JP2023550862A

JP2023550862A - キウイ発酵物を含む胃機能改善用組成物

Info

Publication number: JP2023550862A
Application number: JP2022569257A
Authority: JP
Inventors: ヘンイ、ド; キョンソン、ヨン; セクォン、ヒョク; ヨンイ、ナ; チョンオ、ヒョン
Original assignee: ヴァイテックカンパニーリミテッド
Priority date: 2021-10-19
Filing date: 2022-07-06
Publication date: 2023-12-06
Also published as: KR102520354B1; WO2023068486A1

Abstract

本発明は、キウイを乳酸菌で発酵させたキウイ発酵物を有効成分として含む胃機能改善用組成物に関し、本発明によると、本発明に係るキウイ発酵物を含む組成物は、胃の消化機能及び胃粘膜の損傷を改善し、胃酸の分泌を抑制することによって、胃の機能を改善できる。

Description

本発明は、キウイ発酵物を含む胃機能改善用組成物及びキウイ発酵物の製造方法に関し、より詳細には、キウイ由来の乳酸菌で発酵させたキウイ発酵物を有効成分として含む胃機能改善用組成物に関する。

胃は消化管の一部分であって、食道と十二指腸を繋ぐ中空の袋状の器官である。胃は、食道を通して入ってくる食べ物をしばらく貯め、一部の消化作用を経て十二指腸に食べ物を送ることを調節して膵臓酵素の分泌と調和をなして効率的な消化と吸収が行われるようにする臓器である。胃は、食べ物が入ってくると、これを消化させるために胃酸を分泌するが、この際に胃粘膜の保護層が強い酸性である胃酸によって胃粘膜の損傷を抑制する。

人の胃機能に否定的な影響を及ぼす要因は、遺伝的、生理学的、環境的及び精神的要因など多様である。このような多様な要因によって胃の運動能力が低下する場合、消化不良、胸やけ、胃もたれ、嘔吐などの症状が現れる恐れがあり、このような症状が３ヶ月以上続く場合を機能性胃腸障害という。また、胃酸が過剰に分泌される場合、胃酸によって胃粘膜の保護層が損傷するが、この際に胃に炎症が起き、この炎症が持続的に繰り返される場合、胃炎及び胃潰瘍を誘発する恐れがある。胃炎は、炎症による病変が胃粘膜に限られている場合をいい、胃潰瘍は、胃粘膜を傷つけて粘膜下組織と筋肉層まで潰瘍を形成した場合をいう。更に、慢性胃炎が繰り返されて悪化する場合、粘膜に腸上皮化生（Intestinal Metaplasia）の変化が生じることもあるが、このような変化は、胃癌にまで発展させる可能性があるので、胃機能を改善して胃の健康を維持する必要がある。

キウイ（kiwi fruit）は、マタタビ科（Acinidiaceae）マタタビ属（Actinidia）に属する雌雄異株のつる性落葉果樹であって、主に温帯地域で育つ。実の形が茶色の毛で覆われており、ニュージーランドに生息する「キーウィ」という鳥に似ていることから、キウイという名前が付けられたとされ、韓国ではびこう桃、チャイニーズ・グーズベリーとも呼ばれている。キウイは、食品の味、香味だけでなく、多様な生理活性に貢献すると知られているフェノール性化合物が含有されており、ビタミンＣ、ビタミンＥが豊富であり、葉酸、カリウム、カルシウム、燐などの無機質が多量に含まれているだけでなく、クロロフィル、カロチノイドのような健康に有益な生理活性物質が含有されている。このようにキウイには、多様な生理活性物質などが含まれており、キウイを用いた多様な研究が続けられている。具体的に、下記の特許文献１は、キウイ抽出物を含有する肌のトーンアップ及び肌の老化防止効果のある化粧料組成物に関するものであって、キウイ抽出物が肌の糖化反応を効果的に抑制することによって、肌をトーンアップさせ、肌のシワを緩和できることが開示されている。下記の特許文献２は、ゴールドキウイ乳酸菌発酵物を有効成分として含有する抗酸化組成物に関するものであって、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）菌株培養液で発酵させて製造されたゴールドキウイ乳酸菌発酵物は、発酵していないゴールドキウイに比べて総フェノール及びフラボノイドの含有量が著しく増加し、抗酸化の活性に優れていることが開示されている。また、キウイに含まれているアクチニジンは、蛋白質を分解する酵素であって、消化促進に効果的であるため、胃の健康に役立つ果物として知られている。しかし、従来技術には、キウイ発酵物が消化機能及び胃粘膜の損傷を改善し、胃酸の分泌を抑制することによって、胃の機能を改善する効果については言及していない。

また、キウイは、多様な効能があるにも拘らず、キウイの柔らかくなり過ぎる性質による低い貯蔵性と、一定期間が経過すると嗜好度が低下するという短所により摂取が容易でないため、適切な加工食品の開発が求められているが、キウイの加工食品は乏しいのが現状である。

一方、乳酸菌（lactic acid bacteria）は、糖類を発酵させて乳酸及び多様な代謝産物を生産する微生物であって、乳酸菌の発酵によって生産される代謝産物は、風味の増進、拮抗物質の生成による人体有害微生物の抑制、ビタミンのような人体有用物質の合成による栄養及び健康増進効果、抗菌効果など多様な特性を有するため、乳酸菌のこのような機能性に基づいた多様な食品を発酵させる研究が行われている。

これにより、本発明者らは、前記従来技術の問題を解決すべく鋭意研究した結果、キウイをキウイ由来の乳酸菌であるラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus Lactis）ＶＩ－０１ＫＣＴＣ１４３５１ＢＰ又はその培養液、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）ＶＩ－０２ＫＣＴＣ１４３５２ＢＰ又はその培養液で発酵させたキウイ発酵物を有効成分として含む胃機能改善用組成物の場合、胃の消化機能及び胃粘膜の損傷を改善し、胃酸の分泌を抑制することによって、胃機能を改善できることを確認し、本発明を完成するに至った。

韓国登録特許第１０８１９１０号公報韓国登録特許第２０２７７９８号公報

そこで、本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、胃の消化機能及び胃粘膜の損傷を改善し、胃酸の分泌を抑制することによって、胃機能を改善できるキウイ発酵物を含む胃機能改善用組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、キウイ由来の乳酸菌を用いたキウイ発酵物の製造方法を提供することにある。

本発明の一態様によると、本発明は、キウイを乳酸菌で発酵させたキウイ発酵物を有効成分として含む胃機能改善用組成物を提供する。

本発明における用語である「胃機能改善」は、胃の健康を維持して増進させることができるように胃の機能を改善して向上させるものであって、具体的には、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼのような消化酵素の活性を増加させ、胃の運動性を向上させることによって、消化機能を促進及び改善し、胃炎を防止して損傷した胃粘膜を改善することで、胃粘膜の損傷を予防及び改善し、胃酸の分泌を抑制することによって、胃を保護することを意味する。

本発明におけるキウイは、Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ属（ゴールドキウイ）のキウイであり、細部品種としては、ジェシーゴールド（Actinidia chinensis Planch var. chinensis‘ＪｅｃｙＧｏｌｄ’）、ハンラゴールド（Actinidia chinensis Planch var. chinensis‘ＨａｌｌａＧｏｌｄ’）、ヘグム（Actinidia chinensis Planch var. chinensis‘Ｈａｅｇｕｍ’）、ゼスプリゴールドＺｅｓｐｒｉ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Actinidia chinensis Planch var. chinensis‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’）、ゼスプリサンゴールドＺｅｓｐｒｉ（登録商標）ＳｕｎＧｏｌｄ（Actinidia chinensis Planch var. chinensis‘Ｚｅｓｙ００２’）、ゼスプリゼシー００３Ｚｅｓｐｒｉ（登録商標）Ｚｅｓｙ００３（Actinidia chinensis Planch var. chinensis‘Ｚｅｓｙ００３’）、ゼスプリゼッシュ００４Ｚｅｓｐｒｉ（登録商標）ＺＥＳＨ００４（Actinidia chinensis Planch var. chinensis‘Ｚｅｓｈ００４’）、ドリＣｏｎｓｏｒｚｉｏＤｏｒｉＥｕｒｏｐｅ（登録商標）Ｄｏｒｉ（Actinidia chinensis Planch var. chinensis‘ＡＣ１５３６'）及びジンゴールドＪｉｎｇｏｌｄ（登録商標）（Actinidia chinensis Planch‘Ｊｉｎｔａｏ'）で構成される群から選択されるキウイであり得るが、これに制限されない。

本発明の胃機能改善用組成物において、前記乳酸菌は、キウイ由来の乳酸菌であって、前記キウイ由来の乳酸菌は、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus Lactis）ＶＩ－０１ＫＣＴＣ１４３５１ＢＰ及びラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）ＶＩ－０２ＫＣＴＣ１４３５２ＢＰのうちの１つ以上であることを特徴とする。

本発明者らは、キウイから分離された菌株から乳酸菌を分離し、選別された菌株を１６ｓｒＲＮＡ分析を通じて遺伝体の塩基配列を解読した。また、遺伝体の塩基配列の解読によって選別された菌株を「ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus Lactis）ＶＩ－０１」及び「ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）ＶＩ－０２」と命名し、生命工学研究院の生命資源センター（ＫＣＴＣ）に２０２０年１１月３日付で寄託し、寄託番号ＫＣＴＣ１４３５１ＢＰ、ＫＣＴＣ１４３５２ＢＰがそれぞれ付与された。

本発明の胃機能改善用組成物において、前記乳酸菌は、当業界において一般に発酵に用いる乳酸菌であり、好ましくはラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・デルブルエッキイー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラムノースス（Lactobacillus rhamnosus）及びラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）で構成される群から選択される１つ以上の菌株、より好ましくはラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）及びラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus Helveticus）で構成される群から選択される１つ以上の菌株を含むことを特徴とする。

本発明の胃機能改善用組成物において、前記キウイ発酵物は、組成物の総重量に対して３０～８０重量％、好ましくは３０～６０重量％含まれることを特徴とする。前記キウイ発酵物の含有量が３０重量％未満の場合、十分な胃機能改善の効果を表し難く、８０重量％超過する場合、含有量に比べて胃機能改善の効果が十分でないことから、経済的な面から好ましくない。

本発明の胃機能改善用組成物において、前記組成物は、健康機能食品の組成物であることを特徴とする。

本発明の胃機能改善用組成物において、前記健康機能食品の組成物は、摂取と活用に便利な剤形を有することができ、好ましくはカプセル、錠剤、粉末、顆粒、液状、丸、片状、ペースト状、シロップ、ゲル、飲料、ゼリー及びバーで構成される群から選択される１つ以上の剤形であることを特徴とする。このような剤形に製造するために、通常の賦形剤、安定剤、増粘剤などを更に含むことができる。また、食品添加物を追加で含むことができ、「食品添加物」として適しているか否かは他の規定がない限り、食品医薬品安全処に承認された食品添加物公典の総則及び一般試験法などによって該当品目に関する規格及び基準により判定する。

本発明の胃機能改善用組成物において、前記組成物は、食品組成物であることを特徴とする。

本発明の胃機能改善用組成物において、前記食品組成物は、キウイ発酵物を主成分として利用可能な食品に剤形化でき、好ましくは乳製品、飲料、ソース類、ジャム類及び製菓類で構成される群から選択される１つ以上の剤形であることを特徴とする。

本発明の他の態様によると、本発明は、キウイを乳酸菌で発酵させたキウイ発酵物を有効成分として含む消化機能改善用組成物を提供する。

本発明の一実験例によると、本発明に係るキウイ発酵物は、消化酵素であるアミラーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼの活性に優れており（実験例５参照）、胃の排出能（実験例６参照）及び胃腸管の運動能（実験例７参照）に優れていることを確認した。このような結果は、本発明に係るキウイ発酵物が消化機能を改善でき、このような消化機能の改善は、最終的には胃の機能を改善することで、胃の健康を増進させることができることを示唆する。

本発明の更に他の態様によると、本発明は、キウイを乳酸菌で発酵させたキウイ発酵物を有効成分として含む胃粘膜損傷改善用組成物を提供する。

本発明の一実験例によると、本発明に係るキウイ発酵物は、抗酸化効果に優れており（実験例４参照）、損傷した胃粘膜を回復させ（実験例８参照）、胃粘膜における炎症を減少（実験例９）させることを確認した。このような結果は、本発明に係るキウイ発酵物が胃粘膜の損傷を予防及び改善でき、このような胃粘膜損傷の予防及び改善は、最終的には胃の機能を改善することで、胃の健康を増進させることができることを示唆する。

本発明の別の態様によると、本発明は、キウイを乳酸菌で発酵させたキウイ発酵物を有効成分として含む胃酸分泌抑制用組成物を提供する。

本発明の一実験例によると、本発明に係るキウイ発酵物は、胃酸の分泌を抑制することを確認した（実験例１１参照）。このような結果は、本発明に係るキウイ発酵物が胃酸の分泌を抑制することによって、胃粘膜を保護でき、このような胃酸分泌の抑制は、最終的には胃の機能を改善することで、胃の健康を増進させることができることを示唆する。

本発明の更に別の態様によると、本発明は、キウイを乳酸菌又はその培養液で醗酵させて発酵物を得る段階を含むキウイ発酵物の製造方法を提供する。

本発明の用語である「培養液」は、本発明に係るキウイ由来の乳酸菌を公知の培地で培養させて得られた産物を意味し、前記産物は乳酸菌を含む。

キウイは、多様な効能物質を含んでいるが、柔らかくなり過ぎる性質による低い貯蔵性と、一定期間が経過すると嗜好度が低下するという短所によって摂取が容易でないことから、健康食品としての選好度が低い。これにより、本発明者らは、キウイを乳酸菌又はその培養液で培養して製造したキウイ発酵物をＬＮＦ（liquid nitrogen freezer）を用いて粉末化する場合、摂取が容易な剤形に製造できることを確認した。

前記キウイは、果実そのものを用いることもできるが、好ましくはキウイピューレに製造して用いることができる。キウイピューレは、キウイの果皮をむいて果肉を細かく切り、磨砕機を用いて磨砕した後、濾過網を用いて種を除去することによって製造できる。

本発明のキウイ発酵物の製造方法において、前記乳酸菌はキウイ由来の菌株であって、前記キウイ由来の菌株は、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus Lactis）ＶＩ－０１ＫＣＴＣ１４３５１ＢＰ又はラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）ＶＩ－０２ＫＣＴＣ１４３５２ＢＰであることを含んでいる。

本発明のキウイ発酵物の製造方法において、前記発酵は、当業界において一般に発酵に用いる乳酸菌を追加的に利用して発酵させることができ、好ましくはラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・デルブルエッキイーサブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラムノースス（Lactobacillus rhamnosus）及びラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）で構成される群から選択される１つ以上の菌株、より好ましくはラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）及びラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus Helveticus）で構成される群から選択される１つ以上の菌株を更に用いて発酵させることを含む。

本発明のキウイ発酵物の製造方法において、前記培養液は、第１培地に菌株をそれぞれ培養（種菌培養）して第１培養産物（種培養液）を製造する段階、前記第１培養産物を第２培地に接種及び培養（大量培養）して第２培養産物（大量培養液）を製造する段階、及び前記第２培養産物を遠心分離して上澄み液を除去して培養液を得る段階によって製造されたものを含む。前記で第１培地及び第２培地は同一であるか、異なることができ、菌株を培養するために当業界において用いる如何なる産業の培地も利用可能であり、好ましくはＭＲＳブロスであり得る。

前記第１培養産物（種培養液）を製造する段階は、菌株をそれぞれの培地の０．０１～０．５％に接種した後、３５℃～３７℃で１８時間～２８時間培養して製造できる。前記第２培養産物（大量培養液）を製造する段階は、菌株を培地の０．０１～１％ずつ接種した後、３５℃～３７℃で７時間～１０時間培養して製造できる。

本発明のキウイ発酵物の製造方法において、前記キウイ及び培養液は、７．５～８．５：２．５～１．５重量％の割合で混合でき、好ましくは８：２重量％の割合で混合することを含む。

本発明のキウイ発酵物の製造方法において、前記キウイ発酵物を液状形態で利用可能であるが、パウダー形態で用いるために乾燥及び粉末化する段階を更に含む。

本発明のキウイ発酵物の製造方法において、前記乾燥は、液体窒素冷凍機（ＬＮＦ）を用いて発酵物を－１８０℃～－１９５℃で、好ましくは－１９５℃で急速凍結する段階、及び急速凍結された発酵物を－３５℃～－４５℃で、好ましくは－４０℃で凍結乾燥する段階によって行うことを含む。

本発明の乾燥段階で液体窒素冷凍機（ＬＮＦ）を用いて急速凍結を先に行う場合、凍結乾燥過程で加えられる乳酸菌のダメージを最小化することで、乾燥後の生菌の生存率を増加させることができ、キウイ内の糖成分による褐変現象を最小化できる。

前述したように、本発明に係るキウイ発酵物を含む組成物は、胃の消化機能及び胃粘膜の損傷を改善し、胃酸の分泌を抑制することによって、胃機能を改善できる。また、キウイを摂取し易い液状又はパウダー状の加工食品又は食品添加剤として製造できる。

本発明に係る寄託菌株をグラム染色した図である。本発明に係る寄託菌株の炭酸カルシウム分解による透明環の形成を示す図である。本発明に係る寄託菌株ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓＬａｃｔｉｓＶＩ－０１ＫＣＴＣ１４３５１ＢＰの形態を観察した図である。本発明に係る寄託菌株ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉＶＩ－０２ＫＣＴＣ１４３５２ＢＰの形態を観察した図である。本発明に係る寄託菌株ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓＬａｃｔｉｓＶＩ－０１ＫＣＴＣ１４３５１ＢＰの系統樹である。本発明に係る寄託菌株ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉＶＩ－０２ＫＣＴＣ１４３５２ＢＰの系統樹である。本発明に係るキウイ発酵物の抗酸化効果を確認した結果である。本発明に係るキウイ発酵物の抗酸化効果を確認した結果である。本発明に係るキウイ発酵物の胃排出能を測定した結果である。本発明に係るキウイ発酵物の胃腸管運動能評価の結果である。本発明に係るキウイ発酵物の胃粘膜損傷の抑制度を確認した結果である。本発明に係るキウイ発酵物の胃粘膜損傷の抑制度を確認した結果である。本発明に係るキウイ発酵物の胃粘膜の改善を確認した結果である（ウエスタン・ブロッティング法）。本発明に係るキウイ発酵物の胃粘膜の改善を確認した結果である（ウエスタン・ブロッティング法）。本発明に係るキウイ発酵物の胃粘膜の改善を確認した結果である（ウエスタン・ブロッティング法）。本発明に係るキウイ発酵物の胃粘膜の改善を確認した結果である（ＥＬＩＳＡ）。本発明に係るキウイ発酵物の胃粘膜の改善を確認した結果である（ＥＬＩＳＡ）。本発明に係るキウイ発酵物の胃粘膜の改善を確認した結果である（ＥＬＩＳＡ）。胃腺の長さを測定した結果である。胃腺の長さを測定した結果である。胃酸分泌度を確認した結果である。胃酸分泌度を確認した結果である。胃酸分泌度を確認した結果である。胃酸分泌度を確認した結果である。ペプシン活性度を測定した結果である。

以下、実施例を通じて本発明を更に詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであるため、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものとして解釈されるわけではない。

準備例１：微生物の分離及び確認
１）分離元及び試料の前処理
ゴールドキウイから乳酸菌を分離するために、ゴールドキウイフルーツとピューレを用いた。ゴールドキウイフルーツは、ニュージーランドから輸入したゼスプリゴールドキウイを２０２０年９月にスーパーで購入し、３次蒸留水で洗浄して異物を除去した後、皮と共に細かく切って用いた。ゴールドキウイピューレは、（株）ナムヤン冷凍食品のゴールデンキウイピューレを２０２０年５月に購入し、－２０℃で保管し、使用時に室温で完全に解凍して均一に混合して実験に用いた。

２）自然発酵
細かく切ったゴールドキウイとピューレは、塩蔵条件と脱脂条件で発酵した。塩蔵条件は、それぞれの試料に８％の天日塩を添加し、３時間塩漬けした後、滅菌した１％のフラクトオリゴ糖溶液を混合し、脱脂条件は、それぞれの試料に滅菌した２％の脱脂と１％のフラクトオリゴ糖溶液を混合した。混合した全ての試料は、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを６．０以上に補正し、３７℃の培養器で約３日間発酵させた。

３）乳酸菌の選別及び同定
発酵した試料は、均一に混合した後、発酵液の一部を取ってＢＣＰプレートカウント寒天培地（栄研化学（株）製、日本）を用いて接種し、３７℃で４８時間培養した。その後、培地が黄色を呈し、表現型が互いにコロニーを対象にＭＲＳ寒天（Ｄｉｆｃｏ社製、ＵＳＡ）平板培地を用いて純粋分離した。純粋分離した菌株は、コロニーの特性を確認し、顕微鏡観察（１０００倍）を通じて細胞の形態を確認し、グラム染色によってグラム陽性を示す菌株のみを１次選別した（図１）。その後、炭酸カルシウム（ＤＡＥＪＵＮＧ社製、大韓民国）が１％含まれているＭＲＳ寒天培地に接種し、３７℃で４８時間培養して有機酸によって炭酸カルシウムを分解して透明環（clear zone）が大きく形成された菌株２種を最終的に選別した（図２）。

分離した２種菌株は、任意でＶＩ－０１、ＶＩ－０２と命名し、３０％のグリセロールを用いてストックに製造して－８０℃で保管した。２種菌株の糖分解能、アルギニンおよびエスクリン分解能などの生化学的特性を確認するために、ＡＰＩ５０ＣＨＬキット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社製、フランス）を用いて培地の色変化をアピウェブプログラム（apiweb program）（http：//apiweb.biomerieux.com）を用いて同定した。

１６ｓｒＲＮＡ分析は、株式会社バイオファクトに依頼し、２７Ｆと１４９２Ｒのプライマーを用いたＰＣＲの遂行及び配列分析を行った。確認された各菌株の塩基配列は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋに登録された１６ＳリボソームのＲＮＡ遺伝子配列と相同性を比較し、近接結合法（neighbor-joining method）を適用したＣｌｕｓｔａｌＸ２．１プログラムを用いてアライメントした。系統樹は、ＣｌｕｓｔａｌＸ２．１のブートストラップＮ－Ｊツリー方法を用い、ＮＪｐｌｏｔプログラムで確認した。

４）遺伝体塩基配列の解析
系統ＶＩ－０１菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子分析を通じて１,４１４ｂｐサイズの塩基配列を確認した結果、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓＮＢＲＣ１００９３３ｓｔｒａｉｎと１００％の相同性を示した。従って、ＶＩ－０１菌株をＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓＶＩ－０１と命名した（配列番号１）。

系統ＶＩ－０２菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子分析を通じて１,４４１ｂｐサイズの塩基配列を確認した結果、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉＲ０９４ｓｔｒａｉｎと９９％の相同性を示した。従って、ＶＩ－０２菌株をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉＶＩ－０２と命名した（配列番号２）。

５）糖利用性調査による同定
分離菌株のＡＰＩ５０ＣＨＬキットを用いて糖利用性調査による菌同定結果、系統ＶＩ－０１は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓと９８．４％の類似性が確認され、株ＶＩ－０２は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉと９９．６％の類似性が確認された。

準備例２：菌株の生化学的及び形態学的特性
１）生化学的特性
分離菌株の生化学的特性は、ＡＰＩ５０ＣＨＬキットで測定した。ＭＲＳ寒天培地に純粋培養したコロニーをＡＰＩ５０ＣＨＬ培地に適正濃度に希釈してＡＰＩ５０ＣＨＬキットに接種した後、３７℃で２４～４８時間培養して接種された培地の色変化を観察した。

Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓＶＩ－０１菌株は、４９個の糖のうちガラクトース、Ｄ－グルコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－マンノース、マンニトール、マルトース、ラクトースなど計１９個の糖を用いたが、ソルビトールやキシリトールなどは利用できないことが確認された（表１）。

Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉＶＩ－０２菌株は、糖４９個のうちガラクトース、Ｄ－グルコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－マンノース、マンニトール、ソルビトールなどを含んで２２個の糖を用い、ラクトースとキシリトールなどは利用できなかった（表２）。

２）形態学的特性
形態学的特性は、ＭＲＳ寒天培地で培養した菌株のコロニー形態と色などを確認し、顕微鏡で菌株の形態を観察した。

Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓＶＩ－０１菌株のコロニーは、０．５－１．５ｍｍの小さくて丸い形であり、白色の光沢のある形態である。顕微鏡で菌株の形態を観察した結果、球菌であることが確認された（図３）。

Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉＶＩ－０２菌株のコロニーの形態は、１．５－２．５ｍｍの丸くて凸状であり、白色又はクリーム色の光沢がある。顕微鏡による観察の結果、杆菌として長連鎖を形成した（図４）。

準備例３：菌株寄託
１６ＳＲＮＡ配列分析と形態学的特性を確認し、最終的に菌株確認作業を行った後、生物資源センターに寄託手続きを行い、寄託番号が付与された（表３）。

前記のように新規分離された寄託菌株の活性を確認するための実験を行うために、下記の表４のように、試験群の構成を設定して耐酸性試験、人工胃液抵抗性試験及び人工胆汁酸抵抗性試験を行った。寄託菌株１及び２は、本発明でキウイから分離した新規菌株であり、一般菌株１及び２は、商業的に販売される菌株である。

実験例１：耐酸性試験
滅菌したＭＲＳブロス３０ｍＬを５０ｍＬのコニカルチューブに移した後、菌液１％を接種して３７℃で１８時間培養した。培養液は、４５００ｒｐｍの条件で１０分以上遠心分離して菌体を完全に沈めた後、上澄み液のみを除去した。上澄み液を除去し、菌体のみ入っている５０ｍＬのコニカルチューブにｐＨ２．０とｐＨ３．０のＰＢＳ緩衝液を除去した上澄み液と同じ量で添加して均一に混合した。３７℃で２時間培養した後、試料の一部を取り、０．８５％のＮａＣｌ溶液を用いて適正濃度に希釈し、ＭＲＳ寒天培地に接種して３７℃で４８時間培養した。コロニーが１５～３００個分布したＭＲＳ寒天プレートを選別してコロニーを計数して結果を確認し、その結果を下記の表５に示した。

その結果、前記表５に示すように、本発明でキウイから分離した寄託菌株が一般菌株に比べて生存率が高いことから、耐酸性に優れていることが確認できる。

実験例２：人工胃液抵抗性の試験
１％のペプシン溶液を製造し、滅菌されたＭＲＳブロス３０ｍｌを５０ｍｌのコニカルチューブに移した後、各実験サンプルの菌液１％を接種して３７℃で１８時間培養した。ｐＨ２．５ＭＲＳブロス８９ｍＬに１％のペプシン溶液を１０ｍＬ添加した後、培養液１％を混合し、３７℃で２時間培養し、培養０、１、２時間に試料の一部を取り、０．８５％のＮａＣｌ溶液を用いて適正濃度に希釈した後、ＭＲＳ寒天培地に接種して３７℃で４８時間培養した。培養完了後、生菌数の確認を通じて生存率を測定して結果を確認し、その結果を下記の表６に示した。

その結果、前記表６に示すように、本発明でキウイから分離した寄託菌株が一般菌株に比べて人工胃液の酸性条件での生存率が高いことが分かった。ｐＨ３～４程度の水準であるキウイから分離された本発明の寄託菌株の耐酸性が顕著に優れていることが分かった。

実験例３：人工胆汁酸抵抗性試験
耐胆汁酸試験の場合、胃を経た後、十二指腸内で胆汁による生存可能性及び活性維持などを確認できる実験方法として人工胆汁処理の後に、生菌数を測定して生存率を確認した。

具体的に、滅菌されたＭＲＳブロスに菌体を１％接種し、３７℃で１８時間培養したサンプルを人工胃液に２時間前処理を行った後、ＭＲＳブロス８７ｍｌと１０％のオックスゴール溶液を３ｍｌ混合し、人工胃液前処理サンプルを１０ｍｌ混合して３７℃で４時間培養して処理したサンプルをプレートに塗抹した後、生成されたコロニー数を確認して生存率を計算し、その結果を下記の表７に示した。試験の結果、人体の消化過程に対する補正のために胆汁酸試験の場合、人工胃液の処理後に人工胆汁酸を処理して最終結果を確認した。

その結果、前記表７に示すように、人工胃液に前処理して生存率が減少した状態で人工胆汁酸の処理時に、本発明でキウイから分離した寄託菌株の場合、何れも５０％以上の生存率を示したのに対し、一般菌株の場合、３０％台の生存率のみ示し、寄託菌株の活性の消化器内における胃液や胆汁酸などの消化酵素に対して活性が高いことが分かった。

実施例：乳酸菌を用いたキウイ発酵物の製造
１）キウイの入庫
様々な品種のキウイを使用できるが、本発明では、Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ属（ゴールドキウイ）のキウイを用いた。

２）前処理過程（キウイピューレの製造）
キウイフルーツを数回洗って、原料として使用できるキウイフルーツを選別する。選別基準は、肉眼で観察した際に果実に傷のないもの、腐ったり、菌に汚染していないもの、糖度が１３Ｂｒｉｘ％以上（超えない場合、追熟過程を経る）のものを選別する。選別された果実の果皮をむいて果肉を細かく切る。

３）磨砕・種分離過程（キウイピューレの製造）
磨砕・種分離は、細かく切られた果肉を遠心分離磨砕機に投入して磨砕し、濾過網に濾過された種を除去した後、撹拌して均質する。

４）乳酸菌培養の過程（種培養－タンク培養－遠心分離）
４－１）乳酸菌の菌種
キウイ発酵物を製造するために用いる乳酸菌は、以前実験で分離したＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉＶＩ－０２ＫＣＴＣ１４３５２ＢＰ、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓＶＩ－０１ＫＣＴＣ１４３５１ＢＰの菌株にラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus Helveticus）の３種のラクトバチルス菌種を混合して発酵を行い、３種のラクトバチルス菌種の場合、ソッコ（Socco）社の製品を用いた。

４－２）培養過程
４－２－１）種菌の培養
種菌の培養は、ＭＲＳブロスで培養した。具体的な培養方法は、各菌株をそれぞれの培地の０．１％で接種した後、３７℃で２４時間培養して第１培養産物（菌株）を得た。滅菌は、１２１℃で１５分間実施した。

４－２－２）大量培養
大量培養は、前記第１培養産物を用いて行った。ＭＲＳ培地に第１培養産物を接種した後、３７℃で９時間培養して第２培養産物を得た。滅菌は、１２１℃で２０分間実施した。

大量培養は、１つの菌株のみを用いる場合は、１つの菌株のみを培養して得た第１培養産物をＭＲＳ培地に接種して大量に培養し、１つ以上の菌株を用いる場合には、１つ以上の菌株をそれぞれ培養して得たそれぞれの第１培養産物を全て１つの培地（ＭＲＳ培地）に接種して大量に培養する。

大量培養段階で１つ以上の菌株を接種する場合、菌株を培養した第１培養産物を同じ量で接種して培養するか、好ましくは寄託菌株を培養した第１培養産物を２５～５０重量％で接種し、一般（commercial）菌株を培養した第１培養産物は、合計が５０重量％になるように接種して培養する。

４－２－３）遠心分離及び濃縮
培養が完了した乳酸菌を遠心分離して乳酸菌が含まれている培養液を濃縮する。

５）混合
原料（キウイピューレ）と乳酸菌培養液を８：２の割合で混合する。具体的な構成及び接種量は、下記の表８の通りである。

６）発酵
前記混合した原料を３７℃で８～１２時間培養する。

７）粉末化
実験に用いるために、前記製造された発酵物を急速凍結及び凍結乾燥した後、粉砕して粉末化し、キウイ発酵物粉末（ＦＧＫＰ）を製造した。

前記急速凍結は、液体窒素冷凍機を用いて発酵物を急速凍結させ、凍結乾燥は、発酵した原料を－４０℃以下で凍結乾燥する。

８）粉砕
乾燥した原料を粉末化する。

準備例４：動物モデルの準備
６週齢雄性スプラーグドーリーラット（Sprague-Dawley(SD)Rat）を購入した後、飼育施設で７日間の馴化期間を経た後、実験に投入した（温度：２２±２℃、湿度：４０～６０％、明暗周期：１２時間）。飼育期間中の飼育室の温・湿度は８時間単位で確認した。

実験例４：抗酸化効果の確認
１）ＤＰＰＨラジカル消去活性の測定
実施例で製造したキウイ発酵物の粉末（ＦＧＫＰ）は、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で３時間以上室温で懸濁した後、適正濃度に希釈して実験に用いた。陽性対照群としてはＬ－アスコルビン酸を用い、各試料を濃度別に希釈した溶液と６．３ｍｇ／５０ｍｌの濃度のＤＰＰＨを１：９で混合して１０分間暗所状態で反応させた後、５１７ｎｍで吸光度を測定し、その結果を下記の表９及び図７に示した。

２）ＡＢＴＳラジカル消去活性の測定
１００ｍｇ／ｍｌの濃度で３時間以上室温で懸濁したキウイ発酵物の粉末（ＦＧＫＰ;実施例）を適正濃度に希釈した。陽性対照群としてはＬ－アスコルビン酸を用い、７ｍＭのＡＢＴＳ溶液と２．４ｍＭの過硫酸カリウムを混合して１６時間以上暗所状態で放置した。放置されたＡＢＴＳストックでＡＢＴＳ＋を形成させた後、７３４ｎｍで吸光度値が０．７０±０．０２になるように、無水エタノールで希釈した後、希釈された溶液と試料を９：１の割合で１分間放置した後、吸光度を測定し、その結果を下記の表９及び図８に示した。

その結果、前記表９及び図７、図８に示すように、Ｌ－アスコルビン酸１００μｇ／ｍｌでは抗酸化効果が９６％と現れ、本発明に係るキウイ発酵物（ＦＧＫＰ）は、濃度が増加するほど抗酸化効果が増加した。

実験例５：消化酵素活性の測定
１）アミラーゼ活性の測定
実施例で製造したキウイ発酵物の粉末（ＦＧＫＰ）０．１ｇに蒸留水１０ｍｌ（１％溶液）を加え、密封後に室温で４時間の振とう後、遠心分離して得られた上澄み液を酵素液として用いた。１％のデンプン溶液１．０ｍｌに予め調剤した酵素液１．０ｍｌを添加し、４０℃で３０分間反応させた後、１Ｍの酢酸溶液１０ｍｌを加えて反応を停止させ、０．０００２５Ｎヨウ素溶液１０ｍｌを加えて発色させた後、６６０ｎｍで吸光度を測定した。このとき、空試験（blank）として酵素液の代わりに蒸留水を用いて同じ方法で反応させた後、６６０ｎｍで吸光度を測定した。試料反応液の吸光度測定値が空試験（blank）の吸光度値を基準に１０％減少させることを１ユニットとし、試料１．０ｇ（乾燥重量比）当たりに換算して示した。結果は、表１０に示した。

２）リパーゼ活性の測定
α－アミラーゼ活性の測定のために用意した酵素液（蒸留水に１％の濃度で希釈した溶液）を用いた。リパーゼ活性は、Ｌｅｅなど（１９９９）及びＣａｏなど（２０１５）の方法を若干変形して測定した。アセトニトリルに１０ｍＭの濃度となるように、４－ニトロフェニル酢酸を溶解させた溶液とエタノール及び１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）を実験前に１：４：９５（ｖ／ｖ／ｖ）の割合で混合した基質溶液１．８ｍＬに酵素液２００ｕｌを加え、３７℃で２０分間反応させた後、４０５ｎｍで吸光度を測定した。このとき、空試験（blank）として酵素液の代わりに蒸留水を用いて同じ条件で実験したものを空試験溶液とした。別途にｐ－ニトロフェノール標準品を用いて検量曲線を基準にリパーゼの活性を計算し、リパーゼの１Ｕは１分当たり１ｕＭのｐ－ニトロフェノールを遊離させる酵素の量として試料１ｇ（乾燥重量比）当たりに換算して示した。結果は表１０に示した。

３）プロテアーゼ活性の測定
実施例で製造したキウイ発酵物の粉末（ＦＧＫＰ）０．１０ｇを取り、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．５）１０ｍｌを加えた後、粉末が完全に溶解するまで撹拌（約１０秒）した。次いで、往復振とう機を用いて約１０分間振とうした後、遠心分離（４５００ｒｐｍ、７分）させた後、上澄み液を試験液として用い、全ての試料は、実験に用いるまで４℃以下の冷蔵室に保管した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．５）１．５ｍＬに試験液０．１ｍＬを加えた後、３７℃の水浴槽で約１分間平衡化させた後、基質溶液０．１ｍＬを加えて１０分間更に反応させた。次いで、反応液に５０％の酢酸溶液０．４ｍＬを加えて、酵素反応を停止させた後、分光光度計を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。このとき、空試験（blank）は、試験液０．１ｍＬの代わりに０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液０．１ｍｌを用いて吸光度を測定した後に補正した。プロテアーゼの作用により基質から遊離したｐ－ニトロアニリンの量は、ｐ－ニトロアニリン標準品として作成した検量線を用いて定量し、酵素活性の１ユニット（Ｕ）は、１分当たりに１ｕＭのｐ－ニトロアニリンを遊離させるのに必要な酵素の量とした試料１ｇ（乾燥重量比）当たりに換算して示した。下記の表１０に示した。

※全ての実験は、３回の反復実験後に平均及び標準偏差で示す。

酵素食物は、酵素（α－アミラーゼ、プロテアーゼ）を含有して食品公典上の酵素食品（穀類酵素含有製品、胚酵素含有製品など）として許可が得られた製品であって、酵素力価の表示規定は、α－アミラーゼ、プロテアーゼの表示量以上の酵素の力価を有せばよい。前記表１０に示すように、α－アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼは、それぞれ１２１．５±１．９８Ｕ／ｇ、４．４２±０．０１Ｕ／ｇ、２１．１５±０．０７Ｕ／ｇの数値であって、市販中の代表的な酵素製品の測定結果と類似する水準の酵素力価が確認された。

実験例６：胃排出能の測定
１）動物モデル
実験動物は、１群当たり８匹で６グループに分けて実験した。馴化を終えた実験動物を４８時間絶食させた後、それぞれの試験物質を経口投与した。ＨＰＭＣを賦形剤として用い、正常群（ＮＯＲ）と対照群（ＣＯＮ）には、３％のＨＰＭＣを２ｍｌ経口投与し、実験群には、実施例で製造したキウイ発酵物の粉末（ＦＧＫＰ）を濃度別に（ＦＧＫＰ５０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ）３％のＨＰＭＣと混ぜた後、経口投与した。陽性対照群には、イトプリド３０ｍｇ／ｋｇを３％のＨＰＭＣと混ぜた後、経口投与した。それと同時に、正常群（ＮＯＲ）には蒸留水を腹腔内投与し、対照群（ＣＯＮ）、実験群（ＦＧＫＰ）、陽性対照群（イトプリド）には、シスプラチンを１０ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内投与した。１時間後、０．５％のフェノールレッドを流動食（liquid meal）として用い、１．５％のＨＰＭＣを混ぜて全ての群に経口投与した。

２）実験方法
胃に残っているフェノールレッドの量を測定するために、胃排出遅延誘発物質であるシスプラチンで胃排出遅延を誘発した後、２０分後にイソフルランで吸入麻酔と共に安楽死させた後、食道部分と十二指腸部分を縛って胃を摘出した。摘出した胃は、滅菌されたビーカーに入れて０．１ＮＮａＯＨ１００ｍｌを入れて２０秒間ホモジナイズ（homogenize）させた。完全にすりおろされた胃と胃の内容物は、１時間室温に放置させた後、その内容物５ｍｌを取り、０．５ｍｌの２０％ＴＣＡ溶液と混ぜる。十分に混ぜた後、２５００ｘｇで２０分間遠心分離させた後、チューブに上澄み液２ｍｌを分離した後、０．５ＮＮａＯＨ２ｍｌを混ぜる。十分に反応させた後、マイクロプレート分光光度計（microplate spectrophotometer）を用いて５６０ｎｍの波長で吸光度を測定した。胃排出能の変化を測定した結果を下式１胃排出能（Gastric emptying rate）（％）を用いて換算し、その結果を表１１及び図９に示した。

その結果、前記表１１及び図９に示すように、対照群（ＣＯＮ）は、２０．１±１０．９であって、正常群（ＮＯＲ）６７．７±５．３に比べて有意に低い数値を示し、ＦＧＫＰ実験群は、濃度依存的に対照群に比べて有意に胃排出能の数値が高くなることを確認した。陽性対照群であるイトプリドでも、対照群に比べて胃排出能の数値が高い有意性を示した。

実験例７：胃腸管運動能の評価
１）動物モデル
実験動物は、１群当たり８匹で６グループに分けて実験した。馴化を終えた実験動物を４８時間絶食させた後、それぞれの試験物質を経口投与した。ＨＰＭＣを賦形剤として用い、正常群（ＮＯＲ）と対照群（ＣＯＮ）には、３％のＨＰＭＣを２ｍｌ経口投与し、実験群には、実施例で製造したキウイ発酵物の粉末（ＦＧＫＰ）を濃度別に（ＦＧＫＰ５０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ）３％のＨＰＭＣと混ぜた後、経口投与した。陽性対照群には、モサプリド（mosapride）１０ｍｇ／ｋｇを３％のＨＰＭＣと混ぜた後、経口投与した。それと同時に、正常群（ＮＯＲ）には蒸留水を腹腔内投与し、対照群（ＣＯＮ）、実験群（ＦＧＫＰ）、陽性対照群（モサプリド）には、アトロピンを１ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内投与した。１時間後、ＦＩＴＣ－デキストランを流動食として用い、６．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で０．１ｍｌずつ経口投与した。

２）実験方法
ＦＩＴＣ－デキストランを経口投与した１５分後に麻酔して安楽死させた後、小腸部分のみを再び分離して小腸の先端部分を糸で結んで小腸の内容物が流れないように固定する。分離した小腸は、１０個の分節に一定に分けた後、各分節ごとのＦＩＴＣ－デキストランの量を蛍光を用いて測定し、Ｇ．Ｃ（ジオメトリックセンター（geometric center））を算出した。Ｇ．Ｃの算出方法は、それぞれの分節をチューブに入れ、０．０５Ｍトリス緩衝液を３ｍｌずつそれぞれのチューブに入れて撹拌させた後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離させた。遠心分離が終了すると、上澄み液を取ってマイクロプレート分光光度計を用いて４９０～５２０ｎｍで蛍光シグナルを測定した。胃腸管転移の変化を確認するために、下式２（Ｇ．Ｃ）を用いて換算し、その結果を表１２及び図１０に示した。

その結果、前記表１２及び図１０に示すように、対照群（ＣＯＮ）は、３．７７±０．５７で正常群（ＮＯＲ）６．５５±０．５８に比べて顕著に減少し、実験群であるＦＧＫＰ群は、低濃度、中濃度、高濃度でそれぞれ４．９８±０．３８、５．８１±０．４２、５．１２±０．４３と測定され、陽性対照群であるモサプリド群と共に高い有意性を示し、ＦＧＫＰ群（１２５ｍｇ／ｋｇ）で最も高い数値を示した。

実験例８：胃粘膜損傷の抑制度確認
１）動物モデル
実験動物は、１群当たり８匹ずつ６グループに分けて実験を行った。急性胃炎の誘発前に２４時間絶食させ、飲水は自由に提供した。実験当日、実験群（ＦＧＫＰ）は、実施例で製造したキウイ発酵物の粉末（ＦＧＫＰ）を５０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇの濃度でそれぞれ経口投与し、陽性対照群（スクラルファート）には、胃粘膜保護効果のあるスクラルファート（Sucralfate）を５０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与した。試料及びスクラルファートを投与１時間後、正常群（ＮＯＲ）には、蒸留水を経口投与し、実験群（ＦＧＫＰ）と陽性対照群（スクラルファート）には、１５０ｍＭのＨＣＬと６０％のエタノールを混ぜた溶液を２ｍｌずつ経口投与した。

２）実験方法
摘出した胃組織をピンで固定させた後、２％のＰＦＡで３０分間固定させた後、光学デジタルカメラ（ＤＳＣ－ＨＸ５０Ｖ、ソニー（株）製、東京、日本）を用いて撮影した。損傷した胃粘膜測定は、ｉｍａｇｅ－Ｊプログラムを用いて実際の損傷部位の面積（式３）を測定した後、胃全体面積と比較して損傷割合（式４）で表し、その結果を表１３と図１１及び図１２に示した。

その結果、前記表１３と図１１及び図１２に示すように、ＨＣＬ／エタノールで誘発された急性胃炎動物実験モデルで胃粘膜を肉眼で観察した結果、正常群（ＮＯＲ）における病変が見られない胃粘膜と比較して、対照群（ＣＯＮ）は、ＨＣＬ／エタノールの誘発によって胃粘膜に損傷を受け、発赤、出血及びむくみが明確に現れた。それに対し、陽性対照群（スクラルファート）と試料投与群（ＦＧＫＰ）の何れも出血性粘膜損傷が顕著に減少することが観察できた。また、胃粘膜の損傷度をｉ－ｓｏｌｕｔｉｏｎプログラムを用いて測定したとき、正常群（ＮＯＲ）では、胃粘膜の病変は見られなかったが、対照群（ＣＯＮ）の場合、損傷面積は１８．１５±１．０５と高く現れた。反面、陽性対照群であるスクラルファートは、４．０５±０．７６で対照群に比べて顕著に減少し、実験群であるＦＧＫＰは、１０．３５±０．６１、７．８７±１．５２、２．４５±１．００で有意性のある減少を示した。

実験例９：胃粘膜改善の確認
１）動物モデル
実験動物は、１群当たり８匹ずつ６グループに分けて実験を行った。急性胃炎の誘発前に２４時間絶食させ、飲水は自由に提供した。実験当日、実験群（ＦＧＫＰ）は、実施例で製造したキウイ発酵物の粉末（ＦＧＫＰ）を５０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇの濃度でそれぞれ経口投与し、陽性対照群（スクラルファート）には、胃粘膜保護効果のあるスクラルファートを５０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与した。試料及びスクラルファートを投与１時間後、正常群（ＮＯＲ）には、蒸留水を経口投与し、実験群（ＦＧＫＰ）と陽性対照群（スクラルファート）には、１５０ｍＭのＨＣＬと６０％のエタノールを混ぜた溶液を２ｍｌずつ経口投与した。

２）実験方法
胃の細胞質を得るために、プロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液[１４０ｍＭ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）、０．１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ－１００]を入れて組織粉砕機で粉砕した後、１５分間氷に放置した後、１２,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。胃組織蛋白質を有してウエスタン・ブロッティング法でｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２蛋白質の発現を測定し、ＰＧＥ₂、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６の変化量を確認するために、ＥＬＩＳＡキットを用いて含有量を測定した。ウエスタン・ブロッティングの結果を表１４と図１３～図１５に示し、ＥＬＩＳＡの結果を表１５と図１６～図１８に示した。

ウエスタン・ブロッティングの結果、ＣＯＸ－２の発現は、正常群と比較して対照群で有意な増加があり、ＦＧＫＰ実験群と陽性対照群では、対照群と比較して減少する数値を示した。ｉＮＯＳの発現は、対照群と比較してＦＧＫＰ実験群、陽性対照群で何れも有意に減少する数値を示した。

ＥＬＩＳＡの結果、対照群は正常群よりもＴＮＦ－α、ＩＬ－６の発現を何れも有意に増加させた。ＦＧＫＰ投与群は、対照群に比べて有意に減少させる傾向を示した。また、胃組織の内部に存在するＰＧＥ₂の濃度を確認した結果、対照群は、１９．４３±１．８５ｎｇ／ｍｇで正常群４３．２６±２．１２ｎｇ／ｍｇに比べて大きく減少した。陽性対照群は、２５．５９±１．６８ｎｇ／ｍｇで対照群と比較して増加し、ＦＧＫＰ実験群は、それぞれ２１．５６±１．８５、２４．３４±２．８１、３６．０１±２．０２に増加した。

実験例１０：胃腺長さの測定
１）動物モデル
実験動物は、１群当たり８匹ずつ６グループに分けて実験を行った。急性胃炎の誘発前に２４時間絶食させ、飲水は自由に提供した。実験当日、実験群（ＦＧＫＰ）は、実施例で製造したキウイ発酵物の粉末（ＦＧＫＰ）を５０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇの濃度でそれぞれ経口投与し、陽性対照群（スクラルファート）には、胃粘膜保護効果のあるスクラルファートを５０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与した。試料及びスクラルファートを投与１時間後、正常群（ＮＯＲ）には、蒸留水を経口投与し、実験群（ＦＧＫＰ）と陽性対照群（スクラルファート）には、１５０ｍＭのＨＣＬと６０％のエタノールを混ぜた溶液を２ｍｌずつ経口投与した。

２）実験方法
ＨＣＬ／エタノールで誘発された急性胃炎実験動物において胃の損傷程度を調べるために、摘出した胃を４％のＰＦＡに２４時間固定させた後、キシレンを用いて脱水させて、パラフィン組織標本を製作した。次いで、薄切り機を用いて４μm厚さの切片を製作した後、スライドグラスに付着させた。パラフィンを除去した後、ヘマトキシンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて組織切片を染色した後、光学顕微鏡（ｚｅｉｓｓ社製、ドイツ）を用いて１００倍で染色された組織切片を観察し、ｉ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ映像分析プログラムを用いて胃腺（gastric gland）の長さを測定し、その結果を表１６と図１９及び図２０に示した。

その結果、前記表１６と図１９及び図２０に示すように、ＨＣＬ／エタノールを処理していない正常群の全ての実験動物の胃粘膜では、有意な病変が観察されず、対照群では、正常群に比べて胃腺の長さが短く観察されて胃粘膜の損傷が誘発されたことが確認でき、ＨＣＬ／エタノールと共にスクラルファートを処理した陽性対照群では、対照群に比べて胃腺の長さが長く観察されてスクラルファートの胃粘膜の損傷抑制効果が確認できた。また、ＦＧＫＰを処理した後、ＨＣＬ／エタノールを処理した実験群でも対照群に比べて胃腺の長さが長く観察された。

実験例１１：胃酸分泌度の確認
１）動物モデル
実験動物は、１群当たり８匹で５グループに分けて実験した。馴化を終えた実験動物を２４時間絶食させた後、それぞれの試験物質を経口投与した。対照群（ＣＯＮ）には、蒸留水を経口投与し、実験群は、実施例で製造したキウイ発酵物の粉末（ＦＧＫＰ）を５０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ濃度別に経口投与した。陽性対照群（スクラルファート）には、スクラルファート５０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。試料投与３０分後、各群をイソフルランで麻酔した後、腹腔を２センチほど開腹して胃と十二指腸を繋いでいる幽門部部位を結紮した。切開した腹腔を縫合した後、回復チャンバに留まらせ、ケージに移動させた。

２）実験方法
幽門結紮６時間後、麻酔と共に安楽死させた後、胃を除去して胃液を取って実験に用いた。獲得した胃液は、総体積を測定した後、ｐＨ計を用いてｐＨを測定する。後に胃液１ｍｌをチューブに移し、フェノールフタレン溶液を２～３滴入れる。次いで、０．０５ＮＮａＯＨ水酸化ナトリウムを赤色になるまで入れる。総酸度は、下式５によって計算し、その結果を表１７と図２１～図２４に示した。

その結果、前記表１７と図２１～図２４に示すように、対照群の胃酸の体積が最も多く測定され、ＦＧＫＰ実験群では、高濃度に行くほど胃液の量が減少した。陽性対照群であるスクラルファートでも対照群に比べて胃酸の体積が減少したことが確認された。また、ｐＨを見たとき、対照群で最も低く測定され、高濃度に行くほどｐＨが高くなる傾向を示した。陽性対照群も対照群に比べてｐＨが高くなった。酸度と遊離酸度も同様、対照群で最も高いことが確認でき、陽性対照群だけでなく、ＦＧＫＰ実験群で高濃度に行くほど低い測定値が得られた。

実験例１２：ペプシン活性度の確認
１）動物モデル
実験動物は、１群当たり８匹で５グループに分けて実験した。馴化を終えた実験動物を２４時間絶食させた後、それぞれの試験物質を経口投与した。対照群（ＣＯＮ）には、蒸留水を経口投与し、実験群は、実施例で製造したキウイ発酵物の粉末（ＦＧＫＰ）を５０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ濃度別に経口投与した。陽性対照群（スクラルファート）には、スクラルファート５０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。試料投与３０分後、各群をイソフルランで麻酔した後、腹腔を２センチほど開腹して胃と十二指腸を繋いでいる幽門部部位を結紮した。切開した腹腔を縫合した後、回復チャンバに留まらせ、ケージに移動させた。

２）実験方法
幽門結紮６時間後、麻酔後に安楽死させた後、胃を除去して胃液を取って実験に用いた。２％のヘモグロビンを５００μｌずつ各チューブに入れ、３７℃で３～４分熱を加えた後、各チューブに胃液を１００μｌずつ入れる。次いで、１０分間３７℃で熱を加える。後に１ｍｌのＴＣＡ１６％をそれぞれのチューブに入れ、６０００ｘｇで３０分間遠心分離する。そこから出たそれぞれのチューブから上澄み液を取り、２０℃で一定時間反応させた後、２８０ｎｍで吸光度を測定した。ペプシン活性度は、下式６によって計算し、その結果を表１８及び図２５に示した。

その結果、前記表１８及び図２５に示すように、対照群で最も活性度が高い結果を確認し、ＦＧＫＰ実験群、陽性対照群では、高濃度に行くほどペプシンの活性度が低くなった。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１：ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓＬａｃｔｉｓＶＩ－０１ＫＣＴＣ１４３５１ＢＰ
ＳＥＱＩＤＮＯ：２：ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉＶＩ－０２ＫＣＴＣ１４３５２ＢＰ

［微生物寄託］
１）寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１４３５１ＢＰ
受託日付：２０２０．１１．０３．
２）寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１４３５２ＢＰ
受託日付：２０２０．１１．０３．

Claims

キウイを乳酸菌で発酵させたキウイ発酵物を有効成分として含む胃機能改善用組成物。
前記乳酸菌は、キウイ由来の乳酸菌であることを特徴とする請求項１に記載の胃機能改善用組成物。
前記キウイ由来の乳酸菌は、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus Lactis）ＶＩ－０１ＫＣＴＣ１４３５１ＢＰ及びラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）ＶＩ－０２ＫＣＴＣ１４３５２ＢＰのうちの１つ以上であることを特徴とする請求項２に記載の胃機能改善用組成物。
前記乳酸菌は、ラクトバチルス・エキシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）及びラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus Helveticus）で構成される群から選択される１つ以上の菌株を含むことを特徴とする請求項１に記載の胃機能改善用組成物。
前記キウイ発酵物は、組成物の総重量に対して３０～８０重量％含まれることを特徴とする請求項１に記載の胃機能改善用組成物。
前記組成物は、健康機能食品組成物であることを特徴とする請求項１に記載の胃機能改善用組成物。
前記健康機能食品組成物は、カプセル、精製、粉末、顆粒、液状、丸、片状、ペースト状、シロップ、ゲル、飲料、ゼリー及びバーで構成される群から選択される１つ以上の剤形であることを特徴とする請求項６に記載の胃機能改善用組成物。
前記組成物は、食品組成物であることを特徴とする請求項１に記載の胃機能改善用組成物。
前記食品組成物は、乳製品、飲料、ソース類、ジャム類及び製菓類で構成される群から選択される１つ以上の剤形であることを特徴とする請求項８に記載の胃機能改善用組成物。
キウイを乳酸菌で発酵させたキウイ発酵物を有効成分として含む消化機能改善用組成物。
キウイを乳酸菌で発酵させたキウイ発酵物を有効成分として含む胃粘膜損傷改善用組成物。
キウイを乳酸菌で発酵させたキウイ発酵物を有効成分として含む胃酸分泌抑制用組成物。
キウイを乳酸菌又はその培養液で発酵させて発酵物を得る段階を含む請求項１に記載のキウイ発酵物の製造方法。
前記乳酸菌は、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus Lactis）ＶＩ－０１ＫＣＴＣ１４３５１ＢＰ又はラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）ＶＩ－０２ＫＣＴＣ１４３５２ＢＰであることを特徴とする請求項１３に記載のキウイ発酵物の製造方法。
前記発酵は、ラクトバチルス・エキシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）及びラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus Helveticus）で構成される群から選択される１つ以上の菌株を更に用いて発酵させることを特徴とする請求項１３に記載のキウイ発酵物の製造方法。
前記培養液は、
第１培地に菌株をそれぞれ培養して第１培養産物を製造する段階と、
前記第１培養産物を第２培地に接種及び培養して第２培養産物を製造する段階と、
前記第２培養産物を遠心分離して上澄み液を除去して培養液を得る段階によって製造されることを特徴とする請求項１３に記載のキウイ発酵物の製造方法。
前記（ａ）段階でキウイ及び培養液は、７．５～８．５：２．５～１．５重量％の割合で混合することを特徴とする請求項１３に記載のキウイ発酵物の製造方法。
前記キウイ発酵物を乾燥及び粉末化する段階を更に含むことを特徴とする請求項１３に記載のキウイ発酵物の製造方法。
前記乾燥は、
液体窒素冷凍機（liquid nitrogen freezer、ＬＮＦ）を用いて発酵物を－１８０℃～－１９５℃で急速凍結する段階と、
急速凍結された発酵物を－３５℃～－４５℃で凍結乾燥する段階によって行うことを特徴とする請求項１８に記載のキウイ発酵物の製造方法。