CN110582565A - 自然杀伤细胞的体内致敏 - Google Patents

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Abstract

本披露涉及一种用于癌症治疗的方法，该方法通过体内致敏和活化自然杀伤细胞以实现肿瘤细胞裂解。该方法包括将源自第一肿瘤细胞系的致敏肿瘤细胞制剂(PTCP)引入患者体内，其中对该第一肿瘤细胞系进行辐射以使这些第一肿瘤细胞或其膜制剂失活，这些第一肿瘤细胞在其膜表面上具有已知的致敏配体。通过该PTCP在体内接触该患者的其余NK细胞，得到致敏的NK细胞，这些致敏的NK细胞的特征是CD69上调、CD16脱落或者CD69+和CD16‑组合。然后，这些致敏的NK细胞接触第二肿瘤细胞，即该癌症，并被配置用于裂解和杀伤这些第二肿瘤细胞。

Description

自然杀伤细胞的体内致敏
技术领域
本发明涉及用于治疗癌症的方法；并且更具体地，涉及体内致敏自然杀伤细胞用于治疗癌症和其他疾病。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞是如下的淋巴细胞，其能在不刺激抗原的情况下与某些肿瘤细胞和受病毒感染的细胞结合，并通过插入含有穿孔素的颗粒将其杀伤。
许多癌症在体内形成并扩增，因为NK细胞首先无法识别，并且其次无法吸引它们进行杀伤。首先是免疫监视失败。后者归因于可使肿瘤逃避NK细胞杀伤的肿瘤变化。
在2012年9月4日授权的US 8,257,970描述了一种用于通过肿瘤细胞体外制备来活化自然杀伤细胞的方法；其内容特此通过引用并入。尽管‘970专利的实施例似乎有前景，但与在商业平台上应用该技术相关的问题很多，尤其诸如针对独特患者和疾病的可扩展性和广泛应用性。
确实，寻找治疗癌症的有效方法的问题长期存在，并且在很大程度上尚未解决。出于这一原因，美国政府启动了一项名为“癌症登月计划(Cancer Moonshot)”的计划；这本质上是争取使朝向治愈的进展速率加倍，或者在五年内取得十年的进步。
存在对为了治疗癌症和其他疾病的目的而刺激免疫应答的新方法的持续需要。
发明内容
技术问题
许多癌症的问题在于癌细胞会下调膜表面上的某些信号，有效地逃避了免疫监视和NK细胞杀伤。因此，该癌症能够逃避NK细胞杀伤并在罹患患者体内扩增。
问题的解决方案
披露了一种用于治疗人和动物患者的各种癌症的方法。本文描述的是一种用于在体内“致敏”患者自身的NK细胞的策略和方法，使得它们暴露于通常在肿瘤细胞表面被下调的那些信号，然后在将NK细胞致敏(该NK细胞能够通过与肿瘤细胞表面未下调的其余信号接触来活化)之后接触肿瘤细胞后，从而促进肿瘤细胞裂解。总而言之，该方法实现了自然杀伤(NK)细胞的体内“致敏”，其中静息NK(rNK)细胞在与致敏肿瘤细胞制剂(PTCP)接触后变为已致敏的NK(pNK)细胞。已致敏的NK细胞在接触肿瘤细胞和剩余信号后能够完全活化并裂解肿瘤细胞。
发明的有利效果
致敏肿瘤细胞制剂是有效地向静息NK细胞提供第一信号的细胞、蛋白质和/或配体的生物制剂。该第一信号并非对每种癌症变体都具有特异性，因此在首先通过暴露于PTCP来“致敏”NK细胞时，然后NK细胞可以定位并实行多种癌细胞变体的裂解。因此，所提出的方法提供了一种用于治疗许多种癌症类型的策略，并且不限于单种变体。
另外，本文描述的方法不是自体的，并且因此能够大规模商业化。根据本发明，可以规模化并生产一种PTCP，然后可以将其用于治疗许多罹患不同癌症变体和其他感染性疾病的患者。
全面审查本说明书和附图时，其他优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
图1展示了根据所展示的实施例的用于体内致敏NK细胞的方法。
图2A仅示出了在人PBMC培养物中添加CTV1细胞(一种表达信号1并且可以致敏NK细胞的肿瘤细胞系)可以减少RAJI细胞(一种NK抗性细胞系)的生长。
图2B示出了如果将CTV1细胞添加到培养物中，则当添加到人PBMC群中时，NK抗性肿瘤系RAJI细胞的生长显著减少。
图3示出了混合培养物中RAJI细胞生长的减少与由CTV1致敏的NK细胞的特异性RAJI裂解有关。
实施例的说明
使用自然杀伤(NK)细胞杀伤肿瘤是一个涉及致敏和触发的两步过程；即NK细胞必须被致敏并被触发以造成肿瘤细胞的杀伤。致敏和触发各自分别由NK细胞和肿瘤细胞上不同的受体和配体组控制。大多数自然发生的人类癌症对NK杀伤有抗性，因为它们在细胞表面上缺乏致敏配体。换言之，触发配体保留在肿瘤细胞表面上，但是NK细胞不会引起肿瘤细胞死亡，因为它没有被致敏(即，肿瘤细胞表面上没有致敏配体)。由于肿瘤细胞表面上缺乏致敏配体(以下简称“信号1”)，至少对于绝大多数人类癌症，NK细胞不参与并且无法参与对患者癌症生长的控制。本文披露了如下的一种策略：人工“致敏”NK细胞，使其能够杀伤肿瘤细胞(裂解或凋亡)，也就是说，当已致敏的NK细胞与存在于肿瘤细胞表面的触发信号(下文称为“信号2”)接触时。本文披露的技术将增加人类NK细胞在人类癌症控制——预防和治疗中的作用。
首先描述了NK细胞在癌症控制中的作用，使用细胞因子致敏NK细胞。白细胞介素2(IL-2)的发现及其在NK细胞活化中的作用在1980年代引起了人们对在肿瘤免疫疗法中使用淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞的很大兴趣。但是，这些试验的结果很大程度上令人失望。在一项调查将自体LAK细胞与IL-2一起给予患者的效果的研究中，不到20％的患者出现有应答(Rosenburg等人)。随后的研究示出了IL-2显著扩大体内循环NK细胞的数量，但是这些细胞没有最大的细胞毒性(Miller等人)。
最近，已开发出一种无细胞因子的致敏技术，该技术使用经过谨慎选择的保留了致敏配体但缺乏触发配体的肿瘤细胞(North等人)。在将静息NK细胞(rNK细胞为CD69-)与致敏肿瘤细胞(PTC)(例如CTV-1细胞)放置在一起时，NK细胞将如由活化表型(pNK细胞为CD69+)和脱落CD16定义的被致敏。pNK细胞将杀伤在细胞表面具有触发配体的肿瘤细胞。在许多人类肿瘤类型中这被认为是真实的，并且在某些情况下已得到证实，包括但不限于：骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、前列腺癌以及其他GI和GYN恶性肿瘤。也就是说，在绝大多数患者中，他们的肿瘤通过清除细胞表面上的致敏配体来逃避NK细胞杀伤，但是由于它们在细胞表面上保留了触发配体，因此仍然易于被已致敏的NK细胞杀伤。
肿瘤对NK细胞杀伤有抗性(NK抗性)，或者被NK细胞杀伤(NK敏感)。大多数肿瘤和肿瘤细胞系对NK有抗性。大部分NK抗性肿瘤和细胞系在其细胞表面上没有致敏配体，又不表达触发配体。这意味着NK细胞没有收到需要它杀伤肿瘤细胞的两个信号之一。由于NK抗性肿瘤仍在其细胞表面上具有触发配体，因此它们将被已接收致敏信号的NK细胞杀伤；如通过这些NK抗性系对由提供致敏信号的IL-2致敏的NK细胞的易感性所证明。IL-2是一种高效的细胞因子，其已被证明很难在临床上使用，因为诱导全身性NK细胞致敏所需要的高剂量也会引起严重且通常致命的副作用。因此，已经发现并且确实进行了本文披露的策略：在体内人工提供致敏信号，以将rNK细胞转化为能够在不给予中毒水平的细胞因子的情况下与肿瘤细胞相互作用并杀伤肿瘤细胞的pNK细胞。
作为疗法的一部分，已接收到致敏信号(信号1)的静息NK细胞被称为肿瘤致敏NK细胞(TpNK)。TpNK敏感性肿瘤是血液肿瘤和实体瘤中的大多数。但是，存在TpNK抗性癌症；例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL)。TpNK抗性肿瘤将不符合通过这种体内致敏治疗策略进行的治疗的条件。
在细胞表面上保留致敏配体(信号1)但缺乏触发信号(信号2)的罕见癌细胞和癌细胞系在本文中被称为“NK致敏肿瘤细胞(PTC)”。PTC通过下调其细胞表面的触发配体(S2)来逃避NK细胞杀伤——他们与绝大多数通过清除细胞表面上的致敏配体(信号1)来逃避NK细胞杀伤的癌症相反。PTC是肿瘤细胞的一个小但可识别的子集，它们在细胞表面表达至少三种致敏配体的某种组合。该三种致敏配体可以包括(例如，但不限于)：(i)第一种配体选自下组，该组由以下组成：ICAM-1和ICAM-3；(ii)第二种配体选自下组，该组由以下组成：CD15、CD48、CD58和CD59；并且(iii)第三种配体选自下组，该组由以下组成：MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、PVR、Rae-1和H-60。
CTV-1细胞，源自患有急性成淋巴细胞白血病的患者的一种细胞系(DSMZ号ACC40，www.dsmz.de)，表达致敏配体，该致敏配体可引起在其表面表达的NK受体CD2、LFA-1、NKp46、2B4和DNAM-1的连接。已经发现可使用在细胞表面表达NKp46、2B4和DNAM的配体的肿瘤细胞来致敏静息人NK细胞。进一步考虑到，可使用CD2、LFA-1、NKp46、2B4和DNAM配体的其他组合来致敏人NK细胞。
静息NK细胞的致敏可以在体外和/或体内发生。体外致敏虽然有效，但作为一种癌症疗法在逻辑上复杂、花费高昂且具有局限性。在本文中，披露了NK细胞的体内致敏，其中患者的静息NK细胞在不离开循环的情况下被致敏。
在其细胞表面下调了触发配体(信号2)的一些癌症将对TpNK有抗性。当TpNK与TpNK抗性肿瘤(TRT)接触时，仅提供致敏信号(信号1)，并且无触发信号(信号2)，TpNK细胞不会被触发并且肿瘤细胞不会被杀伤(裂解)。TRT将需要不同的治疗策略。
用于体内致敏NK细胞的PTCP
将致敏肿瘤细胞制剂(PTCP)引入患者，其中PTCP被配置为在体内将NK细胞从静息状态即rNK细胞(CD69-)改变为已致敏状态即pNK细胞。已致敏的NK(pNK)细胞通常以CD69+、CD16-或者CD69+和CD16-的组合为特征。PTCP可以通过静脉内、皮下、肌内、腹膜内、鞘内输注或者鼻内、经支气管或结膜滴注来递送。PTCP可以是细胞或其部分，包括裂解物、裂解物级分、外泌体或微泡。该细胞或其部分可以来自含有至少三种能够引起NK细胞受体CD2、LFA-1、NKp46、2B4和DNAM的连接的致敏配体的细胞系。该细胞或其部分可以是活的、经辐射的、经冷冻的、经冻干的、经固定的、经化学改变的或经遗传改变的、或以其他形式提供的。一个实施例包括用三种或更多种上述致敏配体直接注射经辐射的肿瘤细胞系。另一个实施例是注射肿瘤细胞裂解物或其部分，以将rNK细胞转化为pNK细胞。PTCP可以是人造产品，包括抗体(单克隆抗体、双特异性抗体和三特异性抗体以及微抗体)、蛋白质、适体、小分子或组合，该PTCP将向rNK细胞呈递致敏配体并将其转化为pNK细胞。一个实施例是注射两种结合该致敏配体的靶标的双特异性抗体。另一个实施例是注射一种结合该致敏配体的靶标的三特异性抗体。PTCP可以是细胞和人造产品的组合产品。例如，人造球可以用肿瘤细胞系的裂解物涂覆以产生PTCP。PTCP可以是人造产品的组合。在一个实施例中，脂质、金属、聚合物或组合的纳米球被涂覆了结合该致敏配体的靶标的抗体。在另一个实施例中，脂质、硅烷、聚合物或组合的纳米球被涂覆了结合该致敏配体的靶标的合成致敏配体、适体或蛋白质。
致敏肿瘤细胞制剂(PTCP)可以按单次疗法、连续疗法或者单次疗法和连续疗法的组合来给予。PTCP可以一天给予一次或每天给予一次。可以一次或多次使用PTCP。PTCP可以作为与其他药物、放射和外科疗法的组合疗法的一部分给予。
在PTCP为全细胞的一些实施例中，其中，使用基因工程技术，诸如但不限于基于DNA核酸酶的基因编辑技术(尤其包括锌指、CRISPR或TALEN)、利用rAAV或其他病毒载体的基于病毒载体的基因编辑以及其他基因工程方法，可以将若干个独特的特征设计到PTCP中。因为全细胞PTCP刺激患者的免疫应答，所以可以进行基于全细胞的PTCP的基因修饰以降低患者对同种异体细胞的免疫应答。在一个实施例中，清除了细胞表面上的HLA I类抗原的表达。在另一个实施例中，清除了细胞表面上的I类HLA和II类HLA抗原。在另一个实施例中，保护细胞免受免疫攻击的表面蛋白表达增加，诸如HLA E表达增加和/或HLA G表达增加。PTCP的这些基因修饰将通过减少和/或消除在患者中使用伴随免疫抑制剂的需要来增加基于全细胞的PTCP的效用，并促进使用基于细胞的PTCP对患者进行的多种治疗。
在PTCP为活全细胞的实施例中，该细胞有潜力增殖或植入(在患者体内取得半永久或永久性驻留)。在不希望增殖或植入的情况下，可以将用以预防活细胞增殖的技术设计到治疗方案中或细胞中。在一个实施例中，将活全细胞PTCP进行辐射，之后输注到患者体内，以使细胞不增殖。辐射还将阻止活全细胞PTCP的植入。在另一个实施例中，在输注到患者体内或暴露于患者之前，将细胞使用细胞毒性剂进行处理。在另一个实施例中，将细胞冻干，之后输注到患者体内。冻干防止进一步的细胞分裂。在另一个实施例中，将细胞进行基因修饰以包括自杀基因，诸如但不限于胸苷激酶。在经基因工程化以包含自杀基因的活全细胞PTCP中，当您想清除患者体内活全细胞PTCP的NK细胞致敏作用时，向患者给予触发自杀基因以杀伤活全细胞PTCP的药物。例如，对于胸苷激酶自杀基因，触发已经基因工程化的活全细胞PTCP的自杀的药物是更昔洛韦。自杀诱导药物可以按数小时、数天、数周、数月给予或从不给予，取决于所希望的治疗效果、疾病负担、患者的健康状况和其他因素。例如，在患有微小残留病的患者中，可能需要活全细胞PTCP进行短期疗程，例如每月一次，持续一个月、两个月或三个月。对于疾病负担较大(诸如转移至肺部或脑部)的患者，可能希望进行更长时间的NK致敏疗法来控制疾病，例如较长时期(例如6个月、12个月或18个月)内每周一次、每两周一次或每月一次治疗。对于疾病已得到控制但未根除的患者，可能需要每周一次、每两周一次、每月一次、每两月一次、每季度一次、每半年一次或每年一次的方式进行长期慢性疗法，以控制疾病并延长存活期。对于上述任何一种情况，PTCP的剂量(另外称为“致敏肿瘤细胞制剂(PTCP)”)和治疗间隔可基于肿瘤类型、疾病严重程度或应答类型而有所不同。例如，可以在3个月内每月给予一剂疗法，然后在患者的生存期中以每两个月半剂作为维持疗法。
PTCP产生pNK细胞，这是一种非天然存在的细胞，且未见于人或动物体内。NK细胞仅以静息NK细胞存在，在不连接信号1或信号2的情况下，无法杀伤癌症或受病毒感染的细胞，或者是活化的NK细胞，在连接信号1和信号2后可以杀伤癌症或受病毒感染的细胞。本发明产生一种仅有信号1受体的连接的非天然致敏的pNK细胞。在具有S1的连接的情况下，pNK具有与静息NK细胞和活化的NK细胞不同的生物学特性，该pNK可以用一种或多种复杂的测定(包括但不限于基因组、蛋白质组、脂质组、代谢组、分泌组、表型和功能测定)的组合进行测量。
因此，在一般的实施例中，用于致敏NK细胞的方法包括使NK细胞与致敏肿瘤细胞制剂(PTCP)体内接触的步骤。
在一个实施例中，PTCP包含经辐射的完整肿瘤细胞。完整的肿瘤细胞可在其表面上包含至少一种致敏配体，用于引起选自下组的受体的连接，该组由以下组成：CD2、LFA-1、NKp46、2B4和DNAM-1。
在另一个实施例中，PTCP包含经辐射或化学灭活的细胞膜制剂。细胞膜制剂的膜可以包含至少一种配体，用于引起选自下组的受体的连接，该组由以下组成：CD2、LFA-1、NKp46、2B4和DNAM。
在一些实施例中，PTCP包含经辐射的CTV-1骨髓性白血病细胞或其膜制剂。在其他实施例中，PTCP包含经化学灭活的CTV-1骨髓性白血病细胞或其膜制剂。
在一些实施例中，在致敏过程中，CD69在NK细胞上的表达被上调。在其他实施例中，在NK细胞表面上CD16脱落，因此已致敏的NK细胞是CD16-。
在另一个实施例中，用于体内致敏NK细胞的方法包括：(i)将包含经辐射的肿瘤细胞或其膜制剂的PTCP引入患者，该PTCP具有附接于膜表面的一种或多种致敏配体，所述一种或多种致敏配体各自能够独立地进行选自下组的受体的连接，该组由以下组成：CD2、LFA-1、NKp46、2B4和DNAM；以及(ii)使NK细胞与PTCP体内接触。该方法可以进一步包括以下步骤：在辐射之前，将肿瘤细胞或膜制剂固定在无定形碳水化合物玻璃基质中，并用固定在其中的肿瘤细胞或膜制剂对碳水化合物玻璃基质进行辐射。在一些实施例中，该方法进一步包括使用溶剂(例如水)溶解其中固定有肿瘤细胞或膜制剂的碳水化合物玻璃基质。在其他实施例中，该方法进一步包括以下步骤：在辐射之前，冻干肿瘤细胞或膜制剂，且随后辐射已冻干的肿瘤细胞或膜制剂。
尽管辐射可以充分地灭活致敏肿瘤细胞制剂以防止在人体中的增殖，但是可以实施如本文所述和/或本领域通常已知的其他手段来防止这种增殖。
用于NK细胞的体内致敏的经辐射的CTV-1细胞
现在，在第一个优选的实施例中，将CTV-1细胞进行辐射以形成致敏肿瘤细胞制剂(PTCP)，用于NK细胞的体内致敏。任选地，可以实施如上所述的基因修饰以产生PTCP。
尽管辐射通常使肿瘤细胞失活以防止其在体内增殖，但是相同的辐射会损害与肿瘤细胞相关的蛋白质和其他生物分子，特别是当肿瘤细胞悬浮在水溶液中进行辐射时。为了保护细胞亚组分，可能优选的是首先使用本领域已知的方法将肿瘤细胞制剂以无定形碳水化合物玻璃状态固定，随后辐射所固定的制剂。随后，可以使用水溶解碳水化合物，并且可以分离经辐射的肿瘤细胞或其部分。
可替代地，可将肿瘤细胞制剂冻干并随后辐射。
在一些实施例中，不需要辐射，也就是说，在实施其他手段使得PTCP不能在所引入的患者的体内增殖的情况下。
CTV-1细胞在其表面上表达CD2、NKp46、LFA-1的配体，这些配体可用于致敏该NK细胞的这些受体。因此，适当失活的CTV-1细胞将可以安全地引入人类患者体内，并将起到致敏体内NK细胞的作用。
实例1：共培养物中的RAJI裂解
RAJI细胞已知是NK细胞抗性肿瘤细胞系。
在第一个实验中，从正常志愿者体内分离出人外周血单核细胞(PBMC)，并与RAJI细胞一起进行培养。将用于NK细胞致敏的PTCP添加到PBMC与RAJI细胞的共培养物中，以调节PBMC中的NK细胞对系统中RAJI细胞的应答，该系统模拟人体内血液的自然产生状况。在共同孵育期间，RAJI细胞数量的增加证明了培养物中RAJI细胞的正常生长特征。RAJI细胞在存在NK细胞的情况下相对于单独的RAJI细胞的情况的减少反映了PBMC培养物中RAJI细胞被NK细胞杀伤(裂解)。预计致敏组合物的存在会增加PBMC群中NK细胞杀伤RAJI细胞的程度。
在第一份分离物中，将一定量的PBMC掺入已知量的RAJI细胞。在第二份分离物中，将相同量的PBMC掺入相同量的RAJI细胞和SEM15++。在第三份分离物中，将相同量的PBMC掺入相同量的RAJI细胞和CTV-1。在第四份分离物中，将相同量的PBMC掺入RAJI细胞以及SEM15++与CTV-1的组合。如图2A的图表和图2B的图所示，以二十四小时和四十八小时的时间间隔确定每体积已杀伤的RAJI的数量。结果指示，SEM15++不会减少RAJI细胞的增殖，且单独的CTV-1以及与SEM 15++的组合会减少RAJI细胞的增殖。使用不同的PBMC供体重复该实验，并证实了该结果。从该实验中，我们示出了CTV-1起到减少RAJI细胞的增殖的作用。我们的假设是，在CTV-1细胞表面上表达的配体起着提供信号1以致敏来自外周血的NK细胞的作用，从而使现在已被致敏的NK细胞能够杀伤RAJI细胞。这种致敏是在存在其他单核细胞的情况下和存在全部现有肿瘤细胞的情况下发生的。
图2A仅示出了在人(PBMC)培养物中添加CTV1细胞(一种表达信号1并且可以致敏NK细胞(将rNK转化为pNK)的肿瘤细胞系)可以减少RAJI细胞(一种NK抗性细胞系)的生长。当将CD15阳性SEM细胞添加到PBMC培养物中(作为阴性对照)时，与单独的培养基相比，RAJI细胞的生长不会改变，并且可能会增加。当将CTV1和CD15阳性SEM细胞添加到培养物中时，其应答相当于添加单独的CTV1细胞。
通过比较，如图2B所证明的，如果将CD15阳性SEM细胞添加到培养物中，则RAJI细胞的生长增加。CTV1和SEM细胞都是癌细胞系。CTV1细胞和SEM细胞之间的区别在于，CTV1细胞是表达信号1(致敏信号)但无信号2(触发信号)的NK抗性细胞系。SEM细胞是同时表达信号1和信号2的NK敏感细胞。当将CTV1细胞添加到PBMC中时，NK细胞会被致敏并在其接触RAJI细胞时杀伤它们。RAJI细胞数量减少(生长减少)证明了RAJI细胞的杀伤。当将SEM添加到培养系统中时，NK细胞杀伤SEM细胞。因为系统中没有已致敏的NK细胞，所以不会杀伤RAJI细胞。RAJI细胞生长的增加很可能是因为“冷靶抑制”现象，其中能够自发裂解RAJI细胞的PBMC混合物中NK细胞的一小部分优先地靶向SEM细胞并减少能够靶向RAJI细胞的细胞数量。
实例2：共培养物中的RAJI裂解第II部分
在第二个实验中，我们研究了以下各项对RAJI细胞的增殖的影响：(i)单独的PMBC；(ii)PBMC和CTV-1；(ii)具有IL-2和IL-15的PBMC，以及(iv)具有CTV-1、IL-2和IL-15的组合的PBMC。图3示出了结果。在此，除了上述组合之外，还研究了NK细胞与RAJI细胞的不同比例。我们发现，在48小时后，PBMC与RAJI细胞的比例为约12:1，PMBC和CTV-1的组合比单独的PBMC更有效地杀伤RAJI。即使PBMC与RAJI细胞的比例为2:1，PBMC加CTV-1的组合也明显优于单独的PBMC。此外，具有CTV-1的PBMC示出比具有低剂量IL-2和IL-15组合的PBMC更高的裂解。但是，数据展示，PBMC与CTV-1以及低剂量IL-2和IL-15的组合产生的RAJI细胞杀伤最大。尽管该实验是在体外进行的，但我们认为CTV-1(具有或不具有IL-2和IL-15)将对NK细胞的体内致敏有效。
另外，通过添加极少量的能促进NK细胞功能/健康的炎性因子(IL2和IL15)，与单独的CTV1细胞或单独的细胞因子相比，对RAJI细胞的杀伤显著更高。
尽管在整个披露中使用CTV-1肿瘤细胞，但本发明并不旨在限于CTV-1细胞。该方法可以实施任何导致NK细胞致敏的肿瘤细胞或其片段。因此，可以辐射第一肿瘤细胞并将其引入患者体内进行NK细胞的体内致敏，并且随后可以将已致敏的NK细胞呈递给第二肿瘤细胞以进行裂解。本领域技术人员将理解本发明的这些和其他方面。
因此，披露了一种用于体内致敏自然杀伤细胞的方法。
在一方面，本发明包括引入致敏肿瘤细胞制剂(PTCP)以体内接触静息NK细胞(rNK)；其中rNK细胞与PTCP的体内接触诱导了rNK细胞向已致敏的NK细胞(pNK)的变化，也就是说，这样实现了NK细胞致敏。一旦处于已致敏状态，那么pNK细胞就可以与宿主中的癌细胞接触以接受额外的信号传导，借此可使pNK细胞“活化”以开始颗粒胞吐来裂解癌细胞。
rNK细胞可位于外周血中。
一旦rNK细胞被致敏，它就可以在持续时间内独特地维持在致敏状态。因此，可以称pNK细胞是记忆性的已致敏的NK细胞，并且不需要随后或连续暴露于PTCP来维持致敏状态。
根据一个实施例的PTCP的一个实例包括可商业获得的CTV-1细胞系的衍生物，例如来自德国DSMZ(www.dsmz.de)的细胞系ACC40。据称CTV-1是1982年由一名罹患急性单核细胞白血病(AML M5)的40岁男性复发时的外周血建立的。它是一种展现出特异性配体(“信号1”)的罕见癌细胞系，该配体能够进行rNK细胞上的信号1致敏受体的连接，但CTV-1细胞缺少传导触发受体信号(“信号2”)的特定配体。最近，分离出了一种CD-56阴性(CD56-)CTV-1亚群细胞系，并进行了体外实验。实验结果表明，CTV-1提供了致敏rNK细胞的信号的组合。对所得的CD56-CTV-1致敏的pNK细胞进行了研究，并证实脱落CD16。相反，细胞因子致敏的NK细胞，例如IL-2和/或IL-15，没有脱落CD16。而且，示出所得的CD56-CTV-1致敏的pNK细胞下调NKG2D和NKP46并上调CD69。因此，CD56-CTV-1细胞可以形成PTCP的一部分，具体地在通过辐射或化学灭活进行灭活之后。
在一些实施例中，可能理想的是将一种或多种细胞因子(例如IL-2、IL-15和已知与NK细胞分化有关的其他细胞因子或其组合)与CD56-CTV-1细胞组合以形成增强的PTCP。
PTCP的给予可以通过外周血给予来完成。
虽然描述了CTV-1细胞系，但应理解，可以类似地实施其他PTCP，以便提供配体的组合并将其引入rNK细胞的致敏受体，该受体可以包括受体CD2、LFA-1、NKG2D、2B4和DNAM-1。其他PTCP平台可以包括使用例如SEM细胞或其他已证实在细胞表面具有致敏配体(信号1)但不具有触发配体(信号2)的癌细胞。
可能优选的是在PTCP上实施MHC 1类分子的基因敲除，其中PTCP包括MHC 1类分子的表达。基因策略可以包括TALEN或CRISPR基因编辑技术的实施。
在某些实施例中，使用PTCP实施致敏配体ICAM-1以进行rNK细胞的LFA-1受体的连接。在一个优选的实施例中，PTCP包括在其表面上表达ICAM-1或ICAM-3中的一种或多种的完整肿瘤细胞。
在某些其他实施例中，使用PTCP实施致敏配体CD15、CD58、CD48和CD59以进行rNK细胞的CD2受体的连接。在一个优选的实施例中，PTCP包括在其表面上表达CD15、CD58、CD48和CD59中的一种或多种的完整肿瘤细胞。
在某些其他实施例中，使用PTCP实施致敏配体MICA和/或MICB(主要组织相容性复合物(MHC)I类链相关)、ULBP1-3、PVR、Rae-1和H-60中的一种或多种，以进行rNK细胞的NKG2D和/或DNAM-1受体的连接。在一个优选的实施例中，PTCP包括在其表面上表达MICA、MICB ULBP、PVR、Rae-1和H-60中的至少一种的完整肿瘤细胞。
CD48也可以使用PTCP来实施，作为rNK细胞表面上2B4受体的配体，从而产生致敏活性。
在一个优选的实施例中，选择具有信号1配体但不具有信号2配体的一种或多种第一癌细胞系，例如CTV-1。进一步研究了该一种或多种第一癌细胞系，以识别细胞表面上是否存在所希望的NK细胞致敏配体，诸如上文列出的那些NK细胞致敏配体。选择该一种或多种第一癌细胞系中的一种用于形成NK致敏肿瘤细胞制剂(PTCP)。任选地对第一癌细胞系进行基因修饰，以敲除MHC I类分子，和/或敲入某些理想的基因。可以通过表型分化的选择性分离进一步纯化第一细胞系，例如，可以分离CTV-1的CD56-变体以获得同质亚群。所选择的亚群PTCP可以使用已知技术规模化，并随后进行辐射以防止在人类宿主体内增殖。然后将PTCP引入人类宿主，在该宿主中PTCP诱导rNK细胞成为pNK细胞，其中pNK细胞适配为攻击和杀伤rNK抗性肿瘤细胞(其为pNK易感，因为pNK细胞被致敏而具有致敏信号1活性)。
在将PTCP引入人类宿主之前，PTCP可以通过在体外引入一种或多种细胞因子得以增强。在这方面，可以将PTCP引入IL-2和/或IL-15细胞因子，或者已知增强NK细胞中的肿瘤杀灭佐剂和受体的产生、下调或上调的其他细胞因子。
可使用抗体和/或其衍生物来结合和表达PTCP的细胞的膜表面上的配体。
在某些其他实施例中，PTCP可以如上所述产生，也就是说，用完整的第一癌细胞产生，并且可以使用已知的搅拌和其他技术消融PTCP的细胞以制备膜制剂，其中第一癌细胞的细胞膜片段形成配体和佐剂的混合物，从而形成PTCP。
工业应用性
本披露涉及用于治疗癌症和其他感染性疾病的方法。

Claims (11)

1.一种用于致敏NK细胞的方法，该方法包括使这些NK细胞与致敏肿瘤细胞制剂(PTCP)体内接触的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中该PTCP包含完整的肿瘤细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中这些完整的肿瘤细胞在其表面上包含至少一种能够致敏NK细胞受体的致敏配体，该NK细胞受体选自下组，该组由以下组成：CD2、LFA-1、NKp46、2B4和DNAM。
4.如权利要求1所述的方法，其中该PTCP是经化学灭活的。
5.如权利要求1所述的方法，其中该PTCP包含细胞膜制剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中该细胞膜制剂包含至少一种能够致敏NK细胞受体的致敏配体，该NK细胞受体选自下组，该组由以下组成：CD2、LFA-1、NKp46、2B4和DNAM。
7.如权利要求1所述的方法，其中该PTCP包含经灭活的CTV-1骨髓性白血病细胞或其膜制剂。
8.如权利要求1所述的方法，其中在致敏过程中，CD69在这些NK细胞上的表达上调。
9.如权利要求1所述的方法，其中在致敏过程中，CD16的表达从这些NK细胞的表面脱落。
10.如权利要求2所述的方法，其中这些完整的肿瘤细胞在其表面上包含至少三种用于致敏这些NK细胞的致敏配体，这三种致敏配体包含来自下组的三种，该组由以下组成：
(i)能够致敏这些NK细胞的CD2受体的致敏配体；
(ii)能够致敏这些NK细胞的LFA-1受体的致敏配体；
(iii)能够致敏这些NK细胞的NKp46受体的致敏配体；
(iv)能够致敏这些NK细胞的2B4受体的致敏配体；以及
(v)能够致敏这些NK细胞DNAM受体的致敏配体。
11.如权利要求5所述的方法，其中该细胞膜制剂包含至少三种用于致敏这些NK细胞的致敏配体，这三种致敏配体包含来自下组的三种，该组由以下组成：
(i)能够致敏这些NK细胞的CD2受体的致敏配体；
(ii)能够致敏这些NK细胞的LFA-1受体的致敏配体；
(iii)能够致敏这些NK细胞的NKp46受体的致敏配体；
(iv)能够致敏这些NK细胞的2B4受体的致敏配体；以及
(v)能够致敏这些NK细胞DNAM受体的致敏配体。
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