KR102623065B1 - 자연 살해 세포의 생체 내 프라이밍 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 세포 용해를 이루기 위한 자연 살해 세포의 생체 내 프라이밍 및 활성화에 의한 암 치료 방법에 관한 것이다. 본 방법은 제1 종양 세포주로부터 유래된 프라이밍 종양 세포 제제(PTCP)를 환자 내로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 제제는 제1 종양 세포 또는 그의 막 제제를 불활성화하기 위하여 방사선조사되고, 상기 제1 종양 세포는 그의 막 표면 상에 공지의 프라이밍 리간드를 갖는다. 환자의 휴지기 NK 세포는 생체 내에서 PTCP와 접촉되어, 프라이밍된 NK 세포가 야기되며, 이것은 CD69의 상향조절, CD16의 제거, 또는 CD69+와 CD16-의 조합을 특징으로 한다. 이들 프라이밍된 NK 세포는 그 후 제2 종양 세포, 암과 접촉하며, 제2 종양 세포를 용해 및 살해하도록 구성된다.

Description

자연 살해 세포의 생체 내 프라이밍
본 발명은 암 치료 방법; 및 보다 구체적으로, 암 및 다른 질병의 치료를 위한 자연 살해 세포의 생체 내 프라이밍(priming) 방법에 관한 것이다.
자연 살해(NK) 세포는 항원의 자극 없이 소정의 종양 세포 및 바이러스-감염된 세포에 결합하고, 퍼포린을 함유한 과립의 삽입에 의해 그들을 살해할 수 있는 림프구이다.
NK 세포는 첫째로, 암을 인식할 수 없으며, 둘째로, 살해를 위한 암에의 관여가 불가능하기 때문에, 신체에서 많은 암이 발생하고 증식한다. 첫번째는 면역 감시의 실패이다. 후자는 종양이 NK 세포 살해를 회피하도록 하는 종양에서의 변화로 인한 것이다.
2012년 9월 4일자로 허여된 미국 특허 제8,257,970호는 시험관 내에서 종양 세포 제제에 의해 자연 살해 세포를 활성화하는 방법을 개시하며; 그 내용은 참고로 본원에 포함된다. '970 특허의 실시 형태가 유망해 보이지만, 특히 특이한 케이스의 환자 및 질병에의 광범위한 응용 및 확장성과 같은, 상업적 플랫폼에서의 그 기술의 적용과 관련된 많은 문제가 있다.
사실상, 암을 치료하기 위한 효과적인 방법을 찾는 문제는 오랫동안 절실했지만 대부분 해결되지 않고 있다. 이러한 이유로, 미국 정부는 "캔서 문샷(Cancer Moonshot)"이라는 새로 만들어진 프로그램에 착수하였으며; 이것은 본질적으로는 치유에의 진행 속도를 배가시키거나, 5년내에 10년에 상응하는 발전을 이루는 것을 목표로 한다.
암 및 다른 질병을 치료하는 목적을 위하여 면역 반응을 자극하기 위한 새로운 방법이 계속 필요하다.
많은 암의 문제는 암 세포가 막 표면상의 소정의 신호를 하향조절하여, 면역 감시와 NK 세포 살해를 효과적으로 회피한다는 것이다. 따라서, 암은 NK 세포 살해를 회피하고 병에 걸린 환자에서 증식할 수 있다.
인간 및 동물 환자에서 다양한 암을 치료하는 방법이 개시된다. 본 명세서에서는 환자 자신의 NK 세포가 종양 세포에서 보통 하향조절되는 신호에 노출되도록 생체 내에서 환자 자신의 NK 세포를 "프라이밍"하여, 프라이밍 후에 종양 세포와 접촉할 경우, NK 세포가 종양 세포 표면에서 하향조절되지 않고 남아 있는 신호와의 접촉에 의해 활성화되어서 종양 세포 용해를 촉진할 수 있도록 하는 전략과 방법이 개시된다. 요약하면, 본 방법은 생체 내에서 자연 살해(NK) 세포의 "프라이밍"을 달성하며, 여기서 휴지기 NK(rNK) 세포는 프라이밍 종양 세포 제제(PTCP)와 접촉시에 프라이밍된 NK(pNK) 세포가 된다. 프라이밍된 NK 세포는 종양 세포 및 남아 있는 신호와 접촉시에 활성화 및 종양 세포 용해를 완료할 수 있다.
프라이밍 종양 세포 제제는 휴지기 NK 세포에 첫번째 신호를 효과적으로 제공하는 세포, 단백질 및/또는 리간드의 생물학적 제제이다. 첫번째 신호는 각각의 암 변이체에 특이적이지 않으며, 따라서 PTCP에의 노출에 의해 NK 세포를 먼저 "프라이밍"할 경우, NK 세포는 그 후 다수의 암 세포 변이체를 찾아내고 이의 용해를 일으킬 수 있다. 따라서, 제안된 방법은 많은 암 유형을 치료하기 위한 전략을 제공하며 단일 변이체에 한정되지 않는다.
추가적으로, 본 명세서에 개시된 방법은 자가유래성이 아니므로, 큰 상업적 규모에 대응 가능하다. 본 발명에 따라, 하나의 PTCP가 확장되어 생산될 수 있으며, 이것은 그 후 상이한 암 변이체 및 다른 감염성 질병을 가진 많은 환자를 치료하기 위하여 이용될 수 있다.
다른 장점은 본 명세서와 도면을 완전히 검토하면 당업자에게 자명해질 것이다.
도 1은 예시된 실시 형태에 따른 NK 세포의 생체 내 프라이밍 방법을 보여준다.
도 2a는 신호 1을 발현하며 NK 세포를 프라이밍할 수 있는 종양 세포주인 CTV1 세포의 첨가만이 인간 PBMC 배양물에서 NK 저항성 세포주인 RAJI 세포의 성장을 감소시킬 수 있음을 보여준다.
도 2b는 인간 PBMC 집단에 첨가되었을 때의 NK 저항성 종양주인 RAJI 세포의 성장이, CTV1 세포가 배양물에 첨가된 경우, 유의하게 감소됨을 보여준다.
도 3은 혼합된 배양물에서 RAJI 세포의 성장의 감소는 CTV1에 의해 프라이밍된 NK 세포에 의한 RAJI의 특이적 용해에 관련됨을 보여준다.
자연 살해(NK) 세포를 이용한 종양 살해는 프라이밍과 트리거링(triggering)을 포함하는 2-단계 과정이며; 즉, NK 세포는 종양 세포의 살해를 야기하기 위하여 프라이밍되고 트리거링되어야 한다. 프라이밍과 트리거링은 각각 NK 세포와 종양 세포 상의 수용체와 리간드의 상이한 세트에 의해 제어된다. 대다수의 자연 발생 인간 암은 그들의 세포 표면 상에 프라이밍 리간드가 결핍되므로 NK 살해에 대해 저항성이다. 즉, 트리거링 리간드는 종양 세포 표면 상에 남아 있으나, NK 세포는 프라이밍되지 않으므로(즉, 종양 세포 표면 상에 프라이밍 리간드가 없음) 종양 세포 살해를 야기하지 않는다. 종양 세포 표면 상에서의 프라이밍 리간드(이하에서는 "신호 1")의 결핍으로 인하여, 적어도 대부분의 인간 암과 관련하여, NK 세포는 환자에서 암 성장의 제어에 참여하지 않으며 참여할 수 없다. 본 명세서에서는 NK 세포를 인위적으로 "프라이밍"시켜서, 프라이밍된 NK 세포가 종양 세포의 표면 상에 존재하는 트리거링 신호(이하에서는 "신호 2")와 접촉할 때 그들이 종양 세포를 살해(용해 또는 어팝토시스)할 수 있도록 하는 전략이 개시된다. 본 명세서에 개시된 기술은 예방 및 치료 측면의 인간 암의 제어에서 인간 NK 세포가 하는 역할을 증가시킬 것이다.
암의 제어에서 NK 세포의 역할은 NK 세포를 프라이밍하기 위하여 사이토카인을 이용하여 처음 개시되었다. 1980년대에 인터루킨-2(IL-2) 및 NK-세포 활성화에서의 이의 역할의 발견은 종양 면역요법에서 림포킨-활성화된 킬러(LAK) 세포의 이용에 대한 상당한 관심을 유발하였다. 하지만, 이들 시험의 결과는 대부분 실망스러웠다. 환자에게 IL-2와 함께 자가 LAK 세포를 투여한 효과를 조사하는 연구에서는, 20% 미만의 환자가 반응하였다(문헌[Rosenburg et al.]). 후속 연구는 IL-2가 생체 내에서 순환 NK 세포의 수를 상당히 확대시키지만, 세포가 최대 세포독성이 아님을 보여주었다(문헌[Miller et al.]).
보다 최근에는, 프라이밍 리간드를 보유하지만 트리거링 리간드는 결핍된 신중하게 선별된 종양 세포를 이용하는 무 사이토카인(cytokine free) 프라이밍 기술이 개발되었다(문헌[North et al.]). 휴지기 NK 세포(rNK 세포는 CD69-임)가 프라이밍 종양 세포(PTC), 예를 들어, CTV-1 세포와 함께 놓여질 경우, NK 세포는 활성화된 표현형(pNK 세포는 CD69+임)에 의해 그리고 CD16의 제거(shedding)에 의해 정의된 대로 프라이밍된다. pNK 세포는 그들의 세포 표면 상에 트리거링 리간드를 가진 종양 세포를 살해할 것이다. 이것은 사실로 생각되며, 일부 경우에는 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 유방암, 난소암, 폐암, 신장암, 전립선암 및 다른 GI 및 GYN 암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 인간 종양 유형에서 확인된다. 즉, 많은 대다수의 환자에서, 그들의 종양은 그들의 세포 표면상의 프라이밍 리간드를 제거함으로써 NK 세포 살해를 회피하지만, 그들은 그들의 세포 표면 상에 트리거 리간드를 보유하므로 프라이밍된 NK 세포에 의한 살해에 여전히 민감하다.
종양은 NK 세포 살해에 저항성이거나(NK 저항성), NK 세포에 의해 살해된다(NK 민감성). 대부분의 종양과 종양 세포주는 NK 저항성이다. 대부분의 NK 저항성 종양 및 세포주는 그들의 세포 표면 상에 프라이밍 리간드를 갖고 있지 않지만 트리거링 리간드를 발현하지 않는다. 이것은 NK 세포가 종양 세포를 살해하기 위하여 필요한 두 신호 중 하나를 NK 세포가 수신하지 못함을 의미한다. NK 저항성 종양은 여전히 그들의 세포 표면 상에 트리거링 리간드를 가지고 있으므로, 프라이밍 신호를 제공하는 IL-2에 의해 프라이밍된 NK 세포에 대한 이들 NK-저항성 세포주의 민감성에 의해 입증된 대로, 프라이밍 신호를 수신한 NK 세포에 의해 NK 저항성 종양은 살해될 것이다. IL-2는 전신성 NK 세포 프라이밍을 유도하기 위해 필요한 고용량이, 심각한 부작용, 그리고 종종 치명적인 부작용을 야기하기 때문에 임상적으로 사용하기는 어려운 것으로 입증된 매우 강력한 사이토카인이다. 따라서, rNK 세포를 유독한 수준의 사이토카인의 투여없이 종양 세포와 상호작용하고 이를 살해할 수 있는 pNK 세포로 전환하기 위하여 생체 내에서 프라이밍 신호를 인위적으로 제공하는 것이 발견되었으며 이는 사실상 본 명세서에 개시된 전략이다.
치료법의 일부로서 프라이밍 신호(신호 1)를 수신한 휴지기 NK 세포는 종양 프라이밍된 NK 세포(TpNK)로 불린다. TpNK 민감성 종양은 혈액 종양 및 고형 종양의 대부분이다. 하지만, TpNK 저항성 암도 있으며; 예를 들어, 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. TpNK 저항성 종양은 이러한 생체 내 프라이밍 치료 전략에 의한 치료에 적합하지 않을 것이다.
그들의 세포 표면 상에 프라이밍 리간드(신호 1)를 보유하지만 트리거링 신호(신호 2)가 결핍된 희귀 암 및 암 세포주는 본 명세서에서 "NK 프라이밍 종양 세포(PTC)"로 불린다. PTC는 그들의 세포 표면으로부터 트리거링 리간드(S2)를 하향조절함으로써 NK 세포 살해를 회피한다. PTC는 그들의 세포 표면상의 프라이밍 리간드(신호 1)를 제거함으로써 NK 세포 살해를 회피하는 대부분의 암과는 반대이다. PTC는 그들의 세포 표면 상에 발현된 적어도 세 가지 프라이밍 리간드의 일부 조합을 가진, 작지만 식별가능한 종양 세포 하위세트이다. 세 가지 프라이밍 리간드는 예를 들어 그러나 제한없이 (i) ICAM-1 및 ICAM-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 리간드; (ii) CD15, CD48, CD58, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 리간드; 및 (iii) MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, PVR, Rae-1 및 H-60으로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 리간드를 포함할 수 있다.
급성 림프모구성 백혈병을 가진 환자로부터 유래된 세포주(DSMZ 번호 ACC 40, www.dsmz.de)인 CTV-1 세포는 그들의 표면 상에 발현된 NK 수용체 CD2, LFA-1, NKp46, 2B4 및 DNAM-1의 라이게이션을 야기하는 프라이밍 리간드를 발현한다. 그들의 세포 표면 상에 NKp46, 2B4 및 DNAM의 리간드를 발현하는 종양 세포는 휴지기 인간 NK 세포를 프라이밍하기 위해 이용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. CD2, LFA-1, NKp46, 2B4 및 DNAM 리간드의 다른 조합이 인간 NK 세포를 프라이밍하기 위해 사용될 수 있는 것도 추가로 고려된다.
휴지기 NK 세포의 프라이밍은 시험관 내 및/또는 생체 내에서 발생할 수 있다. 시험관 내 프라이밍은 효과적이지만 실행이 복잡하고, 비용이 많이 들며 암 치료법으로서 제한적이다. 본 명세서에서는, NK 세포의 생체 내 프라이밍이 개시되며, 여기서는 환자의 휴지기 NK 세포가 순환계를 떠나지 않고 프라이밍된다.
그들의 세포 표면으로부터 트리거링 리간드(신호 2)를 하향조절한 일부 암은 TpNK에 저항성일 것이다. TpNK가 TpNK 저항성 종양(TRT)과 접촉하면, 프라이밍 신호(신호 1)만이 제공되며, 트리거링 신호(신호 2)없이 TpNK 세포는 트리거링되지 않으며 종양은 살해(용해)되지 않는다. TRT는 상이한 치료 전략을 요구할 것이다.
NK 세포의 생체 내 프라이밍을 위한 PTCP
프라이밍 종양 세포 제제(PTCP)는 환자에게 도입되며, 여기서 PTCP는 생체 내에서 NK 세포를 휴지기 상태인 rNK 세포(CD69-)로부터 프라이밍된 상태의 pNK 세포로 변화시키도록 구성된다. 프라이밍된 NK(pNK) 세포는 일반적으로 CD69+, CD16-, 또는 CD69+와 CD16-의 조합으로 특징지어진다. PTCP는 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 척추강내 주입에 의해 또는 비내로, 기관지를 통해 또는 결막 점적으로서 전달될 수 있다. PTCP는 세포 또는 용해물, 용해물의 일부, 엑소좀 또는 미세소포를 비롯한 그 일부일 수 있다. 세포 또는 그 일부는 NK 세포 수용체 CD2, LFA-1, NKp46, 2B4 및 DNAM의 라이게이션을 야기할 수 있는 프라이밍 리간드 중 적어도 세 가지를 함유하는 세포주로부터 유래할 수 있다. 세포 또는 그 일부는 살아있거나, 방사선조사되거나, 동결되거나, 동결건조되거나, 고정되거나, 화학적으로 변형되거나 유전적으로 변형되거나, 또는 다르게 제공될 수 있다. 일 실시 형태는 상기에 개시된 프라이밍 리간드 중 세 가지 이상을 가진 방사선조사된 종양 세포주의 직접 주사를 포함한다. 다른 실시 형태는 rNK 세포를 pNK 세포로 전환하기 위한 종양 세포 용해물 또는 그 일부의 주사이다. PTCP는 rNK 세포에 프라이밍 리간드를 제시하고 그들을 pNK 세포로 전환시킬 항체(단클론, 이중 및 삼중특이성 항체 및 미니바디), 단백질, 앱타머, 소분자 또는 조합을 비롯한 인공 산물일 수 있다. 일 실시 형태는 프라이밍 리간드의 표적에 결합하는 두 개의 2특이적 항체의 주사이다. 다른 실시 형태는 프라이밍 리간드의 표적에 결합하는 삼중특이성 항체를 주사하는 것이다. PTCP는 세포와 인공 산물의 조합 산물일 수 있다. 예를 들어, 인공 구체는 PTCP를 생산하기 위하여 종양 세포주의 용해물로 코팅될 수 있다. PTCP는 인공산물의 조합일 수 있다. 일 실시 형태에서, 지질, 금속, 중합체 또는 조합의 나노구체가 프라이밍 리간드의 표적에 결합하는 항체로 코팅된다. 다른 실시 형태에서, 지질, 실란, 중합체 또는 조합의 나노구체가 프라이밍 리간드의 표적에 결합하는 합성 프라이밍 리간드, 앱타머 또는 단백질로 코팅된다.
프라이밍 종양 세포 제제(PTCP)는 단일 요법, 연속 요법 또는 단일 및 연속 치료의 조합으로서 주어질 수 있다. PTCP는 하루 한번, 또는 매일 주어질 수 있다. PTCP는 한번 또는 여러번 이용될 수 있다. PTCP는 다른 약물, 방사선 및 외과적 치료법과의 병용 요법의 일부로서 주어질 수 있다.
일부 실시 형태에서, PTCP가 전세포일 경우, 특히, 징크 핑거, CRISPR 또는 TALEN을 비롯한 유전자 편집 DNA 뉴클레아제 기반 기술, rAAV 또는 다른 바이러스 벡터를 이용한 바이러스 벡터 기반 유전자 편집 및 다른 유전적 조작 방법과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 유전적 조작 기술을 이용하여 여러가지 독특한 특징들이 PTCP 내로 설계될 수 있다. 전세포 PTCP는 환자의 면역 반응을 자극하므로, 동종이계 세포에 대한 환자의 면역 반응을 감소시키기 위한 전세포 기반 PTCP의 유전적 변형이 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, 세포 표면으로부터 HLA 클래스 I 항원의 발현이 제거된다. 다른 실시 형태에서, HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 항원이 세포 표면으로부터 제거된다. 다른 실시 형태에서는, 증가된 HLA E 발현 및/또는 증가된 HLA G 발현과 같은, 면역 공격으로부터 세포를 보호하는 표면 단백질 발현이 증가된다. 이들 PTCP의 유전적 변형은 환자에서 수반되는 면역억제를 사용할 필요를 감소 및/또는 제거하여 전세포 기반 PTCP의 유용성을 증가시킬 것이며 세포 기반 PTCP를 이용한 환자의 다중 치료를 촉진할 것이다.
PTCP가 살아있는 전세포인 실시 형태에서는, 세포가 증식하거나 융합될(환자에서 반영구적이거나 영구적으로 체류함) 가능성이 있다. 증식 또는 융합이 바람직하지 못한 경우, 살아있는 세포의 증식을 방지하기 위한 기술이 치료 프로토콜내로 또는 세포내로 설계될 수 있다. 일 실시 형태에서, 살아있는 전세포 PTCP는, 세포가 증식하지 않도록, 환자 내로 주입되기 전에 방사선조사된다. 방사선조사는 또한 살아있는 전세포 PTCP의 융합을 방지할 것이다. 다른 실시 형태에서, 세포는 환자 내로 주입되기 전에 또는 환자에 노출되기 전에 세포독성 제제로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 세포는 환자 내로 주입되기 전에 동결건조된다. 동결건조는 추가의 세포 분열을 방지한다. 다른 실시 형태에서, 세포는 티미딘 키나아제와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 자살 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된다. 자살 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된, 살아있는 전세포 PTCP에서는, 환자에서 살아있는 전세포 PTCP의 NK 세포 프라이밍 효과를 제거하기를 원할 때, 자살 유전자가 살아있는 전세포 PTCP를 살해하도록 촉발하는 약물이 환자에게 주어진다. 예를 들어, 티미딘 키나아제 자살 유전자의 경우에, 유전적으로 조작된 살아있는 전세포 PTCP의 자살을 촉발하는 약물은 간시클로비어이다. 자살 유도 약물은 원하는 치료 효과, 질병 부담, 환자의 건강 및 다른 인자에 따라, 수 시간, 수 일, 수 주, 수 개월 투여되거나 투여되지 않을 수 있다. 예를 들어, 최소 잔여 질병을 가진 환자에서는, 살아있는 전세포 PTCP가 치료법의 짧은 과정동안, 예를 들어, 1, 2, 또는 3 개월 동안 한달에 한번, 필요할 수 있다. 폐 또는 뇌로의 전이와 같은 질병 부담이 더 큰 환자의 경우에는, 질병 제어를 위해 더 연장된 NK 프라이밍 치료법이 바람직할 수 있으며, 예를 들어, 연장된 기간, 예를 들어, 6, 12 또는 18개월 동안 매주, 격주 또는 매월 치료가 바람직할 수 있다. 제어되지만 박멸되지 않는 질병을 가진 환자의 경우, 질병을 제어하고 생존을 연장하기 위하여 매주, 격주, 매월, 격월, 분기, 반년 또는 매년의 방식으로 장기적인 만성 치료법을 제공하는 것이 필요할 수 있다. 전술한 시나리오중 어느 것이든, PTCP(다르게는 "프라이밍 종양 세포 제제(PTCP)"로 불림)의 용량 및 치료 간의 간격은 종양의 유형, 질병의 심각성 또는 반응의 유형에 기초하여 상이할 수 있다. 예를 들어, 치료법은 3개월 동안 매월 1회 용량이 주어진 후, 환자의 생애 동안 2개월마다 그 용량의 반이 유지 요법으로서 주어질 수 있다.
PTCP는 자연 발생이 아니며 인간 또는 동물에서 나타나지 않는 세포인 pNK 세포를 생성한다. NK 세포는 신호 1 또는 신호 2의 라이게이션없이, 암 또는 바이러스 감염된 세포를 살해할 수 없는 휴지기 NK 세포로 존재하거나, 또는 신호 1과 신호 2 둘 모두의 라이게이션 후 암 또는 바이러스 감염된 세포를 살해할 수 있는 활성화된 NK 세포이다. 본 발명은 신호 1 수용체에서만 라이게이션을 가진 비천연의 프라이밍된 pNK 세포를 생성한다. S1의 라이게이션으로, pNk는 게놈, 단백질체, 지질체, 대사체, 분비체, 표현형 및 기능적 분석을 비롯한, 그러나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 복잡한 분석의 조합으로 측정될 수 있는, 휴지기 및 활성화 NK 세포와 구별되는 생명 활동을 가진다.
따라서, 일반적인 실시 형태에서, NK 세포를 프라이밍하는 방법은 생체 내에서 NK 세포를 프라이밍 종양 세포 제제(PTCP)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, PTCP는 방사선조사된 온전한 종양 세포를 포함한다. 온전한 종양 세포는 CD2, LFA-1, NKp46, 2B4 및 DNAM-1로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체의 라이게이션을 야기하기 위한 적어도 한 가지의 프라이밍 리간드를 그의 표면 상에 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, PTCP는 방사선조사되거나 화학적으로 불활성화된 세포막 제제를 포함한다. 세포막 제제의 막은 CD2, LFA-1, NKp46, 2B4 및 DNAM으로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체의 라이게이션을 야기하기 위한 적어도 하나의 리간드를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, PTCP는 방사선조사된 CTV-1 골수성 백혈병 세포, 또는 그의 막 제제를 포함한다. 다른 실시 형태에서, PTCP는 화학적으로 불활성화된 CTV-1 골수성 백혈병 세포 또는 그의 막 제제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 프라이밍 동안, CD69의 발현이 NK 세포상에서 상향조절된다. 다른 실시 형태에서는, CD16이 NK 세포 표면 상에서 제거되어서, 프라이밍된 NK 세포는 CD16-가 된다.
다른 실시 형태에서, NK 세포의 생체 내 프라이밍 방법은 (i) 막 표면에 부착된 하나 이상의 프라이밍 리간드를 가진 방사선조사된 종양 세포 또는 그의 막 제제를 포함하는 PTCP를 환자에게 도입하는 단계로서, 상기 하나 이상의 프라이밍 리간드의 각각은 독립적으로 CD2, LFA-1, NKp46, 2B4 및 DNAM으로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체를 라이게이션할 수 있는 단계, 및 (ii) NK 세포를 생체 내에서 PTCP와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 방법은 방사선조사 전에, 종양 세포 또는 막 제제를 무정형 탄수화물-유리 매트릭스에서 고정시키고, 그안에 고정된 종양 세포 또는 막 제제를 가진 탄수화물 유리 매트릭스를 방사선조사하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 용매, 예를 들어, 물을 이용하여, 그안에 고정된 종양 세포 또는 막 제제를 가진 탄수화물 유리 매트릭스를 용해시키는 것을 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 방법은 방사선조사 전에, 종양 세포 또는 막 제제를 동결건조시키고, 이어서 동결건조된 종양 세포 또는 막 제제를 방사선조사하는 단계를 추가로 포함한다.
방사선조사는 인체내에서 증식을 방지하기 위하여 프라이밍 종양 세포 제제를 충분히 불활성화시킬 수 있는 한편, 본 명세서에 개시되고/되거나 일반적으로 당업계에서 알려진 대로 그러한 증식을 방지하기 위하여 다른 수단이 실시될 수 있다.
NK 세포의 생체 내 프라이밍을 위한 방사선조사된 CTV-1 세포
이제, 바람직한 제1 실시 형태에서, CTV-1 세포는 NK 세포의 생체 내 프라이밍을 위한 프라이밍 종양 세포 제제(PTCP)를 형성하기 위하여 방사선조사된다. 선택적으로, PTCP를 생성하기 위하여 전술한 대로 유전적 변형이 실시될 수 있다.
방사선조사는 일반적으로 신체내에서의 증식을 방지하기 위하여 종양 세포를 불활성화시키는 한편, 동일한 방사선조사가, 특히 종양 세포가 수용액내에 현탁된 채로 방사선조사될 경우, 종양 세포와 연합된 단백질 및 다른 생체분자를 손상시킬 수 있다. 세포의 하위-성분을 보호하기 위하여, 당업계에 알려진 방법을 이용하여 종양 세포 제제를 먼저 무정형 탄수화물-유리 상태에 고정시키고, 이어서 고정된 제제를 방사선조사하는 것이 바람직할 수 있다. 후속하여, 물이 탄수화물을 용해시키기 위하여 이용될 수 있으며, 방사선조사된 종양 세포 또는 그 일부는 분리될 수 있다.
대안적으로, 종양 세포 제제는 동결건조되고 이어서 방사선조사될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 방사선조사는 필요하지 않으며, 즉, PTCP가 도입되는 환자의 신체내에서 PTCP가 증식할 수 없도록 하는 다른 수단이 실시된다.
CTV-1 세포는 그들의 표면 상에 CD2, NKp46, LFA-1의 리간드를 발현하며, 이들은 NK 세포의 이들 수용체를 프라이밍하기 위해 유용하다. 따라서, 적절하게 불활성화된 CTV-1 세포는 인간 환자내에 도입하기에 안전할 것이며 신체내에서 NK 세포를 프라이밍하기 위해 작용할 것이다.
실시예 1: 공동-배양에서 RAJI 용해
RAJI 세포는 NK 세포 저항성 종양 세포주로 알려져 있다.
첫번째 실험에서, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 정상 지원자로부터 단리하고 RAJI 세포와 함께 배양하였다. NK 세포 프라이밍을 위한 PTCP를 RAJI 세포와의 PBMC의 공동배양물에 첨가하여 생체 내 인간 혈액의 자연 발생 상황을 모방하는 시스템에서 RAJI 세포에 대한 PBMC 내의 NK 세포의 반응을 변형시킨다. 공동-항온처리 기간에 걸쳐, RAJI 세포 수의 증가는 배양물에서 RAJI 세포의 정상 성장 특징을 입증한다. RAJI 세포 단독에 비하여 NK 세포의 존재하에서 RAJI 세포의 감소는 PBMC 배양물내의 NK 세포에 의한 RAJI 세포 살해(용해)를 반영한다. 프라이밍 조성물의 존재는 PBMC 집단내의 NK 세포에 의한 RAJI 세포 살해 정도를 증가시킬 것으로 예상된다.
첫번째 단리물에서, 일정량의 PBMC를 알려진 양의 RAJI 세포와 섞었다. 두번째 단리물에서, 동일한 양의 PBMC를 동일한 양의 RAJI 세포 및 SEM 15++와 섞었다. 세번째 단리물에서, 동일한 양의 PBMC를 동일한 양의 RAJI 세포 및 CTV-1과 섞었다. 네번째 단리물에서, 동일한 양의 PBMC를 RAJI 세포 및 SEM 15++와 CTV-1의 조합과 섞었다. 부피 당 살해된 RAJI의 수를, 도 2a의 차트와 도 2b의 도표에서 나타난 대로 24시간 및 48시간의 시간 간격으로 측정하였다. 결과는 SEM15++가 RAJI의 증식을 감소시키지 않았으며, CTV-1이 단독으로 그리고 SEM 15++와 조합되어, RAJI 세포의 증식을 감소시켰음을 나타낸다. 이 실험을 상이한 PBMC 공여체로 반복하였더니 결과가 사실로 확인되었다. 이 실험으로부터, 본 발명자들은 CTV-1이 RAJI 세포의 증식을 감소시키는 기능을 함을 보여준다. 본 발명자들의 가설은 CTV-1 세포 표면 상에 발현된 리간드가 말초 혈액으로부터의 NK 세포를 프라이밍하기 위한 신호 1을 제공하도록 기능하여, 이제 프라이밍된 NK 세포가 RAJI 세포를 살해할 수 있도록 한다는 것이다. 이 프라이밍은 다른 단핵 세포의 존재하에서 그리고 모두 존재하는 종양 세포의 존재하에서 발생한다.
도 2a는 신호 1을 발현하며 NK 세포를 프라이밍(rNK를 pNK로 전환)할 수 있는 종양 세포주인 CTV1 세포의 첨가만이 인간(PBMC) 배양물에서 NK 저항성 세포주인 RAJI 세포의 성장을 감소시킬 수 있음을 보여준다. (음성 대조군으로서)CD15 양성 SEM 세포가 PBMC 배양물에 첨가될 경우, RAJI 세포의 성장은 변하지 않으며, 배지 단독에 비하여 증가될 수 있다. CTV1 및 CD15 양성 SEM 세포 둘 모두가 배양물에 첨가될 경우, 그 반응은 CTV1 세포 단독의 첨가 시와 동등하다.
대조적으로, 도 2b에 나타난 대로, CD15 양성 SEM 세포가 배양물에 첨가되면 RAJI 세포의 성장이 증가된다. CTV1 및 SEM 세포 둘 모두가 암 세포주이다. CTV1 세포와 SEM 세포 사이의 차이는 CTV1 세포는 신호 1(프라이밍 신호)을 발현하지만 신호 2(트리거링 신호)는 없는 NK 저항성 세포주라는 것이다. SEM 세포는 신호 1과 신호 2 둘 모두를 발현하는 NK 민감성 세포이다. CTV1 세포가 PBMC에 첨가될 경우, NK 세포는 프라이밍되고 그들이 RAJI 세포와 접촉하게 되면 RAJI 세포를 살해한다. RAJI 세포의 살해는 감소된 RAJI 세포 수(감소된 성장)에 의해 입증된다. SEM이 배양 시스템에 첨가될 경우, NK 세포는 SEM 세포를 살해한다. 시스템에 프라이밍된 NK 세포가 없으므로 RAJI 세포의 살해는 없다. RAJI 세포 성장의 증가는 RAJI 세포를 자발적으로 용해시킬 수 있는 PBMC 믹스 내의 작은 비율의 NK 세포가 우선적으로 SEM 세포를 표적화하고 RAJI 세포를 표적화할 수 있는 세포의 수를 감소시키는 "콜드 타겟 억제(cold target inhibition)" 현상으로 인한 것일 것이다.
실시예 2: 공동-배양 파트 II에서 RAJI 용해
두번째 실험에서, 본 발명자들은 RAJI 세포의 증식에 대한, (i) PMBC 단독; (ii) PBMC 및 CTV-1; (ii) IL-2 및 IL-15를 가진 PBMC, 및 (iv) CTV-1, IL-2 및 IL-15의 조합을 가진 PBMC 각각의 영향을 조사하였다. 결과는 도 3에 나타난다. 여기서, 상기 조합에 더하여, 상이한 비율의 NK 세포:RAJI 세포를 조사하였다. 본 발명자들은 48시간 후, 그리고 약 12:1의 PBMC:RAJI 세포 비에서, PMBC와 CTV-1의 조합이 PBMC 단독보다 RAJI 살해에 훨씬 더 효과적이었음을 발견하였다. 2:1의 PBMC:RAJI 세포 비에서조차도, PBMC + CTV-1의 조합은 PBMC 단독보다 식별가능하게 더 우수하였다. 추가로, CTV-1을 가진 PBMC는 저 용량의 IL-2와 IL-15의 조합을 가진 PBMC보다 더 높은 용해를 나타냈다. 하지만, 데이터는 CTV-1을 가진 PBMC와 저 용량 IL-2와 IL-15의 조합이 최대의 RAJI 세포 살해를 생성하였음을 보여준다. 이 실험을 시험관 내에서 수행하였지만, 본 발명자들은 IL-2와 IL-15가 있거나 없이, CTV-1은 NK 세포의 생체 내 프라이밍을 위해 효과적일 것으로 생각한다.
또한, NK 세포 기능/건강을 촉진하는 염증성 사이토카인(IL2 및 IL15) 소량의 첨가에서, CTV1 세포 단독 또는 사이토카인 단독에서보다 상당히 더 많은 RAJI 세포가 살해된다.
CTV-1 종양 세포가 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되지만, 본 발명은 CTV-1 세포로 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 방법은 NK 세포 프라이밍을 야기하는 임의의 종양 세포, 또는 그 단편으로 실시할 수 있다. 따라서, 제1 종양 세포가 방사선조사되고 NK 세포의 생체 내 프라이밍을 위해 환자에게 도입될 수 있으며, 프라이밍된 NK 세포는 후속하여 용해를 위하여 제2 종양 세포에게 제시될 수 있다. 본 발명의 이들 및 다른 양태는 당업자에게 이해될 것이다.
따라서, 자연 살해 세포의 생체 내 프라이밍 방법이 개시된다.
일 양태에서, 본 발명은 생체 내에서 휴지기 NK 세포(rNK)와 접촉시키기 위한 프라이밍 종양 세포 제제(PTCP)의 도입을 포함하며; 여기서 생체 내에서 PTCP와의 rNK 세포의 접촉은 rNK 세포의 프라이밍된 NK 세포(pNK)로의 변화를 유도하며, 즉, 그것은 NK 세포 프라이밍을 이룬다. 일단 프라이밍된 상태에서는, pNK 세포는 숙주 내의 암 세포와 접촉하여 추가의 시그널링을 수신하여, pNK 세포는 암 세포를 용해시키기 위한 과립 엑소사이토시스(exocytosis)를 수행하도록 "활성화"될 수 있다.
rNK 세포는 말초 혈액에 위치할 수 있다.
rNK 세포가 프라이밍되면, 지속된 기간 동안 프라이밍된 상태로 독특하게 유지된다. 따라서, pNK 세포는 기억 프라이밍된 NK 세포이며 프라이밍 상태를 유지하기 위하여 PTCP에의 후속의 또는 연속적인 노출을 요구하지 않는다고 할 수 있다.
일 실시 형태에 따라, PTCP의 예는 상업적으로 입수한 CTV-1 세포주의 유도체, 예를 들어, DSMZ Germany(www.dsmz.de)로부터의 세포주 ACC 40을 포함한다. CTV-1은 1982년에 재발한 급성 단아구성 백혈병(AML M5)을 가진 40세 남성의 말초 혈액으로부터 확립된 것으로 전해진다. 이것은 rNK 세포 상의 신호 1 프라이밍 수용체를 라이게이션시킬 수 있는 특이적 리간드("신호 1")를 나타내는 희귀 암 세포주이지만, CTV-1 세포는 트리거링 수용체를 시그널링하는 특이적 리간드("신호 2")가 결핍되어 있다. 최근에는, CD-56 음성(CD56-) CTV-1 하위 집단 세포주가 단리되어 시험관 내에서 실험이 수행되었다. 실험의 결과는 CTV-1이 rNK 세포를 프라이밍하는 신호의 조합을 제공함을 시사한다. 생성된 CD56-CTV-1 프라이밍된 pNK 세포가 조사되었으며 CD16이 제거된 것으로 확인되었다. 대조적으로, 예를 들어, IL-2 및/또는 IL-15와 같은 사이토카인 프라이밍된 NK 세포에서는 CD16이 제거되지 않는다. 또한, 생성된 CD56-CTV-1 프라이밍된 pNK 세포는 NKG2D 및 NKP46을 하향조절하고 CD69를 상향조절하는 것으로 나타났다. 따라서, CD56- CTV-1 세포는 특히 방사선조사에 의한 불활성화 또는 화학적 불활성화 후, PTCP의 일부를 형성할 수 있다.
일부 실시 형태에서 하나 이상의 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-15, 및 NK 세포의 분화와 관련된 것으로 알려진 다른 것들 또는 그 조합을 CD56- CTV-1 세포와 조합하여 향상된 PTCP를 형성하는 것이 바람직할 수 있다.
PTCP의 투여는 말초 혈액 투여를 통해 이루어질 수 있다.
CTV-1 세포주가 개시되지만, 리간드의 조합이 제공되어, 수용체 CD2, LFA-1, NKG2D, 2B4, 및 DNAM-1을 포함할 수 있는, rNK 세포의 프라이밍 수용체에 도입되도록 다른 PTCP가 유사하게 실시될 수 있음이 이해되어야 한다. 다른 PTCP 플랫폼은 예를 들어, SEM 세포, 또는 세포 표면 상에 프라이밍 리간드(신호 1)를 보유하지만 트리거링 리간드(신호 2)를 보유하지 않는 것으로 확인된 다른 암 세포의 사용을 포함할 수 있다.
PTCP가 MHC 클래스 1 분자의 발현을 포함하는 경우 PTCP 상의 MHC 클래스 1 분자의 유전적 넉아웃(knock out)을 실시하는 것이 바람직할 수 있다. 유전적 전략은 TALEN 또는 CRISPR 유전자 편집 기술의 실시를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 프라이밍 리간드 ICAM-1은 rNK 세포의 LFA-1 수용체의 라이게이션을 위하여 PTCP에서 실시된다. 바람직한 실시 형태에서, PTCP는 그 표면 상에 ICAM-1 또는 ICAM-3 중 하나 이상을 발현하는 온전한 종양 세포를 포함한다.
일부 다른 실시 형태에서, 프라이밍 리간드 CD15, CD58, CD48, 및 CD59는 rNK 세포의 CD2 수용체의 라이게이션을 위하여 PTCP에서 실시된다. 바람직한 실시 형태에서, PTCP는 그 표면 상에 CD15, CD58, CD48, 및 CD59 중 하나 이상을 발현하는 온전한 종양 세포를 포함한다.
일부 다른 실시 형태에서, 프라이밍 리간드 MICA 및/또는 MICB(주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 쇄-관련됨), ULBP1-3, PVR, Rae-1 및 H-60 중 하나 이상이 rNK 세포의 NKG2D 및/또는 DNAM-1 수용체의 라이게이션을 위하여 PTCP에서 실시된다. 바람직한 실시 형태에서, PTCP는 그 표면 상에 MICA, MICB ULBP, PVR, Rae-1 및 H-60 중 적어도 하나를 발현하는 온전한 종양 세포를 포함한다.
CD48은 또한 rNK 세포 표면상의 2B4 수용체를 위한 리간드로서 PTCP에서 실시되어 프라이밍 활성을 야기할 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 신호 1 리간드를 갖지만 신호 2 리간드는 갖지 않는 하나 이상의 제1 암 세포주, 예를 들어, CTV-1이 선택된다. 제1 암 세포주(들)는 상기에 열거한 NK 세포 프라이밍 리간드와 같은, 세포 표면상의 원하는 NK 세포 프라이밍 리간드의 존재를 확인하기 위하여 추가로 조사된다. 제1 암 세포주(들) 중 하나가 NK 프라이밍 종양 세포 제제(PTCP)를 형성하기 위하여 사용하기 위하여 선택된다. 제1 암 세포주는 선택적으로 유전적으로 변형되어 MHC 클래스 I 분자를 넉아웃하거나 및/또는 일부 바람직한 유전자를 넉인(knock in)시킨다. 제1 세포주는 표현형 차이의 선택적 분리에 의해 추가로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 균질한 하위-집단을 수득하기 위하여 CTV-1의 CD56- 변이체가 단리될 수 있다. 선택된 하위-집단 PTCP는 공지 기술을 이용하여 확장될 수 있으며, 후속하여 인간 숙주에서의 증식을 방지하기 위하여 방사선조사될 수 있다. 이어서 PTCP는 인간 숙주에게 도입되어 여기서 PTCP는 rNK 세포가 pNK 세포가 되도록 유도하며, 여기서 pNK 세포는 rNK 저항성 종양 세포(pNK 세포가 프라이밍 신호 1 활성으로 프라이밍되므로, pNK 민감성임)를 공격하고 살해하도록 적응된다.
PTCP는 인간 숙주에게 PTCP를 도입하기 전에 시험관 내에서 하나 이상의 사이토카인을 도입함으로써 향상될 수 있다. 이와 관련하여, PTCP는 IL-2 및/또는 IL-15 사이토카인 또는 NK 세포에서 종양 살해 아쥬반트 및 수용체의 생산, 하향조절 또는 상향조절을 향상시키는 것으로 알려진 다른 사이토카인에 도입될 수 있다.
항체 및/또는 그 유도체는 PTCP의 세포의 막 표면 상의 리간드에 결합하고 발현하기 위해 사용될 수 있다.
일부 다른 실시 형태에서, PTCP는 상기에 개시한 대로, 즉, 온전한 제1 암 세포로 생산될 수 있으며, PTCP의 세포는 공지의 교반 및 막 제제를 제조하기 위한 다른 기술을 이용하여 제거될 수 있으며, 여기서 제1 암 세포의 세포막 단편은 PTCP를 형성하는 리간드와 아쥬반트의 혼합물을 형성한다.
산업상 이용가능성
본 발명은 암 및 다른 감염성 질병의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.

Claims (11)

  1. 불활성화된 종양 세포 또는 이의 막 부분을 포함하는 제제로서,
    상기 세포 또는 이의 막 부분은 CTV-1 골수성 백혈병 세포주로부터 유래되며, 생체 내에서 환자의 자연 살해(NK) 세포를 프라이밍하기 위하여 상기 제제를 환자에게 도입하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법에서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는, 제제.
  2. 제1항에 있어서, 제제는 방사선조사되어 불활성화되는 것을 특징으로 하는, 제제.
  3. 제1항에 있어서, 제제는 방사선조사된 세포 또는 이의 막 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제제.
  4. 제3항에 있어서, 제제는 무정형 탄수화물-유리 매트릭스 내에 제제를 고정시키고, 그안에 고정된 제제를 가진 탄수화물 유리 매트릭스를 방사선조사함으로써 불활성화되는 것을 특징으로 하는, 제제.
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