KR101273204B1 - 골형성 조성물 제조방법 - Google Patents

골형성 조성물 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 골형성 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 골형성 다공성 지지체, 콜라겐 및 성장인자를 혼합하는 단계 및 혼합 조성물에 압력을 가하는 단계를 포함하는 골형성 조성물을 제조하는 방법에 대한 것이다. 상기와 같은 방법으로 제조한 골형성 조성물는 성장인자의 방출량 및 방출 시기를 조절할 수 있고, 우수한 세포분화촉진 효과를 가진다. 따라서, 이와 같이 제조된 골형성 조성물는 다양한 목적의 의료용 재료로서 이용될 수 있다.

Description

골형성 조성물 제조방법{Methof for producing a composition for inducing of bone formation}
골형성을 유도하는 골 보충재를 재조하는 방법에 관한 것이다.
사람의 뼈는 골절되거나 손상된 경우 자연적 치유 능력에 의해 상당 부분 재생된다. 그러나, 골절이나 손상 부위가 클 경우 이러한 치유 능력은 발휘되기 어렵다. 이와 같이 손상된 부분이 많은 경우 또는 치료효과를 극대화하기 위하여, 현재 여러가지 골 보충재가 이용되고 있다.
최근에는 골 종양 적출이나 외상 등에 의해 생긴 뼈 등의 생체 조직의 결손부에 골 보충재 등의 생체 조직 보충재를 보충함으로써 뼈를 재생시켜 결손부를 회복시키는 것이 가능해졌다. 골 보충재로는 하이드록시아파타이트(HAP)이나 트리칼슘 포스페이트(TCP)이 알려져 있지만, 체내에 이물질을 남기지 않는 β-TCP와 같은 트리칼슘 포스페이트 다공체를 포함하는 골격(scaffold)이 사용된다. β-TCP를 뼈 골손부의 뼈 세포에 접촉시키면, 파골 세포가 β-TCP를 흡수하고 골아 세포가 새로운 뼈를 형성하는 리모델링이 행해진다. 즉, 뼈 결손부에 보충된 골 보충재는 경시적으로 자가 골로 치환된다. 이러한 골 보충재를 뼈 결손부에 보충할 때, 뼈 조직과의 고착력을 높이기 위해 뼈 결손부와 접촉하는 표면에 요철부를 설치하는 것이나(JP 3166352B 참조), 부직포를 포함하는 결합용 패드를 뼈 결손부와 접촉면에 배치하는 것(JP 2003-19149A 참조) 등이 각각 제안된 바 있다.
이와 같은 골 보충재는 기능이나 구성성분에 따라 다양하게 나누어진다. 골 보충재는 골치유 기전에 따라 골형성재료(osteogenetive material), 골전도성 재료(osteoconductive material) 및 골유도성 재료(osteeoinductive material)로 구분된다. 골형성 재료는 보충재 안에 살아남은 조골세포(osteoblast)와 전조골세포(preosteoblast)가 주위에서 직접 골형성을 일으킬 수 있는 능력을 가진 것으로, 대표적으로 자가골이 이에 해당한다.
골전도성 재료는 보충재 내부로 혈관이 증식되어 들어올 수 있는 매개체로서의 역할만 하며 보충재의 흡수와 신생골의 침착이 반보적으로 일어난 후 결국 신생골이 보충재를 대체하여 골치유를 하는 것으로, 대표적으로 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), 칼슘 설페이트(calcium sulfate), 실리카(silica), 폴리머(polymer) 및 천연 소유래의 하이드록시아파타이트(natural bovine-derived hydroxyapatite)가 이에 해당한다.
골유도성 재료는 보충재내의 골형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)과 같은 물질이 골형성 단백질 주위에 있는 숙주의 미분화 간엽세포들을 연골아세포(chondroblast) 또는 조골세포 등으로 분화할 수 있도록 하여 신생골 형성을 돕는 것으로, 대표적으로 동결건조 탈회골(demineralized freeze-dried bone, DFDB), BMP(bone morphogenetic protein) 또는 TGF-β 등이 이에 해당한다.
또한, 골 보충재는 공여 종별에 따라, 자기 자신의 골을 보충재로 이용하는 자가골(autograft), 다른 사람의 뼈를 보충재로 이용하는 동종골(allograft), 다른 동물의 뼈를 보충재로 이용하는 이종골(xenograft) 및 인공적으로 합성한 재료를 보충재로 이용하는 합성골(alloplastic material)로 구분된다.
특히, 합성골에는 금속, 실리콘이나 폴리에틸렌 및 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE)과 같은 중합체, 세라믹, 탄소 및 복합재료로 나뉘어 진다.
현재, 골조직 재료로 많이 쓰이는 재료 중 하이드록시아파타이트는 골조직 구성요소중 일차적인 무기질성의 천연 구성요소로서, 다공성 구조로 만들수 있다. 이 것의 장점은 골전도성이 우수하고, 조작이 용이하며, 가격이 저렴 할 뿐 아니라, 다양한 형태로 제조될 수 있다는 점이다. 특히, 입자 크기가 클수록 흡수기간이 길고 오랜 기간 잔존할 수 있으며, 다공성일수록 신생골의 침투가 용이하고 신속히 흡수가 되며, 결정도가 클수록 흡수기간이 길다. 또한, 견고하고 치밀한 블럭형은 압축강도가 높지만 파절되기 쉬우며, 다공성 구조의 경우 강도가 낮다. 또한, 트리칼슘 포스페이트(tricalcium phosphate, TCP)는 HAP로 일부 전환되면서 흡수되는 생체적합성이 입증된 재료이다. 이 재료는 99 % 이상의 순도를 갖는 세라믹 재료로서, 삼투성이 있는 세공이 세포의 내부성장을 활성화시키고 하부 입자들을 촘촘하게 결합시킬 수 있다. 특히 신생골 성장과 동시에 완전히 체내로 흡수가 가능한 장점이 있다.
한편, 뼈 결손부의 상태에 따라서는, 뼈 결손부 주변 세포의 활성을 높이기 위해 성장 인자를 골 보충재에 첨가함으로써 뼈 형성 작용을 촉진하는 경우가 있다. 상기 성장 인자의 첨가 방법으로서, 골 보충재에 크기가 다양한 구멍을 설치하고, 거기에 성장 인자를 함유하는 콜라겐 등의 생분해 점성체를 충전하는 방법이 알려져 있다 (KR10-2005-0120674A),
그러나, 상기와 같은 지금까지의 골 보충재는 다공체 내부의 미세 구멍 사이의 연통성은 확보되어 있지만, 직선적인 관통 구멍이 설치되지 않아 혈관 형성이 충분하지 않다는 문제점이 있다. 또한, 충분한 종류 및 양의 성장인자를 첨가할 수 없고, 시간이 경과함에 따라 결손부 주위의 생체 조직으로 성장인자등이 스며나오게 하는 서방형 방출 특성을 갖는 공급을 행할 수 없어 장시간에 걸친 효과의 유지를 도모할 수 없다는 문제점이 있다.
따라서, 골 유도 효과를 증진시키기 위하여, 보다 많은 양의 골 유도체가 골 지지체에 함침되고, 성장인자등이 지속적으로 방출될 수 있는 보충재인 골형성 조성물을 제조하기 위하여 연구한 결과, 특정 가압 조건 및 반복적인 동결 해동 과정을 거칠 경우 우수한 골 유도 효과 및 성장인자의 지속적인 방출효과를 갖는 골형성 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
JP 3166352B 초록 및 청구항 참조 JP 2003-19149A 초록 및 청구항 참조 KR10-2005-0120674A 초록 및 배경기술 참조
일 구체예는 골형성 다공성 지지체, 콜라겐 및 성장인자를 혼합하는 단계 및 혼합 조성물에 압력을 가하는 단계를 포함하는 골형성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 구체예는 일 구체예의 방법으로 제조된 골형성 조성물을 제공한다.
일 양상은 골형성 다공성 지지체, 콜라겐 및 성장인자를 혼합하는 단계; 및
혼합 조성물에 압력을 가하는 단계를 포함하는 골형성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 골형성 조성물을 제조하는 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.
먼저, 상기 방법은 골형성 다공성 지지체, 콜라겐 및 성장인자를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 골형성 다공체 지지체는 중합체(polymer), 세라믹(ceramics), 카본(carbon) 및 복합재료(composite)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 중합체는 실리콘(silicone), 메틸 메타크릴레이트(methyl metacrylate), 폴리에틸렌(polyethylene), 및 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 세라믹은 알루미늄 옥사이드(aluminum oxide), 티타늄 옥사이드(titanium oxide), 하이드록시아파타이트(HAP), 및 트리칼슘 포스페이트(TCP)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 카본은 바이오카본(biocarbon) 일 수 있다. 또한, 상기 복합재료는 프로플라스트(proplast) 또는 강화 아크릴릭 레진(reinforced acrylic resin)일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 성장인자는 BMP(bone morphogenetic protein) 또는 TGF(transforming growth factor)일 수 있다. 상기 BMP는 BMP-2, BMP-4 및 BMP-7로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 TGF는 α-TGF 또는 β-TGF 일 수 있다. 다공성 지지체에 도입된 BMP-2 성장인자의 농도가 1 ug인 경우 토끼의 골수줄기세포가 분화를 시작하면서 증식을 중단함으로써 세포수가 감소하는 반면 성장인자가 없는 지지체에서는 계속적으로 세포가 증식을 함을 보임으로써, 성장 인자의 유무 및 함량에 따라 세포분화를 야기할 수 있음을 확인하였다(도 9 참조).
이후, 상기 방법은 골형성 다공성 지지체, 콜라겐 및 성장인자의 혼합 조성물에 압력을 가하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 압력은 0.1 mTorr 내지 100 Torr일 수 있으며, 1 mTorr 내지 100 mTorr일 수 있고, 바람직하게는 3 mTorr 내지 50 mTorr일 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 mTorr 내지 15 mTorr일 수 있다. 골형성 다공성 지지체에 콜라겐 및 성장인자의 혼합액에 일정 압력을 가하는 단계를 포함할 경우 콜라겐 및 성장인자의 함침량이 증가함을 확인할 수 있었다(표 1 및 도 6 참조). 특히, 10 mTorr ~ 50 mTorr 사이에서 오스테오칼신의 분비량이 많아, 골분화 효과가 우수함을 확인하였다. 또한, 1000 mTorr 이상의 높은 압력을 가할 경우 함침량이 증가하고, 지속적인 BMP-2의 방출을 유도할 수 있는 장점이 있으므로, 지속적인 BMP-2의 방출을 유도하기 위하여는 높은 압력을 가하여 골형성 조성물을 제조할 수 있다.
또한, 가하는 압력에 변화를 줄 수 있다. 특히, 낮은 압력을 지속적으로 가할 수도 있으나, 골형성 조성물의 용도에 맞추어 낮은 압력에서 높은 압력조건으로 변화하거나 또는 높은 압력에서 낮은 압력조건으로 변화하면서 가압할 수 있다.
이후, 상기 방법은 추가적으로 동결 및 해동하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 동결 및 해동하는 단계를 1 내지 10회 반복할 수 있으며, 3 내지 8회 반복할 수 있으며, 5회 반복할 수 있다. 동결시 온도는 - 80 ℃ 내지 - 4 ℃ 일 수 있으며, - 60 ℃ 내지 - 10 ℃ 일 수 있으며, - 20 ℃ 일 수 있다. 동결 시간은 10분 내지 24시간일 수 있고, 1시간 내지 10시간일 수 있으며, 바람직하게는 5시간 내지 7시간일 수 있다. 또한, 해동은 4 ℃ ~ 37 ℃에서 수행할 수 있으며, 상온에서 수행할 수 있다. 동결 해동을 반복하는 단계가 골분화에 미치는 정도를 평가하기 위하여 지지체에 콜라겐과 성장인자를 도입 후 반복 동결 건조한 지지체에서 우수한 골분화정도를 확인하였다. 그 결과 동결 해동을 시킨 결과, BMP-2의 함침량이 증가함을 확인하였다(도 8 참조).
다른 양상은 상기의 방법으로 제조된 콜라겐 및 성장인자를 포함하는 골형성 조성물을 제공한다. 상기 다공성 지지체는 골 보충재로 사용될 수 있는 모든 재료가 이용될 수 있으며, 특히 하이드록시아파타이트(HAP), 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 혼합물 일 수 있다. 상기 성장인자는 BMP 및 TGF 일 수 있으며, 특히 BMP-2일 수 있다.
본 발명에 따른 골형성 다공성 지지체, 콜라겐 및 성장인자를 혼합하는 단계 및 혼합 조성물에 압력을 가하는 단계를 포함하는 골형성 조성물을 제조하는 방법을 이용할 경우, 성장인자의 방출량 및 방출 시기를 조절할 수 있어, 우수한 골형성 조성물을 제조할 수 있다.
도 1 및 도 2는 하이드록시아파타이트(HA)로 제작된 다공성 지지체와 이의 전자현미경 사진을 나타내는 것이다.
도 3은 다공성 지지체에 콜라겐과 성장인자를 함침시켜 제작한 골형성 조성물의 전자 현미경 사진을 나타내는 것이다.
A: 대조건(성장인자에 지지체를 담지 후 동결건조)
B; 콜라겐 함유군(콜라겐과 성장인자를 담지 후 가압 조건에서 반응 후 동결건조)
도 4 및 도 5는 성장인자를 함유한 골형성 조성물의 세포분화촉진 효과를 나타내는 것이다.
도 6은 다양한 가압 조건에서 생산한 골형성 조성물의 BMP-2의 분비량을 나타낸 것이다.
도 7은 다양한 가압 조건에서 생산한 골형성 조성물의 세포분화촉진 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 반복 동결/해동 단계를 거친 골형성 조성물의 BMP-2 분비량을 나타낸 것이다.
도 9는 성장인자의 함량에 따른 성체줄기세포 분화를 나타내는 것이며, 이때 Y 축은 골수줄기세포의 개수를 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 골형성 단백질 담지 지지체의 제조
구형 고분자인 Sephadex G-50(porogen)을 사용하여 다공성 시편을 성형하였다. 특히, 성형을 위해 석고판 위에 Porogen과 HAP 현탁액을 몰드 속에 부어 제작하였으며, 건조 시 시편이 몰드에서 쉽게 분리될 수 있도록 몰드 안쪽에 실리콘(silicone) 윤활유를 발라 건조 중 성형체에 균열이 발생하지 않도록 하였다. 이후, 2∼3일 간의 습식건조 후 4일간의 자연건조로 이행하여 초기 건조 시 시편의 균열 발생을 억제하였다. 건조된 성형체를 4 ℃/min로 700 ℃까지 승온하여 2시간 유지하는 동안 다공층을 조성하기 위해 도입한 폴로겐(porogen)을 연소시켜 제거하였다. 계속하여 1200 ℃까지 4 ℃/min 의 승온 속도로 가열한 뒤 1200 ℃에서 2시간 유지하여 성형체를 치밀화하였다. 그 뒤 상온에서 식혀 골형성 조성물을 제조하였다(도 1 및 2 참조).
실시예 2 : 지지체에 콜라겐과 성장인자 도입
10% DBM 겔(demineralized bone matrix gel)과 BMP-2 1 ug 을 균일하게 혼합한 10 ml 용액(BMP gel)에 지지체를 담지시킨 후 상온의 Freezing dry(일신바이오)에 넣고 2시간 동안 1~10 mTorr의 압을 가하여 지지체의 기공 내부로 콜라겐과 성장인자를 함침시켰다. 그 후 표면을 콜라겐으로 코팅하였다. 이 후 지지체만을 분리하여 -20 ℃에서 6시간 동결, 상온에서 4 시간 해동을 5회 반복하여 가교시킨 후 동결건조 하였다.
그 결과 콜라겐과 성장인자를 혼합해 지지체에 도입할 경우 성장인자의 농도 조절이 가능하며, 기공 내부까지 침투시키는 것이 가능함을 확인하였다. BMP-2 1 ug 용액에 지지체를 담지 후 동결 건조할 경우 성장인자가 지지체의 표면에 소량 고정화되는 반면, 콜라겐 젤과 혼합해 성장인자를 도입할 경우 기공 내부까지 성장인자가 침투함으로써 많은 양을 함침시키는 것이 가능하며 성장인자의 농도조절이 가능함을 확인하였다(도 3 참조).
실시예 3: 가압 조건에 따른 콜라겐과 성장인자의 함침량 측정
가압 조건에 따른 콜라겐과 성장인자의 함침량을 확인하기 위하여, 실시예 2에서 가압하는 과정을 달리한 것을 제외하고, 실시예 2에서 제조한 방법과 동일한 방법으로 골형성 조성물을 제조하였다. 가압 조건을 다양하게 하기 위하여 고압 조건의 경우 Freezing dry 대신 별도의 가압기를 사용하였다.
이와 같은 방법으로 제작한 골형성 조성물의 BMP-2 및 콜라겐의 지지체내로 함침량을 측정하기 위하여 BMP-2 방출량 및 골분화정도를 평가하기 위하여 오스테오칼신(osteocalin)의 증가량을 확인하였다(표 1, 표 2, 도 6 및 도 7 참조). 압력을 변화시킨 경우, 압력이 증가할 수록 오랜시간 동안 지속적으로 BMP-2를 방출할 수 있음을 확인함으로써, 많은 양의 BMP-2가 함침되었음을 알 수 있었다. 다만, 10 mTorr 내지 50mTorr의 압력을 가할 경우 2주 이내의 기간동안 가장 많은 BMP-2를 방출함을 확인하였다.
content of BMP -2 ( ng / ml )
1일 3일 7일 10일 14일
0( mTorr ) 7.8 6.3 5.1 3.1 1.2
10( mTorr ) 6.3 7.5 7.2 5.3 2.3
50( mTorr ) 6.2 7.3 6.8 5.4 2.8
100( mTorr ) 6.2 6.4 5.9 5.0 3.2
1000( mTorr ) 5.6 6.2 5.8 5.2 3.8
10000( mTorr ) 5.4 5.8 5.5 4.8 4.1
오스테오칼신
0( mTorr ) 1
5( mTorr ) 6.5
50( mTorr ) 6.3
100( mTorr ) 5.5
1000( mTorr ) 4.4
10000( mTorr ) 4.1
실시예 4: 반복 해동에 따른 콜라겐과 성장인자의 함침량 측정
반복 동결 해동에 따른 콜라겐과 성장인자의 함침량을 확인하기 위하여, 실시예 2의 마지막 과정에서 동결 해동 반복 과정을 제외하고 실시예 2에서 제조한 방법과 동일한 방법으로 골형성 조성물을 제조하였다. 즉, 대조군은 동결 해동을 실시하지 않은 골형성 조성물을 나타내며, 실험군은 상온에서 6시간 동결 해동을 5회 반복한 골형성 조성물을 나타낸다.
이와 같은 방법으로 제작한 골형성 조성물의 BMP-2 방출량을 측정하였다. 지지체에 함침된 성장인자의 방출을 콜라겐 젤의 반복 동결/해동법으로 조절할 수 있음을 확인하였다. -20 ℃에서 4시간, 상온에서 6시간 반복 동결/해동을 5회 실시한 실험군의 경우 BMP-2의 초기 초기 방출량이 감소하였고, 14일 경과 후 대조군에 비해 2배 이상의 성장인자가 남아있음을 확인하였다(도 8 참조).
실시예 5: 성장인자의 함량에 따른 성체줄기세포의 분화도 측정
실시예 5-1 : 세포의 증식률 측정
성장인자의 함침량에 따른 성체줄기세포의 증식정도를 확인하기 위하여, 실시예 2에서 BMP-2의 농도를 0 ug, 0.5 ug와 1 ug으로 다르게 한 것을 제외하고 실시예 2에서 실시한 것과 동일한 방법으로 골형성 조성물을 제조하였다.
이와 같은 방법으로 제조한 지지체를 토끼에서 얻은 골수줄기세포(1x104)를 골형성 조성물 표면에 이식한 후 24웰 플레이트에서 7일간 배양하였다. 그 후, 1, 3 및 7일에 WST-8 KIT를 이용해 새포수를 측정하였다. 지지체에 도입된 성장인자의 농도가 1 ug인 경우 토끼의 골수세포가 분화를 시작하면서 증식을 중단함으로써 세포수가 감소하는 반면 성장인자가 없는 지지체에서는 계속적으로 세포가 증식을 하는 것을 확인하였다(도 9 참조).
실시예 5-2 : 골 형성능 평가 측정
성장인자의 골 형성능을 평가하기 위하여 골형성 조성물을 제조하였다. 실시예 2에서 BMP-2/콜라겐 함유 여부만을 다르게 한 것을 제외하고 실시예 2에서 실시한 것과 동일한 방법으로 골형성 조성물을 제조하였다.
골형성 조성물을 EO(ethoxy oxide) 멸균 후 토끼 골수 줄기세포 1 × 106 을 지지체 표면에 이식 후 24 웰 플레이트에서 배양하였다. 3일에 한 번씩 배지를 교체 후 14일 경과 뒤 ALP test와 Real time PCR을 이용해 골 형성능을 평가하였다(도 4 및 5 참조).

Claims (16)

  1. 골형성 다공성 지지체, 콜라겐 및 성장인자를 혼합하는 단계;
    혼합 조성물에 5 내지 50 mTorr 압력을 가하는 단계; 및
    상기 혼합 조성물을 동결 및 해동하는 단계를 포함하는 골형성 조성물을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 골형성 다공체 지지체는 중합체(polymer), 세라믹(ceramics), 카본(carbon) 및 복합재료(composite)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 골형성 조성물을 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 중합체는 실리콘(silicone), 메틸 메타크릴레이트(methyl metacrylate), 폴리에틸렌(polyethylene), 및 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 골형성 조성물을 제조하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 세라믹은 알루미늄 옥사이드(aluminum oxide), 티타늄 옥사이드(titanium oxide), 하이드록시아파타이트(HAP), 및 트리칼슘 포스페이트(TCP)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 골형성 조성물을 제조하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 카본은 바이오카본(biocarbon)인 것인 골형성 조성물을 제조하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 복합재료는 프로플라스트(proplast) 또는 강화 아크릴릭 레진(reinforced acrylic resin)인 골형성 조성물을 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 성장인자는 BMP(bone morphogenetic protein) 또는 TGF(transforming growth factor)인 골형성 조성물을 제조하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 BMP는 BMP-2, BMP-4 및 BMP-7로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 골형성 조성물을 제조하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 TGF는 α-TGF 또는 β-TGF인 골형성 조성물을 제조하는 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 압력은 5 mTorr 내지 10 mTorr인 골형성 조성물을 제조하는 방법.
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 상기 동결 및 해동하는 단계를 1 내지 10회 반복하는 것을 특징으로 하는 골형성 조성물을 제조하는 방법.
  14. 제1항의 방법으로 제조된 다공성 지지체, 콜라겐 및 성장인자를 포함하는 골형성 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 다공성 지지체는 하이드록시아파타이트인 골형성 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 성장인자는 BMP-2인 골형성 조성물.
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