CN111118159B - 一种标志物基因snord16基因及其应用 - Google Patents

一种标志物基因snord16基因及其应用 Download PDF

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Abstract

SNORD16基因在制备结肠癌检测试剂盒中的应用及相关试剂盒，属于生物技术领域。为了挖掘识别高危患者的预后生物标志物，探究结肠癌发病机理的新分子机制，本发明提供了SNORD16基因在制备结肠癌检测试剂盒中的应用，所述SNORD16基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述试剂盒用于结肠癌诊断和/或预后评估；与正常癌旁组织相比，所述SNORD16基因在结肠癌细胞或组织中高表达。本发明还提供了相关的检测试剂盒。体外功能实验表明，SNORD16可以通过抑制细胞凋亡来促进结肠癌细胞的生长，增殖，迁移和侵袭，表明SNORD16在结肠癌中具有致癌作用，也可作为结肠癌的新型诊断和预后生物标志物。

Description

一种标志物基因SNORD16基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种标志物基因SNORD16基因及其应用。
背景技术
结肠癌被认为是男性和女性中最常见和致命的恶性肿瘤之一。它的广泛存在需要新型诊断和预后生物标志物。
由于癌症的预防、早期诊断和治疗水平的改善，过去几十年来，与结肠癌相关的死亡率明显下降，但仍有改善结肠癌患者总体预后的空间。为此，迫切需要探索新的可以识别高危患者的预后生物标志物以及结肠癌发病机理的新分子机制。新兴证据表明，核仁小RNA（snoRNA）在肿瘤发展中起关键作用。
非编码RNA，尤其是microRNA和长链非编码RNA，已被公认为是各种疾病，尤其是肿瘤发生发展中重要调控的分子。而另一种非编码RNA，核仁小RNA（snoRNA）的最新研究表明，它们可以在各种疾病中充当新型调控RNA，并引起了人们的广泛关注。SnoRNA的长度为60至300个核苷酸，主要存在于核仁中，主要用作核糖体RNA转录后修饰的指导RNA，并根据修饰类型分为两大类（C/D box snoRNA和H/ACA box snoRNA）。越来越多的证据表明，snoRNA在各种疾病，尤其是癌症的发生和发展中也起着至关重要的作用。
发明内容
为了挖掘识别高危患者的预后生物标志物，探究结肠癌发病机理的新分子机制，本发明对SNORD16作为原癌基因以及结肠癌预后的生物标志物进行了相关研究，具体技术方案如下：
第一、本发明提供了SNORD16基因在制备结肠癌检测试剂盒中的应用，所述SNORD16基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地限定，所述试剂盒用于结肠癌诊断和/或预后评估；与正常癌旁组织相比，所述SNORD16基因在结肠癌细胞或组织中高表达。
第二、本发明提供了扩增所述SNORD16基因的引物在制备结肠癌检测试剂盒中的应用。
进一步地限定，所述试剂盒用于结肠癌诊断和/或预后评估；与正常癌旁组织相比，所述SNORD16基因在结肠癌细胞或组织中高表达。
进一步地限定，扩增所述SNORD16基因的引物序列为：
正向：5'-TGCAATGATGTCGTAATTTGCGTC-3'；
反向：5'-TTGCTCAGTAAGAATTTTCGTCAA-3'。
第三、本发明还提供了一种结肠癌诊断试剂盒，所述试剂盒包括SNORD16基因或上述扩增SNORD16基因的引物。
第四、本发明还提供了一种结肠癌预后评估试剂盒，所述试剂盒包括SNORD16基因或上述扩增SNORD16基因的引物。
有益效果
本发明研究了SNORD16在结肠癌中的表达谱和功能。证明了SNORD16而非其宿主基因（RPL4）在结肠癌细胞系中上调。与匹配的相邻正常组织相比，结肠癌组织显示出更高的SNORD16表达水平，并且在SNORD16和RPL4之间未发现相关性。SNORD16表达水平高的患者预后较差，多因素分析表明SNORD16高表达是结肠癌的独立预后因素，该基因的表达与结肠癌患者的5年总生存率呈负相关。体外功能实验表明，SNORD16可以通过抑制细胞凋亡来促进结肠癌细胞的生长，增殖，迁移和侵袭。以上结果表明，SNORD16在结肠癌中具有致癌作用，也可作为结肠癌的新型诊断和预后生物标志物。
附图说明
图1 SNORD16在结肠癌细胞系，癌组织中的表达情况；其中（A）通过qRT-PCR与正常结肠上皮细胞系（FHC）相比，结肠癌细胞系（HCT116，SW620和HT29）中SNORD16表达水平；（B，C）与匹配的相邻正常黏膜组织相比，SNORD16在结肠癌中过表达水平（分别为p<0.001和<0.05，Wilcoxon秩相关检验和Mann-Whitney U检验）；（D）ROC曲线分析；（E）SNORD16不同表达水平患者生存率（p<0.001）。
图2 SNORD16与RPL4（SNORD16宿主基因）在结肠癌中的表达分析；（A）通过qRT-PCR与正常结肠上皮细胞（FHC）相比，结肠癌细胞系（HCT116，SW620和HT29）中RPL4的表达水平；（B，C）结肠癌与匹配的相邻正常粘膜组织之间的RPL4表达水平（分别为p＞0.05，Wilcoxon秩相关检验和Mann-Whitney U检验）；（D）SNORD16和RPL4表达Spearman相关性分析（p=0.86）；（E-G）RPL4在转录及转录后的表达水平与SNORD16上调或下调的影响。
图3 SNORD16过表达对结肠癌细胞的影响；（A）转染LV-NC（包裹了阴性对照的病毒）和LV-SNORD16（包裹了目的基因的病毒）后，HCT116和SW620细胞中SNORD16表达水平；（B，C）SNORD16过表达对HCT116和SW620细胞的增殖能力的影响；（D）HCT116和SW620中SNORD16的过表达对细胞克隆形成能力的影响；（E）SNORD16的过表达对HCT116细胞的迁移和侵袭能力的影响；（F）SNORD16的过表达对H2O2（400μM处理5h）的HCT116和SW620细胞的凋亡的影响；*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
图4 敲低SNORD16对结肠癌细胞的影响；（A）siNC（阴性对照），siRNA-1和siRNA-2转染后，SNORD16在HCT116和SW620细胞中的敲低情况；（B，C）CCK-8分析表明，敲低SNORD16对HCT116和SW620细胞的细胞增殖能力的影响；（D）敲低SNORD16对HCT116和SW620细胞克隆形成能力的影响；（E）敲低SNORD16后HCT116细胞的迁移和侵袭能力的变化；（F）敲低SNORD16后，HCT116和SW620细胞的细胞凋亡情况。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
图5 20例结肠癌临床样本中RPL4的表达情况；（A）ROC曲线分析；（B）RPL4表达与SNORD16表达关系。
具体实施方式
实施例1. SNORD16基因与结肠癌病理参数相关性的研究。
一、病人及组织标本
本研究分析了来自癌症基因组图谱（TCGA）数据库的434位结肠癌患者。在评估SNORD16表达与临床病理参数之间的关系时，将临床数据不完整的患者排除在研究之外，总共279例。完整的临床信息包括：患者的性别，年龄，TNM分期，病理性T分期，淋巴结转移，远处转移，淋巴管浸润，静脉浸润以及结肠息肉病史。此外，从中国医科大学附属肿瘤医院结直肠外科获得了20对匹配的结肠癌及邻近的正常黏膜组织，用于评估SNORD16的表达。伦理委员会批准了标本的使用，并征得了每个患者的知情同意。
二、RNA分离和实时定量PCR
将1 ml TRIzol试剂（Ambion,USA）添加到组织样品中，然后使用TissueLyser LT（GIAGEN,Germany）将其研磨，并根据制造商的说明提取组织样品或培养细胞的总RNA。按照说明书流程，使用PrimeSript RT试剂盒（Takara,Japan）进行逆转录。使用iTaq UniversalSYBR Green Supermix（Bio-Rad,USA）进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR），以测量mRNA或snoRNA的表达水平。2−∆∆Ct方法用于计算目的基因的相对表达。使用的引物序列如下：
SNORD16正向引物：5'-TGCAATGATGTCGTAATTTGCGTC-3'；反向引物：5'-TTGCTCAGTAAGAATTTTCGTCAA-3'）；
U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'
RPL4正向引物：5'-CTGCAGGGCCTCTTAACACA-3'；反向引物：5'-GTGCCACCAAGTGGCTATCT-3'；
GAPDH正向引物：5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'；反向引物：5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。
三、细胞培养
HCT116，SW620和HT29细胞系购自上海吉凯公司，FHC细胞系获自美国典型培养物保藏中心（ATCC,USA）。将HCT116和SW620在RPMI-1640培养基（HyClone，USA）中培养。HT29在DMEM/HIGH GLUCOSE（HyClone，USA）中培养。FHC在DMEM：F-12（ATCC,USA）中培养。在培养基中添加了10％的胎牛血清（Gibco，USA）。所有细胞均在37°C的含5％CO2的潮湿环境中孵育。
四、SNORD16的敲低与过表达
为了敲除SNORD16，上海吉玛公司设计并合成了两个靶向SNORD16的特异性小干扰RNA（siRNA）。siRNA的瞬时转染是按照制说明书，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）进行的。表达载体GV235（上海吉凯公司）用于SNORD16过表达，慢病毒LV-SNORD16也由上海吉凯公司构建。根据说明书，使用HiTransG P进行瞬时慢病毒转导。使用qRT-PCR验证敲低和过表达效率。
所使用的SNORD16-siRNA的序列如下：SNORD16-siRNA-1（正向引物：5'-AGTTGCCTGCTGTCAGTAATT-3'；反向引物：5'-TTACTGACAGCAGGCAACTTT-3'）和SNORD16-siRNA-2（正向引物：5' -GCTGGTACAGAAGGTTGACTT-3'；反向引物：5'-GTCAACCTTCTGTACCAGCTT -3'）。
五、细胞增殖与克隆形成实验
使用CCK-8（Dojindo, Japan）和克隆形成来检测SNORD16敲低或过表达的细胞的增殖能力。对于CCK-8分析，将1000个转染的细胞接种在96孔板的每个孔中，并使用酶标仪（Sunrise，Switzerland）每24小时在450 nm下，测量光密度（OD）值。该测定的每组包含5个重复。为了进行菌落形成测定，将500个转染的细胞接种到6孔板的孔中，并培养12天，每4天更换一次培养基。所有细胞克隆用甲醇固定1小时，并在室温下用吉姆萨染色3小时。该实验重复三次。
六、细胞侵袭与迁移实验
为了进行细胞迁移分析，将转染的细胞（用于siRNA转染的细胞为2×105细胞，用于慢病毒转导的细胞为1×105）接种到Transwell单元（Corning Costar，USA）的上室中，并加入100μl无血清培养基，下室充满600ul培养基，并添加20％FBS。48小时后，将上面的细胞洗掉，并将粘附在下面的细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，用600μl0.1％结晶紫染色2小时，然后用显微镜成像（Axio Observer A1，上海卡尔蔡司有限公司）。对于细胞侵袭测定，采用与迁移测定相同的步骤，但首先用50ul稀释的Matrigel（BD Biosciences，美国，稀释度1：8）预涂Transwell单元。所有实验独立重复三遍。
七、细胞凋亡实验
将细胞接种在24孔板中（5×104个细胞用于siRNA转染，4×104个细胞用于慢病毒转染），并在转染后48小时（siRNA）或72小时（慢病毒）收获。使用细胞凋亡检测试剂盒（Dojindo, Japan）检测细胞凋亡，并通过流式细胞术（ACEA Bio, USA）分析凋亡细胞。
八、蛋白印迹
转染后48（siRNA）或72（慢病毒）小时收获细胞，并用4℃ PBS洗涤两次。添加了磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液（50 mmol Tris-HCl，pH 7.5；150 mmol NaCl；0.5％脱氧胆酸钠；1％NP-40），用于裂解细胞沉淀。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的总蛋白（40μg），并转移到硝酸纤维素转移膜（Pall Corporation, USA）上，然后在室温下用5％脱脂牛奶封闭2小时。将膜与一抗在4°C下孵育12小时。使用的主要抗体包括RPL4抗体（1:1000, Santa Cruz, CA, USA）和GAPDH抗体（1:5000; Proteintech, China）。然后将膜与相应的结合了HRP的二抗在室温下孵育2小时。使用ImageQuant LAS500（GE Healthcare，GEHealthcare, Madison, WI, USA）检测抗体结合蛋白的信号强度。
九、统计分析
数据以均数±标准差表示，所有实验均重复三次以上。t检验用于分析细胞系之间的差异，转染后的表达变化以及细胞功能实验。使用SPSS软件版本24.0（SPSS，USA）或GraphPad Prism 7.0（GraphPad软，USA）进行统计分析，p值<0.05被认为具有统计学意义。
结果与分析：
一、SNORD16在结肠癌中高表达。
本发明首先通过qPT-PCR研究了人正常结肠上皮细胞（FHC）和结直肠癌细胞（HCT116，SW620和HT29）之间SNORD16表达水平的差异。当以FHC为标准时，SNORD16的表达在所有3种结直肠癌细胞系中均增加了2倍以上（图1中A）。为了进一步研究SNORD16的表达谱，使用了20对匹配的结肠癌和邻近的正常粘膜组织。如图1中B和图1中C所示，与正常粘膜组织相比，SNORD16在肿瘤组织中显著过表达，这与细胞系结果一致。此外，ROC曲线分析表明SNORD16表达可区分结肠癌和正常粘膜组织（AUC：0.70，95％CI 0.53-0.86，P = 0.033），表明SNORD16可用于结肠癌的诊断（图1中D）。这些结果表明SNORD16在结肠癌中过表达，并有可能成为诊断性生物标志物。
二、SNORD16与临床病理参数、预后之间的关联。
本发明根据SNORD16表达水平（中位数）将结肠癌患者分为两组，并评估SNORD16的表达与临床病理特征以及生存时间的关系。如表1所示，SNORD16的表达与年龄（p=0.023），淋巴管浸润（p<0.001）和结肠息肉患者病史（p<0.001）显著相关。年龄大于70岁，淋巴管浸润阳性、结肠息肉阳性的患者更有可能具有较高水平的SNORD16表达。
表1. SNORD16表达与临床病理特征之间的关系
Figure 253212DEST_PATH_IMAGE001
#SNORD16的表达情况以所有患者的中位数为界限; *p < 0.05.
使用Kaplan-Meier方法和对数秩检验来分析SNORD16高表达组和低SNORD16表达组之间的差异。结果显示，SNORD16高表达患者的总生存期较差（图1中E）（p<0.001），SNORD16高表达和低表达组的5年生存率分别为56.0％和78.4％。为了进一步研究SNORD16的预后价值，使用单因素和多因素Cox比例风险模型分析影响结肠癌患者总体生存的预后因素（表2）。正如预期的那样，在单因素分析中，年龄，TNM分期，病理性T分期，淋巴结转移，远处转移，淋巴管浸润，静脉浸润，SNORD16表达与患者的生存显著相关。但是，多因素分析表明，只有年龄，TNM分期和SNORD16表达是结肠癌患者总生存的独立预后因素。这些结果表明，在结肠癌患者中，SNORD16的上调可导致不良预后，并且SNORD16可被认为是结肠癌潜在的预后生物标志物。
表2. Cox 回归模型的总生存分析
Figure 360845DEST_PATH_IMAGE002
#SNORD16的表达情况以所有患者的中位数为界限; *p < 0.05.
三、SNORD16，而不是其宿主基因RPL4，在结肠癌中过表达。
前期推测SNORD16可能与RPL4具有功能关系，因为它位于RPL4基因的内含子上。本发明检测了RPL4 mRNA在细胞系和临床标本中的表达。结果（图2中A-C）显示，RPL4表达在癌细胞或结肠癌组织中均未上调。RPL4的表达不能用于区分结肠癌和正常的粘膜组织（图5中A），并且与20对临床标本中的SNORD16表达无关（图5中B）。使用TCGA数据库进一步验证了这些结果，发现SNORD16和RPL4表达之间没有相关性（图2中D）。此外，当SNORD16表达被上调或下调时，RPL4 mRNA和蛋白质表达水平也不受影响（图2中E-G）。这些结果表明SNORD16，而不是其宿主基因，在结肠癌中过表达，并且它不调节其宿主基因的表达。
四、SNORD16促进结肠癌细胞增殖和克隆形成。
为了研究SNORD16在结肠癌细胞中的功能，分别用慢病毒SNORD16和慢病毒对照转染了HCT116和SW620细胞。转染后72小时，收获细胞，使用qRT-PCR检测SNORD16表达。结果显示，SNORD16在HCT116和SW620细胞中均成功上调（图3中A）。CCK-8和克隆形成实验图3中B-D显示，过表达SNORD16的细胞表现出增加的细胞增殖和克隆形成能力。为了敲低HCT116和SW620细胞中SNORD16的表达，采用两个独立的靶向SNORD16的siRNA。转染后24小时，使用qRT-PCR收获细胞以检测SNORD16表达。结果表明，SNORD16在HCT116和SW620细胞中均成功下调（图4中A）。CCK-8和克隆形成实验表明，敲低SNORD16表达可显著抑制细胞生长和克隆形成（图4中B-D）。这些结果表明，SNORD16在HCT116和SW620细胞中促进增殖和克隆形成。
五、SNORD16促进结肠癌细胞侵袭与迁移。
SNORD16表达与淋巴管（p<0.001）或静脉浸润（p=0.125）之间呈正相关，促使我们研究其是否影响细胞迁移和侵袭能力。体外transwell迁移和侵袭试验显示，与对照组相比，过表达SNORD16的HCT116细胞显示出增加的迁移和侵袭性（图3中E）。相反，敲除HCT116细胞中的SNORD16可显著抑制迁移和侵袭（图4中E）。综上所述，SNORD16不仅促进细胞增殖和集落形成，而且还显著促进CC细胞迁移和侵袭，与临床数据一致。
六、敲低SNORD16诱导结肠癌细胞凋亡。
为了研究SNORD16的细胞增殖和转移功能是否与细胞凋亡相关，本发明使用细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞。图4中F所示，在HCT116和SW620细胞中SNORD16的抑制导致凋亡细胞的百分比显著增加。在结肠癌细胞中，SNORD16在H2O2处理后表现出抗凋亡作用（图3中F）。这些结果表明，SNORD16通过抑制细胞凋亡来促进增殖和转移能力。
核苷酸序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> SNORD16基因在制备结肠癌检测试剂盒中的应用及相关试剂盒
<130>
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 100
<212> DNA
<213> SNORD16基因核苷酸序列
<400> 1
tgcaatgatg tcgtaatttg cgtcttactc tgttctcagc gacagttgcc tgctgtcagt 60
aagctggtac agaaggttga cgaaaattct tactgagcaa 100
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> SNORD16基因正向引物
<400> 2
tgcaatgatg tcgtaatttg cgtc 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> SNORD16基因反向引物
<400> 3
ttgctcagta agaattttcg tcaa 24
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> U6正向引物
<400> 4
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> U6反向引物
<400> 5
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> RPL4正向引物
<400> 6
ctgcagggcc tcttaacaca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> RPL4反向引物
<400> 7
gtgccaccaa gtggctatct 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> GAPDH正向引物
<400> 8
catgagaagt atgacaacag cct 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> GAPDH反向引物
<400> 9
agtccttcca cgataccaaa gt 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> SNORD16-siRNA-1正向引物
<400> 10
agttgcctgc tgtcagtaat t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> SNORD16-siRNA-1 反向引物
<400> 11
ttactgacag caggcaactt t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> SNORD16-siRNA-2正向引物
<400> 12
gctggtacag aaggttgact t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> SNORD16-siRNA-2反向引物
<400> 13
gtcaaccttc tgtaccagct t 21

Claims (5)

1.SNORD16基因在制备结肠癌检测试剂盒中的应用，所述SNORD16基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于结肠癌诊断和/或预后评估；与正常癌旁组织相比，所述SNORD16基因在结肠癌细胞或组织中高表达。
3.扩增权利要求1中所述SNORD16基因的引物在制备结肠癌检测试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于结肠癌诊断和/或预后评估；与正常癌旁组织相比，所述SNORD16基因在结肠癌细胞或组织中高表达。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物的序列为：
正向：5'-TGCAATGATGTCGTAATTTGCGTC-3'；
反向：5'-TTGCTCAGTAAGAATTTTCGTCAA-3'。
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