WO2023068486A1 - 키위 발효물을 포함하는 위 기능 개선용 조성물 - Google Patents

키위 발효물을 포함하는 위 기능 개선용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2023068486A1
WO2023068486A1 PCT/KR2022/009764 KR2022009764W WO2023068486A1 WO 2023068486 A1 WO2023068486 A1 WO 2023068486A1 KR 2022009764 W KR2022009764 W KR 2022009764W WO 2023068486 A1 WO2023068486 A1 WO 2023068486A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fermented
composition
kiwi
product
gastric
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/009764
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이도행
손연경
권혁세
이나영
오현정
Original Assignee
(주)바이텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)바이텍 filed Critical (주)바이텍
Priority to JP2022569257A priority Critical patent/JP7511277B2/ja
Publication of WO2023068486A1 publication Critical patent/WO2023068486A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/38—Other non-alcoholic beverages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23P—SHAPING OR WORKING OF FOODSTUFFS, NOT FULLY COVERED BY A SINGLE OTHER SUBCLASS
    • A23P10/00—Shaping or working of foodstuffs characterised by the products
    • A23P10/20—Agglomerating; Granulating; Tabletting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23P—SHAPING OR WORKING OF FOODSTUFFS, NOT FULLY COVERED BY A SINGLE OTHER SUBCLASS
    • A23P10/00—Shaping or working of foodstuffs characterised by the products
    • A23P10/20—Agglomerating; Granulating; Tabletting
    • A23P10/28—Tabletting; Making food bars by compression of a dry powdered mixture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23P—SHAPING OR WORKING OF FOODSTUFFS, NOT FULLY COVERED BY A SINGLE OTHER SUBCLASS
    • A23P10/00—Shaping or working of foodstuffs characterised by the products
    • A23P10/30—Encapsulation of particles, e.g. foodstuff additives

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving gastric function containing a fermented kiwi product and a method for preparing a fermented kiwi product, and more particularly, to a composition for improving gastric function containing a fermented product of kiwi fermented with lactic acid bacteria derived from kiwi as an active ingredient. .
  • the stomach is part of the digestive tract, an organ in the form of a hollow sac that connects the esophagus to the small intestine.
  • the stomach is an organ that stores food entering through the esophagus for a while and controls the delivery of food to the duodenum through partial digestion to ensure efficient digestion and absorption in harmony with the secretion of pancreatic enzymes.
  • the stomach secretes gastric acid to digest it.
  • the gastric mucosal protective layer acts to prevent damage to the gastric mucosa by strong acidic gastric acid.
  • Gastritis refers to a case in which an inflammatory lesion is limited to the gastric mucosa
  • gastric ulcer refers to a case in which an ulcer has penetrated the gastric mucosa and reached the submucosa and muscle layer.
  • intestinal metaplasia changes may occur in the mucous membrane, and these changes may develop into gastric cancer, so it is necessary to maintain gastric health by improving gastric function. .
  • the kiwi fruit is a dioecious vine deciduous tree belonging to the genus Actinidia of the family Acinidiaceae and grows mainly in temperate regions. It is said that the fruit shape is covered with brown hairs and resembles a bird called 'Kiwi' that lives in New Zealand, so it was named kiwi.
  • Kiwi contains phenolic compounds known to contribute to various physiological activities as well as the taste and flavor of food, is rich in vitamins C and E, and contains a large amount of minerals such as folic acid, potassium, calcium, and phosphorus. It contains physiologically active substances beneficial to health, such as chlorophyll and carotenoids.
  • Korean Patent Registration No. 1081910 relates to a cosmetic composition containing a kiwi extract that has skin tone improvement and skin aging prevention effects, and the kiwi extract effectively inhibits the glycation reaction of the skin to improve skin tone and relieve skin wrinkles. It has been disclosed that Korean Patent No. 2027798 relates to an antioxidant composition containing fermented gold kiwi lactic acid bacteria as an active ingredient . It is disclosed that the content of total phenols and flavonoids is significantly increased compared to the antioxidant activity.
  • actinidin contained in kiwi is an enzyme that decomposes protein and is effective in promoting digestion, so it is known as a fruit that is helpful for stomach health.
  • actinidin contained in kiwi is an enzyme that decomposes protein and is effective in promoting digestion, so it is known as a fruit that is helpful for stomach health.
  • fermented kiwi to improve digestive function and gastric mucosal damage, and to improve gastric function by inhibiting secretion of gastric acid.
  • kiwifruit is not easy to consume due to its low shelf life due to its brittle nature and low preference after a certain period of time, so the development of appropriate processed food is required.
  • kiwifruit processed food is insignificant.
  • lactic acid bacteria are microorganisms that ferment sugars to produce lactic acid and various metabolites. Because they have various characteristics such as nutritional and health promotion effects and antibacterial effects by substance synthesis, studies on fermenting various foods based on these functionalities of lactic acid bacteria are being conducted.
  • kiwi is a lactic acid bacterium derived from kiwi , Lactococcus Lactis VI-01 KCTC 14351BP or its culture medium, Lactobacillus paracasei ) VI-02 KCTC 14352BP or in the case of a composition for improving gastric function containing fermented kiwifruit fermented with its culture medium as an active ingredient, improving the digestive function of the stomach and gastric mucosal damage, and suppressing the secretion of gastric acid to improve gastric function It was confirmed that it could be improved, and the present invention was completed.
  • the main object of the present invention is to provide a composition for improving gastric function, including fermented kiwifruit, which can improve gastric function by improving digestive function and gastric mucosal damage and inhibiting secretion of gastric acid.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a fermented product of kiwi using lactic acid bacteria derived from kiwi.
  • the present invention provides a composition for improving gastric function comprising, as an active ingredient, a fermented product of kiwifruit fermented with lactic acid bacteria.
  • the term 'improvement of gastric function' in the present invention refers to improving and enhancing the function of the stomach to maintain and promote the health of the stomach, specifically, by increasing the activity of digestive enzymes such as amylase, lipase and protease, and It means promoting and improving digestive function by improving motility, preventing and improving gastric mucosal damage by preventing gastritis and improving damaged gastric mucosa, and protecting the stomach by inhibiting gastric acid secretion.
  • the kiwi in the present invention may be a kiwi of the Actinidia chinensis genus (gold kiwi), and detailed varieties include Jessie Gold ( Actinidia chinensis Planch var. chinensis 'Jecy Gold'), Halla Gold ( Actinidia chinensis Planch var. chinensis 'Halla Gold') '), Haegum ( Actinidia chinensis Planch var. chinensis 'Haegum'), Zespri®Gold ( Actinidia chinensis Planch var. chinensis 'Hort16A'), Zespri®SunGold ( Actinidia chinensis Planch var.
  • chinensis 'Zesy002' Zespri®Zesy003 ( Actinidia chinensis Planch var. chinensis 'Zesy003'), Zespri®ZESH004 ( Actinidia chinensis Planch var. chinensis 'Zesh004'), Consorzio Dori Europe®Dori ( Actinidia chinensis Planch var. chinensis 'AC 1536') and Jingold® ( Actinidia chinensis Planch 'Jintao'), but is not limited thereto.
  • the lactic acid bacteria are kiwi-derived lactic acid bacteria, and the kiwi-derived lactic acid bacteria are Lactococcus Lactis VI-01 KCTC 14351BP and Lactobacillus paracasei VI-02 Characterized in that one or more of KCTC 14352BP.
  • the present inventors isolated lactic acid bacteria from strains isolated from kiwi and decoded the genome sequences of the selected strains through 16s rRNA analysis.
  • the strains selected through genome sequencing were named “ Lactococcus Lactis VI-01” and “ Lactobacillus paracasei VI-02”, and the Bioscience and Biotechnology Research Center (KCTC) on November 3, 2020, and were given accession numbers KCTC14351BP and KCTC14352BP, respectively.
  • the lactic acid bacteria may be lactic acid bacteria commonly used for fermentation in the art, preferably Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus , Lactobacillus gasseri, Lactobacillus delbrueckii ssp.
  • Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum
  • Lactobacillus plantarum Lactobacillus reuteri
  • Lactobacillus rhamnosus At least one strain selected from the group consisting of Lactobacillus salivarius, more preferably Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Lactobacillus Helveticus ) It is characterized by comprising one or more strains selected from the group consisting of.
  • the fermented kiwi product is characterized in that it is included in 30 to 80% by weight, preferably 30 to 60% by weight, based on the total weight of the composition. If the content of the fermented kiwi product is less than 30% by weight, it is difficult to show sufficient gastric function improvement effect, and if it exceeds 80% by weight, the effect of improving gastric function compared to the content is not sufficient, which is not preferable from an economic point of view.
  • the composition for improving gastric function of the present invention is characterized in that it is a health functional food composition.
  • the health functional food composition may have a convenient dosage form for ingestion and utilization, preferably capsules, tablets, powders, granules, liquids, pills, flakes, pastes, syrups, It is characterized in that it is at least one formulation selected from the group consisting of gels, beverages, jellies and bars.
  • a convenient dosage form for ingestion and utilization preferably capsules, tablets, powders, granules, liquids, pills, flakes, pastes, syrups, It is characterized in that it is at least one formulation selected from the group consisting of gels, beverages, jellies and bars.
  • conventional excipients, stabilizers, thickeners, and the like may be further included.
  • food additives may be additionally included, and the suitability as a “food additive” shall be determined according to the general rules of the Food Additive Code and general test methods approved by the Ministry of Food and Drug Safety, unless otherwise specified. judged by
  • the composition for improving gastric function of the present invention is characterized in that it is a food composition.
  • the food composition may be formulated as a food that can use fermented kiwi as a main component, preferably one selected from the group consisting of dairy products, beverages, sauces, jams and baked goods It is characterized by the above formulation.
  • the present invention provides a composition for improving digestive function comprising, as an active ingredient, a fermented product of kiwifruit fermented with lactic acid bacteria.
  • the fermented kiwi product according to the present invention has excellent digestive enzymes such as amylase, lipase and protease activity (see Experimental Example 5), gastric emptying ability (see Experimental Example 6) and gastrointestinal motility. (See Experimental Example 7) was confirmed to be excellent.
  • the present invention provides a composition for improving gastric mucosal damage comprising fermented kiwifruit fermented with lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • the fermented kiwi product according to the present invention has an excellent antioxidant effect (see Experimental Example 4), restores the damaged gastric mucosa (see Experimental Example 8), and reduces inflammation in the gastric mucosa (see Experimental Example 8).
  • Experimental Example 9 was confirmed.
  • the present invention provides a composition for inhibiting gastric acid secretion comprising, as an active ingredient, a fermented product of kiwifruit fermented with lactic acid bacteria.
  • the fermented kiwi product according to the present invention inhibits gastric acid secretion (see Experimental Example 11).
  • the present invention provides a method for producing a fermented kiwi product comprising fermenting kiwi with lactic acid bacteria or a culture medium thereof to obtain a fermented product.
  • the term 'culture medium' of the present invention refers to a product obtained by culturing the lactic acid bacteria derived from kiwi according to the present invention in a known medium, and the product includes lactic acid bacteria.
  • kiwifruit contains various effective substances, it has low preference as a health food because it is not easy to consume due to its low shelf life due to its easily brittle nature and its low preference after a certain period of time. Accordingly, the present inventors confirmed that when the fermented kiwifruit produced by culturing kiwifruit with lactic acid bacteria or a culture medium thereof is powdered using LNF (liquid nitrogen freezer), it can be prepared into an easy-to-ingest formulation.
  • LNF liquid nitrogen freezer
  • the kiwi fruit itself may be used, but it may be preferably prepared and used as kiwi puree.
  • Kiwi puree can be prepared by peeling the skin of kiwi, cutting the flesh, grinding it using a grinding machine, and then removing the seeds using a sieve.
  • the lactic acid bacteria is a kiwi-derived strain
  • the kiwi-derived strain is Lactococcus Lactis VI-01 KCTC14351BP or Lactobacillus paracasei VI-02 KCTC14352BP includes being
  • the fermentation can be performed by additionally using lactic acid bacteria commonly used for fermentation in the art, preferably Lactobacillus paracasei, Lactobacillus Acidophilus Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus (Lactobacillus delbrueckii ssp.
  • lactic acid bacteria commonly used for fermentation in the art, preferably Lactobacillus paracasei, Lactobacillus Acidophilus Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus (Lactobacillus delbrueckii ssp.
  • Lactobacillus fermentum Lactobacillus plantarum , Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus and At least one strain selected from the group consisting of Lactobacillus salivarius, more preferably Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Lactobacillus Helveticus ) It includes fermenting using one or more strains selected from the group consisting of.
  • the culture medium comprises the steps of culturing each strain in a first medium (seed culture) to produce a first culture product (seed culture medium), the first culture product in a second medium Inoculating and culturing (mass culture) to prepare a second culture product (mass culture medium), and centrifuging the second culture product to remove the supernatant to obtain a culture medium.
  • first medium and the second medium may be the same or different, and any industrial medium used in the art for culturing the strain may be used, preferably MRS Broth.
  • the step of preparing the first culture product may be prepared by inoculating the strain with 0.01 to 0.5% of each medium and culturing at 35 ° C to 37 ° C for 18 to 28 hours.
  • the step of preparing the second culture product may be prepared by inoculating the strain at 0.01 to 1% of the medium and culturing at 35 ° C to 37 ° C for 7 to 10 hours.
  • the kiwifruit and the culture medium may be mixed in a ratio of 7.5 to 8.5: 2.5 to 1.5% by weight, preferably 8: 2% by weight.
  • the fermented kiwifruit can be used in liquid form, but further comprising drying and powdering to use in powder form.
  • the drying is performed by rapidly freezing the fermented product at -180 ° C to -195 ° C, preferably at -195 ° C using a liquid nitrogen freezer (LNF). and freeze-drying the quick-frozen fermentation product at -35°C to -45°C, preferably at -40°C.
  • LNF liquid nitrogen freezer
  • the survival rate of viable bacteria after drying can be increased by minimizing damage to lactic acid bacteria applied during the freeze-drying process, and the sugar component in kiwi Browning caused by can be minimized.
  • LNF liquid nitrogen freezer
  • the composition containing the fermented kiwifruit according to the present invention can improve gastric function by improving digestive function of the stomach and gastric mucosal damage, and inhibiting the secretion of gastric acid.
  • kiwi can be prepared as a processed food or food additive in liquid or powder form that is easy to ingest.
  • FIG. 1 is a diagram showing Gram staining of deposited strains according to the present invention.
  • Figure 2 is a view showing the formation of a transparent ring according to the calcium carbonate decomposition of the deposited strain according to the present invention.
  • Figure 3 is a view of observing the morphology of the deposited strain Lactococcus Lactis VI-01 KCTC 14351BP according to the present invention.
  • Figure 4 is a view of observing the morphology of the deposited strain Lactobacillus paracasei VI-02 KCTC 14352BP according to the present invention.
  • 5 is a phylogenetic tree of the deposited strain Lactococcus Lactis VI-01 KCTC 14351BP according to the present invention.
  • Figure 6 is a phylogenetic tree of the deposited strain Lactobacillus paracasei VI-02 KCTC 14352BP according to the present invention.
  • 11 and 12 are results confirming the degree of inhibition of gastric mucosal damage of the fermented kiwi product according to the present invention.
  • FIGS. 13 to 18 show the results confirming the improvement of the gastric mucosa of the fermented kiwifruit according to the present invention (FIGS. 13 to 15; western blotting, FIGS. 16 to 18; ELISA).
  • 19 and 20 are results of measuring the length of the gastric line.
  • 21 to 24 are the results of confirming the degree of gastric acid secretion.
  • Gold kiwi fruit and puree were used to separate lactic acid bacteria from gold kiwi.
  • Gold kiwi fruit was purchased from Zespri Gold Kiwi imported from New Zealand at a mart in September 2020, washed with tertiary distilled water to remove foreign substances, and then cut into small pieces, including the peel, and used.
  • Gold kiwi puree was purchased from Namyang Frozen Food Co., Ltd. in May 2020, stored at -20 ° C, completely melted at room temperature and mixed evenly before use in the experiment.
  • Chopped gold kiwi and puree were fermented under salting and degreasing conditions.
  • salting conditions each sample was salted for 3 hours by adding 8% of cheil salt, and then sterilized 1% fructooligosaccharide solution was mixed. Oligosaccharide solutions were mixed. All mixed samples were corrected to pH 6.0 or higher using sodium hydroxide solution, and fermented for about 3 days in a 37°C incubator.
  • the two separated strains were arbitrarily named VI-01 and VI-02, and were prepared as stocks using 30% glycerol and stored at -80 ° C.
  • API 50 CHL kit Biomerieux, France
  • apiweb program http://apiweb.biomerieux.com ). I sympathized with it.
  • PCR was performed using 27F and 1492R primers and sequencing analysis was performed by requesting Biofact Co., Ltd.
  • the nucleotide sequence of each identified strain was compared for homology with the 16S ribosomal RNA gene sequence registered in GenBank using the blast program of NCBI, and aligned using the ClustalX 2.1 program using the neighbor-joining method.
  • the phylogenetic tree used the bootstrap N-J tree method of ClustalX 2.1 and was confirmed with the NJplot program.
  • strain VI-01 As a result of confirming the nucleotide sequence of 1,414 bp through 16S rRNA gene analysis of strain VI-01 strain, it showed 100% homology with Lactococcus lactis NBRC 100933 strain. Therefore, strain VI-01 was named Lactococcus lactis VI-01 (SEQ ID NO: 1).
  • VI-02 strain As a result of confirming the nucleotide sequence of 1,441 bp through 16S rRNA gene analysis of strain VI-02 strain, it showed 99% homology with Lactobacillus paracasei R094 strain. Therefore, the VI-02 strain was named Lactobacillus paracasei VI-02 (SEQ ID NO: 2).
  • strain VI-01 was confirmed to be 98.4% similar to Lactococcus lactis
  • strain VI-02 was confirmed to be 99.6% similar to Lactobacillus paracasei .
  • Biochemical characteristics of the isolated strains were measured using API 50 CHL kit.
  • the pure cultured colony on the MRS agar medium was diluted in API 50 CHL medium to an appropriate concentration and inoculated into the API 50 CHL kit, then cultured at 37 ° C for 24 to 48 hours and the color change of the inoculated medium was observed.
  • lactis VI-01 strain used a total of 19 sugars, including galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, mannitol, maltose, and lactose among 49 sugars, but it was confirmed that sorbitol or xylitol could not be used ( Table 1).
  • L. paracasei VI-02 strain used 22 sugars, including galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, mannitol, and sorbitol among 49 sugars, but lactose and xylitol were not used ( Table 2).
  • strain L. paracasei VI-02 is 1.5-2.5 mm round and convex, and has white or creamy luster.
  • long chains were formed as bacilli (FIG. 4).
  • Deposited strains 1 and 2 are novel strains isolated from kiwifruit in the present invention, and general strains 1 and 2 are commercially available strains.
  • the deposited strains isolated from kiwifruit in the present invention showed a higher survival rate in acidic conditions of artificial gastric juice than the general strains. It was found that the acid resistance of the deposited strain of the present invention isolated from kiwi at a pH level of 3 to 4 was remarkably excellent.
  • the survival rate was confirmed by measuring the number of viable cells after treatment with artificial bile.
  • a sample inoculated with 1% of the cells in a sterilized MRS borth and cultured at 37 ° C for 18 hours was pretreated with artificial gastric juice for 2 hours, and then mixed with 87ml of MRS broth and 3ml of 10% Oxgall solution and artificial gastric juice pretreated sample 10 ml of the mixture was cultured at 37 ° C. for 4 hours, and the treated sample was spread on a plate, and the survival rate was calculated by checking the number of colonies generated.
  • Table 7 As a result of the test, in the case of the bile acid test, artificial gastric juice was treated and then artificial bile acid was treated to confirm the final result in order to correct for the digestive process of the human body.
  • kiwifruit of the genus Actinidia chinensis (gold kiwifruit) was used.
  • Kiwi fruit is washed several times, and fruit kiwi fruit that can be used as a raw material is selected.
  • the selection criteria are to select fruits that have no damage when observed with the naked eye, that are not rotten or contaminated with bacteria, and that have a sugar content of 13 Brix% or more (if not exceeded, go through a post-ripening process). Peel the skin of the selected fruit and cut the flesh.
  • the cut flesh is put into a centrifugal separator and ground, and the seeds filtered through a sieve are removed and stirred to homogenize.
  • the lactic acid bacteria used to prepare fermented kiwifruit were L. paracasei VI-02 KCTC14352BP and Lc.lactis VI-01 KCTC14351BP strains isolated in the previous experiment, Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei ), Lactobacillus Helveticus ( Lactobacillus Helveticus ) Fermentation was carried out by mixing three types of Lactobacillus strains, and in the case of three types of Lactobacillus strains, products from Sacco were used.
  • Seed culture was cultured with MRS Broth. In the specific culture method, each strain was inoculated with 0.1% of each medium and then cultured at 37° C. for 24 hours to obtain a first culture product (strain). Sterilization was performed at 121° C. for 15 minutes.
  • Mass culture was carried out using the first culture product. After inoculating the first culture product in the MRS medium, the second culture product was obtained by culturing at 37° C. for 9 hours. Sterilization was performed at 121° C. for 20 minutes.
  • the first culture product obtained by culturing only one strain is inoculated into MRS medium for mass culture, and when one or more strains are used, each obtained by culturing one or more strains separately All of the first culture products are inoculated into one medium (MRS medium) and mass-cultured.
  • the first culture products cultured with the strain are inoculated and cultured in the same amount, or preferably, the first culture product cultured with the deposited strain is inoculated at 25 to 50% by weight, and the general (Commercial) The first culture products cultured strains are inoculated and cultured so that the sum is 50% by weight.
  • the cultured lactic acid bacteria are centrifuged to concentrate the culture medium containing the lactic acid bacteria.
  • the mixed raw materials are incubated at 37°C for 8 to 12 hours.
  • the prepared fermented product was rapidly frozen and freeze-dried, and then pulverized and powdered to prepare a fermented product powder (FGKP) of kiwifruit.
  • FGKP fermented product powder
  • the fermented product is quickly frozen using a Liquid Nitrogen Freezer, and in the freeze drying, the fermented raw material is freeze-dried at -40 ° C or less.
  • the fermented kiwi powder (FGKP) prepared in Example was suspended at room temperature for 3 hours or more at a concentration of 100 mg/ml, diluted to an appropriate concentration, and used in the experiment.
  • L-ascorbic acid was used as a positive control, and each sample was mixed with a diluted solution of each concentration and DPPH at a concentration of 6.3mg/50ml at a ratio of 1:9, reacted in the dark for 10 minutes, and then measured absorbance at 517 nm. And the results are shown in Table 9 and FIG. 7 below.
  • Powder of fermented kiwifruit (FGKP; Example) suspended at room temperature for 3 hours or more at a concentration of 100 mg/ml was diluted to an appropriate concentration.
  • As a positive control L-ascorbic acid was used, and a mixture of 7 mM ABTS solution and 2.4 mM potassium persulfate was left in the dark for more than 16 hours.
  • Table 9 and FIG. 8 The results are shown in Table 9 and FIG. 8 below.
  • the antioxidant effect was 96% at 100 ⁇ g/ml of L-ascorbic acid, and the fermented kiwi product (FGKP) according to the present invention has an antioxidant effect as the concentration increases. increased.
  • ⁇ -Amylase activity For the measurement of ⁇ -Amylase activity, a prepared enzyme solution (a solution diluted to a concentration of 1% in distilled water) was used. Lipase activity was measured by slightly modifying the method of Lee et al. (1999) and Cao et al. (2015). A substrate in which a solution of 4-nitrophenyl acetate dissolved in acetonitrile to a concentration of 10 mM, ethanol and 100 mM sodium phosphate buffer solution (pH 7.0) were mixed at a ratio of 1:4:95 (v/v/v) before the experiment. 200 ul of the enzyme solution was added to 1.8 mL of the solution, reacted at 37° C. for 20 minutes, and then absorbance was measured at 405 nm.
  • test solution was added to 1.5 mL of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.5), equilibrated in a water bath at 37 °C for about 1 minute, and then 0.1 mL of substrate solution was added and reacted for 10 minutes. Subsequently, 0.4 mL of a 50% acetic acid solution was added to the reaction solution to stop the enzyme reaction, and then the absorbance was measured at 405 nm using a spectrophotometer. At this time, the blank test was corrected after measuring the absorbance using 0.1 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer instead of 0.1 ml of the test solution.
  • the amount of p-nitroaniline released from the substrate by the action of the protease was quantified using a calibration curve prepared with p-nitroaniline standards, and 1 unit (U) of enzyme activity is the amount of enzyme required to release 1 uM of p-nitroaniline per minute. It was expressed in terms of conversion per 1 g (dry weight base) of one sample. It is shown in Table 10 below.
  • Enzyme foods contain enzymes ( ⁇ -Amylase, Protease) and are approved as enzyme foods (products containing grain enzymes, products containing embryo enzymes, etc.) It should have an enzyme titer. As shown in Table 10, ⁇ -Amylase, Lipase, and Protease are 121.5 ⁇ 1.98 U / g, 4.42 ⁇ 0.01 U / g, and 21.15 ⁇ 0.07 U / g, respectively. A similar level of enzyme titer was confirmed.
  • mice were divided into 6 groups with 8 animals per group. After acclimatization was completed, the experimental animals were fasted for 48 hours, and then each test substance was orally administered.
  • HPMC was used as an excipient, and 2 ml of 3% HPMC was orally administered to the normal group (NOR) and the control group (CON), and to the experimental group, the powder (FGKP) of the fermented kiwifruit prepared in Example was given by concentration (FGKP 50 mg/kg, 125 mg/kg, 250 mg/kg) was mixed with 3% HPMC and then administered orally. In the positive control group, 30 mg/kg of itopride was mixed with 3% HPMC and then administered orally.
  • distilled water was intraperitoneally administered to the normal group (NOR), and cisplatin was intraperitoneally administered at a concentration of 10 mg/kg to the control group (CON), experimental group (FGKP), and positive control group (itopride).
  • CON control group
  • FGKP experimental group
  • itopride positive control group
  • 0.5% phenol red was used as a liquid meal and mixed with 1.5% HPMC was orally administered to all groups.
  • control group (CON) showed a significantly lower value as 20.1 ⁇ 10.9 compared to the normal group (NOR) 67.7 ⁇ 5.3, and the FGKP experimental group was concentration dependent compared to the control group. It was confirmed that the gastric emptying capacity was significantly increased. Itopride, a positive control group, also showed higher significance in gastric emptying capacity compared to the control group.
  • distilled water was intraperitoneally administered to the normal group (NOR), and atropine was intraperitoneally administered at a concentration of 1 mg/kg to the control group (CON), experimental group (FGKP), and positive control group (mosapride).
  • CON control group
  • FGKP experimental group
  • mosapride positive control group
  • FITC-dextran was orally administered at a concentration of 6.25 mg/ml by 0.1 ml each using an evaluation diet.
  • the isolated small intestine was regularly divided into 10 segments, and the amount of FITC-dextran in each segment was measured using fluorescence to calculate a geometric center (G.C).
  • the G.C calculation method contained each segment in a tube, put 3 ml of 0.05M Tris buffer into each tube, stirred, and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes.
  • the control group (CON) significantly decreased to 3.77 ⁇ 0.57 compared to the normal group (NOR) 6.55 ⁇ 0.58
  • the experimental group FGKP group was at low, medium, and high concentrations, respectively. It was measured as 4.98 ⁇ 0.38, 5.81 ⁇ 0.42, and 5.12 ⁇ 0.43, and showed high significance together with the positive control Mosapride group, and the highest value was shown in the FGKP group (125 mg/kg).
  • Experimental animals were divided into 6 groups, 8 animals per group, and the experiment was conducted. They were fasted for 24 hours before inducing acute gastritis, and drinking water was provided ad libitum.
  • the experimental group (FGKP) was orally administered the fermented kiwifruit powder (FGKP) prepared in Example at concentrations of 50 mg/kg, 125 mg/kg, and 250 mg/kg, respectively, and the positive control group (Sucralfate) was administered to the gastric mucosa.
  • Sucralfate which has a protective effect, was orally administered at a concentration of 50 mg/kg.
  • distilled water was orally administered to the normal group (NOR), and 2 ml of a mixture of 150 mM HCl and 60% ethanol was orally administered to the experimental group (FGKP) and the positive control group (sucralfate).
  • the excised gastric tissue was fixed with pins, fixed in 2% PFA for 30 minutes, and images were taken using an optical digital camera (DSC-HX50V, Sony, Tokyo, Japan).
  • the area of the actual damaged area (Equation 3) was measured using the image-J program, and then the damage ratio (Equation 4) was expressed in comparison with the total area of the stomach.
  • the results are shown in Table 13 and FIG. 11. and shown in FIG. 12 .
  • Experimental animals were divided into 6 groups, 8 animals per group, and the experiment was conducted. They were fasted for 24 hours before inducing acute gastritis, and drinking water was provided ad libitum.
  • the experimental group (FGKP) was orally administered the fermented kiwifruit powder (FGKP) prepared in Example at concentrations of 50 mg/kg, 125 mg/kg, and 250 mg/kg, respectively, and the positive control group (Sucralfate) was administered to the gastric mucosa.
  • Sucralfate which has a protective effect, was orally administered at a concentration of 50 mg/kg.
  • distilled water was orally administered to the normal group (NOR), and 2 ml of a mixture of 150 mM HCl and 60% ethanol was orally administered to the experimental group (FGKP) and the positive control group (sucralfate).
  • protease inhibitors and RIPA buffer [140 mM, Tris-HCl (25 mM, pH 7.4), 0.1% SDS, 1% Triton X-100], grind with a tissue grinder, and place on ice for 15 minutes. After leaving it on, it was centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes.
  • iNOS and COX-2 protein expressions were measured by western blotting with gastric tissue proteins, and PGE 2 , TNF- ⁇ and IL-6 contents were measured using an ELISA kit to confirm the amount of change.
  • Western blotting results are shown in Table 14 and FIGS. 13 to 15, and ELISA results are shown in Table 15 and FIGS. 16 to 18.
  • the control group significantly increased the expression of both TNF- ⁇ and IL-6 compared to the normal group.
  • the FGKP-administered group showed a tendency to significantly decrease compared to the control group.
  • the control group was 19.43 ⁇ 1.85ng/mg, which was significantly reduced compared to the normal group of 43.26 ⁇ 2.12ng/mg.
  • the positive control group increased to 25.59 ⁇ 1.68ng/mg compared to the control group, and the FGKP experimental group increased to 21.56 ⁇ 1.85, 24.34 ⁇ 2.81, and 36.01 ⁇ 2.02, respectively.
  • Experimental animals were divided into 6 groups, 8 animals per group, and the experiment was conducted. They were fasted for 24 hours before inducing acute gastritis, and drinking water was provided ad libitum.
  • the experimental group (FGKP) was orally administered the fermented kiwifruit powder (FGKP) prepared in Example at concentrations of 50 mg/kg, 125 mg/kg, and 250 mg/kg, respectively, and the positive control group (Sucralfate) was administered to the gastric mucosa.
  • Sucralfate which has a protective effect, was orally administered at a concentration of 50 mg/kg.
  • distilled water was orally administered to the normal group (NOR), and 2 ml of a mixture of 150 mM HCl and 60% ethanol was orally administered to the experimental group (FGKP) and the positive control group (sucralfate).
  • the extracted stomach was fixed in 4% PFA for 24 hours, and then dehydrated using xylen to prepare a paraffin tissue specimen. Subsequently, 4 ⁇ m-thick slices were prepared using a cutting machine and attached to slide glass. After removing the paraffin, the tissue sections were stained using hematoxylin and eosin (H&E), and the stained tissue sections were observed at x100 magnification using an optical microscope (zeiss, Germany), and the gastric glands were analyzed using an i-solution image analysis program. gastric gland) was measured, and the results are shown in Table 16 and FIGS. 19 and 20.
  • H&E hematoxylin and eosin
  • mice were divided into 5 groups with 8 animals per group. After acclimatization, the experimental animals were fasted for 24 hours, and then each test substance was orally administered. Distilled water was orally administered to the control group (CON), and the experimental group was orally administered with the fermented kiwifruit powder (FGKP) prepared in Example at concentrations of 50 mg/kg, 125 mg/kg, and 250 mg/kg. To the positive control group (Sucralfate), 50 mg/kg of Sucralfate was orally administered. After 30 minutes of sample administration, each group was anesthetized with isoflurane, and then the abdominal cavity was opened about 2 cm, and the pyloric region connecting the stomach and duodenum was ligated. The incised abdominal cavity was sutured, and then moved to a cage after staying in a recovery chamber.
  • CON control group
  • FKP fermented kiwifruit powder
  • the gastric acid volume of the control group was measured the most, and the amount of gastric juice decreased as the concentration increased in the FGKP experimental group.
  • the positive control Sucralfate, it was confirmed that the volume of gastric acid was reduced compared to the control group.
  • the pH of the positive control group also increased compared to that of the control group.
  • acidity and free acidity were found to be the highest in the control group, and in the positive control group as well as in the FGKP experimental group, lower measured values were obtained as the concentration increased.
  • mice were divided into 5 groups with 8 animals per group. After acclimatization, the experimental animals were fasted for 24 hours, and then each test substance was orally administered. Distilled water was orally administered to the control group (CON), and the experimental group was orally administered with the fermented kiwifruit powder (FGKP) prepared in Example at concentrations of 50 mg/kg, 125 mg/kg, and 250 mg/kg. To the positive control group (Sucralfate), 50 mg/kg of Sucralfate was orally administered. After 30 minutes of sample administration, each group was anesthetized with isoflurane, and then the abdominal cavity was opened about 2 cm, and the pyloric region connecting the stomach and duodenum was ligated. The incised abdominal cavity was sutured, and then moved to a cage after staying in a recovery chamber.
  • CON control group
  • FKP fermented kiwifruit powder
  • SEQ ID NO:1 Lactococcus Lactis VI-01 KCTC14351BP
  • SEQ ID NO:2 Lactobacillus paracasei VI-02 KCTC14352BP

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 키위를 유산균으로 발효한 키위 발효물을 유효성분으로 포함하는 위 기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 본 발명에 따른 키위 발효물을 포함하는 조성물은 위의 소화기능 및 위점막 손상을 개선하고, 위산의 분비를 억제함으로써 위 기능을 개선할 수 있다.

Description

키위 발효물을 포함하는 위 기능 개선용 조성물
본 발명은 키위 발효물을 포함하는 위 기능 개선용 조성물 및 키위 발효물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 키위 유래 유산균으로 발효한 키위 발효물을 유효성분으로 포함하는 위 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
위는 소화관의 일부분으로 식도와 샘창자를 이어주는 속이 빈 주머니 형태의 기관이다. 위는 식도를 통하여 들어오는 음식물을 잠시 동안 저장하고 일부 소화 작용을 거쳐 십이지장으로 음식물을 보내는 것을 조절하여 췌장효소의 분비와 조화를 이루어 효율적인 소화와 흡수가 되도록 하는 장기이다. 위는 음식물이 들어오면 이를 소화시키기 위해 위산을 분비하는데, 이때 위점막 보호층이 강한 산성인 위산에 의해 위점막이 손상되지 않도록 작용한다.
사람의 위 기능에 부정적 영향을 미치는 요인은 유전적, 생리학적, 환경적 및 정신적 요인 등으로 다양하다. 이러한 다양한 요인으로 인해 위의 운동 능력이 저하될 경우 소화불량, 속 쓰림, 더부룩함, 구토 등의 증상이 나타날 수 있으며, 이러한 증상이 3개월 이상 지속될 경우를 기능성 위장장애라고 한다. 또한, 위산의 과다분비 될 경우 위산에 의해 위점막 보호층이 손상되게 되는데, 이 때 위에 염증이 발생하게 되고, 이 염증이 지속적으로 반복될 경우 위염 및 위궤양을 유발할 수 있다. 위염은 염증에 의한 병변이 위점막에 한정되어 있을 경우를 말하고, 위궤양은 위점막을 뚫고 점막하 조직과 근육층까지 궤양을 형성했을 경우를 말한다. 더욱이, 만성 위염이 반복되고 악화될 경우, 점막에 장상피화생(Intestinal Metaplasia) 변화가 생일 수도 있는데, 이러한 변화는 위암으로까지 발전시킬 가능성이 있으므로, 위 기능을 개선하여 위 건강을 유지할 필요가 있다.
키위(kiwi fruit)는 다래나무과(Acinidiaceae) 다래나무속(Actinidia)에 속하는 자웅이주의 넝쿨성 낙엽과수로 주로 온대지역에서 자란다. 열매 형태가 갈색 털로 덮여 있어 뉴질랜드에 서식하는 '키위'라는 새와 닮아 키위라고 이름이 붙여졌다고 하며, 우리나라에서는 양다래, 참다래라 부르기도 한다. 키위는 식품의 맛, 향미뿐만 아니라 다양한 생리활성에 기여한다고 알려진 페놀성 화합물을 함유되어 있고, 비타민 C, 비타민 E가 풍부하며, 엽산, 칼륨, 칼슘, 인 등의 무기질이 다량 함유되어 있을 뿐만 아니라 클로로필, 카로티노이드와 같은 건강에 유익한 생리활성물질을 함유되어 있다. 이와 같이 키위에는 다양한 생리활성물질 등이 포함되어 있어 키위를 이용한 다양한 연구가 계속해서 진행되고 있다. 구체적으로, 한국등록특허 제1081910호는 키위 추출물을 함유하는 피부톤 개선 및 피부노화방지 효과가 있는 화장료 조성물에 관한 것으로, 키위 추출물이 피부의 당화반응을 효과적으로 억제함으로써 피부톤을 개선하고 피부 주름을 완화시킬 수 있음이 개시되어 있다. 한국등록특허 제2027798는 골드키위 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물에 관한 것으로, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 배양액으로 발효하여 제조된 골드키위 유산균 발효물은 발효하지 않은 골드키위에 비해 총 페놀 및 플라보노이드의 함량이 현저히 증가되어 항산화 활성이 우수함이 개시되어 있다. 또한, 키위에 함유된 액티니딘은 단백질을 분해하는 효소로 소화 촉진에 효과적이기 때문에 위 건강에 도움이 되는 과일로서 알려져 있다. 그러나 종래 기술에는 키위 발효물이 소화기능 및 위점막 손상을 개선하고, 위산의 분비를 억제함으로써 위 기능을 개선하는 효과에 대해서는 언급된 바 없다.
또한, 키위는 다양한 효능이 있음에도 불구하고 키위의 쉽게 물러지는 성질로 인한 낮은 저장성과 일정 기간이 지나면 기호도가 떨어지는 단점으로 인하여 섭취가 용이하지 않아 적절한 가공식품의 개발이 요구되고 있으나, 키위의 가공식품은 미미한 실정이다.
한편, 유산균(lactic acid bacteria)은 당류를 발효하여 젖산 및 다양한 대사산물을 생산하는 미생물로서 유산균 발효에 의해 생산되는 대사산물은 풍미증진, 길항물질 생성에 의한 인체유해 미생물 억제, 비타민과 같은 인체유용물질 합성에 의한 영양 및 건강증진효과, 항균효과 등 다양한 특성을 갖기 때문에 유산균의 이러한 기능성을 바탕으로 다양한 식품을 발효시키는 연구들이 진행되고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 키위를 키위 유래 유산균인 락토코쿠스 락티스(Lactococcus Lactis) VI-01 KCTC 14351BP 또는 이의 배양액, 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) VI-02 KCTC 14352BP 또는 이의 배양액으로 발효시킨 키위 발효물을 유효성분으로 포함하는 위 기능 개선용 조성물의 경우, 위의 소화기능 및 위점막 손상을 개선하고, 위산의 분비를 억제함으로써 위 기능을 개선할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 위의 소화기능 및 위점막 손상을 개선하고, 위산의 분비를 억제함으로써 위 기능을 개선할 수 있는 키위 발효물을 포함하는 위 기능 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 키위 유래 유산균을 이용한 키위 발효물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 키위를 유산균으로 발효한 키위 발효물을 유효성분으로 포함하는 위 기능 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에서의 용어 ‘위 기능 개선’은 위의 건강을 유지하고 증진시킬 수 있도록 위의 기능을 개선하고 향상시키는 것으로, 구체적으로는 아밀라아제, 리파아제, 프로테아제와 같은 소화 효소의 활성을 증가시키고 위의 운동성을 향상시킴으로써 소화 기능을 촉진 및 개선하고, 위염을 방지하고 손상된 위점막을 개선함으로써 위점막 손상을 예방 및 개선하며, 위산 분비를 억제함으로써 위를 보호하는 것을 의미한다.
본 발명에서의 키위는 Actinidia chinensis 속(골드키위)의 키위일 수 있으며, 세부 품종으로는 제시골드(Actinidia chinensis Planch var. chinensis ‘Jecy Gold’), 한라골드(Actinidia chinensis Planch var. chinensis ‘Halla Gold’), 해금(Actinidia chinensis Planch var. chinensis ‘Haegum'), 제스프리골드 Zespri®Gold (Actinidia chinensis Planch var. chinensis ‘Hort16A’), 제스프리썬골드 Zespri®SunGold (Actinidia chinensis Planch var. chinensis ‘Zesy002’), 제스프리 제시003 Zespri®Zesy003 (Actinidia chinensis Planch var. chinensis ‘Zesy003’), 제스프리 제쉬004 Zespri®ZESH004 (Actinidia chinensis Planch var. chinensis ‘Zesh004’), 도리 Consorzio Dori Europe®Dori (Actinidia chinensis Planch var. chinensis 'AC 1536') 및 진골드 Jingold® (Actinidia chinensis Planch 'Jintao')로 구성된 군에서 선택되는 키위일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 위 기능 개선용 조성물에 있어서, 상기 유산균은 키위 유래 유산균으로, 상기 키위 유래 유산균은 락토코쿠스 락티스(Lactococcus Lactis) VI-01 KCTC 14351BP 및 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) VI-02 KCTC 14352BP 중 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명자들은 키위로부터 분리된 균주들로부터 유산균을 분리하고 선별된 균주를 16s rRNA 분석을 통해 유전체 염기서열을 해독하였다. 또한, 유전체 염기서열 해독을 통해 선별된 균주를 “락토코쿠스 락티스(Lactococcus Lactis) VI-01” 및 “락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) VI-02”로 명명하고, 생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2020년 11월 3일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC14351BP, KCTC14352BP를 각각 부여받았다.
본 발명의 위 기능 개선용 조성물에 있어서, 상기 유산균은 당업계에서 일반적으로 발효에 이용하는 유산균일 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 델브루에키이 서브스피시즈 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 엑시도필러스(Latobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus Helveticus)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 위 기능 개선용 조성물에 있어서, 상기 키위 발효물은 조성물 총 중량 대비 30 내지 80 중량%, 바람직하게는 30 내지 60 중량% 포함되는 것을 특징으로 한다. 상기 키위 발효물의 함량이 30 중량% 미만일 경우 충분한 위 기능 개선 효과를 나타내기 어려우며, 80 중량% 초과할 경우 함량 대비 위 기능 개선 효과가 충분하지 못하여 경제적인 측면에서 바람직하지 못하다.
본 발명의 위 기능 개선용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 위 기능 개선용 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 섭취와 활용에 편리한 제형을 가질 수 있고, 바람직하게는 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 음료, 젤리 및 바로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 한다. 이러한 제형으로 제조하기 위하여 통상의 부형제, 안정제, 증점제 등을 더 포함할 수 있다. 또한, 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물" 으로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
본 발명의 위 기능 개선용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 위 기능 개선용 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 키위 발효물을 주성분으로 이용 가능한 식품으로 제형화될 수 있으며, 바람직하게는 유제품, 음료, 소스류, 잼류 및 제과류로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 키위를 유산균으로 발효한 키위 발효물을 유효성분으로 포함하는 소화 기능 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 본 발명에 따른 키위 발효물은 소화 효소인 아밀라아제, 리파아제 및 프로테아제의 활성이 우수하고(실험예 5 참조), 위배출능(실험예 6 참조) 및 위장관 운동능(실험예 7 참조)이 우수한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 키위 발효물이 소화 기능을 개선할 수 있으며, 이러한 소화 기능의 개선은 최종적으로는 위 기능을 개선함으로써 위 건강을 증진시킬 수 있음을 시사한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 키위를 유산균으로 발효한 키위 발효물을 유효성분으로 포함하는 위 점막 손상 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 본 발명에 따른 키위 발효물은 항산화 효과가 우수하고(실험예 4 참조), 손상된 위점막을 회복시키며(실험예 8 참조), 위점막에서의 염증을 감소(실험예 9)시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 키위 발효물이 위점막의 손상을 예방 및 개선할 수 있으며, 이러한 위점막 손상의 예방 및 개선은 최종적으로는 위 기능을 개선함으로써 위 건강을 증진시킬 수 있음을 시사한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 키위를 유산균으로 발효한 키위 발효물을 유효성분으로 포함하는 위산 분비 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 본 발명에 따른 키위 발효물은 위산 분비를 억제하는 것을 확인하였다(실험예 11 참조). 이러한 결과는 본 발명에 따른 키위 발효물이 위산 분비를 억제함으로써 위점막을 보호할 수 있으며, 이러한 위산 분비의 억제는 최종적으로는 위 기능을 개선함으로써 위 건강을 증진시킬 수 있음을 시사한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 키위를 유산균 또는 이의 배양액으로 발효시켜 발효물을 얻는 단계를 포함하는 키위 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 용어 ‘배양액’은 본 발명에 따른 키위 유래의 유산균을 공지의 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하며, 상기 산물은 유산균을 포함한다.
키위는 다양한 효능 물질들을 포함하고 있지만 쉽게 물러지는 성질로 인한 낮은 저장성과 일정 기간이 지나면 기호도가 떨어지는 단점으로 인하여 섭취가 용이하지 않아 건강식품으로서의 선호도가 낮다. 이에 본 발명자들은 키위를 유산균 또는 이의 배양액으로 배양하여 제조한 키위 발효물을 LNF(liquid nitrogen freezer)를 이용하여 분말화할 경우, 섭취가 용이한 제형으로 제조할 수 있음을 확인하였다.
상기 키위는 과실 자체를 이용할 수도 있으나, 바람직하게는 키위 퓨레로 제조하여 이용할 수 있다. 키위 퓨레는 키위의 과피를 벗겨 과육을 세절하고 마쇄기를 이용하여 마쇄한 후 거름망을 이용하여 씨를 제거함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 키위 발효물의 제조방법에 있어서, 상기 유산균은 키위 유래 균주로서, 상기 키위 유래 균주는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus Lactis) VI-01 KCTC14351BP 또는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) VI-02 KCTC14352BP인 것을 포함한다.
본 발명의 키위 발효물의 제조방법에 있어서, 상기 발효는 당업계에서 일반적으로 발효에 이용하는 유산균을 추가적으로 이용하여 발효시킬 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 델브루에키이 서브스피시즈 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주, 더 바람직하게는 락토바실러스 엑시도필러스(Latobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus Helveticus)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주를 더 이용하여 발효시키는 것을 포함한다.
본 발명의 키위 발효물의 제조방법에 있어서, 상기 배양액은 제1 배지에 균주를 각각 배양(종균배양)하여 제1 배양산물(종배양액)을 제조하는 단계, 상기 제1 배양산물을 제2 배지에 접종 및 배양(대량배양)하여 제2 배양산물(대량배양액)을 제조하는 단계, 및 상기 제2 배양산물 원심분리하여 상등액을 제거하여 배양액을 수득하는 단계를 통해 제조된 것을 포함한다. 상기에서 제1 배지 및 제2 배지는 동일하거나 상이할 수 있으며, 균주를 배양하기 위하여 당업계에서 이용하는 어떠한 산업배지도 이용가능하며, 바람직하게는 MRS Broth일 수 있다.
상기 제1 배양산물(종배양액)을 제조하는 단계는 균주를 각각의 배지의 0.01 내지 0.5%로 접종한 뒤 35℃ 내지 37℃에서 18시간 내지 28시간 배양하여 제조할 수 있다. 상기 제2 배양산물(대량배양액)을 제조하는 단계는 균주를 배지의 0.01 내지 1%씩 접종한 뒤, 35℃ 내지 37℃에서 7시간 내지 10시간 배양하여 제조할 수 있다.
본 발명의 키위 발효물의 제조방법에 있어서, 상기 키위 및 배양액은 7.5~8.5:2.5~1.5 중량% 비율로 혼합할 수 있으며, 바람직하게는 8:2 중량% 비율로 혼합하는 것을 포함한다.
본 발명의 키위 발효물의 제조방법에 있어서, 상기 키위 발효물을 액상 형태로 이용 가능하나, 파우더 형태로 이용하기 위하여 건조 및 분말화하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 키위 발효물의 제조방법에 있어서, 상기 건조는 액체질소동결기(liquid nitrogen freezer, LNF)를 이용하여 발효물을 -180℃ 내지 -195℃에서, 바람직하게는 -195℃에서 급속동결하는 단계, 및 급속동결된 발효물을 -35℃ 내지 -45℃에서, 바람직하게는 -40℃에서 동결건조하는 단계를 통해 수행하는 것을 포함한다.
본 발명의 건조단계에서 액체질소동결기(LNF)를 이용하여 급속동결을 먼저 진행할 경우, 동결건조 과정에서 가해지는 유산균들의 데미지를 최소화함으로써 건조 후 생균의 생존율을 증가시킬 수 있으며, 키위 내의 당 성분에 의한 갈변현상을 최소화할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 키위 발효물을 포함하는 조성물은 위의 소화기능 및 위점막 손상을 개선하고, 위산의 분비를 억제함으로써 위 기능을 개선할 수 있다. 또한, 키위를 섭취가 용이한 액상 또는 파우더 형태의 가공식품 또는 식품 첨가제로 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 기탁 균주를 그람 염색한 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 기탁 균주의 탄산칼슘 분해에 따른 투명환 형성을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 기탁 균주 Lactococcus Lactis VI-01 KCTC 14351BP의 형태를 관찰한 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 기탁 균주 Lactobacillus paracasei VI-02 KCTC 14352BP의 형태를 관찰한 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 기탁 균주 Lactococcus Lactis VI-01 KCTC 14351BP의 계통수이다.
도 6은 본 발명에 따른 기탁 균주 Lactobacillus paracasei VI-02 KCTC 14352BP의 계통수이다.
도 7 및 도 8는 본 발명에 따른 키위 발효물의 항산화 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 키위 발효물의 위배출능을 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 키위 발효물의 위장관 운동능 평가 결과이다.
도 11 및 도 12는 본 발명에 따른 키위 발효물의 위점막 손상 억제도를 확인한 결과이다.
도 13 내지 18은 본 발명에 따른 키위 발효물의 위점막 개선을 확인한 결과이다(도 13 내지 도 15; western blotting, 도 16 내지 18; ELISA).
도 19 및 도 20은 위선 길이를 측정한 결과이다.
도 21 내지 도 24는 위산 분비도를 확인한 결과이다.
도 25는 펩신 활성도를 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
준비예 1: 미생물의 분리 및 확인
1) 분리원 및 시료 전처리
골드키위로부터 유산균 분리를 위해 골드키위 생과와 퓨레를 사용하였다. 골드키위 생과는 뉴질랜드에서 수입된 제스프리 골드키위를 2020년 9월에 마트에서 구매하였으며, 3차 증류수로 세척하여 이물을 제거한 후 껍질을 포함하여 잘게 잘라 사용하였다. 골드키위 퓨레는 ㈜남양냉동식품의 골든키위퓨레를 2020년 5월에 구매하였고, -20℃에 보관하며 사용 시 실온에 완전히 녹여 고르게 혼합하여 실험에 사용하였다.
2) 자연 발효
잘게 자른 골드키위와 퓨레는 염장 조건과 탈지 조건으로 발효하였다. 염장 조건은 각각의 시료에 8%의 첨일염을 첨가해 3시간 동안 염장한 후 멸균한 1% 프락토올리고당 용액을 혼합하였고, 탈지 조건은 각각의 시료에 멸균한 2% 탈지와 1% 프락토올리고당 용액을 혼합하였다. 혼합 한 모든 시료는 수산화나트륨 용액을 사용해 pH를 6.0 이상으로 보정하였고, 37℃ 배양기에서 약 3일 동안 발효하였다.
3) 유산균 선별 및 동정
발효한 시료는 고르게 혼합한 후, 발효액 일부를 취하여 BCP plate count agar(EIKEN, Japan)를 사용해 접종하여 37℃에서 48시간 배양하였다. 이후 배지가 노란색을 띠며 phenotype이 서로 colony를 대상으로 MRS agar (Difco, USA) 평판배지를 사용하여 순수분리 하였다. 순수분리한 균주는 colony의 특성을 확인하고, 현미경 관찰(×1000)을 통해 세포의 형태를 확인하였으며, 그람염색을 통해 그람양성을 나타내는 균주만을 1차 선별하였다(도 1). 이후 탄산칼슘 (DAEJUNG, Korea)이 1% 함유된 MRS agar 배지에 접종하여 37℃에서 48시간 배양하여 유기산에 의해 탄산칼슘을 분해해 투명환 (clear zone)이 크게 형성된 균주 2종을 최종 선별하였다(도 2).
분리한 2종 균주는 임의로 VI-01, VI-02로 명명하였고, 30% glycerol을 사용해 stock으로 제조하여 -80℃에 보관하였다. 2종 균주의 당분해능, arginin과 esculin 분해능 등의 생화학적 특성 확인을 위해 API 50 CHL kit (Biomerieux, France)를 사용해 medium의 색 변화를 apiweb program (http://apiweb.biomerieux.com)을 이용하여 동정하였다.
16s rRNA 분석은 ㈜바이오팩트에 의뢰하여 27F와 1492R primer를 사용한 PCR 수행 및 sequencing 분석을 진행하였다. 확인된 각 균주의 염기서열은 NCBI의 blast program을 사용하여 GenBank에 등록된 16S ribosomal RNA gene sequence와 상동성을 비교하였고, neighbor-joining method를 적용한 ClustalX 2.1 프로그램을 사용해 alignment 하였다. 계통수는 ClustalX 2.1의 bootstrap N-J tree 방법을 사용하였고 NJplot 프로그램으로 확인하였다.
4) 유전체 염기서열 해독
Strain VI-01 균주의 16S rRNA 유전자 분석을 통해 1,414bp 크기의 염기서열을 확인한 결과, Lactococcus lactis NBRC 100933 strain과 100%의 상동성을 나타내었다. 따라서 VI-01 균주를 Lactococcus lactis VI-01이라 명명하였다(서열번호 1).
Strain VI-02 균주의 16S rRNA 유전자 분석을 통해 1,441bp 크기의 염기서열을 확인한 결과, Lactobacillus paracasei R094 strain과 99%의 상동성을 나타내었다. 따라서 VI-02 균주를 Lactobacillus paracasei VI-02라 명명하였다(서열번호 2).
5) 당 이용성조사를 통한 동정
분리균주의 API 50 CHL kit를 사용하여 당 이용성 조사를 통한 균 동정 결과 strain VI-01은 Lactococcus lactis와 98.4%의 유사성이 확인되었으며, Strain VI-02는 Lactobacillus paracasei와 99.6%의 유사성이 확인되었다.
준비예 2: 균주의 생화학적 및 형태학적 특성
1) 생화학적 특성
분리 균주의 생화학적 특성은 API 50 CHL kit로 측정하였다. MRS agar 배지에 순수배양한 colony를 API 50 CHL medium에 적정농도로 희석하여 API 50 CHL kit에 접종한 후, 37℃에서 24~48시간 동안 배양하며 접종된 medium의 색 변화를 관찰하였다.
Lc. lactis VI-01 균주는 49개의 당 중 galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, mannitol, maltose, lactose등 총 19개의 당을 이용하였으나, sorbitol이나 xylitol 등은 이용하지 못하는 것으로 확인되었다(표 1).
No. 당 종류 이용성 No. 당 종류 이용성
1 Glycerol - 26 Salicine +
2 Erythritol - 27 Cellobiose +
3 D-Arabinose - 28 Maltose +
4 L-Arabionse - 29 Lactose +
5 Ribose + 30 Melibiose -
6 D-Xylose - 31 Sanccharose +
7 L-Xylose - 32 Trehalose +
8 Adonitol - 33 Inuline -
9 β-Methl-xyloside - 34 Melezitose -
10 Galactose + 35 D-Raffinose -
11 D-Glucose + 36 Amidon +
12 D-Fructose + 37 Glycogen -
13 D-Mannose + 38 Xylitol -
14 L-Sorbose - 39 β Gentiobiose +
15 Rhamnose - 40 D-Turanose -
16 Dulicitol - 41 D-Lyxose -
17 Inositol - 42 D-Tagatose -
18 Mannitol + 43 D-Fucose -
19 Sorbitol - 44 L-Fucose -
20 α Methyl-D-mannoside - 45 D-Arabitol -
21 α Methyl-D-glucoside - 46 L-Arabitol -
22 N acetyl glucosamine + 47 Gluconate +
23 Amygdaline + 48 2 ceto-gluconate -
24 Arbutine + 49 5 ceto-gluconate -
25 Esculin +
L.paracasei VI-02 균주는 당 49개 중 galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, mannitol, sorbitol 등을 포함하여 22개의 당을 이용하였고, lactose와 xylitol 등은 이용하지 못하였다(표 2).
No. 당 종류 이용성 No. 당 종류 이용성
1 Glycerol - 26 Salicine +
2 Erythritol - 27 Cellobiose +
3 D-Arabinose - 28 Maltose +
4 L-Arabionse - 29 Lactose -
5 Ribose + 30 Melibiose -
6 D-Xylose - 31 Sanccharose +
7 L-Xylose - 32 Trehalose +
8 Adonitol - 33 Inuline -
9 β-Methl-xyloside - 34 Melezitose +
10 Galactose + 35 D-Raffinose -
11 D-Glucose + 36 Amidon -
12 D-Fructose + 37 Glycogen -
13 D-Mannose + 38 Xylitol -
14 L-Sorbose - 39 β Gentiobiose +
15 Rhamnose - 40 D-Turanose +
16 Dulicitol - 41 D-Lyxose -
17 Inositol - 42 D-Tagatose +
18 Mannitol + 43 D-Fucose -
19 Sorbitol + 44 L-Fucose -
20 α Methyl-D-mannoside - 45 D-Arabitol -
21 α Methyl-D-glucoside - 46 L-Arabitol +
22 N acetyl glucosamine + 47 Gluconate +
23 Amygdaline + 48 2 ceto-gluconate -
24 Arbutine + 49 5 ceto-gluconate -
25 Esculin +
2) 형태학적 특성
형태학적 특성은 MRS agar 배지에서 배양한 균주의 콜리니 형태와 색 등을 확인하였으며, 현미경으로 균주 형태를 관찰하였다.
Lc.lactis VI-01 균주의 colony는 0.5-1.5 mm의 작고 둥근 형태이며, 흰색의 광택이 있는 형태이다. 현미경으로 균주의 형태를 관찰한 결과 구균으로 확인되었다(도 3).
L.paracasei VI-02 균주의 colony 형태는 1.5-2.5 mm의 둥글고 볼록한 형태이며, 흰색 또는 크림색의 광택이 있다. 현미경 관찰 결과 간균으로 long chain을 형성하였다(도 4).
준비예 3: 균주기탁
16S RNA sequence 분석과 형태학적인 특성을 확인하고 최종적으로 균주 확인 작업을 진행한 뒤 생물자원센터에 기탁절차를 진행하여 기탁번호를 부여받았다(표 3).
균주명 기탁번호
Lactococcus Lactis VI-01 KCTC 14351BP
Lactobacillus paracasei VI-02 KCTC 14352BP
상기와 같이 신규 분리된 기탁 균주의 활성을 확인하기 위한 실험을 진행하기 위하여 하기 표 4와 같이 시험군의 구성을 설정하여 내산성 시험, 인공위액 저항성 시험 및 인공담즙산 저항성 시험을 진행하였다. 기탁균주 1 및 2는 본 발명에서 키위로부터 분리한 신규 균주이며, 일반균주 1 및 2는 상업적으로 판매되는 균주이다.
균주명
기탁균주 1 Lactobacillus paracasei VI-02
기탁균주 2 Lactococcus lactis VI-01
일반균주 1 Lactobacillus paracasei
일반균주 2 Lactococcus lactis
실험예 1: 내산성 시험
멸균한 MRS broth 30mL를 50mL conical tube에 옮겨 담은 후, 균액 1%를 접종하여 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양액은 4,500 rpm 조건에서 10분 이상 원심분리하여 균체를 완전히 가라앉힌 후, 상등액만 제거하였다. 상등액을 제거하고 균체만 담겨있는 50mL conical tube에 pH 2.0과 pH 3.0 PBS buffer 제거한 상등액과 동량으로 첨가하여 고르게 혼합하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 시료 일부를 취하여 0.85% NaCl solution을 사용해 적정 농도로 희석하고, MRS agar 배지에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 콜로니가 15~300개가 분포한 MRS agar plate를 선별하여 콜로니를 계수하여 결과를 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
구분 생존율 pH 2 생존율 pH 3
기탁균주 1 75.3 % 91.5 %
기탁균주 2 69.4 % 90.1 %
일반균주 1 34.2 % 69.4 %
일반균주 2 31.3 % 65.3 %
그 결과, 상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 키위로부터 분리한 기탁균주들이 일반균주들 대비 생존율이 높은 것으로부터 내산성이 우수한 것을 확인할 수 있다.
실험예 2: 인공위액 저항성 시험
1% pepsin solution을 제조하고 멸균된 MRS Broth 30ml을 50ml conical tube에 옮겨 담은 후, 각 실험샘플의 균액 1%를 접종하여 37℃에서 18시간동안 배양하였다. pH 2.5 MRS broth 89mL에 1% pepsin solution 10mL를 첨가한 후, 배양액 1%를 혼합하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하며, 배양 0, 1, 2시간에 시료 일부를 취하여 0.85% NaCl solution을 사용해 적정농도로 희석한 후, MRS agar 배지에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 생균수의 확인을 통하여 생존률을 측정하여 결과를 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
구분 생존율
기탁균주 1 67.2%
기탁균주 2 61.4%
일반균주 1 27.4%
일반균주 2 20.7%
그 결과, 상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 키위로부터 분리한 기탁균주들이 일반균주에 비해서 인공위액의 산성조건에서의 생존율이 높은 것으로 나타났다. pH 3~4 정도의 수준인 키위에서 분리된 본 발명의 기탁균주의 내산성이 현저히 우수한 것으로 나타났다.
실험예 3: 인공담즙산 저항성 시험
내담즙산 시험의 경우 위를 거친 후 십이지장 내에서 담즙으로 인한 생존 가능성 및 활성 유지 등을 확인할 수 있는 실험방법으로써 인공담즙 처리에 후 생균수를 측정하여 생존률 확인하였다.
구체적으로, 멸균된 MRS borth에 균체를 1% 접종하여 37℃에서 18시간 동안 배양한 샘플을 인공위액에 2시간 전처리를 진행한 후 MRS broth 87ml과 10% Oxgall solution 3ml을 혼합하고 인공위액 전처리 샘플을 10ml 혼합하여 37℃에서 4시간 배양하여 처리한 샘플을 Plate 도말한 뒤 생성된 콜로니 수를 확인하여 생존율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 시험결과 인체의 소화과정에 대한 보정을 위해 담즙산시험의 경우 인공위액 처리 후 인공 담즙산을 처리하여 최종결과를 확인하였다.
구분 생존율
기탁균주 1 58.2 %
기탁균주 2 51.4 %
일반균주 1 13.7 %
일반균주 2 10.1 %
그 결과, 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 인공 위액에 전 처리하여 생존률이 감소된 상태에서 인공담즙산의 처리시 본 발명에서 키위로부터 분리한 기탁균주들의 경우 모두 50%이상의 생존률을 나타난 것에 비해 일반균주의 경우 30%대의 생존율만 나타내어 기탁균주들의 활성의 소화기내에서의 위액이나 담즙산등의 소화효소에 대해 활성이 높은 것으로 나타났다.
실시예 : 유산균을 이용한 키위 발효물의 제조
1) 키위입고
다양한 품종의 키위 사용이 가능하나, 본 발명에서는 Actinidia chinensis 속(골드키위)의 키위를 사용하였다.
2) 전처리과정(키위 퓨레제조)
키위 과실을 수회 세척하고, 원료로 사용할 수 있는 과실 키위를 선별한다. 선별기준은 육안으로 관찰하였을 때 과실에 상처가 없는 것, 썩거나 균에 오염되지 않는 것, 당도가 13 Brix% 이상(넘지 않을 시 후숙과정을 거침)인 것을 선별한다. 선별된 과실의 과피를 벗기고 과육을 세절한다.
3) 마쇄·씨분리과정(키위 퓨레제조)
마쇄·씨분리는 세절된 과육을 원심분리 마쇄기에 투입하여 마쇄하고, 거름망에 걸러진 씨를 제거 후 교반하여 균질한다.
4) 유산균 배양과정(종배양-탱크배양-원심분리)
4-1) 유산균 균종
키위 발효물을 제조하기 위해 이용하는 유산균은 이전 실험에서 분리한 L.paracasei VI-02 KCTC14352BP, Lc.lactis VI-01 KCTC14351BP 균주에 락토바실러스 엑시도필러스(Latobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus Helveticus) 3종의 락토바실러스 균종을 혼합하여 발효를 진행하였고, 3종의 락토바실러스 균종의 경우 Sacco사 제품을 사용하였다.
4-2) 배양과정
4-2-1) 종균배양
종균배양은 MRS Broth로 배양하였다. 구체적인 배양 방법은 각 균주를 각각의 배지의 0.1%로 접종한 뒤, 37℃에서 24시간 배양하여 제1 배양산물(균주)을 수득하였다. 멸균은 121℃에서 15분 동안 실시하였다.
4-2-2) 대량배양
대량배양은 상기 제1 배양산물을 이용하여 실시하였다. MRS 배지에 제1 배양산물을 접종한 후 37℃에서 9시간 배양하여 제2 배양산물을 수득하였다. 멸균은 121℃에서 20분 동안 실시하였다.
대량배양은 하나의 균주만을 이용할 경우에는 하나의 균주만을 배양하여 수득한 제1 배양산물을 MRS 배지에 접종하여 대량배양하고, 하나 이상의 균주를 이용할 경우에는 하나 이상의 균주를 각각 배양하여 수득한 각각의 제1 배양산물 모두를 하나의 배지(MRS 배지)에 접종하여 대량배양한다.
대량배양 단계에서 하나 이상의 균주를 접종할 경우 균주를 배양한 제1 배양산물들을 동일한 양으로 접종하여 배양하거나, 바람직하게는 기탁균주를 배양한 제1 배양산물을 25 내지 50 중량%로 접종하고 일반(commercial)균주를 배양한 제1 배양산물들은 합이 50 중량%가 되도록 접종하여 배양한다.
4-2-3) 원심분리 및 농축
배양이 완료된 유산균을 원심분리하여 유산균이 포함된 배양액을 농축한다.
5) 혼합
원료(키위퓨레)와 유산균 배양액을 8:2 비율로 혼합한다. 구체적인 구성 및 접종량은 하기 표 8과 같다.
키위 발효물 제조를 위한 구성 대량 배양 시 균주(제1 배양산물)의 접종량(중량%)
키위퓨레 + Lb. paracasei VI-02 + Lc. lactis VI-01 + Lb. casei + Lb. acidophillus + Lb. Helveticus 25:25:16.5:16.5:16.5
6) 발효
상기 혼합한 원료를 37℃에서 8~12시간 배양한다.
7) 분말화
실험에 이용하기 위하여 상기 제조된 발효물을 급속동결 및 동결건조한 후, 분쇄하여 분말화하여 키위 발효물 분말(FGKP)을 제조하였다.
상기 급송 동결은 Liquid Nitrogen Freezer를 이용하여 발효물을 급속 동결시키고, 동결건조는 발효된 원료를 -40℃ 이하에서 동결건조한다.
8) 분쇄
건조된 원료를 분말화한다.
준비예 4: 동물 모델의 준비
6주령 수컷 Sprague-Dawley(SD) Rat를 구입 후 사육시설에서 7일간 순화 기간을 거친 후 실험에 투입하였다(온도: 22±2°C, 습도: 40~60%, 명암주기: 12시간). 사육기간 동안 사육실 온·습도는 8시간 단위로 확인하였다.
실험예 4: 항산화 효과 확인
1) DPPH radical 소거 활성 측정
실시예에서 제조한 키위 발효물의 분말(FGKP)은 100 mg/ml의 농도로 3시간 이상 실온에서 현탁한 뒤 적정 농도로 희석하여 실험에 사용하였다. 양성 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였고 각 시료를 농도별로 희석한 용액과 6.3mg/50ml의 농도의 DPPH를 1:9로 혼합하여 10분 동안 암소 상태에서 반응 시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 9 및 도 7에 나타내었다.
2)ABTS radical 소거 활성 측정
100 mg/ml의 농도로 3시간 이상 실온에서 현탁한 키위 발효물의 분말(FGKP; 실시예)을 적정 농도로 희석하였다. 양성 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였고 7mM ABTS 용액과 2.4mM의 potassium persulfate를 혼합하여 16시간 이상 암소상태에서 방치하였다. 방치된 ABTS 스톡에서 ABTS+를 형성시킨 후 734 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02가 되게 absolute ethanol로 희석한 후 희석된 용액과 시료를 9:1 비율로 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 9 및 도 8에 나타내었다.
AA100 FGKP 1.25 FGKP 2.5 FGKP 5 FGKP 10
DPPH (%) 96.88±0.30 6.35±0.65 16.67±1.45 39.73±2.87 90.23±2.01
ABTS (%) 92.33±2.52 31.67±2.08 41.00±1.00 65.00±2.00 94.33±2.52
그 결과 상기 표 9 및 도7, 8에서 나타내는 바와 같이, L-ascorbic acid 100μg/ml에서는 항산화 효과가 96%로 나타났고, 본 발명에 따른 키위 발효물(FGKP)은 농도가 증가할수록 항산화 효과가 증가하였다.
실험예 5: 소화효소 활성 측정
1) 아밀라아제 활성 측정
실시예에서 제조한 키위 발효물의 분말(FGKP) 0.1 g에 증류수 10 ml(1% 용액)를 가하고 밀봉 후 실온에서 4시간 진탕 후 원심분리하여 얻어진 상등액을 효소액으로 사용하였다. 1% 전분용액 1.0 ml에 미리 조제한 효소액 1.0 ml를 첨가하고 40℃에서 30분간 반응시킨 후 1 M 초산용액 10 ml를 가하여 반응을 정지시키고, 0.00025 N 요오드 용액 10 ml를 가하여 발색시킨 다음 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 공시험 (blank)으로서 효소액 대신 증류수를 사용하여 동일한 방법으로 반응시킨 후 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 반응액의 흡광도 측정값이 공시험 (blank)의 흡광도 값을 기준으로 10% 감소시키는 것을 1 unit로 하여 시료 1.0 g (dry weight base)당으로 환산하여 나타내었다. 결과는 표 10에 나타내었다.
2) 리파아제 활성 측정
α-Amylase 활성 측정을 위하여 준비한 효소액 (증류수에 1%의 농도로 희석한 용액)을 사용하였다. Lipase 활성은 Lee 등 (1999) 및 Cao 등 (2015)의 방법을 약간 변형하여 측정하였다. acetonitrile에 10 mM 농도가 되도록 4-nitrophenyl acetate를 용해시킨 용액과 ethanol 및 100 mM sodium phosphate 완충용액 buffer (pH 7.0)를 실험 전에 1:4:95 (v/v/v)의 비율로 혼합한 기질용액 1.8 mL에 효소액 200 ul를 가하고 37℃에서 20분간 반응시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 공시험 (blank)으로서 효소액 대신 증류수를 사용하여 동일한 조건에서 실험한 것을 공시험 용액으로 하였다. 별도로 p-nitrophenol 표준품을 사용하여 검량곡선을 기준으로 lipase의 활성을 계산하였으며, lipase의 1 U는 1분당 1 uM의 p-nitrophenol을 유리시키는 효소의 양으로 하여 시료 1 g (dry weight base) 당으로 환산하여 나타내었다. 결과는 표 10에 나타내었다.
3) 프로테아제 활성 측정
실시예에서 제조한 키위 발효물의 분말(FGKP) 0.10 g을 취하여 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.5) 10 mL를 가한 다음 분말이 완전히 용해될 때까지 voltexing (약 10초)하였다. 이어서 왕복 진탕기를 사용하여 약 10분간 진탕한 다음 원심분리(4500 rpm, 7분)한 후 상등액을 시험액으로 사용하였으며, 모든 시료는 실험에 사용할 때까지 4℃ 이하의 냉장실에 보관하였다. 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.5) 1.5 mL에 시험액 0.1 mL를 가한 다음 37℃의 수욕조에서 약 1분간 평형화시킨 후 기질 용액 0.1 mL를 가하고 10분간 더 반응시켰다. 이어서 반응액에 50% acetic acid 용액 0.4 mL를 가하여 효소반응을 정지시킨 후 분광광도계를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 공시험 (blank)은 시험액 0.1 mL 대신 0.1 M sodium phosphate buffer 0.1 ml를 사용하여 흡광도를 측정한 후 보정하였다. Protease의 작용으로 기질로부터 유리된 p-nitroaniline의 양은 p-nitroaniline 표준품으로 작성한 검량선을 사용하여 정량하였으며, 효소 활성의 1 unit (U)는 분당 1 uM의 p-nitroaniline을 유리시키는데 필요한 효소의 양으로 한 시료 1 g (dry weight base) 당으로 환산하여 나타내었다. 하기 표 10에 나타내었다.
α-Amylase Lipase Protease
Enzymes (U/g) 121.5 ± 1.98 4.42 ± 0.01 21.15 ± 0.07
※ 모든 실험은 3회 반복 실험 후 평균 및 표준편차로 표시함.
효소식품은 효소(α-Amylase, Protease)를 함유하여 식품공전 상의 효소식품(곡류 효소 함유 제품, 배아 효소 함유 제품 등)으로 허가받은 제품으로서, 효소 역가 표시 규정은 α-Amylase, Protease의 표시량 이상의 효소 역가를 가지면 된다. 상기 표 10에서 나타내는 바와 같이, α-Amylase, Lipase, Protease는 각각 121.5±1.98 U/g, 4.42±0.01 U/g, 21.15±0.07 U/g의 수치로서, 시중의 대표적인 효소 제품들의 측정결과와 유사한 수준의 효소 역가가 확인되었다.
실험예 6: 위배출능 측정
1) 동물모델
실험동물은 군당 8마리로 6그룹으로 나누어 실험하였다. 순화를 마친 실험동물을 48시간 절식시킨 후 각각의 시험물질을 경구 투여하였다. HPMC를 부형제로 사용하였으며 정상군(NOR)과 대조군(CON)에는 3% HPMC를 2ml 경구 투여하였고, 실험군에는 실시예에서 제조한 키위 발효물의 분말(FGKP)을 농도별로(FGKP 50 mg/kg, 125 mg/kg, 250 mg/kg) 3% HPMC와 섞은 후 경구 투여하였다. 양성대조군에는 itopride 30 mg/kg를 3% HPMC와 섞은 후 경구 투여하였다. 그와 동시에 정상군(NOR)에는 증류수를 복강투여 하였고 대조군(CON), 실험군(FGKP), 양성대조군(itopride)에는 cisplatin을 10 mg/kg의 농도로 복강 투여하였다. 1시간 후 0.5% phenol red를 평가식이(liquid meal)로 사용하여 1.5% HPMC를 섞어 모든 군에게 경구 투여하였다.
2) 실험방법
위에 남아있는 Phenol red의 양을 측정하기 위하여 위 배출 지연 유발물질인 cisplatin으로 위 배출 지연을 유발한 후 20분 후에 isoflurane으로 흡입마취와 함께 안락사를 시킨 후 식도 부분과 십이지장부분을 묶고 위를 적출하였다. 적출한 위는 멸균된 비커에 담아 0.1N NaOH 100 ml를 넣고 20초 동안 homogenize 시켜주었다. 완전히 갈아진 위와 위 내용물은 1시간 동안 실온에 방치시킨 후 그 내용물 5 ml을 취해서 0.5 ml의 20% TCA 용액과 섞어준다. 충분히 섞어준 후 2500xg로 20분간 원심분리 시킨 후 튜브에 상층액 2 ml을 분리한 뒤 0.5 N NaOH 2 ml을 섞어준다. 충분히 반응 시킨 후 microplate spectrophotometer을 이용하여 560nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. 위 배출능의 변화를 측정한 결과를 하기 식 1(Gastric emptying rate(%))을 이용하여 환산하였으며, 그 결과를 표 11 및 도 9에 나타내었다.
[식 1]
Figure PCTKR2022009764-appb-img-000001
NOR CON FGKP 50 FGKP 125 FGKP 250 Itopride 30
Gastric emptying
(%)		 67.7±5.3 20.1±10.9 42.1±7.3 43.6±5.7 58.6±8.8 59.1±4.4
그 결과 상기 표 11 및 도 9에서 나타내는 바와 같이, 대조군(CON)은 20.1±10.9로서 정상군(NOR) 67.7±5.3에 비해 유의적으로 낮은 수치를 보여 주었으며, FGKP 실험군은 농도 의존적으로 대조군에 비해 유의적으로 위 배출능 수치가 높아지는 것을 확인하였다. 양성대조군인 Itopride에서도 대조군에 비해 위 배출능 수치가 높은 유의성을 보여주었다.
실험예 7: 위장관 운동능 평가
1) 동물모델
실험동물은 군당 8마리로 6그룹으로 나누어 실험하였다. 순화를 마친 실험동물을 48시간 절식시킨 후 각각의 시험물질을 경구 투여하였다. HPMC를 부형제로 사용하여 정상군(NOR)과 대조군(CON)에는 3% HPMC를 2 ml 경구 투여하였고, 실험군에는 실시예에서 제조한 키위 발효물의 분말(FGKP)을 농도별로(FGKP 50 mg/kg, 125 mg/kg, 250 mg/kg) 3% HPMC와 섞은 후 경구 투여하였다. 양성대조군에는 mosapride 10 mg/kg를 3% HPMC와 섞은 후 경구 투여하였다. 그와 동시에 정상군(NOR)에는 증류수를 복강 투여하였고 대조군(CON), 실험군(FGKP), 양성대조군(mosapride)에는 atropine을 1 mg/kg의 농도로 복강 투여하였다. 1 시간 후 FITC-dextran을 평가식이로 사용하여 6.25 mg/ml의 농도로 0.1ml 씩 경구 투여하였다.
2) 실험방법
FITC-dextran을 경구 투여한 15분 후 마취하여 안락사 시킨 후 소장 부분만을 다시 분리하여 소장의 끝부분을 실로 묶어 소장의 내용물이 흐르지 않도록 고정한다. 분리한 소장은 10개 분절로 일정하게 나눈 뒤 각 분절마다의 FITC-dextran의 양을 fluorescence를 이용하여 측정하여 G.C(geometric center)를 산출하였다. G.C 산출 방법은 각각의 분절을 튜브에 담고 0.05M Tris buffer를 3ml씩 각각의 튜브에 넣고 교반시킨 뒤 1200rpm에서 5분간 원심분리 시켜주었다. 원심분리가 끝나면 상층액을 취해서 microplate spectrophotometer를 이용하여 490~520 nm에서 fluorescent signal을 측정하였다. 위장관 전이의 변화를 확인하기 위해 하기 식 2(Geometric center)를 이용하여 환산하였으며, 그 결과를 표 12 및 도 10에 나타내었다.
[식 2]
Figure PCTKR2022009764-appb-img-000002
NOR CON FGKP 50 FGKP 125 FGKP 250 Mosapride 10
Geometric center
(cm)		 6.55±
0.58		 3.77±
0.57		 4.98±0.38 5.81±0.42 5.12±0.43 5.58±0.42
그 결과 상기 표 12 및 도 10에서 나타내는 바와 같이, 대조군(CON)은 3.77±0.57으로 정상군(NOR) 6.55±0.58에 비해 현격하게 감소하였으며, 실험군인 FGKP군은 저농도, 중농도, 고농도에서 각각 4.98±0.38, 5.81±0.42, 5.12±0.43으로 측정되었으며 양성대조군인 Mosapride군과 함께 높은 유의성을 보여주었으며, FGKP군(125 mg/kg)에서 가장 높은 수치를 보였다.
실험예 8: 위점막 손상 억제도 확인
1) 동물모델
실험동물은 군당 8마리씩 6그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 급성위염 유발 전 24시간 동안 절식시켰고 음수는 자유롭게 제공하였다. 실험 당일 실험군(FGKP)은 실시예에서 제조한 키위 발효물의 분말(FGKP)을 50 mg/kg, 125 mg/kg, 250 mg/kg의 농도로 각각 경구 투여하였고, 양성대조군(Sucralfate)에는 위 점막 보호 효과가 있는 Sucralfate를 50 mg/kg의 농도로 경구 투여하였다. 시료 및 sucralfate를 투여 1시간 후 정상군(NOR)에는 증류수를 경구 투여하였고, 실험군(FGKP)과 양성대조군(sucralfate)에는 150 mM HCl과 60% 에탄올을 섞은 용액을 2ml씩 경구 투여하였다.
2) 실험방법
적출한 위 조직을 핀으로 고정시킨 후 2 % PFA에서 30분간 고정시킨 후 광학 디지털 카메라(DSC-HX50V, sony, tokyo, japan) 이용하여 촬영하였다. 손상된 위 점막 측정은 image-J 프로그램을 이용하여 실제 손상 부위의 면적(식 3)을 측정한 후, 위 전체 면적과 비교하여 손상 비율(식 4)로 나타내었으며, 그 결과를 표 13과 도 11 및 도 12에 나타내었다.
[식 3]
Figure PCTKR2022009764-appb-img-000003
[식 4]
Figure PCTKR2022009764-appb-img-000004
NOR CON FGKP 50 FGKP 125 FGKP 250 Sucralfate 50
Gastric lesion area % (AU) 0 18.15±
1.05		 10.36±0.61 7.87±1.53 2.46±1.01 4.05±0.76
그 결과 상기 표 13과 도 11 및 도 12에서 나타내는 바와 같이, HCL/에탄올로 유발된 급성 위염 동물실험 모델에서 위점막을 육안으로 관찰한 결과, 정상군(NOR)에서의 병변이 보이지 않는 위점막과 비교하여 대조군(CON)은 HCL/에탄올 유발로 인하여 위점막에 손상을 받아 발적, 출혈 및 부종이 뚜렷하게 나타났다. 반면 양성대조군(Sucralfate)과 시료투여군(FGKP) 모두 출혈성 점막 손상이 현저히 감소함을 관찰할 수 있었다. 또한, 위점막 손상도를 i-solution 프로그램을 사용하여 측정하였을 때 정상군(NOR)에서는 위 점막의 병변은 보이지 않았으나 대조군(CON)의 경우 손상면적은 18.15±1.05으로 높게 나타났다. 반면 양성대조군인 Sucralfate는 4.05±0.76으로 대조군에 비해 현저히 줄어들었고 실험군인 FGKP는 10.35±0.61, 7.87±1.52, 2.45±1.00으로 유의성 있는 감소를 나타내었다.
실험예 9: 위점막 개선 확인
1) 동물모델
실험동물은 군당 8마리씩 6그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 급성위염 유발 전 24시간 동안 절식시켰고 음수는 자유롭게 제공하였다. 실험 당일 실험군(FGKP)은 실시예에서 제조한 키위 발효물의 분말(FGKP)을 50 mg/kg, 125 mg/kg, 250 mg/kg의 농도로 각각 경구 투여하였고, 양성대조군(Sucralfate)에는 위 점막 보호 효과가 있는 Sucralfate를 50 mg/kg의 농도로 경구 투여하였다. 시료 및 sucralfate를 투여 1시간 후 정상군(NOR)에는 증류수를 경구 투여하였고, 실험군(FGKP)과 양성대조군(sucralfate)에는 150 mM HCl과 60% 에탄올을 섞은 용액을 2ml씩 경구 투여하였다.
2) 실험방법
위의 세포질을 얻기 위해 protease inhibitor와 포함한 RIPA buffer[140 mM, Tris-HCl(25 mM, pH 7.4), 0.1% SDS, 1% Triton X-100]를 넣고 조직 분쇄기로 분쇄한 후, 15분간 얼음에 방치한 후 12,000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 위 조직 단백질을 가지고 western blotting 방법으로 iNOS 및 COX-2 단백질 발현을 측정하며, PGE2, TNF-α 및 IL-6의 변화량을 확인하기 위하여 ELISA kit을 사용하여 함량을 측정하였다. western blotting 결과를 표 14와 도 13 내지 도 15에 나타냈으며, ELISA 결과를 표 15와 도 16 내지 18에 나타내었다.
NOR CON FGKP 50 FGKP 125 FGKP 250 Sucralfate 50
iNOS
(% of NOR)		 100.0±
13.5		 249.7±
12.1		 134.7±13.7 123.1±8.6 120.1±8.2 77.9±5.2
COX-2
(% of NOR)		 100.0±
9.8		 156.8±
9.2		 138.3±11.6 126.8±7.7 105.3±4.4 120.7±9.4
western blotting 결과, COX-2의 발현은 정상군과 비교하여 대조군에서 유의한 증가가 있었으며 FGKP 실험군과 양성대조군에서는 대조군과 비교하여 감소하는 수치를 보였다. iNOS의 발현은 대조군과 비교하여 FGKP 실험군, 양성대조군 모두 유의하게 감소하는 수치를 보였다.
NOR CON FGKP 50 FGKP 125 FGKP 250 Sucralfate 50
PGE2 (ng/mg) 43.3±
2.1		 19.4±
0.6		 21.6±1.9 24.3±2.8 36.0±2.0 25.6±1.7
TNF-α (pg/mg) 372.6±
6.9		 811.3±
37.2		 485.9±5.0 456.6±47.0 400.6±13.1 402.6±28.2
IL-6 (ng/mg) 24.5±
1.3		 47.2±
4.9		 30.4±2.1 29.5±1.8 27.7±2.2 28.1±1.6
ELISA 결과, 대조군은 정상군보다 TNF-α, IL-6의 발현을 모두 유의성 있게 증가시켰다. FGKP 투여군은 대조군에 비해 유의하게 감소시키는 경향을 나타내었다. 또한, 위 조직 내부에 존재하는 PGE2의 농도를 확인한 결과 대조군은 19.43±1.85ng/mg으로 정상군 43.26±2.12ng/mg에 비해 크게 감소되었다. 양성대조군은 25.59±1.68ng/mg로 대조군과 비교하여 증가하였고 FGKP 실험군들은 각각 21.56±1.85, 24.34±2.81, 36.01±2.02로 증가하였다.
실험예 10: 위선 길이 측정
1) 동물모델
실험동물은 군당 8마리씩 6그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 급성위염 유발 전 24시간 동안 절식시켰고 음수는 자유롭게 제공하였다. 실험 당일 실험군(FGKP)은 실시예에서 제조한 키위 발효물의 분말(FGKP)을 50 mg/kg, 125 mg/kg, 250 mg/kg의 농도로 각각 경구 투여하였고, 양성대조군(Sucralfate)에는 위 점막 보호 효과가 있는 Sucralfate를 50 mg/kg의 농도로 경구 투여하였다. 시료 및 sucralfate를 투여 1시간 후 정상군(NOR)에는 증류수를 경구 투여하였고, 실험군(FGKP)과 양성대조군(sucralfate)에는 150 mM HCl과 60% 에탄올을 섞은 용액을 2ml씩 경구 투여하였다.
2) 실험방법
HCL/에탄올로 유발된 급성 위염 실험동물에서 위 손상 정도를 알아보기 위하여, 적출한 위를 4% PFA에 24 시간 고정 시킨 후 xylen을 이용하여 탈수시켜 파라핀 조직표본을 제작하였다. 이어서 박절기를 사용하여 4μm 두께의 절편을 제작한 후 슬라이드 글라스에 부착시켰다. 파라핀을 제거한 다음 hematoxylin과 eosin(H&E)을 사용하여 조직절편을 염색한 다음 광학현미경(zeiss, germany)을 사용하여 x100 배율로 염색된 조직절편을 관찰하고 i-solution 영상분석 프로그램을 사용하여 위선(gastric gland)의 길이를 측정하였으며, 그 결과를 표 16과 도 19 및 도 20에 나타내었다.
NOR CON FGKP 50 FGKP 125 FGKP 250 Sucralfate 50
mucosa thickness (μm) 1181±279 491±96 660±159 722±143 812±145 737±177
그 결과 상기 표 16과 도 19 및 도 20에서 나타내는 바와 같이, HCL/에탄올을 처리하지 않은 정상군의 모든 실험동물의 위점막에서는 유의한 병변이 관찰되지 않았으며, 대조군에서는 정상군에 비해 위선 길이가 짧게 관찰되어 위점막 손상이 유발된 것을 확인할 수 있었으며, HCL/에탄올과 함께 Sucralfate를 처리한 양성대조군에서는 대조군에 비해 위선 길이가 길게 관찰되어서 Sucralfate의 위점막 손상 억제효과를 확인할 수 있었다. 또한 FGKP를 처리한 다음 HCL/에탄올을 처리한 실험군에서도 대조군에 비해 위선 길이가 길게 관찰되었다.
실험예 11: 위산 분비도 확인
1) 동물모델
실험동물은 군당 8마리로 5그룹으로 나누어 실험하였다. 순화를 마친 실험동물들을 24시간 절식시킨 후 각각의 시험물질을 경구 투여하였다. 대조군(CON)에는 증류수를 경구 투여하였고, 실험군은 실시예에서 제조한 키위 발효물의 분말(FGKP)을 50 mg/kg, 125 mg/kg, 250 mg/kg 농도별로 경구 투여하였다. 양성대조군(Sucralfate)에는 Sucralfate 50 mg/kg을 경구 투여하였다. 시료 투여 30분 후 각군들을 isoflurane으로 마취한 후 복강을 2센티 정도 개복을 하여 위와 십이지장을 연결하고 있는 유문부 부위을 결찰하였다. 절개한 복강을 봉합한 후 회복 챔버에 머무르게 한 후 케이지로 이동시켰다.
2) 실험방법
유문결찰 6시간 뒤 마취와 함께 안락사 시킨 후 위를 제거해 위액을 취해 실험에 사용하였다. 획득한 위액은 총 volume을 측정한 다음 pH meter를 사용하여 pH를 측정한다. 후에 위액 1ml을 tube에 옮긴 후 phenolphtalein 용액을 2~3방을 넣는다. 이어서 0.05N NaOH 수산화나트륨(sodium hydroxide)을 붉은색이 될 때까지 넣는다. 총 산도는 하기 식 5에 따라 계산하였으며, 그 결과를 표 17과 도 21 내지 24에 나타내었다.
[식 5]
Figure PCTKR2022009764-appb-img-000005
CON FGKP 50 FGKP 125 FGKP 250 Sucralfate 50
Gastric juice vol. (ml/6h) 10.13±1.22 8.30±1.13 6.63±1.02 4.53±0.95 5.63±0.51
pH 1.01±0.08 1.09±0.11 1.23±0.06 1.60±0.23 1.38±0.09
Titratable acidity (μEq/ml) 157.5±0.4 117.3±3.2 108.5±1.8 69.2±3.2 97.0±3.6
Total acidity
(μEq/6h)		 1599±23 991±40 723±17 332±22 558±26
그 결과 상기 표 17과 도 21 내지 도 24에서 나타내는 바와 같이, 대조군의 위산부피가 가장 많이 측정되었고 FGKP 실험군에서는 고농도로 갈수록 위액의 양이 줄어들었다. 양성대조군인 Sucralfate에서도 대조군에 비해 위산의 부피가 줄어든 것을 확인하였다. 또한, pH를 보았을 때 대조군에서 가장 낮게 측정되었고 고농도로 갈수록 pH가 높아지는 경향을 보였다. 양성대조군도 대조군에 비해 pH가 높아졌다. 산도와 유리산도도 마찬가지로 대조군에서 가장 높은 것을 확인할 수 있었고 양성대조군 뿐만 아니라 FGKP 실험군에서 고농도로 갈수록 낮은 측정값을 얻을 수 있었다.
실험예 12: 펩신 활성도 확인
1) 동물모델
실험동물은 군당 8마리로 5그룹으로 나누어 실험하였다. 순화를 마친 실험동물들을 24시간 절식시킨 후 각각의 시험물질을 경구 투여하였다. 대조군(CON)에는 증류수를 경구 투여하였고, 실험군은 실시예에서 제조한 키위 발효물의 분말(FGKP)을 50 mg/kg, 125 mg/kg, 250 mg/kg 농도별로 경구 투여하였다. 양성대조군(Sucralfate)에는 Sucralfate 50 mg/kg을 경구 투여하였다. 시료 투여 30분 후 각군들을 isoflurane으로 마취한 후 복강을 2센티 정도 개복을 하여 위와 십이지장을 연결하고 있는 유문부 부위을 결찰하였다. 절개한 복강을 봉합한 후 회복 챔버에 머무르게 한 후 케이지로 이동시켰다.
2) 실험방법
유문결찰 6시간 뒤 마취 후 안락사 시킨 다음 위를 제거해 위액을 취해 실험에 사용하였다. 2% 헤모글로빈을 500 μl씩 각 튜브에 넣고 37℃로 3~4분 열을 가해준 후 각 튜브에 위액을 100 μl씩 넣어준다. 이어서 10분간 37℃로 열을 가한다. 후에 1 ml의 TCA 16%를 각각의 튜브에 넣어주고 6000xg에서 30분간 원심분리한다. 거기서 나온 각각의 튜브에서 상층액을 취하여 20℃에서 일정 시간 반응 시킨 후 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. 펩신 활성도는 하기 식 6에 따라 계산하였으며, 그 결과를 표 18 및 도 25에 나타내었다.
[식 6]
Figure PCTKR2022009764-appb-img-000006
CON FGKP 50 FGKP 125 FGKP 250 Sucralfate 50
Pepsin activity
(per ml/h)		 5.02±0.22 4.51±0.10 4.26±0.30 2.26±0.05 2.89±0.04
그 결과 상기 표 18 및 도 25에서 나타내는 바와 같이, 대조군에서 가장 활성도가 높은 결과를 확인하였고, FGKP 실험군, 양성대조군에서는 고농도로 갈수록 펩신 활성도가 낮아졌다.
SEQ ID NO:1: Lactococcus Lactis VI-01 KCTC14351BP
SEQ ID NO:2: Lactobacillus paracasei VI-02 KCTC14352BP
[미생물기탁]
1) 기탁기관명: 한국생명공학연구원
수탁번호: KCTC14351BP
수탁일자: 2020.11.03.
2) 기탁기관명: 한국생명공학연구원
수탁번호: KCTC14352BP
수탁일자: 2020.11.03.
Figure PCTKR2022009764-appb-img-000007
Figure PCTKR2022009764-appb-img-000008

Claims (19)

  1. 키위를 유산균으로 발효한 키위 발효물을 유효성분으로 포함하는 위 기능 개선용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 키위 유래 유산균인 것을 특징으로 하는 위 기능 개선용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 키위 유래 유산균은 락토코쿠스 락티스(Lactococcus Lactis) VI-01 KCTC 14351BP 및 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) VI-02 KCTC 14352BP 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 위 기능 개선용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 엑시도필러스(Latobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus Helveticus)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 위 기능 개선용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 키위 발효물은 조성물 총 중량 대비 30 내지 80 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 위 기능 개선용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 건강기능식품 조성물인 것을 특징으로 하는 위 기능 개선용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 건강기능식품 조성물은 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 음료, 젤리 및 바로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 위 기능 개선용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 위 기능 개선용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 유제품, 음료, 소스류, 잼류 및 제과류로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 위 기능 개선용 조성물.
  10. 키위를 유산균으로 발효한 키위 발효물을 유효성분으로 포함하는 소화 기능 개선용 조성물.
  11. 키위를 유산균으로 발효한 키위 발효물을 유효성분으로 포함하는 위 점막 손상 개선용 조성물.
  12. 키위를 유산균으로 발효한 키위 발효물을 유효성분으로 포함하는 위산 분비 억제용 조성물.
  13. 키위를 유산균 또는 이의 배양액으로 발효시켜 발효물을 얻는 단계를 포함하는 제1항에 따른 키위 발효물의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 유산균은 락토코쿠스 락티스(Lactococcus Lactis) VI-01 KCTC 14351BP 또는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) VI-02 KCTC 14352BP인 것을 특징으로 하는 키위 발효물의 제조방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 발효는 락토바실러스 엑시도필러스(Latobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus Helveticus)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주를 더 이용하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 키위 발효물의 제조방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 배양액은,
    제1 배지에 균주를 각각 배양하여 제1 배양산물을 제조하는 단계;
    상기 제1 배양산물을 제2 배지에 접종 및 배양하여 제2 배양산물을 제조하는 단계; 및
    상기 제2 배양산물을 원심분리하여 상등액을 제거하여 배양액을 수득하는 단계를 통해 제조된 것을 특징으로 하는 키위 발효물의 제조방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 키위 및 배양액은 7.5~8.5:2.5~1.5 중량% 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 키위 발효물의 제조방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 키위 발효물을 건조 및 분말화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키위 발효물의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 건조는,
    액체질소동결기(liquid nitrogen freezer, LNF)를 이용하여 발효물을 -180℃ 내지 -195℃에서 급속동결하는 단계; 및
    급속동결된 발효물을 -35℃ 내지 -45℃에서 동결건조하는 단계;를 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 키위 발효물의 제조방법.
PCT/KR2022/009764 2021-10-19 2022-07-06 키위 발효물을 포함하는 위 기능 개선용 조성물 WO2023068486A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022569257A JP7511277B2 (ja) 2021-10-19 2022-07-06 キウイ発酵物を含む胃機能改善用組成物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210139025A KR102520354B1 (ko) 2021-10-19 2021-10-19 키위 발효물을 포함하는 위 기능 개선용 조성물
KR10-2021-0139025 2021-10-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023068486A1 true WO2023068486A1 (ko) 2023-04-27

Family

ID=85946708

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/009764 WO2023068486A1 (ko) 2021-10-19 2022-07-06 키위 발효물을 포함하는 위 기능 개선용 조성물

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP7511277B2 (ko)
KR (1) KR102520354B1 (ko)
WO (1) WO2023068486A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130073179A (ko) * 2011-12-23 2013-07-03 재단법인 제주테크노파크 참다래 과실 발효물을 이용한 항염증제 조성물 및 피부 미백제 조성물
KR20160123861A (ko) * 2015-04-17 2016-10-26 경상대학교산학협력단 토종다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 조성물
KR20190096130A (ko) * 2018-02-08 2019-08-19 제주대학교 산학협력단 골드키위 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물
KR20210063728A (ko) * 2019-11-25 2021-06-02 (주) 바이텍 장기능 개선용 발효 키위 분말 및 이의 제조방법

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101081910B1 (ko) 2011-03-18 2011-11-09 고려대학교 산학협력단 키위 추출물을 함유하는 피부톤 개선 및 피부노화방지 효과가 있는 화장료 조성물
CN105230925A (zh) 2015-09-29 2016-01-13 明光市农源农作物专业合作社 一种具有健胃消食功效的猕猴桃果脯及其制备方法
TWI683664B (zh) 2018-09-25 2020-02-01 大江生醫股份有限公司 奇異果發酵物及其用於製備增加抗氧化活性、增加抗糖化活性、增加蛋白質分解酶活性、改善腸胃道消化不良狀況、及增加腸胃道菌叢多樣性之醫藥組合物的用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130073179A (ko) * 2011-12-23 2013-07-03 재단법인 제주테크노파크 참다래 과실 발효물을 이용한 항염증제 조성물 및 피부 미백제 조성물
KR20160123861A (ko) * 2015-04-17 2016-10-26 경상대학교산학협력단 토종다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 조성물
KR20190096130A (ko) * 2018-02-08 2019-08-19 제주대학교 산학협력단 골드키위 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물
KR20210063728A (ko) * 2019-11-25 2021-06-02 (주) 바이텍 장기능 개선용 발효 키위 분말 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RICHARDSON DAVID P.; ANSELL JULIET; DRUMMOND LYNLEY N.: "The nutritional and health attributes of kiwifruit: a review", EUROPEAN JOURNAL OF NUTRITION, STEINKOPFF VERLAG, DARMSTADT, DE, vol. 57, no. 8, 22 February 2018 (2018-02-22), DE , pages 2659 - 2676, XP036642018, ISSN: 1436-6207, DOI: 10.1007/s00394-018-1627-z *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102520354B1 (ko) 2023-04-14
JP2023550862A (ja) 2023-12-06
JP7511277B2 (ja) 2024-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018186700A1 (ko) 실크 피브로인으로 코팅되어 장내 정착성이 향상된 유산균을 포함하는 조성물
WO2017074037A1 (ko) 효소 생산능이 우수한 전통 발효식품 유래 신규 균주 및 이를 이용하여 곡물 발효 효소식품을 제조하는 방법
WO2019151843A1 (ko) 락토바실러스 플란타럼 kbl396 균주 및 그 용도
WO2015122717A1 (ko) 비만 억제 효능을 갖는 신규 유산균 및 이의 용도
WO2021182829A1 (ko) 장관 면역조절 기능과 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 락토바실러스 람노서스 균주
WO2016053003A1 (ko) 비배당체가 세포내에 축적되어 있는 미생물 제제의 제조방법 및 이에 의해 제조된 미생물 제제
WO2017204374A1 (ko) 혈당 조절 효능을 갖는 신규 유산균 및 이의 용도
EP3454869A1 (en) A composition comprising a lactic acid bacteria for preventing and treating vaginosis and the use thereof
WO2021162282A1 (ko) 신규 락토바실러스 플란타룸 kc3 균주를 이용한 면역장애, 호흡기 염증 질환, 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 용도
WO2020075949A1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2011010770A1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
WO2020091312A1 (ko) 프로바이오틱스를 유효성분으로 포함하는 알코올성 장손상 예방 또는 치료용 조성물
WO2023055188A1 (ko) 신규 프로바이오틱스 및 이의 용도
WO2017047968A1 (ko) 다양한 기능성을 가진 신규 유산균 및 이의 용도
WO2020130471A1 (ko) 체중 또는 체지방 감소 효능을 갖는 신규 유산균 및 이의 용도
WO2013151362A1 (ko) 신규 바실러스 서브틸리스
WO2017047962A1 (ko) 신규 유산균 및 퇴행성 뇌질환 또는 인지기능 장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2020262755A1 (ko) 장관면역 조절을 위한 신규한 프로바이오틱 조성물
WO2021221398A1 (ko) 우수한 면역기능 증진 효과를 갖는 신규한 유산균 및 이를 포함하는 식품조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스
WO2021066549A1 (ko) 락토바실러스 애시도필러스 kbl409 균주 및 그 용도
WO2022005035A1 (ko) 내산성 및 내담즙성이 우수하며 이상지질혈증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 신규 비피도박테리움 브레베 idcc 4401 균주 및 이의 사균체 id-bbr4401
WO2022039561A1 (ko) 클로스트리디움 디피실리 감염의 치료 또는 예방용 조성물
WO2024071624A1 (ko) 키위 발효물을 포함하는 알코올성 간손상 예방 또는 개선용 조성물
WO2020013670A1 (ko) 락토바실러스 플란타럼 cjlp475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 cjlp17 균주를 포함하는 조성물 및 이의 용도
WO2024136036A1 (ko) 락토바실러스 브레비스 ku15147을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022569257

Country of ref document: JP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22883716

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE