CN108142832A - 一种提高黑纳豆激酶含量和活性的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高黑纳豆激酶含量和活性的制备方法,采用黑豆作为原料,通过菌种培养、黑豆培养基制备、物料烘干温度的控制,在现有生产工艺的基础上,经过改进,在不同原始pH的培养,在一定条件发酵后,分别烘干,修改了种子菌培养基,改变种子培养基成分,依据纳豆菌和黑纳豆酶的固有特性,进行了多种工艺优化,以提高黑纳豆激酶含量和活性,制得的黑纳豆营养成分含量高、易吸收,且生产周期短、成本低,具有很好的经济效益和市场前景。
Description
【技术领域】
本发明涉及豆类发酵制品的深加工领域,尤其是一种提高黑纳豆激酶含量和活性的制备方法。
【背景技术】
纳豆激酶(Natto Kinase,NK)是纳豆(Natto)主要活性成分。常与纳豆中纳豆菌(Bacillus Natto)、黑豆异黄酮、维生素K2一起,共同作用,起到溶栓、排毒、降脂、降压和降低餐后血糖的生理功能。
纳豆是由纳豆芽孢杆菌发酵大豆而成的健康食品。传统制作纳豆是采用稻草作为发酵菌剂的来源,将煮熟的黄豆冷却后用稻草包裹后于温湿度比较高的地方自然发酵1-2天,待大豆表面出现一种白色的黏液状物质即可。目前在日本,纳豆食品生产基本实现了工业化、连续化和商品化。
豆类发酵饮品是以豆浆为主要原料经过乳酸菌发酵而成的类似酸奶产品。因此,利用自身营养成分即可发酵,也可添加非乳糖类糖类物质促进发酵;此外,现今加工工艺生产的豆类发酵饮品还存在各种添加剂,存在着一定的安全隐患。
【发明内容】
本发明提供一种采用黑豆作为原料,无任何添加剂、安全可靠,有效提高黑纳豆激酶含量和活性的制备方法。
为达到上述明目的,采用的技术方案如下:
一种提高黑纳豆激酶含量和活性的制备方法,包括以下步骤:
1)、菌种培养:
1.1.1菌种活化及斜面培养:菌种活化培养基为马铃薯200g/L,胡萝卜200重量份,琼脂20重量份,蛋白胨1.2重量份,葡萄糖21重量份,磷酸二氢钾0.4重量份,硫酸镁0.18重量份,维生素B1少许,接种后菌种活化时间为7-8天;
1.1.2种子菌培养:
1.1.2.1种子菌培养基成分的重量份为:葡萄糖2重量份,黑豆蛋白胨1重量份,Na2HPO4 0.6重量份,NaH2PO4 0.1重量份,MgSO4 0.05重量份,CaCl2 0.02重量份,吐温1重量份;
1.1.2.2种子菌培养基pH调整:自然pH、pH7.0、pH 7.5、pH 8.0;
2)、黑豆培养基制备:
1.2.1黑豆浸泡时间:
精选黑豆浸泡时间视水温而定【如表1】,
表1黑豆浸泡时间
1.2.2浸泡黑豆去种皮处理
纳豆菌耗氧性能强,加之纳豆激酶的合成也需强的耗氧量,因而作为发酵培养基的主要原料的黑豆必须脱除种皮,以免阻碍氧气的供给;同时去种皮后有利于营养物质的运转和转化,实验以浸泡后去种皮的黑豆为发酵培养基;
1.2.3沥水:黑豆一般沥水3~4h,其间间隔翻动;
1.3物料烘干温度的控制
分别在45℃、50℃、55℃和60℃条件下,将发酵后的物料烘干,测定酶活性并记录烘干时间;
1.4、酶活性:
不同原始pH的培养,在一定条件发酵后,分别烘干,酶活力测定结果如表2,
表2不同培养基原始pH在相同条件下发酵烘干,酶活力测定结果
从表2中可见:
(1)当培养基原始pH在7.5-8.0、烘干温度在55℃以下时,酶活力都达到3000U/g以上,烘干时间约30h;当温度升到60℃时酶活力显著下降;
(2)当培养基为自然pH时,无论在何种温度下烘干,酶的活性都明显低于其他各pH的处理;
2.2溶血实验
新鲜鸡血洗净、吸干,分别取0.2g血块和2mL各处理酶液于试管中,以缓冲液为对照,结果均在24h内,达到溶血效果;
2.3不同酶量测定
取培养基原始pH8.0、50℃下烘干黑纳豆,磨粉,研磨提取酶,分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL酶液测定酶活性,结果如表3;
表3,不同酶量的测定结果
从表3可见,随着酶量增加,酶活力增加;
该制备方法修改了种子菌培养基,改变种子培养基成分;(1)、增加了Mg2+、Ca2+等营养元素;(2)、由于种子菌在生长生殖过程中代谢旺盛,培养基pH发生变化,因此,为维持生长最适pH,在培养基中添加了缓冲系统(NaH2PO4~Na2HPO4),营养成分和生存条件的改变有利于培养生长旺盛的种子菌;
改变培养基原始pH,纳豆菌生长的最适pH为7.0~7.5,而产酶的最适pH为7.5~8.0;当培养基原始pH为7.5~8.0时,物料不管在何种温度下烘干,酶活力均较高。
进一步地,在黑豆预处理中,精选黑豆依表1,视水温浸泡,沥干3~4h,干豆和浸泡充分的湿豆比为1∶1.6;然后,除种皮,由于纳豆菌及其发酵产酶好氧均强,种皮阻碍氧、营养和代谢产物的吸收和传递,所有处理都除去了种皮,因而既是在自然pH下,酶活性也大大提高。
本发明的优点:
黑纳豆中纳豆激酶的含量及其活力比纳豆更高。黑纳豆激酶含量和活性,便成了黑纳豆产品质量的重要指标。本发明在原有生产工艺的基础上,依据纳豆菌和黑纳豆酶的固有特性,进行了多种工艺改进,以提高黑纳豆激酶含量和活性。
采用本发明所提供的种子菌培养基并调整其原始为pH7.5~8.0,在55℃以下烘干,酶活性可达2500U/g以上,至于黑豆预处理时浸泡沥干时间也应严格控制,尤其除去种皮更为重要,在酶活性测定时加入5~10mmol/LMg2+作为激活剂。
且取材经济,所涉及的原料都寻常材料,价格也便宜,即方便广大工薪阶级人士自制使用,且选用无副作用的原料,可以坚持食用。特别适合一些中老年人,对于其他人群也非常适用。
本发明使用的发酵设备简单,易操作。
【具体实施方式】
一种提高黑纳豆激酶含量和活性的制备方法,包括以下步骤:
1)、菌种培养:
1.1.1菌种活化及斜面培养:菌种活化培养基为马铃薯200g/L,胡萝卜200重量份,琼脂20重量份,蛋白胨1.2重量份,葡萄糖21重量份,磷酸二氢钾0.4重量份,硫酸镁0.18重量份,维生素B1少许,接种后菌种活化时间为7-8天;
1.1.2种子菌培养:
1.1.2.1种子菌培养基成分的重量份为:葡萄糖2重量份,黑豆蛋白胨1重量份,Na2HPO4 0.6重量份,NaH2PO4 0.1重量份,MgSO4 0.05重量份,CaCl2 0.02重量份,吐温1重量份;
1.1.2.2种子菌培养基pH调整:自然pH(对照组)、pH7.0、pH 7.5、pH 8.0;
2)、黑豆培养基制备:
1.2.1黑豆浸泡时间:
精选黑豆浸泡时间视水温而定【如表1】,
表1黑豆浸泡时间
1.2.2浸泡黑豆去种皮处理
纳豆菌耗氧性能强,加之纳豆激酶的合成也需强的耗氧量,因而作为发酵培养基的主要原料的黑豆必须脱除种皮,以免阻碍氧气的供给;同时去种皮后有利于营养物质的运转和转化,实验以浸泡后去种皮的黑豆为发酵培养基;
1.2.3沥水:黑豆一般沥水3~4h,其间间隔翻动;
1.3物料烘干温度的控制
分别在45℃、50℃、55℃和60℃条件下,将发酵后的物料烘干,测定酶活性并记录烘干时间;
1.4、酶活性:
不同原始pH的培养,在一定条件发酵后,分别烘干,酶活力测定结果如表2.
表2不同培养基原始pH在相同条件下发酵烘干,酶活力测定结果
从表2中可见:
(1)当培养基原始pH在7.5-8.0、烘干温度在55℃以下时,酶活力都达到3000U/g以上,烘干时间约30h;当温度升到60℃时酶活力显著下降;
(2)当培养基为自然pH时,无论在何种温度下烘干,酶的活性都明显低于其他各pH的处理;
2.2溶血实验
新鲜鸡血洗净、吸干,分别取0.2g血块和2mL各处理酶液于试管中,以缓冲液为对照,结果均在24h内,达到溶血效果;
2.3不同酶量测定
取培养基原始pH8.0、50℃下烘干黑纳豆,磨粉,研磨提取酶,分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL酶液测定酶活性,结果如表3;
表3,不同酶量的测定结果
从表3可见,随着酶量增加,酶活力增加;
该制备方法修改了种子菌培养基,改变种子培养基成分;(1)增加了Mg2+、Ca2+等营养元素;(2)由于种子菌在生长生殖过程中代谢旺盛,培养基pH发生变化,因此,为维持生长最适pH,在培养基中添加了缓冲系统(NaH2PO4~Na2HPO4),营养成分和生存条件的改变有利于培养生长旺盛的种子菌;
改变培养基原始pH,纳豆菌生长的最适pH为7.0~7.5,而产酶的最适pH为7.5~8.0;当培养基原始pH为7.5~8.0时,物料不管在何种温度下烘干,酶活力均较高。
另外,在黑豆预处理中,精选黑豆依表1,视水温浸泡,沥干3~4h,干豆和浸泡充分的湿豆比为1∶1.6;然后,除种皮,由于纳豆菌及其发酵产酶好氧均强,种皮阻碍氧、营养和代谢产物的吸收和传递,所有处理都除去了种皮,因而既是在自然pH下,酶活性也大大提高。
同时,黑纳豆蛋白激酶为丝氨酸蛋白,属胰蛋白酶类。该酶受Mg2+激活,因此测定酶活性时加入Mg2+作为激活剂,这也是酶活性较前提高的原因之一。
总之,采用本制备方法所提供的种子菌培养基并调整其原始为pH7.5-8.0在55℃以下烘干,酶活性可达2500U/g以上,至于黑豆预处理时浸泡沥干时间也应严格控制,尤其除去种皮更为重要,在酶活性测定时加入5-10mmol/LMg2+作为激活剂。
酶活性测定方法采用以下步骤:
1.目的:检测纳豆激酶的酶活力。
2.原理与方法:水解酪蛋白法,
纳豆激酶为Ser蛋白酶,属胰蛋白酶类。能水解酪蛋白溶液,使其在275nm波长下光吸收值增加,其增加值与酶活力成正比关系。
酶活力单位定义:在酶活力测定条件,每g纳豆样品(干质量)每分钟在275nm波长下每增加0。001个光吸收单位的酶量为1个酶活力单位(U)。
3.试剂及配制
1)0.1mol/L,pH7.5,磷酸缓冲液(PBS):称取30g Na2HPO4和2。5g NaH2PO4,用蒸馏溶解并定容至1000mL。
2)0.5%酪蛋白溶液:称取0.5g酪蛋白加入一定量上述PBS于40~50℃水浴搅拌溶解,冷却至室温,并以同一种缓冲液定容至100mL。置冰箱保存备用。可连续使用一个月。
3)三氯乙酸水溶液(TCA溶液):分别称取TCA1.798g,2.994gNaAc,1.9mLHAc,用蒸馏水溶解并定容至100mL.即为(0.11,0.22,0.33mol/L)TCA溶液。
4)纳豆粗酶液:取适量的纳豆粉末,加入一定量上述PBS。搅拌下提取1h,离心(10000r/min,室温10min),收集上清夜,残渣重复提取一次,合伴上清液,即为粗酶液。
4.操作步骤
取0.1mL粗酶液加入上述PBS0.9mL,于37℃水浴中保温恒定,加入同样保温的1mL酪蛋白溶液,摇匀,立即准确反应10min,其间间歇摇匀。再加入2mLTCA溶液,摇匀,以终止酶反应。于室温静置10min,离心(或过滤),取上清液,待测。对照先加TCA溶液,后加酪蛋白溶液,其余同上。
以对照溶液调零,在275nm波长下,测定光吸值。
5.结果计算
依下式计算酶活力:
酶活力单位(U/mL)=(A275/0.001)×(1/10)×(1/0.1)
酶活力单位(U/g)=U/mL×V/W
A275:在275nm波长下光吸收平均值。
10:为酶反应时间(min)。
0.1:测定取样量(mL).
1:测定时体积(mL)
V:粗酶液总体积(mL)
W:粗酶提取时的干质量(g)
以上所述实施例只是为本发明的较佳实施例,并非以此限制本发明的实施范围,除了具体实施例中列举的情况外;凡依本发明之原理所作的等效变化,均应涵盖于本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种提高黑纳豆激酶含量和活性的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)、菌种培养:
1.1.1菌种活化及斜面培养:菌种活化培养基为马铃薯200g/L,胡萝卜200重量份,琼脂20重量份,蛋白胨1.2重量份,葡萄糖21重量份,磷酸二氢钾0.4重量份,硫酸镁0.18重量份,维生素B1少许,接种后菌种活化时间为7~8天;
1.1.2种子菌培养:
1.1.2.1种子菌培养基成分的重量份为:葡萄糖2重量份,黑豆蛋白胨1重量份,Na2HPO40.6重量份,NaH2PO4 0.1重量份,MgSO4 0.05重量份,CaCl2 0.02重量份,吐温1重量份;
1.1.2.2种子菌培养基pH调整:自然pH、pH7.0、pH 7.5、pH 8.0;
2)、黑豆培养基制备:
1.2.1黑豆浸泡时间:
精选黑豆浸泡时间视水温而定【如表1】,
表1黑豆浸泡时间
1.2.2浸泡黑豆去种皮处理
纳豆菌耗氧性能强,加之纳豆激酶的合成也需强的耗氧量,因而作为发酵培养基的主要原料的黑豆必须脱除种皮,以免阻碍氧气的供给;同时去种皮后有利于营养物质的运转和转化,实验以浸泡后去种皮的黑豆为发酵培养基,接种种子菌,在26~28℃和相对湿度为≤75%的前提条件下,发酵培养13~15天;
1.2.3沥水:黑豆一般沥水3~4h,其间间隔翻动;
1.3物料烘干温度的控制
分别在45℃、50℃、55℃和60℃条件下,将发酵后的物料烘干,测定酶活性并记录烘干时间;
1.4、酶活性:
不同原始pH的培养,在一定条件发酵后,分别烘干,酶活力测定结果如表2,
表2不同培养基原始pH在相同条件下发酵烘干、酶活力测定结果
从表2中可见:
(1)当培养基原始pH在7.5-8.0、烘干温度在55℃以下时,酶活力都达到3000U/g以上,烘干时间约30h;当温度升到60℃时酶活力显著下降;
(2)当培养基为自然pH时,无论在何种温度下烘干,酶的活性都明显低于其他各pH的处理;
2.2溶血实验
新鲜鸡血洗净、吸干,分别取0.2g血块和2mL各处理酶液于试管中,以缓冲液为对照,结果均在24h内,达到溶血效果;
2.3不同酶量测定
取培养基原始pH8.0、50℃下烘干黑纳豆,磨粉,研磨提取酶,分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL酶液测定酶活性,结果如表3;
表3为不同酶量的测定结果
从表3可见,随着酶量增加,酶活力增加;
该制备方法修改了种子菌培养基,改变种子培养基成分;(1)、增加了Mg2+、Ca2+等营养元素;(2)、由于种子菌在生长生殖过程中代谢旺盛,培养基pH发生变化,因此,为维持生长最适pH,在培养基中添加了缓冲系统(NaH2PO4~Na2HPO4),营养成分和生存条件的改变有利于培养生长旺盛的种子菌;
改变培养基原始pH,纳豆菌生长的最适pH为7.0~7.5,而产酶的最适pH为7.5~8.0;当培养基原始pH为7.5~8.0时,物料不管在何种温度下烘干,酶活力均较高。
2.根据权利要求1所述的一种提高黑纳豆激酶含量和活性的制备方法,其特征在于,在黑豆预处理中,精选黑豆依表1,视水温浸泡,沥干3~4h,干豆和浸泡充分的湿豆比为1∶1.6;然后,除种皮。
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180612 |
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