CN109414495A - 具有定制响应性光学成像的ebv相关肿瘤的治疗抑制剂 - Google Patents
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Abstract
提供了核透过性小分子抑制剂L2P4(其中L2是4‑(4‑(二乙氨基)苯乙烯基)‑N‑羧甲基吡啶鎓氯化物，P4是包含CAhxYFMVFGGRrRK的氨基酸序列，并且它们通过酰胺键偶联)及其合成方法，所述核透过性小分子抑制剂有效靶向EBNA1的二聚化界面，其对于EBV和相关肿瘤的生长是至关重要的过程。还提供了治疗EBV相关癌症和使EBV相关癌症成像的方法。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2017年4月24日提交的美国非临时专利申请系列号15/495,971、2016年4月26日提交的美国临时专利申请系列号62/327,504以及2016年10月11日提交的美国临时专利申请系列号62/406,927的优先权，通过引用将上述专利申请的内容整体并入本文。
技术领域
本发明属于药物和化学品领域。本发明涉及核透过性小分子抑制剂、所述分子的合成以及所述分子用于癌症治疗和成像的用途。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一种普遍存在的人疱疹病毒，可引起传染性单核细胞增多症和淋巴组织增生性疾病。其他癌症(例如鼻咽癌和EBV阳性胃癌亚组)的致癌发展也与EBV病毒的潜伏性感染有关。EBV的生命周期过程，如病毒DNA复制和分离，病毒蛋白EB核抗原(EBNA1)是至关重要的。考虑到EBNA1正常发挥功能必不可少的同源二聚化标准，特异性阻断二聚体形成为治疗潜伏性EBV感染的肿瘤提供了方法。最近，已报道了几种EBNA1特异性抑制剂。已经通过高通量筛选开发了一种称为Eik1的小分子，以靶向EBNA1二聚化结构域的氨基酸序列459-607，而据报道一些肽基抑制剂在560-574区域中发挥相似的作用。然而，特异性亚细胞定位的缺乏和无响应性结合限制了这些现有EBNA1抑制剂对成像和抑制EBNA1二聚化的有效性，进一步阻碍了选择性抑制具有EBV潜伏性感染的癌细胞的功效。
文献揭露，EBNA1广泛分布于EBV感染的细胞的细胞核中。EBNA1与宿主细胞染色体连接(tether)的过程对于EBV来源的质粒的有效复制至关重要。用于对细胞核中EBNA1进行体外微观研究的响应性靶特异性生物探针的开发仍然很少。因此，本发明的目的是提供核透过性(permeable)和EBNA1特异性分子。
在本部分或本申请的任何其他部分中对任何参考文献的引用或确定都不应解释为承认该参考文献可用作本申请的现有技术。
发明概述
因此，本发明提供了一种有效靶向EBNA1的二聚化界面的核透过性肽缀合物L2P4、合成所述肽缀合物的方法、抑制EBV生长和治疗EBV相关肿瘤的方法。本发明还提供了使EBV相关肿瘤成像的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种包含式(I)的核透过性小分子抑制剂L2P4：
其中所述抑制剂是通过酰胺键与氨基酸序列CAhxYFMVFGGRrRK(SEQ ID NO.3)偶联的4-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-N-羧甲基吡啶鎓氯化物。
在本发明第一方面的第一实施方案中，提供了一种核透过性小分子抑制剂L2P4，其中所述抑制剂靶向EB病毒的EBNA1的二聚化界面。
在本发明第一方面的第二实施方案中，提供了一种核透过性小分子抑制剂L2P4，其中所述抑制剂在EB病毒的细胞核内具有清晰的亚细胞定位，并且在与野生型EBNA1结合后具有超过8.8倍的响应性发射增强(emission enhancement)。
在本发明第一方面的第三实施方案中，提供了一种核透过性小分子抑制剂L2P4，其中所述抑制剂对EB病毒感染的肿瘤细胞是选择性的并且显示出细胞毒性。
在本发明的第二方面，提供了一种使EB病毒感染的细胞成像的方法，包括将所述核透过性小分子抑制剂L2P4引入EB病毒感染的细胞，在适当的吸收带辐射所述EB病毒感染的细胞，并使用荧光成像检测由经辐射的EB病毒感染的细胞所产生的发射带。
在本发明第二方面的第二实施方案中，提供了一种使EB病毒感染的细胞成像的方法，其中用核透过性小分子抑制剂诱导的所述EB病毒感染的细胞的适当的吸收带在274nm和约500nm处。
在本发明第二方面的第三实施方案中，提供了一种使EB病毒感染的细胞成像的方法，其中荧光成像检测在560nm和约625nm处所产生的发射带。
在本发明的第三方面，提供了一种用于治疗癌症的方法，包括将所述核透过性小分子抑制剂L2P4施用于需要所述癌症治疗的受试者，其中所述癌症的细胞被EB病毒感染。
在本发明第三方面的第一实施方案中，提供了一种用于治疗癌症的方法，包括将所述核透过性小分子抑制剂L2P4施用于需要所述癌症治疗的受试者，其中所述癌症是EB病毒阳性癌症，其选自由以下各项组成的组：B细胞来源的淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌。
在本发明第三方面的第二实施方案中，提供了一种用于治疗癌症的方法，包括将所述核透过性小分子抑制剂L2P4施用于需要所述癌症治疗的受试者，其中通过肿瘤内注射施用所述核透过性小分子抑制剂。
在本发明的第四方面，提供了一种合成核透过性小分子抑制剂L2P4的方法，包括：
其中
a)使化合物1(4-甲基吡啶)与化合物2(4-二乙氨基苯甲醛)在存在分散于矿物油中的NaH和二甲基甲酰胺(DMF)的情况下于约60℃反应，产生化合物3(N，N’-二乙基-4-(2-(吡啶-4-基)乙烯基)苯胺)；
b)使化合物3与溴乙酸乙酯在存在乙腈(MeCN)的情况下于约85℃反应，以获得化合物4(4-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基-)吡啶-1-鎓)溴化物；
c)用0.4M NaOH在存在二噁烷的情况下于室温水解化合物4，以获得化合物5(4-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-N-羧甲基吡啶鎓氯化物)；
d)将化合物5与P4-树脂在存在二异丙基乙胺(DIPEA)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷磷(PyBOP)以及DMF的情况下于室温偶联，以获得化合物6；
e)在存在三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(Tis)和水的情况下，于室温裂解化合物6的树脂，以获得化合物，并通过高效液相色谱法纯化化合物7，以获得核透过性小分子抑制剂L2P4。
本领域技术人员应当理解，除了具体描述的那些发明之外，可对本文描述的本发明进行变型和修改。
本发明包括所有这类变型和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤和特征，以及所述步骤或特征的任何组合和所有组合或任何两个或更多个步骤或特征。
遍及本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises或comprising)”等变形应理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。还应注意，在本公开中，特别是在权利要求书和/或段落中，诸如“包含(comprises、comprised、comprising)”等的术语可具有美国专利法赋予它的含义；例如，它们可以表示“包括(includes、included、including)”等；并且诸如“基本上由……组成(consists essentially of和consists essentially of)”等的术语具有美国专利法赋予它们的含义，例如，它们允许未明确叙述的元素，但排除现有技术中发现的或影响本发明的基本特征或新颖特征的元素。
此外，遍及本说明书和权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(include)”或诸如“包括(includes或including)”等变形应理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
本文使用的所选术语的其他定义可以在本发明的详细描述中找到，其适用于全文。除非另外定义，否则本文使用的所有其他技术术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义具有相同含义。
通过阅读随后的描述，本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图简述
本专利文件或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在提出请求和支付必要费用后由主管局(Office)提供。
根据以下对本发明的描述，结合附图，本发明的上述目的和特征和其他目的以及特征将会变得显而易见，在所述附图中：
图1A显示了本发明的肽缀合物L2P2、L2P3和L2P4的化学结构。P2(YFMVF)是衍生自EBNA1的β4的肽，且其是EBNA1特异性的。P3(CAhxRrRKGGYFMVF，其中Ahx是6-氨基己酸；R是L-精氨酸，且r是D-精氨酸)和P4(CAhxYFMVFGGRrRK，其中Ahx是6-氨基己酸)肽是EBNA1特异性的，且是核透过性的(由于在该序列中间(P3)或在C末端(P4)添加了RrRK基序)。
图1B显示了通过MD模拟的L2P4与EBNA1 DNA结合结构域的推定单体结构之间的相互作用；EBNA1以带状(左)和静电表面(右)呈现。推定的结构由分离EBNA1-DNA复合体的X射线晶体结构产生(蛋白质数据库ID：1B3T)。模拟显示L2P4主要通过与YFMVF基序的疏水相互作用而与EBNA1二聚体界面结合，并且通过与RrRK基序的进一步静电相互作用可增强这种相互作用。虚线椭圆表示红色发射配体(L2)。
图1C显示MD模拟中探针L2P2、L2P3和L2P4以及EBNA1的代表性构象。计算的广义Born(GB)和泊松-玻尔兹曼(Poisson-Boltzmann，PB)值代表本发明探针和EBNA1之间的结合自由能。
图2A显示响应于WT-EBNA1的添加，L2P4的8.8倍强度增加和25nm蓝移(直角箭头指示)，λex，激发波长。
图2B显示了添加WT-EBNA1后L2、L2P2、L2P3以及L2P4的发射强度变化。
图2C显示了L2P4对各种蛋白的选择性；由任意单位(a.u.)的发射强度表示。
图2D显示了L2P4针对各种缓冲液pH值的发射光谱；用于证实ICT态并确定pKa值。随着pH从7降低到2，发射带逐渐降低，这与ICT发射的特征一致。ICT发射在较低的pH下降低，这是由于氮原子被质子化，从而使得它们的孤电子对不能用于产生ICT激发态。插图：L2P4针对各种缓冲液pH值的发射强度。
图2E所示的来自溶剂化显色实验的L2P4发射光谱显示出降低溶剂极性的作用。
图2F显示了L2P4在结合WT-EBNA1后的发射寿命(衰变)。
图2G显示了随着溶剂极性的增加，L2P4在溶剂化显色(下部)后的发射寿命(衰变)。在极性较小的溶剂中发现相对较大的局部激发(LE)发射衰变和相应较小的ICT衰变，这表明偶极矩较小并因此导致ICT态上移(upshift)。另外，发现L2P4在结合WT-EBNA1后的发射寿命与在极性溶剂中的发射寿命相似。
图3A显示了L2P2探针在EBV阳性C666-1中的体外共聚焦显微结果。λex＝488nm；λem＝500-650nm；滤器，BP500。将C666-1用L2P2(10μM)处理6h，然后用核染料Hoechst 33342(1nM)共染色1h。沿共聚焦显微图像上标记的绿线绘制L2P2探针和Hoechst 33342的发射强度的分布图(Profile)。
图3B显示了L2P3探针在EBV阳性C666-1中的体外共聚焦显微结果。λex＝488nm；λem＝500-650nm；滤器，BP500。将C666-1用L2P3(10μM)处理6h，然后用核染料Hoechst 33342(1nM)共染色1h。沿共聚焦显微图像上标记的绿线绘制L2P3探针和Hoechst 33342的发射强度的分布图。
图3C显示了L2P4探针在EBV阳性C666-1中的体外共聚焦显微结果。λex＝488nm；λem＝500-650nm；滤器，BP500。将C666-1用L2P4(10μM)处理6h，然后用核染料Hoechst 33342(1nM)共染色1h。沿共聚焦显微图像上标记的绿线绘制L2P4探针和Hoechst 33342的发射强度的分布图。在细胞核中发现了L2P4(通过λ扫描)，发射带的形状和位置类似于在相同激发下针对溶液获得的数据。
图3D显示了L2P2探针在EBV阳性NPC43中的体外共聚焦显微结果。λex＝488nm；λem＝500-650nm；滤器，BP500。将NPC43用L2P2(10μM)处理6h，然后用核染料Hoechst 33342(1nM)共染色1h。沿共聚焦显微图像上标记的绿线绘制L2P2探针和Hoechst 33342的发射强度的分布图。
图3E显示了L2P3探针在EBV-阳性NPC43中的体外共聚焦显微结果。λex＝488nm；λem＝500-650nm；滤器，BP500。将NPC43用L2P3(10μM)处理6h，然后用核染料Hoechst 33342(1nM)共染色1h。沿共聚焦显微图像上标记的绿线绘制L2P3探针和Hoechst 33342的发射强度的分布图。
图3F显示了L2P4探针在EBV-阳性NPC43中的体外共聚焦显微结果。λex＝488nm；λem＝500-650nm；滤器，BP500。将NPC43用L2P4(10μM)处理6h，然后用核染料Hoechst 33342(1nM)共染色1h。沿共聚焦显微图像上标记的绿线绘制L2P4探针和Hoechst 33342的发射强度的分布图。在细胞核中发现了L2P4(通过λ扫描)，发射带的形状和位置类似于在相同激发下针对溶液获得的数据。
图4A显示了L2P2、L2P3和L2P4在EBV阴性(CNE2和HeLa)和EBV阳性(C666-1)细胞中的体外共聚焦成像。相应的明视野图像显示在右侧。发现L2P4的发射相对于EBV阴性细胞对EBV阳性细胞是选择性的。
图4B显示了L2P2、L2P3和L2P4在细胞核中的体外发射光谱(来自共聚焦显微术)。在EBV-阳性C666-1细胞中L2P4的发射强度是L2P3的3倍。
图5A显示了EBNA1蛋白纯化。在大肠杆菌(Escherichia coli)(BL21)中表达EBNA1蛋白(379-641a.a.)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合物，并通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B漂洗(GE Healthcare Dharmacon)将其纯化。将WT-EBNA1的残基YFMVF突变为FFAVA，从而产生突变的EBNA1(EBNA1-3A)。
图5B显示了MBS交联二聚化测定。分析WT EBNA1和突变的EBNA1(EBNA1-3A)的二聚化，其不同地损害EBNA1二聚化的能力。
图5C显示了EBNA1同源二聚化效率(**，P＜0.01)。突变的EBNA1(EBNA1-3A)的二聚化效率降低。
图6A显示了EBNA1二聚化测定。在添加肽(P2-P4)后，对WT-EBNA1进行MBS交联二聚化测定。
图6B显示了EBNA1二聚化测定。将肽(P2-P4)的抑制效率测量为EBNA1二聚体/单体的比率；每一蛋白带的强度表示三次独立实验的平均值±s.d.。
图6C显示了EBNA1二聚化测定。在添加肽缀合物(L2P2-L2P4)后，对WT-EBNA1进行MBS交联二聚化测定。
图6D显示了EBNA1二聚化测定。将肽缀合物(L2P2-L2P4)的抑制效率测量为EBNA1二聚体/单体的比率；每一蛋白带的强度表示三次独立实验的平均值±s.d.。
图7A图24显示了24小时后缀合物探针对EBV阴性人正常肺成纤维细胞MRC-5细胞的细胞毒性(MTT测定)。测试每一缀合物探针，一式三份，并重复两次。数据表示平均值±s.d.。
图7B显示了24小时后缀合物探针对EBV阴性人宫颈癌HeLa细胞的细胞毒性(MTT测定)。测试每一缀合物探针，一式三份，并重复两次。数据表示平均值±s.d.。
图7C显示了24小时后缀合物探针对EBV阴性伯基特淋巴瘤Ramos细胞的细胞毒性(MTT测定)。测试每一缀合物探针，一式三份，并重复两次。数据表示平均值±s.d.。
图7D显示了24小时后缀合物探针对EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞的细胞毒性(MTT测定)。测试每一缀合物探针，一式三份，并重复两次。数据表示平均值±s.d.。
图7E显示了24小时后缀合物探针对EBV阳性鼻咽癌NPC43细胞的细胞毒性(MTT测定)。测试每一缀合物探针，一式三份，并重复两次。数据表示平均值±s.d.。
图7F显示了24小时后缀合物探针对EBV阳性伯基特淋巴瘤Raji细胞的细胞毒性(MTT测定)。测试每一缀合物探针，一式三份，并重复两次。数据表示平均值±s.d.。
图8A显示了体内肿瘤抑制测定。给小鼠肿瘤内注射二甲基亚砜(DMSO；媒介和对照)，每周两次，持续21天。在实验结束时，切除肿瘤并拍照。
图8B显示了P4的体内肿瘤抑制测定(每个肿瘤4μg)。给小鼠肿瘤内注射P4，每周两次，持续21天；高(H)和低(L)剂量分别为每个肿瘤4μg和2μg。在实验结束时，切除肿瘤并拍照。
图8C显示了L2P4的体内肿瘤抑制测定(每个肿瘤4μg)。给小鼠肿瘤内注射L2P4，每周两次，持续21天；高(H)和低(L)剂量分别为每个肿瘤4μg和2μg。在实验结束时，切除肿瘤并拍照。
图8D显示了P4和L2P4作为EBV特异性抗癌剂的体内研究。P4和L2P4的体内肿瘤抑制测定，给小鼠肿瘤内注射P4、L2P4或二甲基亚砜(DMSO；媒介和对照)，每周两次，持续21天；高(H)和低(L)剂量分别为每个肿瘤4μg和2μg。在实验结束时，切除肿瘤并拍照，并测量它们的重量。数据表示为平均值±SEM。*P＜0.05；**P＜0.005。
图8E显示了P4和L2P4作为EBV特异性抗癌剂的体内研究。P4和L2P4的体内肿瘤抑制测定，给小鼠肿瘤内注射P4、L2P4或二甲基亚砜(DMSO；媒介和对照)，每周两次，持续21天；高(H)和低(L)剂量分别为每个肿瘤4μg和2μg。在实验结束时，切除肿瘤并拍照，并测量它们的体积。数据表示为平均值±SEM。*P＜0.05；**P＜0.005。
图8F显示了P4和L2P4作为EBV特异性抗癌剂的体内研究。P4和L2P4的体内肿瘤抑制测定，给小鼠肿瘤内注射P4、L2P4或二甲基亚砜(DMSO；媒介和对照)，每周两次，持续21天；高(H)和低(L)剂量分别为每个肿瘤4μg和2μg。在实验结束时，切除肿瘤。切除的C666-1肿瘤的代表性荧光图像。在杀死小鼠后直接切除肿瘤，并将荧光定量为总辐射效率，[光子/s]/[μW/cm2]。图像：min＝0.00，max＝5.59×108。
图9显示了L2P2、L2P3和L2P4的合成路线。
图10A显示了粗制P4的MALDI-TOF谱。
图10B显示了粗制L2P4的MALDI-TOF谱。
图10C显示了粗制L2P4的制备型HPLC谱。
图11A显示了纯化的L2P4的MALDI-TOF谱。已经除去了位于1632.0处对应于P4的最强峰。
图11B显示了纯化的L2P4的分析型HPLC谱。
图12A显示了纯化的L2P4的LCMS谱。
图12B显示了纯化的L2P4的LCMS分析(对于[L2P4+2H]2+，计算：963.025，发现(found)：963.592；对于[L2P4+3H]3+，计算：642.352，发现：643.479；对于[L2P4+4H]4+，计算：482.016，发现：482.785；对于[L2P4+5H]5+，计算：385.814，发现：386.441；对于[L2P4+6H]6+，计算：321.680，发现：322.949)。
图13A显示了纯化的L2P4的模拟精确质谱。
图13B显示了纯化的L2P4的实验精确质谱。
图14A显示了纯化的L2P2的分析型HPLC谱。
图14B显示了纯化的L2P3的分析型HPLC谱。
图15A显示了EBNA1 DBD结构域(蛋白质数据库ID：1B3T，链A，残基461-607)的蛋白序列中的主要结构基序。
图15B显示了EBNA1 DBD结构域(PDB ID：1B3T，链A，残基461-607)的晶体结构的主要结构基序。
图16A显示了用于EBNA1单体(461-607)的MD模拟的、EBNA1 DBD单体的推定结构中所有残基的CαRMSF。
图16B显示了EBNA1中所有残基的CαRMSD(上图)和除高动态环1和5之外的所有残基的CαRMSD(下图)。
图16C显示了包含二聚化界面的四个β片层基序(β1：503-511，β2：532-540，β3：556-566，和β4：593-604)的CαRMSD。
图16D显示了二聚化界面上关键残基的SASA，包括Y561、M563和F565。已经计算了每个残基的参考值，其以黑色虚线显示。对于Y561，所述值为对于M563，其为对于F565，其为
图16E显示了由200ns MD模拟计算的主要聚簇的代表性EBNA1单体构象(群体＞5％)。
图16F显示了EBNA1单体的最大聚簇的代表性结构，其被选择用于对接研究(docking study)。
图17A显示了针对200ns MD模拟选择的P2-EBNA1复合体的位姿(pose)。已在图中标出了肽序列和对接能(docking energy)。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602和D605。
图17B显示了针对200ns MD模拟选择的L2P2-EBNA1复合体的位姿。已在图中标出了肽序列和对接能。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602以及D605。
图17C显示了针对200ns MD模拟选择的P3-EBNA1复合体的位姿。已在图中标出了肽序列和对接能。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602以及D605。
图17D显示了针对200ns MD模拟选择的L2P3-EBNA1复合体的位姿。已在图中标出了肽序列和对接能。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602以及D605。
图17E显示了针对200ns MD模拟选择的P4-EBNA1复合体的位姿。已在图中标出了肽序列和对接能。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602以及D605。
图17F显示了针对200ns MD模拟选择的L2P4-EBNA1复合体的位姿。已在图中标出了肽序列和对接能。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602以及D605。
图18A显示了L2的化学结构(左)和AMBER原子类型(右)。推定的结构用于计算限制性静电势(Restrained Electrostatic Potential，RESP)电荷，并且示出了辅助模型构建和能量精化(Assisted Model Building with Energy Refinement，AMBER)原子类型。
图18B显示了LIN的化学结构和AMBER原子类型。推定的结构用于计算限制性静电势(RESP)电荷，并在图中显示了辅助模型构建和能量精化(AMBER)原子类型。
图19A显示了在P2-EBNA1复合体的MD模拟中EBNA1的所有残基的CαRMSF。
图19B显示了在P2-EBNA1复合体的MD模拟中P2的CαRMSF。
图19C显示了对于P2-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象(endconformation)，EBNA1的所有残基的CαRMSD演化(上图)和EBNA1的除高动态环1和5之外的所有残基的CαRMSD演化(下图)。
图19D显示了对于P2-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，P2中所有残基的CαRMSD演化(上图)和YFMVF基序的CαRMSD(下图)。
图19E显示了在P2-EBNA1复合体的MD模拟中，二聚化界面上参与探针-受体疏水接触的关键残基(Y561、M563和F565)。通过计算模拟期间每个残基的SASA进行观察，并与其在自由可及状态下的参考值(虚线)进行比较。如果SASA小于参考值，则表明可以在该残基内形成链内或链间疏水接触。
图20A显示了在L2P2-EBNA1复合体的MD模拟中EBNA1中所有残基的CαRMSF。
图20B显示了L2P2-EBNA1复合体的MD模拟中L2P2的CαRMSF。
图20C显示了对于L2P2-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，EBNA1的所有残基的CαRMSD演化(上图)和EBNA1的除高动态环1和5之外的所有残基的CαRMSD演化(下图)。
图20D显示了对于L2P2-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，L2P2的CαRMSD演化(上图)和YFMVF基序的CαRMSD(下图)。
图20E显示了在L2P2-EBNA1复合体的MD模拟中，二聚化界面上参与探针-受体疏水接触的关键残基(Y561、M563和F565)。通过计算模拟期间每个残基的SASA进行观察，并与其在自由可及状态下的参考值(虚线)进行比较。如果SASA小于参考值，则表明可以在该残基内形成链内或链间疏水接触。
图21A显示了在P3-EBNA1复合体的MD模拟中，EBNA1中所有残基的CαRMSF。
图21B显示了在P3-EBNA1复合体的MD模拟中P3的CαRMSF。
图21C显示了对于P3-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，EBNA1的所有残基的CαRMSD演化(上图)和EBNA1的除高动态环1和5之外的所有残基的CαRMSD演化(下图)。
图21D显示了对于P3-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，P3中所有残基的CαRMSD演化(上图)和YFMVF基序的CαRMSD(下图)。
图21E显示了在P3-EBNA1复合体的MD模拟中，二聚化界面上参与探针-受体疏水接触的关键残基(Y561、M563和F565)。通过计算模拟期间每个残基的SASA进行观察，并与其在自由可及状态下的参考值(虚线)进行比较。如果SASA小于参考值，则表明可以在该残基内形成链内或链间疏水接触。
图21F显示了在P3-EBNA1复合体的MD模拟中，EBNA1 DBD结构域C-末端处参与与P3中的碱性基序(RrRK)形成盐桥(离子键)的多个酸残基(D601、D602和D603)。通过测量D601/D602/D603的CG原子与精氨酸/赖氨酸的CZ/CE原子之间的距离进行观察。如果距离小于则表明在酸性-碱性残基对之间可形成盐桥。
图22A显示了在L2P3-EBNA1复合体的MD模拟中，EBNA1中所有残基的CαRMSF。
图22B显示了对于L2P3-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，EBNA1的所有残基的CαRMSF演化(上图)和EBNA1的除高动态环1和5之外的所有残基的CαRMSF演化(下图)。
图22C显示了对于L2P3-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，EBNA1的所有残基的CαRMSD演化(上图)和EBNA1的除高动态环1和5之外的所有残基的CαRMSD演化(下图)。
图22D显示了对于L2P3-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，L2P3中所有残基的CαRMSD演化(上图)和YFMVF基序的CαRMSD(下图)。
图22E显示了在L2P3-EBNA1复合体的MD模拟中，二聚化界面上参与探针-受体疏水接触的关键残基(Y561、M563和F565)。通过计算模拟期间每个残基的SASA进行观察，并与其在自由可及状态下的参考值(虚线)进行比较。如果SASA小于参考值，则表明可以在该残基内形成链内或链间疏水接触。
图22F显示了在L2P3-EBNA1复合体的MD模拟中，EBNA1 DBD结构域C-末端处参与与L2P3中的碱性基序(RrRK)形成盐桥(离子键)的多个酸残基(D601、D602和D603)。通过测量D601/D602/D603的CG原子与精氨酸/赖氨酸的CZ/CE原子之间的距离进行观察。如果距离小于则表明在酸性-碱性残基对之间可形成盐桥。
图23A显示了P4-EBNA1复合体的MD模拟中EBNA1的所有残基的CαRMSF。
图23B显示了对于P4-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，EBNA1的所有残基的CαRMSD演化(上图)和EBNA1的除高动态环1和5之外的所有残基的CαRMSD演化(下图)。
图23C显示了对于P4-EBNA1复合体的MD模拟中的起始和终止，EBNA1的所有残基的CαRMSD演化(上图)和EBNA1的除高动态环1和5之外的所有残基的CαRMSD演化(下图)。
图23D显示了对于P4-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，P4中所有残基的CαRMSD演化(上图)和YFMVF基序的CαRMSD(下图)。
图23E显示了在P4-EBNA1复合体的MD模拟中，二聚化界面上参与探针-受体疏水接触的关键残基(Y561、M563和F565)。通过计算模拟期间每个残基的SASA进行观察，并与其在自由可及状态下的参考值(虚线)进行比较。如果SASA小于参考值，则表明可以在该残基内形成链内或链间疏水接触。
图23F显示了在P4-EBNA1复合体的MD模拟中，EBNA1 DBD结构域C末端处参与与P4中的碱性基序(RrRK)形成盐桥(离子键)的多个酸残基(D601、D602和D603)。通过测量D601/D602/D603的CG原子与精氨酸/赖氨酸的CZ/CE原子之间的距离进行观察。如果距离小于则表明可以在酸性-碱性残基对之间形成盐桥。
图24A显示了在L2P4-EBNA1复合体的MD模拟中EBNA1中所有残基的CaRMSF。
图24B显示了在L2P4-EBNA1复合体的MD模拟中L2P4的CaRMSF。
图24C显示了对于L2P4-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，EBNA1的所有残基的CaRMSD演化(上图)和EBNA1的除高动态环1和5之外的所有残基的CaRMSD演化(下图)。
图24D显示了对于L2P4-EBNA1复合体的MD模拟中的起始或终止构象，L2P4中所有残基的CaRMSD演化(上图)和YFMVF基序的CaRMSD(下图)。
图24E显示了在L2P4-EBNA1复合体的MD模拟中，二聚化界面上参与探针-受体疏水接触的关键残基(Y561、M563和F565)。通过计算模拟期间每个残基的SASA进行观察，并与其在自由可及状态下的参考值(虚线)进行比较。如果SASA小于参考值，则表明可以在该残基内形成链内或链间疏水接触。
图24F显示了在L2P4-EBNA1复合体的MD模拟中，EBNA1DBD结构域C末端处参与与L2P4中的碱性基序(RrRK)形成盐桥(离子键)多个酸残基(D601、D602和D603)。通过测量D601/D602/D603的CG原子与精氨酸/赖氨酸的CZ/CE原子之间的距离进行观察。如果距离小于则表明可以在酸性-碱性残基对之间形成盐桥。
图25A显示了由P2-EBNA1复合体的200ns MD模拟产生的代表性结构。在每个复合体中已经标记了肽序列和GB/PB结合自由能。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602以及D603。
图25B显示了由L2P2-EBNA1复合体的200ns MD模拟产生的代表性结构。在每个复合体中已经标记了肽序列和GB/PB结合自由能。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602以及D603。
图25C显示了由P3-EBNA1复合体的200ns MD模拟产生的代表性结构。在每个复合体中已经标记了肽序列和GB/PB结合自由能。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602和D603。
25D显示了由L2P3-EBNA1复合体的200ns MD模拟产生的代表性结构。在每个复合体中已经标记了肽序列和GB/PB结合自由能。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602和D603。
图25E显示了由P4-EBNA1复合体的200ns MD模拟产生的代表性结构。在每个复合体中已经标记了肽序列和GB/PB结合自由能。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602和D603。
图25F显示了由L2P4-EBNA1复合体的200ns MD模拟产生的代表性结构。在每个复合体中已经标记了肽序列和GB/PB结合自由能。EBNA1以带状呈现，EBNA1中的主要结合位点在3D结构中以棒性模式呈现，包括Y561、M563、F565、D601、D602和D603。
图26A显示了在37℃下孵育2、4、6、15和24小时后且在t＝0小时，PBS缓冲液中L2P2的发射光谱(浓度：1μM，PBS缓冲液：8g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，3.62g Na2HPO4·12H2O)。
图26B显示了在37℃下孵育2、4、6、15和24小时后且在t＝0小时，PBS缓冲液中L2P3的发射光谱(浓度：在PBS缓冲液中1μM：8gNaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，3.62gNa2HPO4·12H2O)。
图26C图示了在37℃孵育2、4、6、15和24小时后且在t＝0小时，PBS缓冲液中L2P4的发射光谱(浓度：PBS缓冲液中1μM：8g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，3.62gNa2HPO4·12H2O)。
图27A显示了罗丹明6G在水中的发射光谱，用于发射量子产率测定(λex＝480nm)。
图27B显示了罗丹明在水中的发射图(发射对比吸光度)，用于发射量子产率测定(λex＝480nm)。
图27C显示了L2P2在水中的发射光谱，用于发射量子产率测定(λex＝480nm。通过利用罗丹明6G的比较方法，L2P2的量子产率为4.4％)。
图27D显示了L2P2在水中的发射图(发射对比吸光度)，用于发射量子产率测定(λex＝480nm。通过利用罗丹明6G的比较方法，L2P2的量子产率为4.4％)。
图27E显示了L2P3在水中的发射光谱，用于发射量子产率测定(λex＝480nm。通过利用罗丹明6G的比较方法，L2P3的量子产率为4.3％)。
图27F显示了L2P3在水中的发射图(发射对比吸光度)，用于发射量子产率测定(λex＝480nm。通过利用罗丹明6G的比较方法，L2P3的量子产率为4.3％)。
图27G显示了L2P4在水中的发射光谱，用于发射量子产率测定(λex＝480nm。通过利用罗丹明6G的比较方法，L2P4的量子产率为3.9％)。
图27H显示了L2P4在水中的发射图(发射对比吸光度)，用于发射量子产率测定(λex＝480nm。通过利用罗丹明6G的比较方法，L2P4的量子产率为3.9％)。
图28A显示了在饱和WT-EBNA1存在的情况下，L2P2在水中的图(发射对比吸光度)，用于发射量子产率测定(λex＝480nm。通过利用罗丹明6G的比较方法，L2P2+WT EBNA1的量子产率为3.8％)。
图28B显示了在饱和WT-EBNA1存在的情况下，L2P3在水中的图(发射对比吸光度)，用于发射量子产率测定(λex＝480nm。通过利用罗丹明6G的比较方法，L2P3+WT EBNA1的量子产率为13.0％)。
图28C显示了在饱和WT-EBNA1存在的情况下，L2P4在水中的图(发射对比吸光度)，用于发射量子产率测定(λex＝480nm。通过利用罗丹明6G的比较方法，L2P4+WT EBNA1的量子产率为22.9％)。
图29A显示了在PBS缓冲液中添加WT-EBNA1后L2P2的发射光谱，用于结合常数测定(浓度：2μM)。
图29B显示了在PBS缓冲液中添加WT-EBNA1后L2P3的发射光谱，用于结合常数测定(浓度：2μM)。
图29C显示了在PBS缓冲液中添加WT-EBNA1后L2P3的双对数回归曲线，用于结合常数测定(浓度：2μM。根据双对数回归计算，log Ka的值为5.50，发现L2P34与WT-EBNA1的结合比为1∶1)。
图29D显示了在PBS缓冲液中添加WT-EBNA1后L2P4的发射光谱，用于结合常数测定(浓度：2μM)。
图29E显示了在PBS缓冲液中添加WT-EBNA1后L2P4的双对数回归曲线，用于结合常数测定(浓度：2μM。根据双对数回归计算，log Ka的值为6.82，L2P4与WT-EBNA1的结合比为1∶1)。
图30A显示了在国际添加ZnCl2后L2P3(在PBS缓冲液中2μM)发射光谱的变化。
图30B显示了在国际添加NaHCO3后L2P3(在PBS缓冲液中2μM)发射光谱的变化。
图30C显示了在国际添加CuCl2后L2P3(在PBS缓冲液中2μM)发射光谱的变化。
图30D显示了在国际添加柠檬酸盐后L2P3(在PBS缓冲液中2μM)发射光谱的变化。
图30E显示了在国际添加BSA后L2P3(在PBS缓冲液中2μM)发射光谱的变化。结果表明L2P3对WT-EBNA1是选择性的。
图30F显示了通过添加两种不同蛋白WT-EBNA1和BSA诱导的发射增强的比较。结果表明L2P3对WT-EBNA1是选择性的。
图31A显示了在国际添加ZnCl2后L2P4(在PBS缓冲液中2μM)发射光谱的变化。
图31B显示了在国际添加NaHCO3后L2P4(在PBS缓冲液中2μM)发射光谱的变化。
图31C显示了在国际添加CuCl2后L2P4(在PBS缓冲液中2μM)发射光谱的变化。
图31D显示了在国际添加柠檬酸盐后L2P4(在PBS缓冲液中2μM)发射光谱的变化。
图31E显示了在国际添加BSA后，L2P4(在PBS缓冲液中2μM)发射光谱的变化。结果表明L2P4对WT-EBNA1的选择性高于L2P3。
图31F显示了通过添加两种不同蛋白WT-EBNA1和BSA诱导的发射增强的比较。结果表明L2P4对WT-EBNA1的选择性高于L2P3。
图32显示了L2P4在不同溶剂中的吸收光谱(浓度：10μM)。
图33A显示了L2P3在PBS缓冲液中的发射光谱，用于研究pH对发射光谱的影响和测定pKa值。
图33B显示了L2P3在PBS缓冲液中的图(发射对比pH)，用于研究pH对发射光谱的影响和测定pKa值。
图33C显示了L2P4在PBS缓冲液中的发射光谱，用于研究pH对发射光谱的影响以及测定pKa值。
图33D显示了L2P4在PBS缓冲液中的图(发射对比pH)，用于研究pH对发射光谱的影响和测定pKa值。
图34显示了L2P4在不同溶剂中的发射寿命衰变(光源：460nm纳米LED，浓度：10μm)。
图35A显示了纯化的EBNA1蛋白。在大肠杆菌(BL21)中表达EBNA1蛋白(379-641a.a.)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合物，并通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B漂洗(GEHealthcare Dharmacon)纯化。将WT-EBNA1的残基YFMVF突变成FFAVA，产生EBNA1-3A突变蛋白，或突变成单氨基酸突变，产生Y561A、M563A和F565A。
图35B分析WT EBNA1和EBNA1突变体的二聚化，它们不同地损害EBNA1二聚化的能力。
图35C，EBNA1同源二聚化效率(**，P＜0.01)。WT EBNA1和EBNA1突变体不同地损害EBNA1二聚化的能力。
图36A显示了在EBV阴性人宫颈癌HeLa细胞中L2P2、L2P3和L2P4的细胞摄取。
图36B显示了在EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞中L2P2、L2P3和L2P4的细胞摄取。
图36C显示了在EBV阳性鼻咽癌NPC43细胞中L2P2、L2P3和L2P4的细胞摄取。
图37A显示了在EBV阴性人宫颈癌HeLa细胞中L2P2的体外成像(λex＝488nm，λem＝500-650nm，滤器＝BP500)。
图37B显示了在EBV阴性人宫颈癌HeLa细胞中L2P3的体外成像(λex＝488nm，λem＝500-650nm，滤器＝BP500)。
图37C显示了在EBV阴性人宫颈癌HeLa细胞中L2P4的体外成像(λex＝488nm，λem＝500-650nm，滤器＝BP500)。
图37D，在EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞中L2P2的体外成像(λex＝488nm，λem＝500-650nm，滤器＝BP500)。
图37E，在EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞中L2P3的体外成像(λex＝488nm，λem＝500-650nm，滤器＝BP500)。
图37F，在EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞中L2P4的体外成像(λex＝488nm，λem＝500-650nm，滤器＝BP500)。可以发现探针的不同位置，即L2P2仅显示出细胞质位置，而L2P3和L2P4可以借助NLS序列(RrRK)进入到C666-1细胞核中。
图38A显示了C666-1细胞中的L2P4与溶酶体(lyso)Green DND-26示踪剂的共染色(用10μM L2P4处理细胞，然后将其孵育6小时，之后用1nM溶酶体示踪剂处理细胞，并孵育1小时)。此处显示了L2P4的发射。
图38B显示了C666-1细胞中的L2P4与溶酶体Green DND-26示踪剂的共染色(用10μML2P4处理细胞，然后将其孵育6小时，之后用1nM溶酶体/示踪剂处理细胞，并孵育1小时)。此处显示了溶酶体示踪剂的发射。
图38C显示了C666-1细胞中的L2P4与溶酶体Green DND-26示踪剂的共染色(用10μML2P4处理细胞，然后将其孵育6小时，之后用1nM线粒体(mito)示踪剂处理细胞，并孵育1小时)。几乎不能在溶酶体上观察到位置。
图38D显示了C666-1细胞中的L2P4与线粒体Green FM M7514示踪剂的共染色(用10μM L2P4处理细胞，然后培养6小时，之后用1nM线粒体示踪剂处理细胞，并孵育1小时)。此处显示了L2P4的发射。
图38E显示了C666-1细胞中的L2P4与线粒体Green FM M7514示踪剂的共染色(用10μM L2P4处理细胞，然后将其孵育6小时，之后用1nM线粒体示踪剂处理细胞，并孵育1小时)。此处显示了线粒体示踪剂的发射。
图38F显示了C666-1细胞中的L2P4与线粒体Green FM M7514示踪剂的共染色(用10μM L2P4处理细胞，然后将其孵育6小时，之后用1nM线粒体示踪剂处理细胞，并孵育1小时)。它显示了在线粒体上的位置，因为L2本身通常位于线粒体上。
图39A显示了Pn(n＝2、3、4)对EBV阴性人肺成纤维细胞正常MRC-5细胞的细胞毒性测定结果(孵育时间：24小时)。
图39B显示了Pn(n＝2、3、4)对EBV阴性人宫颈癌HeLa细胞的细胞毒性测定结果(孵育时间：24小时)。
图39C显示了Pn(n＝2、3、4)对EBV阴性伯基特淋巴瘤Ramos细胞的细胞毒性测定结果(孵育时间：24小时)。
图39D显示了Pn(n＝2、3、4)对EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞的细胞毒性测定结果(培养时间：24小时)。
图39E显示了Pn(n＝2、3、4)对新衍生的EBV阳性鼻咽癌NPC43细胞的细胞毒性测定结果(孵育时间：24小时)。
图39F显示了Pn(n＝2、3、4)对EBV阳性伯基特淋巴瘤Raji细胞的细胞毒性测定结果(孵育时间：24小时)。
图40显示了通过肿瘤内注射P4、L2P4(低剂量或高剂量)或DMSO，每周两次，治疗21天后小鼠的体重。
图41A显示了在21天内用不同药物治疗后小鼠的重要器官重量(心脏)。
图41B显示了在21天内用不同药物治疗后小鼠的重要器官重量(脾脏)。
图41C显示了在21天内用不同药物治疗后小鼠的重要器官重量(肝脏)。
图41D显示了在21天内用不同药物治疗后小鼠的重要器官重量(肾脏)。
图41E显示了在21天内用不同药物治疗后小鼠的重要器官重量(肺)。
图42A显示了用P4-L(低剂量的P4，2μg/肿瘤)处理后小鼠的肿瘤大小。
图42B显示了用L2P4-L(低剂量的L2P4，2μg/肿瘤)处理后小鼠的肿瘤大小。
图43A显示了在通过肿瘤内注射P4、L2P4(低剂量或高剂量)或DMSO每周两次，治疗18天后，携带HeLa异种移植物的小鼠的体重。
图43B显示了在通过肿瘤内注射P4、L2P4(低剂量或高剂量)或DMSO，每周两次，治疗18天后，携带HeLa异种移植物的小鼠的肿瘤体积。
图43C显示了在通过肿瘤内注射P4、L2P4(低剂量或高剂量)或DMSO，每周两次，治疗18天后，携带HeLa异种移植物的小鼠的肿瘤重量。在实验结束时，切除肿瘤并称重。每组肿瘤的平均肿瘤重量以克±SEM表示。
图44显示了在通过肿瘤内注射P4、L2P4(低剂量或高剂量)或DMSO，每周两次，治疗18天后，携带HeLa异种移植物的小鼠的肿瘤图像。在处死小鼠后切除肿瘤并拍照。图像显示了每组的代表性肿瘤。
图45显示了图9中化合物3的400MHz-1H-NMR(CDCl3)谱。
图46显示了图9中化合物3的100MHz-13C-NMR(CDCl3)谱。
图47显示了图9中化合物3的MALDI-TOF谱，HRMS(m/z)：针对C17H20N2计算的[M]+，252.1626；发现，252.1611；误差，-6ppm。
图48显示了图9中化合物4的400MHz-1H-NMR(CDCl3)谱。
图49显示了图9中化合物4的100MH2-13C-NMR(CDCl3)谱。
图50显示了图9中化合物4的MALDI-TOF谱，HRMS(m/z)：针对C21H27N2O2 +计算的[M]+，339.2067；发现，339.2046；误差：-6ppm。
图51显示了图9中化合物5的400MHz-1H-NMR(MeOD)谱。
图52显示了图9中化合物5的100MHz-13C-NMR(MeOD)谱。
图53显示了图9中化合物5的MALDI-TOF谱，HRMS(m/z)：针对C19H23N2O2 +计算的[M]+，311.1754；发现，311.1758；误差：1ppm。
图54显示了L2P2的MALDI-TOF谱，HRMS(m/z)：针对C56H69N8O7S+计算的[M]+，998.5083；发现，998.5185；误差：10ppm。
图55显示了L2P3的MALDI-TOF谱，HRMS(m/z)：针对C93H140N26O15S2 +计算的[M+H]+，1925.0427；发现，1925.0363；误差：-3ppm。
图56显示了L2P4的MALDI-TOF谱，HRMS(m/z)：针对C93H140N26O15S2 +计算的[M+H]+，1925.0427；发现，1925.0450；误差：1ppm。
图57的图示显示了本发明的肽缀合物和设计的探针用于杀死癌细胞和成像的用途。
图58显示了从相同L2结构家族合成L2P4和L2的不同途径以及PET成像。
图59显示了与具体PET可用配体缀合的肽的成功合成。
图60显示了具有MRI可用配体的本发明的实施方案。
图61显示了具有PET配体的本发明的实施方案。
发明详述
本发明的范围不限于本文所述的任何具体实施方案。提供以下实施例仅用于举例说明。
EB病毒(EBV)是普遍存在的人疱疹病毒，其引起传染性单核细胞增多症和淋巴组织增生性疾病，但是一旦病毒在人类宿主中建立潜伏性感染，其则被免疫系统很好地控制。EB核抗原1(EBNA1)是在所有EBV阳性肿瘤中都表达的唯一癌蛋白，并且它在EBV基因组的维持、复制和转录中起关键作用。此外，EBNA1可以影响细胞基因转录，这是EBV相关肿瘤发展的基础。鉴于这些关键的生物学功能，EBNA1已成为治疗干预的引人注意的目标。
考虑到EBNA1的同源二聚化对于EBNA1发挥功能是必需的，能特异性地防止二聚化过程的抑制剂为靶向和杀死EBV阳性细胞提供了新途径。已报道了几种有效阻断EBNA1同源二聚化的EBNA1抑制剂，包括小分子EiK1和短EBNA1衍生肽P85。Eik1是通过高通量筛选鉴定的，其能够靶向EBNA1的二聚体界面(残基459-607)。P85含有短EBNA1衍生的β3片层(残基560-566)，其也靶向这个区域(残基560-574)。然而，迄今为止报道的大多数靶向EBNA1的化合物不容易成像(体外)，并且它们生物利用度低。上述两个问题都是该领域的主要挑战，并且阻碍了EBNA1靶向疗法的进一步发展。在本领域中，还存在杂合生物缀合物JLP2，其含有带电荷的水溶性发色团和EBNA-1特异性肽。虽然JLP2能够对EBNA1进行特异性成像和体外抑制，但JLP2缺乏特异性亚细胞定位，并且不显示响应性结合，这限制了其进一步发展为细胞成像工具和用于治疗EBV癌症的选择性治疗剂。
还值得注意的是，EBNA1主要定位于EBV阳性细胞的细胞核中，并且EBNA1充当有丝分裂染色体和复制起点(oriP)质粒之间的桥梁。限制癌症疗法成功的一个因素是特异性靶向期望细胞类型的挑战。目前还没有用于使细胞核中的EBNA1可视化并监测其对EBNA1同源二聚化的作用的直接、灵敏系统。为了解决该问题，需要提供用于选择性EBV癌症成像以及体外和体内抑制的核透过性EBNA1特异性双探针。用于EBNA1的体外显微研究和EBV阳性肿瘤的体内选择性抑制的响应性核特异性生物探针的开发尚未得到详细研究。为此，本发明提供了肽缀合物，其可用于在EBV阳性细胞中响应性发射成像，并且对EBV阳性细胞和肿瘤提供高选择性和有效体外/体内细胞毒性。
图1A显示了本申请的双功能肽-缀合物探针L2P2、L2P3和L2P4显示，并且图9概述了它们的合成。L2是4-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-N-羧甲基吡啶鎓氯化物，P2、P3和P4分别是氨基酸SEQ ID NO.1、2和3的肽。P2(YFMVF)是衍生自EBNA1的β4的肽，并且其是EBNA1特异性的。P3(CAhxRrRKGGYFMVF，其中Ahx是6-氨基己酸；R是L-精氨酸，r是D-精氨酸)和P4(CAhxYFMVFGGRrRK，其中Ahx是6-氨基己酸)。中间体(图9中的化合物3-5)以及L2P2、L2P3和L2P4的表征(包括1H NMR、，13C NMR和质谱分析)显示于图45-56中。通过高效液相色谱法纯化肽缀合物；纯化和表征程序提供于图10A-14B中。L2P4(其中L2是4-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-N-羧甲基吡啶鎓氯化物，P4是氨基酸序列CAhxYFMVFGGRrRK(SEQ ID No.3)，并且它们通过酰胺键偶联)与野生型EBNA1(WT-EBNA1)强烈相互作用，这通过由与WT-EBNA1结合(结合常数＝6.7)后其发射强度增加8.8倍所证实。L2P4具有式(I)，其中式(I)是L2P4在与WT-EBNA1结合后有显著响应，并且发现响应信号受由分子间电荷转移(ICT)机制诱导。通过选择性干扰EBNA1同源二聚化，利用本发明的双功能荧光肽-缀合物探针显示证明了EBV阳性肿瘤的同时成像和抑制。L2P4对EBV阳性细胞是具有高度细胞毒性的(半最大抑制浓度，IC50≈15μM)，但即使在高剂量(50μM，IC50＞0.5mM)下，其对EBV阴性细胞几乎没有或没有细胞毒性。此外，L2P4对EBV阳性肿瘤表现出强的体内毒性(肿瘤内注射4μg导致92.8％的生长抑制)。本文所述的体外和体内研究均证明了L2P4作为双重EBV肿瘤选择性癌症靶向剂和成像探针的效力。本发明的肽缀合物可用于治疗EBV相关的癌症(例如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌)。本发明的肽缀合物也可用于使EBV阳性细胞和肿瘤成像，从而阐明EBNA1在EBV在细胞核内的复制中的功能。图57中阐明了本发明的肽缀合物在癌症治疗和癌细胞成像中的用途。
结果和讨论
a.针对EBNA1二聚体界面的肽或肽缀合物的合理设计和MD模拟。EBNA1的DNA结合结构域(SEQ ID NO.4)的X射线晶体结构(蛋白质数据库ID，1B3T；链A；残基461-607)是一种α/β混合折叠，其包括由几个环连接的四个α-螺旋和四个β片层基序(图1B，左)。不同的结构基序(β片层，β1-β4)有助于其独特的功能区域，所述功能区域经由疏水包装(hydrophobicpacking)驱动二聚体的形成；α螺旋α1和α2通过静电相互作用而与DNA相互作用，而α3和α4则使β片层稳定；带正电荷的环1介导DNA结合；而柔性环5参与二聚化。
EBNA1 DNA结合结构域单体的结构由其同源二聚体的X射线晶体结构产生，并且其用于在AMBER 14中进行200ns全原子显性溶剂(explicit-solvent)MD模拟。除了对EBNA1的同源二聚化没有贡献的高动态环1和5之外，EBNA1结构在模拟期间表现出了良好的稳定性并保持原始构象(图16A和16B)。包含二聚体界面的4个β片层也表现出合理的稳定性(图16C)。而且，还发现构成二聚体界面的4个β片层表现出良好的稳定性。检查了推定结构中二聚体界面的可接近性，已进行溶剂可及表面积(SASA)计算，结果表明二聚体界面上的关键残基(Y561、M563和F565)可以通过外来探针接近(图16D)。在检查了该推定结构的稳定性和可及性之后，选择代表性构象并进行对接研究，以鉴定每个配体-EBNA1复合体的对接位姿(docked poses)(图16E和16F)。配体选自P2、P3、P4、L2P2、L2P3和L2P4。然后使用评分函数对所有对接位姿进行分级，以选择每种复合体的最终位姿。发现大多数选定的位姿都有一些相似之处；例如，EBNA1中的关键残基与YFMVF基序的相互作用出现在所有复合体中(图17A-17F)。此外，在带正电的四肽RrRK和EBNA1中富含天冬氨酸的尾部之间发现了预料不到的盐桥接，证明了这种核定位序列的第二作用。
为了更好地表征配体-EBNA1复合体、计算结合能，使用所选的对接位姿进行200nsMD模拟，以计算复合体中的相互作用能。对非标准残基的AMBER(辅助模型构建和能量精化)类型进行参数化(图18A-18B)，并且在运行MD模拟之前定义缺失的力场参数。发现所有复合体在50ns后都是稳定的。盐-桥相互作用仅出现在具有RrRK四肽、含有P3和P4的配体中。尽管如此，MD模拟显示的每种复合体的主要相互作用是相似的(清晰的疏水接触和盐桥接；图25A-25F)。发现了在配体和二聚体界面上的关键残基之间的发现疏水相互作用，而在RrRK基序和EBNA1中富含天冬氨酸的尾部中的几个残基(D601、D602和D605)之间发现盐桥接/离子键合。特别地，D602表现出最强的盐-桥相互作用，而D605表现出最弱的盐-桥相互作用(图19A-19E、20A-20E、21A-21F、22A-22F、23A-23F和24A-24F)。总之，MD模拟显示两种主要的相互作用类型，其促进本发明的肽缀合物与EBNA1的结合。除了核定位之外，它们还证明了RrRK序列在与EBNA1结合中第二要作用。
通过分子力学泊松-玻尔兹曼表面积(Molecular Mechanics Poisson-BoltzmannSurface Area，MMPBSA)方法计算所有复合体的结合自由能。计算的广义Born(GB)和泊松-玻尔兹曼(PB)值呈现出相同的顺序，L2P4＞L2P3＞L2P2，表明L2P4与EBNA1具有最强的结合相互作用。
b.L2P4与EBNA1的响应性发射。通过在37℃对肽缀合物的发射光谱监测24小时而评估的肽缀合物的稳定性，在模拟的细胞外阴离子混合物(PBS缓冲液)中得到证实(图26A-26C)。如前面部分所述，MD模拟和自由能计算表明，L2P4与WT-EBNA1具有最强的相互作用，因此它可用于防止EBNA1同源二聚化并最终抑制EBV阳性肿瘤的生长。为了获得L2P4与WT-EBNA1的实际结合亲和力，在PBS缓冲液中进行发光滴定实验。由滴定实验获得的结果与通过MMPBSA计算的数据非常一致。发现L2P4在添加4μM WT-EBNA1后具有最强的发射响应(图2A-2C和图29A-29E)，图21显示了8.8倍的发射增强(φ初始＝4％，φ4μM WT-EBNA1＝23％)和25nm的蓝移。如图27A-27H和28A-28C所示，计算在添加和不添加WT-EBNA1情况下的L2P4的量子产率。
在相同条件下，观察到L2P3强度增加4.7倍，而未观察到L2P2的强度发生变化。探针对蛋白质的亲和力可以通过结合常数和结合比来量化。如图21所示，计算三种肽缀合物与WT-EBNA1的结合常数(log Kassoc/Ka)。荧光比的对数表现出与蛋白质浓度的线性关系。经计算，L2P3和L2P4的log Kassoc值分别为5.50和6.82，并且发现这两种结合比均为1∶1。由于L2P4的结合强度更大，在存在各种蛋白质(图2C)和生物相关金属离子和小分子(如Zn2+和柠檬酸盐)(图30A-30F和图31A-31F)的情况下，研究L2P4对WT-EBNA1的结合选择性。在选择性测定中分析的蛋白质包括四种EBNA1突变蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。通过将YFMVF突变为FFAVA(产生EBNA1-3A)或通过将Y561、M563和F565保守点突变为A(产生EBNA1-Y561A、EBNA1-M563A和EBNA1-F565A)来制备EBNA1突变蛋白。通过记录其发射变化来研究L2P4对每种蛋白质的选择性。在添加四种突变EBNA1蛋白和BSA后观察到相对小的发射增强(图2C)，表明L2P4对这些蛋白的结合比对WT-EBNA1的结合弱(EBNA1-Y561A、EBNA1-M563A、EBNA1-F565A和EBNA1-3A的logKassoc值分别为5.1、3.6、4.3和3.9；对于BSA，log Kassoc值为4.7)。显示L2P4对WT-EBNA1具有选择性。
众所周知的是，当环境敏感性荧光团与具有特异性靶向的肽缀合时，随后的蛋白质结合会增加发射强度，并且由于激发态偶极矩的显著变化而会发生大的蓝移。众所周知，4-(N，N-二甲基-氨基)苄腈(DMABN)的双重荧光由于来自局部激发(LE)态的发射和来自ICT态的“异常”红移发射而产生。在迄今报道的该分子的众多DMABN类似物中，吡啶衍生物一直是特别感兴趣的焦点，特别是在细胞微粘度的测定中。考虑到这一点，本发明提供了由ICT态吡啶衍生物荧光团和核透过性EBNA1-特异性肽组成的荧光探针，所述EBNA1-特异性肽在结合EBNA1后产生基于ICT的发射，所述荧光探针可用于防止EBNA1的同源二聚化，并可用于EBV阳性肿瘤的同时成像和抑制。
在各种溶剂中测量L2P4的吸收光谱(图32)。光谱在274nm和约500nm处显示了两个吸收带，分别对应于从基态到局部激发态和ICT态的转变。在极性溶剂中，最大吸收带略微红移。L2P4在激发后显示出双荧光：观察到由局部激发态引起的在560nm处的弱但更高的能量发射和由ICT态引起的在约625nm处的强发射这两者(图2A、2D和2E)。局部激发带的荧光发射是非溶剂依赖性的，而ICT带显示出对溶剂极性的显著依赖性，随着溶剂极性的降低而逐渐发生蓝移(图2E)。此外，图2F上部显示了L2P4的发射衰变，(λex＝475nm；在625nm处监测)，而图34显示了L2P4在不同溶剂中的发射寿命。观察到的较短寿命(约0.5ns)对应于局部激发发射，而ICT带表现出较长的寿命(3.8ns)。
c.L2P4的体外核成像。为了证明L2P4的选择性核定位，针对L2P2、L2P3和L2P4，使EBV阳性(C666-1和NPC43)和EBV阴性(CNE2和HeLa)细胞系成像(图3A-3F和4A-4B)。HeLa是EBV阴性人宫颈癌细胞，CNE2是EBV阴性鼻咽癌细胞，C666-1是EBV阳性鼻咽癌细胞，而Npc 43是新衍生的EBV阳性鼻咽癌细胞。将核定位序列RrRK并入到P3和P4中以增强其核透过性。使用共聚焦成像和流式细胞术独立评估三种探针的细胞摄取和定位(图3A-3F、4A-4B、36A-36C、37A-37F和38A-38F)。根据这些实验，发现L2P4在HeLa和C666-1细胞中都表现出最高的细胞摄取(图36A-36C)。由于RrRK的贡献，在EBV阳性细胞(C666-1和NPC43)中观察到L2P3和L2P4的核定位，而L2P2仅发现于细胞质中，这表明L2P3和L2P4定位于EBV阳性细胞的细胞核中。
d.L2P4对EBV阳性细胞的选择性毒性。EBNA1只能通过形成同源二聚体来促进EBV的DNA复制。因此，阻断二聚体形成为杀死EBV感染的肿瘤细胞提供了途径。众所周知，EBNA1二聚体是通过YFMVF介导的界面形成的，而这可以通过3-马来酰亚胺基苯甲酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)交联二聚化测定来检查；MBS是含有NHS-酯和马来酰亚胺反应性基团的胺-巯基交联剂。MBS介导的蛋白质交联作用表示为二聚体与单体之比。在WT-EBNA1和EBNA1突变体(EBNA1-Y561A、EBNA1-M563A、EBNA1F565A和EBNA1-3A)的同源二聚化效率中进一步研究了YFMVF对二聚化的重要性。在此之前，检查WT-EBNA1和EBNA1突变体的纯度，并分析它们的同源二聚化效率，如图5A-5C所示。结果显示，EBNA1-3A的二聚化效率大大降低，而对于其他三种点突变体，观察到相对小的效率降低(图35A-35C)。与该观察结果和发光滴定实验一致，MBS交联二聚化测定也受到本发明的肽缀合物的抑制，如图6A-6D所示(P＜0.001)。
考虑到L2P4与WT-EBNA1的强结合和选择性核体外成像，证明了对EBV阳性细胞L2P4的选择性且有效的细胞毒性。在三种EBV阴性细胞系(MRC-5(正常肺成纤维细胞)、HeLa和Ramos)和三种EBV阳性细胞系(C666-1、NPC43和Raji)中，对三种肽(P2、P3和P4；图39A-39F)和三种肽缀合物(L2P2、L2P3和L2P4；图7A-7F)进行MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)细胞毒性测定。发现所有探针(肽或肽缀合物)即使在高剂量(50μM)下也在EBV阴性细胞中表现出低细胞毒性，并且在EBV阳性细胞中表现出剂量依赖性细胞毒性。肽缀合物在EBV阳性细胞中的细胞毒性程度(L2P4＞L2P3＞L2P2)与MD模拟、发光滴定和体外成像结果中的相同。
e.L2P4的体内肿瘤成像和抑制
为了进一步评估L2P4的体内性能，经肿瘤内注射对BALB/c裸鼠中的C666-1和HeLa细胞异种移植物施用P4或L2P4(2μg低剂量(L)或4μg高剂量(H))。注射每两周进行一次，同时进行体重和肿瘤测量。携带HeLa细胞异种移植物的小鼠作为对照，以确认P4或L2P4的体内靶向作用的特异性。与对照组相比，用P4或L2P4进行处理对小鼠的体重没有显著影响(图40、41A-41E和43A-43C)，这表明P4和L2P4在EBV阴性癌中都没有表现出体内毒性作用。C666-1细胞异种移植物生长被有效抑制，而HeLa异种移植物的生长未受到P4或L2P4处理的影响(图8D、56D和43B)。到第7天，用P4-L、P4-H和L2P4-H处理C666-1细胞异种移植物与对照相比显著降低了肿瘤体积，并且在实验结束时(第21天)，平均肿瘤体积分别降低65.7％、65.5％和92.3％(p＜0.05，p＜0.005和p＜0.001)(图6D、8D和42A-42B)。对于HeLa细胞异种移植物，在实验结束时(第18天)，在对照小鼠和那些用P4或L2P4(低剂量和高剂量)处理的小鼠之间的平均肿瘤体积没有显著差异，如图43B所示。在实验结束时，杀死小鼠，切除肿瘤并称重。对于C666-1细胞异种移植物，当与对照组比较时，用P4-L、P4-H和L2P4-H处理后平均肿瘤重量分别降低72.6％、86.6％和92.8％(不显著，p＜0.05和p＜0.005)(图8A、8B、8C、8D和8E)。然而，对于HeLa细胞异种移植物，平均肿瘤重量没有显著差异(图43C和44)。P4和L2P4对EBV阳性肿瘤生长的显著性和选择性抑制证实了它们的EBV靶向特异性，并表明L2与P4的缀合不影响其肿瘤抑制作用。
切除的C666-1肿瘤的荧光成像显示，L2P4荧光信号在肿瘤内注射后48小时仍然是可检测的(图8F)。如所预期的，在对照或P4处理的肿瘤中未检测到荧光信号。
在本发明中，初始MD研究显示，疏水相互作用和盐桥的网络介导L2P4与EBNA1的二聚体界面的结合(图1)。使用发光滴定实验进一步证实了L2P4与EBNA1的选择性强结合(图2)。发现L2P4定位于EBV阳性细胞的细胞核中，但不定位于EBV阴性细胞的细胞核中。L2P4在细胞核中的选择性发射通过其与EBNA1的结合而产生(图3A-3F)。
本申请还提供了不能经历同源二聚化的EBNA1突变体(尤其是EBNA1-3A)不能经历同源二聚化(图35A-35C)，从而强调二聚体界面(YFMVF)在EBNA1二聚体形成中的重要性。使用MBS交联二聚化测定在对添加本发明肽缀合物后对时对WT-EBNA1二聚化效率进行的分析表明，本发明的肽缀合物能显著干扰EBNA1二聚体形成(图6A-6D)。对EBV阳性和阴性细胞进行的广泛细胞毒性测定证明了L2P4对EBV阳性细胞生长的显著选择性抑制，更重要的是，揭示了选择性细胞毒性的原因是通过抑制EBNA1二聚化过程(图7A-7F)。最后，研究L2P4对携带C666-1和HeLa细胞异种移植物的小鼠的作用影响的实验证实，L2P4特异性靶向EBV，并且它们证明了本申请的肽缀合物在体内靶向和抑制EBV阳性肿瘤生长中的应用(图8A-8F)，从而治疗EBV相关癌症。本申请证明，通过干扰EBNA1同源二聚化，L2P4可在体外和体内选择性地抑制EBV阳性肿瘤。
实验
1)合成和纯化
肽合成和裂解的一般程序：所用的所有化学品均为试剂级，其购自Sigma-Aldrich，无需进一步纯化即可使用。所有分析级溶剂均通过标准程序干燥，蒸馏并脱气，然后再使用。
肽合成：在配备有Discovery微波单元(microwave unit)的CEM Liberty1单通道微波(MW)肽合成仪上，以0.10mmol规模在Rink酰胺树脂(0.82mmol/g)上进行自动化固相肽合成。使用Fmoc保护的氨基酸(5当量)，同时进行N，N′-二异丙基碳二亚胺/羟基苯并三唑(DIC/HOBt)激活。在“活化剂碱(activator base)”位置使用DIC在DMSO中的0.8M溶液，并且在“活化剂”位置(与默认配置相反)使用HOBt在DMF中的0.5M溶液。如下保护氨基酸侧链功能性：Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Tyt(tBu)-OH。对于Cys残基，于75℃(25W)或50℃使用默认10分钟MW偶联循环进行反应。通过在开始时添加1小时室温(RT)预激活期来延长循环。对于Arg和Cys残基，重复该循环(双偶联)。对于Ahx残基，使用2小时的预激活期。在室温使用哌啶在DMF中的20％(v/v)溶液进行连续处理(5+10分钟)，去除Fmoc基团。对Arg残基，使用延长的Fmoc去保护反应时间(3min MW+20min)。用氮气进行鼓泡，以确保在每个步骤期间有效搅拌反应混合物。在DMF中进行至少1小时干树脂预膨胀。
肽裂解：将肽-树脂在二乙醚中收缩并用3mL裂解混合物(95％三氟乙酸(TFA)、2.5％去离子水和2.5％三异丙基硅烷)在室温处理3.5小时。然后通过过滤除去树脂，将滤液真空浓缩，然后用醚沉淀并倾析液体(随后进行醚洗涤)。将得到的固体肽溶于含有0.1％TFA的去离子水中并冻干。
L2P2、L2P3和L2P4的合成：通过薄层色谱法(TLC)监测每个步骤的反应，所述薄层色谱法使用UV光作为可视化方法在硅胶板(0.25mm，60F254)上进行。快速柱层析在230-400目硅胶上进行。在Bruker Ultrashield 400 Plus NMR光谱仪上记录NMR谱。1H NMR化学位移参考四甲基硅烷，TMS(d＝0.00)。以下缩写用于解释多重性：s＝单重态，d＝双重态，t＝三重态，q＝四重态，dd＝双重态的双重态，m＝多重态，br＝宽(broad)。在Bruker AutoflexMALDI-TOF质谱仪上获得报告为m/z的高分辨率质谱。在TQD质谱仪上获得低分辨率质谱。图9显示了L2P2、L2P3和L2P4的合成路线。合成开始于化合物1(4-甲基吡啶)和化合物2(4-二乙氨基苯甲醛)在存在氢化钠(在矿物油中的60％分散体)作为碱的情况下的反应，得到N，N′-二乙基-4-(2-(吡啶-4-基)乙烯基)苯胺(反应条件a，NaH，二甲基甲酰胺(DMF)，约60℃)，其然后与溴乙酸乙酯反应得到化合物4(4-(4-(二乙氨基)苯乙基)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)吡啶-1-鎓)溴化物(反应条件b，溴乙酸乙酯，乙腈(MeCN)，约85℃)。然后，将化合物4用0.4M NaOH水解，得到化合物5(4-(4-(二乙氨基)苯乙基)-N-羧甲基吡啶鎓氯化物)(反应条件c，0.4M NaOH，二噁烷，室温)，其然后与三种肽-树脂(P2-P4)偶联，接着裂解树脂得到粗产物(粗制L2P2、L2P3和L2P4)(反应条件d，肽-树脂，二异丙基乙胺(DIPEA)，苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷磷(PyBOP)，DMF，室温；反应条件e，三氟乙酸(TFA)，三异丙基硅烷(Tis)，H2O，室温)。通过HPLC纯化粗品，得到三种化合物7(L2P2、L2P3和L2P4)。
3：产率：62％；1HNMR(图45)(CDCl3)：δ-8.50(dd，J1＝1.6Hz，J2＝4.8Hz，2H)，7.41(d，J＝8.8Hz，2H)，7.31(dd，J1＝1.2Hz，J2＝4.8Hz，2H)，7.23(d，J＝16.4Hz，1H)，6.77(d，J＝16Hz，1H)，6.67(d，J＝8.8Hz，2H)，3.40(q，J＝7.2Hz，4H)，1.19(t，J＝7.2Hz，6H)；13CNMR(图46)(CDCl3)：δ149.91，148.14，145.67，133.37，128.55，123.22，120.30，111.45，77.20，44.41，12.62；
4：产率：90％；1HNMR(图47)(CDCl3)：δ-8.83(d，J＝7.2Hz，2H)，7.72(d，J＝6.8Hz，2H)，7.59(d，J＝16Hz，1H)，7.51(d，J＝8.8Hz，2H)，6.82(d，J＝16Hz，1H)，6.68(d，J＝9.2Hz，2H)，5.89(s，2H)，4.30(q，J＝7.2Hz，2H)，3.45(q，J＝7.2Hz，4H)，1.33(t，J＝7.2Hz，3H)，1.23(t，J＝7.2Hz，6H)；13CNMR(图49)(CDCl3)：δ166.53，155.02，150.39，144.65，143.74，131，30，121.66，115.73，111.57，77.23，63.10，59.43，44.69，14.08，12.63；MALDI-TOF MS：针对[N+]计算：339.2067，发现：339.2046(图50)；
5：产率：67％；1HNMR(图51)(MeOD)：δ-8.33(d，J＝6.8Hz，2H)，7.82(d，J＝6.8Hz，2H)，7.70(d，J＝16Hz，1H)，7.49(d，J＝9.2Hz，2H)，6.95(d，J＝16.4Hz，1H)，6.66(d，J＝9.2Hz，2H)，4.88(s，2H)，3.38(q，J＝7.2Hz，4H)，1.11(t，J＝7.2Hz，6H)；13CNMR(图52)(MeOD)：δ154.03，150.04，143.89，142.70，130.51，127.22，122.10，121.50，115.91，111.25，61.73，44.11，11.54；MALDI-TOF MS：针对[M+]计算：311.1754，发现：311.1662(图53)；
L2P2：MALDI-TOF MS：针对[M+]计算：997.5004，发现：998.5093；
L2P3：MALDI-TOF MS：针对[M+]计算：1924.0，发现：1925.0；
L2P4：MALDI-TOF MS：针对[M+]计算：1924.0，发现：1926.308。
HPLC纯化：使用通过高效液相色谱法(HPLC)纯化后的所有肽缀合物。在制备柱(C18，10.0x 250mm，5μm粒度)上或在LCT Premier XE质谱仪上使用BEH分析柱(C18，2.1x50mm，1.7μm粒度)进行HPLC。将肽/探针在H2O/MeCN+0.1％TFA中洗脱。用于纯化的梯度洗脱在60分钟内为0-55％B，并且在30分钟内设定为0-100％B，用于分析。质谱法在TQD质谱仪(Waters Ltd，UK)上进行。通过使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质进行以正离子模式操作的MALDI-TOF质谱分析(Autoflex II ToF/ToF质谱仪Bruker Daltonik GmBH)也证实了肽/肽缀合物的身份。
以L2P4为例来显示详细的纯化方法。在制备型HPLC之前，制备L2P4粗品的MALDI-TOF谱(图10B)。它显示了L2P4和P4两者的身份，而对应于P4的m/z峰甚至比L2P4更强。然后，称取L2P4粗品以制备5mg/mL水溶液，从而进行制备型HPLC(图10C)。
表1.用于制备型HPLC的溶剂梯度
收集在制备型HPLC中出现的所有峰，并将其送去进行MALDI-TOF分析。收集对应于L2P4的保留时间范围并准备用于分析型HPLC。可以再多安排一个制备型和分析型HPLC，直到获得具有单峰的纯分析型HPLC谱(图11A-11B)。并且，发明人还进行了L2P4的LCMS(图12A-12B)和精确质量(图13A-13B)分析。以类似方式纯化L2P2和L2P3，并将其纯化的HPLC显示在图14A-14B中。
表2.用于分析型HPLC的溶剂梯度
2)MD模拟
EBNA1的DNA结合结构域(DBD结构域)的X射线晶体结构是α/β混合折叠，其包含被几个环分开的四个α螺旋和五个β片层(图15A-15B)。每个结构基序都有其自身的功能，五个β片层通过疏水包装驱动二聚化，α螺旋1-2通过静电相互作用与DNA相互作用，带正电荷的环1参与DNA结合。本发明的肽缀合物占据EBNA1 DBD结构域的二聚化界面。为了研究探针和EBNA1之间的相互作用，在AMBER 14中进行200ns MD模拟。
探针-EBNA1复合体的初始结构建立：在MOE软件中构建7种复合体的初始结构。通过使链B中除残基561-565(YFMVF)之外的所有残基缺失，由EBNA1二聚体获得P2-EBNA1复合体结构。将所得截短的肽的N-末端乙酰化，并将C-末端酰胺化，以产生上述复合体结构。基于P2-EBNA1结构，通过将L2添加到N-末端，建立L2P2-EBNA1的初始结构。通过将RrRKGG-序列附加到P2中来修饰P2-EBNA1结构，也获得P3-EBNA1结构。以类似的方式获得剩余复合体的结构。
用于非标准残基的力场参数的修改：在模拟系统中仍然含有几个非标准残基，例如L2和连接体(LIN)，应当在MD模拟之前对它们进行参数化。将L2-NME的推定结构(图18A)上传到R.E.D.开发服务器，以通过将NME的全部电荷限制为零来计算L2部分的RESP部分电荷。通过与PARM99或GAFF力场中的类似原子进行比较，来定义缺失的力场参数(表3)。类似地获得LIN的推定结构和AMBER原子类型(图18B)，没有发现缺失的力场参数。
MD模拟：使用ff99SBildn力场，在Amber 14中对所有系统进行无偏200ns MD模拟。该系统通过Amber工具14中的LEaP模块溶剂化到周期性边界的立方体TIP3显式水箱(explicit water box)中，缓冲距离为通过添加抗衡离子中和整个系统电荷。使建立的系统最小化并平衡。对于每次模拟，使肽在具有TIP322水分子的周期性截短的立方体箱中溶剂化，从而在肽表面和周期性箱边缘之间提供的缓冲距离。然后将肽在20ps中从100K加热至300K。在生产运行之前，在系统的恒定压力和温度(NPT)下进行200ps的平衡，以确保正确的密度。使用SHAKE约束重氢(hydrogen-heavy)原子键，以2fs时间步长，在恒定体积和能量(NVE)下进行生产运行。
RMSD和RMSF计算：通过cpp轨迹(trajectory)分析生产阶段中的所有轨迹。EBNA1的残基16-144用于结构比对，但对于RMSD计算则排除柔性N-末端和C-末端环。对于生产阶段期间的所有快照(snapshot)，获得关于开始和结束的CαRMSD。以5ns的时间窗计算每个残基的CαRMSF。通过使用默认设置，其中距离由CαRMSD定义，生成七个聚簇肽/肽缀合物-EBNA1。
结合自由能计算：通过分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积(MMPBSA)计算所有肽/肽缀合物与EBNA1的结合自由能。调整时间间隔以确保计算中包含至少100帧(frame)。对于广义Born(GB)计算，使用mbondi2，并将盐浓度设置为0.1M。将离子强度设置为0.1mM，并且将来自参数/拓扑(Parameter/topology，prmtop)文档的半径(半径)用于泊松玻尔兹曼(PB)计算。
表3.L2的修改的力场参数
表4.通过MMPBSA由200ns MD模拟计算的结合自由能
3)光物理测量
通过HP UV-8453光谱仪记录200-800nm光谱范围内的UV-可见吸收光谱。使用Fluorolog-3组合荧光寿命(Fluorolog-3 Combined Fluorescence Lifetime)和稳态分光荧光计(Steady state spectrofluorometer)记录发射光谱。它配备了NL-C2 PulsedDiode Controller NanoLED，其是从紫外线到NIR的宽泛范围波长的经济高效的皮秒和纳秒光脉冲源。
L2P2、L2P3和L2P4的稳定性测试：在37℃通过发射光谱评估L2P2、L2P3和L2P4的稳定性24小时，这是由于大多数体外试验(例如流式细胞术、共聚焦成像和共染色和毒性测试)都在24小时内孵育之前进行(图26A-26C)。
L2P2、L2P3和L2P4的发射量子产率：通过使用水中的罗丹明6G(φ＝95％)的比较方法，以480nm处的激发作为参考，在具有和不具有WT(野生型)EBNA1的情况下，测量L2P2、L2P3和L2P4的量子产率。L2Pn的量子产率通过以下方程式1评估：
在下标r和s分别表示参考和样品的情况下，φ是量子产率，G是绘制积分发射强度(integrated emission intensity)对吸光度的斜率，并且η是溶剂的折射率。通过比较标准罗丹明6G的实验记录光谱与公布的数据获得修正曲线。
在WT EBNA1存在下，可以实现L2P3和L2P4量子产率的增强。与L2P3相比，在EBNA1浓度较小的情况下，L2P4表现出更强的增强(φ最初＝4％，φ5μMEBNA1＝23％，图27A-27H和图28A-28C)，这说明L2P4和WT EBNA1之间的结合亲和力更强。
经由发光滴定的结合常数：通过逐渐添加WT EBNA1进行发光滴定分析，以评估三种肽缀合物与WT EBNA1之间的结合常数。当添加的阴离子的量是肽缀合物溶液的5％或者对发光的影响饱和时，停止添加WT EBNA1。根据双对数回归曲线获得Ka的结合常数：
lg[(I-I0)/I0]＝lg Ka+n lg[G] 方程式2
其中I和I0分别是当前荧光和初始荧光，Ka是结合常数，n是每个WT EBNA1的结合位点数，[G]是WT EBNA1的总浓度。
经由发光滴定的选择性测试：准备滴定实验，以研究几种常见生物阴离子和牛血清白蛋白(BSA)对L2P3和L2P4的作用(未测量L2P2对不同生物阴离子和蛋白质的选择性，这是因为对WT EBNA1的滴定没有显示出任何增强，证明L2P2与WT EBNA1之间的结合极其微弱甚至没有结合)。将每种阴离子的液体浓缩储备溶液以及BSA单独并逐渐添加到涉及探针的溶液中。当添加的阴离子的量是肽缀合物溶液的5％或者对探针发光的影响饱和时，停止添加。通过上述程序测定发光发射光谱。
在不同溶剂中的吸收光谱：测量了L2P4在极性和非极性溶剂中的吸收光谱，以进一步研究分子间电荷转移(ICT)态。从光谱中可以看出，在274nm和约500nm处出现两个吸收带，分别对应于从基态到局部激发(LE)态和ICT态的转变，如在相似分子中所赋值的那样。在极性溶剂中最大吸收带略微红移。这种现象表明，由于从-N(Et)2基团向通过苯环连接的受体的π*系统提供电子，ICT态比基态更具极性，这与ICT特性一致。
pH依赖性发射：还测量了不同pH中的L2P4的发射，以进一步证实ICT态的存在。图33A-33D显示了pH对PBS缓冲液中L2P4和L2P3发射光谱的作用。随着pH从7变为2，614nm处的发射带逐渐减小，这一观察结果与ICT发射的特征非常一致，因为氮电子孤对与H+结合，因此无法产生ICT态，因此ICT态发射降低。同时，通过Henderson-Hosslbalch方程式计算pKa值：
在不同溶剂中的寿命衰变：通过使用460光谱LED光源(HKBU，化学系)，在具有NanoLED的Fluorolog-3分光荧光计上测定极性和非极性溶剂中L2P4的发射寿命衰变(在625nm处监测)(图34)。发射衰变显示了表5中记录的两种组成部分。可以得出在极性较小的溶剂中LE发射衰变相对较大而ICT衰变相应较小的结论，这可以解释为在极性小的溶剂中ICT态的偶极矩较小，因此ICT态上移。
表5.L2P4在不同溶剂中的发射寿命
4)体外成像、组织培养和MTT测定
蛋白样品制备：使用五种蛋白样品。在大肠杆菌中表达与谷胱甘肽S-转移酶融合的野生型EBNA1蛋白(379-641a.a.)并通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B漂洗(GE HealthcareDharmacon)纯化，然后制备5μg EBNA1，并将其与MBS在37℃一起孵育10分钟。在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白，将其转移到硝酸纤维素膜上，并通过抗体印迹(blot)。通过Gel-ProAnalyzer(Gel-Pro分析仪)测量蛋白带的强度，并通过GraphPad Prism 5.0软件绘图。通过定点诱变将YFMVF突变为FFAVA(产生EBNA1-3A突变体)或将Y561、M563、F565保守点突变为A(产生EBNA1-Y561A、EBNA1-M563A和EBNA1-F565A)来制备EBNA1突变蛋白。
EBNA1蛋白和体外MBS交联剂介导的二聚化测定：对于MBS(3-马来酰亚胺基苯甲酰基N-羟基琥珀酰亚胺)交联二聚化测定，将5μg WTEBNA1和突变EBNA1与MBS在37℃孵育10分钟。然后将其在SDS-PAGE凝胶上分离，转移到硝酸纤维素膜上并通过抗体进行印迹。使用GraphPad Prism 5.0软件测量蛋白印迹带的强度。将MBS介导的蛋白交联作用表示为二聚体/单体之比。
细胞培养：于37℃和5％CO2下，使MRC-5(正常肺成纤维细胞)细胞在极限必需培养基(MEM)中生长；使HeLa(宫颈癌)细胞在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中生长；使CNE2细胞、Ramos细胞、C666-1细胞和Raji(鼻咽癌)细胞在Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)-1640培养基中生长，所用的所有培养基均补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素和链霉素。
Npc 43细胞是从患有III期复发性NPC的64岁男性患者的手术切除的NPV组织建立的。Npc 43细胞携带EBV病毒，将其保存在补充有10％FBS和4μM Rho激酶抑制剂Y27632的RPMI中，超过200次群体倍增。当在NOD/SCID小鼠的皮下位点注射时(1000万个细胞)，Npc43是致瘤的。STR图谱分析(profiling)证实其来自NPV患者。通过用TPA/丁酸钠和从Npc 43细胞上清液收获的感染性EBV处理，诱导Npc 43细胞进行EBV的裂解再激活。
关于细胞摄取的流式细胞术分析：将HeLa细胞和C666-1细胞(每个样品105)接种到35m培养皿中过夜。然后，将细胞与肽缀合物一起孵育、对其进行胰蛋白酶消化并用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤数次。在氩激光产生的488nm激发下，通过流式细胞术评估细胞摄取。通过使用配备有650nm长通滤器的FL-3获得发射。分析10000次事件以获得细胞摄取。
体外成像和共染色：为了研究L2Pn的体外行为和位置，将10μM L2Pn给予具有2mL组织培养基的C666-1细胞(70％-80％充满)中。在监测成像之前将细胞孵育6小时。在共染色实验中，将其用1nM细胞核溶酶体示踪剂/线粒体示踪剂/Hoechst 33342进一步处理1小时。使用商用多光子Leica TCS SP5(直立结构)共聚焦显微镜进行成像，该显微镜配备有相干飞秒(coherent femto-second)激光器(680nm至1050nm)、氩激光器(432nm、457nm和488nm)、He-Ne激光器(632nm)、紫外灯和受控的CO2含量阶段-顶部组织培养室(stage-toptissue culture chamber)(2-7％CO2，37℃)。
毒性测试：根据标准方法进行MTT活力(viability)测定。简而言之，在暴露于肽缀合物之前24小时，将3×103细胞接种在96孔板中。用肽缀合物在暗处处理细胞另外24小时。用磷酸缓冲盐水(PBS)漂洗细胞单层，然后将其与50μL MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物]溶液(0.5mg/mL)于37℃孵育3小时。然后除去培养基，添加100μLDMSO增溶剂并震荡30分钟，使形成的甲晶体溶解在活细胞中。在Labsystem Multiskan酶标仪(Merck Eurolab，Switzerland)上，在双波长540nm和690nm下测量吸光度。对于MTT测定，每个剂量浓度在孔中进行，一式三份，并重复两次。图39A-39F显示了P2、P3和P4的MTT细胞毒性。
5)动物研究
裸鼠体内肿瘤注射：将悬浮在110μL无血清Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培养基1640中的C666-1细胞(8×106)与Matrigel按1∶1混合至最终体积为150μl，并将其注射到6-8周龄雄性BALB/c裸鼠的右侧腹中。接种后18天，当肿瘤生长至平均体积为200-300mm3时，将小鼠随机分成实验组(每组n＝3或4)。将P4和L2P4在0.1％DMSO中稀释至所需浓度(2μg、P4-L和L2P4-L；4μg，P4-H和L2P4-H)，并使用29号注射器将其直接注射到肿瘤中。仅接受等体积的0.1％DMSO的小鼠用作对照。每周两次测量体重和肿瘤体积。肿瘤体积计算为(长度×宽度2)/2。肿瘤内肿瘤注射每周重复两次，持续3周，之后处死小鼠、收获其内部器官和肿瘤并称重。
表6.用于动物研究的药物治疗和小鼠数量
通过正电子发射计算机断层扫描成像，靶向EBNA1病毒蛋白作为EBV相关肿瘤的治疗途径
在本发明的另一个实施方案中，提出了使用作为L2P4的来自相同L2结构家族组的核透过性小分子抑制剂，通过正电子发射计算机断层扫描成像，用于EBV相关肿瘤的治疗方法。图58的图示阐释了相同L2结构家族的不同配体合成如何导致用于PET成像的L2P4和L2。
受到关注的成像技术是正电子发射计算机断层扫描(PET)，其中引入了放射性元素以产生参与生理过程的小分子的类似物作为示踪剂。临床使用的示踪剂是18F-氟脱氧葡萄糖(FDG)，其是高度参与肿瘤发展的葡萄糖类似物。然而，正常组织对FDG的摄取产生限制敏感性的干扰。必须显著提高选择性。
本发明的该实施方案提供用于EBV相关癌症的双模态成像技术(光学和PET)。多项研究表明EBNA1与EBV相关恶性肿瘤的肿瘤发生之间的关联，使EBNA1在各种过程中的作用可视化并设计合适的抑制剂将是有益的。在文献中，为了提高针对EBV疾病的T细胞定向疗法的功效，治疗部位必须在细胞质中。在该疗法中使用的成像剂应设计成1)特异性地定位于细胞质中以实现最大的治疗功效，和2)使细胞质可视化以便可以监测治疗进展。另一方面，一些研究表明EBNA1在细胞分裂过程中至关重要，并且负责激活III型潜伏状态细胞中其他病毒转化蛋白(viral transforming protein)的转录。然后，需要将专注于该方法的成像剂可选地设计成核透过性的，从而具有成像利益。在产生核透过性分子的过程中，挑战是普遍的，更不用说核透过性荧光化合物。因此，本发明进一步提供了对EBNA1具有特异性同时又显示细胞定位的成像剂。
本发明人已经设计并合成了缀合到用于光学成像的小分子上的功能性选择性肽，并且还应用镓标记以产生更适于细胞核成像的双模态探针。还研究了对EBNA1的选择性和结合亲和力以及癌症抑制方面的领域，用于进行改善。本发明人最近在以高效剂量(＜4mol/kg，约92％癌症抑制)干扰EBV相关癌症生长方面取得了重大突破，并且在以本发明的实施方案为生物探针的情况下，可以在细胞核中使EBNA1可视化。
意义
本发明人已选择将我们的双模态探针致力于进行体外和体内PET和光学成像。本发明人制备并引入了各种肽以优化针对EBNA1的靶特异性，用于可行的临床应用，所述肽目前在临床实践中是不可获得的。本发明人还研究了特异性抑制EBNA1二聚化的基本机制，所述EBNA1二聚化被认为在肿瘤发生中是至关重要的。这种协作的结果提供了关于体外和体内靶向和监测EBV相关癌症并控制EBV潜伏感染肿瘤(例如鼻咽癌)的生长的深度原理证明研究。
EBNA1特异性PET成像剂的设计和合成，以及EBNA1与提出的冷标记试剂(coldlabelling agent)之间的结合机制研究
EBNA1特异性PET(冷标记)可用成像剂的合成
与商业或文献可获得的PET试剂有关的两个主要问题是(i)癌细胞的识别和(ii)射电金属(radiometal)与配体之间的配位时间。对于快速放射性标记，本发明人最近通过新的快速微波方法报道了Ga卟啉-钌配合物以及高产率(约60％)的放射性标记。在本发明的一个实施方案中，本发明人已经产生了许多EBNA1特异性双功能探针，以进行PET成像以及EBNA1功能抑制，其然后可以应用于EBV相关疾病治疗中。已经合成了与EBNA1特异性肽连接的二十种冷镓标记复合体。本发明人的公开物显示，与EBNA1特异性肽缀合的新型镧系元素复合体显示了EBNA1的体外选择性成像，然而，亚细胞定位(仅细胞质)限制了其治疗价值。EBNA1主要定位于细胞核中。本发明人先前已经鉴定了核透过性-EBNA1透过性肽，并成功合成了与特定PET可用配体缀合的肽(图59)。这在EBNA1抑制性功能的研究中取得了很大进展。在改善其细胞透过性和有效监测其治疗效果方面，可以为商业或最近研究的抗癌剂带来显著改变。还应用了一系列用于EBNA1特异性结合的新设计的肽。图60显示了其中合成MRI成像配体的本发明的一些其他实施方案。图61显示了其中还合成用于PET成像的配体的本发明的实施方案。
通过等温滴定量热和蛋白质NMR评估结合亲和力
经由等温滴定量热法(ITC)，通过复合体与EBNA1的结合亲和力检测了复合体与EBNA1的结合和选择性。ITC是测量溶液中相互作用，尤其是大分子蛋白质与其配体的相互作用，的标准。它提供了分子-分子相互作用的实时和准确的溶液观察，具有以下优点：无标记、没有分子量/类型限制，并且最重要的是非破坏性的。
提出的冷镓复合体的体内生物分布评估
将所有提出的复合体静脉内注射到携带异种移植肿瘤(EBV阳性或阴性肿瘤)的BALB/c无胸腺小鼠中。通过ICP-MS测定反映复合体的量的镓含量。评估小鼠尿液中的镓含量以确认这些复合体的体内代谢。此外，还监测所提出的冷镓复合体的体内发射。通过具有457/800/980nm激发源的体内成像盒进行小鼠的全身体内成像，并且通过外科手术提取异种移植物，用于双光子共聚焦显微术检查，其中提取的瘤周细胞为对照。体内光学成像在PI的研究所进行。选择五种镓复合体，并进行体内微PET成像。
各种小鼠模型(9个月)中的体内PET成像。选择五种镓复合体并进行复合体的放射性标记。通过使用全自动模块化实验室系统中的Eckert&Ziegler IGG10068Ge/68Ga-Generator(发生器)产生68GaCl3。如同通过冷复合体进行的体内研究，将热复合体静脉内注射到携带EBV阳性或EBV阴性肿瘤的BALB/c无胸腺小鼠中。这些结果与PET成像相关。此外，在EBV阳性和EBV阴性细胞系中监测放射性标记的镓复合体与EBNA1的体外成像，并将结果与获得的数据进行比较。
全自动模块化实验室系统中的68Ge/68Ga-Generator。如同通过冷复合体进行的体内研究，将热复合体静脉内注射到携带EBV阳性或EBV阴性肿瘤的BALB/c无胸腺小鼠中。获得的结果与PET成像相关。此外，在EBV阳性和EBV阴性细胞系中监测放射性标记的镓复合体与EBNA1的体外成像，并将结果与获得的数据进行比较。
第1阶段(9个月)中复合体的生物学和药代动力学研究
通过流式细胞术和共聚焦显微术评估合成的探针在EBV阳性和阴性NPC细胞中的细胞毒性和亚细胞定位。肿瘤球形成测定用于评估合成的探针的抗肿瘤活性。用我们在1.1节中提出的不同浓度的复合体处理EBV阳性细胞系(例如C666-1、MKN28、LCL(GT)-B细胞、LCL(GS)-B细胞)和EBV阴性细胞系(例如MKN1、Akata B细胞、Awaia B细胞和HeLa)。测定在每种培养物中形成的肿瘤球的尺寸/数量。结果表示为每次治疗的肿瘤球的尺寸分布曲线和总数。通过流式细胞术监测细胞毒性，并使用共聚焦显微术确定探针的亚细胞定位。评估所提出的冷镓复合体在EBV阳性/阴性细胞系中的IC50值。
药代动力学研究。在小鼠中进行基于镓的EBNA1标记试剂的血浆和尿液药代动力学研究。在PI和NKM实验室中进行药代动力学测定。在腹膜内(i.p.)注射单剂量的镓标记试剂(Regan-Shaw，FASEBJ 2008)之前使动物禁食过夜。将小鼠单独圈养在代谢笼中，并且在时间0(作为空白)和药物治疗后每24小时从每组8只小鼠收集尿液和血液样品，直至信号消失。过滤尿液样品并储存在-80℃直至分析。收集来自尾静脉的血液样品。将离心后收集的血浆样品储存在-80℃直至分析。使用镓化合物的ICP-MS分析样品。使用药代动力学分析软件，通过非房室方法确定基于镓的标记试剂的药代动力学参数。
Claims (12)
1.一种核透过性小分子抑制剂，其包含通过酰胺键与含有CAhxYFMVFGGRrRK(SEQ IDNO.3)的氨基酸序列偶联的4-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-N-羧甲基吡啶鎓氯化物。
2.根据权利要求1所述的核透过性小分子抑制剂，其中所述抑制剂靶向EB病毒的EBNA1的二聚化界面。
3.根据权利要求2所述的核透过性小分子抑制剂，其中所述抑制剂在EB病毒的细胞核内具有清晰的亚细胞定位，并且在与野生型EBNA1结合后具有超过8.8倍的响应性发射增强。
4.根据权利要求2所述的核透过性小分子抑制剂，其中所述抑制剂对EB病毒感染的肿瘤细胞是选择性的并且显示出细胞毒性。
5.根据权利要求1所述的核透过性小分子抑制剂，其具有式(I)：
6.一种使EB病毒感染的细胞成像的方法，所述方法包括：
将根据权利要求1所述的核透过性小分子抑制剂引入EB病毒感染的细胞中，
在适当的吸收带辐射所述EB病毒感染的细胞，和
使用荧光成像检测由经辐射的EB病毒感染的细胞所产生的发射带。
7.根据权利要求6所述的方法，其中用核透过性小分子抑制剂诱导的所述EB病毒感染的细胞的适当吸收带在274nm和约500nm处。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述荧光成像检测在560nm和约625nm处所产生的发射带。
9.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括：
将根据权利要求1所述的核透过性小分子抑制剂施用于需要所述癌症治疗的受试者，其中所述癌症的细胞被EB病毒感染。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症是EB病毒阳性癌症，其选自由以下各项组成的组：B细胞来源的淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述核透过性小分子抑制剂通过肿瘤内注射被施用。
12.一种合成根据权利要求1所述的核透过性小分子抑制剂的方法，所述方法包括：
其中：
a)使化合物1(4-甲基吡啶)和化合物2(4-二乙氨基苯甲醛)在存在分散于矿物油中的NaH和二甲基甲酰胺(DMF)情况下于约60℃反应，产生化合物3(N，N’-二乙基-4-(2-(吡啶-4-基)乙烯基)苯胺)；
b)使化合物3与溴乙酸乙酯在存在乙腈(MeCN)的情况下于约85℃反应，以获得化合物4(4-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)吡啶-1-鎓)溴化物；
c)用0.4M NaOH在存在二噁烷的情况下于室温水解化合物4，以获得化合物5(4-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-N-羧甲基吡啶鎓氯化物)；
d)将化合物5与P4-树脂在存在二异丙基乙胺(DIPEA)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷磷(PyBOP)以及DMF的情况下于室温偶联，以获得化合物6；
e)在存在三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(Tis)和水的情况下于室温裂解化合物6的树脂，以获得化合物，并通过高效液相色谱法纯化化合物7，以获得根据权利要求1所述的核透过性小分子抑制剂。
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