JP2001078602A - 植物の生長量を増加させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】植物の生長量を増加させる方法の提供。 【解決手段】外来フェリチン遺伝子（例，ダイズフェリ
チンｃＤＮＡ）を植物（例，レタス，タバコ等）に導入
することにより、該植物の生長量（植物体の生重量，種
子重量，高さ等）を増加させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は植物の生長量を増加
させる方法に関するものである。より詳しくは、本発明
は、植物に外来フェリチン遺伝子を導入するという分子
育種法を利用することにより、植物の生長量を増加させ
る方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】フェリチンは人間を含む高等動物から植
物、細菌等の微生物まで生物界に広く存在する鉄貯蔵タ
ンパク質であり、貯蔵している鉄を他の鉄結合酵素など
に供給すること、および生体に障害を及ぼすような過剰
な無機鉄を取り込み、解毒して細胞を保護することを主
要な生理的役割としている。このタンパク質は非常に巨
大であり（分子量５４０ｋＤａ）、外径が約１３ｎｍも
あり、２４個のサブユニットが対称性を持って積み重な
り、あたかも袋のような構造をしている。この袋状構造
の中に鉄を最大で４５００原子も貯蔵すると推定されて
いる。本発明者らはこのような大量の鉄を貯蔵できるフ
ェリチンの遺伝子を外来遺伝子として植物に導入するこ
とにより、該植物の鉄含量を増加させ得ることを見出
し、「分子育種法による高鉄含量植物およびその作出方
法」として先に特許出願を行った（特開平９−２０１１
９０号公報参照）。なお、フェリチンには上記した鉄の
貯蔵以外に、鉄が関与する酸化ストレスの抑制が知られ
ている。そこで、フェリチンによる酸化ストレスの防御
機構を利用することによる分子育種の適用範囲の拡大に
対する強い要望がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明はこのような要
望に応えるためになされたものであり、外来フェリチン
遺伝子を植物に導入することにより植物への新たな特性
の付与、具体的には植物の生長量を増加させる方法の提
供を課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、外
来フェリチン遺伝子を植物に導入することにより植物の
生長量を増加させる方法に関する。本発明において生長
量の増加とは、上記遺伝子が導入されていない植物（非
形質転換植物）に比べた場合の生重量および／または伸
長量等を直接的に意味し、間接的には光合成速度の増加
や開花時期の早期化等をも意味する。

【０００５】本発明において外来フェリチン遺伝子と
は、該遺伝子の導入により形質転換される植物細胞以外
の細胞、例えばバクテリア、植物または動物の細胞に由
来するフェリチン遺伝子を意味する。この外来フェリチ
ン遺伝子には、その塩基配列の一部が遺伝子工学的に改
変された遺伝子や、一の遺伝子に対して縮重の関係にあ
るコドンを有する遺伝子を包含することはいうまでもな
い。

【０００６】本発明において、外来フェリチン遺伝子の
導入は、一般に植物細胞、例えば単一の植物細胞、また
は該細胞の集合体であって分化構造を有していないカル
スの他、芽や根等の組織等に対して行われ得る。ここ
で、植物細胞内への外来フェリチン遺伝子の導入は公知
のあらゆる方法により行い得るが、例示すれば、Ｔｉプ
ラスミドまたはＲｉプラスミドに所望の外来フェリチン
遺伝子を発現可能に組み込み、それをアグロバクテリウ
ム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)
またはアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium
rhizogenes)を介して導入することができる。Ｔｉプラ
スミドを用いた場合、外来フェリチン遺伝子の導入はリ
ーフディスク法により植物細胞に直接行われ得る。ま
た、植物プロトプラストを予め調製した後、外来フェリ
チン遺伝子を保持するプラスミドを用いてエレクトロポ
レーション法、マイクロインジェクション法、ポリエチ
レングリコール法、直接塗布法により外来フェリチン遺
伝子を植物細胞中に導入することもできる。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の一つの好ましい態様を以
下に示す。しかしながら、本発明が該態様に限定される
ものでないことはいうまでもない。カナマイシン耐性遺
伝子（ＮＰＴ ＩＩ）およびカリラワー・モザイク・ウ
イルスの３５Ｓプロモーターにより転写制御されている
β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を有するバイナ
リーベクターのＧＵＳを切除した箇所に７８０塩基対
（ｂｐ）を有するダイズフェリチンｃＤＮＡを連結した
プラスミドｐＢＧ−１を導入したアグロバクテリウム・
チュメファシエンスＬＢＡ４４０４株（ＦＥＲＭ Ｐ−
１５３９３）の培養懸濁液に、植物、例えばレタス、ミ
ツバ、ブロッコリー、カリフラワー、セロリ、サラダ
菜、キャベツ、ホウレンソウ、ダイズ、ニンジン、キュ
ウリ、トマト、ジャガイモ等の野菜類、イネ、コムギ、
オオムギ、トウモロコシ、マメ等の穀物類、ポプラ、ス
ギ、ユーカリ、シラカバ等の材木類等のリーフディスク
を浸漬した後、カナマイシン耐性をマーカーとして形質
転換体を選抜する。その後、必要に応じ、該形質転換体
の継代培養を繰り返し、カルスや不定芽を経て、生長量
が増加した植物体、さらには種子、塊茎等の後代を作出
することができる。それら各工程における条件等は使用
した植物等に応じ適宜選択される。

【０００８】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を説明する
が、本発明はこの実施例に限定されるものではない。 Ａ．外来フェリチン遺伝子の単離およびベクターの構築 Ａ．１ ダイズフェリチン遺伝子の単離 フェリチン遺伝子の存在が知られているダイズから遺伝
子を単離する。ダイズに対する鉄刺激によって発現量の
増加した葉から抽出したｍＲＮＡを鋳型としＲＴ−ＰＣ
ＲによってフェリチンｃＤＮＡを合成した。さらに、こ
れらのｃＤＮＡがフェリチンｃＤＮＡであることをサザ
ンハイブリダイゼーションによって確認した後、このｃ
ＤＮＡをベクターｐＣＲ ＩＩにクローニングし、塩基
配列を決定した（図１）。得られた遺伝子は７８０ｂｐ
であり、ＰＣＲ反応で予定していた領域を増幅してお
り、翻訳開始コドンであるＡＴＧと終結コドンのＴＡＧ
を保持していた。既知ダイズフェリチン遺伝子との相同
性は９５％であった。また、遺伝子の配列から予想され
るアミノ酸配列の相同性は９４％だった。さらにアミノ
酸配列の比較において、既知配列と今回得られた配列の
うち、親水性や疎水性等の類似の性質を有するアミノ酸
を同じものと仮定した場合、その相同性は９８％となっ
た。以上の結果から、得られたダイズｃＤＮＡはフェリ
チン遺伝子と結論づけられた。 Ａ．２ ベクターの構築 プラスミドｐＢＩ１２１は、カナマイシン耐性遺伝子
（ＮＰＴ ＩＩ）およびカリラワー・モザイク・ウイル
スの３５Ｓプロモーターにより転写制御されているβ−
グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を有するバイナリー
ベクターである。このｐＢＩ１２１を制限酵素ＳｍａＩ
とＳａｃＩで消化した後、アガロース電気泳動により分
画し、ＮＰＴ ＩＩを含む断片を回収した（図２）。一
方、フェリチンｃＤＮＡをクローニングしたプラスミド
ｐＣＲ ＩＩを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳａｃＩで消
化後、フェリチンｃＤＮＡを含む断片を回収した。そし
て、ＮＰＴ ＩＩを含む断片とフェリチンｃＤＮＡの２
つのＤＮＡ断片をリガーゼにより連結し、新しくバイナ
リーベクターｐＢＧ−１を構築した。このｐＢＧ−１を
導入したアグロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢ
Ａ４４０４株（ＡＴ−ｐＢＧ１と命名）は通産省 工業
技術院 生命工学工業技術研究所 特許微生物寄託セン
ターに１９９６年１月１７日寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ−
１５３９３の受託番号を有する。フェリチンｃＤＮＡを
制御する３５Ｓプロモーターは、植物の遺伝子組換え実
験において最も汎用されているプロモーターであり、発
現量が大きいことと、発現時期や発現する組織の範囲が
広いことで知られている。従って、ｐＢＧ−１を植物へ
導入した場合、３５Ｓプロモーターによりフェリチン遺
伝子は恒常的に発現されることが予測される。さらに、
ｐＢＧ−１はＮＰＴ ＩＩを保持していることから、植
物へｐＢＧ−１が導入された場合、カナマイシンにより
選抜することが可能となる。

【０００９】Ｂ．外来フェリチン遺伝子の植物への導入 前項で調製したＡＴ−ｐＢＧ１（ダイズフェリチンｃＤ
ＮＡを有するプラスミドｐＢＧ−１が導入されたアグロ
バクテリウム菌）を用いて供試植物：レタス（品種：グ
リーンリーフ）またはタバコ（品種：ＳＲ−１）に外来
フェリチン遺伝子をそれぞれ以下のように導入した。 （１）レタス：無菌播種して５日目の供試植物の両端を
切除した子葉をＡＴ−ｐＢＧ１培養懸濁液中に５分間浸
漬させた。そして、余分な懸濁液を濾紙で除去後、ＭＳ
培地（０．１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ，０．１ｍｇ／ｌ Ｂ
Ａ）に置床した。２日後、１００ｍｇ／ｌカナマイシン
と５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含有する培地へ外植
体を継代した。以後、Enomoto らの方法〔Plant Cell R
eports 9: 6-9 (1990)〕に従った。 （２）タバコ：無菌播種後、プラントボックス内で維持
・継代していた供試植物から、約７ｍｍ角のリーフディ
スクを切り出した。次に、ＡＴ−ｐＢＧ１培養懸濁液の
濃度が約ＯＤ５９５＝１になるように培地で希釈し、リ
ーフディスクをその中に２分間、浸漬させた。遺伝子導
入後、形質転換された幼植物体の選抜には１００ｍｇ／
ｌカナマイシンを用いた。選抜された幼植物体を外気に
順化させた後、隔離温室内で育成した。各々の植物にお
ける外来ＤＮＡの存在はＰＣＲ法により確認した。ま
た、生長した植物は自家受粉させ、後代の種子を得た。
また、ｐＢＧ−１において、フェリチンｃＤＮＡのＴＰ
（Transit Peptide ）をコードしている部分を除いたプ
ラスミドｐＢＧ−２を作成し、タバコへ導入し、次世代
の種子を得た。なお、レタス植物のコントロールとして
カナマイシンを含まない培地に播種した非形質転換体
を、タバコ植物のコントロールとしてプラスミドｐＢＩ
−１２１を導入した形質転換体を用いた。

【００１０】Ｃ．遺伝子の存在と発現の確認 形質転換体にどのくらい遺伝子が導入されたかを明らか
にするために、サザン分析を行った。改良したShure ら
(1983)の方法を用い、葉から全ＤＮＡを抽出し、該ＤＮ
Ａ１０ｍｇを制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ
によって完全消化した。次に消化後のＤＮＡを１％アガ
ロースゲルで電気泳動を行った。次にナイロン膜（商品
名：Hybond N+ ）にブロットし、ジゴキシゲニンで標識
したフェリチンｃＤＮＡでハイブリダイズした。ハイブ
リダイズと検出はEngler-Blum ら(1993)の方法に準拠し
た。ナイロン膜をＸ線フィルム上で約１２時間感光させ
た。次に、遺伝子の発現をウエスタンブロットで確認し
た。まず、葉０．１ｇを１．５ｍｌ遠心チューブに入
れ、抽出緩衝液〔８０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７）〕，
２％ＳＤＳ，２％２−ＭＥおよび２０％グリセロール〕
中ですばやく破砕し、タンパク質を抽出した。タンパク
質の濃度はBradfordの方法に基づく測定試薬（商品名：
Protein assay kit ，米国バイオラッド社）で測定し
た。抽出液を３分間沸騰水中に入れ、熱によるサブユニ
ットへの分解を行った後、１２０００ｒｐｍ、１０分間
遠心した。そして上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
電気泳動後、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）
膜へ転写した。免疫学的検出はMatsudaira (1987) の方
法に従った。抗体はダイズフェリチンｃＤＮＡを組み込
んだ大腸菌からフェリチンサブユニットを抽出し、ウサ
ギへ免疫した抗血清を用いた。フェリチンの検出にはビ
オチン化したペルオキシダーゼで修飾した抗ウサギＩｇ
Ｇ抗体を使用し（商品名：ABC kit,米国ベクター・ラボ
ラトリー社）、基質にはイムノステインＨＲＰ−１００
０（コニカ社）を用いた。これらの実験の結果、形質転
換体には少なくとも１〜２コピーの完全な長さの外来フ
ェリチン遺伝子がゲノム内に組み込まれ、それが後代に
遺伝していること、および導入遺伝子由来のペプチドが
発現されていることが確認された。

【００１１】Ｄ．生長量の測定方法 Ｄ．１ レタスの生長量測定方法 ３５粒の種子（Ｔ１世代）を有機物や植物生長調節剤を
含まないＭＳ培地へ置床した。ただし、２００ｍｇ／ｌ
カナマイシンを形質転換体の種子を置床した培地にのみ
加えた。２週間後、未発芽や、発芽勢が著しく悪い個体
を除き、実生の生重量を測定した。次に、播種後３週間
に各系統の１０個体を１／５０００ａのワグネルポット
に移植し、温室で育成した。水は自動給水とした。約３
ヵ月後、各個体の体長を３回測定して、その平均を体長
とした。それぞれの個体はそのまま育成し、自家受粉
後、後代（Ｔ２世代）を得た。それらの種子５０粒を合
計した重量を５回測定した。 Ｄ．２ タバコの生長量測定方法 形質転換タバコ後代の種子５０粒を４００ｐｐｍカナマ
イシンを含有するＭＳ培地に播種して、１６時間明条件
で栽培し、３週間後に、生き残った個体の生重量を測定
した。また、１／５希釈したアンチホルミンで消毒した
種子５０粒を２００ｐｐｍカナマイシンおよび３％ショ
糖を含有するＭＳ培地に播種して、暗黒条件下で３週間
静置し、生き残った個体の生重量を測定した。 Ｄ．３ 光合成速度測定方法 １分間の単位面積当たりの光合成速度を播種後８週間経
過した個体の成葉を用いて測定した。各系統５個体を測
定の１時間前に実験室に移動させ、環境に順化させた。
光合成速度は以下に示す条件下３回測定した：光量子密
度（２００ｍｍｏｌ ｍ^-2ｓ^-1）、相対湿度（３０
％）、室温（２５℃）。

【００１２】Ｅ．生育量の測定結果 Ｅ．１ レタスの生長量 図３に各系統（横軸に数字で示す；Ｃはコントロール，
以下の図４〜６でも同様）の播種後２週間目の生重量を
示す（図中、カッコ内は測定個体数、＊＊は１％の有意
差が認められたことを示し、各結果の上部の縦線は標準
誤差である）。カナマイシンに耐性を示した形質転換レ
タス（系統Ｎｏ．６以外）の発芽勢は、カナマイシンを
含まない培地に播種した非形質転換レタス（Ｃ；コント
ロール）よりも勝っており、その生育量は最大の系統
（系統Ｎｏ．５）でコントロールの１．４倍であった。
これらのレタスを鉢に植え替え、３ヵ月後に高さを測定
した結果を図４に示す（測定個体数はコントロールおよ
び各系統いずれも各１０であり、＊および＊＊はそれぞ
れ５％および１％の有意差が認められたことを示し、各
結果の上部の縦線は標準誤差である）。発芽勢で有意差
があった系統のうち、Ｎｏ．３以外は引続きコントロー
ルと有意差が認められた。最も生育が良かった系統Ｎ
ｏ．５は９１ｃｍであり、コントロール（５６ｃｍ）に
比べ３０ｃｍ以上高かった。また、形質転換体には花芽
が形成されていたが、コントロールでは観察されなかっ
た。生育が旺盛になるという傾向は、次世代（Ｔ２）の
種子重量にも観察された（図５；測定個体数はコントロ
ールおよび各系統いずれも各５０であり、＊＊は１％の
有意差が認められたことを示し、各結果の上部の縦線は
標準誤差である）。すなわち、ほとんどの系統でコント
ロールに比べ種子の重量は大きかった。生育量が増加す
るためには、通常よりも多くのエネルギーを必要とする
はずである。そこで、生育量の増加機構を探るために光
合成速度を測定した。その結果、形質転換体の光合成速
度はコントロールの１．５〜１．８倍であった（図６；
測定個体数はコントロールおよび各系統いずれも各５で
あり、＊は５％の有意差が認められたことを示し、各結
果の上部の縦線は標準誤差である）。このように、ほと
んどの形質転換レタス後代の生長量はコントロールより
大きく、それが、生長初期から、３ヵ月後の花芽形成期
に及んでいた。また、次世代の種子重量もコントロール
より大きかった。さらに、それらの事実を裏付けるよう
に、形質転換体における光合成速度も向上していた。 Ｅ．２ タバコの生長量 図７に１６時間明条件（明所）で３週間栽培した後の各
系統の生重量を示す（図中、カッコ内は測定個体数、各
結果の上部の縦線は標準誤差である）。コントロール
（Ｎｏ．１〜３）と比較して、ｐＢＧ−１を導入した全
ての形質転換体（Ｎｏ．７〜１０）の生重量は増加して
いた。ＴＰを最初から除くように構築したプラスミドｐ
ＢＧ−２を導入した系統（Ｎｏ．４〜６）においても同
様な結果であった。次に、この生育量の増加が光による
何らかの効果によるのかを調べるために、暗所で発芽試
験を行った結果を図８に示す（図中、カッコ内は測定個
体数、各結果の上部の縦線は標準誤差である）。暗所に
おいても、コントロール（Ｎｏ．１）に比べて、ｐＢＧ
−１を導入した形質転換体（Ｎｏ．９）およびｐＢＧ−
２を導入した形質転換体（Ｎｏ．４）の生重量は大きか
った。ここで、明所と暗所の発芽の重量を比較すると、
コントロールも形質転換体も暗所の場合の方が低下して
おり、その減少の割合はコントロールとｐＢＧ−１導入
タバコでは約３０％、ｐＢＧ−２導入タバコでは約６０
％であった。

【００１３】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明は、
外来フェリチン遺伝子を植物に導入することにより植物
の生長量を増加させることを初めて見出したものであ
る。換言すれば、本発明は分子育種法により、植物の生
重量や伸長量等を顕著に増加させることを可能としたも
のである。従って、本発明の方法によれば、単位面積あ
たりのレタス等の植物の収量を増加させたり、またより
短期間により多くの収量を得ることができる。また、本
発明は、レタスやミツバ等の水耕栽培に適する植物に容
易に適用できるため、野菜工場における野菜品種の育成
に効果的である。このように、本発明は、無農薬、完
熟、新鮮等の種々の特徴を有する野菜工場での栽培のた
めの専用品種の開発に極めて有効である。さらに、本発
明の方法は、水耕栽培を主とする野菜工場のみならず、
土地耕栽培にも適用可能であることはいうまでもない。
特に、フェリチンは鉄の貯蔵と共に、植物体外の一過性
の鉄の増加や現象に対する解毒作用ともいうべき緩衝作
用があることが報告されているので、本発明の方法は植
物の生育量を増加させる他に、従来では作付けが不可能
とされている、土壌中に鉄分の少ない地域や逆に過剰な
地域においても、本発明のフェリチン遺伝子が組み込ま
れた植物は生育可能であり、栽培可能であるという利点
も併有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例において使用されるダイズフェ
リチンｃＤＮＡ、およびそれから予測されるアミノ酸配
列と既知配列との相同性を示す図面である。（Ａ）：本
実施例で得られたダイズフェリチンｃＤＮＡの塩基配
列。タンパク質への翻訳シグナル配列（ＡＴＧ，ＴＧＡ
の太文字で表記）を有する。全長７８０ｂｐ。（Ｂ）：
塩基配列から予測されるアミノ酸配列（上段）と既知ダ
イズフェリチンのアミノ酸配列（下段）。＊は同じアミ
ノ酸、・は類似のアミノ酸を示す。

【図２】本発明の実施例において使用される外来フェリ
チン遺伝子を導入するためのベクターｐＢＧ−１の構築
を示す図面である（Ａｍｐ＋：アンピシリン耐性遺伝
子，ＮＰＴ ＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子，３５Ｓプ
ロモーター，ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼ遺伝子，Ｎ
ｏｓＴ：ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター）。

【図３】本発明の実施例において行われた播種後２週間
目のレタスの生重量の比較の結果を示すグラフである。

【図４】本発明の実施例において行われた播種後３ヵ月
目のレタスの生長量の比較の結果を示すグラフである。

【図５】本発明の実施例において得られたレタスのＴ２
世代の種子重量を各系統で比較して示すグラフである。

【図６】本発明の実施例において行われたレタスの光合
成速度の比較の結果を示すグラフである。

【図７】本発明の実施例における明所で栽培されたタバ
コの生重量の比較の結果を示すグラフである。

【図８】本発明の実施例における暗所で栽培されたタバ
コの生重量の比較の結果を示すグラフである。

フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD06 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD09 CD13 CD14 CD21 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA04 FA02 FA07 FA10 GA11 GA17 4B065 AA88Y AA89X AB01 AC14 BA02 CA24 CA53 4H045 AA10 AA30 BA10 BA63 CA33 EA05 FA72 FA74 HA07

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 外来フェリチン遺伝子を植物に導入する
   ことにより植物の生長量を増加させる方法。