CN110214179A - 免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒、使用该试剂盒的免疫细胞培养方法、通过该试剂盒或培养方法获得的免疫细胞无血清培养液以及包含该培养液的化妆材料组合物 - Google Patents
免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒、使用该试剂盒的免疫细胞培养方法、通过该试剂盒或培养方法获得的免疫细胞无血清培养液以及包含该培养液的化妆材料组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及适用于免疫疗法的自然杀伤细胞培养技术，更具体而言，涉及与现有的免疫细胞培养方法相比，即便是采血后经过1天以上或极为衰弱的免疫细胞，也能够实现有效率的扩增以及激活的同时，显著增加NK细胞所占比率进行培养的免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒、利用该试剂盒的免疫细胞培养方法、通过该试剂盒或培养方法获得的免疫细胞无血清培养液以及包含该培养液的化妆材料组合物。
Description
技术领域
本发明涉及适用于免疫疗法的自然杀伤细胞(Natural Killer cell；NK细胞)培养技术，更具体而言，涉及一种与现有的免疫细胞培养方法相比，即便是采血后经过1天以上或极为衰弱的免疫细胞，也能够实现有效率的扩增以及激活的同时，显著增加NK细胞所占比率后，根据用途来确定是否使用血清，能够以选择性地包含或不包含血清的状态进行培养的免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒、利用该试剂盒的免疫细胞培养方法、通过该试剂盒或培养方法获得的免疫细胞无血清培养液以及包含该培养液的化妆材料组合物。
背景技术
哺乳动物的免疫系统包括多个独特的细胞，这些细胞起到防御细菌、病毒、毒素以及其他非-宿主物质入侵宿主的作用。对免疫系统的特异性起到主要作用的细胞类型称作淋巴球，淋巴球中具有B细胞、T细胞以及称作自然杀伤细胞的NK细胞。T细胞的命名源于产生自胸腺，B细胞的命名源于产生自骨髓，NK细胞自产生具备能够准确区分自身和外界的能力，及时找出非自身之物并去除，因此称作自然杀伤(NK)细胞。T细胞群中具有诸如抑制性T细胞(suppressor T cell)、细胞毒性T细胞以及辅助性T细胞等多种亚群。辅助性T细胞亚群决定Th1以及Th2两种免疫途径。Th1细胞(CD4+细胞的功能亚群)的特征在于提升细胞介导免疫反应的能力。Th1细胞产生细胞因子IL-2以及干扰素-γ。虽然Th2细胞也是CD4+细胞，但是与Th1细胞有所区别。Th2细胞负责产生抗体，并产生细胞因子IL-4、IL-5、IL-10以及IL-13。这些细胞因子在相互阻碍Th1以及Th2反应中起到重要的作用。
在免疫疗法中激活的免疫细胞中，尤其NK细胞是作为一种特征性形态的大颗粒淋巴细胞(LGL，Large granular lymphocyte)，具有杀死被感染病毒、肿瘤细胞的能力突出且不杀死大部分正常细胞的特性，所述NK细胞的抗肿瘤作用通过坏死(necrosis)或细胞凋亡(apoptosis)或通过同时产生这两种作用机理来实现。NK细胞与IL-2、IL-12、干扰素(Interferon)等细胞因子(cytokine)反应，由此提供效价(细胞毒性，cytotoxicity)、分泌性(secretory)、增殖性(proliferative)机能。在人体中，NK细胞的表现型(phenotype)是CD16(FcγRIII)及CD56，由于细胞表面上没有T细胞受体复合物(TRC，T-cell receptorcomplex)，CD16和CD56被用作NK细胞的标志物(marker)。
已知这种NK细胞在早期生物体防御系统和人体肿瘤免疫中起到重要的作用。即，NK细胞即便没有基于主要组织相容性复合体(Major Histoc ompatibility Complex：MHC)的表达的免疫获取过程，也能杀伤特定自体细胞、同源细胞、甚至异源癌细胞，尤其能够更容易地杀死对Class1MHC表达较少或不表达的靶细胞。因此，NK细胞能够有效杀死不表达MHC的大部分的癌细胞，除此之外，还能够杀死被几种病毒感染的细胞和伤寒沙门菌(salmonella typhi)等细菌。
但是，即使对于正常人而言，这样对杀伤癌细胞起到卓越作用的NK细胞仅占据外周血淋巴球的5～25％，尤其对于癌患者而言，该比率降低至不足5％，因此，若没有通过免疫疗法的额外的扩增过程，则有效攻击癌细胞受限制。
激活免疫细胞尤其激活NK细胞使其增殖时，使用IL-2等细胞因子(C ytokine)和CD等抗体。现有技术中，在免疫细胞的增殖中起到极为重要作用的是CD3抗体，问题在于利用该抗体激活免疫细胞是极为严苛的。即，在培养免疫细胞时，目前的技术主要采用将CD3抗体固定在烧瓶上刺激规定时间的方法。但是，对于免疫细胞而言，每个人的敏感性不同，另外，根据细胞培养条件或操作者的熟练程度，具有极大差异。例如，对于CD3抗体的刺激少或几乎没有时，免疫细胞增殖不好。另外，过度刺激时，NK细胞几乎不增殖，NKT细胞或T细胞增殖较多。此时，尤其T细胞增殖较多，因此很难通过增殖获得较多NK细胞。
尤其，从一开始施加CD3抗体的强刺激时，未成熟前体细胞会成熟为T细胞，因此，通常进行的现行方法采用在一开始轻微刺激CD3抗体的方法，但受到个体差异等周边环境条件的影响较多，获得被激活且大量增殖的NK细胞较为困难。
另一方面，从外周血分离淋巴球，并采用高浓度的IL-2和CD3、CD16、CD56等抗体，在体外培养免疫细胞时，NK细胞和Th1型的细胞增殖，免疫细胞分裂并成长过程中，分泌多种细胞因子，这种细胞因子(γ-干扰素、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18等)不仅强化皮肤免疫，还能抑制Th2细胞因子的过量产生，能够极为有效地用于皮肤炎症治疗。
这种细胞因子中，在NK细胞中大量生产的IL-8使血液中的单核球聚集并分化为巨噬细胞。巨噬细胞先进行去除抗原的活动，但是没有进一步需去除的抗原或通过IL-4转换为M2a型，该M2a型巨噬细胞为了恢复因创伤或炎症所破坏的组织，制作多种相关因子(TGF-β、bFGF、PDGF、VEGF、MMPs、TIMPs)。最终，通过在NK细胞大量制作而成的IL-8，使巨噬细胞(M2a型)增加，从而能够迅速治疗炎症或伤口。甚至，IL-8使角化细胞聚集到表皮，使表皮层保持结实并健康，有效阻止外部侵入，从而改善或治疗皮肤疾病的效果良好。另外，单独使用通过能够容易获得的基因重组技术获得的IL-8或混合使用IL-8和IL-4或干扰素γ等时IL-4将通过IL-8大量增殖的巨噬细胞转换为M2a型的巨噬细胞，因此，能够提高创伤治疗以及皮肤美容效果。
但是，用迄今为止已知的免疫细胞培养方法培养免疫细胞时，在培养时间点的2周之后起，免疫细胞死亡的速度比免疫细胞增殖的速度快，经过3周至4周时，培养基中几乎很难发现免疫细胞。因此，通常从血液提取淋巴球后，培养2周经提取的淋巴球使其增殖来获得免疫细胞，对于获得的免疫细胞或培养液，直接使用或冷冻保管后使用。其结果，为了获得大量的免疫细胞或免疫细胞培养液，需要大量的血液。
另外，在培养免疫细胞时，一般使用血清，此时将使用其他人或动物的血清获得培养液用作化妆材料组合物或治疗剂时，会担心因使用血清感染我们不清楚的疾病，存在不好使用的问题，因此迫切需要不含血清的培养液。
而且，免疫细胞能够使用的有效期为采血后24小时以内。即，寿命短，采血后经过1天时，细胞急速衰弱，难以进行细胞培养。由于上述问题，难以寻找供体血液。为了培养采血后过了较长时间或从免疫力差的人获得的免疫细胞，或回收制备输血用血液制剂时扔掉的白细胞去除过滤器中的免疫细胞，需要一种能够激活衰弱的免疫细胞进行培养的方法。
发明内容
要解决的技术问题
本发明人为了解决上述问题，进行研究努力的结果，开发了一种省略固定抗CD3抗体后使其反应规定时间后去除的工序，而且即便是原本衰弱的免疫细胞或例如高龄层的免疫细胞或重症癌症患者的免疫细胞，也能够使NK细胞在淋巴球培养液中稳定扩增的方法，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供一种免疫细胞无血清细胞培养用培养基添加试剂盒，其省略为了刺激淋巴球而将抗CD3抗体固定在培养容器的状态下将淋巴球(免疫细胞)培养规定时间的繁琐过程，在大容量培养过程中，能够选择性地决定是否包含血清并进行培养，在最终所获得的淋巴球培养液中稳定扩增NK细胞，从而能够大量增殖。
本发明的另一目的在于，提供一种稳定的免疫细胞培养方法，通过依次使用构成培养基添加试剂盒所包含的单元的添加剂，即，指定对淋巴球给予刺激的顺序，即使在培养原本衰弱的免疫细胞或例如高龄层的免疫细胞或重症癌症患者的免疫细胞情况下，在最终获得的淋巴球培养液中T细胞的比重低且NK细胞的比重显著高。
本发明的又一目的在于，提供一种免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒，为了在培养淋巴球时，能够使NK细胞能够以显著高的比率增殖，实现培养步骤中需添加的培养基添加剂的标准化，从而能够极易培养NK细胞。
本发明的又一目的在于，提供一种化妆材料组合物，作为有效成分包含白介素-8以及干扰素γ等高浓度的免疫细胞无血清培养液，基于皮肤美白或皮肤再生效果的改善皱纹等效果优异。
本发明的又一目的在于，提供一种药学组合物，通过包含白介素-8以及干扰素γ等高浓度的免疫细胞无血清培养液作为有效成分，对创伤或烧烫伤等的伤口治疗以及皮肤疾病治疗等效果优异。
本发明的目的不限于以上提及的目的，即便不明确提及，通过后述发明的详细说明，普通技术人员能够意识到的发明目的仍能够包含其中。
技术问题的解决方案
为了实现上述本发明的目的，本发明提供一种免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒，包含：B单元，由包含IL-2、L-谷氨酰胺以及细胞培养用培养基的基本溶液构成；C1-1单元，由细胞因子1-1溶液构成，所述细胞因子1-1溶液，是通过将IL-12和IL-18溶解到所述基本溶液中，以0.5～5ng/mL的浓度包含所述IL-12，以2～50ng/mL的浓度包含所述IL-18来形成的；C1-2单元，由细胞因子1-2溶液构成，所述细胞因子1-2溶液是，通过将IL-12和IL-18溶解到所述基本溶液中，以5.1～15ng/mL的浓度包含所述IL-12，以30～120ng/mL的浓度包含所述IL-18来形成的；C2单元，由细胞因子2溶液构成，所述细胞因子2溶液是，通过将IL-15溶解到所述基本溶液中，以10～50ng/mL的浓度包含所述IL-15来形成的；A1单元，由抗体1溶液构成，所述抗体1溶液是，通过将抗CD16和抗CD56溶解到所述基本溶液，分别以0.1～15ug/mL的浓度包含所述抗CD16和所述抗CD56来形成的；A2单元，由抗体2溶液构成，所述抗体2溶液以1：6～10的体积比包含所述抗体1溶液和所述基本溶液；以及D单元，由抗体-细胞因子混合溶液构成，所述抗体-细胞因子混合溶液是，通过将抗CD3溶解到所述细胞因子1溶液中，以1～12ug/mL的浓度包含所述抗CD3来形成的。
在优选实施例中，所述A1单元比所述D单元先添加到淋巴球培养基中。
在优选实施例中，所述A1单元中包含的所述抗CD16、抗CD56以及所述基本溶液分开包装，在培养基添加步骤中混合，从而形成所述抗体1溶液。
在优选实施例中，所述A2单元中包含的所述抗体1溶液的抗CD16、抗CD56以及所述基本溶液与所述基本溶液分别分开包装，在培养基添加步骤中混合，从而形成所述抗体2溶液。
在优选实施例中，所述D单元中包含的抗CD3以及所述细胞因子1溶液分别分开包装，在培养基添加步骤中混合，从而形成所述抗体-细胞因子混合溶液。
在优选实施例中，按照C1-1单元、C2单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序，或C2单元、C1-1单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序，或C1-1单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序，或C2单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序，依次将各单元添加到淋巴球培养基中使用。
另外，本发明提供一种免疫细胞培养方法，包括：第1步骤，在分离出的淋巴球中添加C1-1单元的细胞因子1-1溶液以及C2单元的细胞因子2溶液中的一种以上后，添加自体血浆；第2步骤，在执行了所述第1步骤的培养基中添加A1单元的抗体1溶液；第3步骤，在执行了所述第2步骤的培养基中添加D单元的抗体-细胞因子混合溶液；第4步骤，在执行了所述第3步骤的培养基中添加C1-1单元的细胞因子1-1溶液后，添加自体血浆；第5步骤，在执行了所述第4步骤的培养基中添加A2单元的抗体2溶液后，添加自体血浆或FBS；第6步骤，在执行了所述第5步骤的培养基中添加C2单元的细胞因子2溶液后，添加自体血浆或FBS；以及第7步骤，在执行了所述第6步骤的培养基中添加A2单元的抗体2溶液及自体血浆或所述抗体2溶液及FBS。
在优选实施例中，还包括：第8步骤，在执行了所述第7步骤的培养基中添加B单元的基本溶液以及自体血浆或FBS进行培养；以及第9步骤，在执行了所述第8步骤的培养基中添加自体血浆或FBS后，放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器中进行培养。
在优选实施例中，所述分离出的淋巴球从采血后经过1天以上的血液中分离。
在优选实施例中，还包括：第10步骤，将执行了所述第7步骤或第9步骤的培养基分离成细胞和血清培养液；第11步骤，对在所述第10步骤中分离出的细胞进行洗涤；第12步骤，将在所述第11步骤中洗涤后的细胞放入新的培养容器中，添加B单元的基本溶液进行培养；以及第13步骤，将执行了所述第12步骤的培养基放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器中，并添加C1-2单元的细胞因子1-2溶液进行培养。
在优选实施例中，还包括：第14步骤，将执行了所述第13步骤的培养基分离成细胞和无血清一级培养液；以及第15步骤，将在所述第14步骤中分离出的细胞添加到B单元的基本溶液中，并放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器中，并添加C1-2单元的细胞因子1-2溶液进行培养。
在优选实施例中，所述自体血浆中，每1ml血浆包含40usp unit以上的肝素。
在优选实施例中，所述添加的自体血浆或FBS的含量小于全体培养基的10体积％。
另外，本发明提供一种通过上述任一种培养方法培养的免疫细胞培养液。
另外，本发明提供一种从通过上述任一种培养基添加试剂盒培养的免疫细胞培养液或通过上述任一种培养方法培养的免疫细胞培养液获得的免疫细胞无血清培养液。
另外，本发明提供一种化妆材料组合物，包含上述免疫细胞无血清细胞培养液以及化妆材料基底。
在优选实施例中，所述免疫细胞无血清培养液作为有效成分，作用于改善炎症、皮肤美白、消除色素沉积、皮肤再生中的一种以上。
在优选实施例中，所述免疫细胞无血清培养液占全体组合物重量的50重量％以下。
另外，本发明提供一种包含上述的免疫细胞无血清培养液的用于治疗包括烧烫伤以及创伤的伤口或皮肤疾病的药学组合物。
发明效果
本发明具有如下优秀的效果。
首先，本发明的免疫细胞培养用培养基添加试剂盒省略为了刺激淋巴球而以将抗CD3抗体固定在培养容器的状态将淋巴球(免疫细胞)培养规定时间的繁琐过程，在大容量培养时，能够选择性地决定是否包含血清进行培养，同时在最终所获得的淋巴球培养液中稳定扩增NK细胞并且能够使其大量增殖。
另外，本发明的免疫细胞培养方法通过依次使用构成培养基添加试剂盒所包含的单元的添加剂，即，指定对淋巴球给予刺激的顺序，即使在培养原本衰弱的免疫细胞或例如高龄层的免疫细胞或重症癌症患者的免疫细胞时，也能够使T细胞在淋巴球培养液中的比重低且使NK细胞的比重显著高。
另外，根据本发明，为了在培养淋巴球时，能够使NK细胞以显著高的比率增殖，使培养步骤中需添加的培养基添加剂标准化，从而能够极易培养NK细胞。
另外，根据本发明的化妆材料组合物，通过包含白介素-8以及干扰素γ等高浓度的免疫细胞无血清培养液作为有效成分，基于皮肤美白或皮肤再生效果的改善皱纹等效果优异。
另外，根据本发明的药学组合物，通过包含白介素-8以及干扰素γ等高浓度的免疫细胞无血清培养液作为有效成分，对于创伤或烧烫伤等的伤口治疗以及皮肤疾病治疗等效果优异。
本发明的上述技术效果不仅限于以上提及的范围，即便未明确提及，通过后述用于实施发明的具体内容的记载，普通技术人员能够意识到的发明效果仍包含其中。
附图说明
图1及图2是示出将本发明实施例的化妆材料组合物涂抹在痤疮部位后所获得的改善炎症以及去除色素沉积效果的过程照片。
图3是示出将本发明实施例的化妆材料组合物涂抹在昆虫叮咬所致的红斑点后所获得的改善炎症以及去除色素沉积效果的过程照片。
图4是示出将本发明实施例的化妆材料组合物涂抹在发生过敏部位后所获得的改善炎症以及去除色素沉积效果的过程照片。
图5是示出将本发明实施例的化妆材料组合物涂抹在间隔时间差产生多种过敏的大面积部位后所获得的改善炎症以及去除色素沉积效果的过程照片。
图6是示出将本发明实施例的化妆材料组合物涂抹在烧烫伤部位后所获得的皮肤再生效果的过程照片。
具体实施方式
本发明所使用的术语仅用于说明特定实施例，并非旨在限定本发明。除非上下文中具有明确的相反含义，否则单数的表述包括复数的表述。要理解，本申请中，“包含”或“具备”等术语是指，存在说明书中记载的特征、数字、步骤、动作、构成要素、部件或它们的组合，并非事先排除存在或附加一个或其以上的其他特征或数字、步骤、动作、构成要素、部件或它们的组合的可能性。
第一、第二等术语可以用于说明多种构成要素，但是所述构成要素并非限定于所述术语。所述术语的使用目的在于，区别一个构成要素和另一个构成要素。例如，在不超出本发明的权利范围的前提下，第一构成要素可以命名为第二构成要素，与此类似，第二构成要素也可以命名为第一构成要素。
除非有不同定义，包括技术或科学术语在内，在这里所使用的所有术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员一般所理解的含义相同的含义。一般而言，所使用的事先定义的术语应解释为，具有与相关技术的语句所具有的含义一致的含义，除非本发明中有明确定义，否则不应解释为理想或过分形式上的含义。
本发明中所使用的“免疫细胞无血清培养液”是指，从不含血清的免疫细胞培养液分离免疫细胞之后的剩余培养液。因此，免疫细胞无血清培养液可以通过从没有血清的条件下增殖的免疫细胞培养液分离免疫细胞而获得，含有免疫细胞的次级代谢产物，例如细胞因子。另外，“NK细胞”用作都包含NK细胞(NK cell)和NKT细胞(NKT cell)的含义。
以下，参照附图以及优选实施例，对本发明的技术构成进行详细说明。
但是，本发明并非限定于在此说明的实施例，可以具体实施为其他方式。在整个说明书中，用于说明本发明的相同的附图标记表示相同的构成要素。
本发明的技术特征在于，一种免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒、利用该培养基添加试剂盒的培养方法以及由该培养液获得的产物的利用方法，无需为了刺激淋巴球而以将抗CD3抗体固定在培养容器的状态将淋巴球(免疫细胞)培养规定时间的繁琐过程，在大容量培养过程中，能够选择性地决定是否包含血清并进行培养，即使在培养原本衰弱的免疫细胞或例如高龄层的免疫细胞或重症癌症患者的免疫细胞时，能够使NK细胞在最终所获得的淋巴球培养液中稳定扩增，从而能够使其大量增殖。
一般而言，在培养基于NK细胞的免疫细胞时，一般大多使用CD3、CD16、CD56等抗体，若用这些直接刺激衰弱细胞，则反而经常发生细胞更快死亡的情形。这被认为是，对衰弱细胞施加较大刺激时诱导细胞凋亡。
本发明用于解决上述问题，着眼于在培养基于NK细胞的免疫细胞时，首先激活衰弱细胞使其强健，接下来刺激抗体时细胞不会凋亡而是大量增殖。
即，在培养基于NK细胞的免疫细胞时，在刺激抗体之前，通过在IL-2的规定浓度下混合IL-12和IL-18或混合IL-12和IL-15或单独IL-15等细胞因子(Cytokine)，首先刺激12～24小时以上时，确认了分泌干扰素γ等很多细胞因子(Cytokine)，发现通过这些细胞因子(Cytokine)，免疫细胞恢复很多并被激活，因为确认了衰弱的免疫细胞在激活的状态下被抗体刺激时(用抗CD16和抗CD56刺激，然后用抗CD3刺激时，或仅用抗CD3刺激时)，如预期，NK细胞、NKT细胞、T细胞等很好地增殖。此时，无需固定抗体来使用，仅仅简单地添加到培养基内就能刺激免疫细胞。
如上所述，根据在本发明中开发的原理，用抗CD16以及抗CD56抗体刺激尚未成熟的未成熟前体细胞，诱导分化成NK细胞，激活已成熟的NK细胞后，用抗CD3抗体刺激T细胞，被激活的T细胞激活NK细胞时，确认到即使抗CD3抗体刺激至在培养基内分解而消失为止，NK细胞也会顺利地大量增殖，通过该实验结果可知，在本发明的培养方法中，即便无需为了刺激淋巴球以将抗CD3抗体固定在培养容器的状态将淋巴球(免疫细胞)培养规定时间的繁琐的过程，也能够，也能够以极高的NK细胞的比率培养淋巴球。
使用这种方法时，即便是原本衰弱的免疫细胞或例如高龄层的免疫细胞或重症癌症患者的免疫细胞，也能很好地培养免疫细胞。尤其，在制备输血用血液时过滤并去除白细胞，即便回收培养这样被扔掉的去除过滤白细胞时的淋巴球时，也能非常有用地使用。
因此，为了能够在培养淋巴球的各个步骤中添加到培养基，本发明的免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒分别独立包装，并包含内容物即组成成分不同的B单元、C1-1单元、C1-2单元、C2单元、A1单元、A2单元以及D单元。其中，考虑到对淋巴球培养基所造成的影响，确定所述单元中所包含的组成成分，以便在培养淋巴球时，即便培养衰弱的淋巴球，也能够使所培养出的大部分细胞为NK细胞。尤其，本发明的免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒在对从采血后经过一天以上的血液分离出的淋巴球进行培养时，与现有培养方式相比，为了能够使NK细胞稳定增殖至最少500倍至5000倍，将所述单元添加到淋巴球培养基进行使用的顺序是下面四种方式中的任意一种。
①C1-1单元、C2单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序，②C2单元、C1-1单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序，③C1-1单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序，④C2单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序。
首先，B单元由基本溶液构成，基本溶液包含IL-2、L-谷氨酰胺以及细胞培养用培养基。此时，IL-2的含量可以是100ng/mL～300ng/mL，优选包含以200～250ng/mL(3240IU/mL～4000IU/mL)的浓度包含。
众所周知，IL-2是T细胞识别抗原而被激活时所制成的分子量为14～17kDa的糖蛋白(glycoprotein)，分泌至T细胞外后，与产生IL-2的T细胞自身反应，从而促进该T细胞的生长。另外，IL-2作用于NK细胞而促进生长，并强化NK细胞的杀伤能力，还作用于B细胞促进其生长。L-谷氨酰胺是作用为起到用于培养免疫细胞的营养成分的成分，细胞培养用培养基是悬浮细胞培养用基本培养基，可以使用公知状态的培养基。
作为B单元的具体实现例，可以将2mg的IL-2和100mL的500mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)放入悬浮细胞培养用基本培养基(市场上销售的细胞培养基，若基本培养基中已存在IL-2或L-谷氨酰胺(L-glutamine)时，通过调节添加量来达到最终浓度)，并溶解，最终制成10L，从而可制备基本溶液(B单元)。
C1-1单元由细胞因子1-1溶液构成，细胞因子1-1溶液包含IL-12、IL-18以及基本溶液。其中，细胞因子1-1溶液中，IL-12的所含浓度可以是0.5ng/mL～5ug/mL，优选的浓度可以是1～3ng/mL，更优选的浓度可以是1.5ng/mL～2.5ng/mL。IL-18的所含浓度可以是2ng/mL～50ng/mL，优选的浓度可以是6ng/mL～20ng/mL，更优选的浓度可以是11ng/mL～15ng/mL。
C1-2单元由细胞因子1-2溶液构成，与细胞因子1-1溶液相同地，细胞因子1-2溶液包含IL-12、IL-18以及基本溶液，仅仅是各成分的含量不同。细胞因子1-2溶液中，IL-12的所含浓度可以是5.1ng/mL～15ug/mL，优选的浓度可以是6～12ng/mL，更优选的浓度可以是8ng/mL～10.5ug/mL。IL-18的所含浓度可以是30ng/mL～120ng/mL，优选的浓度可以是40ng/mL～80ng/mL，更加优选的浓度可以是50ng/mL～70ng/mL。
众所周知，从树突状细胞(DC)、巨噬细胞、B细胞产生IL-12。IL-12在NK细胞和T淋巴球中起到诱导IFN-γ和TNF-α的产生并减少阻碍IFN-γ的IL-4的产生的作用。另外，增加NK细胞和CD8+细胞毒(cytotoxic)T淋巴球的细胞毒性。IL-12在NK细胞内与IL-2信号转导途径有紧密的关系。另外，IL-2在NK细胞内诱导IL-12受体β1和IL-12受体β2的表达，从而表达与IL-12信号转导途径相关的蛋白质并激活。这样的机制在NK细胞的IFN-γ产生能力和靶细胞杀伤能力中被有效证明。据报道，IL-12受体β2被视为对IL-12功能起到重要作用，这是因为阻碍Th2产生的同时促进Th1的产生。在T细胞和NK细胞中，IL-12的信号转导包括在JAK-STAT信号转导途径中，IL-12受体β2的活性在诱导转录因子STAT4的磷酸化并激活时起到重要作用。
另外，IL-18产生于巨噬细胞，是促炎性(proinflamatory)细胞因子基因。IL-18与IL-18受体结合，与IL-12一同在被细菌或病毒感染的细胞中产生免疫反应，并在NK细胞和T细胞中增加IFN-γ的产生。
作为C1-1单元的具体实现例，将10ug的IL-12以及50ug的IL-18溶解于水，制成10mL，制备细胞因子溶液(IL-12：1ug/mL的浓度，IL-18：5ug/mL的浓度)后，可以将1mL的细胞因子溶液溶于500mL的基本溶液，使得以2ng/mL的浓度包含IL-12，以10ng/mL的浓度包含IL-18，从而可制备细胞因子1-1溶液(C1-1单元)。
C2单元由细胞因子2溶液构成，细胞因子2溶液具有包含IL-15以及基本溶液的组成。细胞因子2溶液中，IL-15的含量可以是10～50ng/mL，优选可以是15ng/mL～25ng/mL。
众所周知，IL-15是属于四螺旋簇细胞因子家族(helix bundle cytokinefamily)的多效性细胞因子，作用于多种细胞，对增殖、生存、分化中起到重要作用。另外，IL-15在略微多种细胞中表达，因此与IL-2相比，能够起到略微广泛多样的调节作用。尤其，对免疫反应的各个相(phase)产生影响，还作用于参与各步骤免疫反应的多种细胞，一系列的研究结果论证了IL-15直接参与记忆T细胞(memory T cell)的形成。
作为C2单元的具体实现例，可以将IL-15溶于基本溶液中，制成20ng/mL的浓度，从而可制备细胞因子2溶液(C2单元)。
A1单元由抗体1溶液构成，抗体1溶液包含抗CD16、抗CD56以及基本溶液。此时，构成A1单元的抗体1溶液中，抗CD16以及抗CD56的含量可以分别是0.1～2.0ug/mL，优选可以分别是0.5～0.7ug/mL。
众所周知，CD16以及CD56是NK细胞的表面蛋白，在存在抗CD16抗体或抗原抗体复合体的条件下培养淋巴球时，NK细胞中被添加CD16抗原而产生信号转导，通过这些刺激，NK细胞中IL-2受体的α链等运铁蛋白(transferrin)受体表达或能够产生肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)或IFN-γ。执行抗CD56抗体和与抗CD16抗体类似的功能。
作为A1单元的具体实现例，可以将抗CD16以及抗CD56溶液(1mg/mL)分别取6uL溶于10mL的基本溶液中，从而可制备抗体1溶液(A1单元)。
A2单元由抗体2溶液构成，抗体2溶液可以以1：6～10的体积比包含抗体1溶液和基本溶液，因此，A2单元的具体实现例可以在6.5mL的抗体1溶液中混合30mL的基本溶液来制备抗体2溶液。
如上所述，以抗体已添加到基本溶液中的状态制备的A1单元以及A2单元，在冷藏保管时可以使用1～2个月左右，为了延长使用期限，构成A1单元以及A2单元的抗CD16、抗CD56、基本溶液可以独立分开包装，在培养基添加步骤中混合，分别形成抗体1溶液以及抗体2溶液。
D单元由抗体-细胞因子混合溶液构成，抗体-细胞因子混合溶液可以包含抗CD3以及细胞因子1溶液。此时，抗CD3的含量可以是1ug/mL～12ug/mL，优选可以是3ug/mL～8ug/mL，更加优选可以是4ug/mL～5ug/mL。
众所周知，T细胞(T cell)通过TCR接收信号时被激活(activation)，但是TCRα或β链无法自行传递激活信号(activation signal)，而是通过位于TCR周围的CD3链(CD3chain)来传递信号。即，当TCR识别到抗原时，CD3抗原起到将该信号传递至细胞内的作用，例如，当TRC与MHC+抗原结合时，向细胞内传递已结合的信号，TCR与CD3抗原(γ、δ、ε、ζ、ζ或η)形成复合物。
作为D单元的具体实现例，可以将5uL的抗CD3溶液(1mg/mL)溶于1mL的细胞因子1溶液中，来制备抗体-细胞因子混合溶液(D单元)。
在D单元的情形下，以抗体已添加到细胞因子1溶液的状态进行制备时，在冷藏保管条件下可以使用1～2个月左右。因此，为了延长使用期限，可将构成D单元的抗CD3以及细胞因子1溶液独立分开包装，在培养基添加步骤中混合，形成抗体-细胞因子混合溶液。此时，可以将使用期限延长6个月以上。
接下来，本发明的利用免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒的免疫细胞培养方法包括：第1步骤，在分离出的淋巴球中添加C1-1单元的细胞因子1-1溶液以及C2单元的细胞因子2溶液中的一个以上后，添加自体血浆；第2步骤，在执行了所述第1步骤的培养基中添加A1单元的抗体1溶液；第3步骤，在执行了所述第2步骤的培养基中添加D单元的抗体-细胞因子混合溶液；第4步骤，在执行了所述第3步骤的培养基中添加C1-1单元的细胞因子1-1溶液后，添加自体血浆；第5步骤，在执行了所述第4步骤的培养基中添加A2单元的抗体2溶液后，添加自体血浆或FBS；第6步骤，在执行了所述第5步骤的培养基中添加C2单元的细胞因子2溶液后，添加自体血浆或FBS；以及第7步骤，在执行了所述第6步骤的培养基中添加A2单元的抗体2溶液以及自体血浆或FBS。
为了使最终所获得的免疫细胞培养液中根据用途包含或不包含血清，可以通过下面的两种方法执行上述的本发明的免疫细胞培养方法。
首先，免疫细胞培养液中包含血清的情形还可执行：第8步骤，在执行了所述第7步骤的培养基中添加B单元的基本溶液以及自体血浆或FBS并进行培养；以及第9步骤，在执行了所述第8步骤的培养基中添加自体血浆或FBS后，放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器进行培养。
另外，免疫细胞培养液中不包含血清的情形还可执行：第10步骤，将执行了所述第7步骤或第9步骤的培养基分离成细胞和血清培养液；第11步骤，对在所述第10步骤中分离出的细胞进行洗涤；第12步骤，将在所述第11步骤中洗涤后的细胞放入新的培养容器后，添加B单元的基本溶液进行培养；以及第13步骤，将执行了所述第12步骤的培养基放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器，并添加C1-2单元的细胞因子1-2溶液进行培养。必要时，还可执行：第14步骤，将执行了所述第13步骤的培养基分离成细胞和无血清一级培养液；以及第15步骤，将在所述第14步骤中分离出的细胞添加到B单元的基本溶液中，并放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器，并添加C1-2单元的细胞因子1-2溶液进行培养。必要时，第14步骤以及第15步骤可以重复执行一次以上，获得无血清二级培养液、无血清三级培养液等，根据培养的细胞状态进一步重复1～2次，从而可在一个批次中获得3～4升以上的免疫细胞无血清培养液。
此时，在第1步骤中分离出的淋巴球可以是从采血后经过1天以上的血液分离或高龄层的免疫细胞或重症癌症患者的免疫细胞等衰弱的免疫细胞，所添加的自体血浆或FBS的含量小于全体培养基的10体积％。
在执行第1步骤后到执行第2步骤为止间隔24小时以上时，能够充分激活衰弱的免疫细胞。在执行第2步骤后到执行第3步骤为止也间隔24小时以上，需要用抗体1溶液即存在IL-2条件下用抗CD16和抗CD56充分刺激淋巴球，然后执行第3步骤，才能使D溶液包含的抗CD3抗体不固定而添加到培养基中，即便抗CD3抗体刺激至在培养基内分解消失，也完全不会发生特别的问题且NK细胞增殖较多。
在本发明的培养步骤中所添加的自体血浆中，所含的肝素多出公知的培养方法中所使用的自体血浆中所包含的肝素的量至少3倍以上。即，通常采血时，即便每10mL的血液使用158usp unit的肝素，血液也不会凝固，但是以约每5mL的血浆158usp unit放入细胞培养液中时，因发生如凝胶一般凝固的现象，细胞培养不好。但是，在本发明中，至少使用一般用量的3倍以上的肝素时，确认到无凝固现象且细胞培养良好，并确认到即便使用已知量3～4倍以上的肝素，培养中也无任何问题。另外，一般所使用的血浆失活方法中，在摄氏56度下加热30分钟而去除补体等蛋白等时，细胞培养所需的有效成分一同被去除，但是如本发明所述，使用约3倍以上的肝素并且不使用血浆失活方法时，不会导致培养所需的有效成分的损失，因此能够使用少量的血浆(plasma)。例如，以往使用培养液的10体积％以上，但是本发明确认到即便使用小于10体积％即仅使用3体积％至7体积％，培养也良好。因此，本发明的培养方法中所使用的自体血浆中，每1ml的血浆可以包含40usp unit以上的肝素，优选可以包含50～60usp unit以上。
通过如上所述的方式培养免疫细胞时，在细胞培养步骤培养的免疫细胞数量中，30至80％为NK细胞，能够提高NK细胞的比重，如上所述，当NK细胞的比重提高时，混合培养液中可以包含大量的白介素-8、各种生长因子以及干扰素γ等细胞因子，作为一例，白介素-8的浓度范围可以是100～20000pg/mL，干扰素γ的浓度范围可以是400～400000pg/mL。如上所述，当无血清培养液中含大量白介素-8或干扰素γ时，从无血清培养液仅分离免疫细胞而获得的免疫细胞无血清培养液能够起到对包括烧烫伤以及创伤的伤口治疗、包含过敏引起的皮肤炎的皮肤疾病治疗以及皮肤美容效果非常优异的有效成分的作用。
本发明的化妆材料组合物包含免疫细胞无血清培养液以及化妆材料成分，通过白介素-8以及干扰素γ的作用，对皮肤美白、去除色素沉积、改善皱纹中的一种以上有效。尤其，基于化妆材料组合物的全体重量，免疫细胞无血清培养液可以使用0.1重量％至50重量％，IL-8可以包含1pg/mL～1200pg/mL，干扰素γ可以包含5pg/mL～15000pg/mL左右。通过后述的实验例可以明确，对于过敏性鼻炎、过敏性皮肤炎、异位性皮炎、痤疮、虫子叮咬后产生的炎症等的炎症改善效果良好，尤其具有快速消除瘙痒的效果。通过治疗烧烫伤、创伤等皮肤再生效果和去除色素沉积的效果极其良好，另外确认到对皮肤美白也有效果。
本发明的化妆材料组合物仅在以规定重量包含通过本发明的免疫细胞培养方法获得的免疫细胞培养液方面上有所区别，使用已知的包含乳液、脂质体、盐雾等化妆材料组合物制备方法能够实现沐浴露、润肤乳、精华液、霜等已知制剂，因此对其省略详细说明。
本发明的药学组合物将免疫细胞无血清培养液作为有效成分包含其中，通过白介素-8以及干扰素γ等的作用，对包括烧烫伤以及创伤的伤口或皮肤疾病的治疗有效。本发明的药学组合物能够以非口服的多种剂型给药，形成制剂时，一般使用药学允许的已知的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂以及表面活性剂等稀释剂或赋形剂等来调制。
用于非口服给药的制剂包括灭菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干剂，适用于皮肤的是，例如已知组成的悬浮剂、溶液剂、起泡剂、乳剂(例如：油中水(water/oil，W/O)和水中油(oil/water，O/W)乳剂)、以及胶体制剂等。
尤其，基于药学组合物的全体重量，免疫细胞无血清培养液可以使用10重量％至80重量％，IL-8可以包含100pg/mL～8000pg/mL，干扰素γ可以包含300pg/mL～50000pg/mL左右。
实施例1
如下准备免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒
1、B单元准备步骤
将2.2mg的IL-2和100mL的500mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)溶液放入悬浮细胞培养用基本培养基(若基本培养基中已存在IL-2或L-谷氨酰胺时，通过调节添加量来达到最终浓度)，并溶解，最终制成10L，从而制备基本溶液(B溶液)。利用3.8L的该溶液，分别取36mL盛放在容器中，塞上塞子，粘贴事先准备好的“B溶液(B solution)”标签，准备B单元，并冷藏保管。剩余6.2L用于制备其他单元。
2、C1-1单元准备步骤
将20ug的IL-12和125ug的IL-18溶于蒸馏水，制成10mL，制备了细胞因子溶液(C溶液)。将1mL的C溶液溶于1000mL的基本溶液(B溶液)中，制备了细胞因子1-1溶液(C1-1溶液)。在该C1-1溶液中使用490mL，分别取4.5mL盛放在容器中，塞上塞子，粘贴事先准备好的“C1-1溶液(C1-1solution)”标签，准备C1-1单元，并冷藏保管。剩余110mL用于D单元的制备。
3、C1-2单元准备步骤
将5mL的C溶液溶于1000mL的基本溶液，制备了细胞因子1-2溶液(C1-2溶液)。分别取50mL盛放在容器中，塞上塞子，粘贴事先准备好的“C1-2溶液(C1-2solution)”标签，准备C1-2单元，并冷藏保管。
3、C2单元准备步骤
将20ug的IL-15放入B溶液中，制成1000ml，制备了细胞因子2溶液(C2溶液)。分别取9mL的C2溶液盛放在容器中，塞上塞子，粘贴事先准备好的“C2溶液(C2solution)”标签，制备C2单元，并冷藏保管。
4、A1单元准备步骤
将抗CD16以及抗CD56抗体分别取0.5mg，溶于300mL的B溶液中，制备了抗体1溶液(A1溶液)。取100mL的抗体1溶液，分别在容器中盛放1mL，粘贴事先准备好的“A1溶液(A1solution)”标签，准备A1单元后，冷藏保管。剩余的200mL用于制备A2单元。
5、A2单元准备步骤
混合200mL的A1溶液和3400mL的B溶液，制备了抗体2溶液(A2溶液)。分别取9mL、27mL盛放在容器中，粘贴事先准备好的“A2溶液(A2solution)”标签，准备A2单元后，冷藏保管。此时，A1溶液以及A2溶液具有一个月以内的短暂的有效期，因此还可以如下制备并使用。
独立包装抗CD16(1mg/mL)和抗CD56(1mg/mL)抗体溶液各6uL和3mL的B溶液，在细胞培养时混合使其互溶，从而能够制备A1和A2溶液来使用。
即，首先在3mL的B溶液中溶解独立包装的6uL的抗CD16以及抗CD56抗体来制备A1溶液，取其中1mL装入容器中，粘贴事先准备好的“A1溶液(A1solution)”标签，制备A1单元后，冷藏保管。在大约2mL的剩余溶液中混合34mL的B溶液，制备A2溶液后，将制备A2溶液分别取9mL和27mL单独盛放，粘贴“A2溶液(A2solution)”标签，制备A2单元后，可以冷藏保管使用。此时，它们的有效期可以延长至6个月以上。
6、D单元准备步骤
将500ug的抗CD3抗体放入C1-1溶液，制成105mL，制备抗体-细胞因子混合溶液(D溶液)后，分别取1ml放入容器中，粘贴事先准备的“D溶液(D solution)”标签，准备D单元后，冷藏保管。此时，D溶液具有1个月以内的短暂有效期，因此还可以如下制备来使用。
可以将5uL的抗CD3抗体溶液(1mg/mL)以及1mL的C1-1溶液分别独立包装到各容器中，准备D单元后，使用时将其混合而制备D溶液。即，在使用之前，将5uL的抗CD3抗体溶于1mL的C1-1溶液中，粘贴事先准备好的“D1溶液，第1天(D1solution,day 1)”标签，制备D单元后，可以冷藏保管使用。此时，有效期可以延长至6个月以上。
7、免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒的准备
摆放准备好的B单元、C1-1单元、C1-2单元、C2单元、A1单元、A2单元以及D单元，可以制备免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒。必要时，可以按照使用顺序，以C1-1单元、C2单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序摆放来准备。
实施例2
从患者的血液准备淋巴球以及自体血浆之后，利用从实施例1获得的免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒，如下培养免疫细胞。
1、淋巴球提取以及自体血浆准备步骤
利用人类的淋巴球或单核球等单核细胞比重低于1.077的性质，将治疗对象患者的血液混合到1.077比重的Ficoll-Paque Plus溶液中，以规定的离心力使其离心沉淀，根据比重之差，使比重大于1.077的红细胞和粒细胞层向下分离，1.077以下的单核细胞层和血小板等向上分离，从而获得包含淋巴球的单核细胞层，从分离的单核细胞层仅提取出淋巴球。
更加详细而言，将从患者A采血经过一天的30ml的放入50ml的锥形管(conicaltube)，离心分离后，将上层的自体血浆放入肝素管进行处理后，放入新的50ml的锥形管(conical tube)，再次离心分离后，将上层部的血浆成分准备为自体血浆。
然后，在去除血浆的血液管中放入PBS，将体积调节为30mL后充分混合，并移入准备好的具有Ficoll-Paque Plus的管中，在800xg下离心分离15分钟后，分离第二层即具有淋巴球的血沉棕黄层(Buffy coat layer)，收集在50ml的锥形管(conical tube)，用PBS将体积调整至50ml后进行混合。然后，通过2至3次的离心分离，去除上清液，并分离淋巴球。此时，所获得的淋巴球细胞数量为1.0×107。
2、当天(Day 0)：如下去执行在分离的淋巴球中添加C1-1单元的细胞因子1-1溶液以及C2单元的细胞因子2溶液中的一种以上后添加自体血浆的第1步骤：
对分离的淋巴球细胞处理1瓶(4.5mL)C1-1溶液(C1-1solution)和0.5ml的血清，放入T25烧瓶(Flask)中，在CO2培养箱(Incubator)中进行培养。
3、第1天(Day 1)：如下去执行在执行第1步骤的培养基中添加A1单元的抗体1溶液的第2步骤：
在培养中的T25烧瓶中追加1瓶(1mL)A1溶液(A1solution)，轻轻振荡后放入培养基，继续进行培养。
4、第2天(Day 2)：如下去执行在执行第2步骤的培养基中添加D单元的抗体-细胞因子混合溶液的第3步骤：
在培养中的T25烧瓶中追加1瓶(1mL)D溶液(D solution)，轻轻振荡后放入培养基，继续进行培养。
5、第3天(Day 3)：如下去执行在执行第3步骤的培养基中添加C1-1单元的细胞因子1-1溶液后添加自体血浆的第4步骤：
在培养中的T25烧瓶中追加1瓶(4.5mL)C1-1溶液(C1-1solution)，并添加0.5mL的自体血浆后，稍微用力振荡后，在培养基中继续培养。
6、第4天(Day 4)：如下去执行在执行第4步骤的培养基中添加A2单元的抗体2溶液后添加自体血浆或FBS的第5步骤：
用刮刀(scraper)充分刮削培养中的T25烧瓶底部，并将通过刮削收集而成的所有细胞移至T75烧瓶。在其中追加1瓶(9mL)A2溶液(A2s olution)和1mL自体血浆或FBS(或与其类似之物)，轻轻振荡后放入培养基，继续进行培养。
7、第5天(Day 5)：如下去执行在执行第5步骤的培养基中添加C2单元的细胞因子2溶液后添加自体血浆或FBS的第6步骤：
在培养中的T75烧瓶中添加1瓶(9mL)C2溶液(C2solution)和1mL自体血浆或FBS(或与其类似之物)，轻轻振荡后放入培养基，继续进行培养。
8、第6天(Day 6)：如下去执行在执行第6步骤的培养基中添加A2单元的抗体2溶液以及自体血浆或FBS的第7步骤：
用刮刀(scraper)充分刮削培养中的T25烧瓶底部，并将通过刮削收集而成的所有细胞移至T150烧瓶。在其中追加1瓶(27mL)A2溶液(A2solution)和3mL自体血浆或FBS(或与其类似之物)，轻轻振荡后放入培养基，继续进行培养。
9、第7天(Day 7)：如下去执行在执行第7步骤的培养基中添加B单元的基本溶液及自体血浆或所述基本溶液及FBS的第8步骤：
在培养中的T150烧瓶中添加1瓶(36mL)B溶液(B solution)和4mL自体血浆或FBS(或与其类似之物)，轻轻振荡后放入培养基，继续进行培养。
10、第8天～第14天(Day 8～Day 14)：如下执行在执行第8步骤的培养基中添加自体血浆或FBS后放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器进行培养的第9步骤(大量培养后收获细胞步骤)：
-第8天(Day 8)：可以在该步骤用刮刀(scraper)充分刮削培养中的T25烧瓶底部收集而收获细胞，但是在本研究中确认细胞后，直接添加该细胞和培养液中剩余的全部自体血浆或10ml的FBS(或与其类似之物)，制备细胞悬浮液后，用夹子夹住含有细胞培养基的1L CO2透过性培养袋的1/3后，添加细胞悬浮液，进行揉捏，以便与细胞培养基充分混合，然后放入37℃、5％CO2培养箱中均匀展开，进行培养。
-第9天(Day 9)：对培养袋(bag)充分揉捏使得培养中的细胞生长良好，然后在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
-第10天(Day 10)：将夹住1/3培养袋的夹子解开至2/3，并充分揉捏后，在37℃、5％CO2培养箱中，继续进行培养。
-第11天(Day 11)：全部拿掉夹住2/3培养袋的夹子，并充分揉捏后，在37℃、5％CO2培养箱中，继续进行培养。
-第14天(Day 14)：将结束培养的最终培养液装入离心分离管，通过多次分离收获细胞。用生理盐水袋包装收获的细胞，可以冷藏保管或冷冻保管。
实施例3
同样地执行在实施例2执行的第1步骤至第7步骤后，进一步执行以下步骤。
1、第7天(Day 7)：如下执行将执行第7步骤的培养基分离成细胞和血清培养液的第10步骤：
为了将培养中的T150烧瓶的培养液分离成免疫细胞和血清培养液，进行离心分离。
2、第7天(Day 7)：如下执行对在第10步骤中分离出的细胞进行洗涤的第11步骤：
用PBS对经过离心分离的免疫细胞洗涤3次以上。
3、第7天(Day 7)：如下执行将在第11步骤中洗涤后的细胞放入新的培养容器后添加B单元的基本溶液进行培养的第12步骤：
将经过洗涤的免疫细胞放入T150烧瓶中，在其中添加100ml B溶液(Bsolution)后，在CO2培养箱(Incubator)中进行培养。
4、第8天～第11天(Day 8～Day 11)：如下执行将执行第12步骤的培养基放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器并添加C1-2单元的细胞因子1-2溶液进行培养的第13步骤：
-第8天(Day 8)：用夹子夹住含有细胞培养基的1L培养袋的一半后，将T150烧瓶的包含培养中的细胞的培养液放入该袋(bag)中，放入50mL C1-2单元的细胞因子1-2溶液，并放入37℃、5％CO2培养箱(incubator)中进行培养。
-第9天(Day 9)：充分揉捏使得培养中的细胞生长良好，然后在37℃、5％CO2培养箱中继续进行培养。
-第10天(Day 10)：从通过夹子夹住一半的1L CO2透过袋(bag)中去除夹子，并继续进行培养。
5、第11天～第14天(Day 11～Day 14)：如下执行将执行第13步骤的培养基分离成细胞和无血清一级培养液的第14步骤以及在第14步骤中分离出的细胞添加B单元的基本溶液并放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器后添加C1-2单元的细胞因子1-2溶液并进行培养的第15步骤：
第11天(Day 11)：将包含细胞的一级培养液，通过离心分离(400xg)，分离成免疫细胞和无血清一级培养液，收集无血清一级培养液，并冷藏保管。
二级细胞培养：将从一级培养液收获的免疫细胞放入100ml B溶液(Bsolution)。用夹子夹住含有细胞培养基的1L培养袋(bag)的一半后，将包含细胞的培养液放入该袋(bag)中，放入50mL C1-2单元的细胞因子1-2溶液，放入37℃、5％CO2培养箱(incubator)中进行培养。
-第12天(Day 12)：充分揉捏使得培养中的细胞生长良好，然后在37℃、5％CO2培养箱中继续进行培养。
-第13天(Day 13)：从通过夹子夹住一半的1L CO2透过袋(bag)中去除夹子，并继续进行培养。
-第14天(Day 14)：充分揉捏使得培养中的细胞生长良好，然后在37℃、5％CO2培养箱中继续进行培养。
6、第15天～第18天(Day 15～Day 18)：收获二级细胞后收集三级培养液以及无血清免疫细胞培养液
-第15天(Day 15)：将包含执行第15步骤的细胞的二级培养液，通过离心分离(400xg)，分离成免疫细胞和培养液。分离出的培养液是免疫细胞无血清培养液，对其进行冷藏保管。
三级细胞培养：将从二级培养液收获的免疫细胞放入100ml B溶液(Bsolution)。用夹子夹住含有细胞培养基的1L培养袋(bag)的一半后，将包含细胞的培养液放入该袋(bag)中，放入50mL C1-2单元的细胞因子1-2溶液，放入37℃、5％CO2培养箱(incubator)中进行培养。
-第16天(Day 16)：充分揉捏使得培养中的细胞生长良好，然后在37℃、5％CO2培养箱中继续进行培养。
-第17天(Day 17)：从通过夹子夹住一半的1L CO2透过袋(bag)中去除夹子，并继续进行培养。
-第18天(Day 18)：充分揉捏使得培养中的细胞生长良好，然后在37℃、5％CO2培养箱中继续进行培养。
7、根据细胞状态，进一步重复1～2次以上6中记载的过程，从而在一个批次中能够获得总计4升以上的无血清培养液。
实施例4
同样地执行在实施例2执行的第1步骤至第8步骤后，进一步执行以下步骤。
1、第8天～第10天(Day 8～Day 10)：如下执行在执行第8步骤的培养基中添加自体血浆或FBS后放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器进行培养的第9步骤(大量培养后收获细胞步骤)：
-第8天(Day 8)：在培养基中放入剩余的全部自体血浆或10ml FBS(或与其类似之物)。用夹子夹住含有细胞培养基的1L CO2透过性培养袋的一半后，将包含细胞的培养中的细胞放入袋(bag)中，然后放入37℃、5％CO2培养箱(incubator)中，进行培养。
-第9天(Day 9)：对培养袋(bag)充分揉捏使得培养中的细胞生长良好，然后在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
-第10天(Day 10)：解开夹住一半培养袋的夹子，充分揉捏后，在37℃、5％CO2培养箱(incubator)中，继续进行培养。
2、从第11天(Day 11)起，同样地执行在实施例3执行的第10步骤至第15步骤，获得血清培养液、一级无血清培养液至四级无血清培养液。
比较例
除不执行实施例2中第1步骤以外，执行与实施例2相同的方法，获得比较例培养液。
实验例1
在通过实施例2获得的培养液和通过比较例获得的比较例培养液中，分析总细胞数量和NK细胞比率，并在表1中示出其结果。
[表1]
| 区分 | 初始细胞数量 | 培养2周后总细胞数量 | 培养2周后NK细胞比率 |
| 比较例 | 1.0×10<sup>7</sup> | 195×10<sup>7</sup> | 40.2 |
| 实施例2 | 1.0×10<sup>7</sup> | 250×10<sup>7</sup> | 60.5 |
从表1可知，对于诸如从患者采血后经过1天的血液中分离的淋巴球的衰弱的免疫细胞而言，如本发明所述，利用细胞因子激活衰弱的淋巴球使其恢复后，用抗CD16、抗CD56刺激，能够使增殖的细胞数量增加，甚至能够使NK细胞比率也增加。
实验例2
分析了在实施例3获得的血清培养液、一级无血清培养液、二级无血清培养液、三级无血清培养液、四级无血清培养液中培养的总细胞数量与白介素-8以及干扰素γ的含量以及NK细胞比率，并在表2中示出其结果。
从表2可知，即便培养至四级，也能够获得性能符合总细胞数和白介素-8以及干扰素γ的含量以及NK细胞比率方面的培养液。
[表2]
实施例3
分析在实施例4获得的血清培养液、一级无血清培养液、二级无血清培养液、三级无血清培养液、四级无血清培养液中培养的总细胞数量与白介素-8和干扰素γ的含量以及NK细胞比率，并在表3中示出其结果。
通过上述的表2以及下面的表3可知，当获得培养期间比实施例3晚7天并且直到四级无血清培养液时，总细胞数量或NK细胞比率并无区别，也许是因为所培养的免疫细胞的活性减少，白介素-8以及干扰素γ的含量降低至大约一半水平，但是可以明确，与通过现有方法获得的培养液相比，根据本发明，能够获得无血清且细胞因子的含量也合适的免疫细胞无血清培养液。
[表3]
通过以上的实验结果可以确认，作为免疫细胞二级代谢产物的多个细胞因子的含量在更换培养基后大约在第2天急剧增加，大约在第3天达到最高值。因此，本发明中，以3～4天的间隔更换培养基时，可以从二级培养液获得细胞因子含量丰富的免疫细胞培养液。本发明的免疫细胞培养液包含大量的细胞因子(Cytokine)，皮肤美白、消除色素沉积、皮肤再生效果卓越，因此，作为治疗剂或美容材料，可成为有竞争力的材料。
实施例5
制备了包含5重量％的在实施例3获得的免疫细胞无血清培养液、组分如下面的表4所述的化妆材料组合物。
[表4]
实验例4
为了确认在实施例5获得的化妆材料组合物的炎症改善效果以及色素沉积改善效果，在两人的痤疮部位，早晚洁面后分别涂抹2次化妆材料组合物，并且分别在图1以及图2中示出表示经过7天以及16天后的照片。
从图1以及图2可以确认，起初痤疮极为严重，但是随着时间流逝，痤疮大大改善，沉积的色素也消除许多。
实验例5
为了确认在实施例5获得的化妆材料组合物的炎症改善以及色素沉积消除效果，在虫子叮咬的红斑点部位，早晚分别涂抹2次化妆材料组合物，并且在图3中示出表示其经过的照片。
如图3所示，确认到2天内炎症迅速消除，瘙痒也消失，红斑点也消失。
实验例6
为了确认在实验例5获得的化妆材料组合物的炎症改善以及色素沉积消除效果，在发生过敏的部位，早晚分别涂抹2次化妆材料组合物，并且在图4中示出表示其经过的照片。
如图4所示，脓在涂抹后1天内消失，虽未图示，但是直到色素消失大约需要1周左右。
实验例7
为了确认在实验例5获得的化妆材料组合物的炎症改善以及色素沉积消除效果，在间隔时间发生多种过敏的大面积部位，早晚分别涂抹2次化妆材料组合物，并且在图5中示出表示其经过的照片。
如图5所示，直到炎症和色素消失大约需要1周左右。
实施例6
制备了包含20重量％在实施例3获得的免疫细胞无血清培养液，组分中，实施例3的表4中的免疫细胞无血清培养液为20重量％，其余相同。
实验例8
为了确认在实验例6获得的药学组合物的皮肤再生效果，在烧烫伤的部位，早晚分别涂抹2次药学组合物，并且在图6中示出表示其经过的照片。
具体而言，对经过进行说明，图6所示的斜线状态的伤口是第一次于2016年6月末手臂被烤面包机烫伤后的情形，而垂直方向伤口是8月31日再一次被烫伤的情形。如上所述，在烫伤部位，早晚分别涂抹2次药学组合物并观察16天的经过可以确认，受损表皮恢复，沉积的色素消失，并且可以确认，烫伤后立刻涂抹药学组合物时，其治疗效果更佳。
本发明以如上所述的优选实施例为例图示并说明，但是并非限定于上述实施例，在不超出本发明的精神的范围内，本发明所属技术领域中的普通技术人员可以进行多种变更和修改。
Claims (19)
1.一种免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒，包含：
B单元，由包含IL-2、L-谷氨酰胺以及细胞培养用培养基的基本溶液构成；
C1-1单元，由细胞因子1-1溶液构成，所述细胞因子1-1溶液，是通过将所述IL-12和IL-18溶解到所述基本溶液中，以0.5～5ng/mL的浓度包含IL-12，以2～50ng/mL的浓度包含IL-18来形成的；
C1-2单元，由细胞因子1-2溶液构成，所述细胞因子1-2溶液，是通过将所述IL-12和IL-18溶解到所述基本溶液中，以5.1～15ng/mL的浓度包含IL-12，以30～120ng/mL的浓度包含IL-18来形成的；
C2单元，由细胞因子2溶液构成，所述细胞因子2溶液，是通过将IL-15溶解到所述基本溶液中，以10～50ng/mL的浓度包含所述IL-15来形成的；
A1单元，由抗体1溶液构成，所述抗体1溶液，是以将抗CD16和抗CD56溶解到所述基本溶液中，分别以0.1～15ug/mL的浓度包含所述抗CD16和所述抗CD56来形成的；
A2单元，由抗体2溶液构成，所述抗体2溶液以1：6～10的体积比包含所述抗体1溶液和所述基本溶液；以及
D单元，由抗体-细胞因子混合溶液构成，所述抗体-细胞因子混合溶液，是通过将抗CD3溶解到所述细胞因子1溶液中，以1～12ug/mL的浓度包含所述抗CD3来形成的。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒，其特征在于，
所述A1单元比所述D单元先添加到淋巴球培养基中。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒，其特征在于，
所述A1单元中包含的所述抗CD16、抗CD56以及所述基本溶液分开包装，在培养基添加步骤中混合，从而形成所述抗体1溶液。
4.根据权利要求1所述的免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒，其特征在于，
所述A2单元中包含的所述抗体1溶液的抗CD16、抗CD56以及所述基本溶液与所述基本溶液分别分开包装，在培养基添加步骤中混合，从而形成所述抗体2溶液。
5.根据权利要求1所述的免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒，其特征在于，
所述D单元中包含的抗CD3和所述细胞因子1溶液分别分开包装，在培养基添加步骤中混合，从而形成所述抗体-细胞因子混合溶液。
6.根据权利要求1所述的免疫细胞无血清培养用培养基添加试剂盒，其特征在于，
按照C1-1单元、C2单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序，或
C2单元、C1-1单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序，或
C1-1单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序，或
C2单元、A1单元、D单元、C1-1单元、A2单元、C2单元、A2单元、B单元以及C1-2单元的顺序，
依次将各单元添加到淋巴球培养基中使用。
7.一种免疫细胞培养方法，包括：
第1步骤，在分离出的淋巴球中添加C1-1单元的细胞因子1-1溶液以及C2单元的细胞因子2溶液中的一种以上后，添加自体血浆；
第2步骤，在执行了所述第1步骤的培养基中添加A1单元的抗体1溶液；
第3步骤，在执行了所述第2步骤的培养基中添加D单元的抗体-细胞因子混合溶液；
第4步骤，在执行了所述第3步骤的培养基中添加C1-1单元的细胞因子1-1溶液后，添加自体血浆；
第5步骤，在执行了所述第4步骤的培养基中添加A2单元的抗体2溶液后，添加自体血浆或FBS；
第6步骤，在执行了所述第5步骤的培养基中添加C2单元的细胞因子2溶液后，添加自体血浆或FBS；以及
第7步骤，在执行了所述第6步骤的培养基中添加A2单元的抗体2溶液以及自体血浆或FBS。
8.根据权利要求7所述的免疫细胞培养方法，其特征在于，还包括：
第8步骤，在执行了所述第7步骤的培养基中添加B单元的基本溶液以及自体血浆或FBS进行培养；以及
第9步骤，在执行了所述第8步骤的培养基中添加自体血浆或FBS后，放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器中进行培养。
9.根据权利要求7或8所述的免疫细胞培养方法，其特征在于，
所述分离出的淋巴球，是从采血后经过1天以上的血液中分离出来的。
10.根据权利要求7或8所述的免疫细胞培养方法，其特征在于，还包括：
第10步骤，将执行了所述第7步骤或第9步骤的培养基分离成细胞和血清培养液；
第11步骤，对在所述第10步骤中分离出的细胞进行洗涤；
第12步骤，将在所述第11步骤中洗涤后的细胞放入新的培养容器中，添加B单元的基本溶液进行培养；以及
第13步骤，将执行了所述第12步骤的培养基放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器中，并添加C1-2单元的细胞因子1-2溶液进行培养。
11.根据权利要求10所述的免疫细胞培养方法，其特征在于，还包括：
第14步骤，将执行了所述第13步骤的培养基分离成细胞和无血清一级培养液；以及
第15步骤，将在所述第14步骤中分离出的细胞添加到B单元的基本溶液中，并放入含有细胞培养基的大容量细胞培养容器中，并添加C1-2单元的细胞因子1-2溶液进行培养。
12.根据权利要求7或8所述的免疫细胞培养方法，其特征在于，
所述自体血浆中，每1ml血浆包含40usp unit以上的肝素。
13.根据权利要求7或8所述的免疫细胞培养方法，其特征在于，
添加的所述自体血浆或FBS的含量小于全体培养基的10体积％。
14.一种免疫细胞培养液，其通过权利要求7或8所述的培养方法培养。
15.一种免疫细胞无血清培养液，其从通过权利要求1至6中任一项所述的培养基添加试剂盒培养的免疫细胞培养液或通过权利要求10所述的培养方法培养的免疫细胞培养液获得。
16.一种化妆材料组合物，包含：
权利要求15所述的免疫细胞无血清培养液；以及
化妆材料基底。
17.根据权利要求16所述的化妆材料组合物，其特征在于，
所述免疫细胞无血清培养液作为有效成分，作用于改善炎症、皮肤美白、消除色素沉积、皮肤再生中的一种以上。
18.根据权利要求16所述的化妆材料组合物，其特征在于，
所述免疫细胞无血清培养液占全体组合物重量的50重量％以下。
19.一种用于治疗包括烧烫伤及创伤的伤口或皮肤疾病的药学组合物，包含权利要求15所述的免疫细胞无血清培养液。
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