CN101617056A - Eb病毒相关癌症的早期诊断方法及各自的试剂和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诊断与受试者中EB病毒(EBV)感染相关的癌症类型的方法，利用确定EBV基因负荷和一些分子标志物的基因表达谱，所述标志物是与EBV相关癌症相关的病毒和细胞来源的。

Description

EB病毒相关癌症的早期诊断方法及各自的试剂和试剂盒
发明领域
[0001]本发明涉及诊断与受试者中EB病毒(Epstein-Barr virus)感染相关的癌症的方法。发明利用了对一些分子生物标志的基因负荷(geneload)和基因表达谱(gene expression profiling)的确定，所述分子生物标志与EB病毒相关癌症相关。发明还涉及用于实施发明方法的试剂和试剂盒。
发明背景
[0002]EB病毒(EBV)是嗜淋巴细胞的人疱疹病毒，可以建立终身潜伏。在儿童时期，EBV感染通常是无症状的。然而，在青少年和成人中，EBV初次感染可导致自限性淋巴组织增生病、感染性单核细胞增多症(IM)。在EBV初次感染后，病毒存在于器官中，并终身通过唾液分泌。此外，在每10000个人外周B细胞中，约有1个潜伏存在所述病毒。在罕见的情况下，EBV感染可以导致所谓的X-连锁淋巴细胞增生综合征(XLP-综合征)或Duncan综合征，其与X染色体上的基因缺陷相关。
[0003]EBV在世界范围流行，约95％的成人群体对EBV为血清阳性。潜伏存在病毒的B细胞具有在细胞培养中发展成永生化细胞的能力，而这些细胞不受调控的增殖在体内通常受功能性细胞免疫的抑制。然而，在免疫抑制患者中，例如经历器官移植的患者，或感染HIV的患者，EBV感染的B细胞可以不受控制的增殖，从而导致B细胞淋巴瘤。
[0004]由于该刺激细胞增殖和使感染细胞永生化的性质，所述病毒与多种人类恶性病强烈相关，特征是高滴度的抗EBV抗体谱，和增加的循环EBV DNA水平。除上述在免疫抑制患者中的B细胞淋巴瘤外，EBV还与伯基特(Burkitt)淋巴瘤、鼻咽癌(NPC)和唾液腺癌强相关，还与霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤和胃腺癌较低程度的相关。然而，尚未完全阐述清楚EBV在上述恶性肿瘤的病因学中扮演的特定角色。
[0005]鼻咽癌(NPC)表现出世界范围内非常不均匀的地理分布。NPC是格林兰岛第二常见的肿瘤(31例/105居民/年)，是中国南部(app.42例/105居民/年)和东南亚，包括新加坡、香港、越南和印度尼西亚最常见的肿瘤。在北非也属常见，但是在其它国家则相对稀少(瑞典0.6例/105居民/年)。这一显著的、不均匀的癌症分布强烈地提示了，除了与EB病毒(EBV)证据充分的相关性以外，环境风险因子对遗传易感群体的作用。
[0006]示例性的病因学因子可包括生活方式，例如对咸鱼和一些草药中亚硝胺类的消费，和遗传因素，包括可遗传的，换言之，体细胞和外遗传改变。
[0007]在印度尼西亚，具有2.25亿人口的人种差异群体，NPC是最常见的耳-鼻-喉(ENT)肿瘤，在当地种群中具有高流行性，年度全面检验估算为6.2/100,000居民。目前，生活在苏拉威西岛上的当地种群证明了示例性的高发病率。在爪哇岛中部的日惹(Yogyakarta)，NPC是男性中最流行的肿瘤，是女性中第4流行的肿瘤，男性/女性比为2.4，分别构成两性中所有确诊恶性肿瘤的22％和8％。
[0008]在未分化NPC、发育不良性障碍、原位癌和转移组织的所有样本中，都可以检测到EBV DNA、RNA和蛋白质。已知在该肿瘤中表达6种EBV基因。在NPC中表达的一种此类蛋白质——LMP1，可以在体外转化已建系的啮齿类成纤维细胞和人上皮细胞(Wang等人，1985；Hu等人，1993)，因此被归类为癌基因。来自74例NPC的临床和随访数据显示，LMP1阳性的NPC比LMP1阴性的肿瘤生长更快，扩张更快(Hu等人，1995)。此外，显示所有的高等级发育不良性上皮障碍和侵袭性NPC中都存在EBV感染，而来自胎儿或正常成人的任何正常表皮中都不存在。
[0009]伯基特淋巴瘤在赤道非洲和新几内亚的约7至9岁儿童中具有高地方性发病率。约98％的这类地方性伯基特淋巴瘤在转化细胞中表现出EB病毒。在伯基特淋巴瘤的散发形态(主要出现在成人中)中，约25％的病例与EBV相关。
[0010]在上述所有的EBV相关疾病和癌症中，都可以验证病毒蛋白EBNA1的存在。发现EBNA1是对在细胞核中长期维持病毒基因组具有重要意义的DNA结合蛋白。
[0011]然而，肿瘤发生被认为是多步骤的过程，因此，即使在导致恶性肿瘤的事件中，EBV似乎是关键性因素的情况下，病毒相关肿瘤的发育和进展作为多步骤过程，仍很显然涉及次级细胞事件。在该过程中，基因(遗传的和外遗传的)和环境因子(包括EBV)扮演了决定性的角色。近年，不断增加的证据证实，肿瘤抑制基因(TSG)的失活和癌基因的活化是癌症发病和发展中的关键元件。这些基因可以分类到细胞周期调控、DNA损伤修复、凋亡、肿瘤侵袭和生长因子应答基因中。
[0012]近年，特别是外遗传的改变及其在肿瘤发展和进展中的作用已引起了关注。
[0013]外遗传改变发生于遗传材料的修饰，而非遗传材料本身。通过细胞分裂，外遗传改变也是可遗传的，在许多生理学和病理生理学病况中扮演了重要角色。研究显示，外遗传机制提供了“额外的”一层调控基因如何表达的转录调控。这些机制是细胞的正常发育和生长中的关键组件。已经发现，外遗传异常是癌症、遗传病症和儿科综合征的诱因，也是自身免疫病和衰老的促成因素。
[0014]在外遗传事件(例如甲基化、脱乙酰作用和染色质重建)中，启动子过度甲基化是得到最详细研究的，可以是癌症中肿瘤阻抑基因失活的主要机制。已知或候选的肿瘤阻抑基因的启动子过度甲基化涉及在不同的基础通路中，例如：凋亡、DNA损伤修复、细胞运动和迁移，据报道所述过度甲基化是不同类型的癌症中的早期事件。例如，在NPC中频繁观察到肿瘤阻抑基因的异常甲基化。
[0015]胞嘧啶DNA甲基化是DNA的共价修饰作用，其中，通过胞嘧啶(DNA-5)-甲基转移酶的家族，甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到胞嘧啶的C-5位。DNA甲基化几乎专一地发生在CpG核苷酸上，并且在基因表达调控和基因组中重复元件的沉默中具有重要的促成作用。
[0016]遍布整个基因组的CpG岛的广泛过度甲基化暗示，EBV中的甲基剂表型与恶性肿瘤相关。除了沉默肿瘤阻抑基因外，DNA甲基化还可以在维持肿瘤细胞中特定的EBV潜伏程序中发挥重要作用。因此，细胞转化可以涉及病毒和细胞基因的甲基化。
[0017]早期遗传改变，染色体3p的杂合性缺失(LOH)已在例如NPC的早期阶段，甚至在EBV潜伏感染前，就已经被频繁地鉴别出，并在其后无性系扩增(Chan等人，2000)。研究显示，在临床诊断前35个月，通过确定唾液中肿瘤阻抑基因p16和O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)的异常甲基化，可以诊断患鳞状肺细胞癌的患者。
[0018]到目前为止，对于不涉及颈部淋巴结的早期NPC患者，放射治疗仍然是主要的治疗选择。存活率是50％～80％。然而，发现超过70％的NPC患者涉及到部位淋巴结，10％的患者在确诊时表现出远处转移。早期诊断是主要因素，因为晚期诊断可以负面地影响治疗效果。
[0019]目前，NPC的诊断需要来自原发肿瘤位点或转移灶的活组织检查，用于通过EBER1/2原位杂交，进行组织病理学评估和证实EBV涉及。
[0020]虽然NPC患者比健康的EBV携带者具有更高的抗EBVEA/VCA IgA抗体滴度，并在患有原发或复发癌症的NPC患者的临床症状开始前，就可以发现升高的抗体滴度，该方法已用于对高发病地区的群体进行风险预测，但是低检测率和高假阳性率的结果导致该方法是不利的。
[0021]已推测循环的EBV DNA值可用于预后监控，但是由于肿瘤凋亡或坏死，即使在NPC患者中，血液中EBV DNA水平也是低的或阴性的。
[0022]重要地，虽然EBV对EBV相关癌症的发病是关键的，但它不是充分条件，因为肿瘤的发生涉及多个其它病原因素，具有多种过程和步骤。因此，仍然需要用于诊断早期EBV相关癌症，特别是NPC的方法，此类方法在这类癌症的诊断、后续疗法的选择和存活概率评估中将大有裨益。通过本发明提供的方法满足了该需求。
发明概述
[0023]本发明提供了诊断EB病毒(EBV)相关癌症的方法，通过确定EBV基因负荷和一些分子生物标志的基因表达水平，所述分子生物标志为例如与癌症相关的病毒和细胞来源。
[0024]在第一方面，发明涉及诊断受试者中EB病毒相关癌症的方法，包括从所述受试者收集生物学样品，通过确定EBNA1(EB核抗原1)基因负荷来确定所述生物学样品中的EB病毒的基因负荷量，并确定至少一个选自以下基因的基因的表达水平：EB病毒基因LMP1(潜伏膜蛋白1)和细胞基因RASSF1(ras相关结构域家族1A)、CHFR(具有fork-head相关和环指的限制点)和DAPK(死亡相关蛋白激酶)，并将所述生物学样品中确定的所述基因的表达水平与参照比较。
[0025]在发明方法的一个实施方案中，确定了EBNA1的基因负荷和选自以下基因的至少两个基因的表达水平，或至少三个基因的表达水平：EB病毒LMP1和细胞基因RASSF1、CHFR和DAPK，并将其与参照比较。
[0026]在发明的一个特定的实施方案中，确定了LMP1和RASSF1A的表达水平。任选的，还可以确定CHFR和/或DAPK的表达水平。
[0027]通过所述基因的外遗传状态，可以确定上文提示的标志物基因的表达水平。在这一点上，肿瘤阻抑基因RASSF1A、CHFR和DAPK的启动子过度甲基化是特别令人感兴趣的，因为这些基因的过度甲基化启动子区域导致降低或完全消除的基因产物的表达，从而丧失了这些基因产物的肿瘤阻抑功能。进一步地，EBV基因LMP1的甲基化状态也是主要的关注点，因为LMP1编码活化转录因子的蛋白质，并阻断凋亡，已与肿瘤发展和进展相关。
[0028]例如通过甲基化特异性PCR(MSP)，可以确定上述基因的甲基化状态。为了加快确定步骤，可以以多重甲基化特异性PCR(MMSP)的方式进行MSP。
[0029]在发明方法的一个实施方案中，用于确定EBV基因负荷的引物可以是考虑硫酸氢盐处理后(使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶)后核苷酸的改变而设计的，使EBV基因负荷也通过甲基化特异性PCR(MSP)的方式来确定。
[0030]为了通过PCR确定生物学样品中、或从此类样品分离和纯化的DNA中的EBNA1的基因负荷，可以使用适合该目的的寡核苷酸引物。用于进行发明方法的合适的上游(正义)引物可包括SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3中提出的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成，而合适的下游(反义)引物可包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中提出的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0031]为了通过甲基化特异性PCR来确定生物学样品或DNA(所述DNA分离或纯化自此类样品)中的LMP1、RASSF1、CHFR和DAPK(可同时存在或分别存在)各自的甲基化状态，每个基因可以使用一组引物，换言之，根据EBV相关癌症中所讨论的基因的预期甲基化状态，(分别)用于甲基化或未甲基化的基因。作为此类情况的示例性实例，可以使用例如：用于LMP1的未甲基化变体的引物组和/或RASSF1、CHFR和DAPK的至少一个的甲基化变体的引物组。可选的，可以使用两组寡核苷酸引物。两组寡核苷酸引物(正义和反义引物)都可针对甲基化或未甲基化的靶基因变体。每个基因的其它引物可以覆盖待检测基因的基因变异的罕见事件。在另一个替代方案中，两组寡核苷酸引物被使用，一组引物用于基因的甲基化变体，以及另一组引物用于未甲基化变体。此类方法通过使未甲基化的基因变体和甲基化的基因变体的检测信号相互关联，能够例如定量样品中的基因甲基化作用。
[0032]用于未甲基化的LMP1的示例性上游(正义)引物可包括SEQ IDNO：5和7提出的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。用于甲基化的LMP1的示例性上游(正义)引物可包括SEQ ID NO：23提出的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0033]用于未甲基化的LMP1的示例性下游(反义)引物可包括SEQ IDNO：6和8提出的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。用于甲基化的LMP1的示例性下游(反义)引物可包括SEQ ID NO：24提出的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0034]用于甲基化的RASSF1A、CHFR和DAPK的示例性上游(正义)引物可分别包括SEQ ID NO：9或11，SEQ ID NO：13或15，和SEQ IDNO：17或19提出的核苷酸序列，或分别基本由上述序列组成，或分别由上述序列组成。用于未甲基化的RASSF1A、CHFR和DAPK的示例性上游(正义)引物可分别包括SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29提出的核苷酸序列，或分别基本由上述序列组成，或分别由上述序列组成。
[0035]用于甲基化的RASSF1A、CHFR和DAPK的示例性下游(反义)引物可分别包括SEQ ID NO：10或12，SEQ ID NO：14或16，和SEQ IDNO：18或20提出的核苷酸序列，或分别基本由上述序列组成，或分别由上述序列组成。用于未甲基化的RASSF1A、CHFR和DAPK的示例性下游(反义)引物可分别包括SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30提出的核苷酸序列，或分别基本由上述序列组成，或分别由上述序列组成。
[0036]用于比较选定基因的测定表达水平或外遗传状态的参照，可以是正常(健康)组织例如正常的上皮细胞，或任何其它参照组织。因此，所述参照组织可以是由非EBV-感染的细胞组成的非癌组织，例如非EBV感染的上皮细胞。参照组织可以源自被收集生物学样品的受试者，或者源自任何其它适当的来源，例如未遭受EBV感染或EBV相关癌症的受试者，或非EBV-感染的细胞系，例如非EBV感染的上皮细胞系。可选的，EBV相关肿瘤组织或细胞系，例如Namalwa BL细胞系，可以提供阳性对照。
[0037]可以直接分析生物学样品，或者可以分离和纯化样品中含有的DNA，然后进行发明的方法。在一个实施方案中，分离和纯化的DNA是基因组DNA。
[0038]为了确保样品DNA的质量，发明的方法还可以利用测定对照基因的存在或量。该对照基因可以是任何合适的持家基因，例如肌动蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。
[0039]如果对照基因是肌动蛋白，且测定方法是PCR，则合适的引物可包括SEQ ID NO：21(正义)和SEQ ID NO：22(反义)提出的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0040]从其中获得生物学样品的受试者可以是哺乳动物，例如但不限于人、小鼠、大鼠、狗或猫。
[0041]可以利用本发明的方法诊断的EBV相关癌症的示例性实例包括但不限于B细胞淋巴瘤，例如在免疫抑制患者中，伯基特淋巴瘤，包括地方性的和散发性的形式，鼻咽癌(NPC)、唾液腺癌、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴瘤、AIDS-相关的淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤，例如免疫抑制患者中的致死性中线肉芽肿、胃腺癌和平滑肌肉瘤，和一些良性肿瘤例如口腔毛状白斑。虽然并非所有上述EBV相关癌症都可以表达本发明中公开的所有标志物基因，但它们可以通过使用合适的标志物子集来诊断。例如，伯基特淋巴瘤不表达LMP1。然而，根据发明的方法，通过利用本文中公开的其它标志物基因，仍然可以诊断。
[0042]在另一个方面，本发明涉及寡核苷酸引物，所述引物包括SEQ IDNO：1-30的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0043]在另一个方面，本发明涉及修饰DNA分子的方法，其中，DNA分子被变性，与液体琼脂糖混合，滴入冷冻的液体中形成琼脂糖珠，具有含有变性DNA分子的琼脂糖珠，其中，获得的琼脂糖珠随后经过下文的修饰和纯化步骤(参见下文第0119段)。
附图说明
[0044]当与非限制性实施例和附图联合考虑时，根据详细的说明书可以更好的理解本发明，所述附图中：
[0045]图1通过直接比较单MSP获得的结果，证实了多重MSP的可行性。使用的生物学样品是Namalwa细胞系，一种表达EBNA1和LMP1的EBV阳性的伯基特淋巴瘤细胞系，每个细胞含有一拷贝的EBV基因组DNA(所述细胞可以自例如美国典型培养物收藏中心(ATCC)获得)。对这些细胞进行MMSP或单MSP，使用特异性针对所提示的标志物基因的引物。然后在琼脂糖凝胶上分析获得的PCR片段。来自MMSP的所有条带的密度都与单MSP之一相对应，表明MMSP的反应条件对每个基因都是最优化的，最大地降低了引物之间的竞争。
[0046]图2显示了多个样品的琼脂糖凝胶电泳的结果，证实了MMSP的灵敏度。通过对EBV DNA负荷(load)的半定量评估，和通过对持家基因肌动蛋白的评估，使用Namalwa细胞作为参照用于样品DNA输入。连续稀释与待分析的Namalwa细胞数相应的DNA量，并将其用于MMSP。如图中所示，该测定中的灵敏度相当于从105EBV阴性细胞中检测多达2个细胞。在MMSP扩增后，可以清楚的证实所有选定标志物基因的条带。
[0047]图3示例了由已知的NPC细胞系的MMSP获得的结果。C15表示具有表达LMP1的NPC的裸鼠。如Western印迹和免疫染色分析验证的，C666-1是EBV阳性的，但是不表达LMP1的细胞系。其余的是EBV阴性的NPC细胞系。可以在C15中检测到EBNA1和LMP1，在C666-1中检测到EBNA1。
[0048]图4显示了来自活组织检查和石蜡处理的NPC(paraffin NPC)的MMSP结果。5FB、9FB和18FB表示来自NPC的活组织检查样品，而56par.、58par.、60par.、63par.表示石蜡处理的NPC样品。C15表示来自具有表达LMP1的NPC的裸鼠的样品，H2O表示阴性对照。
[0049]图5显示了在石蜡处理的NPC样品(par.)和刷的(brush)NPC样品(brush)之间的MMSP结果的比较。C15表示来自具有表达LMP1的NPC的裸鼠的样品，Namalwa表示Namalwa细胞样品(EBV阳性的伯基特淋巴瘤细胞系，其表达EBNA1和LMP1)。H2O表示水对照。
发明的详细描述
[0050]本发明的一个目标是提供用于不同EBV相关肿瘤的早期诊断和预后的工具。
[0051]为了实现这一目标，发明提供了确定样品中肿瘤特异性甲基化模式的方法。可以从接近原发肿瘤的体液中收集样品，例如来自肺癌患者的唾液、来自膀胱癌或前列腺癌患者的尿液、来自鼻咽癌(NPC)患者的鼻咽拭子(swab)和漱口液(mouth washing fluid)。然而，也能够使用血样检测，即使使用血样可导致相当非特异性的信号。方法能够对不同标志物的表达水平和模式进行半定量评估，所述标志物来自可以通过非侵入方法获得，且可以简单、快速收集的材料。
[0052]在示例性的方法中，为了设定生物标志组，研究了NPC的分子基础，所述生物标志组可用于诊断和监控NPC的疗效。
[0053]实施该方法，令人惊讶的发现在NPC样品中存在一些基因，与正常鼻咽上皮样品相比，其在NPC中的表达水平显著地改变了，所述基因包括EBV编码基因和细胞基因。基于这些发现，设定了多达6个标志物的组(来自EBV的2个基因，来自细胞的3个和用于内部质量控制的1个)，可用作肿瘤的早期检测或疗效的监控。
[0054]因此，在第一个方面，本发明针对诊断受试者中EB病毒相关癌症的方法，包括从所述受试者中收集生物学样品；通过确定EBNA1基因负荷和至少一个下述基因的表达水平，来确定所述生物学样品中EB病毒基因负荷的量(所述基因选自EB病毒基因LMP1和细胞基因RASSF1A、CHFR和DAPK)，以及将所述生物学样品中所述基因的确定的表达水平与参照比较。
[0055]通常以非侵入式的方式进行本发明的方法，例如，通过使用体液作为生物学样品，例如漱口液或鼻咽拭子/刷子。然而，生物学样品也可以是血液或组织样品。
[0056]EBV相关癌症可以是任何与EB病毒感染相关的恶性肿瘤。从而其可以包括鼻咽癌(NPC)、伯基特淋巴瘤、唾液腺癌、霍奇金淋巴瘤、在免疫抑制患者(例如在器官移植、HIV感染或化疗后)中发生的其他B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤例如致死性中线肉芽肿、胃腺癌、在免疫抑制受试者中的平滑肌肉瘤。还包括与EBV相关的良性肿瘤，例如口腔毛状白斑。
[0057]在一个示例性实施方案中，发明的方法用于在受试者中诊断NPC。
[0058]通过选择合适的标志物基因例如EBNA1，并确定每个细胞的所述基因的拷贝数(例如通过半定量PCR)，来确定EBV基因负荷。为了计算基因负荷，可以与参照比较所获得的结果，所述参照例如具有定义的每个细胞的EBV基因组拷贝数的细胞系。此类细胞的特定实例是Namalwa细胞系，其来自人伯基特淋巴瘤，并具有单个EBV基因组拷贝/细胞。
[0059]EBNA1是EB核抗原1的缩写，在本发明的上下文中用于表示编码所述蛋白质的基因。EBNA1的基因产物对病毒维持是关键的，并且对人原代B淋巴细胞的生长转化具有重要影响，因为它参与潜伏的EB病毒基因组的复制、分离和转录激活，避免蛋白酶体处理和细胞表面呈递。所述EBNA1蛋白通过隔离关键性的调控蛋白，来影响细胞事件。因此，EBNA1是在几乎每一个EBV感染细胞中表达的基因，从而适合用于确定EBV基因负荷，所述EBV基因负荷与EBV-相关癌症的临床过程和预后，及其转移的倾向相关，从而可以在治疗过程中得到监控。
[0060]在通过任何合适的核酸扩增方法(例如PCR技术)确定给定样品中的EBNA1基因负荷的情况下，可以使用本发明中提出的寡核苷酸引物组。本发明公开的、用于确定样品中的EBNA1基因负荷的寡核苷酸引物包括SEQ ID NO：1-4提出的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成，其中SEQ ID NO：1和3表示上游引物，即正义引物，而SEQ ID NO：2和4表示下游引物，即反义引物。此外，SEQ ID NO：1-4提出的核苷酸序列的互补序列、变体和片段也是本发明所预期的。
[0061]可以通过本领域技术人员已知的任何合适方法确定标志物基因LMP1、RASSF1A、CHFR和DAPK的表达水平。此类方法可包括Northern印迹、Western印迹和核酸扩增技术，例如TMA(转录介导的扩增)和PCR。在发明的一个实施方案中，确定了标志物基因的外遗传状态，例如甲基化状态。
[0062]可以通过使用任何合适的方法确定甲基化状态，例如但不限于：甲基化敏感的DNA限制性酶、甲基化特异性的核酸探针和甲基化特异性的聚合酶链式反应(MSP)。用于执行本发明特别有效的是MSP技术。甲基化特异性PCR(MSP)是基于亚硫酸氢盐转换的PCR技术，用于研究DNA CpG甲基化作用。对于MSP实验，特异性针对甲基化DNA(M，M引物)和/或针对未甲基化DNA(U)的寡核苷酸引物对是必需的。为了实现对甲基化和未甲基化DNA的区分，每条引物序列(或至少一对中的一条)都包括一个或多个CpG位点。首先，用亚硫酸氢钠修饰DNA并纯化。用亚硫酸氢盐处理DNA使所有未甲基化的胞嘧啶(C)都转变成尿嘧啶，因此，它们与鸟苷(G)的Watson-Crick碱基配对现在成为与腺苷(A)配对。根据检测的下述靶区域设计所使用的引物对，靶区域具有甲基化C(在相应的互补位置具有G)(M引物)，或靶区域具有已经转化为U的未甲基化C(在相应的互补位置具有A)(U引物)。然后，利用M引物对和/或U引物对实施PCR反应。用M对和/或U对进行成功的扩增分别提示了甲基化和未甲基化。
[0063]除了单个甲基化特异性PCR反应外，可以同时用不同的引物和不同的靶实施多个此类反应，只要所获得的扩增PCR片段是可区分的，所述区分反过来可以通过适当的引物设计实现的。此类测定被称为多重甲基化特异性PCR(MMSP)。
[0064]MMSP技术具有的优势是，可以在单次反应中评估多个靶基因的甲基化状态。因此，该方法降低了对样品的DNA需求和在PCR扩增过程中的引物竞争。
[0065]EBV蛋白LMP1(潜伏膜蛋白1)对EBV使B淋巴细胞永生化是绝对必需的，在大部分NPC和一些EBV相关肿瘤中表达。它是EBNA2的直接靶标，对潜伏感染的细胞的存活和增殖是关键的。对缺失变体的研究已显示，LMP1蛋白的跨膜结构域和信号传导结构域对它的转化性质是必需的。LMP1蛋白具有约62kDa的分子量，长386个氨基酸，具有N端186个氨基酸(形成跨膜结构域)，和C端200个氨基酸(形成胞质信号传导结构域)。跨膜结构域由6个跨膜区组成，通过介导多聚化的短环状区域连接。LMP1蛋白多聚化导致独立于配体结合的组成型地活化的信号传导复合体。虽然缺乏与肿瘤坏死因子受体(TNF-R)家族成员的序列同源性，LMP1具有与这类蛋白的许多功能相似性。同样地，LMP1通过其C端活化区1-3(CTAR 1-3)与多种蛋白相互作用，所述蛋白是TNF-R家族蛋白相互作用的蛋白，包括TRAF1、2、3和5，TRADD和RIP。基于与这些蛋白质的结合，激活了经典的和非经典的NFκB信号传导通路。此外，活化了Jak-STAT通路和MAP激酶p38JNK和ERK。通过这些信号传导通路，LMP1诱导了活化和附着标志物的表达，例如C54、II类MHC、CD23、CD95和CD86，及抗凋亡蛋白的表达，例如Bcl2、BclX和A20。LMP1是直接的癌基因潜力得到证实的唯一的EBV病毒蛋白。因此，已经在一些EBV相关的恶性肿瘤中发现了LMP1的表达。LMP1蛋白表达的水平强烈依赖LMP1的甲基化状态。在许多EBV相关癌症中发现未甲基化形态下，LMP1蛋白是组成型表达的。相反，在通常不含有EBV基因组的正常组织中，或者在非致瘤性EBV感染组织中，没有发现LMP1蛋白表达，后者中LMP1通常是甲基化的。
[0066]因此，LMP1基因的甲基化状态在EBV相关的恶性肿瘤的诊断中具有高重要性。
[0067]可以利用寡核苷酸引物，通过甲基化特异性PCR(MSP)确定未甲基化LMP1基因的存在或量，所述引物包括SEQ ID NO：5或7(上游，正义)和SEQ ID NO：6或8(下游，反义)中提出的核苷酸序列及其互补序列、变体和片段，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0068]RASSF1A(Ras相关结构域家族1A)蛋白是由RASSF1A编码的细胞肿瘤阻抑制子，通过抑制细胞周期的G1/S期进程起作用。RASSF1A蛋白已经表现出与Ras GTP结合蛋白Nore-1的结合，与其作为Ras原癌基因的负调节物的角色一致(Ortiz-Vega等人，(2002)Oncogene21(9)：1381-1390)。根据通过启动子甲基化导致RASSF1A失活的高频率，已推断它在多种原发性人肿瘤的发展中扮演了关键性的角色。然而，RASSF1A作用的机制仍然是未知的。RASSF1A还与微管相关联，已表现出该关联对RASSF1A介导其生长抑制效应是关键的。RASSF1A的过表达促进了稳定微管的形成，而RASSF1A的显性负片段则使微管网络去稳定化。由于RASSF1A定位在有丝分裂纺锤体上，阻断被活化的Ras-诱导的基因组不稳定性，因此它还涉及影响基因组的稳定性。因此，目前认为RASSF1A在控制微管聚合作用中，并可能在维持基因组的稳定性中发挥作用(Vos等人，(2004)Cancer Research 64：4244-4250)。
[0069]在本发明的一个实施方案中，可以利用寡核苷酸引物，通过甲基化特异性PCR，确定RASSF1A基因的启动子过度甲基化，所述引物包括SEQ ID NO：9或11(上游，正义)和SEQ ID NO：10或12(下游，反义)中提出的核苷酸序列及其互补序列、变体和片段，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0070]CHFR(具有fork-head相关的和环指的限制点(Checkpoint withfork-head associated and ring finger))是涉及细胞周期调控的细胞肿瘤阻抑制子。CHFR是泛素连接酶，也是新的有丝分裂关卡中的关键组件，所述有丝分裂关卡在分裂前期起作用，在应答有丝分裂胁迫时延迟染色体凝聚(Scolnick和Halazonetis(2000)Nature 406(6794)：430-5)。通过限制点机制监控细胞周期进程，从而确保基因组的完整性，和姐妹染色单体分离的保真性。此类限制点功能的失效导致基因组的不稳定性，这是使细胞易于向瘤性转化和肿瘤进展的条件。在人细胞中，对于延迟前期CHFR似乎是必需的。虽然在正常组织中，CHFR是遍在表达的，其在人类癌症中频繁地下调，主要是由于它的启动子区域的过度甲基化作用。大部分的人食道癌都缺失了CHFR基因的表达(Shibata等人，(2002)Carcinogenesis23(10)：1695-1700；Toyota等人，(2003)PNAS 100(13)：7818-7123；Yu等人，(2005)Nature Genetics 37(4)：401-406)。
[0071]在本发明的一个实施方案中，可以利用寡核苷酸引物，通过甲基化特异性PCR来确定CHFR基因的启动子过度甲基化，所述引物包括SEQID NO：13或15(上游，正义)和SEQ ID NO：14或16(下游，反义)中提出的核苷酸序列及其互补序列、变体和片段，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0072]DAPK(死亡相关蛋白激酶)是细胞肿瘤阻抑制子。DAPK是Ca2+/钙调蛋白-依赖的、细胞骨架相关的蛋白激酶，它的表达涉及细胞对TNFα和干扰素-γ的凋亡效应的灵敏度。缺失钙调蛋白结合结构域导致组成型活性的突变体，具有更强的细胞毒性效应。相反，催化失活的突变体产生显性负调控效应，降低了细胞毒性，并保护细胞免受干扰素-γ诱导的细胞死亡。在人类癌症和B-细胞白血病中频繁的缺失DAPK表达，并且较低的表达水平与高的转移率相关联。在B-细胞恶性肿瘤、头颈癌和其他实体肿瘤中注意到了高频的死亡相关蛋白激酶(DAPK)启动子过度甲基化作用，从而在分子检测方案中将其作为肿瘤标志物使用(Reddy等人，(2003)Cancer Research 63：7694-7698)。
[0073]在本发明的一个实施方案中，可以利用寡核苷酸引物，通过甲基化特异性PCR来确定DAPK基因的启动子过度甲基化，所述引物包括SEQID NO：17或SEQ ID NO：19(上游，正义)和SEQ ID NO：18或20(下游，反义)中提出的核苷酸序列及其互补序列、变体和片段，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0074]此外，在另一个实施方案中，可以分别确定LMP1基因的甲基化形态和RASSF1A、CHFR和/或DAPK基因的未甲基化形态或上述以外的其它情况(or in addition to the above)。如果确定了基因的甲基化和未甲基化形态，两种信号都可以与确定样品中的基因甲基化程度相关。用于确定甲基化LMP1的合适引物包括SEQ ID NO：23(上游，正义)和SEQ IDNO：24(下游，反义)中提出的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。为了确定未甲基化的RASSF1A、CHFR和/或DAPK，可以使用的引物分别包括SEQ ID NO：25、27和29(上游，正义)和分别包括SEQ ID NO：26、28和30(下游，反义)中提出的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0075]如上所述，在一个实施方案中，发明方法涉及确定EBNA1基因负荷和EBV癌基因LMP1的甲基化状态。
[0076]此外，可以确定细胞肿瘤阻抑基因RASSF1A的甲基化状态。
[0077]任选的，还可以确定细胞肿瘤阻抑基因CHFR和DAPK的甲基化状态。
[0078]在一个实施方案中，通过PCR实施对基因负荷和表达水平的确定，所述PCR例如MSP或MMSP。
[0079]在确定步骤前，可以从生物学样品中分离和纯化DNA，然后用于不同的确定技术。分离和纯化的DNA可以包括病毒和细胞的DNA，也可以是基因组DNA。用于从样品中分离DNA或基因组DNA的合适的方法和规程对技术人员是已知的，用于实施DNA分离和纯化的试剂盒是可商购的。
[0080]为了具有检查(内参)分离的DNA的质量足以执行表达水平或EBNA1基因负荷的确定，可以伴随地确定对照基因。合适的对照基因是细胞的所有的持家基因(持家基因通常是组成型基因，以相对恒定的水平转录)，例如肌动蛋白、泛素或GAPDH。在DNA制品中缺少此类持家基因表示DNA制品的质量(纯度)不适合执行本文描述的诊断方法。
[0081]在对照基因是肌动蛋白，且确定方法是PCR技术的情况下，用于检测肌动蛋白的合适的寡核苷酸引物可以包括SEQ ID NO：21(上游，正义)和SEQ ID NO：22(下游，反义)中提出的核苷酸序列，及其互补序列、变体或片段，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0082]为了评估所获得的结果，可以和参照比较选定的标志物基因的表达水平。该参照可以是正常的组织，即，非癌组织，优选的是与生物学样品相同的组织类型。参照可以源自自其中收集生物学样品的受试者，或任何其它合适的来源，例如来自另一个供体的健康组织或培养的细胞。如果目的基因的表达水平超过了一定值，例如，与参照样品比较的预定阈值，则认为基因的表达水平改变。根据选定基因的生物学功能，与参照样品相比，表达水平可以增加或降低。
[0083]在本上下文中，LMP1蛋白表达的水平，例如强烈的依赖于LMP1基因的甲基化状态。在一些EBV-相关癌症中发现的未甲基化形态中，LMP1蛋白是组成型表达的。相反，在正常(健康)组织中没有发现LMP1蛋白表达，其中通常是EBV基因组阴性的，或其中LMP1基因启动子通常是甲基化的。
[0084]与病毒癌基因LMP1相反，细胞肿瘤阻抑基因RASSF1A、CHFR和DAPK在正常(健康)细胞中通常是组成型表达的。基于基因的过度甲基化，特别是启动子区域，这些基因的表达降低或丧失，在受影响的细胞中不再发现其基因产物。因此，在许多癌症中发现消失或降低的RASSF1A、CHFR和/或DAPK蛋白表达。
[0085]如上文有所描述，可以通过与参照比较所获得结果，来确定基因负荷，所述参照具有定义的EBV基因负荷。此类参照可以是来自具有定义的EBV基因负荷的细胞系的细胞，例如Namalwa细胞。
[0086]从其中收集生物学样品的受试者可以是哺乳动物，特别是人类。
[0087]在一个实施方案中，NPC样品获得自刷子或漱口剂，它来自经过的肿瘤细胞，并且通过化学品修饰肿瘤DNA，然后通过经由单次反应的甲基化和未甲基化特异性PCR扩增。该设计能够降低来自珍贵的样品的DNA量，并降低PCR扩增过程中的引物竞争。在该实施方案中，可以使用肌动蛋白标志物作为内部的DNA质量对照。Namalwa细胞可以作为对照用于系统性工作条件，也作为参照用于半定量控制EBV DNA负荷。然后可以评估NPC相关基因的“表达”模式，用于早期检测/预后。该方法是在临床实验室中待使用的简单易行的方法。
[0088]本文中描述的方法不仅具有用于诊断的价值，而且还可用于监控癌症的治疗。从而，方法可以产生用于从分子基础进行肿瘤分类的新基准，开启了多种创新的诊断、预防和治疗方案。因此，从发明的方法获得的结果可以在开发用于EB病毒-相关癌症的治疗或预防方案中使用。
[0089]在另一个方面，本发明涉及用于执行发明的方法的试剂。此类试剂能够确定EBNA1的基因负荷，和/或LMP1、RASSF1A、CHFR和DAPK中任一个的表达水平。适合通过核酸扩增技术，用于确定EBNA1的基因负荷，和/或选自LMP1、RASSF1A、CHFR和DAPK中基因的表达水平的示例性试剂可以是寡核苷酸引物。这些引物可以包括SEQ ID NO：1-20和23-30中提出的核苷酸序列，及其互补序列、变体和片段，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0090]在另一个方面，本发明涉及用于执行发明的方法的试剂盒。因此，本发明的特征还在于用于诊断受试者的EBV-相关癌症的试剂盒，包括至少一种用于确定EBV基因负荷的试剂(例如通过确定EBNA1基因负荷)，和至少一种用于确定标志物基因的表达水平的试剂，所述标志物基因选自EBV基因LMP1和细胞基因RASSF1A、CHFR和DAPK。
[0091]发明的试剂盒还可以包括用于确定参照基因的表达的试剂。
[0092]在发明的一个实施方案中，试剂盒包括的试剂是寡核苷酸，优选的寡核苷酸引物对。所述寡核苷酸可包括SEQ ID NO：1-30中提出的核苷酸序列的任一种，及其互补序列、变体和片段，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
[0093]因此，在一个实施方案中，发明的试剂盒包括用于确定EBNA1基因负荷的寡核苷酸引物对，和至少一种用于确定标志物基因的表达的其他引物对，所述标志物基因选自LMP1、RASSF1A、CHFR和DAPK。
[0094]此外，试剂盒还可以包括其它试剂，例如缓冲剂、溶剂和用于检测表达水平的化合物，例如核酸聚合酶或用于Western印迹的抗体。
[0095]到目前尚未说明，本文中使用的术语和表述具有以下含义。
[0096]关于核酸的“片段”，涉及给定核苷酸序列的3’和/或5’截短形式。此类片段包括例如这样的核酸，所述核酸与全长对应物相比，在其3’和/或5’端短一个或多个核苷酸。优选的，这些片段具有足以保留全长版功能的长度，即，在用于核酸扩增的寡核苷酸引物的情况下，此类片段优选的具有至少9个核苷酸的长度，更优选的至少12，最优选的至少15个核苷酸。
[0097]关于核酸的术语“变体”，指化学修饰的核酸，例如自给定的核苷酸序列衍生的主链修饰的核酸或突变核酸。突变体可以包括一种或多种碱基取代，然而优选的保留了原始核酸分子的功能。因此，优选的变体与原始核酸具有至少70、75、80％，更优选的90％，最优的95％的核苷酸序列同一性。碱基取代可以包括任何天然存在的标准碱基A、G、T、C和U，但也可以包括其他碱基。化学修饰可以存在于碱基、糖部分或磷酸主链，并可以改变核酸分子的性质，例如关于它的稳定性。
[0098]“互补”涉及核酸分子通过公认的Waston-Crick碱基配对，与另一个核酸分子碱基配对的性质。因此，“互补序列”是可以通过Waston-Crick碱基配对，和给定的核苷酸序列杂交的核酸。
[0099]“基因”是基因组DNA的一部分，其编码多肽。
[00100]“表达产物”是基因表达的产物，包括转录产物即mRNA，和翻译产物，即多肽。
[00101]本文中使用的“表达水平”涉及基因转录的程度。可以通过任何合适的方法学，确定本发明中的表达水平，例如，通过Northern印迹、转录-介导的扩增或其它已知技术，来确定特定mRNA的存在或量。还可以通过确定编码蛋白质的存在来确定表达水平，例如通过使用Western印迹、免疫染色、免疫沉淀或其它已知的技术。如本发明中公开的，还可以通过评估基因的外遗传状态，直接确定表达水平。启动子过度甲基化提示表达水平是低的或实质上不存在的，而未甲基化的启动子区域提示目的基因是表达的。通过RT-PCT(mRNA)或Western印迹(蛋白质)，或通过甲基化特异的PCR(DNA片段)显示，特定基因的启动子的甲基化程度与基因表达水平相关。
[00102]本文中使用的“外遗传”状态涉及通过细胞分裂可遗传的遗传材料的修饰作用，在多种生理学和病理生理学病况中扮演重要角色。外遗传机制提供了“额外”一层调节基因如何表达的转录调控。这些机制是细胞的正常发育和生长中关键性的组件。在外遗传事件例如甲基化、脱乙酰作用和染色质重建中，已研究最详细的是启动子过度甲基化。
[00103]本文中使用的“甲基化”或“DNA甲基化”主要涉及CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5-位甲基化，所述二核苷酸可聚集成簇，其被称为CpG岛。因此，甲基化基因包括5-甲基化胞嘧啶，其主要位于启动子区或该基因的外显子1中，而未甲基化的基因缺乏这些在胞嘧啶上的额外甲基化岛。
[00104]“肿瘤阻抑制子”是在细胞增殖或凋亡的调控中涉及的基因或基因产物。在基因突变丧失其功能或缺失的情况下，细胞丧失了基础的调控机制，所述机制通常帮助调节细胞生长、细胞增殖或凋亡，从而有助于防止细胞转化。因此，在肿瘤中常见肿瘤阻抑基因的失功能突变。
[00105]“癌基因”是促进细胞转化的基因。此类原癌基因可以是病毒来源的，或可以源自组成型激活的细胞原癌基因，例如通过活化突变。已经提示，大量癌基因和细胞原癌基因在癌症的发展和进展中扮演重要角色。
[00106]本发明中使用的“基因负荷(gene load)”涉及细胞或含有细胞的样品中的某一基因或基因组的拷贝数，特别是EBV基因组。换言之，表述“基因负荷”指细胞或生物学样品中，某一基因的量，例如EBV基因EBNA1。所述量可以定性地确定，即，通过确定它比参照样品的量更高、相等或更低；或定量地确定，例如通过与具有定义的拷贝数的参照比较，计算目的基因的拷贝数。如本文中使用的，确定基因负荷还可以包括检测基因的存在或缺失，所述基因例如EBNA1。在过去几年中，发现病毒DNA负荷是后续临床事件的良好预兆剂(prognosticator)(Tan等人，(2006)BMCCancer 6：227)。
[00107]本文中示例性描述的发明可以适合在缺少任何一种或多种元件或一种或多种限制的条件下实践，不特别限于本文公开的内容。因此，例如术语“包括”、“包含”、“含有”等，应该理解为广泛地，不带限制的。此外，本文中使用的术语和表述是作为说明而非限制的术语使用的，此类术语和表述的使用没有任何意图排除所示和所描述特征的任何等价方式或其部分，应认识到在发明要求保护的范围内存在不同的修饰。因此，应该理解，虽然本发明特定的公开了优选的实施方案和任选的特征，但是本领域熟练的技术人员可以借助本文公开的发明的修饰和变化，从而此类修饰和变化也认为在本发明的范围内。
[00108]本文已经广泛的、普遍的描述了发明。每种落入普遍公开内容内的更小的种类和亚属也构成发明的一部分。其包括具有附加条件或负限制的发明的普遍描述，所述条件或限制是从所述属中去除任何主题，不论其是否是本文中特别叙述过的特定材料。
[00109]根据下列示例性实例和权利要求，发明的其它特征和优势将更显而易见。应该理解，实施例仅出于示例性的目的，不应该理解为对本发明范围的限制。
实施例
[00110]本研究中使用了CNE1、CNE2、TW03、C666-1和HONE1NPC细胞系。除C666-1外，细胞在37℃下，生长在含有10％胎牛血清和抗生素的IMDM培养基中，C666-1根据Cheung等人(Cheung等人，(1999)Int.J.Cancer 83(1)：121-126)描述的条件培养。
[00111]Namalwa细胞是EBV阳性的淋巴瘤细胞系，表达EBNA1和LMP1，含有一拷贝EBV基因组DNA/细胞。
[00112]异种移植C15小鼠(具有人NPC的裸鼠)获得自P.Busson博士，Institute Gustave Roussy，Paris。
[00113]为该项研究，从病理学确认的NPC患者获得了133例NPC样品，从GMU，GMU和HMU获得了35例不匹配的NPC和24例正常的鼻咽上皮细胞(道德许可：no.00-312斯德哥尔摩、瑞典和中国的当地委员会)。其中，98例是配对的样品，具有活组织检查/石蜡处理NPC和刷子/拭子样品。
[00114]在用1％可卡因溶液表面麻醉的条件下收集NPC刷子/拭子。为了获得这些样品，将棉花/刷子包顶的小棍置入左侧和右侧鼻腔中，移动直到鼻咽壁。然后将棉花拭子对着鼻咽后壁和侧壁旋转若干次。退出后，将具有吸附材料的棉花棒转移到
Figure A20068005691900261
管中，管中含有3ml盐水，并立即在3000xg离心处理10min。将细胞沉淀储存在400μlTE缓冲液中(10μMTris 1μM EDTA，pH 7.0)，在-80℃下储存直到进一步使用。可选的，用含有0.5％SDS/50μg/ml蛋白酶K(Invitrogen，Carlsbad，CA)的TE缓冲液浸泡和洗涤吸附的材料，通过酚/氯仿(CH3Cl)方法抽提DNA。
[00115]在早晨用20ml 0.9％NaCl漱口两次，收集漱口液(mouthwashing)。
[00116]将NPC活组织检查组织在液氮中速冻，直到进一步使用。在解冻后，将活组织检查搅匀，并用含有50μg/ml蛋白酶K(Invitrogen，Carlsbad，CA)的TE缓冲液在56℃处理3小时。通过常规的酚/氯仿和乙醇抽提，获得高分子量的基因组DNA。
[00117]还通过常规的酚/氯仿方法从拭子的细胞沉淀中抽提基因组DNA。
[00118]通过硅方法改造来自石蜡切片的DNA。将四片厚5μm的福尔马林固定且石蜡包埋的活组织切片用于DNA抽提。向装有石蜡切片的管中加入100μl 0.5％Tween-20。然后振荡管，并在热循环仪中加热至90℃10min，然后冷却至55℃。在消化前，蜡保留在溶液中。向管中加入2μl的10mg/ml蛋白酶K，在55℃孵育3小时，每个小时轻柔振荡。将消化的溶液加热到99℃10min，加入100μl 5％Chelex-100，并悬浮在Tris-EDTA中。轻柔的振荡悬浮溶液，同时在10,500g热离心15min。然后将管置于冰上，使蜡变硬得以去除。将管加热至45℃，加入100μl氯仿同时轻柔的振荡管。将管在10,500g离心15min，回收上层相(～180μl)。PCR检测使用10μl样品(Servi等人，(2002)J.Clinical Microbiology 40(11)：3986-3992)。
[00119]为了确定靶基因的甲基化状态，根据Alexander Olek等人(OlekA等人，(1996)Nucleic Acids Res.24(24)：5064-5066)公开的规程，稍微调整了亚硫酸氢盐的修饰程序。简而言之，通过在0.3M NaOH中，在37℃孵育15分钟，来变性500ng基因组DNA，然后与两种体积的2％低熔点琼脂糖混合。将琼脂糖/DNA混合物移入冰冷的矿物油中，形成琼脂糖珠。将每个珠置于单个管中，向其中添加等量的200μl 5M亚硫酸氢盐溶液(2.5M偏亚硫酸氢钠，Sigma；100mM氢醌，Sigma；pH5.0)。然后，在黑暗中孵育反应混合物，50℃，16小时。通过针对1ml的TE缓冲液平衡，再在500μl的0.2M NaOH中进行脱磺酸基步骤，终止处理。最后，用1ml H2O洗涤珠子，然后在PCR反应中直接使用。
[00120]将亚硫酸氢盐处理的DNA进行PCR，使用位于靶向甲基化-特异性PCR区域侧翼的引物。表1中列举了正向和反向引物的序列。
表1.在PCR反应中使用的寡核苷酸引物的核苷酸序列
  标志物基因   寡核苷酸序列正向/正义引物   寡核苷酸序列反向/反义引物  PCR产物大小bp
  EBNA1   AGA GGT TTA GGA GTT TTA GTAGTT AGT TAT(SEQ ID NO：1)   CAC CTT CTT AAT AAT ATT CAAAAT AAT C(SEQ ID NO：2)   129
  AGG GTT AAG ATA TAG AGA TGGTGT T(SEQ ID NO：3)   TAC TCC TAC CCC TCC TAC TCCTAC(SEQ ID NO：4)   130
  未甲基化的LMP1   GAG GTA GTA TGG GTA TAG ATTTTT TGA(SEQ ID NO：5)   CAT TTC CTA TTA CAC TTA ACCACC AC(SEQ IDNO：6)   149
  TGG TTA TGT TAG AGT AAT GTG(SEQ ID NO：7)   TTT CTA CTT CCC CTT TCT ATG(SEQ ID NO：8)   150
  甲基化的RASFF1A   GGG TTT TGC GAG AGC GCG(SEQ ID NO：9)   GCT AAC AAA CGC GAA CCG(SEQ ID NO：10)   169
  GTT TTG CGA GAG CGC G(SEQ IDNO：11)   GCT AAC AAA CGC GAA CGG(SEQ ID NO：12)   169
  甲基化的CHFR   GTT TTA ATA TAA TAT GGC GTCGAT C(SEQ ID NO：13)   CTC AAC TAA TCC GCG AAA CG(SEQ ID NO：14)   213
  TAA TTG TAT TCG AAA GGG TTTTTA C(SEQ ID NO：15)   TTA ATC CTA ACC AAA CGA CTTCG(SEQ ID NO：16)   217
  甲基化的DAPK   GAG GAT AGT CGG ATC GAG TTAAC(SEQ ID NO：17)   CAA CTA AAA AAT AAA TAA AAA     227ACG CA(SEQ IDNO：18)   227
  CGG TAG GGT TTG GGG TCG(SEQ ID NO：19)   AAA CCT CCC AAC TTC GAT CG(SEQ ID NO：20)   225
  BS-肌动蛋白   AAG TTA AGT TTT GTT TTT ATTTTT TTT(SEQ ID NO：21)   CAA TAA TCT CCT TCT ACA TCCTAT C(SEQIDNO：22)   184
  甲基化的LMP1   AAT TTG TAT AAA GAG GCG CG(SEQ ID NO：23)   CTT CTA CTT CAT CAC CCG CCG(SEQ ID NO：24)   149
  未甲基化的RASSF1A   GGG GTT TTG TGA GAG TGT G(SEQ ID NO：25)   CTA ACA AAC ACA AAC CAA ACA(SEQ ID NO：26)   169
  未甲基化的CHFR   TTG TGG TTG TGG GAG GGG GTG(SEQ ID NO：27)   ATC CCC AAA ACT ACA ACA ACA(SEQ ID NO：28)   213
  未甲基化的DAPK   ATT TTT TAG TTG TGT TTT TGTTGT T(SEQ ID NO：29)   TCC CAA TTA CTC AAA ACA CTACCC C(SEQ ID NO：30)   227
[00121]25μl的亚硫酸氢盐测序PCR反应体系含有20ng的亚硫酸氢盐处理的DNA作为模板，10pmol的各种引物，100pmol的各种脱氧核苷三磷酸，10x PCR缓冲液，和1单位的AmpliTaq Gold(Applied Biosystems，Foster City，CA)。循环条件如下：95℃10min，然后在94℃45秒，55℃45秒，和72℃90秒循环34圈。利用QLA快速凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)纯化PCR产物。根据生产商的推荐，利用TA克隆试剂盒(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)克隆纯化的PCR产物。利用ABI3100DNA测序仪和Big Dye Terminator v3.0循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)，用M13R引物测序5个克隆。在非CpG位点上的所有胞嘧啶残基都被胸腺嘧啶取代，上述情况的存在证实了亚硫酸氢盐转化的完全。
[00122]表1中总结了特异针对基因EBNA1、未甲基化的LMP1、甲基化RASSF1A、甲基化CHFR、甲基化DAPK和肌动蛋白的PCR引物序列，以及预期的PCR产物大小。对于PCR反应，向终体积为25μl的PCR混合物中添加2μl的亚硫酸氢盐修饰的DNA，所述混合物含有1x PCR缓冲液、1.5mM MgCl2、100pmol的各种脱氧核苷三磷酸、100pmol的各种使用的引物，和一单位的AmpiTaq Gold(Applied Biosystems，Branchburg，NJ)。
[00123]在95℃实施PCR扩增10分钟，然后进行34圈以下循环：94℃下30秒，特异的退火温度55℃下45秒，和72℃下90秒。每个反应都包括阳性的甲基化对照(Namalwa细胞DNA，每个细胞1份EBV基因组)、阴性甲基化对照(正常的鼻咽上皮组织)和空白水对照。通过2％琼脂糖凝胶电泳分析MMSP产物，并将其用溴化乙锭染色。重复所有的实验，用于评估结果的可重复性，与Namalwa细胞相比，半定量的评估EBV DNA负荷，其中Namalwa细胞按每个细胞1拷贝EBV基因组作为参照。
[00124]表2中描述了样品评估产生的结果。
表2.对NPC早期诊断和预后的评估
Figure A20068005691900301
§：Y：NPC，N：非NPC；
＊：5-3是可以诊断为NPC，2：不确定；0：非NPC
[00125]EBV EBNA1基因存在于所有NPC中，但不存在于正常上皮细胞中。因此，其似乎对于诊断和预测NPC是关键的。LMP1在超过60％的NPC中表达。EBNA1和LMP1阳性的样品获得100％确定的NPC诊断。为了诊断LMP1阴性样品中的NPC，需要有阳性的EBNA1，加上甲基化RASSF1A或同时甲基化CHFR/DAPK为阳性。因此，NPC诊断的基准是EBNA1的可检测性，加上未甲基化LMP1、甲基化RASSF1A或甲基化CHFR/DAPK中任一项的可检测性。
[00126]来自98例匹配的NPC(具有活组织检查和拭子/刷子/漱口液)，35例不匹配的NPC活组织检查，和34例正常对照样品的结果，显示对拭子样品92％的癌症检测率，从而MMSP检测方法的特异性是约90％(表3)。灵敏度等价于从105个细胞检测出2个细胞，假阳性和阴性少于5％。
表3.匹配的NPC样品中的MMSP结果
  基因   NPC活组织检查/石蜡切片   NPC拭子/刷子/漱口液   正常
  No.cases/总 ％   No.cases/总   ％   No.cases/总  ％
  EBNA1   87/91       95.6   76/82         92.7   0            0
  LMP1   57/91       62.6   48/82         58.5   0            0
  RASSF1A   71/91       78.0   52/82         63.4   1/34         2.9
  CHFR   38/58       65.5   25/47         53.2   0            0
  DAPK   55/91       60.4   45/82         54.9   2/34         6
[00127]因此，本发明首次提供了高特异性、高灵敏度、非侵入式的方法，用于EBV相关癌症(例如鼻咽癌)的早期诊断。
序列表
<110>伊诺基因卡尔生物技术私人有限公司(Innogene Kalbiotech)
<120>EB病毒相关癌症的早期诊断方法及各自的试剂和试剂盒
<130>P101733
<160>30
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>EBNA1寡核苷酸引物(正义)
<400>1
agaggtttag gagttttagt agttagttat  30
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>EBNA1寡核苷酸引物(反义)
<400>2
caccttctta ataatattca aaataatc    28
<210>3
<211>25
<212>人工的
<220>
<223>EBNA1寡核苷酸引物(正义)
<400>3
agggttaaga tatagagatg gtgtt       25
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>EBNA1寡核苷酸引物(反义)
<400>4
tactcctacc cctcctactc ctac        24
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>U-LMP1寡核苷酸引物(正义)
<400>5
gaggtagtat gggtatagat tttttga          27
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>U-LMP1寡核苷酸引物(反义)
<400>6
catttcctat tacacttaac caccac           26
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>U-LMP1寡核苷酸引物(正义)
<400>7
tggttatgtt agagtaatgt g                21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>U-LMP1寡核苷酸引物(反义)
<400>8
tttctacttc ccctttctat g                21
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-RASFF1A寡核苷酸引物(正义)
<400>9
gggttttgcg agagcgcg                    18
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-RASFF1A寡核苷酸引物(反义)
<400>10
gctaacaaac gcgaaccg                 18
<210>11
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-RASFF1A寡核苷酸引物(正义)
<400>11
gttttgcgag agcgcg                   16
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-RASSF1A寡核苷酸引物(反义)
<400>12
gctaacaaac gcgaacgg                 18
<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-CHFR寡核苷酸引物(正义)
<400>13
gttttaatat aatatggcgt cgatc         25
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-CHFR寡核苷酸引物(反义)
<400>14
ctcaactaat ccgcgaaacg              20
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-CHFR寡核苷酸引物(正义)
<400>15
taattgtatt cgaaagggtt tttac           25
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-CHFR寡核苷酸引物(反义)
<400>16
ttaatcctaa ccaaacgact tcg             23
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-DAPK寡核苷酸引物(正义)
<400>17
gaggatagtc ggatcgagtt aac             23
<210>18
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-DAPK寡核苷酸引物(反义)
<400>18
caactaaaaa ataaataaaa aacgca          26
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-DAPK寡核苷酸引物(正义)
<400>19
cggtagggtt tggggtcg                   18
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-DAPK寡核苷酸引物(反义)
<400>20
aaacctccca acttcgatcg                 20
<210>21
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BS-肌动蛋白寡核苷酸引物(正义)
<400>21
aagttaagtt ttgtttttat ttttttt          27
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>BS-肌动蛋白寡核苷酸引物(反义)
<400>22
caataatctc cttctacatc ctatc            25
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-LMP1寡核苷酸引物(正义)
<400>23
aatttgtata aagaggcgcg                  20
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>M-LMP1寡核苷酸引物(反义)
<400>24
cttctacttc atcacccgcc g                21
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>U-RASSF1A寡核苷酸引物(正义)
<400>25
ggggttttgt gagagtgtg                  19
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>U-RASSF1A寡核苷酸引物(反义)
<400>26
ctaacaaaca caaaccaaac a               21
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>U-CHFR寡核苷酸引物(正义)
<400>27
ttgtggttgt gggagggggtg                21
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>U-CHFR寡核苷酸引物(反义)
<400>28
atccccaaaa ctacaacaac a               21
<210>29
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>U-DAPK寡核苷酸引物(正义)
<400>29
attttttagt tgtgtttttg ttgtt           25
<210>30
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>U-DAPK寡核苷酸引物(反义)
<400>30
tcccaattac tcaaaacact acccc          25

Claims (30)

1.诊断受试者中EB病毒相关癌症的方法，其包括：
(a)从所述受试者收集生物学样品；
(b)通过确定EBNA1基因负荷，以及至少一个选自EB病毒基因LMP1和细胞基因RASSF1A、CHFR和DAP的基因的表达水平，来确定所述生物学样品中EB病毒基因负荷的量；和
(c)将确定的所述生物学样品中的所述基因的表达水平和参照比较。
2、权利要求1的方法，其还包括在b)前，从所述生物学样品中分离和纯化DNA。
3、权利要求2的方法，其中分离和纯化的DNA是基因组DNA。
4、根据权利要求1-3的任一项的方法，其中通过确定至少一个选自EB病毒基因LMP1和细胞基因RASSF1A、CHFR和DAP中的基因的外遗传状态，来确定表达水平。
5、根据权利要求4的方法，其中外遗传状态是甲基化状态。
6、根据权利要求5的方法，其中甲基化状态是通过甲基化特异性PCR(MSP)来确定的。
7、根据权利要求6的方法，其中甲基化特异性PCR是多重甲基化特异性PCR(MMSP)。
8、根据权利要求1-7的任一项的方法，其还包括确定EBNA1的基因负荷，以及LMP1和RASSF1A的表达水平。
9、根据权利要求8的方法，其还包括确定CHFR和/或DAP的表达水平。
10、根据权利要求1-9的任一项的方法，其还包括确定对照基因的表达水平，作为样品DNA质量的对照。
11、根据权利要求10的方法，其中将持家基因用作为对照基因。
12、根据权利要求11的方法，其中使用肌动蛋白和/或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为对照基因。
13、根据权利要求1-12的任一项的方法，其中EB病毒相关癌症选自B细胞和T细胞淋巴瘤，其包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，与免疫抑制相关的淋巴瘤，和致死性中线肉芽肿；癌症，其包括鼻咽癌(NPC)、唾液腺癌、和胃腺癌；以及肉瘤，其包括平滑肌肉瘤。
14、根据权利要求1-13的任一项的方法，其中c)中的参照是正常组织。
15、根据权利要求1-14的任一项的方法，其中，确定EBNA1的基因负荷包括使用至少两种寡核苷酸引物，其中，第一种引物包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段。
16、根据权利要求1-15的任一项的方法，其中确定LMP1的表达水平包括利用至少两种寡核苷酸引物，其中，第一种引物包括SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段。
17、根据权利要求1-16的任一项的方法，其中确定RASSF1A的表达水平包括利用至少两种寡核苷酸引物，其中，第一种引物包括SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段。
18、根据权利要求1-17的任一项的方法，其中确定CHFR的表达水平包括利用至少两种寡核苷酸引物，其中，第一种引物包括SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段。
19、根据权利要求1-18的任一项的方法，其中确定DAPK的表达水平包括利用至少两种寡核苷酸引物，其中，第一种引物包括SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段。
20、根据权利要求12-19的任一项的方法，其中确定作为对照基因的肌动蛋白的表达水平包括利用至少两种寡核苷酸引物，其中，第一种引物包括SEQ ID NO：21中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQ ID NO：22中提出的核苷酸序列，或其变体、互补序列和片段。
21、根据权利要求1-20的任一项的方法，其中生物学样品选自鼻咽拭子、漱口液和体液。
22、根据权利要求1-21的任一项的方法，其中受试者是哺乳动物。
23、根据权利要求22的方法，其中受试者是人。
24、通过权利要求1-23的任一项的方法获得的结果的用途，其用于发展针对EB病毒相关癌症的预防性或治疗性方案。
25、寡核苷酸，其具有选自SEQ ID NO：1-30提出的序列的核苷酸序列。
26、用于诊断受试者中EB病毒相关癌症的试剂盒，其包括至少一种用于确定EBNA1基因负荷的试剂，和至少一种用于确定至少一个选自EB病毒基因LMP1和细胞基因RASSF1A、CHFR和DAP中的基因的表达水平的试剂。
27、根据权利要求26的试剂盒，其还包括用于确定参照基因的基因表达水平的试剂。
28、根据权利要求26或27的试剂盒，其中用于检测EBNA1基因负荷，至少一个选自EB病毒基因LMP1和细胞基因RASSF1A、CHFR和DAP中的基因的表达水平，和/或参照基因的表达水平的试剂是一种或多种寡核苷酸引物。
29、根据权利要求28的试剂盒，其中一种或多种寡核苷酸引物包括SEQ ID NO：1-30中提出的任一种核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。
30、修饰DNA分子的方法，其中，DNA分子是变性的，与液体琼脂糖混合，移入冷的液体中形成琼脂糖珠，其中琼脂糖珠含有变性的DNA分子，其中，随后将获得的琼脂糖珠进行后续的修饰和纯化步骤。
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