases de longitud.

El nivel y la especifidad de hibridación dependen de diferentes parámetros, como:

a) la pureza de la preparación del ácido nucleico sobre el que se debe hibridar la sonda o el cebador; b) la composición de bases de la sonda o del cebador, los pares de bases G-C que poseen una mayor estabilidad térmica que los pares de bases A-T o A-U;

c) la longitud de la secuencia de bases homologas entre la sonda o el cebador y el ácido nucleico;

d) la fuerza iónica: el grado de hibridación aumenta con el crecimiento de la fuerza iónica y la duración del tiempo de incubación;

e) la temperatura de incubación;

f) la concentración de ácido nucleico sobre la cual se debe hibridar la sonda o el cebador;

g) la presencia de agentes desnaturalizantes como agentes que favorecen la rotura de los enlaces de hidrógeno como formamida o urea que aumentan la astringencia de la hibridación;

h) el tiempo de incubación, aumentando el grado de hibridación con la duración de la incubación;

i) la presencia de agentes de exclusión de volumen, como dextrano sulfato de dextrano, que aumentan el grado de hibridación debido a que aumentan las concentraciones efectivas de la sonda o del cebador y del ácido nucleico que se debe hibridar, en el contexto en la preparación.

Los parámetros que definen las condiciones de astringencia dependen de la temperatura a la que se separan un 50% de enlaces pareados (Tm).

Para secuencias que comprenden más de 360 bases, la Tm se define mediante la relación:

Tm = 81,5 0,41 (% G+C) 16,6 Log (concentración en cationes) - 0,63 (% formamida) - (600/número de bases)

(SAMBROOK et al., (1989), páginas 9.54-9.62).

Para secuencias de longitud inferior a 30 bases, la Tm se define mediante la relación: Tm= 4 (G+C) 2 (A+T). En las condiciones de astringencia apropiadas, en las cuales las secuencias específicas no se hibridan, la temperatura de hibridación es de aproximadamente 5 a 30° C, preferentemente de 5 a 10°C por debajo de la Tm. Mediante “condiciones de hibridación de elevada astringencia” según la invención se entienden las condiciones de hibridación tales las que se colocan a una temperatura de hibridación de 5°C por debajo de la Tm.

Las condiciones de hibridación anteriormente descritas pueden ser adaptadas en función de la longitud y de la composición de bases del ácido nucleico cuya hibridación se busca o del tipo de marcado escogido, según las técnicas conocidas por un experto en la técnica.

Las condiciones convenientes de hibridación pueden ser adaptadas, por ejemplo, según las instrucciones contenidas en la publicación de HAMES y HIGGINS (1985) o incluso en la publicación de AUSUBEL et al. (1989).

Con carácter ilustrativo, las condiciones de hibridación utilizadas para el ácido nucleico de 200 bases de longitud son las siguientes:

Prehibridación:

Mismas condiciones que para la hibridación

Duración: 1 noche.

Hibridación:

5 x SSPE (NaCl 0.9 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 7,7, EDTA 5 mM)

5 x Denhardt's (0,2% PVP, 0,2% Ficoll, 0,2% SAB)

10 pg/ml de ADN de esperma de salmón

0,1% de SDS

Duración: 1 noche.

Lavados:

2 x SSC, 0,1 % de SDS, 10 min, 65° C

I x SSC, 0,1% de SDS, 10 min, 65°C

0,5 x SSC, 0,1% de SDS, 10 min, 65° C

0,1 x SSC, 0,1% de SDS, 10 min, 65° C.

Las sondas o los cebadores de nucleótidos según la invención comprenden al menos 12 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico según la invención, en particular un ácido nucleico de secuencias SEQ ID N° 10 o SEQ ID N° I I o de su secuencia complementaria, de un ácido nucleico que tiene un 95% de identidad de nucleótidos con una secuencia escogida entre las secuencias SEQ ID N° 10 o SEQ ID N° 11 o de su secuencia complementaria o incluso de un ácido nucleico hibridante en condiciones de hibridación de elevada astringencia con una secuencia escogida entre las secuencias SEQ ID N° 10 o SEQ ID N° 11 o de su secuencia complementaria.

Preferentemente, las sondas o cebadores de nucleótidos según la invención tendrán una longitud de al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 o 3000 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico según la invención.

Alternativamente, una sonda o un cebador de nucleótidos según la invención consistirá y/o comprenderá fragmentos con una longitud de 12, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 o 3000 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico según la invención.

Un cebador o una sonda de nucleótidos según la invención se puede preparar mediante cualquier método adaptado bien conocido por un experto en la técnica, comprendida la clonación y acción de enzimas de restricción o incluso mediante síntesis química directa según técnicas como el método de fosfodiéster de NARANG et al. (1979) o de BROWN et al. (1979), el método de dietilfosforamiditas de BEAUCAGE et al. (1980) o incluso la técnica sobre soporte sólido descrita en la patente Europea n° EP 0.707.592. Cada uno de los ácidos nucleicos según la invención, comprendidas las sondas y cebadores de oligonucleótidos anteriormente descritos, pueden ser marcados si se desea, incorporando una molécula detectable, es decir un marcador detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o incluso químicos.

Por ejemplo, estos marcadores pueden consistir en isotopos radioactivos (32P, 3H, 35S) de moléculas fluorescentes (5-bromo desoxiuridina, fluoresceína, acetilaminofluoreno o incluso ligandos como biotina).

El marcado de las sondas se hace preferentemente mediante la incorporación de moléculas marcadas en polinucleótidos mediante extensión de cebadores o bien mediante adición a los extremos 5' o 3'.

Ejemplos de marcados no radioactivos de los fragmentos de ácidos nucleicos se describen en particular en la patente francesa n° FR 7810975 o incluso en los artículos de URDEA et al. (1988) o SANCHEZ PESCADOR et al. (1988).

De forma ventajosa, las sondas según la invención pueden tener características estructurales de naturaleza que permitan una amplificación de la señal, como las sondas descritas por URDEA et al; (1991) o incluso en la patente europea n° EP 0225807 (Chiron).

Las sondas de oligonucleótidos según la invención pueden ser utilizadas en particular en hibridaciones de tipo Southern en cualquier ácido nucleico que codifique la proteína SEQ ID N° y, en particular, ácidos nucleicos de secuencias SEQ ID N° 10 o SEQ ID N° 11 o incluso en hibridaciones de ARN cuando se busca la expresión del transcrito correspondiente en una muestra.

Las sondas según la invención pueden ser utilizadas también para la detección de productos de amplificación PCR o incluso para la detección de malapareamientos.

Las sondas o cebadores de nucleótidos según la invención pueden ser inmovilizados sobre un soporte sólido. Estos soportes sólidos son bien conocidos por un experto en la técnica y comprenden superficies de pocillos de placas de microtitulación, bolitas de poliestireno, bolitas magnéticas, bandas de nitrocelulosa o incluso micropartículas como partículas de látex.

En consecuencia, la invención tiene todavía por objeto un ácido nucleico utilizable como una sonda o cenador de nucleótidos, caracterizado porque comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico como se define con anterioridad, en particular, un ácido nucleico consecuencias de nucleótidos SEQ ID N° 10 y SEQ ID N° 11.

La invención se refiere también a un ácido nucleico utilizable como sonda o cebador de nucleótidos, caracterizado porque consiste en un polinucleótidos de al menos 12 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico según la invención, de manera especialmente 'referida un ácido nucleico de secuencias escogidas entre las secuencias de nucleótidos SEQ ID N° 10 y SEQ ID N° 11.

Como se describe con anterioridad, este ácido nucleico puede estar caracterizado además porque está marcado con una molécula detectable.

Un ácido nucleico utilizable como sonda o cebador de nucleótidos para detección o la amplificación de una secuencia genómica, de ARNm o de ADNc del gen (G/g) puede estar caracterizado además porque se escoge entre las secuencias siguientes:

a) secuencias de nucleótidos hibridantes, en condiciones de hibridación de elevada astringencia, con un ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 10 o SEQ ID N° 11;

b) secuencias que comprenden al menos 12 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 10 o SEQ ID N° 11.

Vectores, células y plantas según la invención

En la combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea objeto de la invención, para permitir que al menos uno de los elementos genéticos de control sea artificialmente introducido en la planta dicotiledónea, los ácidos nucleicos y los polinucleótidos reguladores anteriormente definidos deben ser introducidos en vectores y seguidamente en las células.

Por tanto, la invención tiene también por objeto vectores, células y plantas transformadas, que comprenden polinucleótidos reguladores (PG) y (Pg), ácidos nucleicos que codifican proteínas CmWIP1 activas o no activas, así como ácidos nucleicos correspondientes a alelos (G) y (g) como se definen con anterioridad y los cebadores de definidos por los mismos.

Vectores

Un ácido nucleico como se define con anterioridad, denominado en lo sucesivo ácido nucleico de interés, puede ser insertado en un vector apropiado.

Por “vector” en el contexto de la presente invención, se entiende una molécula de ADN o de ARN circular o lineal que está indiferentemente en forma de cadena única o de cadena doble.

Un vector recombinante según la invención es preferentemente un vector de expresión o, más específicamente, un vector de inserción, un vector de transformación o un vector de integración.

Se puede tratar en particular de un vector de origen bacteriano o viral.

En todos los casos, el ácido nucleico de interés está colocado bajo el control de una o varias secuencias que contienen señales de regulación de su expresión en la planta considerada, ya sea señales de regulación, es decir que las señales de regulación están todas contenidas en el ácido nucleico de interés, como es el caso en las construcciones de ácidos nucleicos descritos en la sección anterior, es decir, que uno o varios entre ellas, o incluso todas las señales de regulación están contenidas en el vector receptor en el que ha sido insertado el ácido nucleico de interés.

Un vector recombinante según la invención comprende ventajosamente secuencias de inicio y de detención de transcripción apropiadas.

Además, los vectores recombinantes según la invención pueden incluir uno o varios orígenes de replicación funcionales en las células hospedantes en las que se busca su expresión, así como, en su caso, secuencias de nucleótidos marcadores de selección.

Los vectores recombinantes según la invención pueden incluir también una o varias señales de regulación de la expresión como se definen con anterioridad en la descripción.

Los vectores bacterianos preferidos según la invención son, por ejemplo, vectores pBR322 (ATCC n°37 017) o incluso vectores como pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Estados Unidos).

Se pueden citar todavía otros vectores comercializados como los vectores pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI y pSG (Stratagene).

Se puede tratar también de vectores de tipo Baculovirus como el vector pVL1392/1393 (Pharmingen) utilizado para transfectar células de la línea Sf9 (ATCC n° CRL 1711) derivada de Spodoptera frugiperda.

De forma preferida, y para la aplicación principal de vectores de la invención consistente en obtener una expresión estable, y preferentemente inducible, de una secuencia que codifica una proteína CmWIP1 en una planta, se recurrirá a vectores especialmente adaptados para la expresión de secuencias de interés en células de plantas, como los vectores siguientes:

- vector pBIN19 (BEVAN et al.), comercializado por la empresa CLONTECH (Palo Alto, Californie, USA);

- vector pBI 101 (JEFFERSON, 1987), comercializado por la empresa CLONTECH;

- vector pBI121 (JEFFERSON, 1987), comercializado por la empresa CLONTECH;

- vector pEGFP; Yang et al. (1996), comercializado por la empresa CLONTECH;

- vector pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994)

- vectores intermedios y superbinadiro derivados de los vectores pSB12 y pSB1 descritos por Japan Tobacco (documento EP 672752 de Ishida et al., 1996).

Células

Los métodos más extendidos para introducir ácidos nucleicos en células bacterianas pueden ser utilizados en el contexto de esta invención. Puede ser la función de células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen ADN, electroporación, bombardeo por proyectiles, infección mediante vectores virales, etc. Las células bacterianas a menudos son utilizadas para amplificar el número de plásmidos que contienen el constructo que comprende la secuencia de nucleótidos, objeto de la invención. Las bacterias se ponen en cultivo y los plásmidos seguidamente se aíslan según métodos bien conocido por un experto en la técnica (se hace referencia a los manuales de protocolos ya citados), que incluyen estuches de ensayo de purificación de plásmidos comercializados, por ejemplo, por las entidades EasyPrepl de Pharmacia Biotech o QIAexpress Expression System de Qiagen. Los plásmidos así aislados y purificados son seguidamente manipulados para producir otros plásmidos que serán utilizados para transfectar las células vegetales.

Para permitir la expresión de un ácido nucleico de interés según la invención colocado bajo el control de una secuencia reguladora apropiada, los ácidos nucleicos o los vectores recombinantes definidos en la presente invención deber ser introducidos en una célula hospedante. La introducción de los polinucleótidos según la invención en una célula hospedante se puede realizar in vitro según técnicas bien conocidas por un experto en la técnica. La invención tiene por objeto además una célula hospedante transformada por un ácido nucleico según la invención o por un vector recombinante como se definió con anterioridad.

Esta célula hospedante transformada es preferentemente de origen bacteriano, fúngico o vegetal.

Por tanto, pueden ser utilizadas células bacterianas de diferentes cepas de Escherichia coli o incluso de Agrobacterium tumefaciens.

Ventajosamente, la célula hospedante transformada es una célula de planta o incluso un protoplasto de planta. Entre las células que pueden ser transformadas según el procedimiento de la invención, se pueden citar como ejemplos células de planta dicotiledóneas, preferentemente pertenecientes a la familia de las cucurbitáceas, cuyos miembros se detallan con posterioridad en la parte titulada “plantas según la invención”.

Preferentemente, se trata de una célula o de un protoplasto de una planta perteneciente a la especie cucumis melo. La invención tiene también por objeto la utilización de un ácido nucleico de interés, para fabricar una planta transformada cuyo fenotipo sexual es modificado.

La invención se refiere también a la utilización de un vector recombinante como se define en la presente descripción para fabricar una planta transformada cuyo fenotipo sexual es modificado.

La invención se refiere también a la utilización de un hospedante celular transformado por un ácido nucleico de interés, para fabricar una planta transformada cuyo fenotipo sexual es modificado.

La invención se refiere también a una planta transformada que comprende una pluralidad de células hospedantes como se definen con anterioridad.

Plantas transformadas según la invención.

La invención se refiere también a un organismo multicelular vegetal transformado, caracterizado porque comprende una célula hospedante transformada o una pluralidad de células hospedantes transformadas mediante al menos uno de los ácidos nucleicos como se definen con anterioridad o incluso mediante un vector recombinante que comprende este ácido nucleico.

La planta transformada puede contener una pluralidad de copias de un ácido nucleico que codifica la proteína CmWIP1, en situaciones en las que se busca una sobreexpresión de la proteína CmWIP1. Una sobreexpresión de la proteína CmWIP1 se busca particularmente cuando se desea obtener plantas que producen flores machos y hembras o bien plantas que producen flores machos y hermafroditas.

Una planta que sobreexpresa la proteína CmWIP1 produce flores machos y hembras en los modos de realización de la combinación de dos elementos genéticos de la invención en los que la proteína CmWIP1 es también sobreexpresada (alelo A presente en estado de homocigoto o heterocigoto y heterocigoto).

Una planta que sobreexpresa la proteína CmWIP1 produce flores machos y hermafroditas en los modos de realización de la combinación de dos elementos genéticos de la invención en la que hay ausencia de expresión de una proteína ACS activa.

Por tanto, la invención se refiere también a una planta transformada como se define con anterioridad cuyas flores son machos y hembras y una planta transformada como se define con anterioridad cuyas flores son machos y hermafroditas.

La planta transformada puede contener una pluralidad de copias de un ácido nucleico que codifica la proteína ACS, en situaciones en las que se busca una sobreexpresión de la proteína ACS. Una sobreexpresión de la proteína ACS es buscada particularmente cuando se desea obtener plantas que producen flores hembra, no capaces de autopolinización.

Una planta que sobreexpresa la proteína ACSproduce flores machos y hembras en los modos de realización de la combinación de dos elementos genéticos de la invención en los que la proteína CmWIP1 es también sobreexpresada (alelo G presente en estado de homocigoto).

Una planta que sobreexpresa la proteína ACS produce flores hembras en los modos de realización de la combinación de dos elementos genéticos de la invención en los que hay ausencia de expresión de una proteína CmWIP1 activa.

Por tanto, la invención se refiere también a una planta transformada como se define con anterioridad cuyas flores son machos y hembras y a una planta transformada como se define con anterioridad cuyas flores son exclusivamente hembras.

Las plantas transformadas según la invención comprenden todas al menos un segundo elemento genético de la combinación según la invención, escogido entre ácidos nucleicos y polinucleótidos reguladores definidos con anterioridad en una forma artificialmente introducida en su genoma.

La invención se refiere también a cualquier parte de una planta transformada como se define en la presente descripción como la raíz, pero también las partes áreas como el tallo, as hojas, la flor y sobre todo el grano o el fruto. La invención tiene todavía por objeto una semilla o un grano de planta producida mediante una planta transformada como se define con anterioridad.

Normalmente, esta semilla transformada o este grano transformado comprende una o varias células que comprenden en su genoma una o varias copias de los primeros y segundos elementos genéticos de control como se definen con anterioridad, artificialmente introducidos en dicha planta dicotiledónea, que permiten las síntesis de la proteína CmWIP1 a un nivel elevado o a un nivel bajo, en su caso de forma controlada e inducible.

Según un modo de realización preferente de una planta transformada según la invención, se busca expresar de forma controlada la proteína CmWIP1, lo que implica que la planta transformada no contiene, como copia funcional de un polinucleótido que codifica la proteína CmWIP1 únicamente la o las copias que han sido artificialmente introducidas en sus células y, preferentemente, en su genoma, mientras que las secuencias del gen (G/g) que codifica CmWIP1, que se encuentran de forma natural en la planta salvaje, portan al menos una mutación que provoca un detecto en la expresión del gen (G/g).

Las plantas transformadas según la invención son dicotiledóneas, preferentemente pertenecientes a la familia de cucurbitáceas y, en particular, a los géneros escogidos entre:

Abobra, Acanthosicyos, Actinostemma, Alsomitra, Ampelosicyos, Anacaona, Apatzingania, Apodanthera, Bambekea, Benincasa, Biswarea, Bolbostemma, Brandegea, bryonia, Calycophysum, Cayaponia, Cephalopentandra, Ceratosanthes, Chalema, Cionosicyos, Citrullus, Coccinia, Cogniauxia, Corallocarpus, Cremastopus, Ctenolepis, Cucumella, Cucumeropsis, Cucumis, Cucurbita,, Cucurbitella, Cyclanthera, Cyclantheropsis, Dactyliandra, Dendrosicyos, Dicoelospermum, Dieterlea, Diplocyclos, Doyerea, Ecballium, Echinocystis, Echinopepon, Edgaria, Elateriopsis, Eureiandra, Fevillea, Gerrardanthus, Gomphogyne, Gurania, Guraniopsis, Gymnopetalum, Gynostemma, Halosicyos, Hanburia, Helmontia, Hemsleya, Herpetospermum, Hodgsonia, Ibervillea, Indofevillea, Kedrostis, Lagenaria,, Lemurosicyos, Luffa, Marah, Melancium, Melothria, Melothrianthus, Microsechium, Momordica, Muellerargia, Mukia, Myrmecosicyos, Neoalsomitra, Nothoalsomitra, Odosicyos, Oreosyce, Parasicyos, Penelopeia, Peponium, Peponopsis, Polyclathra, Posadaea, Praecitrullus, Pseudocyclanthera, Pseudosicydium, Psiguria, Pteropepon, Pterosicyos, Raphidiocystis, Ruthalicia, Rytidostylis, Schizocarpum, Schizopepon, Sechiopsis, Sechium,, Selysia, Seyrigia, Sicana, Sicydium, Sicyos, Sicyosperma, Siolmatra, Siraitia, Solena, Tecunumania, Telfairia, Thladiantha, Trichosanthes, Tricyclandra, Trochomeria, Trochomeriopsis, Tumamoca, Vaseyanthus, Wilbrandia, Xerosicyos, Zanonia, Zehneria, Zombitsia, o Zygosicyos.

Preferentemente, las plantas transformadas pertenecen al género Cucumis y a la especie Cucumis Melo.

Procedimientos de detección según la invención

La identificación del sistema de control del desarrollo del tipo floral por los inventores ha permitido llevar a cabo procedimientos de detección del fenotipo sexual de las plantas extremadamente simples, cuyas características principales se detallan a continuación.

La invención se refiere también a un procedimiento de detección de la presencia de un alelo (G) o (g), comprendiendo dicho método las etapas de:

1) Poner en contacto una sonda o una pluralidad de sondas de nucleótidos como se definen con anterioridad con la muestra que va a ser ensayada; y

2) detectar el complejo eventualmente formado entre la o las sondas y el ácido nucleico presente en la muestra. El procedimiento de detección anterior, puede ser utilizado conjuntamente con el procedimiento de detección de la presencia de un alelo (A) o (a) descrito en la solicitud PCT n° WO 2007/125264, que comprende las etapas de: 1) poner en contacto una sonda o una pluralidad de sondas de nucleótidos como se definen con anterioridad con la muestra que va a ser ensayada; y

2) detectar el complejo eventualmente formado entre la o las sondas y el ácido nucleico presente en la muestra. Estos dos procedimientos de detección permiten seleccionar plantas cuyos fenotipos y genotipos se resumen en la tabla 1.

La detección del complejo entre un ácido nucleico y una sonda se puede hacer mediante cualquier técnica conocida por un experto en la técnica y, en particular utilizando sondas o cebadores marcados, como se describen en la parte “sondas y cebadores según la invención”.

Estos procedimientos son particularmente ventajosos ya que evitan tener que cultivar una planta dicotiledónea para conocer su fenotipo sexual. Es posible así realizar la detección del fenotipo sexual de una muestra muy grande de plantas a un coste menor.

Procedimientos de selección según la invención.

Los procedimientos de detección anteriores se pueden utilizar en los procedimientos de selección detallados a continuación.

La invención tiene también por objeto un procedimiento de selección del tipo floral de una planta perteneciente al género cucurbitácea, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) Determinar la presencia de alelos (G) y (g) en una planta de interés perteneciente a la familia de las cucurbitáceas, por ejemplo, utilizando ácidos nucleicos como se definen con anterioridad, y

b) seleccionar positivamente la planta que posee el alelo (G) o el alelo (g) en su genoma.

El procedimiento de selección anterior puede ser utilizado conjuntamente con el procedimiento de selección del tipo floral de una planta perteneciente al género cucurbitáceas que se describe en la solicitud PCT n° WO 2007/125264, que se caracteriza porque comprende las etapas de:

a) determinar la presencia de los alelos (A) y (a) en una planta de interés perteneciente a la familia de las cucurbitáceas, por ejemplo, utilizando ácidos nucleicos como se definen con anterioridad o un anticuerpo dirigido contra la proteína ACS y

b) seleccionar positivamente la planta que posee el alelo (A) o el alelo (a) en su genoma.

La determinación de la presencia de los alelos (A), (a), (G) y (g) se puede efectuar por tanto de forma ventajosa llevando a cabo los procedimientos de detección anteriores.

El experto en la técnica puede combinar fácilmente los procedimientos de selección anteriormente definidos, que se hace referencia en la Tabla 1, que proporciona la correspondencia entre genotipo y fenotipo, para obtener plantas de fenotipo únicamente hembra o hermafroditas, por ejemplo.

Procedimiento de obtención de una planta transformada según la invención

Las plantas transformadas según la invención pueden ser obtenidas gracias a uno cualquiera de los numerosos procedimientos que forman parte actualmente de los conocimientos generales de un experto en la técnica.

Se describen a continuación procedimientos de obtención de plantas transformadas según la invención.

Procedimiento de obtención de plantas transformadas mediante “TILLING”

El “TILLING” (para “Targeted Induced Local Lésions In Genomes”) es un método de genética in verso que está basado en la capacidad de una endonucleasa para detectar los malapareamientos en un enlace doble de ADN y realizar una desconexión del ADN a nivel de las bases no apareadas. Esta técnica permite detectar puntos de mutación únicos generados por la exposición de las plantas a un compuesto químico mutagénico. La técnica TILLING permite por tanto la identificación de una serie de alelos de un gen dado y está particularmente bien adaptada para la utilización de procedimientos de selección de alto rendimiento que permiten la selección, en genes diana de interés, de mutaciones inducidas por mutagénesis química.

El método de TILLING es bien conocido por un experto en la técnica, se describe particularmente por Mc Callum et al. (2000, Plant Physiology, Vol. 123: 439-442).

Para las necesidades de la presente invención, la técnica de TILLING está particularmente bien adaptada a la obtención y la selección de plantas en las que se ha introducido artificialmente el alelo (g) del segundo elemento de control genético (G/g).

Según la invención, la técnica de TILLING puede ser utilizada también con éxito para la obtención y la selección de plantas en las que se ha introducido artificialmente el alelo (a) del primer elemento genético (A/a).

Por definición, considerando lo que antecede, la técnica de TILLING está adaptada para la obtención y la selección de plantas en las que se ha introducido artificialmente al mismo tiempo el alelo (g) del segundo elemento de control genético (G/g) y el alelo (a) del primer elemento genético (A/a).

La obtención de plantas dicotiledóneas artificialmente mutadas en el gen que codifica la proteína CmWIP1 se puede realizar utilizando la técnica de TILLING, por ejemplo, según un procedimiento que comprende las etapas siguientes: a) generar una colección de plantas dicotiledóneas mutantes mediante mutagénesis química;

b) seleccionar en la colección de plantas mutantes generadas en la etapa a) las plantas que poseen una mutación o más de una mutación en el gen que codifica la proteína CmWIP1,

c) seleccionar, entre las plantas mutantes seleccionadas en la etapa b), las plantas que expresan el fenotipo (g). En ciertos modos de realización del procedimiento anterior, la etapa a) se realiza mediante mutagénesis química de semillas de plantas dicotiledóneas de interés, mediante exposición de las semillas a un agente mutagénico, por ejemplo, etil-metanosulfonato, por ejemplo, utilizando el método descrito por Koornbeef et al. (1982, Mutat Res, Vol.

93: 109-123).

Seguidamente, se genera una colección de plantas M1 a partir de semillas previamente expuestas al agente mutagénico. Las plantas M1 son seguidamente autofecundadas con el fin de generar una colección de plantas M2 que es la colección de plantas generada en la etapa a) del procedimiento.

Seguidamente, en la etapa b), se extrae el ADN de cada planta de la colección de plantas generada en la etapa a) y se realiza una amplificación del ácido nucleico del gen diana, en este caso el gen que codifica la proteína CmWIP1, y se busca la presencia de mutación(es) en la secuencia del gen diana, mediante comparación con la secuencia del gen diana no mutado. Seguidamente, se seleccionan las plantas mutadas en la secuencia del gen que codifica el gen diana, en este caso el gen que codifica la proteína CmWIP1.

En ciertos modos de realización de la etapa b), el ADN se extrae a partir de varias plantas M2, por ejemplo, 20 plantas M2 y se mezcla en un primer momento y la detección de las mutaciones en la secuencia del gen diana se realiza sobre la mezcla (“pool”) de extracto de ADN con el fin de reducir el número de etapas de detección de mutaciones que se debe efectuar.

Seguidamente, se realiza una etapa de amplificación de secuencias diana mediante PCR, utilizando cebadores nucleicos apropiados y los amplicones que se generan son calentados, seguidamente enfriados con el fin de generar heteroduplex de ADN entre el ADN original de una planta no mutada sobre el ácido nucleico diana y el ADN procedente de una etapa mutada sobre el ácido nucleico diana.

Seguidamente, los heteroduplex de ADN se incuban en presencia de una endonucleasa que se escinde a nivel de los malapareamientos. Seguidamente, los heteroduplex escindidos son desnaturalizados y separados.

Seguidamente las cadenas de ADN separadas se someten a la etapa de detección de mutación(es) propiamente dichas, por ejemplo, mediante electroforesis o bien mediante HPLC en condiciones desnaturalizantes (DHPLc ).

En ciertos modos de realización de la etapa b), la detección de mutación(es) en el gen diana se realiza mediante la técnica de HPLC en condiciones desnaturalizantes (“DHPLC”), como se describe, por ejemplo, por Mc Callum et al.

(2000, Plant Physiol., Vol. 123: 439 - 442).

Seguidamente, en la etapa c), se selecciona, entre las plantas mutadas sobre el gen diana, en este caso las plantas mutadas en el gen que codifica la proteína CmWIP1, las plantas que expresan el fenotipo asociado al alelo (g) del elemento genético (G/g).

Como ya se mencionó con anterioridad, la técnica de TILLING puede ser utilizada, según la presente invención, para la obtención de plantas transformadas que comprenden una cualquiera de las combinaciones de alelos (G/g) y (A/a) descritas en la presente invención.

Consecuentemente, en ciertos modos de realización del procedimiento que antecede, se pueden seleccionar en la etapa b), las plantas (i) que poseen una mutación o más de una mutación en el gen que codifica la proteína CmWIP1 y (ii) que poseen una mutación o más de una mutación en el gen que codifica la proteína ACS.

En estos modos de realización particulares se selecciona entonces en la etapa c), entre las plantas mutadas sobre los dos genes diana, es decir, las plantas mutadas en el gen que codifica la proteína CmWIP1 y en el gen qu codifica la proteína ACS, las plantas que expresan al mismo tiempo el fenotipo asociado al alelo (g) del elemento genético (G/g) y el fenotipo asociado al alelo (a) del elemento genético (A/a).

La presente invención tiene también por objeto plantas dicotiledóneas de tipo floral modificado en el genoma en las que se ha introducido al menos una mutación del gen que codifica la proteína CmWIP1.

La presente invención se refiere también a plantas dicotiledóneas de tipo floral modificado que han sido artificialmente mutadas en la secuencia del gen que codifica la proteína CmWIP1, expresando dichas plantas el fenotipo asociado al alelo (g) del elemento genético (G/g).

La presente invención tiene también por objeto plantas dicotiledóneas de tipo floral modificado en el genoma en las que se ha introducido (i) al menos una mutación en el gen que codifica la proteína CmWIP1 y (ii) al menos una mutación en el gen que codifica la proteína ACS.

La presente invención se refiere también a plantas dicotiledóneas de tipo floral modificado que han sido artificialmente mutadas (i) en la secuencia del gen que codifica la proteína CmWIP1 y (ii) en la secuencia del gen que codifica la proteína ACS, expresando dichas plantas al mismo tiempo (i) el fenotipo asociado al alelo (g) del elemento genético (G/g) y el fenotipo asociado al alelo (a) del elemento genético (G/g).

Otros procedimientos de obtención de plantas transformadas

La invención se refiere en primer lugar a un procedimiento para la obtención de una planta transformada destinado a insertar el alelo (G) en una planta que no comprende este alelo.

La invención por tanto tiene por objeto un procedimiento para la obtención de una planta transformada, perteneciente a la familia de las cucurbitáceas, que porta flores hembras, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) transformación de al menos una célula vegetal de una planta de interés que no porta el alelo (G) en su genoma, por una secuencia de nucleótidos (NG); o un vector recombinante que comprende este ácido nucleico;

b) selección de las células transformadas obtenidas en la etapa a) que se han integrado en su genoma, el ácido nucleico (NG);

c) regeneración de una planta transformada a partir de las células transformadas en la etapa b).

Este tipo de procedimiento es particularmente útil ya que permite insertar el alelo (G) en el genoma de una planta, que presentará así un fenotipo monoico o andromonoico.

La invención tiene también por objeto un procedimiento de transformación de plantas destinado a suprimir el alelo (G) en una planta o a sustituir el alelo (G) por un alelo (g), de forma que se obtenga una planta de fenotipo hermafrodita o una planta de tipo hembra.

La invención por tanto tiene por objeto un procedimiento para la obtención de una planta transformada, perteneciente a la familia de las cucurbitáceas que porta flores hemafroditas o flores hembras, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) la sustitución en una planta del alelo (G) por un alelo (g),

La presente invención tiene también por objeto plantas dicotiledóneas de tipo floral modificado en el genoma en las que se ha introducido al menos una mutación del gen que codifica la proteína CmWIP1.

La presente invención se refiere también a plantas dicotiledóneas de tipo floral modificado que han sido artificialmente mutadas en la secuencia del gen que codifica la proteína CmWIP1, expresando dichas plantas el fenotipo asociado al alelo (g) del elemento genético (G/g).

La presente invención tiene también por objeto plantas dicotiledóneas de tipo floral modificado en el genoma en las que se ha introducido (i) al menos una mutación en el gen que codifica la proteína CmWIP1 (ii) al menos una mutación en el gen que codifica la proteína ACS.

La presente invención se refiere también a plantas dicotiledóneas de tipo floral modificado que han sido artificialmente mutadas (i) en la secuencia del gen que codifica la proteína CmWIP1 y(ii) en la secuencia del gen que codifica la proteína ACS, expresando dichas plantas al mismo (i) el fenotipo asociado al alelo (g) del elemento genético (G/g) y el fenotipo asociado al alelo (a) del elemento genético (G/g).

Otros procedimientos de obtención de plantas transformadas

La invención se refiere en primer lugar a un procedimiento para la obtención de una planta transformada dirigido a insertar el alelo (G) en una planta que no comprende este alelo.

Por tanto, la invención tiene por objeto un procedimiento para la obtención de una planta transformada, perteneciente a la familia de las cucurbitáceas, que porta flores hembras, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) transformación de al menos una célula vegetal de una planta de interés que no porta el alelo (G) en su genoma, por una secuencia de nucleótidos (NG); o un vector recombinante que comprende este ácido nucleico;

b) selección de las células transformadas obtenidas en la etapa a) que han integrado en su genoma el ácido nucleico (NG);

c) regeneración de una planta transformada a partir de las células transformadas obtenidas en la etapa b).

Este tipo de procedimiento es particularmente útil ya que permite insertar el alelo (G) en el genoma de una planta, que presentará así un fenotipo monoico o andromonoico.

La invención tiene también por objeto un procedimiento de transformación de plantas destinado a suprimir el alelo (G) en una planta o sustituir el alelo (G) por un alelo (g) de forma que se obtenga una planta de fenotipo hermafrodita o una planta de tipo hembra.

Por tanto, la invención tiene por objeto un procedimiento para la obtención de una planta transformada, perteneciente a la familia de las cucurbitáceas, que porta flores hermafroditas o flores hembras, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) la sustitución en una planta del alelo (G) por un alelo (g),

b) selección de las células transformadas obtenidas en la etapa (a) que han integrado en su genoma el alelo (g); c) regeneración de una planta transformada a partir de las células transformadas de la etapa b).

Sin que esto forme parte de la invención, el procedimiento puede comprender todavía una etapa d) de crecimiento de plantas obtenidas en la etapa c) para la obtención de una que ya no porte alelo (G).

En un primer modo de realización del procedimiento anterior, la etapa a) consiste en transformar una planta que comprende el alelo (G) en su genoma por un ácido nucleico de tipo “antisentido” como se define con anterioridad, y seleccionar las planta que ya no comprenden el alelo (G).

Se puede obtener un resultado idéntico utilizando fenómenos de recombinación homóloga destinados a sustituir totalmente o en parte el ácido nucleico (NG) por un ácido nucleico de estructura alterada, que no permita obtener un fenotipo correspondiente al alelo (G).

Este ácido nucleico de estructura alterada puede consistir en un polinucleótido regulador (Pg) o un ácido nucleico que codifica una proteína CmWIP1 alterada en su secuencia.

Por tanto, la invención tiene por objeto un procedimiento para la obtención de una planta transformada, perteneciente a la familia de las cucurbitáceas, que porta flores hermafroditas, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) transformación de al menos una célula vegetal de una planta de interés que comprende un alelo (G) por un polinucleótido regulador (Pg) o por un ácido nucleico que codifica una proteína CmWIP1 alterada; o un vector recombinante que comprende este ácido nucleico;

b) selección de células transformadas obtenidas en la etapa a) que han integrado en su genoma al menos una copia de un polinucleótido regulador (Pg) o un ácido nucleico que codifica una proteína CmWIP1 alterada;

c) regeneración de una planta transformada a partir de las células transformadas obtenidas en la etapa b).

Sin que esto forme parte de la invención, el procedimiento puede comprender todavía una etapa d) de crecimiento de plantas obtenidas en la etapa c) para la obtención de una que ya no porte alelo (G).

Este tipo de procedimiento es particularmente útil ya que permite obtener plantas que ya no comprenden alelo (G) y que son de tipo hermafrodita o ginoico.

El procedimiento anterior se puede llevar a cabo con el procedimiento de transformación de plantas dirigido a insertar el alelo (A) que se describe en la solicitud PCT n° WO 2007/125364.

Este procedimiento anterior para la obtención de una planta transformada perteneciente a la familia de las cucurbitáceas, que porta flores hembras, se caracteriza porque comprende las etapas siguientes:

a) transformación de al menos una célula vegetal de una planta de interés que no comprende el alelo (A) en su genoma, por una secuencia de nucleótidos (NA); o un vector recombinante que comprende este ácido nucleico; b) selección de las células transformadas obtenidas en la etapa a) que han integrado en su genoma el ácido nucleico (NA);

c) regeneración de una planta transformada a partir de las células transformadas obtenidas en la etapa b).

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de transformación de plantas destinado a sustituir el alelo (A) por el alelo (a).

El procedimiento anterior se puede llevar a cabo con el procedimiento de transformación de plantas destinado a insertar el alelo (A) que se describe en la solicitud PCT n° Wo 2007/125364.

Este procedimiento anterior para la obtención de una planta transformada, perteneciente a la familia de las cucurbitáceas, que porta flores hermafroditas, se caracteriza porque comprende las etapas siguientes:

a) la sustitución en una planta del alelo (A) por un alelo (a),

b) selección de las células transformadas obtenidas en la etapa a) que han integrado en su genoma el alelo (A), c) regeneración de una planta transformada a partir de las células transformadas obtenidas en la etapa b).

Sin que esto forme parte de la invención, el procedimiento puede comprender todavía una etapa d) de crecimiento de plantas obtenidas en la etapa c) para la obtención de una que ya no porte el alelo (A).

Por tanto, los procedimientos anteriores pueden ser combinados entre ellos fundiéndose en la Tabla 1, de forma que se obtengan plantas exclusivamente hembras o exclusivamente hermafroditas, cuyo interés industrial se expuso con anterioridad.

Para simplificar los procedimientos para la obtención de una planta transformada exclusivamente hembra o exclusivamente hermafrodita, es posible realizar una etapa previa en los procedimientos definidos con anterioridad, en el transcurso de la cual las mutaciones de los genes (A/a) y (G/g) presentes de forma natural en la planta se efectúan, por ejemplo, mediante inserción aleatoria del transposón Mutator en una población de plantas de fenotipo salvaje, detectando seguidamente en los mutantes obtenidos, aquellos entre estos mutantes que son de genotipo (aagg), por ejemplo, por medio de sondas o de cebadores de nucleótidos descritos en los ejemplos.

Según este modo de realización preferente, la planta transformada según la invención se caracteriza porque posee un genotipo (aagg) y presenta flores exclusivamente hermafroditas.

En un modo de realización de los procedimientos de obtención de una planta transformada anteriormente descritos, el polinucleótido (NG), cuando es utilizado, comprende un polinucleótido regulador (PG) activador inducible.

Las plantas obtenidas según el procedimiento que anteceden portan exclusivamente flores hermafroditas y, por tanto, son particularmente interesantes desde un punto de vista industrial, ya que no son capaces de una autopolinización.

Por tanto, estas plantas pueden ser utilizadas en procedimientos de creación de líneas puras.

Procedimientos de transformación de las plantas según la invención.

En el contexto de esta invención pueden ser utilizados los métodos más extendidos para introducir ácidos nucleicos en células vegetales.

La transformación de células vegetales se puede realizar mediante diversos métodos como, por ejemplo, la transferencia de los vectores anteriormente mencionados en los protoplastos vegetales después de una incubación de estos últimos en una solución de polietilenglicol en presencia de cationes divalentes divalentes (Ca 2+), electroporación (Fromm et al. 1985), la utilización de un cañón de partículas o microinyección citoplásmica o nuclear (Neuhaus et al, 1987).

Uno de los métodos de transformación de células vegetales que puede ser utilizado en el contexto de la invención es la infección de las células vegetales mediante un hospedante celular bacteriano que comprende el vector que contiene la secuencia de interés. El hospedante celular puede ser Agrobacterium tumefaciens (An et al. 1986), o A. rhizogenes (Guerche et al. 1987).

De forma preferida, la transformación de las células vegetales se realiza mediante la transferencia de la región T del plásmido circular extracromozómico inductor de tumores Ti de A. Tumefaciens, utilizando un sistema binario (Watson et al., 1994). Para hacer esto, se construyen dos vectores. En uno de estos vectores, la región de ADN-T fue eliminada mediante deleción, con la excepción de los bordes de derecha e izquierda, siendo insertado un gen marcador entre ellos para permitir la selección de las células de plantas. El otro miembro del sistema binario es un plásmido Ti auxiliar, plásmido modificado que ya no tiene ADN-T pero contiene siempre los genes de virulencia vir necesarios para la transformación de la célula vegetal. Este plásmido es mantenido en Agrobacterium.

Según un modo preferido, el método descrito por Ishida et al. (1996) puede ser aplicado para la transformación de dicotiledones. Según otro protocolo, la transformación se realiza según el método descrito por Finer et al. (1992) utilizando un cañón de partículas de wolframio o de oro.

La presente invención se ilustra también, sin por ello limitarla, en los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación del elemento genético de control (G/g)

La clonación del lugar g basada en cartografía se realiza mediante selección de los elementos de recombinación en una población de 12660 plantas que segregan el alelo g. Una planta de generación F1 procedente del crecimiento de PI124112 (genotipo monoico A-G-) x Gynadou (genotipos ginoicos A-gg) fue retrocruzada con Gynadou con el fin de generar una población de generación F2, para fines de análisis. El lugar g estaba localizado en un intervalo entre los marcadores M261 y M365 sobre el cromosoma 4 (véase la figura 1A).

Los marcadores M261 y M365 fueron anclados en cuatro clones BAC diferentes procedentes de una biblioteca genómica de genotipo monoico, con el fin de generar un mapa físico del lugar.

Un análisis de las SNP en este intervalo mostró dos recombinantes muy críticos, lo que permitió reducir de forma última el lugar g a una región de 1,4 kb en el clo BAC monoico 102 (véase la figura 1C). La anotación de este clon permitió identificar 8 marcos abiertos de lectura (ORFs) en esta región (véase la figura 1B).

No se encontró ningún polimorfismo significativo en los 8 marcos abiertos de lectura que rodean este intervalo, cuando la región correspondiente fue secuenciada en el genotipo ginoico que porta el alelo recesivo.

No obstante, se encontró una inserción de 8 kb en el interior de la región de 1,4 kb delimitada por la clonación posicional (Figura 1B). Esta inserción corresponde al transposón de ADN de familia hAT, denominado Gyno-hAT (Secuencia n° 14) un grupo muy extendido de elementos transportables (TEs).

Debido a que este transposón de ADN fue encontrado mediante clonación posicional en el intervalo más corto, y debido a que este transposón corresponde al único polimorfismo significativo entre los genotipos monoicos y ginoicos en este lugar, este elemento transportable (TE) tiene una probabilidad muy elevada de ser responsable del fenotipo de determinación del sexo.

Ejemplo 2: caracterización del elemento genético de control (G/g)

Debido a que los elementos transportables (TEs) están sometidos a una inhibición (“silenciado” epigenética que induce una sobreexpresión de la transposición y del agrupamiento genómico ilegítimo, se examinó el estado de metilación del ADN del transposón en el lugar g, mediante amplificación PCR sensible a la endonucleasa McrBC. Se observó que el transposón está altamente metilado (véase la figura 2).

Se analizó la extensión potencial de la metilación del ADN de los genes del entorno del lugar g realizando una amplificación PCR sensible a la endonucleasa McrBC sobre los tres marcos abiertos de lectura (ORFs) más próximos al transposón.

Este análisis mostró que el único marco abierto de lectura de referencia ORF3 que está localizado a una distancia inferior a 1 kb del lugar g, estaba específicamente metilado en el genotipo ginoico que porta el transposón (Figura 3A). El marco abierto de lectura ORF3 codifica un factor de transcripción de dedos de zinc C2H2 y es homologo a los miembros de la subfamilia WIP específica de las plantas (Sagasser et al., 2002).

Con el fin de obtener una información más precisa sobre los perfiles de metilación del ADN de la secuencia genómica CmWIP1, se seleccionó la totalidad del gen CmWlP1 mediante PCR cuantitativa sensible a la endonucleasa McrBC en las plantas PI124112 (G-) y Gynadou (gg) (véase la figura 3B). Se mostró que el ADN genómico de Gynadou estaba altamente metilado en la región promotora en las proximidades del sitio de inicio de la transcripción, en comparación con el genotipo monoico (Figura 3B).

La metilación de ADN era también más elevada en el primer exón, el intrón y en las proximidades de la secuencia 3' UTR del genotipo genoico, pero de forma menor.

Con el fin de proseguir el estudio de los perfiles de metilación del ADN de CmWIP1, se realizó un secuenciado en bisulfito sobre la región altamente metilada del promotor CmWIP1. El secuenciado en bisulfito conformó el fenotipo de hipermetilación de las plantas ginoicas.

Debe entenderse que la metilación era siempre más elevada en el promotor de las plantas que portan el transposón al lugar g y se observó también la metilación en los residuos de citosina que estaban completamente no metilados en el genotipo monoico (véase la Figura 3C).

No obstante, de forma interesante, se apreció una metilación significativa del ADN en el promotor de PI124112. El hecho de que se detectara una metilación significativa del ADN en el promotor CmWIP1 podría explicar la extensión considerable de la inhibición de expresión (“silenciado”) cuando era insertado un elemento transportable (TE) en las proximidades. La hipermetilación de CmWIP1 se confirmó en los diferentes fondos genéticos recesivos para el alelo g, lo que refuerza la correlación entre la presencia del ADN de transposón y el estado de metilación más elevado de este gen (Figura 4).

Estos resultados sugieren fuertemente que la hipermetilación de CmWIPI, que es debida a una extensión de la inhibición debida al transposón (“silenciado”), podría ser la causa de la determinación del sexo en las plantas que portan el alelo g.

Se asoció la metilación excesiva de los residuos de citosina en la región promotora a una expresión génica reducida, lo que podría conducir a una disminución de los niveles de producción de transcritos de CmWIP1.

Ejemplo 3: perfiles de regulación de expresión del elemento de control (G/g)

Con el fin de ensayar la hipótesis según la cual hipermetilación de la región promotora del gen CmWIP1 podría inducir una disminución de la expresión de este gen, se analizaron los perfiles de regulación del ARNm de CmWIP1. Los niveles de expresión de CmWIP1 se determinaron mediante PCR cuantitativa durante la determinación del sexo y el desarrollo floral.

Los niveles relativos de transcritos se compararon en flores machos de PI124112 (G-) y en flores hembras de Gynadou (gg).

De forma general, la determinación del sexo y del desarrollo floral en las cucurbitáceas se dividieron en 12 fases, que van desde el inicio del meristemo floral en la antesis (Bai et al., 2004). Los procedimientos de determinación del sexo, es decir, la detención del órgano sexual inapropiado en la yema floral bisexual inicial, tiene lugar aproximadamente en las etapas 7 y 8.

En el presente caso, se ha mostrado que el gen CmWIP1 era expresado fuertemente en las yemas florales machos en la fase 6 y que su expresión decrecía rápidamente en las etapas posteriores (Figura 5). Por el contrario, en las yemas florales hembras, el ARNm de CmWIP1 fue detectado a un nivel muy bajo, cualquiera que sea la fase del desarrollo floral. De forma destacable, la expresión elevada y transitoria de CmWIP1 en las yemas florales machos en una fase precoz del desarrollo reproductivo coincide con la detención del desarrollo de los carpelos que se describe en trabajos recientes sobre cucurbitáceas (Hao et al., 2003; Bai et al., 2004).

Con el fin de determinar el perfil de expresión de espacio-tiempo del ARNm de CmWIP1, se realizaron hibridaciones in situ de las flores machos de PI142112 (G-) y de flores hembras de Gynadou (gg). El ARNm de CmWIP1 fue detectado de forma precoz durante el desarrollo floral alrededor de la fase 6 en yemas florales machos, lo que es acorde con los resultados de análisis mediante PCR cuantitativa.

Se encontró que la localización de ARNm de CmWIP1 estaba fuertemente confinada en la cuarta espiral de las yemas florales machos. Esta localización corresponde al carpelo primario que se detendrá en su desarrollo en la fase inmediatamente posterior, en las flores machos.

El ARNm de CmWIP1 no fue detectable en las yemas florales hembras, en ninguna de las fases de desarrollo. Estos resultados confirman la expresión muy reducida que ya se mostró mediante el análisis por PCT cuantitativo en flores machos de Gynadou (véase la figura 7).

Los niveles de expresión de CmWIP1 eran también muy bajos durante las fases de desarrollo asociadas a la determinación del sexo (hasta la fase 6) en las yemas florales hermafroditas (aagg) y en las yemas florales hembras de genotipo monoico (Figura 6). Dicho de otro modo, la expresión de CmWIP1 en fase precoz del desarrollo floral era siempre bajo en las flores que se desarrollaron en estructura hembra madura en todos los genotipos. El conjunto de estos resultados sugiere fuertemente que CmWIP1 tiene una función en la determinación del sexo en el melón, en particular en la detención del desarrollo de los carpelos en las yemas florales machos.

Ejemplo 4: determinación del tipo floral bajo el control del elemento (G/g)

Con el fin de profundizar el estudio de la función de CmWIP1 en la determinación del sexo y el desarrollo floral en el melón, se desarrolló una propuesta de genética inversa con el fin de identificar la función de esta proteína.

Se utilizó una estrategia que utiliza la técnica de TILLING (para Targeted Induced Local-scale Lesions in Genome”) con el fin de seleccionar una población de genotipo monoico (A-G-) mutagénizada con etilmetanosulfonato (EMS). La elección de la población se centró en los dos exones de CmWIP1. Según la alineación con los homólogos cercanos, la proteína, CmWIP1 está compuesta por dos dominios diferentes, respectivamente, un dominio N-terminal específico y un dominio C- terminal conservado en proteínas WIP con dedos de zinc.

Se identificaron tres mutantes en la secuencia que codifica CmWIP1 que tiene una sustitución única de base. Las sustituciones de nucleótidos dan lugar a las modificaciones de aminoácidos siguientes: L77F, P193L y S306F. Las sustituciones de aminoácidos estaban localizadas ya sea en la parte específica N-terminal de CmWIP1 o bien en el dominio C-terminal altamente conservado de la proteína.

Se observaron los fenotipos florales en plantas imitantes de homocigotos M2, en comparación con las plantas homocigotos de tipo salvaje de la misma familia EMS.

Los tres alelos imitantes mostraron un nuevo desarrollo de los carpelos, en comparación con clores machos de tipo salvaje (Figura 7).

Los mutantes P193L y S306F devinieron completamente ginoicos, lo que confirma que CmWIPI es el gen de la ginoesia. El mutante L77F es un mutante débil.

Los resultados de los ejemplos muestran que el epialelo de CmWIPI que se encontró en plantas genoicas, es claramente transmisible y se co-segrega con el fenotipo, ya que se observaron relaciones genotipos-fenotipos en diferentes fondos genéticos (véase la Figura 4) y en 12 mil gametos mediante experimentos de clonación posicional. De forma interesante y de acuerdo con la regulación epigenética, se observaron ocasionalmente fenotipos revertientes durante el desarrollo somático, que estaban correlacionados con la desmetilación de la secuencia de ADN de CmWIP1.

Los resultados de los ejemplos, que demuestran la implicación de la regulación del gen CmWIP1 en la determinación del sexo floral, son tanto más interesantes por cuanto los genes que codifican proteínas en dedos de zinc de tipo WIP se encuentran en una amplia diversidad de plantas, comprendidas las monocotiledóneas, los gimnospermas y los musgos. Además, se recuerda que la conservación de los dominios C-terminales de las proteínas en dedos de zinc de tipo WIP es muy elevada.

En consecuencia, la realización de un control de la regulación de CmWIP1, o de genes de la misma familia en genomas de plantas dicotiledóneas, monocotiledóneas, gimnospermas y musgos, a nivel transcripcional o posttranscripcional durante el desarrollo floral precoz, es de naturaleza que orienta de forma controlada el desarrollo de tipo floral en las plantas.

Ejemplo 5: expresión espacial y temporal del elemento genético de control (A/a)

Para estudiar la expresión del elemento genético de control A/a bajo la forma de alelo A, se efectuaron hibridaciones in situ utilizando sondas específicas del alelo A sobre plantas y, más precisamente, sobre meristemos florales de plantas machos, hembras y hermafroditas, de genotipo AA GG, aa GG, AA gg y aa gg. En los meristemos florales A, la expresión es localmente elevada y la señal de hibridación es detectada de forma específica en los primordios de los carpelos de flores hembras y hermafroditas de las plantas monoicas, andromonoicas, ginoicas y hermafroditas. Haciendo referencia a las diferentes fases de desarrollo de la flor descrito para el pepino (Bai et al., 2004), parece que en el melón el gen (A/a) es expresado en una fase precoz del desarrollo de los meristemos florales antes de que se pueda efectuar una distinción morfológica entre las flores machos y las flores hembras.

En las flores machos y hermafroditas, no se detectó ninguna expresión en las anteras. Estos datos indican que la expresión del alelo A en los carpelos de flores hembra evita el desarrollo de los estambres. Debido a que, en las flores hermafroditas, el alelo recesivo (a) presenta el mismo perfil de expresión que el alelo A en flores hembras, se puede concluir que la función del gen A depende de su especificad de expresión de tejidos, así como de la naturaleza de la proteína ACS sintetizada.

Ejemplo 6: transgénesis en Arabidopsis thaliana

Se estudiaron los efectos potenciales del gen A/a y de la proteína ACS sobre el fenotipo sexual floral y la arquitectura de la flor en plantas no pertenecientes a las cucurbitáceas mediante transformación de Arabidopsis thaliana por Agrobacterium. Las plantas transgénicas de Arabidopsis que portan el alelo de melón A o a presentan un fenotipo a nivel de la arquitectura floral y de las silicuas (Figuras 9a y 9B). En efecto, las silicuas de los transformantes de Arabidopsis son más cortas que las de una planta Arabidopsis salvaje y la arquitectura de las flores transformantes de Arabidopsis se ve muy afectada. Estos resultados permiten ampliar la utilización del gen de melón (A/a) a plantas dicotiledóneas no pertenecientes a la familia de las cucurbitáceas.

En resumen, gracias a la clonación del gen A (denominado CmACS-7) y del gen G (denominado CmWIP1) se ha demostrado que la expresión de la proteína CmWIP1 en el carpelo inhibe el desarrollo del carpelo y la expresión de CmACS-7 o cualquier otra enzima capaz de producir etileno en el carpelo, inhibe el desarrollo de estambres. Por tanto, un experto en la técnica puede expresar la proteína CmWIP1 en el carpelo de una planta, preferentemente una cucurbitácea, para bloquear el desarrollo del carpelo o, por el contrario, inhibir la expresión de la proteína CmWIP1 en el carpelo para favorecer el desarrollo del carpelo.

Un experto en la técnica puede expresar también la proteína CmACS-7 en el carpelo de una planta, preferentemente una cucurbitácea para bloquear el desarrollo de los estambres o, por el contrario, inhibir la expresión de la proteína CmWIP1 en el carpelo para favorecer el desarrollo de los estambres. Por tanto, la combinación de la expresión de las proteínas activas o mutantes de CmACS-7 y CmWIP1 permitirá la generación de diferentes tipos florales descritos en la tabla 1.

Los autores han identificado también los ortólogos de CmACS-7 y CmWIPI en otras especies. En el pepino (Cucumis sativa) el lugar M codifica el ortólogo de SEQ ID N°

Tabla de secuencias

Referencias

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Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Utilización de una combinación de dos elementos genéticos para el control del desarrollo del tipo floral de una planta dicotiledónea, comprendiendo dicha combinación, respectivamente:

a) un primer elemento genético de control (A/a) presente en dicha planta dicotiledónea, en forma de un alelo dominante (A) y un alelo recesivo (a), en el cual:

- el alelo dominante (A) consiste en un ácido nucleico (NA) que permite la expresión de la proteína ACS (aminociclopropano-carboxilato sintasa) de secuencia SEQ ID N° 3

- el alelo recesivo (a) se distingue del alelo dominante en que dicho alelo recesivo (a) es no funcional en dicha planta dicotiledónea, y

b) un segundo elemento genético de control (G/g) presente en dicha planta dicotiledónea, en forma de un alelo dominante (G) y un alelo recesivo (g), en el cual:

- el alelo dominante (G) consiste en un ácido nucleico (NG) que permite la expresión de la proteína CmWIPI ("C. melo Zinc Finger Protein") de secuencia SEQ ID N° 12,

- el alelo recesivo (g) se distingue del alelo dominante en que dicho alelo recesivo (g) es no funcional en dicha planta dicotiledónea,

entendiéndose que al menos el segundo elemento genético de control ha sido artificialmente introducido en dicha planta dicotiledónea.

2. Utilización de una combinación de dos elementos genéticos según la reivindicación 1, caracterizada porque: - el alelo dominante (A) consiste en un ácido nucleico (NA) que comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PA) funcional en una planta dicotiledónea, y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión es regulada por el polinucleótido regulador (PA), codificando dicho ácido nucleico la proteína ACS (aminociclopropano-carboxilato sintasa) de secuencia SEQ ID N° 3,

- el alelo recesivo (a) no funcional se distingue del alelo dominante por un ácido nucleico no funcional y comprende: (i) un polinucleótido regulador (Pa) cuya secuencia de nucleótidos comprende una inserción, una sustitución o una deleción con respecto al ácido nucleico que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 5907 de la secuencia SEQ ID N° 1 y que conduce a una expresión reducida o nula de la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3,

(ii) un ácido nucleico (Na) que codifica una proteína que difiere de la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3 por la sustitución, la inserción o la deleción de uno o varios aminoácidos y que no posee la actividad biológica de dicha proteína ACS en dicha planta dicotiledónea, y

- el alelo dominante (G) consiste en un ácido nucleico (NG) que comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PG) funcional en una planta dicotiledónea y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión está regulada por el polinucleótido regulador (PG), en que dicho ácido nucleico codifica la proteína CmWIP1 ("C. melo Zinc Finger Protein") de secuencia SEQ ID N° 12,

el alelo recesivo no funcional (g) se distingue del alelo dominante (G) por un ácido nucleico no funcional y comprende:

(i) un polinucleótido regulador (Pg) cuya secuencia de nucleótidos comprende al menos una mutación, una inserción o una deleción con respecto al ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 13 conduciendo dicho ácido nucleico a una expresión reducida o nula de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12, o

(ii) un ácido nucleico (Ng) que codifica una proteína que difiere de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12 por la sustitución, la inserción o la deleción de uno o varios aminoácidos y que no posee la actividad biológica de dicha proteína CmWIP1 en dicha planta dicotiledónea.

3. Utilización de una combinación de dos elementos genéticos según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque el ácido nucleico que codifica la proteína CmWIP1 comprende, desde el extremo 5' hacia el extremo 3', al menos:

(i) una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 3000 hasta el nucleótido 3617 de la SEQ ID N° 10, y

(ii) una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 5458 hasta el nucleótido 5901 de la SEQ ID N° 10.

4. Utilización de una combinación de dos elementos genéticos según una de las reivindicaciones 2 y 3, caracterizada porque el polinucleótido regulador (PG) comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID N° 11.

5. Ácido nucleico que comprende, desde el extremo 5' hacia el extremo 3', al menos:

(i) una secuencia que tiene al menos un 98,5% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 3000 hasta el nucleótido 3617 de la secuencia SEQ ID N° 10, y

(ii) una secuencia que tiene al menos un 99,5% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 5458 hasta el nucleótido 5901 de la secuencia SEQ ID N° 10.

6. Ácido nucleico en forma de alelo (G) como se define en la reivindicación 5, de secuencia SEQ ID N° 10.

7. Ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que va desde el nucleótido 3000 hasta el nucleótido 5901 de la secuencia SEQ ID N° 10.

8. Ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que porta al menos una alteración escogida entre una mutación, una inserción o una deleción, con respecto al ácido nucleico que va desde el nucleótido 1, hasta el nucleótido 2999 de la secuencia SEQ ID N° 10, conduciendo dicho ácido nucleico alterado a una expresión alterada de la proteína CmWIP1 de la secuencia SEQ ID N° 12, cuando controla la expresión de dicha proteína, con respecto a la expresión de la proteína CmWIP1 controlada por el ácido nucleico que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 2999 de la secuencia SEQ ID N° 10.

9. Vector recombinante que comprende un ácido nucleico, destinado a ser artificialmente introducido en una planta dicotiledónea, en que el ácido nucleido se escoge entre:

a) un elemento genético de control (G/g),

en que el elemento genético de control (G/g) se presenta en forma de un alelo dominante (G) o de un alelo recesivo (g):

- consistiendo el alelo dominante (G) en un ácido nucleico (NG), comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PG) funcional en una planta dicotiledónea, y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión está regulada por el polinucleótido regulador (PG), codificando dicho ácido nucleico la expresión de la proteína CmWIP1 («C. melo Zinc Finger Protein») de secuencia SEQ ID N° 12,

- el alelo recesivo no funcional (g) que se distingue del alelo dominante (G) en un ácido nucleico no funcional y que comprende:

(i) un polinucleótido regulador (Pg) cuya secuencia de nucleótidos comprende al menos una mutación, una inserción o una deleción con respecto al ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 13, conduciendo dicho ácido nucleico a una expresión reducida o nula de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12, o

(ii) un ácido nucleico (Ng) que codifica una proteína que difiere de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12 en la sustitución, la inserción o la deleción de uno o varios aminoácidos y que no posee la actividad biológica de dicha proteína CmWIP1 en dicha planta dicotiledónea, o

b) un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.

10. Célula hospedante transformada por un vector recombinante según la reivindicación 9, en que la célula hospedante comprende, en su genoma, un ácido nucleico artificialmente introducido por dicho vector recombinante, en que el ácido nucleico se escoge entre:

a) un elemento genético de control (G/g),

en que el elemento genético de control (G/g) se presenta en forma de un alelo dominante (G) o de un alelo recesivo (g):

- consistiendo el alelo dominante (G) en un ácido nucleico (NG), comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PG) funcional en una planta dicotiledónea, y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión está regulada por el polinucleótido regulador (PG), codificando dicho ácido nucleico la expresión de la proteína CmWIPI («C. melo Zinc Finger Protein») de secuencia SEQ ID N° 12,

- el alelo recesivo no funcional (g) que se distingue del alelo dominante (G) en un ácido nucleico no funcional y que comprende:

(i) un polinucleótido regulador (Pg) cuya secuencia de nucleótidos comprende al menos una mutación, una inserción o una deleción con respecto al ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 13, conduciendo dicho ácido nucleico a una expresión reducida o nula de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12, o

(ii) un ácido nucleico (Ng) que codifica una proteína que difiere de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12 en la sustitución, la inserción o la deleción de uno o varios aminoácidos y que no posee la actividad biológica de dicha proteína CmWIP1 en dicha planta dicotiledónea, o

b) un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.

11. Célula hospedante según la reivindicación 10, caracterizada porque se trata de una célula de planta perteneciente a la familia de las cucurbitáceas y, preferentemente, a la especie cucumis melo.

12. Planta perteneciente a la familia de las cucurbitáceas transformada mediante un vector recombinante según la reivindicación 9, en que dicha planta comprende, en su genoma, un ácido nucleico artificialmente introducido por dicho vector recombinante, en que el ácido nucleico se escoge entre:

a) un elemento genético de control (G/g),

en que el elemento genético de control (G/g) se presenta en forma de un alelo dominante (G) o de un alelo recesivo (g):

- consistiendo el alelo dominante (G) en un ácido nucleico (NG), comprende:

(i) un polinucleótido regulador (PG) funcional en una planta dicotiledónea, y

(ii) un ácido nucleico cuya expresión está regulada por el polinucleótido regulador (PG), codificando dicho ácido nucleico la expresión de la proteína CmWIP1 («C. melo Zinc Finger Protein») de secuencia SEQ ID N° 12,

- el alelo recesivo no funcional (g) que se distingue del alelo dominante (G) en un ácido nucleico no funcional y que comprende:

(i) un polinucleótido regulador (Pg) cuya secuencia de nucleótidos comprende al menos una mutación, una inserción o una deleción con respecto al ácido nucleico de secuencia SEQ ID N° 13, conduciendo dicho ácido nucleico a una expresión reducida o nula de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12, o

(ii) un ácido nucleico (Ng) que codifica una proteína que difiere de la proteína CmWIP1 de secuencia SEQ ID N° 12 en la sustitución, la inserción o la deleción de uno o varios aminoácidos y que no posee la actividad biológica de dicha proteína CmWIP1 en dicha planta dicotiledónea, o

b) un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.

13. Planta transformada según la reivindicación 12, caracterizada porque comprende al menos un alelo (G) como se define en la reivindicación 1.

14. Célula hospedante, transformada por:

(i) un vector recombinante que comprende un ácido nucleico escogido entre:

- un ácido nucleico que determina un alelo A o a como se define en la reivindicación 1,

- un ácido nucleico que comprende, desde el extremo 5' hacia el extremo 3', al menos:

(i) una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 5907 hasta el nucleótido 6086 de la secuencia SEQ ID N° 1,

(ii) una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 6181 hasta el nucleótido 6467 de la secuencia SEQ ID N° 1, y

(iii) una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con el polinucleótido que va desde el nucleótido 7046 hasta el nucleótido 7915 en la secuencia SEQ ID N° 1,

- un ácido nucleico en forma de alelo (A), como se define en la reivindicación 2, de secuencia SEQ ID N°1;

- un ácido nucleico en forma de alelo (a), como se define en la reivindicación 2, de secuencia SEQ ID N° 2, - un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 5906 de la secuencia SEQ ID N° 1,

- un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que porta al menos una alteración escogida entre una mutación, una inserción o una deleción, con respecto al ácido nucleico que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 5907 de la secuencia SEQ ID N° 1, conduciendo dicho ácido nucleico alterado a una expresión alterada de la proteína ACS de secuencia SEQ ID N° 3, cuando controla la expresión de dicha proteína, con respecto a la expresión de la proteína ACS controlada por el ácido nucleico que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 5907 de la secuencia SEQ ID N° 1, y

- un ácido nucleico que comprende una secuencia que va desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 3650 de la secuencia SEQ ID N° 2, y

(ii) un vector recombinante según la reivindicación 9,

en la que la célula hospedante comprende, en su genoma, un ácido nucleico artificialmente introducido por dicho vector recombinante.

15. Célula hospedante según la reivindicación 14, caracterizada porque se trata de una célula de planta perteneciente a la familia de las cucurbitáceas y, preferentemente, a la especia cucumis melo.

16. Ácido nucleico utilizable como cebador, que se hibrida específicamente con un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.

17. Procedimiento de detección de la presencia de un alelo (G) o (g) como se define en la reivindicación 1, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

1) poner en contacto una sonda o una pluralidad de sondas de nucleótidos que se hibridan específicamente con un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, con la muestra que va a ser ensayada,

2) detectar el complejo eventualmente formado entre la o las sondas y el ácido nucleico presente en la muestra.

18. Procedimiento de obtención de plantas artificialmente mutadas en el gen que codifica la proteína CmWIP1, que comprende las etapas siguientes:

a) generar una colección de plantas dicotiledóneas mutantes mediante mutagénesis química.

b) seleccionar en la colección de plantas mutantes generada en la etapa a) las plantas que poseen una mutación o más de una mutación en el gen que codifica la proteína CmWIP1,

c) seleccionar entre las plantas mutantes seleccionadas en la etapa b), las plantas que expresan el fenotipo asociado al alelo (g) del elemento genético (G/g) como se define en la reivindicación 1.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque las plantas son además mutadas en el gen que codifica la proteína ACS y porque:

- se seleccionan en la etapa b) las plantas (i) que poseen una mutación o más de una mutación en el gen que codifica la proteína CmWIP1 y (ii) que poseen una mutación o más de una mutación en el gen que codifica la proteína ACS,

- se seleccionan en la etapa c), entre las plantas mutadas en el gen que codifica la proteína CmWIP1 y en el gen que codifica la proteína ACS, las plantas que expresan al mismo tiempo el fenotipo asociado al alelo (g) del elemento genético (G/g) y el fenotipo asociado al alelo (a) del elemento genético (A/a).

20. Procedimiento para la obtención de una planta transformada perteneciente a la familia de las cucurbitáceas, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) transformación de al menos una célula vegetal de una planta de interés que no comprende el alelo (G) como se define en la reivindicación 1 en su genoma, mediante una secuencia de nucleótidos (NG) como se define en la reivindicación 1, o un vector recombinante que comprende este ácido nucleico;

b) selección de las células transformadas obtenidas en la etapa (a) que se han integrado en su ácido nucleico (NG); c) regeneración de una planta transformada a partir de las células transformadas obtenidas en la etapa b).

21. Procedimiento para la obtención de una planta transformada perteneciente a la familia de las cucurbitáceas, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) transformación de al menos una célula vegetal de una planta de interés que comprende el alelo (G) como se define en la reivindicación 1 en su genoma, mediante un polinucleótido regulador (Pg) no funcional o mediante un ácido nucleico (Ng) que codifica una proteína CmWIP1 alterada, como se define en la reivindicación 1, o mediante un ácido nucleico (NG) antisentido,

b) selección de las células transformadas procedentes de una planta obtenida en la etapa a) y que han integrado en su genoma al menos una copia de un polinucleótido regulador (Pg) no funcional o de un ácido nucleico (Ng) que codifica una proteína CmWIP1 alterada, como se define en la reivindicación 1, o que ya no comprenden el alelo (G), c) regeneración de una planta transformada a partir de las células transformadas obtenidas en la etapa b).