KR20220138990A - 우유 유래 세포외소포체를 포함하는 골형성 촉진용 조성물 - Google Patents
우유 유래 세포외소포체를 포함하는 골형성 촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 우유 유래 세포외소포체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 골형성 및 뼈성장 촉진 효과를 갖는 우유 유래 세포외소포체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 우유 유래 세포외소포체는 열 및 pH 안정성이 우수할 뿐만 아니라 동물모델에서 현저한 골형성 및 뼈성장 효과가 있는 것을 확인하였다. 또한 본 발명에 따른 우유 유래 세포외소포체의 제조방법은 세포외소포체의 내부 물질은 유지되면서, 대량생산이 가능한 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 우유 유래 세포외소포체 및 이의 제조방법은 뼈성장 촉진 및 골질환 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 우유 유래 세포외소포체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 골형성 및 뼈성장 촉진 효과를 갖는 우유 유래 세포외소포체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
우유에는 단백질, 탄수화물, 지방 뿐만 아니라, 칼슘, 비타민, 무기질 등이 풍부하여 대표적인 영양식품이다. 우유에도 IGF(insulin-like growth factor)를 포함한 성장인자가 함유되어 있지만 대부분은 소화가 되고 일부 적은 양만이 혈액으로 흡수된다고 알려져 있다. 또한 유제품에 대한 알레르기나 유당 불내증을 갖는 사람들은 섭취가 힘든 경우가 있다. 따라서 우유만으로 성장 효과를 기대하기는 어려운 실정이다.
최근 소포체(vesicle)를 연구한 결과가 다수 발표되었으며, 소포체의 유래에 따라 다양한 효능이 있다는 것을 밝혀졌다. 따라서 기존의 우유 내 존재하는 세포외소포체를 추출하여 뼈 기능에 효과적인 제품을 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 현재까지 대다수의 연구에서 우유 유래 세포외소포체는 초고속원심분리 방법을 통해 분리되었다. 초고속원심분리 방법은 세포외소포체에 과도한 충격을 주어 세포외소포체가 깨질 우려가 있으며, 응집물(aggregates)이 발생된다는 한계가 있다. 또한 초고속원심분리 방법은 우유 유래 세포외소포체를 얻는 수율이 떨어지며, 한번에 많은 양의 시료를 분리할 수 없어 산업적 이용가능성이 떨어지는 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 종래 분리방법의 한계가 개선된 우유 유래 세포외소포체 제조방법을 개발하고, 분리된 우유 유래 세포외소포체의 골형성 및 뼈성장 촉진 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 포함하는 골형성 또는 뼈성장 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 우유 유래 세포외소포체를 포함하는 골질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) 우유를 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 수득된 상층액으로부터 접선유동여과법(Tangential Fluid Filtration)으로 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 분리하는 단계;를 포함하는 골형성 또는 뼈성장 촉진용 우유 유래 세포외소포체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 우유 유래 세포외소포체를 포함하는 골형성 또는 뼈성장 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 우유 유래 세포외소포체를 포함하는 골형성 또는 뼈성장 촉진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 우유 유래 세포외소포체를 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 우유 유래 세포외소포체를 포함하는 골질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 우유를 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 수득된 상층액으로부터 접선유동여과법(Tangential Fluid Filtration)으로 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 분리하는 단계;를 포함하는 골형성 또는 뼈성장 촉진용 우유 유래 세포외소포체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 우유 유래 세포외소포체는 열 및 pH 안정성이 우수할 뿐만 아니라 동물모델에서 현저한 골형성 및 뼈성장 효과가 있는 것을 확인하였다. 또한 본 발명에 따른 우유 유래 세포외소포체의 제조방법은 세포외소포체의 내부 물질은 유지되면서, 대량생산이 가능한 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 우유 유래 세포외소포체 및 이의 제조방법은 뼈성장 촉진 및 골질환 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1a는 우유 유래 세포외 소포체를 전자현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 나노입자추적분석법 (nanoparticle tracking analysis)을 통해 우유 유래 세포외소포체의 크기를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 웨스턴 블롯팅을 통해 우유 세포외소포체의 마커 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 dot blot을 통해 우유 유래 세포외소포체 내 성장인자를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 우유 유래 세포외소포체의 조골세포 증식 촉진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는 조골세포에서 우유 유래 엑소좀의 DNA 합성능 증가 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 웨스턴 블롯팅을 통해 우유 유래 세포외소포체 처리에 따른 세포주기 관련 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 우유 유래 세포외소포체 투여에 따른 랫드의 체중을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 우유 유래 세포외소포체 투여에 따른 랫드의 정강이뼈 길이를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5b는 우유 유래 세포외소포체 투여에 따른 랫드의 소주골 골밀도(Trabecular bone mineral density, Trabecular BMD)를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5c는 우유 유래 세포외소포체 투여에 따른 랫드의 피질골 골밀도(Cortical bone mineral density, Cortical BMD)를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a는 열처리된 우유 유래 세포외소포체의 마커 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6b 및 c는 열처리된 우유 유래 세포외소포체의 단백질 및 나노입자의 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6d는 산처리된 우유 유래 세포외 소포체의 마커 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6e 및 f는 산처리된 우유 유래 세포외소포체의 단백질 및 나노입자의 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 제조방법에 따른 우유 유래 세포외소포체의 단백질 정량 결과를 나타낸 도이다.
도 7b는 제조방법에 따른 우유 유래 세포외소포체의 나노입자 정량 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 제조방법에 따른 우유 유래 세포외소포체의 조골세포 증식 촉진 효과를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9a는 동결건조된 우유 유래 세포외소포체를 나타낸 도이다.
도 9b는 동결건조 여부에 따른 우유 유래 세포외소포체의 질량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9c는 초저온 전자현미경을 통해 동결건조된 우유 유래 세포외소포체를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 9d는 동결건조된 우유 유래 세포외소포체의 크기를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 나노입자추적분석법 (nanoparticle tracking analysis)을 통해 우유 유래 세포외소포체의 크기를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 웨스턴 블롯팅을 통해 우유 세포외소포체의 마커 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 dot blot을 통해 우유 유래 세포외소포체 내 성장인자를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 우유 유래 세포외소포체의 조골세포 증식 촉진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는 조골세포에서 우유 유래 엑소좀의 DNA 합성능 증가 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 웨스턴 블롯팅을 통해 우유 유래 세포외소포체 처리에 따른 세포주기 관련 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 우유 유래 세포외소포체 투여에 따른 랫드의 체중을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 우유 유래 세포외소포체 투여에 따른 랫드의 정강이뼈 길이를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5b는 우유 유래 세포외소포체 투여에 따른 랫드의 소주골 골밀도(Trabecular bone mineral density, Trabecular BMD)를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5c는 우유 유래 세포외소포체 투여에 따른 랫드의 피질골 골밀도(Cortical bone mineral density, Cortical BMD)를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a는 열처리된 우유 유래 세포외소포체의 마커 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6b 및 c는 열처리된 우유 유래 세포외소포체의 단백질 및 나노입자의 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6d는 산처리된 우유 유래 세포외 소포체의 마커 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6e 및 f는 산처리된 우유 유래 세포외소포체의 단백질 및 나노입자의 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 제조방법에 따른 우유 유래 세포외소포체의 단백질 정량 결과를 나타낸 도이다.
도 7b는 제조방법에 따른 우유 유래 세포외소포체의 나노입자 정량 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 제조방법에 따른 우유 유래 세포외소포체의 조골세포 증식 촉진 효과를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9a는 동결건조된 우유 유래 세포외소포체를 나타낸 도이다.
도 9b는 동결건조 여부에 따른 우유 유래 세포외소포체의 질량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9c는 초저온 전자현미경을 통해 동결건조된 우유 유래 세포외소포체를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 9d는 동결건조된 우유 유래 세포외소포체의 크기를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 포함하는 골형성 또는 뼈성장 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 세포외소포체는 세포로부터 유래하는 다양한 종류의 막 구조로서, 엔도좀 시스템(endosomal system)에서 유래하는 엑소좀(exosome)과 원형질막(plasma membrane)에서 유래하는 마이크로베시클(microvesicle)로 구성된다. 이들은 체액에 존재하며, 다양한 생리적 및 병리적 과정에 관여한다. 세포외소포체는 (i) 세포 간의 단백질, 지질, 유전물질 등 교환 과정; 및 (ii) 세포 간의 신호전달 과정;에 관여한다. 또한 세포외소포체는 기원(origin) 및 세포의 상태에 따라 다른 성분을 함유하며, 이에 따른 특정 기능에 대해서는 거의 밝혀지지 않았다.
본 발명의 구체예에서, 상기 우유 유래 세포외소포체는 bFGF(Basic fibroblast growth factor), IGF-1(Insulin-like growth factor 1), TGF-β(Transforming growth factor beta), 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하며, 골형성 및 뼈성장에 긍정적인 영향을 미치는 성분이라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 우유 유래 세포외소포체는 크기가 10 내지 1000 nm인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 20 내지 500 nm일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 분말화 전 우유 유래 세포외소포체는 크기가 평균 260.5 ± 6.7 nm일 수 있고, 분말화된 후에는 크기가 평균 245.9 ± 5.3 nm일 수 있다. 우유 유래 세포외소포체는 분말화함에 따라 질량 감소 및 수분이 제거되어, 생산 및 유통 상 장점이 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 우유 유래 세포외소포체는 열 및 pH 안정성을 갖는 것이 바람직하다. 보다 상세하게는 상기 우유 유래 세포외소포체는 40 내지 120℃에서도 안정한 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 50 내지 80℃, 가장 바람직하게는 75℃에서 안정한 것이다. 또한 상기 우유 유래 세포외소포체는 pH 0.1 내지 7 범위에서 안정한 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 pH 0.5 내지 3.5에서 안정한 것이다.
본 발명의 구체예에서, 상기 골형성 촉진용은 골밀도 증가용인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 우유 유래 세포외소포체를 랫드에 경구 투여한 결과, 소주골 골밀도 및 피질골 골밀도가 성장호르몬 처리군과 유사한 수준으로 증가된 것을 확인하였다.
본 발명의 구체예에서, 상기 뼈성장 촉진용은 뼈의 길이 성장용인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 우유 유래 세포외소포체를 랫드에 경구투여한 결과, 정강이뼈 길이가 현저히 증가한 것을 확인하였다.
본 발명의 구체예에서, 상기 우유 유래 세포외소포체는 (a) 우유를 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 수득된 상층액으로부터 접선유동여과법(Tangential Fluid Filtration)으로 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 분리하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것이 바람직하다. 우유 유래 세포외소포체가 이와 같이 제조될 경우 열 및 pH 안정성이 높고, 골형성 및 뼈성장 촉진 효과가 우수하다. 또한 상기 방법으로 제조된 우유 유래 세포외소포체는 종래 이용되던 초고속원심분리법에 비해 수율이 높으며, 조골세포 증식 촉진 활성이 보다 우수하다.
본 발명의 구체예에서, 우유 유래 세포외소포체의 농도는 400 내지 800 mg/kg/day인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 500 내지 700 mg/kg/day이고, 가장 바람직하게는 600 mg/kg/day이다.
본 발명에 따른 골형성 또는 뼈성장 촉진용 조성물은 식품 또는 건강기능식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 골형성 또는 뼈성장 촉진용 조성물이 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물인 경우 본 발명의 우유 유래 세포외소포체는 건강기능식품, 식품 첨가제 또는 식이보조제 등의 형태로 사용될 수 있다.
상기 우유 유래 엑소좀이 식품 첨가제로 사용할 경우, 상기 우유 유래 엑소좀을 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
또한 상기 우유 유래 엑소좀과 같은 추가적인 유효성분의 혼합은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 변경될 수 있음은 물론이며, 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 99.9 중량%로 포함되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1 내지 80중량%로 포함되는 것이다. 그 함량이 0.001중량% 미만일 경우에는 섭취의 효율성이 떨어질 수 있으며, 99.9중량%를 초과할 경우에는 제형화에 어려움이 있다.
구체적인 예로, 식품의 제조 시에는 본 발명의 우유 유래 엑소좀은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하여 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 양으로 첨가될 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 본 발명의 우유 유래 엑소좀을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 10중량%, 바람직하게는 0.01 내지 0.1중량%로 포함된다.
본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있으며, 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제 비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 0.1중량% 범위내로 포함되는 것이 바람직하다.
건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우, 본 발명의 식품 또는 건강기능식품 조성물은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 장기간 복용이 가능하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 우유 유래 세포외소포체를 포함하는 골질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 무혈성대퇴골괴사(Avascular necrosis of the Femoral Head), 치주염(periodontal disease) 및 파제트병(paget's disease)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 골질환 예방 개선 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물이 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 경우 본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 우유 유래 세포외소포체와 함께 골질환에 대하여 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 또한, 상기 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 0.05 내지 5 mg/kg의 농도로 투여되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 0.1 내지 0.4 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 0.35 mg/kg, 더더욱 바람직하게는 0.25 mg/kg일 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 상기 비경구 투여 방식으로는 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등이 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 골질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른면, 본 발명은 (a) 우유를 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 수득된 상층액으로부터 접선유동여과법(Tangential Fluid Filtration)으로 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 분리하는 단계;를 포함하는 골형성 또는 뼈성장 촉진용 우유 유래 세포외소포체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 우유 유래 세포외소포체는 단백질 및 나노입자가 풍부한 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 우유 유래 세포외소포체는 열 및 pH에 대한 안정성을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 제조방법은 (c) 상기 단계 (b)에서 분리된 우유 유래 세포외소포체를 분말화하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 접선유동여과법을 이용한 우유 유래 세포외소포체 추출 및 특성 분석
국내에서 시판되는 식이성 저온살균 우유를 구매하여 냉장보관(4℃ 이하)하며, 유통기한 내에 접선유동여과법을 통해 세포외소포체(Extracellular Vesicles, EVs)를 추출하여 얻었다.
구체적으로, 시판하는 식이성 우유를 50 mL씩 수거하여 2,000 xg에서 10분간 원심분리하여 잔여물을 제거하고 상층액을 취했다. 상기 상층액을 10,000 xg, 4℃에서 40분 동안 원심분리하여 남아있는 잔여물을 제거하였다. 원심분리 후 상층액을 취하여 100 kDa MWCO membrane이 설치된 접선유동여과(Tangential Fluid Filtration) 시스템을 이용하여 우유 유래 세포외소포체를 분리 및 정제하였다.
전자현미경 관찰, 나노입자추적분석법(nanoparticle tracking analysis) 및 웨스턴 블롯팅을 통해 우유 유래 세포외소포체의 특성을 분석하였다. 상기 웨스턴 블롯팅은 세포외소포체 마커 단백질인 CD81 및 CD9 발현을 확인하였다. 우유 유래 세포외소포체의 특성을 분석한 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1a 및 b에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체는 크기가 50 내지 400 nm 정도이며, 평균 260.5 ± 6.7 nm의 균일한 크기로 존재하는 것을 확인하였다.
도 1c에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체는 세포외소포체 마커 단백질인 CD81 및 CD9이 발현되는 것을 확인하였다.
dot blot을 통해 우유 유래 세포외소포체 내 성장인자를 분석하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체는 성장인자인 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 및 IGF-1(Insulin-like growth factor 1); 조골세포 분화인자 TGF-β(Transforming growth factor beta); 및 신생혈관생성인자 VEGF(vascular endothelial growth factor);를 포함하는 것을 확인하였다.
실시예 2. 우유 유래 세포외소포체 처리에 의한 조골세포 증식효과 확인
조골세포는 키 성장 및 뼈 강화 효과를 확인하는데 주로 사용되는 세포이다. 이에, 상기 실시예 1에서 수득된 우유 유래 세포외소포체가 조골세포 증식에 미치는 영향을 확인하였다.
2-1. 세포 배양
100 μL 배양배지[DMEM/F-12 1:1(1x), 2.5 mM L-Glutamine, 15 mM HEPES Buffer(GE Healthcare Life Sciences, cat no. SH30023.01), 10% Fetal Bovine Serum(Gibco, cat no. 12483-020)]가 포함된 96-웰 플레이트에 인간 조골세포(Saos-2 cell)를 웰당 3 x 103 세포씩 접종하였다. 접종된 세포는 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 각 웰에 상기 실시예 1에서 수득된 우유 유래 세포외소포체를 다양한 농도(100, 200, 500, 1,000 μg/mL)로 처리하였고, 48시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. 대조군은 무처리군, 즉, 우유 유래 세포외소포체를 처리하지 않은 세포이다.
2-2. 세포 증식 분석
실시예 2-1에서 준비된 우유 유래 세포외소포체를 처리한 세포와 EZ-Cytox kit(DoGen, Cat no. EX-3000)를 사용하여, 세포 증식을 분석하였다. 상기 분석은 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였고, 450 nm(420~480 nm) 파장에서 흡광도를 측정한 후 세포의 증식률을 계산하였다. 세포의 증식률을 확인한 결과는 도 3a에 나타내었다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체는 대조군에 비해 조골세포의 증식을 촉진하는 것을 확인하였다. 특히, 우유 유래 세포외소포체 1,000 μg/mL 처리군은 조골세포가 30% 이상 증식된 것을 확인하였다.
후술되는 DNA 합성능 분석 및 세포주기 관련 단백질 분석에는 우유 유래 세포외소포체 1,000 μg/mL를 처리한 세포를 이용하였다.
2-3. DNA 합성능 분석
우유 유래 세포외소포체(1 mg/ml)를 처리한 세포와 Propidium Iodide를 이용하여 DNA 합성능을 분석하였다. DNA 합성능 분석 결과는 도 3b에 나타내었다.
조골세포에 우유 유래 세포외소포체(1 mg/ml)를 처리한 후 Propidium Iodide으로 조골세포를 염색하였다. 유세포분석기 (flow cytometry)를 이용하여 DNA 합성능을 분석하였다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체 처리군은 대조군에 비해 DNA 합성능이 약 9% 이상 증가된 것을 확인하였다.
2-4. 세포주기 관련 단백질 분석
웨스턴 블롯팅을 통해, 배양 시간(24, 48 및 72시간)에 따른 우유 유래 세포외소포체(1 mg/ml)를 처리 세포의 세포주기 관련 단백질(CDK2, Cyclin E, CDK4, Cyclin D1) 발현을 확인하였다. 웨스턴 블롯팅 결과는 도 3c에 나타내었다.
도 3c에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체를 처리한 조골세포는 대조군에 비해 세포주기 관련 단백질(CDK2, Cyclin E, CDK4, Cyclin D1)의 발현이 현저히 증가된 것을 확인하였다.
실시예 3. 동물모델에서 우유 유래 세포외소포체의 뼈 성장 촉진 활성 확인
7주령의 Sprague-Dawley female 랫드에 우유 유래 세포외소포체를 농도 600 mg/kg/day로 14일 동안 경구 투여하였다. 음성 대조군(control)은 동량의 PBS를 경구 투여하였고, 양성대조군(GH)은 성장호르몬인 Somatropin를 200 μg/kg/day으로 14일간 피하 주사하였다. 투여기간 동안 랫드의 체중을 측정하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체를 600 mg/kg/day의 농도로 처리한 랫드는 음성 및 양성 대조군에 비해 체중이 유의하게 증가한 것을 확인하였다.
실험 종료일에는 랫드를 안락사하여 오른쪽 다른 정강이 뼈를 얻은 후 microCT로 촬영하여 정강이뼈 길이; 소주골 골밀도(Trabecular bone mineral density, Trabecular BMD); 및 피질골 골밀도(Cortical bone mineral density, Cortical BMD); 측정하였다. 뼈 길이, 소주골 골밀도 및 피질골 골밀도 측정 결과는 각각 도 5a 내지 c에 나타내었다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체를 600 mg/kg/day의 농도로 처리한 랫드는 음성 대조군에 비해 정강이뼈의 길이가 유의하게 증가한 것을 확인하였다. 이는 성장호르몬 Somatropin 처리군(즉, 양성 대조군)과 유사한 수준임을 알 수 있다.
도 5b에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체를 600 mg/kg/day의 농도로 처리한 랫드의 정강이 뼈 소주골 골밀도는 음성 및 양성 대조군에 비해 높은 것을 확인하였다.
도 5c에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체를 600 mg/kg/day의 농도로 처리한 랫드는 피질골 골밀도는 음성 대조군에 비해 높은 것을 확인하였다. 특히, 우유 유래 세포외소포체를 600 mg/kg/day의 농도로 처리한 랫드는 피질골 밀도가 성장호르몬 Somatropin 처리군(즉, 양성 대조군)과 유사한 수준임을 알 수 있다.
상기 결과는 우유 유래 세포외소포체는 뼈 길이 및 골밀도 증가, 즉, 뼈 성장을 촉진한다는 것을 의미한다.
실시예 4. 우유 유래 세포외소포체의 안정성 분석
상기 실시예 1에서 수득된 우유 유래 세포외소포체(1 mg/ml)의 열 및 pH 안정성을 분석하였다. 안정성 분석의 대조군 압출법으로 제조된 인공 세포외소포체(0.5 mg/ml)를 사용하였다. 상기 인공 세포외소포체는 HEK293 세포를 10, 5, 1 μm 크기의 막을 통과시키는 압출법을 이용하여 제조하였다. 제조된 인공 세포외소포체에는 세포외소포체 마커 단백질인 CD81, CD9을 발현하며, 인공 세포외소포체 안에는 베타-엑틴(β-acitn)과 같은 cytosolic protein을 함유하고 있다.
4-1. 열 안정성 분석
우유 유래 세포외소포체 및 인공 세포외소포체를 75℃에서 3시간 동안 배양하였다. 열처리 여부에 따른 우유 유래 세포외소포체와 인공 세포외소포체의 마커 CD9의 발현을 분석하였으며, 그 결과는 도 6a에 나타내었다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 엑소좀은 열을 처리 했음에도 CD9의 발현이 유지되는 것을 확인하였다. 반면에, 인공 엑소좀은 열처리로 인해 CD9의 발현이 현저히 감소된 것을 확인하였다.
또한 열처리에 따른 세포외소포체의 단백질 및 나노입자 농도를 측정하였다. 구체적으로 세포외소포체의 단백질 농도 측정은 Bradford assay를 이용하여 측정하였으며, 나노입자의 농도의 나노입자추적분석법(nanoparticle tracking assay)을 이용하여 측정하였다. 열처리에 따른 세포외소포체의 단백질 및 나노입자 농도 측정 결과는 각각 도 6b 및 c에 나타내었다.
도 6b 및 c에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체는 열을 가하였음에도, 단백질 및 나노입자의 농도 변화가 거의 없는 것을 확인하였다. 이와 달리, 인공 세포외소포체는 열을 처리함에 따라 단백질 및 나노입자의 농도가 현저히 감소한 것을 확인하였다.
상기 결과는 실시예 1에서 수득된 우유 유래 세포외소포체가 열 안정성이 우수하다는 것을 의미한다.
4-2. pH 안정성 분석
우유 유래 세포외소포체 및 인공 세포외소포체에 각각 HCl을 처리하여 pH 5로 조절하였다. 그 후, 우유 유래 세포외소포체와 인공 세포외소포체의 마커 CD9의 발현을 분석하였으며, 그 결과는 도 6d에 나타내었다.
도 6d에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 엑소좀은 강산을 처리 했음에도 CD9의 발현이 유지되는 것을 확인하였다. 반면에, 인공 엑소좀은 산처리로 인해 CD9의 발현이 현저히 감소된 것을 확인하였다.
또한 산처리에 따른 세포외소포체의 단백질 및 나노입자 농도를 측정하였다. 단백질 및 나노입자 농도 측정은 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 수행하였다. 세포외소포체의 단백질 및 나노입자 농도 측정 결과는 각각 도 6e 및 f에 나타내었다.
도 6e 및 f에 나타낸 바와 같이, 우유 유래 세포외소포체는 산을 가하였음에도, 단백질 및 나노입자의 농도 변화가 거의 없는 것을 확인하였다. 이와 달리, 인공 세포외소포체는 산을 처리함에 따라 단백질 및 나노입자의 농도가 현저히 감소한 것을 확인하였다.
상기 결과는 실시예 1에서 수득된 우유 유래 세포외소포체가 pH 안정성이 우수하다는 것을 의미한다.
실시예 5. 제조방법에 따른 우유 유래 세포외소포체의 특성 분석
초고속원심분리법 및 접선유동여과법으로 제조된 우유 유래 세포외소포체의 특성을 분석하였다.
5-1. 초고속원심분리법으로 제조된 우유 유래 세포외소포체의 제조
시판하는 식이성 우유를 50 mL씩 수거하여 2,000 xg에서 10분간 원심분리하여 잔여물을 제거하고 상층액을 취했다. 상기 상층액을 10,000 xg, 4℃에서 40분 동안 원심분리하여 남아있는 잔여물을 제거하였다. 초고속원심분리법을 이용하여 우유 유래 세포외소포체를 정제하기 위해, 상기 10,000 xg 원심분리 상층액을 35,000 xg, 4℃에서 1시간 동안 초고속원심분리하고, 상층액을 다시 100,000 xg, 4℃에서 1시간 동안 초고속원심분리하여 펠렛을 얻었다.
5-2. 접선유동여과법으로 제조된 우유 유래 세포외소포체의 제조
시판하는 식이성 우유를 50 mL씩 수거하여 2,000 xg에서 10분 동안 원심분리하여 잔여물을 제거하고 상층액을 취하여 10,000 xg, 4℃에서 40분 동안 원심분리하여 남아있는 잔여물을 제거하였다. 상층액을 100 kDa MWCO membrane이 설치된 접선유동여과(Tangential Fluid Filtration) 시스템을 이용하여 세포외소포체를 분리하였다.
5-3. 제조방법에 따른 우유 유래 세포외소포체의 특성 분석
제조방법에 따른 수율을 비교하기 위해, 단위 kg 우유당 획득한 우유 유래 세포외소포체의 단백질 및 나노입자를 정량하였다. 세포외소포체의 단백질 농도는 Bradford assay를 이용하여 측정하였으며, 이는 세포외소포체 전체 단백질 양을 대변한다. 나노입자의 농도는 나노입자추적분석법(nanoparticle tracking assay)을 이용하여 측정하였으며, 측정 시 total light scattering 방식을 사용하였으며 이는 화면에서 관찰되는 전체 나노입자양을 대변한다. 우유 유래 세포외소포체의 단백질 및 나노입자 정량 결과는 각각 도 7a 및 b에 나타내었다.
도 7a에 나타낸 바와 같이, 접선유동여과법(TFF)으로 제조된 우유 유래 세포외소포체는 단위 kg 우유에서 얻을 수 있는 단백질의 양이 초고속원심분리법(UC)에 비해 약 6배 이상 높은 것을 확인하였다.
도 7b에 나타낸 바와 같이, 접선유동여과법(TFF)으로 제조된 우유 유래 세포외소포체는 단위 kg 우유에서 얻을 수 있는 나노입자의 양이 초고속원심분리법(UC)에 비해 약 3배 이상 높은 것을 확인하였다.
제조방법에 따른 우유 유래 세포외소포체의 조골세포 증식능을 분석하였다. 상기 분석은 두가지 방법으로 제조된 우유 유래 세포외소포체를 동일 나노입자량으로 조골세포에 처리하였고, 나머지 실험 조건은 실시예 2의 방법과 동일하게 수행하였다. 조골세포 증식능 분석 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 접선유동여과법(TFF)으로 제조된 우유 유래 세포외소포체는 초고속원심분리(UC)제조된 것보다 조골세포의 증식을 촉진하는 활성이 우수한 것을 확인하였다.
실시예 6. 우유 유래 세포외소포체의 분말화
상기 실시예 1에서 수득된 우유 유래 세포외소포체를 동결건조 장비(Operon, FDUT-8606)를 이용하여 -40℃에서 진공조건에서 24시간 동안 동결건조하였다. 그 결과, 도 9a와 같이 분말형태의 우유 유래 세포외소포체를 얻었다. 또한 동결건조 여부에 따른 우유 유래 세포외소포체의 질량을 비교한 결과는 도 9b와 같으며, 동결건조 후 우유 유래 세포외 소포체의 질량이 크게 감소한 것을 확인하였다.
또한 동결건조된 우유 유래 세포외소포체를 초저온 전자현미경으로 관찰하였으며, 세포외소포체의 크기를 분석하였다. 동결건조된 세포외소포체의 초저온 전자현미경 관찰 결과 및 크기 분석 결과는 각각 도 9c 및 d에 나타내었다.
도 9c 및 d에 나타낸 바와 같이, 동결건조된 우유 유래 세포외소포체는 크기가 50 내지 400 nm 정도이며, 평균 245.9 ± 5.3 nm의 균일한 크기로 존재하는 것을 확인하였다.
종합적으로 본 발명자들은 접선유동여과법으로 우유 유래 세포외소포체를 제조하였으며, 이는 열 및 pH 안정성이 우수한 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 상기 우유 유래 세포외소포체는 동물 모델에서 조골세포 증식 및 뼈 길이 성장을 촉진하고, 골밀도를 증가시키는 것을 실험을 통해 확인하였다. 따라서 우유 유래 세포외소포체가 뼈성장 촉진 및 골질환 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이하, 제제예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 제제예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 제제예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.
제제예 1. 식품 제제의 제조
1-1. 건강식품의 제조
우유 유래 세포외소포체 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 g
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 g
비타민 C 10 mg
비오틴 10 g
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 g
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
1-2. 건강음료의 제조
우유 유래 세포외소포체 100 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3 g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃ 에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (14)
- 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 포함하는, 골형성 또는 뼈성장 촉진용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 우유 유래 세포외소포체는 bFGF(Basic fibroblast growth factor), IGF-1(Insulin-like growth factor 1), TGF-β(Transforming growth factor beta), 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 골형성 또는 뼈성장 촉진용 식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 우유 유래 세포외소포체는 크기가 10 내지 1000 nm인, 골형성 또는 뼈성장 촉진용 식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 골형성 촉진용은 골밀도 증가용인, 골형성 또는 뼈성장 촉진용 식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 뼈성장 촉진용은 뼈의 길이 성장용인, 골형성 또는 뼈성장 촉진용 식품 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 우유 유래 세포외소포체는
(a) 우유를 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 수득된 상층액으로부터 접선유동여과법(Tangential Fluid Filtration)으로 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 분리하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것인, 골형성 또는 뼈성장 촉진용 식품 조성물. - 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 포함하는, 골형성 또는 뼈성장 촉진용 건강기능식품 조성물.
- 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 포함하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제8항에 있어서,
상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 무혈성대퇴골괴사(Avascular necrosis of the Femoral Head), 치주염(periodontal disease) 및 파제트병(paget's disease)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 포함하는, 골질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- (a) 우유를 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 수득된 상층액으로부터 접선유동여과법(Tangential Fluid Filtration)으로 우유 유래 세포외소포체(extracellular vesicle)를 분리하는 단계;를 포함하는, 골형성 또는 뼈성장 촉진용 우유 유래 세포외소포체의 제조방법. - 제11항에 있어서,
상기 우유 유래 세포외소포체는 단백질 및 나노입자가 풍부한 것인, 골형성 또는 뼈성장 촉진용 우유 유래 세포외소포체의 제조방법. - 제11항에 있어서,
상기 우유 유래 세포외소포체는 열 및 pH에 대한 안정성을 갖는 것인, 골형성 또는 뼈성장 촉진용 우유 유래 세포외소포체의 제조방법. - 제11항에 있어서,
상기 제조방법은 (c) 상기 단계 (b)에서 분리된 우유 유래 세포외소포체를 분말화하는 단계;를 더 포함하는, 골형성 또는 뼈성장 촉진용 우유 유래 세포외소포체의 제조방법.
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