TWI632917B - 具有特定響應性光學成像的抑制劑用於ｅｂｖ相關腫瘤的治療 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種細胞核穿透性小分子抑制劑L₂ P₄ （其中L₂ 為4- （ 4- （二乙基氨基）苯乙烯基） -N- 羧甲基吡啶陽離子氯化物 且P₄ 是一段含有CAhxYFMVFGGRrRK 的氨基酸序列，此二者透過醯胺鍵結合）以及此抑制劑的合成，它以EBVs及相關腫瘤的生長之必要程序的EBNA1的二聚合中的二聚界面為標靶從而達到對EBV陽性細胞及腫瘤的有效抑制。本發明亦提供對EBV相關癌症的治療和成像的方法。

Description

具有特定響應性光學成像的抑制劑用於EBV相關腫瘤的治療

本發明屬於藥學及化學領域。本發明關於一種細胞核穿透性（nucleus-permeable）小分子抑制劑、其合成方式、以及此分子用於癌症治療及成像的使用方式。

艾司坦－巴爾病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一種普遍存在的人類皰疹病毒，它可導致感染性單核白血球增多症和淋巴增生性疾病。它的潛伏性感染也與其他癌症的發展息息相關（例如鼻咽癌以及EBV陽性胃癌的子群）。艾司坦－巴爾核抗原1（Epstein-Barr nuclear antigen 1, EBNA1）對於EBV的重要生命進程，如DNA的複製和病毒的傳代，是十分關鍵的。考慮到EBNA1同型二聚化是EBNA1發揮其功能的先決條件，通過特異性阻斷EBNA1二聚體的形成可提供一種治療潛伏性EBV感染腫瘤的方法。近期已有幾種EBNA1特異性抑制劑的報道。一款通過高通量篩出的小分子，EiK1，它以二聚結構域（dimerization domain）中的氨基酸序列459-607為靶標從而起到對EBNA1二聚合的抑制作用，而另一些具有相似功能的多肽抑制劑則以560-574這一段氨基酸序列為靶標。然而，這些抑制劑既缺乏特異性的細胞器定位（subcellular localization）也沒有與EBNA1結合的響應性信號，因而限制了這些抑制劑對EBNA1二聚合的成像及抑制的有效性，更進一步阻礙這些抑制劑對EBV潛伏性感染癌細胞的選擇性抑制功效。

文獻表明EBNA1廣泛分佈於經EBV感染之細胞的細胞核中。EBNA1連繫宿主細胞染色體的過程對EBV衍生質體（EBV-derived plasmid）的有效複製至關重要。利用體外顯微鏡技術研究細胞核內EBNA1的之具響應性的靶標特異性生物探針（target-specific bioprobe）仍舊稀少。據此，本發明的目的在於提供細胞核穿透性的EBNA1特異性的分子。

本段或本申請的任何其他段落的任何引用的引用或標識不應被解釋為承認此參考可用作本申請的現有技術。

據此，本發明提供一種細胞核穿透性的並以EBNA1二聚合界面為靶標的多肽接合物（nucleus-permeable peptide conjugate）、合成此多肽接合物的方法、抑制EBV生長以及治療EBV相關性腫瘤（EBV-associated tumors）的方法。本發明亦提供對EBV相關腫瘤進行成像的方法。

在本發明之第一方面中，提供一種細胞核穿透性小分子抑制劑L₂ P₄ ，其分子結構如（I）所示(I)， 其中此抑制劑為4-（4-（二甲基氨基）苯乙烯基）-N-羧甲基吡啶陽離子氯化物（4-(4-(Diethylamino)styryl)-N-carboxymethylpyridinium chloride），其係透過醯胺鍵和含有氨基酸序列CAhxYFMVFGGRrRK（SEQ ID NO. 3）的多肽連接起來。

在本發明之第一方面的第一實施例中，提供一種細胞核穿透性小分子抑制劑L₂ P₄ ，其中此抑制劑以艾司坦－巴爾病毒之病毒蛋白EBNA1的二聚合界面為靶標。

在本發明之第一方面的第二實施例中，提供一種細胞核穿透性小分子抑制劑L₂ P₄ ，其中此抑制劑在經艾司坦－巴爾病毒感染的細胞的細胞核中具有明顯的定位，並且在與野生型EBNA1（wild type EBNA1，WT-EBNA1）結合後發出超過8.8倍的響應性螢光信號（responsive emission enhancement）。

在本發明之第一方面的第三實施例中，提供一種細胞核穿透性小分子抑制劑L₂ P₄ ，其中此抑制劑具有毒性選擇性，對於經艾司坦－巴爾病毒感染的腫瘤細胞中表現出顯著細胞毒性。

在本發明之第二方面中，提供一種用於對經艾司坦－巴爾病毒感染的細胞進行成像的方法，其包含使經艾司坦－巴爾病毒感染之細胞攝入細胞核穿透性小分子抑制劑L₂ P₄ 、用適當的L₂ P₄ 的吸收光照射經艾司坦－巴爾病毒感染的細胞、並利用螢光成像收集自經輻射之經艾司坦－巴爾病毒感染的細胞的發射光。

在本發明之第二方面的第二實施例中，提供一種對經艾司坦－巴爾病毒感染的細胞進行成像的方法。細胞核穿透性小分子抑制劑在經艾司坦－巴爾病毒感染的細胞內可引起大致在274 nm及〜500 nm處的吸收。

在本發明之第二方面的第三實施例中，提供一種對經艾司坦－巴爾病毒感染的細胞進行成像的方法，其中螢光成像偵測在560 nm及～625 nm處所得的吸收帶。

在本發明之第三方面中，提供一種治療癌症的方法，其包含投予細胞核穿透性小分子抑制劑L₂ P₄ 至需要治療此癌症的受者，其中此癌症的細胞為經艾司坦－巴爾病毒所感染。

在本發明之第三方面的第一實施例中，提供一種治療癌症的方法，其包含投予細胞核穿透性小分子抑制劑L₂ P₄ 至需要此癌症治療的受者，其中此癌症為艾司坦－巴爾病毒陽性的癌症，其選自於由B細胞衍生淋巴瘤（B cell-derived lymphomas）、T細胞淋巴瘤（T-cell lymphomas）、何杰金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma）、鼻咽癌（nasopharyngeal cancer）及胃癌（gastric carcinoma）所組成的群組。

在本發明之第三方面的第二實施例中，提供一種治療癌症的方法，其包含投予細胞核穿透性小分子抑制劑L₂ P₄ 至需要此癌症治療的受者，其中此細胞核穿透型小分子抑制劑藉由腫瘤內注射所投予。

在本發明之第四方面中，提供一種合成細胞核穿透性小分子抑制劑L₂ P₄ 的方法，其包含：其中 a) 化合物1（4-甲基吡啶 (4-methylpyridine)）及化合物2（4-二乙基氨基苯甲醛 (4-diethylaminobenzaldehyde)）在氫化鈉（分散在煤油中）存在下溶解在二甲基甲醯胺（dimethylformide，DMF）中並升溫至60°C進行反應，獲得化合物3（N,N'-二乙基-4-（2-（吡啶-4-基）乙烯基）苯胺 (N,N’-diethyl-4-(2-(pyridine-4-yl) vinyl)aniline)）； b) 將化合物3 與溴乙酸乙酯（ethyl bromoacetate）在乙腈（MeCN）存在下於約85°C進行反應，以獲得化合物4（4-（4-（二乙基氨基）苯乙烯基）-1-（2-乙氧基-2-氧代乙基）吡啶-1-溴）(4-(4-(diethylamino)styryl)-1-(2-ethoxy- 2-oxoethyl)pyridine-1-ium bromide）； c) 以二噁烷（dioxane）為溶劑於室溫用0.4M 氫氧化鈉（NaOH）水解化合物4，以獲得化合物5（4-（4-（二甲基氨基）苯乙烯基）-N-羧甲基吡啶陽離子氯化物）； d) 在二異丙基乙基胺（diisopropylethylamine，DIPEA）、苯並三唑-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸鹽（benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate，PyBOP）及DMF存在下於室溫將化合物5與P₄ -樹脂（P₄ -resin）進行偶合，以獲得化合物6； e) 在三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA）、三異丙基矽烷（triisopropylsilane，Tis）及水存在下於室溫裂解化合物6的樹脂化物以獲得化合物7，並藉由高效液相層析純化化合物7以獲得細胞核穿透性小分子抑制劑L₂ P₄ 。

本領域之技藝人士將理解，除了具體描述的那些部份之外，本文描述的發明易於變化和修改。

本發明包括所有這些變化和修改。 本發明還包括在說明書中單獨地或集體地引用或指示的所有步驟和特徵，以及任何與所有組合或任二個或多個步驟或特徵。

在整個說明書中，除非上下文另有要求，單詞「包含（comprise）」或諸如「包含（comprises）」或「包含（comprising）」等變化詞將被理解為暗示包括所描述的整數或整數組，但不排除任何其他整數或整數組。還值得注意的是，在本揭露中，特別是在申請專利範圍及／或段落中，諸如「包含（comprise）」、「包含（comprises）」、「包含（comprising）」等的術語可以具有在美國專利法中歸因於它的含義；例如它們可以是「包括（includes）」、「包括（included）」、「包括（including）」等等；「基本上由...組成（consisting essentially of）」與「基本上由...組成（consisting essentially of）」這些術語具有專利法中賦予它們的含義，例如，它們允許沒有明確敘述的元素，但是排除在現有技術中發現的或影響本發明的基本或新穎特徵的元素。

此外，在整個說明書和申請專利範圍中，除非上下文另有要求，單詞「包括（include）」或諸如「包括（includes）」或「包括（including）」等變化詞將被理解為暗示包括所描述的整數或整數組，但是不排除任何其他整數或整數組。

本文使用的所選術語的其它定義可以在本發明的詳細說明內找到並且通篇適用。除非另有定義，本文使用的所有其他技術術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。

對於本領域之技藝人士來說，本發明的其它方面及優點從隨後說明的檢閱將是顯而易見的。

本發明的範圍不限於本文所述的任何具體實施方案。 以下實施例僅用於舉例說明。

艾司坦－巴爾病毒（EBV）是一種普遍存在的人類皰疹病毒，它可導致感染性單核白血球增多症和淋巴增生性疾病，但是它在人宿主中建立的潛伏性感染一般能得到免疫系統良好地控制。艾司坦－巴爾核抗原1（EBNA1）是唯一在所有EBV陽性腫瘤中表達的致癌蛋白，且其對EBV基因組的維持、複製和轉錄起關鍵作用。此外，EBNA1可以影響細胞基因轉錄，這是EBV相關腫瘤發展的基礎。鑑於這些關鍵的生物學功能，EBNA1已成為干預治療（therapeutic intervention）中的一個很具有吸引力的靶標。

考慮到EBNA1同型二聚化是EBNA1發揮其功能的先決條件，通過特異性阻斷EBNA1二聚體的形成可提供一種靶向（target）和殺死EBV陽性細胞的新途徑。已有報導指出數種EBNA1抑制劑，這些抑制劑有效地阻斷EBNA1同型二聚合，包括一款小分子化合物EiK1和一條EBNA1衍生的短肽P85。Eik1是通過高通量篩選所發現的，它能夠靶向EBNA1的二聚合界面（殘基459-607）。而含有自EBNA1的b3褶板衍生來的一段短肽，P85（殘留560-566），亦靶向此區域（殘基560-574）。然而，迄今報導的大多數EBNA1靶向（EBNA1-targeting）化合物都很難成像（體外），且這些化合物的生物利用度都很低。這些問題都對此領域產生重大挑戰並阻礙這些抑制劑在EBNA1靶向療法上的進一步發展。在本領域中，還有一種混合的生物接合物-JLP₂ ，其含有一個帶電荷的水溶性的發色團與一段EBNA-1特異性多肽。儘管JLP₂ 實現了體外的特異性成像以及對EBNA1的抑制，但JLP₂ 缺乏特異性細胞器定位，並且不能與EBNA1產生響應性結合合（responsive binding），這些因素限制了其作為細胞成像工具以及選擇性治療EBV相關性癌症的試劑上的進一步發展。

還值得注意的是，EBNA1主要位於EBV陽性細胞的細胞核中，並且EBNA1是連接有絲分裂染色體和質體的複製起始點（oriP）的橋樑。限制癌症治療成功的一個因素是難以特異性靶向目標細胞類型。目前尚不存在這樣一種直接又高效的體系，既能實現細胞核中EBNA1的可視化（visualize）又能監測它對EBNA1同型二聚合的影響。為了解決這個問題，需要開發出一種細胞核穿透性的EBNA1特異性雙功能探針，用以在體外和體內選擇性的對EBV相關性癌症進行成像和腫瘤抑制。對EBNA1體外顯微鏡研究和對體內EBV陽性腫瘤選擇性抑制的響應性細胞核穿透性的生物探針（responsive nucleus-permeable bioprobe）的開發尚未被詳細地探討。為此，本發明提供了可對EBV陽性細胞進行響應性螢光成像（responsive-emission imaging）且針對EBV陽性腫瘤細胞具備高選擇性及有效的體外／體內細胞毒性的多肽接合物。

本申請的雙功能多肽接合物探針L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 係如圖1A所示，其合成在圖9中概述。L₂ 是4-（4-（二乙基氨基）苯乙烯基）-N-羧甲基吡啶陽離子氯化物，而P₂ 、P₃ 及P₄ 分別為氨基酸序列編號（SEQ ID NO.）1、2及3的多肽。P₂ （YFMVF）是一種衍生自EBNA1之b4的多肽，且其為EBNA1特異性的。P₃ 為CAhxRrRKGGYFMVF，其中Ahx為6-胺基己酸，R為L-精氨酸，且r為D-精氨酸，以及P₄ 為CAhxYFMVFGGRrRK，其中Ahx為6-胺基己酸。中間體（圖9中的化合物3-5）以及L₂ P₂ ,、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 的表徵（包括¹ H NMR、¹³ C NMR和質譜）顯示於圖45至圖56中。藉由高效液相色譜純化多肽接合物；純化及表徵（characterization）的方法及結果在圖10A至圖14B中提供。L₂ P₄ （其中L₂ 是4-（4-（二乙基氨基）苯乙烯基）-N-羧甲基吡啶陽離子氯化物，P₄ 是氨基酸序列CAhxYFMVFGGRrRK（SEQ ID No.3），二者係通過醯胺鍵偶合）與野生型EBNA1（WT-EBNA1）之間強烈的相互作用藉由與WT-EBNA1結合時的增加的8.8倍發光強度（結合常數= 6.7）而被證實。L₂ P₄ 具有如式（I）之結構，其中式（I）為。L₂ P₄ 對於與WT-EBNA1的結合有明顯的反應，反應性訊號被發現係藉由分子間電荷轉移（intermolecular charge transfer，ICT）機制所誘導。藉由本發明之雙功能螢光多肽接合物探針透過對EBNA1同型二聚合進行選擇性干擾，顯示對EBV陽性腫瘤實現同時成像並達到抑制效果。L₂ P₄ 對EBV陽性細胞具有高度的細胞毒性（半抑制濃度（IC₅₀ ） ≈ 15mM），但即使在高劑量（50mM，IC₅₀ ＞ 0.5mM）下，對EBV陰性細胞幾乎沒有或沒有細胞毒性。此外，L₂ P₄ 對EBV陽性腫瘤具有強烈的體內毒性（4微克（mg）的腫瘤內注射導致了92.8％的生長抑制）。本文所述的體外和體內研究都證明了L₂ P₄ 作為雙功能EBV腫瘤選擇性靶向劑（targeting agent）和成像探針（imaging probe）的有效性。本發明的多肽接合物有治療EBV相關癌症（例如柏基特淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、鼻咽癌及胃癌）的潛力。本發明的多肽接合物也可用於對EBV陽性細胞和腫瘤進行成像，從而有助於闡明EBNA1在細胞核內的生物功能。在圖57中表示本發明的多肽接合物在癌症治療及癌細胞成像中的用途。

結果與討論 .

a. 多肽或多肽接合物對 EBNA1 二聚合界面的影響的理性設計與 MD 模擬： EBNA1的DNA結合域（SEQ ID NO.4）（蛋白質資料庫ID：1B3T，鏈A，殘基461至607）的X射線晶體結構是由藉由透過數個彎曲部分連接的四個α螺旋以及四個β褶板所構成的α／β混合摺疊（圖1B，左）。不同的結構（β褶板，β1-β4）承擔不同的功能並經由疏水性堆積（hydrophobic packing）共同輔助形成二聚體；a螺旋，a1及a2經由靜電交互作用（electrostatic interaction）與DNA作用，而a3及a4可穩定β褶板；帶正電的彎曲部分1（loop 1）介導（mediate）與DNA的結合；可撓性的彎曲部分5（loop 5）亦輔助EBNA1的二聚合。

EBNA1之DNA結合域的單體結構由其同型二聚體（homodimer）的X射線晶體結構所產生，並且用於在AMBER 14中進行200奈秒（ns）的全原子顯性溶劑MD模擬（all-atom explicit-solvent MD simulation）。除了對於EBNA1的同型二聚合貢獻較小的高度動態的彎曲部分1及彎曲部分5（圖16A及圖16B）之外，EBNA1結構表現出了良好的穩定性並維持了模擬過程中的原始構型。包含二聚合界面的4個β褶板也表現出合理的穩定性（圖16C）。此外，由四個β褶板構成的二聚合界面也被發現表現出良好的穩定性。在接下來的檢查推定的結構中二聚合界面的可及性（accessibility），進行溶劑可及表面積（Solvent Accesible Surface Area, SASA）的計算，發現，二聚合界面上的關鍵殘基（Y561、M563及F565）可以藉由外源（extrinsic）的探針所觸及（圖16D）。在檢查此推定結構的穩定性和可及性之後，選定具代表性的構型，並進行對接研究（docking study），以鑑定每個配體－EBNA1複合體的對接姿勢（docked pose）（圖16E及圖16F）。配體選自P₂ 、P₃ 、P₄ 、L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 。接著使用評分功能對所有對接姿勢進行排名，以選擇每個複合體的最終姿勢。大多數選定的姿勢被發現具有一些相似之處；例如，EBNA1中的關鍵殘基與YFMVF片段的相互作用出現在所有複合體中（圖17A至圖17F）。此外，在帶正電荷的四肽RrRK和EBNA1中富含天冬氨酸的尾部之間發現了意想不到的鹽橋作用，表明此核定位序列還有另一功效。

為了更好地表徵配體－EBNA1的複合體，並計算其結合能，我們使用選定的對接姿勢進行了200奈秒（ns）的MD模擬用以計算複合體中的交互作用能（interaction energy）。對非標準殘基（non-standard residue）的能量精化輔助建模（assisted model building with energy refinement，AMBER）類型進行參數化（圖18A至圖18B），並且在運行MD模擬之前定義缺失的力場參數。所有的複合體被發現在50奈秒（ns）之後均呈穩定狀態。鹽橋的交互作用只出現在含有具備RrRK四肽之配體的P₃ 及P₄ 中。儘管如此，每個複合體藉由MD模擬所顯示的主要交互作用具有相似性（明顯的疏水性接觸以及鹽橋接；圖25A至圖25F）。疏水性的交互作用在二聚合界面上的配體和關鍵殘基之間被發現，而在RrRK片段以及EBNA1中富含天冬氨酸的尾部中的幾個殘基（D₆₀₂ 、D₆₀₁ 及D₆₀₅ ）之間也發現了鹽橋／離子鍵。特別是，D₆₀₂ 表現出最強的鹽橋交互作用（salt-bridge interaction），而D₆₀₅ 顯示出最弱的鹽橋交互作用（圖19A至圖19E、圖20A至圖20E、圖21A至圖21F、圖22A至22F、圖23A至圖23F以及圖24A至圖24F）。總言之，MD模擬顯示探針與EBNA1之間的兩種主要交互作用類型，其促進本發明之多肽接合物與EBNA1的結合。除了核定位之外，RrRK序列還表現出增強與EBNA1結合的另一作用。

所有複合體的結合自由能藉由分子力學泊松－波茲曼表面積（Molecular Mechanics Poisson-Boltzmann Surface Area，MMPBSA）方法計算。經計算的廣義玻恩（generalized Born，GB）及泊松－波茲曼（Poisson-Boltzmann，PB）值對與EBNA1的結合都表現相同的順序：L₂ P₄ ＞L₂ P₃ ＞L₂ P₂ ，表明L₂ P₄ 與EBNA1之間具有最強的結合交互作用（binding interaction）。

b. L₂ P₄ 與 EBNA1 的反應性發光： 在經模擬的細胞外陰離子混合物（PBS緩衝液）（圖26A至圖26C）中確認藉由在37°C下監測其發射光譜24小時所評估的多肽接合物的穩定性。如前一節所述，MD模擬和自由能計算顯示，L₂ P₄ 與WT-EBNA1具有最強的相互作用，因此可有效防止EBNA1的同型二聚合並且最終抑制EBV陽性腫瘤的生長。為了獲得L₂ P₄ 對WT-EBNA1的實際結合親和力（actual binding affinity），在PBS緩衝液中進行發光滴定（luminescence titration）實驗。自滴定實驗獲得的結果與經由MMPBSA所計算的數據有良好的一致性。發現L₂ P₄ 在添加4 mM WT-EBNA1（圖2A至圖2C以及圖29A至圖29E）時具有最強的響應性螢光（emission response），即8.8倍的發光增強（ϕ_初始 = 4％，ϕ_{4 m M WT-EBNA1} = 23％），且在圖21中顯示25奈米（nm）的螢光藍移（blue-shift）。具有WT-EBNA1與不具有WT-EBNA1的L₂ P₄ 的量子產率也算出，如圖27A至圖27H以及圖28A至圖28C所示。如圖21所示，計算三種接合物與WT-EBNA1的結合常數（logK_assoc / Ka）。

在相同的條件下，觀察到L₂ P₃ 的螢光強度增加4.7倍，L₂ P₂ 則沒有觀察到強度變化。探針對於蛋白質的親和力可以經由結合常數（binding constant）以及結合比（binding ratio）進行定量。如圖21所示，計算三種多肽接合物與WT-EBNA1的結合常數（log Kassoc／Ka）。初始螢光與最終螢光比率的對數相對於蛋白質濃度呈現線性關係。對於L₂ P₃ 和L₂ P₄ ，log K_assoc 的計算值分別為5.50和6.82，並且兩者的結合比都被發現為1：1。由於L₂ P₄ 的結合強度較高，在各種蛋白質（圖2C）及生物相關金屬（biologically relevant metal）離子及小分子（如Zn²⁺ 及檸檬酸鹽）的存在下，L₂ P₄ 對WT-EBNA1的結合選擇性（圖30A至圖30F以及圖31A至圖31F）被研究。在選擇性測定（selectivity assay）中分析的蛋白質包括四種EBNA1突變蛋白和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）。藉由將YFMVF突變為FFAVA（產生EBNA1-3A）或經由Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 以及F₅₆₅ 的保守點（conservative point）突變為A（產生EBNA1-Y₅₆₁ A、EBNA1-M₅₆₃ A以及EBNA1-F₅₆₅ A）以製備EBNA1突變蛋白。藉由記錄其發光變化以研究L₂ P₄ 對於每種蛋白質的選擇性。在添加四種突變體（mutant）EBNA1蛋白以及BSA時，觀察到相對較小的發光增強（圖2C），顯示對於這些蛋白質，L₂ P₄ 的結合相較於WT-EBNA1為弱（EBNA1-Y₅₆₁ A、EBNA1-M₅₆₃ A、EBNA1-F₅₆₅ A以及EBNA1-3A的log K_assoc 值分別為5.1、3.6、4.3以及3.9；對於BSA，log K_assoc 為4.7）。L₂ P₄ 顯示對WT-EBNA1具有選擇性。

已公認的是，當環境敏感的螢光團與具有特異性靶向的多肽結合時，將產生螢光增強現象，並且由於激發態偶極矩（dipole moment）的顯著變化而將發生強烈的藍移。眾所周知，4-（N,N-二甲基-氨基）芐腈（4-(N,N-dimethyl-amino)benzonitrile，DMABN）的雙螢光是由於來自原始激發（local excited，LE）狀態的發光以及來自ICT狀態的「異常（anomalous）」相對紅移的發光所引起。迄今為止所報導的這類分子之眾多的DMABN類似物中，吡啶衍生物一直是特別關注的焦點，特別是在測定細胞微黏度（cell microviscosity）方面。考慮到這一點，本發明提供由ICT狀態的吡啶衍生物螢光團以及在結合EBNA1後產生基於ICT機理之發光的細胞核穿透性EBNA1特異性多肽所組成的螢光探針，其可用於防止EBNA1的同型二聚合，並用於EBV陽性腫瘤的成像與抑制。

對L₂ P₄ 在多種溶液中的吸收光譜進行了測量（圖32）。光譜顯示了位於274 nm和〜500 nm處的兩個吸收帶，其分別對應於從基態到原始激發以及ICT狀態的轉變。極性溶劑中最大吸收帶稍微有紅移。L₂ P₄ 在激發時表現出雙螢光：在560 nm處自原始激發態所產生的微弱但較高能量的發光，並且觀察到來自ICT狀態位於〜625 nm處的強發光（圖2A、2D以及2E）。原始激發帶的螢光強度與溶劑無關，而ICT發射光譜則表現出對溶劑極性的顯著依賴性，如隨著溶劑極性的降低而逐漸藍移（圖2E）。此外，L₂ P₄ 的發光衰減如圖2F上方所示（l_ex = 475 nm；於625 nm所監測），L₂ P₄ 在不同溶劑中的螢光壽命如圖34所示。所觀察到的較短的壽命（約0.5 ns）係對應於原始激發發光，而ICT發光表現出更長的壽命（3.8 ns）。

c. L₂ P₄ 之體外細胞核成像： 為了證明L₂ P₄ 的選擇性細胞核定位（selective nuclear localization），EBV陽性（C666-1及NPC43）和EBV陰性（CNE2及HeLa）細胞被用於L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 的成像研究（圖3A至圖3F以及圖4A至圖4B）。HeLa為EBV陰性人宮頸癌細胞，CNE2為EBV陰性鼻咽癌細胞，C666-1為EBV陽性鼻咽癌細胞，NPC 43為新衍生的EBV陽性鼻咽癌細胞。將細胞核定位序列RrRK併入P₃ 和P₄ 以提高其細胞核的穿透性。使用共軛焦成像和流式細胞儀獨立評估三個探針的細胞攝取及定位情況（圖3A至圖3F、圖4A至圖4B、圖36A至圖36C、圖37A至圖37F以及圖38A至圖38F）。從這些實驗中，發現L₂ P₄ 在HeLa和C666-1細胞中表現出最高的細胞攝取（圖36A至圖36C）。由於RrRK的作用，在EBV陽性細胞（C666-1和NPC43）中觀察到L₂ P₃ 和L₂ P₄ 的細胞核定位，而L₂ P₂ 僅在細胞質中發現，表示L₂ P₃ 和L₂ P₄ 定位於EBV陽性細胞的細胞核中。

d. L₂ P₄ 對於 EBV 陽性細胞的選擇性毒性： EBNA1只能藉由形成同型二聚體（homodimer）促進EBV的DNA複製；因此，阻斷二聚體形成提供了殺死EBV感染的腫瘤細胞的途徑。眾所周知，EBNA1二聚體係透過YFMVF介導的界面所形成，並且其可以經由3-馬來醯亞胺苯甲醯基N-羥基琥珀醯亞胺酯（3-maleimidobenzoylN -hydroxysuccinimide ester，MBS）交聯二聚合試驗（cross-linked dimerization assay）所測定；MBS為含有NHS－酯以及馬來醯亞胺反應性基團的胺－巰基交聯劑（amine-to-sulfhydryl crosslinker）。MBS介導的蛋白質交聯作用以EBNA1二聚體與單體的比例表示。在WT-EBNA1和EBNA1突變體（EBNA1-Y₅₆₁ A、EBNA1-M₅₆₃ A、EBNA1-F₅₆₅ -A以及EBNA1-3A）的同型二聚合效率中進一步研究YFMVF對二聚合的重要性。在此之前，確認WT-EBNA1及EBNA1突變體的純度，並分析其同型二聚合效率，如圖5A-5C所示。結果表明，對於EBNA1-3A，二聚合效率大大降低，而其他三點突變體的效率的降低程度相對較小（圖35A至圖35C）。與此觀察結果和發光滴定實驗一致的是，MBS交聯二聚合測定亦被本發明的多肽接合物所抑制，如圖6A至圖6D所示（P ＜0.001）。

就L₂ P₄ 與WT-EBNA1的強結合和選擇性細胞核體外成像而言，顯示了L₂ P₄ 對於EBV陽性細胞的選擇性和有效的細胞毒性。在三個EBV陰性細胞系（MRC-5（正常肺纖維母細胞）、HeLa以及Ramos）和三個EBV陽性細胞系（C666-1、NPC43以及Raji）中對三種多肽(P₂ 、P₃ 以及P₄ ；圖39A至圖39F)和三種多肽接合物（L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ ；圖7A至圖7F）進行MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide））細胞毒性測定。發現所有探針（多肽或多肽接合物）即使在高劑量（50 μM）下也能在EBV陰性細胞中表現出低細胞毒性，並且在EBV陽性細胞中表現出具劑量依賴性的細胞毒性。多肽接合物在EBV陽性細胞中的細胞毒性程度與MD模擬、發光滴定以及體外成像結果（L₂ P₄ ＞L₂ P₃ ＞L₂ P₂ ）相同。

e. L₂ P₄ 的體內腫瘤成像及抑制

為了進一步評估L₂ P₄ 的體內表現，於BALB / c裸鼠中的C666-1和HeLa細胞異種移植物（xenograft）內以腫瘤內注射投予P₄ 或L₂ P₄ （低劑量（L）2 mg或高劑量（H）為4 mg）。注射每兩週進行一次，伴隨體重及腫瘤的測量。攜帶HeLa細胞異種移植物的小鼠作為對照組，以證實P₄ 或L₂ P₄ 的體內靶向效應（in vivo targeting effect）的特異性。與對照組（圖40、圖41A至圖41E以及圖43A至圖43C）相比，使用P₄ 或L₂ P₄ 進行治療對小鼠的體重沒有顯著影響，表示P₄ 和L₂ P₄ 都不會表現出對於EBV陰性癌症的體內毒性作用。C666-1細胞異種移植物的生長被有效地抑制，而HeLa異種移植物的生長則不受P₄ 或L₂ P₄ 治療的影響（圖8D、圖56D以及圖43B）。到第7天，相對於對照組而言，用P₄ -L、P₄ -H以及L₂ P₄ -H治療C666-1細胞異種移植物顯著地降低腫瘤的體積，並且在實驗結束時（第21天），平均腫瘤體積分別減少65.7%、65.5%以及92.3%（p ＜0.05，p ＜0.005和p ＜0.001）（圖6D、圖8D以及圖42A至圖42B）。對於HeLa細胞異種移植物，在實驗結束時（第18天），對照組的小鼠與用P₄ 或L₂ P₄ （低劑量和高劑量）治療的小鼠之間的平均腫瘤體積沒有顯著差異，如圖43B所示。在實驗結束時，將小鼠殺死，切除腫瘤並稱重。對於C666-1細胞異種移植物，當與對照組（圖8A、圖8B、圖8C、圖8D及圖8E）相比時，P₄ -L、P₄ -H以及L₂ P₄ -H治療後平均腫瘤重量分別降低72.6%、86.6%以及92.8%（不顯著，p ＜0.05及p ＜0.005）。而對於HeLa細胞異種移植物，平均腫瘤重量沒有顯著差異（圖43C及圖44）。藉由P₄ 及L₂ P₄ 對EBV陽性腫瘤生長有選擇性的顯著抑制，證實了其EBV靶向特異性，並且表示L₂ 與P₄ 的接合不影響P₄ 的腫瘤抑制作用。

經切除之C666-1腫瘤的螢光成像顯示，在腫瘤內注射後48小時，L₂ P₄ 螢光信號保持可檢測的狀態（圖8F）。如預期地，在對照組或P₄ 治療的腫瘤中並未檢測到螢光信號。

在本發明中，初始的MD研究顯示，疏水性交互作用以及鹽橋所形成的相互作用網介導了L₂ P₄ 與EBNA1之二聚合界面的結合（圖1）。使用發光滴定實驗進一步證實了L₂ P₄ 與EBNA1的具選擇性且強力的結合（圖2）。L₂ P₄ 被發現定位於EBV陽性細胞的細胞核中，但不在EBV陰性細胞的細胞核中。細胞核中L₂ P₄ 的選擇性發光係藉由與核內EBNA1的結合所產生（圖3A至圖3F）

本申請還提供EBNA1突變體（特別是EBNA1-3A）難以進行同型二聚合（圖35A至圖35C），而強調出二聚合界面（YFMVF）在EBNA1二聚體形成中的重要性。使用MBS交聯二聚合測定法分析於添加本發明之多肽接合物時WT-EBNA1的二聚合效率，顯示本發明的多肽接合物可顯著地干擾EBNA1二聚體形成（圖6A至圖6D）。對EBV陽性及陰性細胞進行的細胞毒性測定（extensive cytotoxicity assay），證明了L₂ P₄ 對EBV陽性細胞生長有顯著且具選擇性的抑制，更重要的是，揭示了選擇性細胞毒性的原因係透過抑制EBNA1二聚合過程（圖7A至圖7F）產生的。最後，實驗研究L₂ P₄ 對帶有C666-1和HeLa細胞異種移植物之小鼠的影響，證實了L₂ P₄ 特異性地以EBV為標靶，並顯示本申請的多肽接合物可在體內應用-靶向抑制EBV陽性腫瘤的生長（圖8A至圖8F），從而治療EBV相關性癌症。本申請表明，L₂ P₄ 可以藉由干擾EBNA1同型二聚合而在體外和體內選擇性地抑制EBV陽性腫瘤的生長。

實驗方法

1) 合成及純化

多肽合成及裂解的一般程序 ： 所有使用的化學試劑均為試劑級，購自Sigma-Aldrich，無需進一步純化即可使用。所有分析級溶劑通過標準方法乾燥，在使用前進行蒸餾和脫氣。

多肽合成：在裝有Discovery微波單元（Discovery microwave unit）的CEM Liberty1單通道微波（MW）多肽合成儀上，以0.10 mmol標度的Rink醯胺樹脂（0.82 mmol／g）進行自動固相多肽合成（automated solid-phase peptide synthesis）。使用Fmoc保護的氨基酸（5當量）與N,N'-二異丙基碳二亞胺／羥基苯並三唑（DIC／HOBt）活化。在「活化劑基質（activator base）」的位置使用含0.8M DIC的DMSO溶液，在「活化劑（activator）」位置（與預設構型相反）中使用0.5M HOBt的DMF溶液。氨基酸側鏈官能團係被保護，如下列所示：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH以及Fmoc-Tyt(tBu)-OH。使用預設的10分鐘MW偶合循環（MW coupling cycle）在75℃（25W）下進行反應，或對於Cys殘基在50℃下進行反應。藉由在開始時加入1小時室溫（RT）預活化期（preactivation period）以延長循環。對於Arg和Cys殘基，重複此循環（雙偶合（double couplings））。2小時預活化期係用於Ahx殘基。在RT中使用中含20%（v／v）哌啶的DMF溶液進行兩次連續處理（5+10分鐘），以進行Fmoc基團的移除。延展的Fmoc去保護反應時間用於Arg殘基（3分鐘MW+20分鐘）。使用氮氣起泡以用來確保在每個步驟期間反應混合物的有效攪拌。乾燥樹脂的預膨脹（preswelling）在DMF中進行至少1小時。

多肽裂解：多肽－樹脂在乙醚中收縮，並以3mL裂解混合液（cleavage cocktail）（95％三氟乙酸（TFA）、2.5％去離子水以及2.5％三異丙基矽烷）在室溫下處理3.5小時。然後藉由過濾除去樹脂，濾液在真空中濃縮，使用乙醚沉澱並傾析液體（隨後用乙醚洗滌）。將所得固體多肽溶解於含有0.1％TFA的去離子水中並凍乾。

L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 的合成： 藉由薄層層析（TLC）監測每個步驟的反應，系通過使用UV光作為可視化方法在矽膠板（0.25 mm，60 F₂₅₄ ）上進行監測。快速柱層析（flash column chromatography）在230至400目矽膠上進行。NMR光譜在Bruker Ultrashield 400 Plus NMR光譜儀上。¹ H NMR化學位移參考四甲基矽烷，TMS（d = 0.00）。以下縮寫用於解釋多重性：s =單峰，d =雙峰，t =三重峰，q =四重峰，dd =雙峰雙峰，m =多重峰，br =寬峰。以m／z值為報告的高解析度質譜在Bruker Autoflex MALDI-TOF質譜儀上獲得。低解析度質譜在TQD質譜儀上獲得。L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 的合成路徑由如圖9所示。合成開始於化合物1（4-甲基吡啶）和化合物2（4-二乙基氨基苯甲醛）在氫化鈉（60%礦物油分散體）作為鹼的存在下所進行的反應，得到N,N'-二乙基-4-（2-（吡啶-4-基）乙烯基）苯胺（反應條件a，氰化鈉，二甲基甲醯胺（DMF），約60℃），然後與溴乙酸乙酯反應，得到化合物4（4-（4-（二乙基氨基 ）苯乙烯基）-1-（2-乙氧基-2-氧代乙基）吡啶-1-溴）（反應條件b，溴乙酸乙酯，乙腈（MeCN），約85℃）。然後將化合物4用0.4M NaOH水解，得到化合物5（4-（4-（二乙基氨基）苯乙烯基）-N-羧甲基吡啶陽離子氯化物）（反應條件c，0.4M NaOH，二噁烷，室溫），然後用三種多肽（P₂ 至P₄ ）－樹脂對其進行偶合，然後裂解樹脂得到粗產物（粗L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ ）（反應條件d，多肽－樹脂，二異丙基乙胺（DIPEA），苯並三唑-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸鹽（PyBOP），DMF，室溫；反應條件e，三氟乙酸（TFA），三異丙基矽烷（Tis），H₂ O，室溫）。通過HPLC純化粗產物，得到三種化合物7（L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ ）。

3 ： 產率：62%；¹ HNMR（圖 45）(CDCl₃ )：δ -8.50（dd J₁ = 1.6 Hz, J₂ = 4.8 Hz, 2H)，7.41 (d, J = 8.8 Hz, 2H)，7.31(dd, J₁ = 1.2 Hz, J₂ = 4.8 Hz, 2H)，7.23 (d, J = 16.4 Hz, 1H)，6.77 (d, J = 16 Hz, 1H)，6.67 (d, J = 8.8 Hz, 2H)，3.40 (q, J = 7.2 Hz, 4H)，1.19 (t, J = 7.2 Hz, 6H)；¹³ CNMR （圖46）(CDCl₃ )： δ 149.91, 148.14, 145.67, 133.37, 128.55, 123.22, 120.30, 111.45, 77.20, 44.41, 12.62；

4 ： 產率：90%；¹ HNMR （圖47）(CDCl₃ )：δ -8.83 (d, J = 7.2 Hz, 2H)，7.72 (d, J = 6.8 Hz, 2H)，7.59 (d, J = 16 Hz, 1H)，7.51 (d, J = 8.8 Hz, 2H)，6.82 (d, J = 16 Hz, 1H)，6.68 (d, J = 9.2 Hz, 2H)，5.89 (s, 2H)，4.30 (q, J = 7.2 Hz, 2H)，3.45 (q, J = 7.2 Hz, 4H)，1.33 (t, J = 7.2 Hz, 3H)，1.23 (t, J = 7.2 Hz, 6H)；¹³ CNMR （圖49）(CDCl₃ )：δ 166.53, 155.02, 150.39, 144.65, 143.74, 131,30, 121.66, 115.73, 111.57, 77.23, 63.10, 59.43, 44.69, 14.08, 12.63；MALDI-TOF MS：[M⁺ ]的計算值為339.2067，[M⁺ ]的獲得值為339.2046（圖50）；

5 ： 產率：67%；¹ HNMR （圖51）(MeOD)：δ -8.33 (d, J = 6.8 Hz, 2H)，7.82 (d, J = 6.8 Hz, 2H)，7.70 (d, J = 16 Hz, 1H)，7.49 (d, J = 9.2 Hz, 2H)，6.95 (d, J = 16.4 Hz, 1H)，6.66 (d, J = 9.2 Hz, 2H)，4.88 (s, 2H)，3.38 (q, J = 7.2 Hz, 4H)，1.11 (t, J = 7.2 Hz, 6H)；¹³ CNMR （圖52）(MeOD)：δ 154.03, 150.04, 143.89, 142.70, 130.51, 127.22, 122.10, 121.50, 115.91, 111.25, 61.73, 44.11, 11.54； MALDI-TOF MS：[M⁺ ]的計算值為311.1754，[M⁺ ]的獲得值為311.1662（圖53）。

L₂ P₂ ： MALDI-TOF MS：[M⁺ ]的計算值為：997.5004，[M⁺ ]的獲得值為998.5093；

L₂ P₃ ： MALDI-TOF MS：[M⁺ ]的計算值為：1924.0，[M⁺ ]的獲得值為1925.0；

L₂ P₄ ： MALDI-TOF MS：[M⁺ ]的計算值為：1924.0，[M⁺ ]的獲得值為1926.308。

HPLC 純化 ： 所有多肽接合物在通過高效液相層析（HPLC）純化後使用。使用製備型色譜柱（C18，10.0×250mm，5 µm粒徑）、或在BEH分析柱（C18，2.1×50mm，1.7µm粒徑）的LCT Premier XE質譜儀上進行HPLC純化。多肽／探針由H₂ O／MeCN + 0.1%TFA所沖提。用於純化的淋洗劑梯度為60分鐘內0-55%B，用於分析的梯度設為30分鐘內0-100%B。質譜在TQD質譜儀（Waters Ltd，UK）上進行。藉由使用α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）基質以正離子模式操作的MALDI-TOF質譜分析（Autoflex II ToF／ToF質譜儀Bruker Daltonik GmBH）也證實了獲得的經純化的多肽／多肽接合物。

以L₂ P₄ 為例，以顯示詳細的純化程序。在製備型HPLC之前，準備了L₂ P₄ 粗產物的MALDI-TOF光譜（圖10B）。其對L₂ P₄ 及P₄ 進行表徵（identity），可以看到P₄ 的m／z峰甚至比L₂ P₄ 更強。然後將L₂ P₄ 粗產物稱重以製備5 mg／mL的水溶液，以進行製備型HPLC（圖10C）。

表 1 ： 用於製備型HPLC的溶劑梯度

收集在製備型HPLC中出現的所有波峰並發送以用於MALDI-TOF分析。將L₂ P₄ 的滯留時間段收集的L₂ P₄ 進一步採用分析型HPLC分析。如果分析結果顯示不純的話，會安排再多一次的製備型及分析型HPLC，直到獲得具有單一個峰的純分析HPLC光譜（圖11A至圖11B）。並且本發明人還進行了L₂ P₄ 的LCMS（圖12A至圖12B）和精確質量（圖13A至圖13B）分析。L₂ P₂ 及L₂ P₃ 以類似的方式純化，且其純化的HPLC顯示在圖14A至圖14B中。

表 2 ： 用於分析型HPLC的溶劑梯度

2) MD 模擬 EBNA1的DNA結合域（DBD結構域）的X射線晶體結構是　/　混合折疊，包含四個a螺旋及五個b褶板，其藉由數個彎曲部分（loop）所分離（圖15A至圖15B）。每個結構具有其自身的功能並經由疏水性堆疊共同輔助形成二聚體，　螺旋1至2經由靜電交互作用而與DNA作用，而正電荷彎曲部分1（positive charge loop 1）也介導與DNA的結合。本發明的多肽接合物佔據EBNA1之DBD結構域的二聚合界面。為了研究探針與EBNA1之間的交互作用，在AMBER 14進行了200 奈秒（ns）的MD模擬。

探針－ EBNA1 複合體的初步結構建立： 7個複合體的初始結構建立在MOE軟體中。藉由刪除鏈B中除了殘基561-565（YFMVF）之外的所有殘基，而從EBNA1二聚體獲得P₂ -EBNA1複合體初始結構。所得的經截短之多肽的N端被乙醯化，C端被醯胺化以產生上述複合體結構。L₂ P₂ -EBNA1的初始結構係基於P₂ -EBNA1結構並藉由將L₂ 加入到N端所建立。藉由將RrRKGG序列附加到P₂ 中，亦可透過修飾P₂ -EBNA1結構以獲得P₃ -EBNA1結構。剩餘複合體的結構以類似的方式獲得。

非標準殘基 （ non-standard residue ）之力場參數的修改： 模擬系統中仍然含有數個非標準殘基，諸如L₂ 和連接子（linker，LIN），其在進行MD模擬之前應進行參數化。L₂ -NME的推定結構（圖18A）被上傳至R.E.D.開發伺服器，並藉由將NME的整體電荷限制為零，以計算L₂ 部分的RESP部分電荷。藉由與PARM99或GAFF力場中的類似原子進行比較，以定義缺失力場參數（missing force field parameter）（表3）。

MD 模擬： 使用ff99SBildn力場對Amber 14中的所有系統進行無偏差的200奈秒（ns）MD模擬。在Amber工具14（Amber tools 14）中，系統藉由LEaP模組於具有10 Å緩衝距離的周期邊界（periodic boundary）、立方（cubic）及TIP3顯式水箱（explicit water box）中進行溶劑化（solvate）。整個系統電荷藉由加入相對離子以進行中和。所建立的系統係進行最小化及平衡化（equilibrate）。對於每個模擬，多肽在具有TIP3²² 水分子的周期性截短立方體中溶劑化，在多肽表面及周期性盒體的邊緣之間提供10 Å緩衝距離。接著將多肽在20皮秒（picosecond，ps）內加熱至100K至300K。在生產運行之前對系統的恆定壓力和溫度（NPT）進行200 ps的平衡，以確保正確的密度。以恆定的體積和能量（NVE）以2飛秒（femtosecond，fs）時階（time step）進行生產運行，對氫重原子鍵使用SHAKE約束。

RMSD 以及 RMSF 計算 ： 藉由cpp軌跡以分析生產階段的所有軌跡。EBNA1的殘基16-144係用於結構比對，並排除N末端和C末端的彈性環以計算RMSD。在生產階段的期間，鑒於所有快鏡拍攝（snapshot）的開始及結束，而獲得C_α RMSD。在5奈秒（ns）的時間窗（time window）中計算每個殘基的C_α RMSF。藉由C_α RMSD所定義之距離的內定設置生成七個群集（cluster）的多肽／多肽接合物與EBNA1的複合體。

結合自由能計算 : 所有多肽／多肽接合物對EBNA1的結合自由能由分子力學／泊松－波茲曼表面積（Molecular Mechanics／Poisson-Boltzmann Surface Area，MMPBSA）計算，調整時間間隔以確保在計算中至少包含100幀（frame）。對於廣義玻恩（Generalized Born，GB）計算，使用mbondi2，且鹽濃度設置為0.1 M。離子強度設置為0.1 mM，並且參數／拓撲（prmtop）檔案的半徑係用於泊松波茲曼（PB）的計算。

表 3. 經修正之L₂ 的力場參數

表 4. 自200 ns MD模擬藉由MMPBSA所計算的結合自由能

3) 光物理 學性質的 測量

通過HP UV-8453光譜儀記錄在200至800 nm的光譜範圍內的紫外－可見吸收光譜。使用結合有Fluorolog-3的螢光壽命分析儀及穩態螢光光度計以記錄發射光譜。其配備NL-C2脈衝二極管控制的NanoLED（NL-C2 Pulsed Diode Controller NanoLED），這種NanoLED係一種經濟有效的裝備皮秒至奈秒的光學脈衝（optical pulse）並可適用於紫外至近紅外的廣泛波長範圍內的光源。

L₂ P₂ 、 L₂ P₃ 以及 L₂ P₄ 的穩定度 試驗（ Stability test）： 由於大部分體外試驗（如流式細胞儀、共軛焦成像與共染色以及毒性試驗）係於經過24小時內的培養之後進行，所以經由發射光譜在37℃下對L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 長達24小時的穩定性進行了評估（圖26A至圖26C）。

L₂ P₂ 、 L₂ P₃ 以及 L₂ P₄ 的發光量子產率： 藉由比較方法，使用玫瑰紅6G（f= 95%）在水中在480nm的激發下的發射光譜為參考，測量具有與不具有WT（野生型）EBNA1的L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 的量子產率。L₂ P_n 的量子產率藉由以下方程式1進行評估： f_s = () ()² f_r 方程式1

其中下標r和s分別表示參考品和樣品，f是量子產率，G是從整體發光強度（integrated emission intensity）與吸光度的曲線圖，h是溶劑的折射率。校正曲線是藉由比較經過實驗記錄的標準玫瑰紅6G光譜與公佈的數據所獲得。

在WT EBNA1存在下，L₂ P₃ 和L₂ P₄ 可以實現量子產率的提升。L₂ P₄ 與L₂ P₃ 相比較，係以較小的EBNA1濃度而表現出較大的螢光增強（ϕ _起始 = 4%，ϕ _{5 m M} EBNA1 = 23%，圖27A至圖27H以及圖28A至圖28C），其說明了L₂ P₄ 與WT EBNA1之間具有更強的結合親和力。

經由 發光滴定的 結合常數： 逐漸加入WT EBNA1以進行發光滴定分析（Luminescence titration analysis），以評估三種多肽接合物與WT EBNA1之間的結合常數。當加入陰離子的體積為多肽接合物的5%而仍不對螢光強度產生影響或對發光的影響為飽和時，則停止添加WT EBNA1。以K_a 來表示的的結合常數（binding constant）是從雙對數回歸曲線得到的： lg[(I-I₀ )/I₀ ] = lg K_a + n lg[G] 方程式2

其中I和I₀ 分別是當前以及初始螢光，K_a 為結合常數，n為每個WT EBNA1結合的探針數目，而[G]為WT EBNA1的總濃度。

經由 發光滴定的 選擇性測試 ： 準備滴定實驗以研究數種常見的生物陰離子和牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA）對L₂ P₃ 和L₂ P₄ 的影響（L₂ P₂ 對不同的生物性陰離子及蛋白質的選擇性並未測量，這是由於滴定至WT EBNA1時L₂ P₂ 的發射光譜也沒有增強，表示L₂ P₂ 和WT EBNA1之間的結合極弱或甚至無結合）。每個陰離子及BSA的液體濃縮儲備溶液各自逐漸添加至相關探針的溶液中。當加入陰離子的體積為多肽接合物溶液的5%而仍不對螢光光譜產生影響或對探針發光的影響呈飽和時，停止加入。藉由上述程序判定發射光譜。

不同溶劑中的吸收光譜： 測量極性和非極性溶劑中的L₂ P₄ 的吸收光譜，以進一步研究分子間電荷轉移（ICT）狀態。從光譜中可以看出，在274 nm和〜500 nm處出現了兩個吸收帶，分別對應於從基態到原始激發（LE）狀態和ICT狀態的轉變，這跟文獻中類似分子的雙發射光譜一致。極性溶劑中最大吸收帶有些微的紅移。這種現象表明，由於從–N(Et)₂ 基團向連接於苯環之受體的p*系統給予電子，ICT狀態比基態更具極性，所以這種紅移與ICT特性一致。

pH 對發光 的影響： 測量不同pH下的L₂ P₄ 的發光，進一步證實了ICT狀態的存在。PBS緩衝液中不同pH下L₂ P₄ 和L₂ P₃ 的發射光譜如圖33A至圖33D所示。614 nm處的發光帶隨著pH值從7變化至2而逐漸降低，此觀察結果與ICT發光的特性一致，由於氮離子對與H⁺ 鍵結，因此無法產生ICT狀態，且因此降低ICT狀態的發光。同時，pK_a 值係透過亨德森－哈塞爾巴爾赫（Henderson-Hasselbalch）方程式來進行計算： pH = pK_a + log方程式3

不同溶劑中的 螢光 壽命 （ 衰減 ） ： 極性和非極性溶劑中的L₂ P₄ （於625nm處監測）的螢光壽命（衰減）藉由使用460nm的LED光源（HKBU，化學系）的NanoLED於Fluorolog-3 spectrofluorometer光譜儀上所測定（圖34）。螢光壽命（衰減）記錄在表5中，它顯示螢光壽命包含兩個成分。相對較大的LE螢光壽命（衰減）和相應的較小的ICT螢光壽命（衰減）可以在極性較小的溶劑中獲得，其可以解釋為在小極性之溶劑中ICT狀態的偶極矩為小，進而導致ICT激發態的上移（upshift）。

表 5. 在不同溶劑中L₂ P₄ 的螢光壽命

4) 體外成像、組織培養以及 MTT 測定

蛋白質樣品製備： 使用五種蛋白質樣品。與穀胱甘肽S-轉移酶融合的野生型EBNA1蛋白（379-641 a.a.）在大腸桿菌中表現並通過穀胱甘肽瓊脂糖凝膠4B（glutathione sepharose 4B，GE Healthcare Dharmacon）潤洗而純化，之後製備5 μg EBNA1，並在37℃下與MBS一起培養10分鐘。蛋白質在SDS-PAGE凝膠上分離，轉移到硝酸纖維素膜上並藉由抗體進行轉印。蛋白質條帶的強度藉由Gel-Pro分析儀（Gel-Pro Analyzer）測量，並用GraphPad Prism 5.0軟體進行繪製。通過定點誘變（site-directed mutagenesis）將YFMVF突變為FFAVA（產生EBNA1-3A突變體）或Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 至A的保守點突變（產生EBNA1-Y₅₆₁ A、EBNA1-M₅₆₃ A以及EBNA1-F₅₆₅ A）製備EBNA1突變蛋白。

EBNA1 蛋白和體外 MBS 交聯劑介導的二聚合 效率的 測定： 對於MBS（3-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺（3-maleimidobenzoyl N-hydroxysuccinimide））交聯的EBNA1二聚合效率的測定，係將5 mg WT和突變體EBNA1與MBS在37℃培養10分鐘。接著將其在SDS-PAGE凝膠上分離，轉移到硝酸纖維素膜上並藉由抗體進行轉印。使用GraphPad Prism 5.0軟體進行免疫印跡分析（western blotting）條帶的強度。MBS介導的蛋白質交聯效應以二聚體／單體的比例表示。

細胞培養： MRC-5細胞（正常肺纖維母細胞）於基礎培養基（Minimum Essential Medium，MEM）中生長；HeLa細胞（子宮頸癌細胞）於DMEM培養基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM）中生長；CNE2細胞、Ramos細胞、C666-1細胞以及Raji細胞(鼻咽癌細胞)於RPMI-1640培養基中生長（Roswell Park Memorial Institute-1640 medium，RPMI-1640 medium），所有使用的培養基均補充有10％胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、1%青黴素和鏈黴素，37℃以及5%二氧化碳。

從具有III期復發性NPC之64歲男性患者的手術切除的NPV組織建立NPC 43細胞。NPC 43細胞攜帶EBV病毒，並保存在補充有10%FBS及4mM Rho激酶抑制劑的RPMI培養基中，Y27632倍增超過200群體。當注射在NOD／SCID小鼠的皮下位點（subcutaneous site）（1000萬細胞）時，NPC 43為具致腫瘤性的（tumorigenic）。STR分析（STR profiling）確認其來源來自於NPV患者。利用TPA／丁酸鈉進行處理並從NPC 43細胞的上清液中收集的感染性EBV，通過對NPC 43細胞的裂解式活化（lytic reactivation）獲得感染性EBV病毒。

對於細胞攝取（ cellular uptake ）的流式細胞儀分析 ： 將HeLa和C666-1細胞（每個樣品有10⁵ 個）接種到35 m培養皿（Petri dish）中過夜。之後，將細胞與多肽接合物一同培養，以胰蛋白酶消化並用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）洗滌數次。使用流式細胞儀（flow cytometry）在氬激光產生的488nm激發下評估細胞攝取。藉由使用配備有650nm長通濾光片（long pass filter）的FL-3獲得發光。分析10000個細胞數目以獲得細胞攝取情況。

體外成像以及共染色： 為了研究L₂ P_n 的體外行為和細胞器定位，用2 mL組織培養基將10 μML₂ P_n 加入到C666-1細胞中。在監測成像之前，將細胞培養6小時。在共染色實驗中進一步用1 nM細胞核溶酶體染劑／粒線體染劑／Hoechst 33342處理1小時。使用商業用多光子徠卡TCS SP5（multi-photon Leica TCS SP5）（直立配置）共軛焦顯微鏡進行成像，此共聚焦顯微鏡配備有相關的飛秒雷射（femto-second laser）（680 nm至1050 nm）、氬雷射（432 nm，457 nm及488 nm）、氦－氖雷射（He-Ne laser）（632 nm）、UV燈以及受控制的CO₂ 含量階段頂部組織培養腔室（CO₂ content stage-top tissue culture chamber）（2至7% CO₂ ，37℃）。

毒性測試 ： 根據標準方法進行MTT存活率測定。簡言之，在暴露於多肽接合物之前，將3×10³ 細胞接種在96孔盤中並培養24小時。細胞在黑暗處用多肽接合物處理再培養24小時。用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）潤洗孔中的單層細胞，接著與50 μL MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物）溶液（0.5mg／mL）在37°C再培養3小時。然後，移除培養基，加入100 μL的DMSO溶解試劑，搖動30分鐘，使活細胞中形成的甲䐶晶體（formazan crystal）溶解。在Labsystem Multiskan微量盤式分析儀（Labsystem Multiskan microplate reader）（Merck Eurolab，瑞士）上，於雙波長540nm以及690nm測量吸光度。每一劑量濃度在三個孔中重複檢測，並重覆兩次。P₂ 、P₃ 及P₄ 的MTT細胞毒性如圖39A至圖39F所示。

5) 動物實驗研究

裸鼠之 腫瘤內注射 ： 將懸浮在110 mL無血清RPMI培養基1640（Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media 1640）中的C666-1細胞（8×10⁶ ）與基質膠（Matrigel）1：1混合至最終體積為150 ml，並注射到6至8週齡的雄性BALB／c裸鼠。接種18天後，當腫瘤的平均體積生長至200至300 mm³ 時，將小鼠隨機分為實驗組（每組n = 3或4）。將P₄ 和L₂ P₄ 用含0.1%DMSO的PBS稀釋至所需濃度（2 mg，P₄ -L及L₂ P₄ -L；4mg，P₄ -H及L₂ P₄ -H），並使用29號注射器（29 gauge syringe）直接注射到腫瘤中。單獨接受等體積之0.1%DMSO注射的小鼠作為對照組。每週兩次測量小鼠的體重和腫瘤體積。腫瘤體積計算為（長×寬² ）／2（(length × width² )/2）。腫瘤內注射每週重複兩次，持續3週，然後殺死小鼠，並測量其內臟和腫瘤並秤重。

表 6. 藥物治療所研究的小鼠數量

靶向 EBNA1 病毒蛋白作為 EBV 相關腫瘤治療且伴隨正電子發光斷層掃描成像的方法

本發明的另一實施例中提出EBV相關腫瘤的治療方法，使用來自與L₂ P₄ 相同的L₂ 結構家族的核可滲透小分子抑制劑進行正電子發光斷層掃描成像（positron emission tomography imaging）。圖58顯示了相同L₂ 結構家族的不同配體合成而可導致用於PET成像的L₂ P₄ 和L₂ 的說明。

引起注意的成像技術是正電子發光斷層掃描（PET），其中引入放射性元素以產生作為示蹤劑（tracer）來參與生理過程的小分子的類似物。臨床使用的示蹤劑是18F-氟脫氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，FDG），其是大量涉及腫瘤發育的葡萄醣類似物。然而，通過正常組織攝取FDG會產生限制靈敏度的干擾。必須明顯地改善選擇性。

本實施例提供用於EBV相關癌症的雙重模態成像技術（dual-modality imaging technique）（光學及PET）。多項研究表明，EBNA1與EBV相關惡性腫瘤的發生具有相關性，有利於將EBNA1在各種過程中的作用進行可視化，並設計合適的抑制劑。在文獻中，為了提高T細胞治療對EBV病毒的療效，治療部位必須在細胞質中。此種治療中使用的成像劑應設計為：1）特異性定位於細胞質中以達到最大治療效果，並且2）使細胞質可視化，以便監測治療進展。另一方面，一些研究表明，EBNA1在細胞分裂過程中至關重要，負責活化III型潛伏期（type III latency）的細胞中其他病毒轉化蛋白（viral transforming protein）的轉錄。因而需要將聚焦於此種方式的成像劑設計成具有核可滲透性，以便進行成像。產生核可滲透分子的挑戰是普遍常見的，更何況是核可滲透的螢光化合物。因此，本發明還提供對EBNA1具有特異性的成像劑，並同時顯示細胞定位。

本發明人已經設計並合成具功能性的選擇性胜肽，以將其接合至用於光學成像的小分子上，並且還應用鎵（gallium）標記以產生更適合於細胞核成像的雙模態探針（dual-modality probe）。亦對EBNA1及癌症抑制的選擇性和結合親和力的區域進行研究以便改進。本發明人在高效劑量（＜4 μmol／kg，～92%的癌症抑制）下干擾EBV相關的癌細胞的生長已經取得巨大的突破，並且EBNA1可以在本發明的實施態樣中在細胞核中可視化而作為生物探針。

顯著性

本發明人選擇將雙模態探針集中於體外和體內進行PET和光學成像。本發明人製備並引入各種胜肽以優化針對EBNA1的靶向特異性以用於可行的臨床應用，目前臨床實踐中尚不可用。本發明人亦研究特異性抑制EBNA1二聚合的基礎機制，據信此係於腫瘤發生中至關重要的。此種相互作用的結果為體外和體內靶向及監測EBV相關癌症提供深入的原則證據調查，並控制EBV潛伏感染腫瘤（如鼻咽癌）的生長。

EBNA1 特異性 PET 成像劑的 設計和合成、以及 EBNA1 與所提出的冷標記物（ cold labelling agent ）之間的結合機制的研究

EBNA1 特異性 PET （冷標記）可用於成像劑的合成

與商業市場上或文獻可用的PET試劑有關的兩個主要問題－（i）癌細胞的識別和（ii）放射性金屬和配體之間的協調時間。為了快速進行放射性標記，本發明人報導了經由新的和快速的微波方法的鎵－卟啉－釕複合體且於進行高產率（〜60%）的放射性標記。在本發明的一個實施態樣中，本發明人已經生成許多EBNA1特異性雙功能探針以進行PET成像以及EBNA1功能的抑制，然後可以將其應用於EBV相關疾病治療。已經合成了與EBNA1特異性胜肽連接的20個冷鎵標記複合體。本發明人的揭露顯示，與EBNA1特異性胜肽接合的新型鑭系元素複合體（lanthanide complex）在體外表現出EBNA1的選擇性成像，然而，次細胞定位（僅細胞質）限制其治療價值。EBNA1主要位於細胞核中。本發明人先前已經鑑定了核可滲透的EBNA1滲透胜肽以及與特定PET可用配體接合之胜肽的成功合成（圖59）。這在EBNA1抑制功能的研究中取得了很大進展。在提高細胞滲透性和有效監測其治療效果方面，可以對商業或近期研究的抗癌劑進行重大改變。亦將一系列新設計的胜肽應用於EBNA1的特異性結合。本發明的一些其它實施態樣，其中MRI成像配體已被合成，如圖60所示。圖61顯示本發明的實施態樣，其中用於PET成像的配體亦被合成。

經由等溫滴定量熱（ isothermal titration calorimetric ）法和蛋白質 NMR 評估結合親和力

複合物與EBNA1的結合和選擇性經由等溫滴定量熱法（ITC）透過複合體與EBNA1的結合親和力進行檢驗。ITC是測定溶液中交互作用的標準品，特別是搭配其配體的大分子蛋白質。其提供分子－分子交互作用中實時且準確的溶液觀察，具有無標記的優點，沒有分子量／類型的限制，最重要是不具破壞性。

所提出的冷鎵複合體（ cold gallium complex ）的體內生物分佈評估：

將所有提出的複合體用靜脈內注射至攜帶異種移植腫瘤（EBV陽性或陰性腫瘤）的BALB／c無胸腺小鼠。通過ICP-MS測定反映鎵含量及複合體的量。評估小鼠尿液中的鎵含量，以確認這些複合體在體內的代謝。此外，所提出的冷鎵複合體的體內發光被監測。小鼠的全身體內成像藉由具有457／800／980 nm激發源的體內成像盒（in vivo imaging box）進行，並透過手術提取異種移植物，以用於雙光子共軛焦顯微鏡，提取腹膜細胞（peritumoral cell）作為對照組。體內光學成像將在PI研究所進行。將選擇5種鎵複合體進行體內微PET成像（in vivo micro-PET imaging）。

在各種小鼠模型（ 9 個月）中的體內 PET 成像： 選定五個鎵複合體，並藉由在全自動模組化實驗室系統（fully-automated Modular-Lab system）中使用Eckert & Ziegler IGG100⁶⁸ Ge／⁶⁸ Ga產生器（Eckert & Ziegler IGG100⁶⁸ Ge/⁶⁸ Ga-Generator）來製備進行複合體的放射性標記⁶⁸ GaCl₃ 。如同冷複合體的體內研究，將熱複合體用靜脈內注射至具有EBV陽性或EBV陰性腫瘤的BALB／c無胸腺小鼠。這些結果與PET成像相關。此外，在EBV陽性和EBV陰性細胞系中監測放射性標記的鎵複合體與EBNA1的體外成像，結果與獲得的數據進行比較。

⁶⁸ Ge／⁶⁸ Ga產生器在全自動模組化實驗室系統中。 如同冷複合體的體內研究，將熱複合物靜脈內註射到具有EBV陽性或EBV陰性腫瘤的BALB／c無胸腺小鼠。所得結果與PET成像相關。此外，在EBV陽性和EBV陰性細胞系中監測放射性標記的鎵複合體與EBNA1的體外成像，結果與獲得的數據進行比較。

複合體在階段 1 （ 9 個月）的生物學和藥代動力學研究

藉由流式細胞儀以及共軛焦顯微鏡評估所合成的探針在 EBV 陽性和陰性 NPC 細胞中的細胞毒性和細胞 器 定位： 腫瘤球形成測定（tumor sphere formation assay）用於評估合成探針的抗腫瘤活性。EBV陽性細胞系（例如C666-1、MKN28、LCL(GT)-B細胞、LCL(GS)-B細胞）以及EBV陰性細胞系（例如MKN1、Akata B細胞，Awaia B細胞及HeLa細胞）在1.1節中以不同濃度處理所提出的複合體。確定每個培養物中形成的腫瘤球的大小／數目。結果表示每次治療的尺寸分佈曲線和腫瘤球的總數目。通過流式細胞儀監測細胞毒性，並使用共軛焦顯微鏡測定探針的刺細胞定位。評估所提出的冷鎵複合體在EBV陽性／陰性細胞系中的IC₅₀ 值。

藥代動力學 研究： 鎵基EBNA1標記試劑的血漿及尿液之藥代動力學研究於小鼠中進行。藥代動力學測定在PI和NKM實驗室進行。動物在使用單劑量的鎵標記物（gallium labelling agent）（Regan-Shaw，FASEBJ 2008）進行i.p.注射之前禁食過夜。將小鼠分別安置在代謝籠，並且在時間0（作為空白）及藥物治療後的每24小時從每組8隻小鼠收集尿液及血液樣本，直到信號消失。將尿液樣本過濾並儲存在-80°C直到分析。收集尾靜脈的血液樣本。離心後收集的血漿樣本儲存在-80°C直到分析。使用鎵化合物的ICP-MS分析樣本。利用藥代動力學分析軟體，藉由非隔室方法（non-compartmental method）測定鎵基標記物的藥代動力學參數。

無

本專利或申請文件至少包含一個彩色處理的圖式。含有彩色圖式之本專利或專利申請公開案的複本將由官方當局根據要求提供，並支付必要的費用。

當結合附圖時，本發明的上述和其它目的和特徵將從下面對本發明的描述中變得顯而易見，其中：

圖1A顯示本發明的多肽接合物L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P_4­ 的化學結構。P₂ （YFMVF）衍生自EBNA1的b4且具有EBNA1特異性。P₃ （CAhxRrRKGGYFMVF，其中Ahx為6-胺基己酸 (6-aminohexanoic acid)，R為L-精氨酸 (L-arginine)，且r為D-精氨酸 (D-arginine)）以及P₄ （CAhxYFMVFGGRrRK，其中Ahx為6-胺基己酸）多肽具有EBNA1特異性及細胞核穿透性（細胞核穿透性的獲得是由於在P₃ 的中部或P₄ 的C端引入的入核信號RrRK）。

圖1B顯示由MD模擬所推定的L₂ P₄ 和EBNA1單體之DNA結合域（DNA-binding domain）之間的交互作用。EBNA1係以帶狀所示（左）以及以靜電表面（electrostatic surface）所示（右）。EBNA1的單體結構係通過對EBNA1-DNA複合體（蛋白質資料庫 ID：1B3T）的X射線晶體結構的分離所推出的。模擬顯示L₂ P₄ 與EBNA1二聚界面的結合主要經由YFMVF的疏水性交互作用形成，且此種結合作用能進一步藉由RrRK的靜電交互作用而加強。虛線的橢圓形內所示的是紅色發光團（L₂ ）。

圖1C顯示的是MD模擬建議的探針L₂ P₂ 、L₂ P₃ 及L₂ P₄ 與EBNA1相互作用的代表性構型。所算出的廣義玻恩（GB）及泊松－波茲曼（PB）數值表示本發明的探針與EBNA1之間的結合自由能。

圖2A顯示在添加野生型EBNA1（WT-EBNA1）的情形下，L₂ P₄ 出現的響應性信號-8.8倍的發光強度的增加以及25 nm的藍移（由直角箭頭所表示），l_ex 為激發波長。

圖2B 顯示在添加WT-EBNA1時，L₂ 、L₂ P₂ 、L₂ P₃ 及L₂ P₄ 之發光強度的變化。

圖2C顯示L₂ P₄ 對於不同蛋白質的選擇性；藉由發光強度所表示，發光強度以任意單位（arbitrary unit，a.u.）為單位。

圖2D顯示L₂ P₄ 在不同緩衝pH值下的發射光譜；用於確認L₂ P₄ 的ICT特性，並判定pKa值。當pH值自7降低至2，發光帶逐漸降低，這與ICT發光特性相吻合。在酸性條件下（較低pH值），由於氮原子質子化，氮原子上的孤對電子不足以產生ICT激發態，進而降低ICT發光。插圖：在不同pH緩衝溶液中，L₂ P₄ 的發光強度。

圖2E顯示溶劑化效應（solvatochromism experiment）對L₂ P₄ 發射光譜的影響，即溶劑極性的不斷降低對L₂ P₄ 發射光譜的影響。

圖2F顯示L₂ P₄ 與WT-EBNA1結合時的螢光壽命（衰減）。

圖2G顯示L₂ P₄ 於溶劑極性不斷增加（溶劑效應）時的螢光壽命（衰減）。如圖所示，在極性較小的溶劑中出現的相對大的由原始激發（LE）產生的發光衰減和相對應較小的由ICT產生的發光衰減，表明較小的偶極矩相應的提升了ICT的激發態。此外，值得注意的是，L₂ P₄ 在結合WT-EBNA1時的螢光壽命與其在極性溶劑中的螢光壽命相似。

圖3A顯示的是在EBV陽性C666-1細胞中L₂ P₂ 探針的體外共軛焦顯微鏡影像結果圖。l_ex = 488 nm；l_em = 500至650 nm；濾鏡為BP500。C666-1係經L₂ P₂ （10 mM）處理6小時，接著用細胞核染劑Hoechst 33342（1 nM）共同染色1小時。L₂ P₂ 探針和Hoechst 33342的發光強度圖是根據共軛焦顯微鏡圖像上標示的綠線處的強度所繪製。

圖3B顯示的是在EBV陽性C666-1細胞中的L₂ P₃ 探針的體外共軛焦顯微鏡影像結果圖。l_ex = 488 nm；l_em = 500至650 nm；濾鏡為BP500。C666-1係經L₂ P₃ （10 mM）處理6小時，接著用細胞核染劑Hoechst 33342（1 nM）共同染色1小時。L₂ P₃ 探針和Hoechst 33342的發光強度圖是根據共軛焦顯微鏡圖像上標示的綠線處的強度所繪製。

圖3C顯示的是在EBV陽性C666-1細胞中的L₂ P₄ 探針的體外共軛焦顯微鏡影像結果圖。l_ex = 488 nm；l_em = 500至650 nm；濾鏡為BP500。C666-1係經L₂ P₄ （10 mM）處理6小時，接著用細胞核染劑Hoechst 33342（1 nM）共同染色1小時。L₂ P₄ 探針和Hoechst 33342的發光強度圖是根據共軛焦顯微鏡圖像上標示的綠線處的強度所繪製。在細胞核中發現的L₂ P₄ （通過λ掃描）的發光帶的形狀與位置與溶液中得到的數據類似。

圖3D顯示的是在EBV陽性NPC43細胞中的L₂ P₂ 探針的體外共軛焦顯微鏡影像結果圖。l_ex = 488 nm；l_em = 500至650 nm；濾鏡為BP500。NPC43係經L₂ P₂ （10 mM）處理6小時，接著用細胞核染劑Hoechst 33342（1 nM）共同染色1小時。L₂ P₂ 探針和Hoechst 33342的發光強度圖是根據共軛焦顯微鏡圖像上標示的綠線處的強度所繪製。

圖3E顯示的是在EBV陽性NPC43細胞中的L₂ P₃ 探針的體外共軛焦顯微鏡影像結果圖。l_ex = 488 nm；l_em = 500至650 nm；濾鏡為BP500。NPC43係經L₂ P₃ （10 mM）處理6小時，接著用細胞核染劑Hoechst 33342（1 nM）共同染色1小時。L₂ P₃ 探針和Hoechst 33342的發光強度圖是根據共軛焦顯微鏡圖像上標示的綠線處的強度所繪製。

圖3F顯示的是在EBV陽性NPC43細胞中的L₂ P₄ 探針的體外共軛焦顯微鏡影像結果圖。l_ex = 488 nm；l_em = 500至650 nm；濾鏡為BP500。NPC43係經L₂ P₄ （10 mM）處理6小時，接著用細胞核染劑Hoechst 33342（1 nM）共同染色1小時。L₂ P₄ 探針和Hoechst 33342的發光強度圖是根據共軛焦顯微鏡圖像上標示的綠線處的強度所繪製。在細胞核中發現的L₂ P₄ （通過λ掃描）的發光帶的形狀與位置與在溶液中得到的數據類似。

圖4A顯示的是在EBV陰性（CNE2及Hela）以及EBV陽性（C666-1）細胞中的L₂ P₂ 、L₂ P₃ 與L₂ P₄ 探針的體外共軛焦顯微鏡影像結果圖。相對應的亮視野影像顯示於右方。如圖所示，相對於EBV陰性細胞，L₂ P₄ 的發射光譜對EBV陽性細胞具有選擇性。

圖4B顯示的是細胞核中的L₂ P₂ 、L₂ P₃ 與L₂ P₄ 的體外發射光譜（數據來自共軛焦顯微鏡）。在EBV陽性C666-1細胞中，L₂ P₄ 之發光強度是L₂ P ₃ 之發光強度的三倍以上。

圖5A顯示EBNA1蛋白質純化結果。與穀胱甘肽S-轉移酶（GST）融合的EBNA1蛋白質（379-641a.a.）表現於在大腸桿菌（BL21）中，並藉由穀胱甘肽瓊脂糖凝膠4B潤洗（GE Healthcare Dharmacon）純化。EBNA1突變體（EBNA1-3A）是通過將野生型EBNA1中氨基酸序列YFMVF突變為FFAVA所產生的。

圖5B顯示MBS交聯的EBNA1二聚合效率。野生型（WT）和突變體EBNA1（EBNA1-3A）的二聚化分析表明突變體EBNA1的二聚合能力有所降低。

圖5C顯示了不同EBNA1蛋白的同型二聚合效率（**，P＜0.01）的比較。其中，突變體EBNA1（EBNA1-3A）的二聚合效率有所降低。

圖6A顯示EBNA1的二聚合效率。在添加多肽（P₂ -P₄ ）之後，對野生型EBNA1的二聚合效率進行了測定。

圖6B顯示EBNA1的二聚合效率。多肽（P₂ -P₄ ）對EBNA1二聚合效率的抑制作用以EBNA1二聚體／單體的比例來表示；每個蛋白質帶的強度以三個獨立實驗的平均值±s.d.表示。

圖6C顯示EBNA1的二聚合效率。在添加多肽（L₂ P₂ -L₂ P₄ ）之後，對野生型EBNA1的二聚合效率進行了測定。

圖6D顯示EBNA1的二聚合效率。多肽接合物（L₂ P₂ -L₂ P₄ ）對EBNA1二聚合效率的抑制作用以EBNA1二聚體／單體的比例來表示；每個蛋白質帶的強度以三個獨立實驗的平均值±s.d.表示。

圖7A顯示接合物探針於EBV陰性的人類正常肺纖維母細胞MRC-5 24小時後的細胞毒性（MTT測定）結果。各接合物探針三重複試驗，並重覆進行二次。

圖7B顯示接合物探針於EBV陰性的人類子宮頸癌HeLa細胞24小時後的細胞毒性（MTT測定）結果。各接合物探針三重複試驗，並重覆進行二次。數據以平均值±s.d.表示。

圖7C顯示接合物探針於EBV陰性的柏基特淋巴瘤Ramo細胞24小時後的細胞毒性（MTT測定）結果。各接合物探針三重複試驗，並重覆進行二次。數據以平均值±s.d.表示。

圖7D顯示接合物探針於EBV陽性的鼻咽癌C666-1細胞24小時後的細胞毒性（MTT測定）結果。各接合物探針三重複試驗，並重覆進行二次。數據以平均值±s.d.表示。

圖7E顯示接合物探針於EBV陽性的鼻咽癌NPC43細胞24小時後的細胞毒性（MTT測定）結果。各接合物探針三重複試驗，並重覆進行二次。數據以平均值±s.d.表示。

圖7F顯示接合物探針於EBV陽性的柏基特淋巴瘤Raji細胞24小時後的細胞毒性（MTT測定）結果。各接合物探針三重複試驗，並重覆進行二次。數據以平均值±s.d.表示。

圖8A顯示體內腫瘤抑制測定結果。給予小鼠腫瘤內注射二甲基亞砜（DMSO，對照組），每週兩次，持續21天。於實驗終點時，將腫瘤切除並進行拍照。

圖8B顯示P₄ （每個腫瘤4 mg的注射量）的體內腫瘤抑制測定結果。給予小鼠腫瘤內注射P₄ ，每週兩次，持續21天；高劑量（H）及低劑量（L）分別為每個腫瘤4 mg及2 mg。於實驗終點時，將腫瘤切除並進行拍照。

圖8C顯示L₂ P₄ （每個腫瘤4 mg的注射量）的體內腫瘤抑制測定結果。給予小鼠腫瘤內注射L₂ P₄ ，每週兩次，持續21天；高劑量（H）及低劑量（L）分別為每個腫瘤4 mg及2 mg。於實驗終點時，將腫瘤切除並進行拍照。

圖8D顯示P₄ 和L₂ P₄ 作為EBV特異性抗癌劑的體內研究結果。對P₄ 和L₂ P₄ 進行體內腫瘤抑制測定，給予小鼠腫瘤內注射P₄ 、L₂ P₄ 或二甲基亞砜（DMSO為載體和對照組），每週兩次，持續21天；高（H）和低（L）劑量分別為每個腫瘤4 mg及2 mg。於實驗終點時，將腫瘤切除、進行拍照並測量其重量。數據以平均值±SEM表示。* P ＜0.05；** P ＜0.005。

圖8E顯示P₄ 和L₂ P₄ 作為EBV特異性抗癌劑的體內研究結果。對P₄ 和L₂ P₄ 進行體內腫瘤抑制測定，給予小鼠腫瘤內注射P₄ 、L₂ P₄ 或二甲基亞砜（DMSO為載體和對照組），每週兩次，持續21天；高（H）和低（L）劑量分別為每個腫瘤4 mg及2 mg。於實驗終點時，將腫瘤切除、進行拍照並測量其體積。數據以平均值±SEM表示。* P ＜0.05；** P ＜0.005。

圖8F顯示P₄ 和L₂ P₄ 作為EBV特異性抗癌劑的體內研究結果。對P₄ 和L₂ P₄ 進行體內腫瘤抑制測定，給予小鼠腫瘤內注射P₄ 、L₂ P₄ 或二甲基亞砜（DMSO為載體和對照組），每週兩次，持續21天；高（H）和低（L）劑量分別為每個腫瘤4 mg及2 mg。於實驗終點時，將腫瘤切除。被切除的C666-1腫瘤的代表性螢光影像。在小鼠死亡後，直接切除腫瘤，並將螢光量化為總輻射效率[光子／秒] ／ [µW／cm² ]。影像：min = 0.00，max =5.59´10⁸ 。

圖9顯示L₂ P₂ ,、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 的合成路徑。

圖10A顯示粗肽P₄ 的MALDI-TOF光譜。

圖10B顯示未經純化的多肽結合物L₂ P₄ 的MALDI-TOF光譜。

圖10C顯示對L₂ P₄ 進行純化的製備型HPLC光譜。

圖11A顯示經純化之L₂ P₄ 的MALDI-TOF光譜。相對於P₄ 的MALDI-TOF光譜中最強的波峰1632.0，此時已被去除。

圖11B顯示經純化之L₂ P₄ 的分析型HPLC光譜。

圖12A顯示經純化之L₂ P₄ 的LCMS光譜。

圖12B顯示經純化之L₂ P₄ 的LCMS分析結果（[L₂ P₄ +2H]²⁺ ：計算值963.025，獲得值963.592；[L₂ P₄ +3H]³⁺ ：計算值642.352，獲得值643.479；[L₂ P₄ +4H]⁴⁺ ：計算值482.016，獲得值482.785；[L₂ P₄ +5H]⁵⁺ ：計算值385.814，獲得值386.441；[L₂ P₄ +6H]⁶⁺ ：321.680，獲得值322.949）。

圖13A顯示經純化之L₂ P₄ 的模擬精確質譜。

圖13B顯示經純化之L₂ P₄ 的實驗精確質譜。

圖14A顯示經純化之L₂ P₂ 的分析型HPLC光譜。

圖14B顯示經純化之L₂ P₃ 的分析型HPLC光譜。

圖15A顯示EBNA1 DBD結構域 (蛋白質資料庫ID：1B3T，鏈A，殘基461- 607)之蛋白質序列中的主要結構單元。

圖15B顯示EBNA1 DBD結構域 (蛋白質資料庫ID：1B3T，鏈A，殘基461- 607)之晶體結構中的主要結構單元。

圖16A顯示用於MD模擬的EBNA1單體（461-607）中DBD上的全部殘基的C_a RMSF。

圖16B顯示EBNA1單體中全部殘基的C_a RMSD值（上方），以及去除了高度動態的彎曲部分1及彎曲部分5（highly dynamic loop 1 and 5）之後的全部殘基的C_a RMSD（下方）。

圖16C顯示組成二聚合界面的四個b褶板（beta sheet）（b1：503-511，b2：532-540，b3：556-566以及b4：593-604）的C_a RMSD。

圖16D顯示二聚合界面上的關鍵殘基的SASA值，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 與F₅₆₅ 。這些殘基的SASA的參考值已算出並用黑色虛線標在圖上。其中，Y₅₆₁ 的值為44.7；M₅₆₃ 的值為22.7；F₅₆₅ 的值為27.6。

圖16E顯示從200奈秒（ns）的MD模擬所計算之主要群集的代表性EBNA1單體構型（母體＞ 5％）。

圖16F顯示EBNA1單體之最大群集的代表性結構，且這一結構被選定用於對接研究。

圖17A顯示200奈秒（ns）MD模擬所選出的P₂ -EBNA1的結合模式。多肽序列和對接能量標示在圖中。EBNA1係呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖17B顯示200奈秒（ns）MD模擬所選出的L₂ P₂ -EBNA1的結合模式。多肽序列和對接能量標示在圖中。EBNA1係呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖17C顯示200奈秒（ns）MD模擬所選出的P₃ -EBNA1複合體的結合模式。多肽序列和對接能量標示在圖中。EBNA1係呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖17D顯示用於200奈秒（ns）MD模擬所選出的L₂ P₃ -EBNA1複合體的結合模式。多肽序列和對接能量標示在圖中。EBNA1係呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀的形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖17E顯示用於200奈秒（ns）MD模擬所選出的P₄ -EBNA1複合體的結合模式。多肽序列和對接能量標示在圖中。EBNA1係呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀的形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖17F顯示用於200奈秒（ns）MD模擬所選出的L₂ P₄ -EBNA1複合體的結合模式。多肽序列和對接能量標示在圖中。EBNA1係呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀的形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖18A顯示L₂ 的化學結構（左）和AMBER原子類型（右）。推定的結構用於計算限制靜電勢（Restrained Electrostatic Potential，RESP）電荷，並顯示能量精化輔助建模（assisted model building with energy refinement，AMBER）的原子類型。

圖18B顯示LIN的化學結構（左）和AMBER原子類型（右）。推定的結構用於計算限制靜電勢（Restrained Electrostatic Potential，RESP）電荷，並顯示能量精化輔助建模的原子類型。

圖19A顯示在P₂ -EBNA1複合體之MD模擬中的EBNA1全部殘基的C_a RMSF。

圖19B顯示在P₂ -EBNA1複合體之MD模擬中的P₂ 的C_a RMSF。

圖19C顯示關於在P₂ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，EBNA1之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及去除了高度動態的彎曲部分1及彎曲部分5（highly dynamic loop 1 and 5）之外的全部殘基的C_a RMSD演變（下方）。

圖19D顯示關於在P₂ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，P₂ 中之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及對於YFMVF部分的C_a RMSD（下方）。

圖19E顯示在P₂ -EBNA1複合體的MD模擬中涉及探針－受體疏水性連接的二聚合界面上的關鍵殘基（Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 與F₅₆₅ ）的SASA。模擬期間每個關鍵殘基的SASA都被計算並與其在自由可及狀態（free-accessible status）的參考值（虛線）進行了比較。若SASA較參考值為小，則認為此中的殘基可與EBNA1形成分子內或分子間鏈的蔬水性連接。

圖20A顯示在L₂ P₂ -EBNA1複合體之MD模擬中的EBNA1中全部殘基的C_a RMSF。

圖20B顯示在L₂ P₂ -EBNA1複合體之MD模擬中的L₂ P₂ 的C_a RMSF。

圖20C顯示關於在L₂ P₂ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，EBNA1之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及去除了高度動態的彎曲部分1及彎曲部分環5（highly dynamic loop 1 and 5）之外的全部殘基的C_a RMSD演變（下方）。

圖20D顯示關於在L₂ P₂ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，L₂ P₂ 之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及對於YFMVF部分的C_a RMSD（下方）。

圖20E顯示在L₂ P₂ -EBNA1 複合體的MD模擬中涉及探針－受體疏水性連接的二聚合界面上的關鍵殘基（Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 與F₅₆₅ ）的SASA。模擬期間每個關鍵殘基的SASA都被計算並與其在自由可及狀態（free-accessible status）的參考值（虛線）進行了比較。若SASA較參考值為小，則認為此中的殘基可與EBNA1形成分子內或分子間鏈的蔬水性連接。

圖21A顯示在P₃ -EBNA1複合體之MD模擬中的EBNA1中全部殘基的C_a RMSF。

圖21B顯示在P₃ -EBNA1複合體之MD模擬中的P₃ 的C_a RMSF。

圖21C顯示關於在P₃ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，EBNA1之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及去除了高度動態的彎曲部分1及彎曲部分5（highly dynamic loop 1 and 5）之外的全部殘基的C_a RMSD演變（下方）。

圖21D顯示關於在P₃ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，P₃ 之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及對於YFMVF部分的C_a RMSD演變（下方）。

圖21E顯示在P₃ -EBNA1複合體的MD模擬中涉及探針－受體疏水性連接的二聚合界面上的關鍵殘基（Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 與F₅₆₅ ）的SASA。模擬期間計算每個關鍵殘基的SASA都被計算並與其在自由可及狀態（free-accessible status）的參考值（虛線）進行了比較。若SASA較參考值為小，則認為此中的殘基可與EBNA1形成分子內或分子間鏈的蔬水性連接。

圖21F顯示在P₃ -EBNA1複合體的MD模擬中，EBNA1 DBD 結構域之C端的多個酸殘基（acid residue）（D₆₀₁ 、D₆₀₂ 與D_{60 5} ）與在P₃ 中的鹼性部分（basic motif）（RrRK）形成的鹽橋（離子鍵）。藉由量測D₆₀₁ ／D₆₀₂ ／D₆₀₅ 之CG原子與精胺酸／離胺酸之CZ／CE原子之間的距離而進行觀察。若距離小於5 Å，則認為此中的酸－鹼殘基可形成鹽橋。

圖22A顯示在L₂ P₃ -EBNA1複合體之MD模擬中的EBNA1中全部殘基的C_a RMSF。

圖22B顯示L₂ P₃ -EBNA1複合體之MD模擬中的L₂ P₃ 的C_a RMSF。

圖22C顯示關於在L₂ P₃ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，EBNA1之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及去除了高度動態的彎曲部分1及彎曲部分5（highly dynamic loop 1 and 5）之外的全部殘基的C_a RMSD演變（下方）。

圖22D顯示關於在L₂ P₃ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，L₂ P₃ 之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及對於YFMVF部分的C_a RMSD演變（下方）。

圖22E顯示在L₂ P₃ -EBNA1複合體的MD模擬中涉及探針－受體疏水性連接的二聚合界面（Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 與F₅₆₅ ）上關鍵殘基的SASA。模擬期間每個關鍵殘基的SASA都被計算並與其在自由可及狀態（free-accessible status）的參考值（虛線）進行了比較。若SASA較參考值為小，則認為此中的殘基可與EBNA1形成分子內或分子間鏈的蔬水性連接。

圖22F顯示在L₂ P₃ -EBNA1複合體的MD模擬中，EBNA1 DBD 結構域之C端的多個酸殘基（acid residue）（D₆₀₁ 、D₆₀₂ 與D_{60 5} ）與在L₂ P₃ 中的鹼性部分（basic motif）（RrRK）形成的鹽橋（離子鍵）。藉由量測D₆₀₁ ／D₆₀₂ ／D₆₀₅ 之CG原子與精胺酸／離胺酸之CZ／CE原子之間的距離而進行觀察。若距離小於5 Å，則認為此中的酸－鹼殘基可形成鹽橋。

圖23A顯示在P₄ -EBNA1複合體之MD模擬中的EBNA1中全部殘基的C_a RMSF。

圖23B顯示P₄ -EBNA1複合體之MD模擬中的P₄ 的C_a RMSF。

圖23C顯示關於在P₄ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，EBNA1之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及去除了高度動態的彎曲部分1及彎曲部分5（highly dynamic loop 1 and 5）之外的全部殘基的C_a RMSD演變（下方）。

圖23D顯示關於在P₄ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，P₄ 之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及對於YFMVF部分的C_a RMSD演變（下方）。

圖23E顯示在P₄ -EBNA1複合體的MD模擬中涉及探針－受體疏水性連接的二聚合界面上關鍵殘基（Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 與F₅₆₅ ）的SASA。模擬期間每個關鍵殘基的SASA都被計算觀察並與其在自由可及狀態（free-accessible status）的參考值（虛線）進行了比較。若SASA較參考值為小，則認為此中的殘基可與EBNA1形成分子內或分子間鏈的蔬水性連接。

圖23F顯示在P₄ -EBNA1複合體的MD模擬中，EBNA1 DBD 結構域之C端的多個酸殘基（acid residue）（D₆₀₁ 、D₆₀₂ 與D_{60 5} ），與在P₄ 中的鹼性部分（basic motif）（RrRK）形成的鹽橋（離子鍵）。藉由量測D₆₀₁ ／D₆₀₂ ／D₆₀₅ 之CG原子與精胺酸／離胺酸之CZ／CE原子之間的距離而進行觀察。若距離小於5 Å，則認為此中的酸－鹼殘基可形成鹽橋。

圖24A顯示在L₂ P₄ -EBNA1複合體之MD模擬中的EBNA1中全部殘基的C_a RMSF。

圖24B顯示在L₂ P₄ -EBNA1複合體之MD模擬中的L₂ P₄ 的C_a RMSF。

圖24C顯示關於在L₂ P₄ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，EBNA1之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及去除了高度動態的彎曲部分1及彎曲部分5（highly dynamic loop 1 and 5）之外的全部殘基的C_a RMSD演變（下方）。

圖24D顯示關於在L₂ P₄ -EBNA1複合體的MD模擬中的初始或最終構型，L₂ P₄ 之全部殘基的C_a RMSD演變（上方），以及對於YFMVF部分的C_a RMSD演變（下方）。

圖24E顯示在L₂ P₄ -EBNA1複合體的MD模擬中涉及探針－受體疏水性連接的二聚合界面上關鍵殘基（Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 與F₅₆₅ ）的SASA。模擬期間每個關鍵殘基的SASA都被計算並與其在自由可及狀態（free-accessible status）的參考值（虛線）進行了比較。若SASA較參考值為小，則認為此中的殘基可與EBNA1形成分子內或分子間鏈的蔬水性連接。

圖24F顯示在L₂ P₄ -EBNA1複合體的MD模擬中，EBNA1 DBD 結構域之C端的多個酸殘基（acid residue）（D₆₀₁ 、D₆₀₂ 與D_{60 5} ），與在L₂ P₄ 中的鹼性部分（basic motif）（RrRK）形成的鹽橋（離子鍵）。藉由量測D₆₀₁ ／D₆₀₂ ／D₆₀₅ 之CG原子與精胺酸／離胺酸之CZ／CE原子之間的距離而進行觀察。若距離小於5 Å，則認為此中的酸－鹼殘基可形成鹽橋。

圖25A顯示由P₂ -EBNA1複合體之200奈秒（ns）MD模擬所得的代表性結構。多肽序列和GB／PB結合自由能（GB／PB binding free energy）標示在各複合體中。EBNA1呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖25B顯示由L₂ P₂ -EBNA1複合體之200奈秒（ns）MD模擬所得的代表性結構。多肽序列和GB／PB結合自由能（GB／PB binding free energy）標示在各複合體中。EBNA1係呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖25C顯示由P₃ -EBNA1複合體之200奈秒（ns）MD模擬所得的代表性結構。多肽序列和GB／PB結合自由能（GB／PB binding free energy）標示在各複合體中。EBNA1呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖25D顯示由L₂ P₃ -EBNA1複合體之200奈秒（ns）MD模擬所得的代表性結構。多肽序列和GB／PB結合自由能（GB／PB binding free energy）標示在各複合體中。EBNA1係呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖25E顯示由P₄ -EBNA1複合體之200奈秒（ns）MD模擬所得的代表性結構。多肽序列和GB／PB結合自由能（GB／PB binding free energy）標示在各複合體中。EBNA1係呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖25F顯示由L₂ P₄ -EBNA1複合體之200奈秒（ns）MD模擬所得的代表性結構。多肽序列和GB／PB結合自由能（GB／PB binding free energy）標示在各複合體中。EBNA1係呈帶狀，EBNA1中的主要結合位置以3D結構中的棒狀形式呈現，包括Y₅₆₁ 、M₅₆₃ 、F₅₆₅ 、D₆₀₁ 、D₆₀₂ 以及D₆₀₅ 。

圖26A顯示L₂ P₂ 在PBS緩衝液中，於t = 0小時且37℃下分別培養2、4、6、15及24小時後的發射光譜（濃度：1 mM，PBS緩衝液：8 g NaCl，0.2 g KCl，0.2 g KH₂ PO₄ ，3.62g Na₂ HPO₄ ·12H₂ O）。

圖26B顯示L₂ P₃ 在PBS緩衝液中，於t = 0小時且37℃下分別培養2、4、6、15及24小時後的發射光譜（濃度：1 mM，PBS緩衝液：8 g NaCl，0.2 g KCl，0.2 g KH₂ PO₄ ，3.62 g Na₂ HPO₄ ·12H₂ O）。

圖26C顯示L₂ P₄ 在PBS緩衝液中，於t = 0小時且37℃下分別培養2、4、6、15及24小時後的發射光譜（濃度：1 mM，PBS緩衝液：8g NaCl，0.2g KCl，0.2 g KH₂ PO₄ ，3.62g Na₂ HPO₄ ·12H₂ O）。

圖27A顯示用於測定發光量子產率的玫瑰紅6G（rhodamine 6G， 對照組）在水中的發射光譜（l_ex = 480nm）。

圖27B顯示用於測定發光量子產率的玫瑰紅6G（rhodamine 6G， 對照組）在水中的發射曲線（emission plot）（發光vs 吸光）（l_ex = 480nm）。

圖27C顯示用於測定發光量子產率的L₂ P₂ 在水中的發射光譜（l_ex = 480nm。藉由使用玫瑰紅6G為參照，L₂ P₂ 的量子產率為4.4 %）。

圖27D顯示用於測定發光量子產率的L₂ P₂ 在水中的發射曲線（emission plot）（發光vs 吸光）。（l_ex = 480nm。藉由使用玫瑰紅6G為參照，L₂ P₂ 的量子產率為4.4 %）。

圖27E顯示用於測定發光量子產率的L₂ P₃ 在水中的發射光譜。（l_ex = 480nm。藉由使用玫瑰紅6G為參照，L₂ P₃ 的量子產率為4.3 %）。

圖27F顯示用於測定發光量子產率測定的L₂ P₃ 在水中的發射曲線（emission plot）（發光vs 吸光）（l_ex = 480nm。藉由使用玫瑰紅6G為參照，L₂ P₃ 的量子產率為4.3%）。

圖27G顯示用於測定發光量子產率測定的L₂ P₄ 在水中的發射光譜。（l_ex = 480nm。藉由使用玫瑰紅6G為參照，L₂ P₄ 的量子產率為3.9%）。

圖27H顯示用於測定發光量子產率測定的L₂ P₄ 在水中的發射曲線（emission plot）（發光vs 吸光）（l_ex = 480nm。藉由使用玫瑰紅6G為參照，L₂ P₄ 的量子產率為3.9%）。

圖28A顯示在飽和WT-EBNA1（saturated WT-EBNA1）存在下，用於測定發光量子產率的L₂ P₂ 在水中的曲線（發光vs 吸光）（l_ex = 480nm。藉由使用玫瑰紅6G為參照，L₂ P₂ +WT EBNA1的量子產率為3.8%）。

圖28B顯示在飽和WT-EBNA1（saturated WT-EBNA1）存在下，用於測定發光量子產率的L₂ P₃ 在水中的曲線（發光vs 吸光）（l_ex = 480nm。藉由使用玫瑰紅6G的為參照，L₂ P₃ +WT EBNA1的量子產率為13.0%）。

圖28C顯示在飽和WT-EBNA1（saturated WT-EBNA1）存在下，用於測定發光量子產率的L₂ P₄ 在水中的發射曲線（plot）（發光vs 吸光）（l_ex = 480nm。藉由使用玫瑰紅6G為參照，L₂ P₄ +WT EBNA1的量子產率為22.9%）。

圖29A顯示在PBS緩衝液中加入WT-EBNA1以進行結合常數測定時L₂ P₂ 的發射光譜（濃度：2 mM）。

圖29B顯示在PBS緩衝液中加入WT-EBNA1以進行結合常數測定的L₂ P₃ 的發射光譜（濃度：2 mM）。

圖29C顯示了在PBS緩衝液中加入WT-EBNA1後以進行結合常數測定的L₂ P₃ 的雙對數回歸曲線（濃度：2 μM。由雙對數回歸計算的log Ka值為5.50，且發現L₂ P₃ 與WT-EBNA1的結合比（binding ratio）為1：1）。

圖29D顯示在PBS緩衝液中加入WT-EBNA1以進行結合常數測定的L₂ P₄ 的發射光譜（濃度：2 μM）。

圖29E顯示了在PBS緩衝液中加入WT-EBNA1後以進行結合常數測定的L₂ P₄ 的雙對數回歸曲線（濃度：2 μM。由雙對數回歸計算的log Ka值為6.82，且發現L₂ P₄ 與WT-EBNA1的結合比（binding ratio）為1：1）。

圖30A顯示摻入ZnCl₂ 後，L₂ P₃ （於PBS緩衝液中的濃度為2 mM）的發射光譜的變化。

圖30B顯示摻入NaHCO₃ 後，L₂ P₃ （於PBS緩衝液中的濃度為2 mM）的發射光譜的變化。

圖30C顯示摻入CuCl₂ 後，L₂ P₃ （於PBS緩衝液中的濃度為2 mM）的發射光譜的變化。

圖30D顯示摻入檸檬酸鹽後，L₂ P₃ （於PBS緩衝液中的濃度為2 mM）的發射光譜的變化。

圖30E顯示摻入BSA後，L₂ P₃ （於PBS緩衝液中的濃度為2 mM）的發射光譜的變化。結果顯示L₂ P₃ 對WT-EBNA1具有選擇性。

圖30F顯示藉由比較添加WT-EBNA1及BSA二種不同的蛋白質所誘導的發光增強程度。結果顯示L₂ P₃ 對WT-EBNA1具有選擇性。

圖31A顯示摻入ZnCl₂ 後，L₂ P₄ （於PBS緩衝液中的濃度為2 mM）的發射光譜的變化。

圖31B顯示摻入NaHCO₃ 後，L₂ P₄ （於PBS緩衝液中的濃度為2 mM）的發射光譜的變化。

圖31C顯示摻入CuCl₂ 後，L₂ P₄ （於PBS緩衝液中的濃度為2 mM）的發射光譜的變化。

圖31D顯示摻入檸檬酸鹽後，L₂ P₄ （於PBS緩衝液中的濃度為2 mM）的發射光譜的變化。

圖31E顯示摻入BSA後，L₂ P₄ （於PBS緩衝液中的濃度為2 mM）的發射光譜的變化。結果顯示L₂ P₄ 對WT-EBNA1的選擇性相較於L₂ P₃ 為高。

圖31F顯示藉由比較添加WT-EBNA1及BSA二種不同的蛋白質所誘導的發光增強程度。結果顯示L₂ P₄ 對WT-EBNA1的選擇性相較於L₂ P₃ 為高。

圖32顯示在不同溶劑中L₂ P₄ 的吸收光譜（濃度：10 mM）。

圖33A顯示PBS緩衝液中L₂ P₃ 的發射光譜，用於研究pH值對於發射光譜的影響和測定pK_a 值。

圖33B顯示在PBS緩衝液中的L₂ P₃ 的曲線圖（發光vs pH），用於研究pH值對於發射 光譜的影響和測定pK_a 值。

圖33C顯示PBS緩衝液中L₂ P₄ 的發射光譜，用於研究pH值對於發射光譜的影響和測定pK_a 值。

圖33D顯示在PBS緩衝液中的L₂ P₄ 的曲線圖（發光vs pH），用於研究pH值對於發射光譜的影響和測定pK_a 值。

圖34顯示L₂ P₄ 在不同溶劑中的螢光壽命衰減（光源：460nm nanoLED，濃度：10 mM）。

圖35A顯示EBNA1蛋白質純化結果。與穀胱甘肽S-轉移酶（GST）融合的EBNA1蛋白質（379-641a.a.）表現於在大腸桿菌（BL21）中，並藉由穀胱甘肽瓊脂糖凝膠4B潤洗（GE Healthcare Dharmacon）純化。WT-EBNA1的殘基YFMVF突變為FFAVA，產生EBNA1-3A突變蛋白或產生Y₅₆₁ A、M₅₆₃ A以及F₅₆₅ A的單一氨基酸突變的突變蛋白。

圖35B顯示野生型與突變型EBNA1之二聚合效率的分析結果，突變型EBNA1不同程度地減弱了EBNA1二聚合的能力。

圖35C顯示野生型與突變型EBNA1同型二聚合效率的比較（**，P＜0.01）。EBNA1突變體不同程度地減弱了EBNA1二聚合的能力。

圖36A顯示在EBV陰性人類子宮頸癌HeLa細胞中，L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 的細胞攝取情況。

圖36B顯示在EBV陽性鼻咽癌C666-1細胞中，L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 的細胞攝取情況。

圖36C顯示在EBV陽性鼻咽癌NPC43細胞中，L₂ P₂ 、L₂ P₃ 以及L₂ P₄ 的細胞攝取情況。

圖37A顯示在EBV陰性人類子宮頸癌HeLa細胞中的L₂ P₂ 的體外成像（l_ex = 488 nm，l_em = 500至650 nm，濾鏡為BP500）。

圖37B顯示在EBV陰性人類子宮頸癌HeLa細胞中的L₂ P₃ 的體外成像（l_ex = 488 nm，l_em = 500至650 nm，濾鏡為BP500）。

圖37C顯示在EBV陰性人類子宮頸癌HeLa細胞中的L₂ P₄ 的體外成像（l_ex = 488 nm，l_em = 500至650 nm，濾鏡為BP500）。

圖37D顯示在EBV陽性鼻咽癌C666-1細胞中的L₂ P₂ 的體外成像（l_ex = 488 nm，l_em = 500至650 nm，濾鏡為BP500）。

圖37E顯示在EBV陽性鼻咽癌C666-1細胞中的L₂ P₃ 的體外成像（l_ex = 488 nm，l_em = 500至650 nm，濾鏡為BP500）。

圖37F顯示在EBV陽性鼻咽癌C666-1細胞中的L₂ P₄ 的體外成像（l_ex = 488 nm，l_em = 500至650 nm，濾鏡為BP500）。如圖所示，不同探針在C666-1細胞中有不同的細胞器定位，即L₂ P₂ 僅顯示位於細胞質位置，而L₂ P₃ 和L₂ P₄ 可以通過NLS序列（RrRK）進入C666-1細胞核。

圖38A顯示L₂ P₄ 與溶酶體綠光DND-26染劑（lyso Green DND-26 tracker）針對C666-1細胞的共染色（細胞以10 mML₂ P₄ 處理，然後培養6小時，之後細胞用1 nM溶酶體染劑（lyso tracker）處理，培養1小時）。在此顯示的是L₂ P₄ 的發光。

圖38B顯示L₂ P₄ 與溶酶體綠光DND-26染劑（lyso Green DND-26 tracker）針對C666-1細胞共染色（細胞以10 mML₂ P₄ 處理，然後培養6小時，之後細胞用1 nM溶酶體染劑（lyso tracker）處理，培養1小時）。在此顯示的是溶酶體染劑的發光。

圖38C顯示L₂ P₄ 與溶酶體綠光DND-26染劑（lyso Green DND-26 tracker）針對C666-1細胞的共染色（細胞以10 mML₂ P₄ 處理，然後培養6小時，之後細胞用1 nM溶酶體染劑（lyso tracker）處理，培養1小時）。幾乎沒有觀察到L₂ P₄ 在溶酶體上的發光。

圖38D顯示L₂ P₄ 與粒線體綠光FM M7514染劑（lyso Green DND-26 tracker）針對C666-1細胞的共染色（細胞以10 mML₂ P₄ 處理，然後培養6小時，之後細胞用1 nM粒線體染劑（mito tracker）處理，培養1小時）。在此顯示了L₂ P₄ 的發光。

圖38E顯示L₂ P₄ 與粒線體綠光FM M7514染劑（lyso Green DND-26 tracker）針對C666-1細胞的共染色（細胞以10 mML₂ P₄ 處理，然後培養6小時，之後細胞用1 nM粒線體染劑（mito tracker）處理，培養1小時）。在此顯示了粒線體染劑的發光。

圖38F顯示L₂ P₄ 與粒線體綠光FM M7514染劑（lyso Green DND-26 tracker）針對C666-1細胞的共染色（細胞以10 mML₂ P₄ 處理，然後培養6小時，之後細胞用1 nM粒線體染劑（mito tracker）處理，培養1小時）。由於L₂ 一般位於粒線體上，所以有觀察到L₂ P₄ 在粒線體上的發光。

圖39A顯示P_n （n = 2、3及4）對EBV陰性正常人類肺纖維母MRC-5細胞的細胞毒性測定結果（培養時間：24小時）。

圖39B顯示P_n （n = 2、3及4）對EBV陰性正常人類子宮頸癌HeLa細胞的細胞毒性測定結果（培養時間：24小時）。

圖39C顯示P_n （n = 2、3及4）對EBV陰性柏基特淋巴瘤Ramo細胞的細胞毒性測定結果（培養時間：24小時）。

圖39D顯示P_n （n = 2、3及4）對EBV陽性鼻咽癌C666-1細胞的細胞毒性測定結果（培養時間：24小時）。

圖39E顯示P_n （n = 2、3及4）對EBV陽性鼻咽癌NPC43細胞的細胞毒性測定結果（培養時間：24小時）。

圖39F顯示P_n （n = 2、3及4）對EBV陽性柏基特淋巴瘤Raji c細胞的細胞毒性測定結果（培養時間：24小時）。

圖40顯示使用腫瘤內注射P₄ 、L₂ P₄ （低劑量或高劑量）或DMSO每週兩次，在注射21天後的小鼠的體重。

圖41A顯示在21天內用不同藥物處理後的小鼠的重要器官的重量（心臟）。

圖41B顯示在21天內用不同藥物處理後的小鼠的重要器官的重量（脾臟）。

圖41C顯示在21天內用不同藥物處理後的小鼠的重要器官的重量（肝臟）。

圖41D顯示在21天內用不同藥物處理後的小鼠的重要器官的重量（腎臟）。

圖41E顯示在21天內用不同藥物處理後的小鼠的重要器官的重量（肺臟）。

圖42A顯示用P₄ -L（低劑量的P₄ ，2 mg／腫瘤）處理後的小鼠的腫瘤大小。

圖42B顯示用L₂ P₄ -L（低劑量的L₂ P₄ ，2 mg／腫瘤）處理後的小鼠的腫瘤大小。

圖43A顯示使用腫瘤內注射P₄ 、L₂ P₄ （低劑量或高劑量）或DMSO每週兩次，在注射18天後攜帶HeLa異種移植物的小鼠的體重。

圖43B顯示使用腫瘤內注射P₄ 、L₂ P₄ （低劑量或高劑量）或DMSO每週兩次，在注射18天後攜帶HeLa異種移植物的小鼠的腫瘤體積。

圖43C顯示使用腫瘤內注射P₄ 、L₂ P₄ （低劑量或高劑量）或DMSO每週兩次，在注射18天後攜帶HeLa異種移植物的小鼠的腫瘤重量。在實驗終點，切除腫瘤並稱重。每組的平均腫瘤重量的單位為克（gram）±SEM。

圖44顯示使用腫瘤內注射P₄ 、L₂ P₄ （低劑量或高劑量）或DMSO每週兩次，在注射18天後攜帶HeLa異種移植物的小鼠的腫瘤影像。在小鼠上死後，切除腫瘤並進行拍照。影像顯示來自每組的代表性腫瘤。

圖45顯示圖9中化合物3的400MHz-¹ H-NMR（CDCl₃ ）光譜。

圖46顯示圖9中化合物3的100MHz-¹³ C -NMR（CDCl₃ ）光譜。

圖47顯示圖9中化合物3的MALDI-TOF光譜，HRMS（m／z）：C₁₇ H₂₀ N₂ 的[M]⁺ ：計算值252.1626；獲得值252.1611； 誤差：-6 ppm。

圖48顯示圖9中化合物4的400MHz-¹ H-NMR（CDCl₃ ）光譜。

圖49顯示圖9中化合物4的100MHz-¹³ C -NMR（CDCl₃ ）光譜。

圖50顯示圖9中化合物4的MALDI-TOF光譜，HRMS（m／z）：C₂₁ H₂₇ N₂ O₂ ⁺ 的[M]⁺ ：計算值339.2067；獲得值339.2046； 誤差：-6 ppm。

圖51顯示圖9中化合物5的400MHz-¹ H-NMR（MeOD）光譜。

圖52顯示圖9中化合物5的100MHz-¹³ C -NMR（MeOD）光譜。

圖53顯示圖9中化合物5的MALDI-TOF光譜，HRMS（m／z）：C₁₉ H₂₃ N₂ O₂ ⁺ 的[M]⁺ ：計算值311.1754；獲得值311.1758； 誤差：1 ppm。

圖54顯示L₂ P₂ 的MALDI-TOF光譜，HRMS（m／z）：C₅₆ H₆₉ N₈ O₇ S⁺ 的[M]⁺ ：計算值998.5083；獲得值998.5185； 誤差：10 ppm。

圖55顯示L₂ P₃ 的MALDI-TOF光譜，HRMS（m／z）：C₉₃ H₁₄₀ N₂₆ O₁₅ S₂ ⁺ 的[M+H]⁺ ：計算值1925.0427；獲得值1925.0363； 誤差：-3 ppm。

圖56顯示L₂ P₄ 的MALDI-TOF光譜，HRMS（m／z）：C₉₃ H₁₄₀ N₂₆ O₁₅ S₂ ⁺ 的[M+H]⁺ ：計算值1925.0427；獲得值1925.0450； 誤差：1 ppm。

圖57顯示本發明的多肽接合物以及它們在癌細胞殺除及成像中的應用。

圖58顯示採用與L₂ P₄ 以及L₂ 結構類似的（structure family）可用於PET成像的化合物以及它們的合成途徑。

圖59顯示與已知PET配體（PET available ligand）成功合成的多肽結合物。

圖60顯示本發明中已有的MRI配體（MRI available ligand）的實施態樣。

圖61顯示本發明中PET配體的實施態樣。

＜110＞ 香港浸會大學 ＜120＞ 具有特定響應性光學成像的抑制劑用於EBV相關腫瘤的治療 ＜130＞ P1058US00 ＜150＞ US62/327,504 ＜151＞ 2016-04-26 ＜150＞ US15/495,971 ＜151＞ 2017-04-24 ＜150＞ US62/406,927 ＜151＞ 2016-10-11 ＜160＞ 4 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 5 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列（artificial sequence） ＜220＞ ＜223＞ 序列已合成 ＜400＞ 1 Tyr Phe Met Val Phe 1 5 ＜210＞ 2 ＜211＞ 13 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 序列已合成 ＜220＞ ＜221＞ 多肽 ＜222＞ (2)..(2) ＜223＞ X 為 6-胺基己酸 ＜220＞ ＜221＞ 多肽 ＜222＞ (3)..(3) ＜223＞ R 為L-精氨酸 ＜220＞ ＜221＞ 多肽 ＜222＞ (4)..(4) ＜223＞ X 為 D-精氨酸 ＜220＞ ＜221＞ 多肽 ＜222＞ (5)..(5) ＜223＞ R 為L-精氨酸 ＜400＞ 2 Cys Xaa Arg Xaa Arg Lys Gly Gly Tyr Phe Met Val Phe 1 5 10 ＜210＞ 3 ＜211＞ 13 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 序列已合成 ＜220＞ ＜221＞ 多肽 ＜222＞ (2)..(2) ＜223＞ X 為6-胺基己酸 ＜220＞ ＜221＞ 多肽 ＜222＞ (10)..(10) ＜223＞ R 為 L-精胺酸 ＜220＞ ＜221＞ 多肽 ＜222＞ (11)..(11) ＜223＞ X 為 D-精胺酸 ＜220＞ ＜221＞ 多肽 ＜222＞ (12)..(12) ＜223＞ R 為 L-精胺酸 ＜400＞ 3 Cys Xaa Tyr Phe Met Val Phe Gly Gly Arg Xaa Arg Lys 1 5 10 ＜210＞ 4 ＜211＞ 147 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人類皰疹病毒 ＜400＞ 4 Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro 1 5 10 15 Lys Phe Glu Asn Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser 20 25 30 His Val Glu Arg Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe 35 40 45 Val Tyr Gly Gly Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr 50 55 60 Ala Leu Ala Ile Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro 65 70 75 80 Phe Gly Met Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu 85 90 95 Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala 100 105 110 Glu Val Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala 115 120 125 Pro Thr Cys Asn Ile Arg Val Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly Val 130 135 140 Asp Leu Pro 145

Claims (9)

1. 一種細胞核穿透性小分子抑制劑，包含4-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)-N-羧甲基吡啶陽離子氯化物，其係透過醯胺鍵連接至包含CAhxYFMVFGGRrRK(SEQ ID NO.3)胺基酸序列的多肽。
2. 如請求項1所述的細胞核穿透性小分子抑制劑，其中該抑制劑以艾司坦-巴爾病毒之EBNA1的二聚合界面為靶標。
3. 如請求項2所述的細胞核穿透性小分子抑制劑，其中該抑制劑在艾司坦-巴爾病毒的細胞核中具有明顯的細胞器定位，並且在與野生型EBNA1結合後產生超過8.8倍的響應性螢光增強。
4. 如請求項2所述的細胞核穿透性小分子抑制劑，其中該抑制劑為選擇性的，且對於經艾司坦-巴爾病毒感染的腫瘤細胞表現出細胞毒性。
5. 如請求項1所述的細胞核穿透性小分子抑制劑，具有如式(I)所示的化合物：

   
6. 一種用於對經艾司坦-巴爾病毒感染的細胞進行成像的方法，其包含：引入如請求項1所述的細胞核穿透性小分子抑制劑至經艾司坦-巴爾病毒感染之細胞；於適當的吸收帶對該經艾司坦-巴爾病毒感染的細胞進行輻射；及利用螢光成像自該經輻射之經艾司坦-巴爾病毒感染的細胞偵測所得的發光帶。
7. 如請求項6所述之方法，其中用細胞核穿透性小分子抑制劑誘導的該經艾司坦-巴爾病毒感染的細胞的適當吸收帶在274nm及~500nm處。
8. 如請求項6所述之方法，其中該螢光成像偵測在560nm及~625nm處所得的適當吸收帶。
9. 一種合成如請求項1所述的細胞核穿透性小分子抑制劑的方法，其包含：

   

   其中a)在NaH(分散在煤油中)存在下將化合物1(4-甲基吡啶)及化合物2(4-二乙氨基苯)於60℃與二甲基甲醯胺(DMF)進行反應，以產生化合物3(N,N'-二乙基-4-(2-(吡啶-4-基)乙烯基)苯胺)；b)將該化合物3與溴乙酸乙酯在乙腈(MeCN)存在下於約85℃進行反應，以獲得化合物4(4-(4-(二乙基氨基)苯乙烯基)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)吡啶-1-基溴化物)；c)在二氧六環存在下於室溫用NaOH水解該化合物4，以獲得化合物5(4-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)-N-羧甲基吡啶陽離子氯化物)；d)在二異丙基乙基胺(DIPEA)、苯並三唑-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)及DMF存在下於室溫將該化合物5與P₄-樹脂在進行偶合，以獲得化合物6；e)在三氟乙酸(TFA)、三異丙基矽烷(Tis)及水存在下於室溫切割該化合物6的樹脂以獲得化合物7，並藉由高效液相層析純化化合物7以獲得如請求項1所述的細胞核穿透性小分子抑制劑。