JP2002508968A - ポリケチドおよびその合成 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ローディングモジュールおよび複数の伸長モジュールを具備する伸長されたポリケチドシンターゼ遺伝子アセンブリーであって、少なくとも一つの伸長モジュールを含む第二の核酸部分が、ローディングモジュールおよび少なくとも一つ、好ましくは複数の伸長モジュールをコードする第一の核酸部分の中に挿入されている伸長されたポリケチドシンターゼ遺伝子アセンブリーを提供する。このような伸長された遺伝子は、天然物よりもサイズの大きい新規なマクロライドの製造、例えば、14員環マクロライドの代わりに16員環マクロライド類を製造するために有用である。
Description
【０００１】 本発明は、組換え合成によって新規なポリケチド類、特に16員環マクロライド
を調製するための方法、およびこのようにして製造された新規なポリケチド類に
関する。異なるポリケチド生合成遺伝子クラスターに由来し得るポリケチド生合
成遺伝子またはその一部を操作して、16員環マクロライド類のような予測された
構造の、特定の新規ポリケチドの製造を可能にする。特に、本発明は天然物より
もサイズの大きいマクロライド、例えば、14員環マクロライドの代わりに16員環
マクロライドを製造するために追加の遺伝子を組込むことに関する。
を調製するための方法、およびこのようにして製造された新規なポリケチド類に
関する。異なるポリケチド生合成遺伝子クラスターに由来し得るポリケチド生合
成遺伝子またはその一部を操作して、16員環マクロライド類のような予測された
構造の、特定の新規ポリケチドの製造を可能にする。特に、本発明は天然物より
もサイズの大きいマクロライド、例えば、14員環マクロライドの代わりに16員環
マクロライドを製造するために追加の遺伝子を組込むことに関する。
【０００２】 ポリケチドは構造的に多様な大きな分類の天然物であり、抗菌性または他の薬
理学的性質を有する多くの化合物、例えばエリスロマイシン、テトラサイクリン
、ラパマイシン(rapamycin)、アベルメクチン(avermectin)およびＦＫ５０６が 含まれる。特に、ポリケチド類はストレプトミセス属および関連の放線菌によっ
て豊富に産生される。それらは、脂肪酸の生合成に類似した方法で、アシルチオ
エステル類の反復した段階的な縮合により合成される。天然のポリケチド類に見
られる大きな構造的多様性は、通常は「出発」ユニットまたは「伸長」ユニット
としてアセテートまたはプロピオネートを選択することにより生じ；また夫々の
縮合後に観察されるβ-ケト基の程度の異なるプロセッシングにより生じる。プ ロセッシング工程の例には、β-ヒドロキシアシル-への還元、還元後の2-エノイ
ル-への脱水、および飽和アシルチオエステルへの完全な還元が含まれる。また 、これらプロセッシング工程の立体化学的結果は、鎖延長の各サイクルについて
特定される。
理学的性質を有する多くの化合物、例えばエリスロマイシン、テトラサイクリン
、ラパマイシン(rapamycin)、アベルメクチン(avermectin)およびＦＫ５０６が 含まれる。特に、ポリケチド類はストレプトミセス属および関連の放線菌によっ
て豊富に産生される。それらは、脂肪酸の生合成に類似した方法で、アシルチオ
エステル類の反復した段階的な縮合により合成される。天然のポリケチド類に見
られる大きな構造的多様性は、通常は「出発」ユニットまたは「伸長」ユニット
としてアセテートまたはプロピオネートを選択することにより生じ；また夫々の
縮合後に観察されるβ-ケト基の程度の異なるプロセッシングにより生じる。プ ロセッシング工程の例には、β-ヒドロキシアシル-への還元、還元後の2-エノイ
ル-への脱水、および飽和アシルチオエステルへの完全な還元が含まれる。また 、これらプロセッシング工程の立体化学的結果は、鎖延長の各サイクルについて
特定される。
【０００３】 ポリケチド類の生合成は、ポリケチドシンターゼとして知られる一群の鎖形成
酵素によって開始される。二つの種類のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）が、放
線菌において記述されている。一つの種類はＩ型ＰＫＳと称されるものであり、
マクロライドであるエリスロマイシン、アベルメクチンおよびラパマイシン（図
１）のためのＰＫＳに代表され、ポリケチド鎖延長の各サイクルのための異なっ
た組または「モジュール」の酵素からなっている（図２）（Cortex, J. et al.,
Nature (1990) 348:176-178; Donadio, S. et al., Science (1991) 252:675-6
79; MacNeil. D. J. et al., Gene (1992) 115:119-125; Schweke, T. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci USA (1995) 92:7839-7843）。
酵素によって開始される。二つの種類のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）が、放
線菌において記述されている。一つの種類はＩ型ＰＫＳと称されるものであり、
マクロライドであるエリスロマイシン、アベルメクチンおよびラパマイシン（図
１）のためのＰＫＳに代表され、ポリケチド鎖延長の各サイクルのための異なっ
た組または「モジュール」の酵素からなっている（図２）（Cortex, J. et al.,
Nature (1990) 348:176-178; Donadio, S. et al., Science (1991) 252:675-6
79; MacNeil. D. J. et al., Gene (1992) 115:119-125; Schweke, T. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci USA (1995) 92:7839-7843）。
【０００４】 ここで用いる「天然モジュール」の用語は、β-ケトアシル-ＡＣＰシンターゼ
（「ＫＳ」）遺伝子から次のアシルキャリアタンパク質（「ＡＣＰ」）遺伝子ま
での連続的ドメインを意味し、これはポリケチド鎖伸長の一つのサイクルを達成
する。「組合わせモジュール」の用語は、第一の天然モジュールにおける第一の
点から、第二の天然モジュールにおける第二の等価な点まで伸びる連続的ドメイ
ン（およびドメイン部分）の何れかの基を意味するために使用される。この第一
および第二の点は、一般的には全てのモジュールに存在するコアドメイン、即ち
、夫々のＫＳ、ＡＴ（アシルトランスフェラーゼ）またはＡＣＰドメインの等価
な点の両方の中にあるであろう。
（「ＫＳ」）遺伝子から次のアシルキャリアタンパク質（「ＡＣＰ」）遺伝子ま
での連続的ドメインを意味し、これはポリケチド鎖伸長の一つのサイクルを達成
する。「組合わせモジュール」の用語は、第一の天然モジュールにおける第一の
点から、第二の天然モジュールにおける第二の等価な点まで伸びる連続的ドメイ
ン（およびドメイン部分）の何れかの基を意味するために使用される。この第一
および第二の点は、一般的には全てのモジュールに存在するコアドメイン、即ち
、夫々のＫＳ、ＡＴ（アシルトランスフェラーゼ）またはＡＣＰドメインの等価
な点の両方の中にあるであろう。
【０００５】 エリスロマイシンの生合成の場合、鎖放出チオエステラーゼ／サイクラーゼ活
性を含む、エリスロマイシン産生ＰＫＳの酵素ドメインの遺伝子加工を用いた特
異的再配置により、形成されるポリケチドの長さが変化した（Cortes, J et al.
, Science (1995) 268:1487-1489; Kao, C.M. et al., J.Am.Chem. Soc. (1995)
117:9105-9106）。
性を含む、エリスロマイシン産生ＰＫＳの酵素ドメインの遺伝子加工を用いた特
異的再配置により、形成されるポリケチドの長さが変化した（Cortes, J et al.
, Science (1995) 268:1487-1489; Kao, C.M. et al., J.Am.Chem. Soc. (1995)
117:9105-9106）。
【０００６】 エリスロマイシン産生ＰＫＳ（6-デオキシエリスロノリドＢシンターゼ；ＤＥ
ＢＳとしても知られる）のモジュール５における、ケトレダクターゼドメインの
一部をコードするＤＮＡのインフレーム欠失は、エリスロマイシン類縁体である
5,6-ジデオキシ-3-α-ミカロシル-5-オキソエリスロノリドＢ、5,6-ジデオキシ-
5-オキソエリスロノリドＢ、および5,6-ジデオキシ-6,6-βエポキシ-5-オキソエ
リスロノリドＢの形成に導くことが示された（Donadio, S. et al., Science, (
1991) 252:675-679）。同様に、対応するＰＫＳをコードするＤＮＡの遺伝子加 工およびそのサッカロポリスポラ・エリスラエ(saccharopolyspora erythraea) への導入により、ＤＥＢＳのモジュール４のエノイルレダクターゼドメインにお
ける活性部位残基を変更することにより、6,7-アンヒドロエリスロマイシンＣの
産生が導かれる（Donadio S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:
7119-7123）。
ＢＳとしても知られる）のモジュール５における、ケトレダクターゼドメインの
一部をコードするＤＮＡのインフレーム欠失は、エリスロマイシン類縁体である
5,6-ジデオキシ-3-α-ミカロシル-5-オキソエリスロノリドＢ、5,6-ジデオキシ-
5-オキソエリスロノリドＢ、および5,6-ジデオキシ-6,6-βエポキシ-5-オキソエ
リスロノリドＢの形成に導くことが示された（Donadio, S. et al., Science, (
1991) 252:675-679）。同様に、対応するＰＫＳをコードするＤＮＡの遺伝子加 工およびそのサッカロポリスポラ・エリスラエ(saccharopolyspora erythraea) への導入により、ＤＥＢＳのモジュール４のエノイルレダクターゼドメインにお
ける活性部位残基を変更することにより、6,7-アンヒドロエリスロマイシンＣの
産生が導かれる（Donadio S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:
7119-7123）。
【０００７】 国際特許出願番号WO/13663は、改変されたポリケチドを産生できるＤＥＢＳ遺
伝子のもう一つの遺伝子操作を記載している。しかし、多くのこのような試みは
、非生産的であったことが報告されている（Hutchinson C. R. and Fujii, I. A
nnu. Rev. Microbiol. (1995) 49:201-238, at p.231）。
伝子のもう一つの遺伝子操作を記載している。しかし、多くのこのような試みは
、非生産的であったことが報告されている（Hutchinson C. R. and Fujii, I. A
nnu. Rev. Microbiol. (1995) 49:201-238, at p.231）。
【０００８】 マクロ環免疫抑制ポリケチドであるラパマイシンの生合成を支配する、モジュ
ール１型ＰＫＳをコードするストレプトミセス・ヒグロスコピクス(Streptomyce
s hygroscopicus)由来の完全なＤＮＡ配列が開示されている（Schwecke, T. et
al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843）。このＤＮＡ配列は、
受付番号X86780の下にEMBL/Genebankデータベースに寄託されている。
ール１型ＰＫＳをコードするストレプトミセス・ヒグロスコピクス(Streptomyce
s hygroscopicus)由来の完全なＤＮＡ配列が開示されている（Schwecke, T. et
al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843）。このＤＮＡ配列は、
受付番号X86780の下にEMBL/Genebankデータベースに寄託されている。
【０００９】 II型ＰＫＳと称する第二の分類のＰＫＳは、芳香族化合物のためのシンターゼ
によって代表される。II型ＰＫＳ類は鎖伸長のための一組の酵素活性のみを含ん
でおり、連続したサイクルにおいて適切に再使用される（Bibb, M.J. et al., E
MBO J. (1998) 8:2727-2736; Sherman, D.H. et al., EMBO J. (1989) 8:2717-2
725; Fernandez-Moreno, M.A. et al., J. Biol. Chem. (1992) 267:19278-1929
0）。II型ＰＫＳ類のための「伸長」ユニットは通常はアセテートユニットであ り、また特異的サイクラーゼの存在によって、完全な鎖の芳香族生成物への環化
のための優先的経路を指令する（Hutchinson, C.R. and Fujii, I., Annu. Rev.
Microbiol. (1995) 49:201-238）。クローン化されたII型ＰＫＳ遺伝子を含む ＤＮＡを異なるII型ＰＫＳ遺伝子クラスターを含む他の株に導入すること、例え
ば、アクチノロージン(actinorhodin)、即ち、ストレプトミセス・コエリカラー
(Streptomyces coelicolor)由来の青色ポリケチドの遺伝子クラスターから誘導 されたＤＮＡをストレプトミセス・ガリレウス(Streptomyces galileus)のアン トラキノンポリケチド産生株に導入することによって、混成ポリケチド類が得ら
れている（Bartel, P.L. et al., J. Bacteriol. (1990) 172:4816-4826）。
によって代表される。II型ＰＫＳ類は鎖伸長のための一組の酵素活性のみを含ん
でおり、連続したサイクルにおいて適切に再使用される（Bibb, M.J. et al., E
MBO J. (1998) 8:2727-2736; Sherman, D.H. et al., EMBO J. (1989) 8:2717-2
725; Fernandez-Moreno, M.A. et al., J. Biol. Chem. (1992) 267:19278-1929
0）。II型ＰＫＳ類のための「伸長」ユニットは通常はアセテートユニットであ り、また特異的サイクラーゼの存在によって、完全な鎖の芳香族生成物への環化
のための優先的経路を指令する（Hutchinson, C.R. and Fujii, I., Annu. Rev.
Microbiol. (1995) 49:201-238）。クローン化されたII型ＰＫＳ遺伝子を含む ＤＮＡを異なるII型ＰＫＳ遺伝子クラスターを含む他の株に導入すること、例え
ば、アクチノロージン(actinorhodin)、即ち、ストレプトミセス・コエリカラー
(Streptomyces coelicolor)由来の青色ポリケチドの遺伝子クラスターから誘導 されたＤＮＡをストレプトミセス・ガリレウス(Streptomyces galileus)のアン トラキノンポリケチド産生株に導入することによって、混成ポリケチド類が得ら
れている（Bartel, P.L. et al., J. Bacteriol. (1990) 172:4816-4826）。
【００１０】 国際特許出願WO 95/548号は、アクチノロージンＰＫＳ遺伝子を他のII型ＰＫ Ｓクラスター類由来の異種ＤＮＡで置換して、混成ポリケチド類を得ることを記
載している。同じ国際特許出願WO 95/548号は、天然のアクチノロージン遺伝子 クラスタを実質的に欠失しているストレプトミセス・コエリカラー株の構築、お
よび該株において、ストレプトミセス・コエリカラーから単離された低複製数プ
ラスミドベクターＳＣＰ２★（Bibb, M.J. and Hopwood, D.S., J. Gen. Microb
iol. (1981) 126:427）由来のプラスミドベクターｐＲＭ５を使用して、アクチ ノロージン遺伝子クラスターの多様なact I/act IIIプロモータ領域の制御下で 異種ＰＫＳを含むＤＮＡが発現され得ること（Fernandez-Moreno, M.A., et al.
J. Biol. Chem. (1992) 267:19278-19290）を記載している。このプラスミドｐ
ＲＭ５はまた、特定のアクチベータタンパク質、即ちAct II-orf4の遺伝子をコ ードするアクチノロージン生合成遺伝子クラスター由来のＤＮＡを含んでいる。
このAct II-orf4タンパク質は、act I/act III二方向性プロモータの制御下に置
かれた遺伝子の転写のために必要とされ、また菌糸体における成長相から静止相
への遷移期の際の発現を活性化する（Hallam, S.E. et al., Gene (1988) 74:30
5-320）。
載している。同じ国際特許出願WO 95/548号は、天然のアクチノロージン遺伝子 クラスタを実質的に欠失しているストレプトミセス・コエリカラー株の構築、お
よび該株において、ストレプトミセス・コエリカラーから単離された低複製数プ
ラスミドベクターＳＣＰ２★（Bibb, M.J. and Hopwood, D.S., J. Gen. Microb
iol. (1981) 126:427）由来のプラスミドベクターｐＲＭ５を使用して、アクチ ノロージン遺伝子クラスターの多様なact I/act IIIプロモータ領域の制御下で 異種ＰＫＳを含むＤＮＡが発現され得ること（Fernandez-Moreno, M.A., et al.
J. Biol. Chem. (1992) 267:19278-19290）を記載している。このプラスミドｐ
ＲＭ５はまた、特定のアクチベータタンパク質、即ちAct II-orf4の遺伝子をコ ードするアクチノロージン生合成遺伝子クラスター由来のＤＮＡを含んでいる。
このAct II-orf4タンパク質は、act I/act III二方向性プロモータの制御下に置
かれた遺伝子の転写のために必要とされ、また菌糸体における成長相から静止相
への遷移期の際の発現を活性化する（Hallam, S.E. et al., Gene (1988) 74:30
5-320）。
【００１１】 II型ＰＫＳクラスタは、経路特異的なアクチベータ遺伝子によって活性される
ことが知られており（Narva, K.E. and Feitelson, J.S., J. Bacteriol. (1990
) 172:326- 333; Stutzman-Engwall, K. J. et al., J. Bacteriol (1992) 174:
144-154; Frenandez-Moreno, M. et al., Cell (1991) 66:769-780; Takano, E.
et al., Mol. Microbiol. (1992) 7:837-845; Takano, E. et al., Mol. Micro
biol (1992) 6:2797-2804）、その遺伝子産物は特定のプロモータからの転写の ために必要とされる。このアクチベータ遺伝子の遺伝子産物は、該アクチベータ
遺伝子が位置するＰＫＳ遺伝子クラスターのプロモータにおける特定のＤＮＡ配
列に結合することによって作用すると考えられている（Stutzman-Engwall, K. J
. et al., J. Bacteriol (1992) 174:144-154; Takano, E. et al., Mol. Micro
biol. (1992) 7:837-845）。Dnrl遺伝子産物はＳ.コエリカラーのactII-orf4遺 伝子における突然変異を補完し、Dnrlタンパク質およびActII-orf4タンパク質が
同じ標的に対して作用することを示唆する。マクロライドポリケチドであるスピ
ラマイシンのためのI型ＰＫＳ遺伝子付近に位置する遺伝子（srmR）が記載され ている（EP 0 524 832 A2）。この遺伝子は、マクロライドポリケチドであるス ピラマイシンの産生を特異的に活性化するが、このような遺伝子の他の例は発見
されていない。また、I型ＰＫＳ遺伝子に作用するActII-orf4/DnrI/RedD科アク チベータの同族体は未だ記載されていない。
ことが知られており（Narva, K.E. and Feitelson, J.S., J. Bacteriol. (1990
) 172:326- 333; Stutzman-Engwall, K. J. et al., J. Bacteriol (1992) 174:
144-154; Frenandez-Moreno, M. et al., Cell (1991) 66:769-780; Takano, E.
et al., Mol. Microbiol. (1992) 7:837-845; Takano, E. et al., Mol. Micro
biol (1992) 6:2797-2804）、その遺伝子産物は特定のプロモータからの転写の ために必要とされる。このアクチベータ遺伝子の遺伝子産物は、該アクチベータ
遺伝子が位置するＰＫＳ遺伝子クラスターのプロモータにおける特定のＤＮＡ配
列に結合することによって作用すると考えられている（Stutzman-Engwall, K. J
. et al., J. Bacteriol (1992) 174:144-154; Takano, E. et al., Mol. Micro
biol. (1992) 7:837-845）。Dnrl遺伝子産物はＳ.コエリカラーのactII-orf4遺 伝子における突然変異を補完し、Dnrlタンパク質およびActII-orf4タンパク質が
同じ標的に対して作用することを示唆する。マクロライドポリケチドであるスピ
ラマイシンのためのI型ＰＫＳ遺伝子付近に位置する遺伝子（srmR）が記載され ている（EP 0 524 832 A2）。この遺伝子は、マクロライドポリケチドであるス ピラマイシンの産生を特異的に活性化するが、このような遺伝子の他の例は発見
されていない。また、I型ＰＫＳ遺伝子に作用するActII-orf4/DnrI/RedD科アク チベータの同族体は未だ記載されていない。
【００１２】 多くの治療的に重要なポリケチドが同定されているが、向上した特性を有し、
または完全に新規な生物活性を有する新規なポリケチド類を得ることの必要性が
未だ存在している。モジュール形のI型ＰＫＳ類によって産生される複雑なポリ ケチド類は、それらが駆虫剤、殺虫剤、免疫抑制剤、抗真菌剤、または抗菌剤と
して公知の有用性をもった化合物を含む点において特に価値がある。このような
新規なポリケチド類は、それらの構造的な複雑さのために、完全化学合成または
公知のポリケチド類の化学修飾では容易に得ることはできない。
または完全に新規な生物活性を有する新規なポリケチド類を得ることの必要性が
未だ存在している。モジュール形のI型ＰＫＳ類によって産生される複雑なポリ ケチド類は、それらが駆虫剤、殺虫剤、免疫抑制剤、抗真菌剤、または抗菌剤と
して公知の有用性をもった化合物を含む点において特に価値がある。このような
新規なポリケチド類は、それらの構造的な複雑さのために、完全化学合成または
公知のポリケチド類の化学修飾では容易に得ることはできない。
【００１３】 また、構築される混成ＰＫＳ遺伝子の全部または大部分が機能し得、且つ所望
のポリケチド産物を産生するように個々の分子を実際に配置するための、信頼性
があり且つ特異的な方法を開発する必要性が存在してる。
のポリケチド産物を産生するように個々の分子を実際に配置するための、信頼性
があり且つ特異的な方法を開発する必要性が存在してる。
【００１４】 継続中の国際特許出願PCT/GB97/01819号は、ＰＫＳ遺伝子アセンブリー（特に
I型）が、ロードモジュール(loading module)（その後に少なくとも一つの伸長 モジュールが続く）をコードすることを開示している。従って、図２ａはDEBS遺
伝子の構成を示している。第一のオープンリーディングフレームは第一のマルチ
酵素またはカセット（DEBS1）をコードし、これは三つのモジュール、即ち、ロ ードモジュール（ery-ロード）および二つの伸長モジュール（モジュール１およ
び２）からなる。該ロードモジュールは、アシルトランスフェラーゼおよびアシ
ルキャリアタンパク質を含んでいる。これは、WO93/13663（上記で参照したもの
）の図１と対比される。これは、ＯＲＦ１が二つのモジュールのみからなり、そ
の第一のモジュールは、実際にはローディングモジュールおよび第一の伸長モジ
ュールであることを示している。
I型）が、ロードモジュール(loading module)（その後に少なくとも一つの伸長 モジュールが続く）をコードすることを開示している。従って、図２ａはDEBS遺
伝子の構成を示している。第一のオープンリーディングフレームは第一のマルチ
酵素またはカセット（DEBS1）をコードし、これは三つのモジュール、即ち、ロ ードモジュール（ery-ロード）および二つの伸長モジュール（モジュール１およ
び２）からなる。該ロードモジュールは、アシルトランスフェラーゼおよびアシ
ルキャリアタンパク質を含んでいる。これは、WO93/13663（上記で参照したもの
）の図１と対比される。これは、ＯＲＦ１が二つのモジュールのみからなり、そ
の第一のモジュールは、実際にはローディングモジュールおよび第一の伸長モジ
ュールであることを示している。
【００１５】 PCT/GB97/01819は、一般に、ローディングモジュールおよび少なくとも一つの
伸長モジュールを含む混成ＰＫＳ遺伝子アセンブリーの製造を記載している。し
かし、それは天然のＰＫＳアセンブリーに存在する数よりも多い追加モジュール
が付加されたＰＫＳ遺伝子アセンブリー製造の具体的な開示を含んでいない。
伸長モジュールを含む混成ＰＫＳ遺伝子アセンブリーの製造を記載している。し
かし、それは天然のＰＫＳアセンブリーに存在する数よりも多い追加モジュール
が付加されたＰＫＳ遺伝子アセンブリー製造の具体的な開示を含んでいない。
【００１６】 Marsden, A.F.A. et al., Science (1998) Vol 279 5348:199-202は、正常な ローディングモジュールの代わりに、アベルメクチン産生ポリケチドシンターゼ
の特異性の広いローディングモジュールをエリスロマイシンＰＫＳの第一の多重
酵素成分（DEBS1）に移植することによって、混成ＰＫＳ遺伝子アセンブリーを 構築することを記載している。一定の新規ポリケチドは、この混成ＰＫＳ遺伝子
アセンブリーを使用して製造することができる。
の特異性の広いローディングモジュールをエリスロマイシンＰＫＳの第一の多重
酵素成分（DEBS1）に移植することによって、混成ＰＫＳ遺伝子アセンブリーを 構築することを記載している。一定の新規ポリケチドは、この混成ＰＫＳ遺伝子
アセンブリーを使用して製造することができる。
【００１７】 Katz. L., Chem. Rev. (1997) 7:2557-2575は、ポリケチド鎖の長さがモジュ ールを除去または追加によって変更できると述べているが、ＰＫＳ鎖の短縮を生
じるモジュールの除去のみを開示している。今回、ＰＫＳ遺伝子アセンブリーに
モジュールを追加することができ、これら延長されたアセンブリーは、より長い
鎖を有するポリケチドを製造するために首尾よく使用できることが見出された。
じるモジュールの除去のみを開示している。今回、ＰＫＳ遺伝子アセンブリーに
モジュールを追加することができ、これら延長されたアセンブリーは、より長い
鎖を有するポリケチドを製造するために首尾よく使用できることが見出された。
【００１８】 一つの側面において、本発明は、一つのローディングモジュールおよび複数の
伸長モジュールを含む伸長されたＰＫＳ遺伝子アセンブリーの製造であって、前
記ローディングモジュールおよび少なくとも一つ、好ましくは複数の伸長モジュ
ールをコードする第一の核酸部分に、少なくとも一つの伸長モジュールをコード
する第二の核酸部分を挿入することによる製造に関する。一般に、前記核酸はＤ
ＮＡである。
伸長モジュールを含む伸長されたＰＫＳ遺伝子アセンブリーの製造であって、前
記ローディングモジュールおよび少なくとも一つ、好ましくは複数の伸長モジュ
ールをコードする第一の核酸部分に、少なくとも一つの伸長モジュールをコード
する第二の核酸部分を挿入することによる製造に関する。一般に、前記核酸はＤ
ＮＡである。
【００１９】 好ましくは、伸長されたＰＫＳ遺伝子は、一つのローディングモジュールおよ
び2〜7の伸長モジュールをコードする。適切には、前記第一の部分はローディン
グモジュールおよび1〜6の伸長モジュール並びに鎖停止酵素（一般にはチオエス
テラーゼ）をコードし、前記第二の部分は一つの伸長モジュールをコードする。
び2〜7の伸長モジュールをコードする。適切には、前記第一の部分はローディン
グモジュールおよび1〜6の伸長モジュール並びに鎖停止酵素（一般にはチオエス
テラーゼ）をコードし、前記第二の部分は一つの伸長モジュールをコードする。
【００２０】 好ましくは、ＰＫＳ遺伝子はI型ＰＫＳをコードする。
【００２１】 16員環のマクロライドの調製に使用できるＰＫＳアセンブリーを製造するため
に、伸長モジュールを挿入しないときには14員環マクロライドを産生するＰＫＳ
遺伝子アセンブリーの中に、伸長モジュールを挿入するのが特に有用である。こ
の目的のために特に適切なＰＫＳ類は、その全てについて遺伝子およびモジュー
ル組織が少なくとも部分的に知られているエリスロマイシン、ラパマイシン、ア
ベルメクチン、テトロナシン(tetronasin)、オレアンドマイシン(oleandomysin)
、スピロマイシン、チロマイシン(tylomycin)、ＦＫ506、ミデカマイシン(midec
amycin)およびリファマイシン(rifamycin)のためのＰＫＳ類である。
に、伸長モジュールを挿入しないときには14員環マクロライドを産生するＰＫＳ
遺伝子アセンブリーの中に、伸長モジュールを挿入するのが特に有用である。こ
の目的のために特に適切なＰＫＳ類は、その全てについて遺伝子およびモジュー
ル組織が少なくとも部分的に知られているエリスロマイシン、ラパマイシン、ア
ベルメクチン、テトロナシン(tetronasin)、オレアンドマイシン(oleandomysin)
、スピロマイシン、チロマイシン(tylomycin)、ＦＫ506、ミデカマイシン(midec
amycin)およびリファマイシン(rifamycin)のためのＰＫＳ類である。
【００２２】 第一の核酸部分に挿入された伸長モジュール（類）は同種でも異種でもよい。
それらは、同じ起源または異なった起源に由来する天然の配列であることができ
る。例えば、第一の部分はエリスロマイシンＰＫＳのモジュールをコードするこ
とができ、第二の部分はアベルメクチンのような異なったＰＫＳの伸長モジュー
ルをコードすることができる。或いは、第二の部分は修飾された伸長モジュール
をコードしてもよく、これは第一の部分と同じ起源または異なる起源に由来する
天然モジュールの変形バージョンであってもよい。
それらは、同じ起源または異なった起源に由来する天然の配列であることができ
る。例えば、第一の部分はエリスロマイシンＰＫＳのモジュールをコードするこ
とができ、第二の部分はアベルメクチンのような異なったＰＫＳの伸長モジュー
ルをコードすることができる。或いは、第二の部分は修飾された伸長モジュール
をコードしてもよく、これは第一の部分と同じ起源または異なる起源に由来する
天然モジュールの変形バージョンであってもよい。
【００２３】 第二の部分は完全合成のものであってもよく、或いは、例えばスプライシング
により加工された、一以上の異なる起源に由来するＤＮＡを含むモジュールであ
ってもよい。第一の部分は、例えばPCT/GB97/01819号に記載されたようにして製
造される混成ＰＫＳをコードしてもよい。それは、以前の伸長モジュールの挿入
により製造されたものであってもよい。従って、本発明のこの側面は、複数の核
酸配列（夫々の配列は少なくとも一つの伸長モジュールをコードする）を、一つ
のローディングモジュールおよび少なくとも一つの伸長モジュールをコードする
当初の核酸部分に段階的に追加することを包含するものである。適切には、第一
の部分の中にコード化されたローディングモジュールは、例えばストレプトミセ
ス・アベルミチリス(streptomyces avermitilis)のアベルメクチン(avr)-産生Ｐ
ＫＳのローディングモジュールについて；または、例えばその全てがシキメート
誘導開始ユニット(shikimate-derived starter unit)を本来許容するラパマイシ
ン-、ＦＫ506-およびアスコマイシン-産生ＰＫＳ類のローディングモジュールに
対し異常な特異性を有するローディングモジュールについて、緩和された特異性
を示す。
により加工された、一以上の異なる起源に由来するＤＮＡを含むモジュールであ
ってもよい。第一の部分は、例えばPCT/GB97/01819号に記載されたようにして製
造される混成ＰＫＳをコードしてもよい。それは、以前の伸長モジュールの挿入
により製造されたものであってもよい。従って、本発明のこの側面は、複数の核
酸配列（夫々の配列は少なくとも一つの伸長モジュールをコードする）を、一つ
のローディングモジュールおよび少なくとも一つの伸長モジュールをコードする
当初の核酸部分に段階的に追加することを包含するものである。適切には、第一
の部分の中にコード化されたローディングモジュールは、例えばストレプトミセ
ス・アベルミチリス(streptomyces avermitilis)のアベルメクチン(avr)-産生Ｐ
ＫＳのローディングモジュールについて；または、例えばその全てがシキメート
誘導開始ユニット(shikimate-derived starter unit)を本来許容するラパマイシ
ン-、ＦＫ506-およびアスコマイシン-産生ＰＫＳ類のローディングモジュールに
対し異常な特異性を有するローディングモジュールについて、緩和された特異性
を示す。
【００２４】 最も好ましくは、第一の部分における第一および第二の伸長モジュールをコー
ドする核酸の間に、第二の核酸部分が挿入される。或いは、核酸の第二の部分は
、第一の部分における最後の伸長モジュールをコードする核酸と鎖停止酵素をコ
ードする核酸との間に挿入すればよい。
ドする核酸の間に、第二の核酸部分が挿入される。或いは、核酸の第二の部分は
、第一の部分における最後の伸長モジュールをコードする核酸と鎖停止酵素をコ
ードする核酸との間に挿入すればよい。
【００２５】 遺伝子アセンブリーの末端は変更されてもよい。従って、ＰＫＳの正常な鎖停
止酵素（通常はチオエステラーゼ）は、異なったタイプの生成物に導く酵素によ
って置き換えることができる。例えば、ポリケチド鎖をアミノ酸（または可能で
あればアミノ酸鎖）に結合するラパマイシン系由来の酵素を使用することができ
る。後者は、ポリペプチド／ポリケチドの組合せ、例えばβ-ラクタム誘導体を 製造するために使用することができる。
止酵素（通常はチオエステラーゼ）は、異なったタイプの生成物に導く酵素によ
って置き換えることができる。例えば、ポリケチド鎖をアミノ酸（または可能で
あればアミノ酸鎖）に結合するラパマイシン系由来の酵素を使用することができ
る。後者は、ポリペプチド／ポリケチドの組合せ、例えばβ-ラクタム誘導体を 製造するために使用することができる。
【００２６】 本発明のこの側面は、ＰＫＳ遺伝子モジュールを組立てブロックとして処理し
、また追加のブロックを現存のアセンブリーに挿入することに大きく関わってい
る。モジュール間の結合を形成および破壊するための正しい場所は、モジュール
の間の連結領域であると思われ、先に報告した限定的なタンパク質分解を使用し
た実験により、これらのリンカー（連結領域）がタンパク質の表面にあることが
示されている（Aparicio, F.F. et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:8524-8528
; Staunton J. et al., (1996) Nature Structure Biol. 3:188-192）。しかし 、場合によっては、実際には当該ドメイン（酵素をコードする部分）のエッジに
近接した該ドメイン内において、切断および結合することが好ましいことが見出
された。ここでのＤＮＡは全てのモジュール型ＰＫＳの間で高度に保存されてお
り、これは転写され得る新規な伸長されたＰＫＳアセンブリーを構築するための
補助になり得る。
、また追加のブロックを現存のアセンブリーに挿入することに大きく関わってい
る。モジュール間の結合を形成および破壊するための正しい場所は、モジュール
の間の連結領域であると思われ、先に報告した限定的なタンパク質分解を使用し
た実験により、これらのリンカー（連結領域）がタンパク質の表面にあることが
示されている（Aparicio, F.F. et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:8524-8528
; Staunton J. et al., (1996) Nature Structure Biol. 3:188-192）。しかし 、場合によっては、実際には当該ドメイン（酵素をコードする部分）のエッジに
近接した該ドメイン内において、切断および結合することが好ましいことが見出
された。ここでのＤＮＡは全てのモジュール型ＰＫＳの間で高度に保存されてお
り、これは転写され得る新規な伸長されたＰＫＳアセンブリーを構築するための
補助になり得る。
【００２７】 本発明は更に、このような伸長されたＰＫＳアセンブリー、このような遺伝子
アセンブリーを含むベクター、およびこれらを発現できる形質転換体生物を提供
する。形質転換体生物は組換えプラスミドを含んでいてもよく、または該プラス
ミドは一体化されてもよい。int配列をもったプラスミドは、宿主染色体の特定 の結合部位（att）の中に組込まれるであろう。形質転換体生物は、例えばエリ スロマイシン（図２に示すもの）および他のポリケチド類の産生において普通の
生合成的修飾の全てまたは幾つかを行うことにより、最初の生成物を修飾するこ
とができる。一以上の「天然の」水酸基または糖基を含まない生成物を製造する
ために、正常な経路の幾つかがブロックされるような突然変異体生物を使用して
もよい。本発明は更に、形質転換体生物によって直接的または間接的に産生され
得る新規なポリケチド類を提供する。（これは酵素的修飾を経たポリケチド類を
含む）。
アセンブリーを含むベクター、およびこれらを発現できる形質転換体生物を提供
する。形質転換体生物は組換えプラスミドを含んでいてもよく、または該プラス
ミドは一体化されてもよい。int配列をもったプラスミドは、宿主染色体の特定 の結合部位（att）の中に組込まれるであろう。形質転換体生物は、例えばエリ スロマイシン（図２に示すもの）および他のポリケチド類の産生において普通の
生合成的修飾の全てまたは幾つかを行うことにより、最初の生成物を修飾するこ
とができる。一以上の「天然の」水酸基または糖基を含まない生成物を製造する
ために、正常な経路の幾つかがブロックされるような突然変異体生物を使用して
もよい。本発明は更に、形質転換体生物によって直接的または間接的に産生され
得る新規なポリケチド類を提供する。（これは酵素的修飾を経たポリケチド類を
含む）。
【００２８】 更なる側面において、本発明は上記の側面により得られる新規なポリケチド類
を提供する。これらには、エリスロマイシン（並びにその類縁体および他の誘導
体）のような本来は14員環として存在するポリケチド類の、伸長された同族体で
ある16員環マクロライドが含まれる。チロシン(tylosin)およびロキタマイシン(
rokitamycin)（またはロキタマイシンのロイコマイシンA5前駆体）類縁体のよう
な、公知の16員環マクロライド類の新規な誘導体もまた、本来は14員環マクロラ
イドを産生するＰＫＳアセンブリーに伸長モジュールを追加することによって製
造される。これらは、下記の点において、対応する「天然の」化合物とは異なる
： ａ）一以上のケチド単位の酸化状態（即ち、-CO-、-CH(OH)-、=CH-、および
-CH2-の群からの一つの選択）、ここで、何れかの-CH(OH)-の立体化学もまた独 立に選択可能である；または ｂ）「天然の」メチル側鎖が存在しないこと；または ｃ）「天然の」メチル；および／またはメチル以外の環置換基の立体化学。
を提供する。これらには、エリスロマイシン（並びにその類縁体および他の誘導
体）のような本来は14員環として存在するポリケチド類の、伸長された同族体で
ある16員環マクロライドが含まれる。チロシン(tylosin)およびロキタマイシン(
rokitamycin)（またはロキタマイシンのロイコマイシンA5前駆体）類縁体のよう
な、公知の16員環マクロライド類の新規な誘導体もまた、本来は14員環マクロラ
イドを産生するＰＫＳアセンブリーに伸長モジュールを追加することによって製
造される。これらは、下記の点において、対応する「天然の」化合物とは異なる
： ａ）一以上のケチド単位の酸化状態（即ち、-CO-、-CH(OH)-、=CH-、および
-CH2-の群からの一つの選択）、ここで、何れかの-CH(OH)-の立体化学もまた独 立に選択可能である；または ｂ）「天然の」メチル側鎖が存在しないこと；または ｃ）「天然の」メチル；および／またはメチル以外の環置換基の立体化学。
【００２９】 上記(a)〜(c)の二以上の項目において同定された天然物とは相違するチロシン
(tylosin)およびロキタマイシン(rokitamycin)（特にロキタマイシンのロイコマ
イシンA5前駆体）のような、16員環マクロライド類の類縁体を調製することも可
能である。
(tylosin)およびロキタマイシン(rokitamycin)（特にロキタマイシンのロイコマ
イシンA5前駆体）のような、16員環マクロライド類の類縁体を調製することも可
能である。
【００３０】 また、上記チロシンおよびロキタマイシン（またはロイコマイシンA5）につい
て提案されているような追加の修飾を有する、エリスロマイシン以外のポリケチ
ド類のより長い同族体を製造することもできる。このような長い同族体が製造さ
れ得るポリケチド類の例には、ラパマイシン、アベルメクチン、テトロナシン、
オレアンドマイシン、モネンシン、アンホテリシン(amphotericin)およびリファ
マイシンが含まれる。
て提案されているような追加の修飾を有する、エリスロマイシン以外のポリケチ
ド類のより長い同族体を製造することもできる。このような長い同族体が製造さ
れ得るポリケチド類の例には、ラパマイシン、アベルメクチン、テトロナシン、
オレアンドマイシン、モネンシン、アンホテリシン(amphotericin)およびリファ
マイシンが含まれる。
【００３１】 ラクトン類、ヘミケタール類、ケタール類、ラクタム類またはラクトール類の
形成により環化されたポリケチド類（または融合体）のように、ケチド／非ケチ
ドの融合体を調製してもよい。
形成により環化されたポリケチド類（または融合体）のように、ケチド／非ケチ
ドの融合体を調製してもよい。
【００３２】 非ＰＫＳ酵素による更なるプロセッシング、例えばヒドロキシル化、エポキシ
化、グリコシル化およびメチル化の一以上を受けた、上記ポリケチド類の何れか
の誘導体を製造してもよい。
化、グリコシル化およびメチル化の一以上を受けた、上記ポリケチド類の何れか
の誘導体を製造してもよい。
【００３３】 本発明による好ましい化合物の例は、式（Ｉ）および（II）の化合物である。
【００３４】
【化３】
【００３５】
【化４】
【００３６】 本発明は、新規な複合ポリケチド類を得る方法；および公知のポリケチド類お
よび新規なポリケチド類の両方を製造する新規な方法を提供する。好ましい実施
例において、本発明は新規な16員環マクロライド類、例えば式（I）および（II ）の化合物、およびこれらの新奇化合物およびロキタマイシン（またはロイコマ
イシンA5）およびチロシンのような高知の化合物の両方を製造する新規な方法を
提供する。本発明の方法により製造され得る他の16員環マクロライド類には、ジ
ョサマイシン(josamycin)、スピラマイシン(spiramycin)、ミオカマイシン(miok
amycin)、ロイコマイシン(leucomycin)およびミデカマイシン(midecamycin)が含
まれる。このような16員環マクロライド類を製造する好ましい方法は、発現され
たときに通常は14員環マクロライドを産生することが期待されるＰＫＳ遺伝子ア
センブリーに、追加の伸長モジュールをコードするDNAを挿入することである。
よび新規なポリケチド類の両方を製造する新規な方法を提供する。好ましい実施
例において、本発明は新規な16員環マクロライド類、例えば式（I）および（II ）の化合物、およびこれらの新奇化合物およびロキタマイシン（またはロイコマ
イシンA5）およびチロシンのような高知の化合物の両方を製造する新規な方法を
提供する。本発明の方法により製造され得る他の16員環マクロライド類には、ジ
ョサマイシン(josamycin)、スピラマイシン(spiramycin)、ミオカマイシン(miok
amycin)、ロイコマイシン(leucomycin)およびミデカマイシン(midecamycin)が含
まれる。このような16員環マクロライド類を製造する好ましい方法は、発現され
たときに通常は14員環マクロライドを産生することが期待されるＰＫＳ遺伝子ア
センブリーに、追加の伸長モジュールをコードするDNAを挿入することである。
【００３７】 16員環マクロライドの範囲を調製できることは、一般にこのような化合物が、
医薬として使用したときに14員環マクロライド類よりも良好な副作用プロファイ
ルを有すると思われるので、特に有用である。
医薬として使用したときに14員環マクロライド類よりも良好な副作用プロファイ
ルを有すると思われるので、特に有用である。
【００３８】 本発明に従って製造された伸長されたＰＫＳアセンブリーの鎖停止酵素は、天
然の環員数を有するマクロライドを製造するように、ポリケチド鎖を環化しやす
いであろう。例えば、追加の伸長モジュールがエリスロマイシンアセンブリーに
挿入される場合は、エリスロマイシンチオエステラーゼがモジュール６によって
追加された基を攻撃して、14員環マクロライドを製造するであろうことが予想さ
れる。しかし、予測に反して、驚くべきことに、伸長されたＰＫＳ遺伝子アセン
ブリーは拡張された環をもったマクロライド類を形成すること、即ち、エリスロ
マイシンの場合は測定可能な量の16員環マクロライドが製造されることが見出さ
れた。これは、伸長されたＰＫＳアセンブリーを用いて、天然のマクロライド類
よりも大きなマクロライド類を製造できることを意味している。例えば、ロキタ
マイシン（またはロイコマイシンA5）類縁体は、修飾されたエリスロマイシン遺
伝子アセンブリーから好都合に製造することができる。
然の環員数を有するマクロライドを製造するように、ポリケチド鎖を環化しやす
いであろう。例えば、追加の伸長モジュールがエリスロマイシンアセンブリーに
挿入される場合は、エリスロマイシンチオエステラーゼがモジュール６によって
追加された基を攻撃して、14員環マクロライドを製造するであろうことが予想さ
れる。しかし、予測に反して、驚くべきことに、伸長されたＰＫＳ遺伝子アセン
ブリーは拡張された環をもったマクロライド類を形成すること、即ち、エリスロ
マイシンの場合は測定可能な量の16員環マクロライドが製造されることが見出さ
れた。これは、伸長されたＰＫＳアセンブリーを用いて、天然のマクロライド類
よりも大きなマクロライド類を製造できることを意味している。例えば、ロキタ
マイシン（またはロイコマイシンA5）類縁体は、修飾されたエリスロマイシン遺
伝子アセンブリーから好都合に製造することができる。
【００３９】 伸長されたＰＫＳ遺伝子の発現に適した適切なプラスミドベクターおよび遺伝
子加工された細胞は、混成PKS I遺伝子の発現に適したものとしてPCT/GB97/0181
0に記載されているものである。効果的な宿主の例は、サッカロポリスポラ・エ リスラエ(Saccharopolyspora erythraea)、ストレプトミセス・コエリカラー(St
reptomyces coelicolor)、ストレプトミセス・アベルミチリス(Streptomyces av
ermitilis)、ストレプトミセス・グリセオフスクス(Streptomyces griseofuscus
)、ストレプトミセス・シンナモネンシス(Streptomyces cinnamonensis)、ミク ロモノスポラ・グリセオルビダ(Micromonospora griseorubida)、ストレプトミ セス・ヒグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)、ストレプトミセス・フ
ラディアエ(Streptomyces fradiae)、ストレプトミセス・ロンギスポロフラブス
(Streptomyces longisporoflavus)、ストレプトミセス・ラサリエンシス(Strept
omyces lasaliensis)、ストレプトミセス・ツクバエンシス(Streptomyces tsuku
baensis)、ストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、ストレプト
ミセス・ベネズエラエ(Streptomyces venezuelae)、ストレプトミセス・アンチ ビオチクス(Streptomyces antibioticus)、ストレプトミセス・リビダンス(Stre
ptomyces lividans)、ストレプトミセス・リモスス(Streptomyces rimosus)、ス
トレプトミセス・アルブス(Streptomyces albus)である。これらには、その中で
ＳＣＰ２★誘導プラスミドベクター自動的に複製されることが知られているＳ．
コエリカラー、Ｓ．アベルミチリスおよびＳ．グリセオフスクスのような宿主；
およびサッカロポリスポラ・エリスラエアのような、ＳＣＰ２★誘導プラスミド
ベクターが挿入されたプラスミド上の配列と染色体上の配列との間の相同組換え
によって染色体中に組込まれる他の宿主；および自殺プラスミドベクターによっ
て完全に形質変換される全ての宿主が含まれる。
子加工された細胞は、混成PKS I遺伝子の発現に適したものとしてPCT/GB97/0181
0に記載されているものである。効果的な宿主の例は、サッカロポリスポラ・エ リスラエ(Saccharopolyspora erythraea)、ストレプトミセス・コエリカラー(St
reptomyces coelicolor)、ストレプトミセス・アベルミチリス(Streptomyces av
ermitilis)、ストレプトミセス・グリセオフスクス(Streptomyces griseofuscus
)、ストレプトミセス・シンナモネンシス(Streptomyces cinnamonensis)、ミク ロモノスポラ・グリセオルビダ(Micromonospora griseorubida)、ストレプトミ セス・ヒグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)、ストレプトミセス・フ
ラディアエ(Streptomyces fradiae)、ストレプトミセス・ロンギスポロフラブス
(Streptomyces longisporoflavus)、ストレプトミセス・ラサリエンシス(Strept
omyces lasaliensis)、ストレプトミセス・ツクバエンシス(Streptomyces tsuku
baensis)、ストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、ストレプト
ミセス・ベネズエラエ(Streptomyces venezuelae)、ストレプトミセス・アンチ ビオチクス(Streptomyces antibioticus)、ストレプトミセス・リビダンス(Stre
ptomyces lividans)、ストレプトミセス・リモスス(Streptomyces rimosus)、ス
トレプトミセス・アルブス(Streptomyces albus)である。これらには、その中で
ＳＣＰ２★誘導プラスミドベクター自動的に複製されることが知られているＳ．
コエリカラー、Ｓ．アベルミチリスおよびＳ．グリセオフスクスのような宿主；
およびサッカロポリスポラ・エリスラエアのような、ＳＣＰ２★誘導プラスミド
ベクターが挿入されたプラスミド上の配列と染色体上の配列との間の相同組換え
によって染色体中に組込まれる他の宿主；および自殺プラスミドベクターによっ
て完全に形質変換される全ての宿主が含まれる。
【００４０】 本発明の更なる側面では、「ドナー」ＰＫＳ・ＤＮＡを含むプラスミドを、該
プラスミドがバクテリア染色体上のアクセプターＰＫＳ遺伝子アセンブリーの中
に組込まれて伸長されたＰＫＳを生じる条件下で、宿主細胞の中に導入する。好
ましい実施例は、ドナーＰＫＳ・ＤＮＡが伸長モジュールをコードする切片を含
む場合である。
プラスミドがバクテリア染色体上のアクセプターＰＫＳ遺伝子アセンブリーの中
に組込まれて伸長されたＰＫＳを生じる条件下で、宿主細胞の中に導入する。好
ましい実施例は、ドナーＰＫＳ・ＤＮＡが伸長モジュールをコードする切片を含
む場合である。
【００４１】 次に、添付の図面を参照して本発明の幾つかの実施例を説明する。
【００４２】 以下、幾つかの実施例により本発明を例示するが、これは本発明を限定するも
のではない。
のではない。
【００４３】 実施例１：組換えベクターｐＣＪＲ５４の構築 PCT/GB97/01819に記載したようにして、プラスミドｐＣＪＲ２４を調製した。
制限消化、キナーゼ末端ポリッシングおよび再連結技術を用いて、ｐＣＪＲ２４
からＳｓｅ８３８７１ポリリンカーを取り除き、プラスミドｐＣＪＲ２４−Ｓを
得た。
制限消化、キナーゼ末端ポリッシングおよび再連結技術を用いて、ｐＣＪＲ２４
からＳｓｅ８３８７１ポリリンカーを取り除き、プラスミドｐＣＪＲ２４−Ｓを
得た。
【００４４】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）戦略を用いることにより、遺伝子をコードす
るＤＥＢＳ１−ＴＥの６１２０塩基対の位置にＳｓｅ８３８７１制限部位を創出
した。この部位を創出する塩基変化は、何れのアミノ酸にも突然変異を引き起こ
さなかった。
るＤＥＢＳ１−ＴＥの６１２０塩基対の位置にＳｓｅ８３８７１制限部位を創出
した。この部位を創出する塩基変化は、何れのアミノ酸にも突然変異を引き起こ
さなかった。
【００４５】 Ｓｓｅ８３８７１部位を含む遺伝子をコードするＤＥＢＳ１−ＴＥをＰＣＪＲ
２４−Ｓに導入し、プラスミドｐｌＢ１０３を得た。
２４−Ｓに導入し、プラスミドｐｌＢ１０３を得た。
【００４６】 制限消化により、Ｓｓｅ８３８７１フラグメントとしてラパマイシンモジュー
ル２を分離した。ＰＣＲを用いて導入部位のＤＮＡ塩基配列を変化させたところ
、何れのアミノ酸にも突然変異を引き起こさなかった。ラパマイシンモジュール
２はｒａｐＡ遺伝子の開始点から9900塩基対におけるアミノ酸配列（ＡＣＲ）か
ら、ｒａｐＡの開始点から14633塩基対におけるＡＣＲまでを含んでいた。
ル２を分離した。ＰＣＲを用いて導入部位のＤＮＡ塩基配列を変化させたところ
、何れのアミノ酸にも突然変異を引き起こさなかった。ラパマイシンモジュール
２はｒａｐＡ遺伝子の開始点から9900塩基対におけるアミノ酸配列（ＡＣＲ）か
ら、ｒａｐＡの開始点から14633塩基対におけるＡＣＲまでを含んでいた。
【００４７】 修飾したラパマイシンモジュール２を含む4763塩基対の得られたＤＮＡフラグ
メントを、Ｓｓｅ８３８７１フラグメントとしてＳｓｅ８３８７１切断ｐｌＢ１
０３に挿入し、ｐＣＪＲ５４を得た。
メントを、Ｓｓｅ８３８７１フラグメントとしてＳｓｅ８３８７１切断ｐｌＢ１
０３に挿入し、ｐＣＪＲ５４を得た。
【００４８】 実施例２：Ｓ．エリスレア(S.erythraea)ＮＲＲＬ２３３８／no.５／ｐＣＪＲ
５４の構築 相同的組換えにより、Ｓ．エリスレア(S.erythraea)をｐＣＪＲ５４で形質転 換した（Ｓ．エリスレア(S.erythraea)の形質転換はPCT/GB97/01819に記載され る）。適切な組込み体の選択は、チオストレプトン耐性クローンの選択で確認さ
れた。１つのクローン（no.6）を選択した。エリスロマイシンアグリコンをグリ
コシル化できないという理由でＳ．エリスレア(S.erythraea)ＮＲＲＬ２３３８ ／No.５を選択した。
５４の構築 相同的組換えにより、Ｓ．エリスレア(S.erythraea)をｐＣＪＲ５４で形質転 換した（Ｓ．エリスレア(S.erythraea)の形質転換はPCT/GB97/01819に記載され る）。適切な組込み体の選択は、チオストレプトン耐性クローンの選択で確認さ
れた。１つのクローン（no.6）を選択した。エリスロマイシンアグリコンをグリ
コシル化できないという理由でＳ．エリスレア(S.erythraea)ＮＲＲＬ２３３８ ／No.５を選択した。
【００４９】 実施例３：Ｓ．エリスレア(S.erythraea)ＮＲＲＬ２３３８／no.５／ｐＣＪＲ
５４／６を用いたポリケチドの生産 ｐＣＪＲ５４／no．５／６株の凍結懸濁液を、250ｍｌコニカルフラスコ中で ＳＶ２培地50ｍｌに接種した。ＳＶ２は脱イオン水１リットルにつき、グルコー
ス 15ｇ、グリセロール 15ｇ、大豆ペプトン 15ｇ、ＮａＣｌ 3ｇ、ＣａＣＯ3 1
ｇを含んでいた。オートクレーブ処理の前に、ｐＨを7.0に調節した。接種前に 、濃度5μｇ ｍＬ-1になるようにチオストレプトンを添加した。この培養液を25
0ｒｐｍ、28℃において、3日間振とうし、それからそれを用いて生産用培地ＳＭ
３に接種した。生産用培地は脱イオン水１リットルにつき、グルコース 5ｇ、マ
ルトデキストリン（グルシデックス） 50ｇ、ソヤフロアー（アルカソイ） 25ｇ
、ビート糖蜜 3ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 0.25ｇ、ＣａＣＯ3 2.5ｇを含んでいた。オート
クレーブ処理の前に、ｐＨを7.0に調節した。接種前に、濃度5μｇになるように
チオストレプトンを添加した。種培養をＳＭ３300ｍＬを含む７つの２リットル フローレンス(florence)フラスコに接種した（2％容量／容量）。250ｒｐｍ、28
℃にて、7日間振とう、採取した。発酵液（２Ｌ）を4500ｒｐｍで遠心分離した 。デカンテーションにより細胞と上澄みを分離し、上澄みのｐＨを9.5に調節し た。得られた溶液を酢酸エチル（２Ｌ）で抽出した。酢酸エチル層を取り除き、
減圧乾燥して、オイル1.297ｇを得た。
５４／６を用いたポリケチドの生産 ｐＣＪＲ５４／no．５／６株の凍結懸濁液を、250ｍｌコニカルフラスコ中で ＳＶ２培地50ｍｌに接種した。ＳＶ２は脱イオン水１リットルにつき、グルコー
ス 15ｇ、グリセロール 15ｇ、大豆ペプトン 15ｇ、ＮａＣｌ 3ｇ、ＣａＣＯ3 1
ｇを含んでいた。オートクレーブ処理の前に、ｐＨを7.0に調節した。接種前に 、濃度5μｇ ｍＬ-1になるようにチオストレプトンを添加した。この培養液を25
0ｒｐｍ、28℃において、3日間振とうし、それからそれを用いて生産用培地ＳＭ
３に接種した。生産用培地は脱イオン水１リットルにつき、グルコース 5ｇ、マ
ルトデキストリン（グルシデックス） 50ｇ、ソヤフロアー（アルカソイ） 25ｇ
、ビート糖蜜 3ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 0.25ｇ、ＣａＣＯ3 2.5ｇを含んでいた。オート
クレーブ処理の前に、ｐＨを7.0に調節した。接種前に、濃度5μｇになるように
チオストレプトンを添加した。種培養をＳＭ３300ｍＬを含む７つの２リットル フローレンス(florence)フラスコに接種した（2％容量／容量）。250ｒｐｍ、28
℃にて、7日間振とう、採取した。発酵液（２Ｌ）を4500ｒｐｍで遠心分離した 。デカンテーションにより細胞と上澄みを分離し、上澄みのｐＨを9.5に調節し た。得られた溶液を酢酸エチル（２Ｌ）で抽出した。酢酸エチル層を取り除き、
減圧乾燥して、オイル1.297ｇを得た。
【００５０】 酢酸エチル（0.4ｍＬ）、メタノール（0.8ｍＬ）、10ｍＭ酢酸アンモニウム（
1.2ｍＬ）およびＣＨ3ＣＮ：20ｍＭ酢酸アンモニウム（80：20）（0.8ｍＬ）を そのオイルに加え、得られた溶液を以下の設定条件を用いて分取用ＨＰＬＣを行
った： カラム：５ミクロンハイパーシル(Hypersil)Ｃ18 ＢＤＳ（15ｃｍ×内径2.5ｃ
ｍ）と連続して接続した７ミクロンクロマシル(Kromasil)Ｃ８（6ｃｍ×内径2.5
ｃｍ） 移動相：Ａ．10ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ．ＣＨ3ＣＮ：20ｍＭ酢酸アンモニ ウム（80：20）
1.2ｍＬ）およびＣＨ3ＣＮ：20ｍＭ酢酸アンモニウム（80：20）（0.8ｍＬ）を そのオイルに加え、得られた溶液を以下の設定条件を用いて分取用ＨＰＬＣを行
った： カラム：５ミクロンハイパーシル(Hypersil)Ｃ18 ＢＤＳ（15ｃｍ×内径2.5ｃ
ｍ）と連続して接続した７ミクロンクロマシル(Kromasil)Ｃ８（6ｃｍ×内径2.5
ｃｍ） 移動相：Ａ．10ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ．ＣＨ3ＣＮ：20ｍＭ酢酸アンモニ ウム（80：20）
【００５１】 グラジエントプログラム 時間（分） ％Ｂ 流速（ｍＬ／分） ０ ０ ２０ １ ０ ２０ ６０ ７５ ２０
【００５２】 溶出液を210ｎｍにおけるＵＶスペクトル分析にてモニターし、それぞれ溶液1
.8ｍＬ（上述の通りに調製される）中、２回連続して分離操作を行った。フラク
ションを0.5分間隔で集め（10ｍＬ容量）、マススペクトル（−ｖｅＡＰＣｌ） 分析を行った。 （構造式（Ｉ）を有する化合物の単離） 上記分取用分離において保持時間48〜50.5分の間に溶出する質量(mass)430の 化合物を含むフラクションを混合し、窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除いた。 その水溶液をiso-elut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）（インターナショ
ナル ソルベント テクノロジー(International Sorbent Technology)）。そのカ
ートリッジを蒸留水で洗浄し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発(ce
ntrifugal evaporation)によりＭｅＯＨを取り除き、固体（1.5ｍｇ）を単離し た。これは構造式（Ｉ）を有する化合物と同定された。
.8ｍＬ（上述の通りに調製される）中、２回連続して分離操作を行った。フラク
ションを0.5分間隔で集め（10ｍＬ容量）、マススペクトル（−ｖｅＡＰＣｌ） 分析を行った。 （構造式（Ｉ）を有する化合物の単離） 上記分取用分離において保持時間48〜50.5分の間に溶出する質量(mass)430の 化合物を含むフラクションを混合し、窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除いた。 その水溶液をiso-elut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）（インターナショ
ナル ソルベント テクノロジー(International Sorbent Technology)）。そのカ
ートリッジを蒸留水で洗浄し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発(ce
ntrifugal evaporation)によりＭｅＯＨを取り除き、固体（1.5ｍｇ）を単離し た。これは構造式（Ｉ）を有する化合物と同定された。
【００５３】 約323°Ｋにおける重ジメチルスルホキシド(hexadeutero dimethyl sulphoxid
e)溶液の500ＭＨｚプロトンＮＭＲスペクトルは以下のおおよその値を中心とす るピークを示す[δ値、括弧内は多重度、カップリング定数（Ｈｚ）および積分 値]： 0.75(d,6.5,3H)、0.93(d,6.5,3H)、2.21(m,1H)、2.74(m,1H)、3.44(dd,10.5,2,1
H)、3.55(t,9.5,1H)、3.85(dd,10.5,3.5,1H)、3.93(dd,9,2,1H)、4.74(m,1H)。 （構造式（II）を有する化合物の単離） 最初の分取用分離において保持時間43.5〜45分の間に溶出する質量(mass)416 の化合物を含むフラクションを混合し、窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除いた 。その水溶液をiso-elut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）。そのカートリ
ッジを蒸留水で洗浄し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発によりＭ ｅＯＨを取り除き、固体（117.5ｍｇ）を回収した。その固体をＭｅＯＨ（0.9ｍ
Ｌ）、10ｍＭ酢酸アンモニウム（0.6ｍＬ）に溶解し、この溶液を以下に記載の 条件を用いて分取用ＨＰＬＣを行った。 カラム 5ミクロンハイパーシル(Hypersil)Ｃ１８ ＢＤＳ（15ｃｍ×内径2.5ｃ ｍ） 移動相 上述の通り グラジエントプログラム 上述の通り 溶出液を210ｎｍにおけるＵＶスペクトル分析にてモニターし、フラクション を0.5分間隔で集め（10ｍＬ容量）、マススペクトル（−ｖｅＡＰＣｌ）分析を 行った。保持時間38.5〜40分の間に溶出する質量(mass)416の化合物を含むフラ クションを混合した。窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除き、その水溶液をiso-e
lut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）。そのカートリッジを蒸留水で洗浄 し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発によりＭｅＯＨを取り除き、 固体（1.5ｍｇ）を単離した。これは構造式（II）を有する化合物と同定された 。
e)溶液の500ＭＨｚプロトンＮＭＲスペクトルは以下のおおよその値を中心とす るピークを示す[δ値、括弧内は多重度、カップリング定数（Ｈｚ）および積分 値]： 0.75(d,6.5,3H)、0.93(d,6.5,3H)、2.21(m,1H)、2.74(m,1H)、3.44(dd,10.5,2,1
H)、3.55(t,9.5,1H)、3.85(dd,10.5,3.5,1H)、3.93(dd,9,2,1H)、4.74(m,1H)。 （構造式（II）を有する化合物の単離） 最初の分取用分離において保持時間43.5〜45分の間に溶出する質量(mass)416 の化合物を含むフラクションを混合し、窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除いた 。その水溶液をiso-elut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）。そのカートリ
ッジを蒸留水で洗浄し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発によりＭ ｅＯＨを取り除き、固体（117.5ｍｇ）を回収した。その固体をＭｅＯＨ（0.9ｍ
Ｌ）、10ｍＭ酢酸アンモニウム（0.6ｍＬ）に溶解し、この溶液を以下に記載の 条件を用いて分取用ＨＰＬＣを行った。 カラム 5ミクロンハイパーシル(Hypersil)Ｃ１８ ＢＤＳ（15ｃｍ×内径2.5ｃ ｍ） 移動相 上述の通り グラジエントプログラム 上述の通り 溶出液を210ｎｍにおけるＵＶスペクトル分析にてモニターし、フラクション を0.5分間隔で集め（10ｍＬ容量）、マススペクトル（−ｖｅＡＰＣｌ）分析を 行った。保持時間38.5〜40分の間に溶出する質量(mass)416の化合物を含むフラ クションを混合した。窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除き、その水溶液をiso-e
lut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）。そのカートリッジを蒸留水で洗浄 し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発によりＭｅＯＨを取り除き、 固体（1.5ｍｇ）を単離した。これは構造式（II）を有する化合物と同定された 。
【００５４】 重ジメチルスルホキシド(hexadeutero dimethyl sulphoxide)溶液の500ＭＨｚ
プロトンＮＭＲスペクトルは以下のおおよその値を中心とするピークを示す[δ 値、括弧内は多重度、カップリング定数（Ｈｚ）および積分値]： 0.71(d,6.5,3H)、0.80(d,7,3H)、0.82(d,6.5,3H)、0.90(d,6.5,6H)、0.93(d,7,3
H)、1.07(d,6.5,3H)、1.71(m,1H)、2.22(dq,3.5,7,1H)、3.54(m,1H)、3.88(m,1H
)、3.99(m,1H)、4.75(m,1H)。 （構造式（III）を有する化合物の単離）
プロトンＮＭＲスペクトルは以下のおおよその値を中心とするピークを示す[δ 値、括弧内は多重度、カップリング定数（Ｈｚ）および積分値]： 0.71(d,6.5,3H)、0.80(d,7,3H)、0.82(d,6.5,3H)、0.90(d,6.5,6H)、0.93(d,7,3
H)、1.07(d,6.5,3H)、1.71(m,1H)、2.22(dq,3.5,7,1H)、3.54(m,1H)、3.88(m,1H
)、3.99(m,1H)、4.75(m,1H)。 （構造式（III）を有する化合物の単離）
【化５】
【００５５】 最初の分取用分離において保持時間32.5〜33.5分の間に溶出する質量(mass)41
6の化合物を含むフラクションを混合し、窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除いた
。その水溶液をiso-elut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）。そのカートリ
ッジを蒸留水で洗浄し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発によりＭ ｅＯＨを取り除き、固体（4.1ｍｇ）を単離した。この固体をＤＭＳＯ(0.2ｍＬ)
、ＭｅＯＨ(0.4ｍＬ)および10ｍＭ酢酸アンモニウム(1.0ｍＬ）に溶解し、構造 式（II）を有する化合物を単離するために記載した条件を用いて分取用ＨＰＬＣ
を行った。保持時間29.5〜30.5分の間に溶出する分子量(mass)416の化合物を含 むフラクションを混合し、窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除いた。その水溶液 をiso-elut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）。そのカートリッジを蒸留水
で洗浄し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発によりＭｅＯＨを取り 除き、固体（0.2ｍｇ）を単離した。これは構造式（III）を有する化合物と同定
された。
6の化合物を含むフラクションを混合し、窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除いた
。その水溶液をiso-elut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）。そのカートリ
ッジを蒸留水で洗浄し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発によりＭ ｅＯＨを取り除き、固体（4.1ｍｇ）を単離した。この固体をＤＭＳＯ(0.2ｍＬ)
、ＭｅＯＨ(0.4ｍＬ)および10ｍＭ酢酸アンモニウム(1.0ｍＬ）に溶解し、構造 式（II）を有する化合物を単離するために記載した条件を用いて分取用ＨＰＬＣ
を行った。保持時間29.5〜30.5分の間に溶出する分子量(mass)416の化合物を含 むフラクションを混合し、窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除いた。その水溶液 をiso-elut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）。そのカートリッジを蒸留水
で洗浄し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発によりＭｅＯＨを取り 除き、固体（0.2ｍｇ）を単離した。これは構造式（III）を有する化合物と同定
された。
【００５６】 重ジメチルスルホキシド(hexadeutero dimethyl sulphoxide)溶液の500ＭＨｚ
プロトンＮＭＲスペクトルは以下のおおよその値を中心とするピークを示す[δ 値、括弧内は多重度、カップリング定数（Ｈｚ）および積分値]： 0.82(ddd,5.5,11,14.5,1H)、0.91(d,7,3H)、0.92(d,7,3H)、0.93(d,7,3H)、0.97
(d,6.5,3H)、0.99(d,7,3H)、1.04(d,6,3H)、1.10(d,6.5,3H)、1.49(m,1H)、1.77
(ddd,3.5,6,14.5,1H)、2.58(dq,9.5,6.5,1H)、3.94(m,1H)、5.23(ddd,2,4.5,10,
1H)。
プロトンＮＭＲスペクトルは以下のおおよその値を中心とするピークを示す[δ 値、括弧内は多重度、カップリング定数（Ｈｚ）および積分値]： 0.82(ddd,5.5,11,14.5,1H)、0.91(d,7,3H)、0.92(d,7,3H)、0.93(d,7,3H)、0.97
(d,6.5,3H)、0.99(d,7,3H)、1.04(d,6,3H)、1.10(d,6.5,3H)、1.49(m,1H)、1.77
(ddd,3.5,6,14.5,1H)、2.58(dq,9.5,6.5,1H)、3.94(m,1H)、5.23(ddd,2,4.5,10,
1H)。
【００５７】 （エリスロノリドＢの単離） 最初の分取用分離において保持時間37.5〜38.5分の間に溶出する質量(mass)40
2の化合物を含むフラクションを混合し、窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除いた
。その水溶液をiso-elut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）。そのカートリ
ッジを蒸留水で洗浄し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発によりＭ ｅＯＨを取り除き、固体（17.5ｍｇ）を単離した。これはエリスロノリドＢと同
定された。
2の化合物を含むフラクションを混合し、窒素気流下で、ＣＨ3ＣＮを取り除いた
。その水溶液をiso-elut env+カートリッジに通した（500ｍｇ）。そのカートリ
ッジを蒸留水で洗浄し、ＭｅＯＨ（2.5ｍＬ）で溶出させた。遠心蒸発によりＭ ｅＯＨを取り除き、固体（17.5ｍｇ）を単離した。これはエリスロノリドＢと同
定された。
【００５８】 実施例４：組換えベクターｐｌＢ１２６の構築 プラスミドｐｌＢ１２６を以下の通りに構築した： ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）戦略を用いて、ＤＥＢＳ１−ＴＥ遺伝子の60
63塩基対の位置にＮｈｅｌ制限部位を創出した。その部位の導入により、アミノ
酸がＱＡＡからＱＬＡに変化した。
63塩基対の位置にＮｈｅｌ制限部位を創出した。その部位の導入により、アミノ
酸がＱＡＡからＱＬＡに変化した。
【００５９】 このＮｈｅｌ部位を含むＤＥＢＳ１‐ＴＥ遺伝子をｐＣＪＲ２４に中にクロー
ニングし、ｐｌＢ１１７を得た。
ニングし、ｐｌＢ１１７を得た。
【００６０】 ＤＥＢＳ１−ＴＥ遺伝子由来のＡＣＰ１およびＫＳ２間のリンカー領域におけ
るＮｈｅｌ部位に、ラパマイシンポリケチドシンターゼモジュール５を挿入した
。ラパマイシンモジュール５の片末端にＮｈｅ１を導入するための変更は、ＰＣ
Ｒによって導入された。この結果、モジュールの開始点においてＡＮからＬＡに
、末端ではＲＴからＬＡに、それぞれアミノ酸の変化が生じた。ラパマイシンモ
ジュール５は、ｒａｐＢの開始点から67塩基対の位置（ＡＮ）から4873塩基対の
位置（ＲＴ）までを含んでいた。得られた4854塩基対のフラグメント（片末端に
Ｎｈｅｌ制限部位を伴ったモジュール５を含む）をＮｈｅｌ部位においてｐｌＢ
１１７に挿入して、ｐｌＢ１２６を得た。
るＮｈｅｌ部位に、ラパマイシンポリケチドシンターゼモジュール５を挿入した
。ラパマイシンモジュール５の片末端にＮｈｅ１を導入するための変更は、ＰＣ
Ｒによって導入された。この結果、モジュールの開始点においてＡＮからＬＡに
、末端ではＲＴからＬＡに、それぞれアミノ酸の変化が生じた。ラパマイシンモ
ジュール５は、ｒａｐＢの開始点から67塩基対の位置（ＡＮ）から4873塩基対の
位置（ＲＴ）までを含んでいた。得られた4854塩基対のフラグメント（片末端に
Ｎｈｅｌ制限部位を伴ったモジュール５を含む）をＮｈｅｌ部位においてｐｌＢ
１１７に挿入して、ｐｌＢ１２６を得た。
【００６１】 実施例５：Ｓ．エリスレア(S.erythraea)ＮＲＲＬ２３３８／ｐｌＢ１２６の 構築 Ｓ．エリスレア(S.erythraea)をｐｌＢ１２６で形質転換した。染色体へのプ ラスミドの組込みは、チオストレプトン耐性クローンの選択により確認された。
１つのクローンを選択した。
１つのクローンを選択した。
【００６２】 実施例６：Ｓ．エリスレア(S.erythraea)ＮＲＲＬ２３３８／ｐｌＢ１２６を 用いたポリケチドの生産 Ｓ．エリスレア(S.erythraea)ＮＲＲＬ２３３８／ｐｌＢ１２６の凍結懸濁液 ををチオストレプトン（５μｇ／ｍｌ）を含むＴＳＢ培地に接種した。この種培
養液を250ｒｐｍ、28℃において3日間振とうし、次いでそれを用いて生産用培地
ＳＭ３に接種した。残りの発酵工程は前述の実施例３の通りであった。
養液を250ｒｐｍ、28℃において3日間振とうし、次いでそれを用いて生産用培地
ＳＭ３に接種した。残りの発酵工程は前述の実施例３の通りであった。
【００６３】 Ｓ．エリスレア(S.erythraea)ＮＲＲＬ２３３８／ｐｌＢ１２６の発酵抽出サ ンプルを電子スプレー（ＥＳ）マススペクトル（ＭＳ）により分析し、保持時間
およびイオン質量(masses)により確認した。Ｓ．エリスレア(S.erythraea)ＮＲ ＲＬ２３３８／no．５／ｐＣＪＲ５４／no．６から得られた化合物（I）および 化合物（II）の純粋なサンプルを標品とした。
およびイオン質量(masses)により確認した。Ｓ．エリスレア(S.erythraea)ＮＲ ＲＬ２３３８／no．５／ｐＣＪＲ５４／no．６から得られた化合物（I）および 化合物（II）の純粋なサンプルを標品とした。
【００６４】 ＨＰＬＣ条件： 緩衝液Ａ：10ｍＭ酢酸アンモニウム＋0.1％ギ酸 緩衝液Ｂ：90％アセトニトリル／10％水；10ｍＭ酢酸アンモニウム＋0.07％ギ酸
カラム：ハイパーシル(Hypersil)Ｃ18 ＢＤＳ、3ミクロン、150×4.6ｍｍ 流速：１ｍＬ／分
カラム：ハイパーシル(Hypersil)Ｃ18 ＢＤＳ、3ミクロン、150×4.6ｍｍ 流速：１ｍＬ／分
【００６５】 グラジエント： ０．００分 ９８％Ａ ２％Ｂ ２．００分 ９８％Ａ ２％Ｂ ２０．００分 ２％Ａ ９８％Ｂ ２７．５０分 ２％Ａ ９８％Ｂ ２８．００分 ９８％Ａ ２％Ｂ ３２．００分 ９８％Ａ ２％Ｂ 化合物I：保持時間＝16.35分 化合物II：保持時間＝15.35分
【００６６】 電子スプレー（ＥＳ）マススペクトル（ＭＳ）を＋ｖｅおよび−ｖｅの両モー
ドで実施した。＋ｅｖモードではＭＨ+およびＭＨ+-Ｈ2Ｏ付加生成物としてイオ
ンが観測された。−ｅｖモードでは[Ｍ‐Ｈ]-または[Ｍ（ギ酸塩)]-としてイオ ンが観測された。
ドで実施した。＋ｅｖモードではＭＨ+およびＭＨ+-Ｈ2Ｏ付加生成物としてイオ
ンが観測された。−ｅｖモードでは[Ｍ‐Ｈ]-または[Ｍ（ギ酸塩)]-としてイオ ンが観測された。
【００６７】 本発明は上述の実施例で例示されるが、それらは本発明の範囲を限定するもの
とみなされるべきではない。上述の例示には、追加の伸長モジュールの挿入によ
る伸長されたＩ型ＰＫＳ遺伝子アッセンブリーの構築、および合成中間体または
抗生物質のような生物活性原料として有用な新規ポリケチド生成物を得るための
その使用について、初めて記載されている。新規16員環エリスロマイシン同族体
を得るために、ｅｒｙ ＰＫＳへのｒａｐ伸長モジュールの挿入についてここに 記載してきた。他のＰＫＳ遺伝子セット由来の伸長モジュールがｅｒｙＰＫＳま
たは全く相違するＰＫＳ遺伝子アッセンブリーに挿入可能であるということは本
技術分野における当業者には容易に思いつくであろう。
とみなされるべきではない。上述の例示には、追加の伸長モジュールの挿入によ
る伸長されたＩ型ＰＫＳ遺伝子アッセンブリーの構築、および合成中間体または
抗生物質のような生物活性原料として有用な新規ポリケチド生成物を得るための
その使用について、初めて記載されている。新規16員環エリスロマイシン同族体
を得るために、ｅｒｙ ＰＫＳへのｒａｐ伸長モジュールの挿入についてここに 記載してきた。他のＰＫＳ遺伝子セット由来の伸長モジュールがｅｒｙＰＫＳま
たは全く相違するＰＫＳ遺伝子アッセンブリーに挿入可能であるということは本
技術分野における当業者には容易に思いつくであろう。
【図１】 図１は、高知のポリケチド類の化学式を示している。
【図２ａ】 図２ａは、6-デオキシエリスロノリドシンターゼＢ（DEBS）、即ち、6-デオキ
シエリスロノリドＢ（エリスロマイシンＡの前駆体）を産生するＰＫＳの機能を
示す図である。
シエリスロノリドＢ（エリスロマイシンＡの前駆体）を産生するＰＫＳの機能を
示す図である。
【図２ｂ】 図２ｂは、6-DEBのエリスロマイシンＡへの変換を含むエリスロマイシンのポ ストＰＫＳ生合成を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓ ｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇ ｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａ ｉｎ (72)発明者 スタウントン、ジェームス イギリス国、シービー２・１イーダブリ ュ、ケンブリッジ、レンズフィールド・ロ ード、（番地なし）ユニバーシティ・オ ブ・ケンブリッジ内 (72)発明者 ウィルキンソン、バリー イギリス国、エスジー１・２エヌワイ、ハ ートフォードシャー、スティーブンエイ ジ、ガンネルズ・ウッド・ロード、（番地 なし）グラクソ・ウエルカム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー内 (72)発明者 ロー、クリスティーン・ジャネット イギリス国、シービー２・１ジーエー、ケ ンブリッジ、テニス・コート・ロード、 （番地なし）ユニバーシティ・オブ・ケン ブリッジ内 (72)発明者 ボーム、イネス・ウテ イギリス国、シービー２・１キューピー、 ケンブリッジ、テニス・コート・ロード、 （番地なし）ユニバーシティ・オブ・ケン ブリッジ内 (72)発明者 バス、アントニー・デビッド イギリス国、エスジー１・２エヌワイ、ハ ーツ、スティーブンエイジ、ガンネルズ・ ウッド・ロード、（番地なし）グラクソ・ ウエルカム・パブリック・リミテッド・カ ンパニー内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA80 CA01 DA05 EA04 GA11 GA19 4B065 AA01X AB01 BA02 CA34 CA44 4C071 AA03 BB01 CC12 DD35 EE07 FF18 GG01 HH05 HH09 KK30 LL01
Claims (9)
- 【請求項１】 一つのローディングモジュールおよび複数の伸長モジュール
をコードする核酸を含む伸長されたポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子アセ
ンブリーであって、前記ローディングモジュールおよび少なくとも一つの伸長部
分をコードする第一の核酸部分の中に、少なくとも一つの伸長モジュールをコー
ドする第二の核酸部分が挿入されている伸長されたＰＫＳ遺伝子アセンブリー。 - 【請求項２】 請求項１に記載の伸長されたＰＫＳ遺伝子アセンブリーであ
って、前記第一の核酸部分は、発現されたときに14員環マクロライドを生産する
ために使用できるＰＫＳ遺伝子アセンブリーをコードし、前記伸長されたＰＫＳ
遺伝子アセンブリーは、発現されたときに16員環マクロライドを生産するように
使用することができる伸長されたＰＫＳ遺伝子アセンブリー。 - 【請求項３】 請求項１または請求項２に記載の遺伝子アセンブリーによっ
てコードされる伸長されたＰＫＳ。 - 【請求項４】 請求項１または２に記載の遺伝子または核酸を含むベクター
。 - 【請求項５】 請求項１または２に記載の遺伝子または核酸を含み、且つそ
れによってコードされるポリケチドシンターゼを発現できる形質転換された生物
。 - 【請求項６】 請求項５に記載の生物を培養することにより、ポリケチドを
製造する方法。 - 【請求項７】 請求項６に記載の方法によって製造されるポリケチド。
- 【請求項８】 請求項７に記載のポリケチドであって、16員環マクロライド
であるポリケチド。 - 【請求項９】 下記式Ｉまたは式ＩＩのポリケチド 【化１】 【化２】
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| GBGB9800879.0A GB9800879D0 (en) | 1998-01-15 | 1998-01-15 | Polyketides and their synthesis |
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| PCT/GB1999/000117 WO1999036546A1 (en) | 1998-01-14 | 1999-01-14 | Polyketides and their synthesis |
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-
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-
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