CN103717757A - 用于调节爱泼斯坦-巴尔核抗原1的活性的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包含调节爱泼斯坦-巴尔核抗原1（EBNA1）蛋白的活性的化合物，及其在治疗潜伏爱泼斯坦-巴尔病毒感染的方法中的用途。R7是取代或未取代的苯基、吡啶基或嘧啶基。本发明还提供了包含与可药用载体混合的本发明的化合物的药物组合物以及使用本发明的组合物调节爱泼斯坦-巴尔核抗原1（EBNA1）蛋白的活性和治疗潜伏爱泼斯坦-巴尔病毒感染的方法。

Description

用于调节爱泼斯坦-巴尔核抗原1的活性的组合物和方法
发明背景
本申请要求2011年5月24日提交的美国临时申请号61/489,293的优先权利益，其内容整体通过参考并入本文。
爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）是几种淋巴系和上皮细胞恶性肿瘤的致癌辅助因子（Kieff(2007)，《爱泼斯坦-巴尔病毒及其复制》（Epstein-Barr Virus and its Replication），第5版，Wolters KluwerHealth/Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia；Rickinson&Kieff(2007)，《爱泼斯坦-巴尔病毒》（Epstein-Barr Virus），第5版，WoltersKluwer Health/Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia；Young&Rickinson(2004)Nat.Rev.Cancer4:757-68）。EBV与伯基特氏淋巴瘤和鼻咽癌（NPC）的大部分流行形式相关。EBV也在～50%的所有霍奇金病肿瘤活组织检查、一些形式的胃癌、甲状腺肿瘤、NK/T细胞淋巴瘤以及大部分与免疫抑制相关的非霍奇金淋巴瘤和淋巴增生症中发现。大多数与EBV相关的肿瘤带有潜伏的病毒基因组作为被转化细胞的核中的多拷贝游离体。在潜伏感染期间，EBV不产生后代病毒粒子，但是表达有限的一组促进宿主细胞存活和增殖的病毒基因产物。在增殖的细胞中，潜伏病毒基因组的维持依赖于爱泼斯坦-巴尔核抗原1（EBNA1）蛋白的功能（Leight&Sugden(2000)Rev.Med.Virol.10:83-100）。EBNA1在增殖细胞和肿瘤中发现的所有类型的EBV潜伏感染中表达。EBNA1对于被EBV感染的初始B淋巴细胞的永生化来说是必不可少的（Humme等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:10989-94），并且它被siRNA贫化或显性失活突变体的异位表达的抑制引起被感染细胞的死亡（Kennedy等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:14269-14274；Yin&Flemington(2006)Virology346:385-93）。
EBNA1是定向抑制EBV潜伏感染的候选物。EBNA1始终如一地表达在如果不是所有也是大多数的EBV相关恶性肿瘤中（Thorley-Lawson&Gross(2004)N.Engl.J.Med.350:1328-37）。EBNA1对于病毒基因组维持和被感染细胞的存活来说是必不可少的（Kennedy等，(2003)同上；Yin&Flemington(2006)同上）。最重要的是，EBNA1是具有明确清楚的生物化学性质和结构性质的病毒编码的蛋白。EBNA1由两个主要功能结构域、即羧基端DNA结合结构域和氨基端染色体结合结构域构成（Leight&Sugden(2000)同上；Wang等，(2006)Mol.Cell Biol.26:1124-34）。DNA结合结构域对于与病毒的质粒复制原点（OriP）的相互作用来说是必不可少的（Yates等，(1985)Nature313:812-815）。OriP由一系列30bp的重复序列构成，EBNA1作为同二聚体结合于其中的18bp回文序列（Ambinder等，(1990)J.Virol.64:2369-79；Rawlins等，(1985)Cell42:859-68）。在脱辅基和结合有DNA的形式中，已通过高分辨率X-射线晶体学解析了DNA结合和二聚化界面（Bochkarev等，(1996)Cell84:791-800；Bochkarev等，(1995)Cell83:39-46）。尽管EBNA1不存在已知的细胞同源物，但EBNA1的三维结构类似于人类乳头瘤病毒（HPV）E2蛋白的总体结构，所述E2蛋白在HPV的DNA复制原点处具有与EBNA1类似的功能（Bochkarev等，(1995)同上）。蛋白质结构预测程序表明，EBNA1和E2共有与卡波斯肉瘤相关性疱疹病毒（KSHV）LANA蛋白类似的结构折叠，所述LANA蛋白与EBNA1共有许多功能性质，包括DNA结合和KSHV oriP的游离体维持（Garber等，(2002)J.Biol.Chem.277:27401-11）。这些观察表明，EBNA1是在人类基因组中没有明显直系同源物的病毒原点结合蛋白家族的成员，因此可能代表了病毒潜伏复制和存留的抑制剂的有吸引力的靶点。
特异性抑制蛋白质-DNA结合活性的小分子的鉴定，已获得一些成功（Bowser等，(2007)Bioorg.Med.Chem.Lett.17:5652-5；Kiessling等，(2006)Chem.Biol.13:745-51；Mao等，(2008)J.Biol.Chem.283:12819-30；Rishi等，(2005)Anal.Biochem.340:259-71）。由于在过去几十年间常规药物开发过程的低成本效益和耗时性，作为有吸引力的并且作为传统HTS的补充方法，出现了高通量模拟筛选（HTVS）。HTVS通常依赖于作为计算筛选的模板的蛋白靶点的高分辨率晶体结构的可用性。多年来，HTVS已被应用于对抗靶分子例如HIV-1蛋白酶、胸苷酸、流感血凝素和寄生虫蛋白酶的生物活性分子的成功鉴定（Siddiquee等，(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:7391-7396；Vangrevelinghe等，(2003)J.Med.Chem.46:2656-2662）。
发明概述
本发明描述了式I、II或III的化合物
Figure BDA0000421797950000031
其中
X是O或NH；
R1是取代或未取代的苯基、吡啶基或噻唑基团；
R2是=O或2H；
R3是CR4、取代或未取代的吡啶基、嘧啶基、苯基吗啉基团、噁唑基团或
Figure BDA0000421797950000032
R4是取代或未取代的苯基；
R5和R6独立地是卤素基团、取代或未取代的低级烷基、或取代或未取代的甲氧基，其前提是当R2为=O并且R5为H时，R6不是Cl、C(CH3)3或CF3；并且
R7是取代或未取代的苯基、吡啶基或嘧啶基。还提供了包含与可药用载体混合的本发明化合物的药物组合物，以及使用本发明的组合物调节爱泼斯坦-巴尔核抗原1（EBNA1）蛋白的活性和治疗潜伏爱泼斯坦-巴尔病毒感染的方法。
发明详述
进行了基于荧光偏振（FP）的高通量筛选和电泳迁移率变动分析（EMSA）以鉴定爱泼斯坦-巴尔核抗原1（EBNA1）的小分子抑制剂。发现在这些分析中鉴定到的化合物是EBNA1的高选择性抑制剂。这些化合物及其类似物和衍生物起到新的EBNA1抑制剂的作用，用作针对EBV的治疗剂。因此，本发明描述了在本文中鉴定到的化合物以及它们在治疗潜伏爱泼斯坦-巴尔病毒感染中的用途。
发现本发明的化合物共有共同的苯并呋喃结构。更具体来说，本发明的化合物具有式I、式II和式III的结构。
Figure BDA0000421797950000041
其中X是O或NH；
R1是取代或未取代的苯基、吡啶基或噻唑基团；
R2是=O或2H；
R3是CR4、取代或未取代的吡啶基、嘧啶基、苯基吗啉基团、噁唑基团或
R4是取代或未取代的苯基；
R5和R6独立地是卤素基团、取代或未取代的低级烷基、或取代或未取代的甲氧基，其前提是当R2为=O并且R5为H时，R6不是Cl、C(CH3)3或CF3；并且
R7是取代或未取代的苯基、吡啶基或嘧啶基。
“低级烷基”意在是指含有1至6个碳原子的支链或非支链饱和单价烃基团，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、丁基、正己基等。
示例性取代基包括但不限于卤素（即氟、氯、溴和碘）、低级烷基、乙氧基、甲氧基、羟基、胺、酰胺、硝基、亚硝基、醛、羧基、巯基和硫代羰基。
式I、式II和式III的示例性化合物显示在表2中。这样的化合物可被制备成药物组合物、可药用衍生物或可药用盐类，并单独被提供或与单位剂量的主题化合物组合地以试剂盒的形式被提供。在这样的试剂盒中，除了含有单位剂量的容器之外，还包括描述使用化合物的用法和随之而来的益处的信息性包装附页。
本发明的化合物的“可药用衍生物”包括其盐类、酯类、烯醇醚类、烯醇酯类、缩醛、缩酮、原酸酯类、半缩醛、半缩酮、酸、碱、溶剂化物、水合物或前体药物。这样的衍生物可以由本领域技术人员使用用于这样的衍生化的已知方法容易地制备。产生的化合物可以给药于动物或人类而没有显著毒性效应，并且具有药物活性或者是前体药物。
化合物的“可药用盐”是指在制药上可接受的并且具有母体化合物的所需药理活性的盐。这样的盐包括：（1）酸加成盐，与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成，或与有机酸例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成；或者（2）当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子代替，或者与有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡萄糖胺等配位时形成的盐。
除了在本文中具体公开的化合物之外，本发明还涉及所述化合物的调节EBNA1活性的类似物和衍生物。广义来说，EBNA1的三维晶体结构与本发明化合物的结构的组合，可用于设计或筛选具有EBNA1抑制活性的测试化合物，并且可以测试所设计或筛选的化合物调节EBNA1活性的能力。在某些实施方式中，使用各种计算机模拟、体外和/或体内测定法，基于EBNA1的DNA结合结构域或DNA结合结构域的残基与测试化合物之间的相互作用的检测来进行筛选。
在本发明的情形中，EBNA1是指爱泼斯坦-巴尔核抗原1蛋白。EBNA1被描述在例如GENBANK登记号YP_401677中，并在本文中显示在SEQ ID NO:1中。根据本发明，可以使用全长EBNA1蛋白，或者可以使用EBNA1的DNA结合结构域（即454至607位氨基酸残基）。出于本发明的目的，对EBNA1的指称还包括EBNA1的合成变体以及EBNA1的片段。合成变体包括与本文公开的EBNA1具有至少80%、优选地至少90%的同源性，并具有结合DNA的能力的变体。更优选地，这样的变体对应于本文中提供的EBNA1序列，但是具有一个或多个，例如1至10个或1至5个氨基酸替换、缺失或插入。EBNA1及其变体的片段的长度优选地在100至500个氨基酸残基之间或150至300个氨基酸之间。示例性的片段包括涵盖EBNA1的DNA结合结构域的约150个氨基酸残基。
根据本发明，可以利用分子设计技术来设计、鉴定和合成能够结合于EBNA1的DNA结合口袋的一个或多个氨基酸的类似物和衍生物，包括抑制性和刺激性化合物。使用对接程序例如GRAM、DOCK、HOOK或AUTODOCK（Dunbrack等，(1997)Folding&Design2:27-42），可以将EBNA1的DNA结合口袋的结构与计算机模拟联合使用，以鉴定EBNA1蛋白的潜在调节物。这一过程可以包括将化合物计算机拟合于EBNA1的DNA结合口袋，以例如确定化合物的形状和化学结构与DNA结合结构域的互补性有多好，或者将化合物与本文公开的抑制剂的结合进行比较。也可以利用计算机程序来估算EBNA1蛋白与效应化合物的吸引、排斥和空间位阻。一般来说，空间位阻越低，吸引力越大，特异性越高，这是更可能与EBNA1蛋白而不是其他类型蛋白质相互作用的特异性效应化合物的重要特点。
可替选地或此外，在EBNA1调节物或效应物的设计中可以利用化学探针方法。例如，Goodford（(1985)J.Med.Chem.28:849）描述了几种商业化软件包例如GRID（Molecular Discovery Ltd.,Oxford,UK），其可用于使用不同的化学探针例如水、甲基、胺基的氮、羧基的氧和羟基探测EBNA1的DNA结合结构域。由此确定EBNA1的DNA结合结构域与每种探针之间的相互作用的有利位点，并且可以从得到的三维图案产生推断的互补分子。
也可以通过目测检查EBNA1的DNA结合结构域的三维结构来设计本发明化合物的类似物和衍生物，以确定更有效的抑制剂或激活剂。这种类型的模拟一般被称为“手动”药物设计。手动药物设计可以利用目测检查和使用图形可视化程序例如“O”的分析（Jones等，(1991)Acta Crystallographica Section A A47:110-119）。一开始，通过手动药物设计选择效应化合物。然后可以通过计算机模拟程序改良由此设计的结构类似物，以更好地确定最可能有效的候选物。减少潜在候选物的数量是有用的，因为不可能合成并筛选可能与已知抑制性分子具有一些相似性的无数化合物变化形式。已显示，这样的分析在HIV蛋白酶抑制剂的开发中有效（Lam等，(1994)Science263:380-384；Wlodawer等，(1993)Ann.Rev.Biochem.62:543-585；Appelt(1993)Perspectives inDrug Discovery and Design1:23-48；Erickson(1993)Perspectives inDrug Discovery and Design1:109-128）。
适用于搜索三维数据库的程序包括MACCS-3D和ISIS/3D（Molecular Design Ltd,San Leandro,CA）、ChemDBS-3D（ChemicalDesign Ltd.,Oxford,UK）和Sybyl/3DB Unity（Tripos Associates,StLouis,MO）。适用于化合物选择和设计的程序包括例如DISCO（AbbottLaboratories,Abbott Park,IL）、Catalyst（Bio-CAD Corp.,Mountain View,CA）和ChemDBS-3D（Chemical Design Ltd.,Oxford,UK）。
本发明化合物的类似物和衍生物可以结合于EBNA1的DNA结合结构域的全部或一部分，并且可能比本发明化合物更强力、更特异、毒性更低并且更有效。所设计的化合物也可能效力更低，但是在体内和/或体外具有更长的半衰期，因此对于在体内和/或体外长时期调节EBNA1活性来说更加有效。这样的设计的调节物可用于激活EBNA1或抑制EBNA1活性，以例如阻止肿瘤形成。
本发明还提供了使用分子设计技术来计算筛选小分子数据库，以寻找能够以与EBNA1的天然底物和/或本文公开的化合物类似的方式结合于EBNA1的化学实体或化合物。这样的计算筛选可以鉴定与DNA结合结构域的一个或多个氨基酸残基相互作用的各种不同基团，并可用于合成本发明的调节物。
本发明还包括体外（即溶液中）筛选测定法。例如，这样的测定法包括将EBNA1或EBNA1的DNA结合结构域（例如本文中公开的）与或不与底物（例如DNA探针）在溶液中合并，并确定类似物或衍生物是否能够阻断或增强EBNA1的DNA结合活性。就此而言，可以执行体外筛选测定法来监测在类似物或衍生物存在或不存在的情况下的DNA结合。根据本发明的这一方面，本发明包括使用基于FP的测定法和/或EMSA来证实类似物或衍生物与EBNA1的DNA结合结构域的结合。这样的测定法在本领域中经常实施，并且在本文中更详细地公开。
在设计或筛选类似物或衍生物后，随后测试类似物或衍生物在体内调节EBNA1的活性的能力。这可以使用常规测定法例如本文公开的基于细胞的报告物测定法或通过测定EBV基因组拷贝数维持来进行。
为了进一步评估本发明的化合物、类似物或衍生物的效能，专业技术人员将会认识到，可以利用涉及潜伏EBV感染的任何特定疾病或障碍的模型系统来评估化合物的吸收、分布、代谢和排泄，以及它在急性、亚慢性和慢性研究中的潜在毒性。例如，可以在实施例2中公开的模型，即使用携带人类淋巴系异种移植物的beige/nude/xid小鼠（Dosch等，(1991)Internation.Immunol.3:731-35）或嫁接有人类淋巴细胞的SCID小鼠（Rowe等，(1991)J.Exp.Med.173:147-158）的EBV模型中，测试效应性或调节性化合物。最终，在人类临床试验中评估本发明化合物的安全性和效能。
本发明的化合物具有各种不同用途。EBNA1蛋白在所有EBV相关肿瘤中表达，在所述肿瘤中，它对于病毒复制、基因组维持和病毒基因表达来说是不可或缺的。EBNA1的转录因子样功能也扩展到影响参与在肿瘤发生期间通常失调的途径的细胞基因的表达。因此，在一种实施方式中，EBNA1的DNA结合活性的抑制剂通过破坏EBNA1的DNA结合来抑制病毒复制。在许多情况下，病毒复制的抑制等同于肿瘤形成的抑制。因此，EBNA1的DNA结合活性的抑制剂对于由EBV潜伏感染引起的人类疾病或病症、特别是EBV相关肿瘤的治疗来说，将是有效的治疗剂。除了病毒基因的调控之外，已显示EBNA1调控宿主细胞基因表达。例如，已显示EBNA1在B细胞中诱导CD25、RAG1、RAG2和CCL20的表达（Baumforth等，(2008)Am.J.Pathol.173:195-204；Kube等，(1999)J.Virol.73:1630-1636；Srinivas&Sixbey(1995)J.Virol.69:8155-8158），并且诱导上皮细胞中参与转录、翻译和细胞信号传导的细胞基因的差异调控（O'Neil等，(2008)J.Gen.Virol.89:2833-2842；Wood等，(2007)Oncogene26:4135-4147）。此外，EBNA1增强STAT1的表达，其使细胞对干扰素诱导的STAT1激活敏感，调节TGFβ1途径中的信号传导，并提高AP-1活性，引起参与血管发生和肿瘤转移的宿主细胞机制的增强（O'Neil等，(2008)同上；Wood等，(2007)同上）。因此，激活EBNA1的化合物可用于诱导EBV的裂解周期，以研究疾病发生并分析EBNA1对宿主细胞基因表达的影响。总的来说，不论希望在细胞或生物体中增加还是降低EBNA1活性，都可使用本发明的分子。
因此，本发明的化合物、类似物和衍生物在用于调节（即阻断或抑制或增强或激活）EBNA1的方法中找到应用。这样的方法包括将EBNA1在体外或体内与有效量的本发明化合物、类似物或衍生物相接触，以便调节EBNA1的活性。效应性或调节性化合物的有效量，是当与未接触所述化合物的EBNA1相比时，将EBNA1的活性降低或增加至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的量。这样的活性可以通过用于检测EBNA1活性的基于报告物的测定法或在使用DNA底物的竞争性结合测定法中监测。本发明具体涵盖的化合物提供在本文的实施例中。
本领域技术人员可以认识到，调节EBNA1的活性，在选择性分析模型系统中的EBNA1信号传导事件中，以及在预防或治疗涉及EBNA1潜伏感染的疾病、病症和障碍中，可能是有用的。在特定疾病或障碍的预防或治疗中使用的化合物的选择，将依赖于所述特定疾病或病症。例如，EBNA1参与癌症，因此，抑制EBNA1的化合物将可用于预防或治疗癌症，包括但不限于伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、某些形式的胃癌、甲状腺肿瘤、NK/T细胞淋巴瘤和免疫抑制相关的非霍奇金淋巴瘤。此外，已怀疑EBV在慢性疲劳综合征的病理发生中发挥作用（Lerner等，(2004)In Vivo18:101-6），使得EBNA1的抑制可能也可用于治疗这种病症。
因此，本发明还提供了用于预防或治疗潜伏爱泼斯坦-巴尔病毒感染的方法。这样的治疗包括向需要治疗的对象给药含有有效量的本文公开的EBNA1抑制性化合物（参见例如表2）的药物组合物。在大多数情形中，所述对象是人类，但是农业动物例如家畜和家禽以及伴侣动物例如狗、猫和马的治疗，明确地被本发明覆盖。
当在本文中使用时，术语“治疗”是指改善病症或症状，阻止病症或疾病的建立，或以其他方式阻止、阻碍、迟滞或逆转病症或疾病或其他不想要的症状的进展的任何和所有应用。
当在本文中使用时，术语“有效量”在其意义内包括药剂或化合物的提供所需效果的无毒性但足够的量。所需的准确量随对象而变，取决于多种因素，例如所治疗的物种、对象的年龄和总体状况、待治疗病症的严重性、给药的具体药剂和给药方式等。就此而言，对于任何给定病例来说，适合的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅仅使用常规实验来确定。
含有本发明化合物的药物组合物可以采取可药用盐和复合物的形式，并且可以在可药用载体中并以适合的剂量提供。这样的药物组合物可以通过本领域公知的方法来制备，并含有本领域公知的载体。这样的方法和成分的公认纲要是《Remington药物学科学与实践》（Remington:The Science and Practice of Pharmacy），Alfonso R.Gennaro主编，第20版，Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000。可药用载体、组合物或介质，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，涉及将主题化合物从一个器官或身体的一个部分携带或运输到另一个器官或身体的另一部分。每种载体必须在与配方中的其他成分相容并且对待治疗的对象没有伤害的意义上是可接受的。
可以用作可药用载体的材料的实例包括糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯；粉末状黄耆树胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及在制药配方中使用的其他无毒性相容物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂，也可以存在于组合物中。
本发明的组合物可以按照标准医学实践肠胃外（例如通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内注射）、局部（包括颊和舌下）、口服、鼻内、阴道内或直肠内给药。
所选的剂量水平取决于各种不同因素，包括所使用的本发明的特定化合物的活性、给药途径、给药时间、所使用的特定化合物的排泄或代谢速率、治疗的持续时间、与所使用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、待治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和以前的医疗史等医学领域中公知的因素。
具有本领域普通技术的医生或兽医，可以容易地确定并开出所需的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以从低于为了获得所需治疗效果而需要的水平开始化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至获得所需效果。这被认为是在专业人员的技术范围之内，并且人们可以参阅关于特定化合物或类似化合物的现有文献，以确定最适剂量。
除了EBV潜伏感染的治疗之外，设想了本文公开的化合物同等地适用于抑制具有类似DNA结合结构域的其他病毒。例如，EBNA1与人类乳头瘤病毒（HPV）E2蛋白的总体结构类似，所述E2蛋白在HPV的DNA复制原点处具有与EBNA1类似的功能（Bochkarev等，(1995)同上）。蛋白质结构预测程序表明，EBNA1和E2共有与卡波斯肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）LANA蛋白相似的结构折叠，所述LANA蛋白与EBNA1共有许多功能性质，包括DNA结合和KSHV oriP的游离体维持（Garber等，(2002)同上）。因此，按照本文公开的方法鉴定的效应物也可能可用于调节LANA和E2蛋白的活性，以及用于与KSHV和HPV相关的疾病的治疗。
通过下面非限制性实例，对本发明进行更详细描述。
实施例：化合物的平行合成
Figure BDA0000421797950000131
Figure BDA0000421797950000141
按照反应路线1-7合成的化合物的取代基列于表1中。
表1
Figure BDA0000421797950000151
除了3-硝基-苯并呋喃之外，还设想了其他核心结构，包括但不限于下列结构。
Figure BDA0000421797950000152
Figure BDA0000421797950000161
实施例2：材料和方法
重组EBNA1DBD的表达和纯化。将编码DNA结合结构域的EBNA1的454至607位氨基酸（GENBANK登记号YP_401677；SEQ IDNO:1）作为六聚组氨酸融合蛋白在大肠杆菌中表达。表达在Rosetta2细胞中，在25℃下用0.3mM IPTG诱导3小时。回收可溶性蛋白并按照标准方法通过Ni-NTA琼脂糖进行纯化（Frangioni&Neel(1993)Anal.Biochem.210:179-87）。将结合的蛋白用20mM HEPES、pH7.9、1MNaCl、5mM2-巯基乙醇、40mM咪唑和10%甘油大量洗涤，以解离结合于EBNA1的非特异性DNA，然后在含有250mM咪唑的缓冲液中洗脱。将洗脱蛋白的峰级份合并，并针对20mM HEPES、pH7.9、500mM NaCl、5mM2-巯基乙醇、10%甘油和0.2mM PMSF进行透析。
FP测定法。FP测定法使用具有非回文位点的探针，所述非回文位点具有两个高亲和性半位点（5’-GGG TAG CAT ATG CTA TCT aga tagcat atg cta ccc-3’；SEQ ID NO:2）。该探针在EMSA（电泳迁移率变动分析）中以相似的效率结合EBNA1，但是在FP（荧光偏振）测定法中性能明显更好。制备反应混合物，其含有200mM NaCl，20mM Tris-ClpH7.4，1mM DTT，10μg/mL BSA和5nM CY5标记的EBNA1BS发夹（opl3016）或5nM FITC标记的EBNA1BS发夹（opl4624），并含有或不含246至100nM纯化的EBNA1的DNA结合结构域。将该溶液在室温下温育30分钟以确保结合。使用BIOTEK MICROFLO Select分发器将30μL这种溶液分发到带有化合物的测试板的每个孔。然后将板以165x g离心以确保溶液沉降在孔中，并在25℃下温育30分钟。然后使用PERKIN ELMER2104Multilabel读板器对板进行分析。
EMSA测定法。制备EMSA反应缓冲液，其含有20%甘油、200mMNaCl、20mM Tris-Cl pH7.4、1mM DTT、10μg/mL BSA和10nM CY5标记的EBNA1BS发夹（opl3016），并含有或不含246nM纯化的EBNA1的DNA结合结构域。将该溶液在室温下温育20分钟以确保结合。将30μL该溶液分发到含有0.5μL DMSO中的测试化合物的EPPENDORF管，随后混合。然后将样品装载到6%聚丙烯酰胺凝胶上，并以170V电泳90分钟。然后使用General Electric TYPHOON成像仪扫描凝胶以获取荧光。
FP筛选。对于初始筛选来说，将重悬浮在DMSO中的2μl测试化合物以50mM的浓度分发到黑色PERKIN ELMER OPTIPLATE中的三份平行孔中，以便当重悬浮在30μL反应溶液中时获得3.33mM的终浓度。使用本文中描述的FP测定法对板进行测定。具体来说，将30μl预先形成的EBNA1：CY5-或FITC-DNA发夹复合物分发到含有候选化合物的孔中。在室温下温育1小时后，使用ENVISION XCITEMultilabel读板器（PERKIN ELMER）测量荧光偏振（EX:620，EM:680）。为每种化合物计算相对于测定板对照孔的EBNA1DNA结合的抑制百分数（即抑制的%=(mPMax-mPCmpd)/(mPMax-mPmin)x100）。在去卷积后，将结果分层为四类：活性物质（即生物活性化合物显示出>15%的EBNA1DNA结合的抑制，并且在水平和竖直两个维度上干净利落地作图于独一无二的孔），不明确的（即生物活性化合物在任一维度上作图于2个或更多孔），孤儿（即在第二维度上不能鉴定到正交匹配），以及无活性（EBNA1DNA结合活性的抑制<15%）。
IC50测定。为了确定IC50值，进行了100%（v/v）DMSO中的每种化合物的10个点的3倍连续稀释液的两份平行样的滴定，从10mM的起始浓度开始，使用PERKIN ELMER JANUS产生母板。从该母板，将0.5μL人工转移至带有PERKIN ELMER JANUS的黑色PERKINELMER OPTIPLATE测试板或转移至EPPENDORF管。使用本文中的FP测定法对板进行测定，并使用上述EMSA流程对管进行测定。
EBNA1转录去阻遏分析。将293T细胞接种在10-cm板中含有10%FBS的DMEM培养基中。在37℃温育18小时以允许细胞贴壁后，每块板使用40μL LIPOFECTAMINE（INVITROGEN）来转染处于50-70%合生的细胞。将每块板的细胞用4μg Qp-萤光素酶报告基因质粒（N1852）和0.125μg EBNA1表达质粒（N803）或4μg Qp-萤光素酶报告基因质粒（N1852）和0.125μg对照质粒（N799）（无EBNA）进行转染。24小时后，在不使用胰蛋白酶的情况下收获细胞，1200RPM离心5分钟，并以每毫升100,000个细胞的浓度重悬浮在含有10%FBS的DMEM培养基中。使用BIOTEK MICROFLO Select分发器将40μL该溶液（40,000个细胞）分发到白色板的每个孔中。如上所述添加测试化合物以获得125μM-2nM的终浓度范围。将细胞在37℃温育48小时，收获，使用PROMEGA STEADY-GLO萤光素酶系统分析萤光素酶活性，并使用PERKIN ELMER2104Multilabel读板器读数。
EBV阳性选择性杀死分析。为了确定化合物是否选择性杀死EBV阳性细胞，将EBV阳性细胞（LCLs、Mutu1、Raji）的存活性与EBV阴性细胞（DG75或BCBL1）进行比较。将细胞以每毫升100,000个细胞的浓度重新悬浮，并将40μl（40,000个细胞）重悬液分发到384孔透明板的每个孔中。向每个孔加入测试化合物（0.5μl）以获得125μM-2nM的终浓度范围。在将细胞与化合物在37℃温育72小时后，使用PROMEGA MTS试剂分析细胞，并使用PERKIN ELMER2104Multilabel读板器读板。
异种移植小鼠模型测定法。为了测试化合物在体内的效能，在免疫缺陷NOD SCID（NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl）小鼠（The JacksonLaboratory）中开发了异种移植小鼠模型。将Mutu LCL细胞用组成性表达GFP和萤光素酶的慢病毒（N1893）转导，并使用流式细胞术进行分拣以分离表达GFP和萤光素酶的细胞群体。将5百万个转导的Mutu LCL GFP/萤光素酶阳性细胞悬浮在100μl无菌PBS中，并皮下注射到6周龄雌性NOD SCID小鼠的右胁中。将测试化合物配制在介质（5%n-甲基吡咯烷酮，45%SOLUTOL HS15和50%1%LUTROL F68，在水中）中，并无菌过滤。在第7、9和11日，将测试化合物每日一次腹膜内给药。在第9、14、18、21、23和25日，使用IVIS成像仪测量肿瘤尺寸。为了这些测量，将每只动物用异氟烷麻醉，用每克体重250μl15mg/ml的D-萤火虫萤光素钾盐（GOLDBIOTECHNOLOGY，#LUCK1G，溶解在DPBS中）腹膜内注射。20分钟后，将小鼠置于XENOGEN IVIS成像仪（CALIPERLIFESCIENCES）中，并使用总通量作为测量值读取肿瘤尺寸。
实施例3：化合物的活性
在本文中公开的基于细胞的测定法中筛选化合物的活性。化合物的IC50值列于表2中。
表2
Figure BDA0000421797950000191
Figure BDA0000421797950000201
Figure BDA0000421797950000211
Figure BDA0000421797950000221
Figure BDA0000421797950000231
IC50为125000nM的化合物无活性。

Claims (7)

1.式I的化合物
Figure FDA0000421797940000011
其中
X是O或NH；并且
R1是取代或未取代的苯基、吡啶基或噻唑基团。
2.式II的化合物
Figure FDA0000421797940000012
其中
R2是=O或2H；
R3是CR4、取代或未取代的吡啶基、嘧啶基、苯基吗啉基团、噁唑基团或
Figure FDA0000421797940000013
R4是取代或未取代的苯基；并且
R5和R6独立地是卤素基团、取代或未取代的低级烷基、或取代或未取代的甲氧基，其前提是当R2为=O并且R5为H时，R6不是Cl、C(CH3)3或CF3。
3.式III的化合物
Figure FDA0000421797940000021
其中R7是取代或未取代的苯基、吡啶基或嘧啶基。
4.药物组合物，其包含与可药用载体混合的权利要求1、2或3的化合物。
5.用于调节爱泼斯坦-巴尔核抗原1（EBNA1）蛋白的活性的方法，所述方法包括将EBNA1蛋白与有效量的权利要求1、2或3的化合物相接触，以便调节EBNA1蛋白的活性。
6.用于治疗潜伏爱泼斯坦-巴尔病毒感染的方法，所述方法包括向需要治疗的对象给药权利要求4的药物组合物，以便治疗对象的潜伏爱泼斯坦-巴尔病毒感染。
7.权利要求6的方法，其中所述潜伏爱泼斯坦-巴尔病毒感染与癌症相关。
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