CN111321226A - 用于检测或抑制LncRNA PPP1R14B-AS1的核酸的应用 - Google Patents

用于检测或抑制LncRNA PPP1R14B-AS1的核酸的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测或抑制LncRNA PPP1R14B‑AS1的核酸的应用。本发明发现LncRNA PPP1R14B‑AS1基因在肺腺癌组织中显著高表达，能够作为肺腺癌的生物标志物用于肺腺癌诊断；高表达的LncRNA PPP1R14B‑AS1基因与肺腺癌病人的不良预后密切相关，提示LncRNA PPP1R14B‑AS1基因能够作为肺腺癌的预后标志物，为肺腺癌的预后评估、治疗效果监测提供有效信息。

Description

用于检测或抑制LncRNA PPP1R14B-AS1的核酸的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种用于检测或抑制LncRNAPPP1R14B-AS1的核酸的应用。
背景技术
肺腺癌是全世界最常见、死亡率最高的恶性肿瘤之一，我国肺腺癌形势同样相当严峻，严重危害我国居民的健康。到目前为止，对肺腺癌最有效的疗法仍然是手术联合放化疗，但治疗效果非常有限，因绝大多数患者在早期无明显临床症状，在确诊时已为相对晚期，从而失去了根治性手术的机会。因此，进一步寻找肺腺癌早期诊断和治疗的生物标志物至关重要。
长链非编码RNA(LncRNA)是指长度超过200个核苷酸的非编码RNA，无蛋白编码功能，但可介导多种表观遗传调节过程而发挥其生物学作用，如染色质修饰、转录调控、转录后调控、基因印迹等，此外，其与恶性肿瘤的关系也逐渐被发现。多种LncRNA被证明参与恶性肿瘤的发生发展：LncRNA TCF7在肝癌组织和肝癌干细胞中的表达量显著上调，LncRNATCF7招募染色质SWI/SNF复合物结合到TCF7的启动子上，调控其转录，激活Wnt信号通路，从而激发肝癌干细胞的自我更新；LncRNA H19在前列腺癌及食管癌组织中高表达，介导细胞EMT细胞进程，从而促进癌细胞的转移；LncRNA HOTAIR在乳腺癌、结直肠癌、肺癌及肝细胞癌中的表达量明显上调，通过介导H3K27甲基化、上调PCDH及HOXD10等原癌基因的表达而促进相关肿瘤细胞的增殖、转移及血管生成能力。此外，LncRNA MEG3、LncRNA GAS5、LncRNALSINCT5等均与恶性肿瘤的发生发展有着不可忽视的关系。本发明的发明人研究发现LncRNA PPP1R14B-AS1在肺腺癌中显著高表达，且至今尚未见关于LncRNAPPP1R14B-AS1与恶性肿瘤关系的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供LncRNA PPP1R14B-AS1在指导肺腺癌诊断及治疗方面的应用。发明人研究发现，肺腺癌中LncRNA PPP1R14B-AS1表达较癌旁组织显著升高(P<0.001)，LncRNA PPP1R14B-AS1高表达不利于肺腺癌患者总体生存(P<0.001)，且敲低LncRNAPPP1R14B-AS1时，肺癌细胞A549的迁移受到了显著抑制。因此，LncRNA PPP1R14B-AS1可成为肺腺癌诊断及治疗指导的新生物标志物。
具体地，本发明的第一方面提供用于检测和/或抑制LncRNA PPP1R14B-AS1的核酸在制备肺腺癌诊断或预后判断试剂和/或治疗药物中的应用。
所述核酸可以为用于实时荧光定量检测LncRNA PPP1R14B-AS1表达的引物对：
正向引物：5’-TGCTACCAGGCTTGAACAG-3’(SEQ ID NO：1)；
反向引物：5’-CAGGCACAGAGGAAGACAT-3’(SEQ ID NO：2)。
所述核酸也可以为抑制LncRNA PPP1R14B-AS1基因表达的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列为以下两条序列中任一序列所示：
siRNA-1序列：
正义链5’-GCUUGAACAGUCUUCAAAUCC-3’(SEQ ID NO：3)；
反义链5’-AUUUGAAGACUGUUCAAGCCU-3’(SEQ ID NO：4)；
siRNA-2序列：
正义链5’-GCUGUAACAAAGAUUAAAUAG-3’(SEQ ID NO：5)；
反义链5’-AUUUAAUCUUUGUUACAGCCU-3’(SEQ ID NO：6)。
基于上述检测用核酸，本发明的第二方面提供一种用于肺腺癌诊断或预后判断的试剂盒，所述试剂盒含有如下引物对：
上述用于实时荧光定量检测LncRNA PPP1R14B-AS1表达的引物对；
内参基因β-Actin PCR引物对：
正向引物：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’(SEQ ID NO：7)；
反向引物：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’(SEQ ID NO：8)。
进一步地，所述试剂盒还含有用于实时荧光定量的试剂。优选地，所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种：Trizol、氯仿、无水乙醇、异丙醇、无RNA酶水、M-MLV逆转录酶、5×M-MLV缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTPs、随机引物。
基于上述治疗用核酸，本发明的第三方面提供一种LncRNA PPP1R14B-AS1基因的表达抑制剂，所述表达抑制剂为上述siRNA。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1)本发明发现LncRNA PPP1R14B-AS1基因在肺腺癌组织中显著高表达，能够作为肺腺癌的生物标志物用于肺腺癌诊断；高表达的LncRNA PPP1R14B-AS1基因与肺腺癌病人的不良预后密切相关，提示LncRNA PPP1R14B-AS1基因能够作为肺腺癌的预后标志物，为肺腺癌的预后评估、治疗效果监测提供有效信息。
2)本发明提供了LncRNA PPP1R14B-AS1基因的表达抑制剂siRNA，在用于LncRNAPPP1R14B-AS1基因的表达抑制时，干扰效果好，具有临床基因治疗的应用潜力。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出了TCGA高通量数据分析肺腺癌中LncRNA PPP1R14B-AS1的表达。肺腺癌组织中LncRNA PPP1R14B-AS1的表达量显著高于正常组织(P<0.001)。
图2示出了TCGA高通量数据分析LncRNA PPP1R14B-AS1高表达对肺腺癌患者生存的影响。LncRNA PPP1R14B-AS1高表达不利于肺腺癌患者总体生存(P<0.001)。
图3示出了稳定敲减LncRNA PPP1R14B-AS1的细胞株中LncRNA PPP1R14B-AS1基因的mRNA表达水平显著降低。
图4示出了敲减LncRNA PPP1R14B-AS1后，A549细胞增殖能力显著下降。
图5示出了敲减LncRNA PPP1R14B-AS1后，A549细胞侵袭迁移能力显著下降。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1
本实施例用于说明TCGA高通量数据分析肺腺癌中LncRNA PPP1R14B-AS1的表达量变化。
1.TCGA高通量数据分析过程:
登录TCGA官方网站(https://cancergenome.nih.gov)，使用数据传输工具GDCclient(gdc-client_v1.4.0_OSX_x64)下载肺腺癌(LUAD)的RNA-Seq的HTSeq-Counts数据和HTSeq-FPKM数据。然后在R的环境下分别使用“merge”功能对数据进行整合得到样本编号和基因RNA-Seq的HTSeq-Counts数据的表达矩阵以及样本编号和基因RNA-Seq的HTSeq-FPKM数据的表达矩阵。利用R包“edgeR”对HTSeq-Counts数据进行基因的差异化分析，设定的阈值为log2(FC)values>0.85，p<0.001，从而筛选出目的基因PPP1R14B-AS1。再调取HTSeq-FPKM矩阵的PPP1R14B-AS1的表达数据，利用GraphPad Prism 6.0软件绘图，统计方法为Mann-Whitney检验。
2.结果：肺腺癌组织中LncRNA PPP1R14B-AS1的表达量较正常组织显著升高(P<0.001)，如图1所示。
实施例2
本实施例用于说明TCGA高通量数据分析LncRNA PPP1R14B-AS1高表达与肺腺癌预后关系。
1.TCGA高通量数据分析过程：
登录TCGA官方网站(https://cancergenome.nih.gov)，使用数据传输工具GDCclient(gdc-client_v1.4.0_OSX_x64)下载肺腺癌(LUAD)的临床数据文件(clinical)。然后在R的环境下分别使用“merge”功能对数据进行整合得到样本编号和各项临床数据的矩阵。提取各个样本的PPP1R14B-AS1的RNA-Seq的HTSeq-FPKM数据，样本的生存状态数据和样本的生存天数数据，用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验生存曲线差异，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果：LncRNAPPP1R14B-AS1高表达不利于肺腺癌患者总体生存(P＜0.001)，如图2所示。
实施例3
本实施例提供一种稳定敲减PPP1R14B-AS1基因的细胞株的构建方法，细胞株具体为A549肺腺癌细胞株。A549肺腺癌细胞购自美国ATCC公司，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基(购自Thermo Fisher Scientific)置于37℃、5％的二氧化碳条件下培养。
1.构建方法为：
(1)设计用于干扰PPP1R14B-AS1基因表达的2个siRNA
siRNA-1序列：
正义链5’-GCUUGAACAGUCUUCAAAUCC-3’(SEQ ID NO：3)；
反义链5’-AUUUGAAGACUGUUCAAGCCU-3’(SEQ ID NO：4)；
siRNA-2序列：
正义链5’-GCUGUAACAAAGAUUAAAUAG-3’(SEQ ID NO：5)；
反义链5’-AUUUAAUCUUUGUUACAGCCU-3’(SEQ ID NO：6)。
(2)利用shRNA技术构建可稳定过表达PPP1R14B-AS1特异性siRNA的A549细胞系；将上述(1)中的shPPP1R14B-AS1的正义链和反义链退火，得到双链shPPP1R14B-AS1-1和双链shPPP1R14B-AS1-2。
表达siPPP1R14B-AS1-1的质粒为将双链siPPP1R14B-AS1-1的编码DNA分子插入GV248载体(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)得到的载体，可以稳定表达siPPP1R14B-AS1-1。
表达siPPP1R14B-AS1-2的质粒为将双链siPPP1R14B-AS1-2的编码DNA分子插入GV248载体(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)得到的载体，可以稳定表达siPPP1R14B-AS1-2。
表达siPPP1R14B-AS1-1的质粒、表达siPPP1R14B-AS1-2的质粒shRNA和GV248载体(对照质粒)分别用Lipofectamine3000转染至A549细胞系，48小时后开始用终浓度为200mg/ml的嘌呤霉素水溶液进行稳定细胞系的筛选，一个月后，能够在此浓度药物中正常生长的细胞分别为稳定转siPPP1R14B-AS1-1细胞、稳定转siPPP1R14B-AS1-2细胞和稳定转GV248载体细胞。
(3)基因敲减效果检测
使用RNAiso plus(TaKaRa)提取稳定转siPPP1R14B-AS1-1细胞、稳定转siPPP1R14B-AS1-2细胞和稳定转GV248载体细胞的总RNA，然后用ReverTraAceqPCR RT试剂盒(TOYOBO)反转录成cDNA。荧光定量PCR使用SYBR Green RealTime PCRMaster Mix(TOYOBO)完成，以β-Actin为内参基因，每组实验三次重复。
所用的引物为：
LncRNA PPP1R14B-AS1：
正义：5’-TGCTACCAGGCTTGAACAG-3’(SEQ ID NO：1)；
反义：5’-CAGGCACAGAGGAAGACAT-3’(SEQ ID NO：2)；
β-Actin：
正义：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’(SEQ ID NO：7)；
反义：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’(SEQ ID NO：8)。
2.结果：图3显示稳定敲减PPP1R14B-AS1基因的细胞株与对照细胞株中PPP1R14B-AS1基因的mRNA表达情况，由图3可知，与对照组细胞(mRNA相对表达量>90％)相比，构建的稳定细胞株中PPP1R14B-AS1基因的表达量显著降低(mRNA相对表达量<20％)，说明细胞株中PPP1R14B-AS1基因敲减成功，该构建方法能够筛选得到PPP1R14B-AS1基因稳定低表达的肺腺癌细胞。
实验例1
本实验例利用实施例3中构建的稳定敲减PPP1R14B-AS1基因的细胞株，检测PPP1R14B-AS1基因对肺腺癌细胞增殖、侵袭和转移的影响。
1.具体检测内容为：
(1)细胞增殖实验
收集细胞，制成细胞浓度为1×104/ml的悬液。制备底层琼脂，加入1mL于6孔板中，室温下凝固，制备上层琼脂，取37℃的细胞悬液1.5mL于小烧杯中，加入等体积40℃、5％琼脂混匀。用配好的半固体琼脂培养液立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下凝固。常规培养，显微镜下观察。
(2)细胞迁移实验
实验前48h，以2×106/皿将肿瘤细胞接种于10cm的培养皿中。使用胰酶消化，调整细胞浓度为2×105/mL。4×104个细胞(于200μL无血清RPMI-1640中)接种于24孔小室进行迁移实验，该小室底部为8μL孔径的膜，用以模仿基底膜上的孔隙。细胞置于常规条件中培养24h后，甲醇固定5min，0.5％结晶紫染色1h后，用自来水清洗，用棉签去除没有迁移的细胞。室温晾干后，于光学显微镜下(200×)随机选取5个视野计算迁移细胞数。
2.结果：图4显示稳定敲减PPP1R14B-AS1基因的细胞株与对照细胞株的细胞增殖检测结果。由图4可知，PPP1R14B-AS1基因表达对肺腺癌细胞的增加有明显的影响。图5显示稳定敲减PPP1R14B-AS1基因的细胞株与对照细胞株的细胞迁移检测结果。由图5可知，肺腺癌细胞在敲减PPP1R14B-AS1基因后，细胞的迁移能力显著降低，说明肺腺癌细胞的迁移与PPP1R14B-AS1基因表达显著相关。可见，PPP1R14B-AS1基因参与肺腺癌的发生发展，有潜力作为临床对食管癌的预后评估、治疗效果监测的指标，为肺腺癌的诊断和靶向治疗提供有效信息，提高患者的生存率和生存质量。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 武汉轻工大学
<120> 用于检测或抑制LncRNA PPP1R14B-AS1的核酸的应用
<130> BJI2000169WHPU
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 1
tgctaccagg cttgaacag 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 2
caggcacaga ggaagacat 19
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 3
gcuugaacag ucuucaaauc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 4
auuugaagac uguucaagcc u 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 5
gcuguaacaa agauuaaaua g 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 6
auuuaaucuu uguuacagcc u 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 7
tgacgtggac atccgcaaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 8
ctggaaggtg gacagcgagg 20

Claims (7)

1.用于检测和/或抑制LncRNA PPP1R14B-AS1的核酸在制备肺腺癌诊断或预后判断试剂和/或治疗药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述核酸为用于实时荧光定量检测LncRNAPPP1R14B-AS1表达的引物对：
正向引物：5’-TGCTACCAGGCTTGAACAG-3’(SEQ ID NO：1)；
反向引物：5’-CAGGCACAGAGGAAGACAT-3’(SEQ ID NO：2)。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述核酸为抑制LncRNA PPP1R14B-AS1基因表达的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列为以下两条序列中任一序列所示：
siRNA-1序列：
正义链5’-GCUUGAACAGUCUUCAAAUCC-3’(SEQ ID NO：3)；
反义链5’-AUUUGAAGACUGUUCAAGCCU-3’(SEQ ID NO：4)；
siRNA-2序列：
正义链5’-GCUGUAACAAAGAUUAAAUAG-3’(SEQ ID NO：5)；
反义链5’-AUUUAAUCUUUGUUACAGCCU-3’(SEQ ID NO：6)。
4.一种用于肺腺癌诊断或预后判断的试剂盒，所述试剂盒含有如下引物对：
权利要求2所述的用于实时荧光定量检测LncRNA PPP1R14B-AS1表达的引物对；
内参基因β-Actin PCR引物对：
正向引物：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’(SEQ ID NO：7)；
反向引物：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’(SEQ ID NO：8)。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还含有用于实时荧光定量的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种：Trizol、氯仿、无水乙醇、异丙醇、无RNA酶水、M-MLV逆转录酶、5×M-MLV缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTPs、随机引物。
7.一种LncRNA PPP1R14B-AS1基因的表达抑制剂，所述表达抑制剂为权利要求3所述的siRNA。
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