CN101198252A - 用于细菌感染的抗微生物疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于定向诱变和异源表达的分子遗传学方法以及细菌性发病机理的活体外和活体内模型以阐明金黄色葡萄球菌(S.aureus)色素是致病因子及抗微生物疗法的潜在新颖目标。

Description

用于细菌感染的抗微生物疗法
相关申请案交叉参考
根据35U.S.C.§119，本申请案主张优先于在2005年4月18日提出申请的美国临时申请案第60/672,359号的权利，所述案件的揭示内容以引用方式并入本文中。关于政府资助研究的声明
本发明部分受益于国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的许可号AI048694。政府可对本发明拥有一定的权利。
技术领域
本发明关于一种用于定向诱变及异源表达的分子遗传学方法以及细菌性发病机理的活体外和活体内模型以阐明金黄色葡萄球菌色素是致病因子及抗微生物疗法的潜在新颖目标。
背景技术
Ogston(1881)杜撰了葡萄球菌属(genus Staphylococcus)以阐述葡萄样细菌簇(staphylo＝葡萄，Gr.)并且自外科手术脓肿获取了葡萄球菌属。此后不久，Rosenbach(1884)在纯净培养物中分离出此病原体并根据其相对于经常寄居在皮肤表面的低毒力葡萄球菌(staphylococci)的特征表面色素沉着提出了种属名称金黄色葡萄球菌(S.aureus(金色，拉丁文))。
在进入其七十年代后，抗微生物疗法时代已大大地减少了由感染性疾病引发的发病和死亡。然而，出现的抗性微生物现在已达流行性比例并对医学界提出了巨大的挑战。突出革兰氏阳性细菌病原体金黄色葡萄球菌呈现特别明显的令人担忧的趋势，其对第一线抗生素疗法变得越来越没有反应。在世界上，金黄色葡萄球菌可能是危及生命的急性细菌感染的最常见原因，且其能够造成各种各样的疾病，严重程度自简单的烫伤或脓疱病到爆发性脓毒症或中毒性休克综合征。金黄色葡萄球菌是菌血症、医院相关(院内)感染、皮肤及软组织感染、伤口感染、及骨骼和关节感染的单一主导因素。其是心内膜炎及食物中毒的若干最常见病因中的一种。
对24,000种以上侵润性细菌分离物的全国前瞻性调研显示与疾病有关的具有甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌菌株(MRSA)已经自22％(1995年)增加到57％(目前)。现在，MRSA经常发现于社会获得性感染以及医院中。急需发现用以解除此真实公共健康危害的新颖抗生素类别。半世纪以来，人们基于＜10个抗菌支架合成类似物已经研发了＞100种抗菌剂并将其投放市场，但除了噁唑烷酮核心之外，在过去30年里没有出现用以解决出现的抗性问题的新颖支架。
研发靶向诸如金黄色葡萄球菌类胡萝卜素色素等细菌致病因子的新颖类别抗生素是一种人们尚未注意到其潜在优势的方法。经典抗生素方法试图通过靶向主要细胞功能(例如，细胞壁生物合成、蛋白质合成、DNA复制、RNA聚合酶、或代谢途径)来杀死细菌或抑制细菌生长。这些常用疗法具有较高毒性风险，这是因为许多所述细胞功能对于哺乳动物细胞也是十分重要的并且需要在微生物目标与宿主细胞对应部分之间进行精细的分子区分。第二，相同主要目标的重复使用意味着当细菌在治疗期间对特定抗生素药剂产生抗性时，即使所述细菌从未暴露于作用于所述目标的其它药剂，其也可能会同时对所述其它药剂产生交叉抗性。第三，常用疗法对细菌施加“生或死”的挑战，因此，所述细菌会承受发展针对所述抗微生物药剂抗性的强大选择压力。最后，许多通用抗生素具有广谱活性以及会根除许多正常菌群组成的副作用，进而产生不期望并发症，例如，难辨梭状芽孢杆菌结肠炎或续发性真菌感染(例如，念珠菌属(Candida)感染)。
在金黄色葡萄球菌感染的经验疗法中，出现的MRSA可顺应甲氧西林及相关抗生素(苯唑西林(oxacillin)、双氯西林(dicloxacillin))及所有头孢菌素类(cephalosporings)(例如，头孢唑林(cefazolin)、头孢力新(cephalexin))的临床使用。MRSA经常会对大环内酯类(例如，红霉素)、β-内酰胺酶抑制剂组合(例如，优立新(Unasyn)、奥格门汀(Augmentin))及氟喹诺酮类(例如，环丙沙星(ciprofloxacin))具有明显水平的抗性且偶尔会对克林霉素(clindamycin)、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异噁唑(trimethoprim/sulfamethoxisol)(Bactrim)、及利福平(rifampin)产生抗性。在严重的金黄色葡萄球菌感染中，静脉注射万古霉素是最后的办法，但现在也有关于金黄色葡萄球菌对万古霉素(一种常用于治疗MRSA的静脉注射抗生素)抗性的令人感到惊慌的报告。
诸如利奈唑胺(linezolid)(Zyvox)或奎奴普汀(quinupristin)/达福普汀(dalfopristin)(Synercid)(二者均以与核糖体亚单位结合的方式利用传统目标来抑制RNA合成)等新颖抗-MRSA药剂是相当昂贵的。
对于金黄色葡萄球菌色素的后续研究已阐明可产生一系列类胡萝卜素的具体生物合成途径。在饮食水果及植物中产生的类似类胡萝卜素依靠其自由基清除性质及淬灭单态氧的异常能力而成为公认的强效抗氧化剂。
发明内容
本发明阐明类胡萝卜素在微生物中可用作致病/抗性因子。在一个具体实施例中，本发明阐明金黄色葡萄球菌类胡萝卜素是一种可依靠其抗氧化剂性质削弱嗜中性粒细胞杀伤及促进疾病发病的致病因子，及(2)表明类胡萝卜素色素生成的药理抑制可致使有机体对氧化剂及血液杀伤更敏感。
本发明提供一种治疗细菌感染的方法，其包括对遭受所述感染的受试者投与可抑制细菌中类胡萝卜素生成及/或活性的药剂。在一个实施例中，所述细菌感染是葡萄球菌感染。在另一实施例中，所述细菌是葡萄球菌属。在又一实施例中，所述细菌是金黄色葡萄球菌。
本发明还提供一种通过靶向类胡萝卜素来预防、治疗MRSA或改进MRSA治疗有效性的方法。一方面，所述类胡萝卜素是葡萄球菌属类胡萝卜素。另一方面，所述方法包括涉及胡萝卜素形成抑制剂的类胡萝卜素靶向。在又一实施例中，所述胡萝卜素形成抑制剂是多功能氧化酶抑制剂，例如，2-二乙基氨基乙基-2，2-二苯基-戊酸酯(SKF 525-A)。
本发明还提供一种筛选用于治疗细菌感染的MRSA治疗剂的方法，其包括使可产生类胡萝卜素的细菌与怀疑可抑制类胡萝卜素生成或活性的测试药剂接触，并测量所述药剂在氧化剂存在及不存在时的效果。
附图说明
图1A-E显示金黄色葡萄球菌类胡萝卜素色素的遗传操控及其抗氧化剂功能。A)用于通过等位基因置换实施金黄色葡萄球菌crtM(编码脱氢角鲨烯合酶)胡萝卜素形成及诱变作用的生化途径。B)金黄色葡萄球菌色素沉着在ΔCrtM突变体中的消除；金黄色葡萄球菌4′4′-二脱辅基链孢红素色素在酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)中的异源表达。金黄色葡萄球菌ΔCrtM突变体对C)过氧化氢或D)单态氧杀伤的敏感性增加，在与pCrtMN互补时WT抗性水平恢复。E)表达4′4′-二脱辅基链孢红素的酿脓链球菌的单态氧敏感性降低。误差棒代表所绘变量的标准偏差；所示结果代表至少3组实验。
图2A-F显示金黄色葡萄球菌类胡萝卜素色素在嗜中性粒细胞及全血中赋予对氧化剂杀伤的抗性。WT及ΔCrtM金黄色葡萄球菌在A)具有分离人类嗜中性粒细胞的共培养物及B)鼠类全血中的存活率。在(B)中还显示与单独载体或pCrtMN互补的ΔCrtM的全血存活率。(C)crtMN的质粒表达对酿脓链球菌在小鼠全血中存活率的影响。D)氧化猝发抑制剂DPI对WT及ΔCrtM突变体金黄色葡萄球菌人类嗜中性粒细胞共培养物存活率的影响。Phox-/-Phox-/-WT及ΔCrtM突变体金黄色葡萄球菌在E)正常人及缺少NADPH氧化酶功能的gp47Phox-/-患者或者F)野生型CD1和C57B1/6小鼠及gp91Phox-/-小鼠的血液中的相对存活率。结果代表至少3组实验。使用CGD人类患者血液的分析实施两次。.
图3A-C显示金黄色葡萄球菌类胡萝卜素在皮下脓肿模型中产生毒力。用接受对比的两种菌株在小鼠的左右侧进行皮下注射。线型图绘示由指定菌株产生的总累积皮肤损伤面积。散点图上的点＝自每一小鼠个体皮肤损伤回收的经着色菌株与未经着色菌株的cfu比例。照片图像绘示每一治疗组的代表性小鼠。A)CD1小鼠中的野生型(WT)与ΔCrtM突变体金黄色葡萄球菌，B)gp91Phox-/-小鼠中的WT与ΔCrtM突变体金黄色葡萄球菌，及C)葡萄球菌4′4′-二脱辅基链孢红素的酿脓链球菌+/-表达。
图4A-B显示抑制金黄色葡萄球菌色素生成可增加氧化剂敏感性及提高吞噬细胞清除率。在指定浓度的SKF 525-A存在或不存在时培养野生型及ΔCrtM突变体金黄色葡萄球菌。此图绘示对A)色素沉着表现型、B)单态氧敏感性、及C)在鼠类全血中存活率的观测影响。所示结果代表至少3组实验。
图5A-D阐明对金黄色葡萄球菌crtM基因的等位基因置换缺少多型性影响。A)活细菌在WT金黄色葡萄球菌与ΔCrtM突变体的固定相培养物中的固定相浓度的类似性及细菌在新鲜THB培养基中的后续生长动力学。WT金黄色葡萄球菌与ΔCrtM突变体在如下方面缺少可测量差异：B)浮力密度，通过在Percoll中迁移评定C)疏水性，通过分配到正十六烷中来测量，及D)表面电荷，通过细胞色素C结合测定。
图6A-F显示关于金黄色葡萄球菌类胡萝卜素色素抗吞噬性质的进一步分析。A)WT及ΔcrtM突变体金黄色葡萄球菌是以相当的速率受到人类嗜中性粒细胞吞噬。代表性研究的反卷积荧光显微镜检查显示细胞内(绿色)及细胞外(红色)有机体。B)WT及ΔcrtM突变体金黄色葡萄球菌可激起类似程度的人类嗜中性粒细胞氧化猝发，如通过氮蓝四唑还原测量得。C)氧化猝发抑制剂二伸苯基碘鎓(DPI)对WT及ΔCrtM突变体金黄色葡萄球菌在正常小鼠血液中存活率的影响。WT及ΔCrtM突变体金黄色葡萄球菌菌株对由D)颗粒蛋白酶组织蛋白酶G及人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶或E)鼠类组织蛋白酶抑制素mCRAMP引发的杀伤的敏感性。F)嗜中性粒细胞细胞内存活率在金黄色葡萄球菌WT与ΔCrtM突变体金黄色葡萄球菌之间的差异于用自体血清进行预调料的实验(如那些不含血清者)中是类似的(例如，图6A)。
具体实施方式
除非上下文明确指出，否则本文及随附权利要求中所用单数形式“一”、“一个”及“所述”包括复数个指示物。由此，例如，当提及“一蛋白质”时包括复数个所述蛋白质且当提及“所述细胞”时包括提及一或多个熟悉所属技术的人员已知的细胞，等等。
除非另有说明，否则本文所用所有技术及科学用语均具有与一熟悉本发明所属技术的普通人员通常所了解的意义相同的意义。尽管本文阐述了例示性方法、装置及材料，但类似于或等效于那些本文所阐述者的方法及材料也可用于实践所揭示方法及组合物。
上文及本文通篇中所讨论公开案仅因为其揭示内容先于本申请案的申请日期而提供。不得将本文中任何内容解释为承认本发明者无权使本发明早于先前揭示内容。
本发明提供用于治疗微生物感染的方法及组合物，其中所述微生物表达类胡萝卜素。例如，本发明提供用于治疗金黄色葡萄球菌感染(包括那些由甲氧西林-及万古霉素-抗性菌株产生的感染)的方法及组合物。本发明的方法及组合物可单独或联合传统抗微生物剂及抗生素使用以治疗所述感染。另外，本文所揭示方法和组合物可用于诸如异物、导管等装置或血管内感染、慢性骨髓炎、医院获得性或手术后感染、复发性皮肤感染、或用于免疫妥协宿主的金黄色葡萄球菌感染。
类胡萝卜素代表一大类自然色素。在细菌、真菌、藻类、植物及动物中已识别出600种以上不同的类胡萝卜素(Staub，O.，In：Pfander，H.(编辑)，Key to Carotenoids，第2版，Birkhuser Verlag，Basel)。所述类胡萝卜素可用作光合作用的辅助色素、抗氧化剂、人类及动物中维生素的前体以及用于光保护及菌种特异性染色的色素。类胡萝卜素在历史上具有重要作用，例如，用于医药、食品着色剂和动物饲料及营养强化剂。如下发现增强了人们对这些天然产物在医药应用方面的兴趣：这些天然产物在预防癌症及慢性疾病方面可起重要作用(主要归因于其抗氧化性)及，最近，因其与癌细胞之间的特异性相互作用而使其呈现显著的肿瘤抑制活性(Bertram，J.S.，Nutr.Rev.，1999；57：182-191；Singh等人，Oncology，1998；12：1643-168；Rock，C.L.，Pharmacol.Ther.，1997；75：185-197；Edge等人，J.Photochem.Photobiol.，1997；41：189-200)。
类胡萝卜素可通过组合来自不同有机体的生物合成基因以创造生物合成途径来在重组微生物中产生。目前，已经自可用于制造各种各样类胡萝卜素的细菌、植物、藻类及真菌中分离出150个以上的用于24种胡萝卜素形成酶(crt)的基因。
已经自许多细菌克隆出若干完整类胡萝卜素生物合成途径，其中生物合成酶基因在基因簇中排列(参见Armstrong，Ann.Rev.Microbiol.，1997，51：629；Sandmann，Eur.J.Biochem.，1994，223：7)。分别用于合成玉米黄质二糖苷及无环叶黄素球形烯(spheroidene)和球形烯酮(spheroidenone)的Erwinia及Rhodobacter途径是自其识别出所有涉及酶的第一途径(Armstrong等人，Mol.&General Gene.，1989，216：254；Lang等人，J.Bacteriol.，1995，177：2064；Lee及Liu，Mol.Microbiol.，1991，5：217；Misawa等人，J.Bacteriol.，1990，172：6704)。
各种技术已经应用于克隆胡萝卜素形成基因(Hirschberg，J.，In：Carotenoids：Biosynthesis and Metabolism，第3卷，Carotenoids，G.Britton，Ed.B asel：Birkhuser Verlag，148-194，1998)。功能颜色互补在自Erwinia表达胡萝卜素形成基因的大肠杆菌中已成功地用于克隆各种微生物及植物胡萝卜素形成基因(Verdoes等人，Biotech，and Bioeng.，1999，63：750；Zhu等人，Plant and Cell Physiology，1997，38：357；Kajiwara等人，Plant Mol.Biol.，1995，29：343；Pecker等人，Plant Mol.Biol.，1996，30：807；关于植物类胡萝卜素生物合成可参见Hirschberg等人，Pure and Applied Chemistry，1997，69：2151；Cunninghamand Gantt，Ann.Rev.of Plant Physiol及Plant Mol.Biol.，1998，49：557)。
编码早期类胡萝卜素生物合成酶GGDP合酶、八氢番茄红素合酶及八氢番茄红素去饱和酶的基因占所有克隆胡萝卜素形成基因的一半以上。可获得不同的八氢番茄红素去饱和酶基因，其可将2个、3个、4个或5个双键导入八氢番茄红素中以分别产生胡萝卜素(植物、蓝色细菌、藻类)(Bartley等人，Eur.J.of Biochem.，1999，259：396)、链孢红素(红色细菌)(Raisig等人，J.Biochem.，1996，119：559)、番茄红素(大多数真细菌及真菌)(Verdoes等人，Biotech，and Bioeng.，1999，63：750；RuizHidalgo等人，Mol.&Gen.Genetics，1997，253：734)或3，4-二脱氢番茄红素(粗糙链孢霉(Neurospora crassa))(Schmidhauser等人，Mol.and Cell Biol.，1990，10：5064)。下列是已经克隆出类胡萝卜素生物合成基因的实例：
crtE：来自荚膜红色细菌(R.capsulatus)及噬夏孢欧文氏杆菌(E.uredovora)的GGPP-合酶
crtB：来自荚膜红色细菌及噬夏孢欧文氏杆菌的八氢番茄红素合酶
crtI：来自噬夏孢欧文氏杆菌及草生欧文氏菌(E.herbicola)的八氢番茄红素去饱和酶
crtY：来自噬夏孢欧文氏杆菌及草生欧文氏菌的番茄红素环化酶
crtA：来自荚膜红色细菌及球形红细菌(R.spaeroides)的球形烯单氧合酶
crtO：来自蓝细菌(Synechocistis sp)的β-C4-酮酶(氧合酶)。
crtW：来自产碱菌(Algaligenes sp.)、海洋细菌(A.aurantiacum)的β-C4-酮酶
crtD：来自荚膜红色细菌及球形红细菌的甲氧基链孢红素去饱和酶
crtX：来自噬夏孢欧文氏杆菌及草生欧文氏菌的玉米黄质葡萄糖基转移酶
crtZ：来自噬夏孢欧文氏杆菌及草生欧文氏菌的β-胡萝卜素羟化酶
crtU：来自灰色链霉菌(S.griseus)的β-胡萝卜素去饱和酶
crtM：来自金黄色葡萄球菌的脱氢角鲨烯合酶
crtN：来自金黄色葡萄球菌的脱氢角鲨烯去饱和酶。
与经常寄居在皮肤表面上的低毒力葡萄球菌(例如，表皮葡萄球菌)相比，主要的人类病原体金黄色葡萄球菌(S.aureus)因其特征金黄色色素沉着(aureus＝金色，拉丁文)得名。关于金黄色葡萄球菌色素的后续研究揭开了产生一系列类胡萝卜素的具体生物合成途径。在饮食水果及植物中产生的类似类胡萝卜素依靠其自由基清除性质及淬灭单态氧的异常能力而成为公认的强效抗氧化剂。所述金黄色葡萄球菌色素可具有类似性质。本发明检查了金黄色葡萄球菌是否可利用其金色类胡萝卜素色素来抵抗宿主先天免疫系统的基于氧化剂的清除机制。例如，嗜中性粒细胞及巨噬细胞可通过使杀死其已吞噬细菌的反应性分子(例如，过氧化物、漂白剂及单态氧)产生“氧化猝发”来杀死细菌。
由类胡萝卜素色素产生的金色是人类病原体金黄色葡萄球菌的齐名特征。配对诱变与异源表达的分子遗传学分析已用于证实此标志表现型实际上是一种借助其抗氧化剂性质来保护所述细菌免受吞噬杀伤的致病因子。在本世纪中，在社会及医院中，此重要病因的有效控制受到抗微生物剂抗性迅速发展的危害。本发明阐明：抑制胡萝卜素形成可为并发性金黄色葡萄球菌感染治疗提供一种新颖治疗方法，其可有效地致使所述病原体对由正常宿主先天免疫防御产生的清除更敏感。
本发明阐明：类胡萝卜素色素生成可造成B组链球菌(GBS)对巨噬细胞杀伤产生抗性。在人类新生儿中，GBS是诸如肺炎、败血症及脑膜炎等侵润性细菌感染的主要原因。人们已识别出类胡萝卜素色素(CylE)生成所需基因。所述色素为有机体产生具有在疾病发病中起重要作用的细胞损伤及促炎性质的溶血素/细胞溶素毒素所需。与侵润性感染相关的其它细菌及真菌人类病原体(例如，烟曲菌(Aspergillus fumigatus)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcesens))可产生具有抗氧化剂性质的类胡萝卜素或黑色素样色素，表明常见致病主因并揭露针对吞噬细胞清除机制的潜在色素生成选择性优点。
因此，可将用于抗微生物疗法的靶向色素生成方法推广至产生色素(例如，类胡萝卜素色素或其它可赋予氧化保护的色素)的有机体。确切地说，曲霉菌属(Aspergillussp.)是导致免疫妥协受试者(例如，接受癌症化学治疗者)死亡的重要原因且洋葱伯克霍尔德氏菌是造成纤维性囊肿患者死亡的重要原因。曲霉菌及伯克霍尔德氏菌二者经常具有多种药物抗性并对现存抗生素疗法具有顽抗性。
本发明阐明：通过使用靶向基因删除分子遗传学方法(以创造未经着色金黄色葡萄球菌突变体)及克隆技术(以在其它细菌中表达所述金黄色葡萄球菌色素)以创造“活性剂(living reagent)”来确定所述色素在金黄色葡萄球菌疾病发病中的真实重要性。金黄色葡萄球菌类胡萝卜素色素的确可保护细菌免受过氧化物及单态氧的损害并使其在小鼠及人类血液中对杀伤更具抗性及对由纯化人类嗜中性粒细胞引起的杀伤更具抗性。借助形成金黄色葡萄球菌脓肿的小鼠模型，表明类胡萝卜素色素在活体内可提升细菌存活率及加速疾病进展。使用在嗜中性粒细胞氧化剂生成中受伤的小鼠的对照实验证实生成的类胡萝卜素色素可依靠其抗氧化剂性质来产生金黄色葡萄球菌毒力。本发明阐明：在药理学上抑制金黄色葡萄球菌色素生成可导致所述细菌对氧化剂更敏感并会降低血液存活率。
通过吞噬细胞清除病原体的一个重要机制是通过释放由NADPH氧化酶产生的反应性氧物质。本发明阐明诸如那些由金黄色葡萄球菌表达者等类胡萝卜素起针对这些防御分子的保护作用。例如，与WT金黄色葡萄球菌菌株相比，ΔCrtM突变体可以10倍至100倍更有效的方式受到过氧化氢杀伤且其可以100倍至1,000倍更有效的方式受到单态氧杀伤。类似地，葡萄球菌色素在酿脓链球菌中的异源表达与单态氧致死率降低100倍至1,000倍有关。
本发明提供用于治疗微生物感染及促进抗微生物活性的抑制胡萝卜素形成的方法及药剂。例如，一方面，多功能氧化酶抑制剂2-二乙基氨基乙基-2，2-二苯基-戊酸酯(SKF 525-A，Calbiochem)显示在金黄色葡萄球菌中抑制色素形成，且在所述药剂存在下生长的金黄色葡萄球菌WT菌株中表现出类胡萝卜素生成的剂量依赖性降低。阻断金黄色葡萄球菌色素形成导致有机体对单态氧杀伤的敏感性出现相称的剂量依赖性增加及其存活于人类全血中的能力降低。作为对照，使ΔCrtM突变体在平行实验中暴露于SKF 525-A，对氧化剂敏感性或血液存活率无明显影响。
本发明提供用于通过抑制类胡萝卜素生成及/或活性来治疗细菌感染的方法和组合物。更具体来说，本发明提供治疗具有细菌感染(例如，葡萄球菌属细菌感染)的受试者的方法，其包括使受试者与可抑制葡萄球菌属的类胡萝卜素活性及/或生成的药剂接触。一方面，所述药剂是小分子、聚核苷酸(例如，核酶或反义分子)、多肽(例如，抗体)或拟肽物质。在本发明的一个方面中，所述药剂是一种可抑制胡萝卜素形成的药理剂。例如，所述药剂可为多功能氧化酶抑制剂，例如2-二乙基氨基乙基-2，2-二苯基-戊酸酯(SKF 525-A，Calbiochem)、2，4-二氯-6-苯基苯氧基乙基胺、2，4-二氯-6-苯基苯氧基乙基二乙基胺及胡椒基丁醚。
另一方面，所述胡萝卜素形成抑制剂包括寡核苷酸或聚核苷酸(例如，反义核苷酸、核酶或siRNA)。例如，反义技术是一种下调其中目标基因序列已知的基因的方法。在包含葡萄球菌属基因的技术中已知诸多类胡萝卜素基因。在此方面中，已经克隆出来自期望基因(例如，crtM及/或crtN)的核酸片段并将其以可操作方式连接到启动子以便于RNA的反义链会受到转录。随后将此构建体导入目标细胞中并产生RNA的反义链。反义RNA可通过阻止编码相关蛋白质的mRNA累积来抑制基因表达。因此，针对crtM及/或crtN的反义分子可减少病原微生物的类胡萝卜素合成，藉此致使所述微生物对由吞噬细胞引起的氧化损伤敏感。熟悉所属技术的人员可知应考虑某些与反义技术使用相关的因素以减少特定基因表达。例如，反义基因的适当表达可能会需要借助熟悉所属技术人员已知的不同调节因子来使用不同嵌合基因。
在本发明的上下文中，显然，通过使用抑制性核酸来调控细菌类胡萝卜素生物合成途径的表达可提供一种有用的治疗方法。例如，本发明已识别出编码类胡萝卜素生物合成途径中酶的基因，包括crtM和crtN。或者(或另外)，可能需要剔除导致C30类胡萝卜素合成的crtM/crtN基因。常用分子生物技术可用于产生抑制性核酸分子，例如，可与野生型细菌(例如，葡萄球菌属)产生的crtN及/或M核酸相互作用的反义分子。
本文所用分离核酸实质上不含蛋白质、脂质及与体内生成核酸自然缔合的其它核酸。通常，所述核酸的纯度为至少70重量％、80重量％、90重量％或以上，且用于在活体外合成核酸的常用方法可用于代替活体内方法。本文所用“核酸”或“聚核苷酸”或“寡核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，其呈独立片段形式或作为较大遗传构建体的组成(例如，通过以可操作方式将启动子连接到编码(例如)反义分子的核酸)。在所属技术中已知许多遗传构建体(例如，质粒及其它表达载体)且其可用于在不含细胞的系统或原核细胞或真核(例如，酵母菌、昆虫、或哺乳动物)细胞中产生本发明的期望核酸。本发明的核酸可容易地用于常用分子生物技术以产生本发明的肽。
可将包含反义核酸、核酶或siRNA的聚核苷酸插入“表达载体”中。术语“表达载体”是指一种遗传构建体，例如质粒、病毒或其它可经改造以含有(例如)反义分子的所属技术已知的介体。所述表达载体通常含有复制源及启动子以及方便转化细胞表型选择的基因。各种启动子(包括诱导型及组成型启动子)均可用于本发明。通常，所述表达载体含有源自与宿主/目标细胞兼容的物种的控制序列及复制子位点。
可使用熟悉所属技术的人员已知的常用技术对具有本发明聚核苷酸的宿主/目标细胞实施转化或转染。例如，当所述宿主细胞是大肠杆菌时，可使用所属技术中已知的CaCl2、MgCl2或RbCl方法来制备能够吸收DNA的感受态细胞。或者，可使用诸如电穿孔或显微注射等物理方法。电穿孔可通过高压电脉冲将聚核苷酸转移到细胞中。另外，可通过原生质体融合使用所属技术中熟知的方法将聚核苷酸导入宿主细胞中。人们还知道用于转化真核细胞的适宜方法，例如，电穿孔及脂转染。
本发明所涵盖的宿主细胞或目标细胞是任何其中本发明的聚核苷酸可用于表达抑制性核酸分子的细胞。所述术语还包括宿主/目标细胞的任何子代。有用的宿主/目标细胞包括细菌细胞、真菌细胞(例如，酵母菌细胞)、植物细胞及动物细胞。例如，宿主细胞可为高等真核生物细胞(例如，哺乳动物细胞)、低等真核生物细胞(例如，酵母菌细胞)，或者所述宿主细胞可为原核动物细胞(例如，细菌细胞)。可通过磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染或电穿孔来实现所述构建体至所述宿主细胞的导入(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology(1986))。作为适当宿主的代表性实例，可提及：真菌细胞，例如，酵母菌；昆虫细胞，例如，DrosophilaS2及Spodoptera Sf9；动物细胞，例如，CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物细胞，及诸如此类。适当宿主的选择被视为属于熟悉所属技术人员根据本文教示内容可知的范围。
宿主细胞可为真核生物宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)。一方面，所述宿主细胞是适合在细胞培养物中生长的哺乳动物产生细胞。常用于工业的所述细胞的实例为CHO、VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos；Cos-7)、MDCK、293、3T3、C127、骨髓瘤细胞系(尤其为鼠类骨髓瘤细胞系)、PC12及W138细胞。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞广泛地用于产生若干复杂的重组蛋白质，例如，细胞因子、凝血因子及抗体(Brasel等人，Blood 88：2004-2012，1996；Kaufman等人，J.Biol Chem 263：6352-6362，1988；McKinnon等人，J Mol Endocrinol 6：231-239，1991；Wood等人，J.Immunol145：3011-3016，1990)。缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)的突变体细胞系(Urlaub等人，ProcNatl Acad Sci USA 77：4216-4220，1980)是常用的CHO宿主细胞系，这是因为有效的DHFR可选择及可扩增基因表达系统有利于在这些细胞中高水平地表达重组蛋白质(Kaufman，Meth Enzymol 185：527-566，1990)。另外，这些细胞易于作为贴壁或悬浮培养物操作并呈现相当好的遗传稳定性。已经对CHO细胞及在其中表达的重组蛋白质进行了详尽地表征且所述CHO细胞及重组蛋白质已由管理机构获准用于临床生成。
可使用诸如本文所述分析(活体外和活体内分析)等熟悉所属技术的人员已知的常用方法来测定这些抑制药剂(例如，小分子(2-二乙基氨基乙基-2，2-二苯基-戊酸酯)及抑制性核酸)的活性。
本发明还提供一种用于通过使细菌与抑制有效量的类胡萝卜素生物合成抑制剂(即，胡萝卜素形成抑制剂)接触来抑制所述细菌生长的方法。术语“接触”是指使微生物(例如，细菌)暴露于药剂以便于所述药剂能够抑制、杀死或裂解微生物或致使其对氧化性破坏敏感。有机体与可抑制类胡萝卜素生物合成的药剂的接触可通过(例如)将所述药剂添加到细菌培养物中或使沾染有细菌的表面与所述药剂接触来在活体外发生。
或者，接触可通过(例如)将所述药剂投与遭受细菌感染或易受到感染的受试者来在活体内发生。活体内接触包括非经肠以及局部接触。“抑制”或“抑制有效量”是指足以产生(例如)抑菌或杀菌作用、减少特定细菌细胞类别着色、或减少由所述细菌产生的特定类胡萝卜素数量的药剂量。可受到类胡萝卜素抑制剂使用影响的细菌包括革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌。例如，可受到影响的细菌包括金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌(A组)、链球菌属(草绿色群组(viridans group))、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组)、猪链球菌(S.bovis)、链球菌(厌氧型菌种)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、及肠球菌属(Enterococcus sp.)；革兰氏阴性球菌(Gram-negative cocci)，例如，奈瑟氏淋病双球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎双球菌(Neisseriameningitidis)、及卡他布兰汉氏菌(Branhamella catarrhalis)；革兰氏阳性杆菌(Gram-positive bacilli)，例如，炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、痤疮丙酸杆菌(P.acne)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)及是类白喉菌的棒状杆菌属(Corynebacterium species)(需氧型及厌氧型)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠杆菌属(Enterobacterspecies)、奇异变形杆菌(Proteus mirablis)及其它菌属、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏杆菌(Shigella)、粘质沙雷氏菌(Serratia)、及空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)。确切地说，本发明的方法和组合物可用于抵抗任何可合成赋予抵抗反应性氧物质(例如，由NADPH氧化酶产生的物质)保护的类胡萝卜素的病原体。受到一种或多种这些细菌感染可能会引发诸如下述等疾病：菌血症、肺炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、鼻窦炎、关节炎、泌尿道感染、破伤风、坏疽、结肠炎、急性胃肠炎、脓疱病、痤疮、酒渣鼻痤疮(acne posacue)、伤口感染、出生感染、筋膜炎、支气管炎、及各种脓肿、院内感染、及伺机性感染。用于抑制细菌生长的方法还可包括使所述细菌与肽和一种或多种抗生素的组合物接触。
真菌有机体(例如，犬小孢子菌(Microsporum canis)及其它小孢子菌属(Microsporum sp.)；及毛癣菌属(Trichophyton sp.)，例如红色毛藓菌(T.rubrum)及须发藓菌(T.mentagrophytes))、酵母菌(例如，白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(C.Tropicalis)、或其它念珠菌属)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)(圆形糠秕孢子菌(Pityropsporon orbiculare)、或卵圆糠秕孢子菌(P.ovale))、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲菌(Aspergillusfumigatus)、构巢曲酶(Aspergillus nidulans)、及其它曲霉属、接合菌(Zygomycetes)(例如，根霉菌(Rhizopus)、毛霉菌(Mucor))、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitides)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、及申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)也可受到类胡萝卜素抑制剂的影响。
可将可有效地抑制类胡萝卜素(赋予(例如)氧化侵袭抗性)生成之量的类胡萝卜素生物合成抑制剂投与任何宿主，包括人类或非人类动物。一方面，所述投药可抑制细菌、病毒、及/或真菌的生长。因此，所述方法及组合物可用作抗微生物剂、抗病毒剂及/或抗真菌剂。
各种业内已知方法中的任何一种均可用于单独或联合其它抗生素药剂投与类胡萝卜素抑制剂。例如，可以非经肠方式通过注射或通过经过一段时间逐渐输注实施投药。所述药剂可经静脉内、腹膜腔内、肌内、皮下、腔内、吸入、或经皮投与。
另一方面，可单独或联合其它用于局部投药的抗生素/抗真菌剂调配类胡萝卜素生物合成抑制剂(例如，乳液、乳霜、喷雾剂、凝胶或软膏)。这些局部调配物可用于治疗或抑制存于眼睛、皮肤及粘膜(例如，口、阴道及诸如此类)上的或感染这些组织的微生物、真菌、及/或病毒。市售调配物的实例包括局部用乳液、乳霜、肥皂、擦及诸如此类。其可调配成脂质体以降低毒性或增加生物利用度。用于递送药物的其它方法包括需要将所述调配物囊封于微球体或类蛋白中的口服方法、气溶胶递送(例如，给肺)、或经皮递送(例如，通过离子导入法或经皮电穿孔)。其它投药方法为熟悉所属技术的人员所知。
适于以非经肠方式投与包含类胡萝卜素抑制剂的组合物的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液、及乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如，橄榄油)、及可注射有机酯(例如，油酸乙酯)。水性载剂的实例包括水、盐水、及经缓冲的介质、醇性/水性溶液、及乳液或悬浮液。非经肠媒剂的实例包括氯化钠溶液、林格氏葡聚糖(Ringer′s dextrose)、葡聚糖及氯化钠、乳酸林格氏液、及固定油。静脉注射媒剂包括流体及营养补充剂、电解质补充剂(例如，那些基于林格氏葡聚糖者)及诸如此类。还可包含防腐剂及其它添加剂，例如，其它抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体及诸如此类。
本发明提供一种用于通过对具有细菌、病毒及/或真菌相关性病况或处于患所述病况风险下的受试者单独或联合其它抗微生物剂投与治疗有效量的类胡萝卜素生物合成抑制剂(例如，crtM及/或crtN抑制剂)或者使所述受试者与所述药剂接触来抑制所述病况的方法。术语“抑制”意指预防或改善病况的病征或症状(例如，皮疹、溃疡及诸如此类)。可得到改善的疾病病征的实例包括受试者的TNF血液水平增加、发烧、低血压、嗜中性白血球减少症、白血球减少、血小板减少症、弥漫性血管内凝血、成人呼吸窘迫综合征、休克、及器官衰竭。可根据本发明治疗的受试者实例包括那些处于患毒血症(例如，由革兰氏阴性细菌感染引起的内毒素血症)、毒物中毒或肝衰竭的风险下或正遭受所述疾病折磨的受试者。其它实例包括具有皮炎的受试者以及那些具有皮肤感染或由革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、病毒或真菌引起损伤的受试者。候选受试者的实例包括那些正遭受大肠杆菌、脑膜炎双球菌、葡萄球菌或肺炎球菌感染者。其它受试者包括那些正遭受枪弹伤、肾或肝衰竭、创伤、烧伤、免疫妥协感染(例如，HIV感染)、造血系统肿瘤、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼氏病(Castleman′s disease)或心脏粘液瘤折磨的受试者。熟悉医学技术的人员能够容易地采用常规标准识别适合根据本发明治疗的受试者。
治疗有效量可通过测量皮肤溃疡的严重性程度作为足以减少受试者皮疹或皮炎症状的量加以测量。通常，用足以减少疾病或病况症状至少50％、90％或100％之量的本发明治疗组合物来治疗受试者。一般来说，最佳剂量将取决于所述病况及诸如下述等因素：受试者体重、细菌、病毒或真菌感染类型、体重、性别及症状严重程度。然而，适宜剂量可由一熟悉所属技术的人员容易地确定。通常，适宜剂量为0.5至40毫克/公斤体重，例如，1至8毫克/公斤体重。
如上文所述，本发明的组合物和方法可包括额外(例如，除类胡萝卜素生物合成抑制剂之外)治疗剂(例如，TNF抑制剂、抗生素及诸如此类)的使用。可同时投与但也可相继投与类胡萝卜素生物合成抑制剂、其它治疗剂及/或抗生素。适宜抗生素包括氨基糖甙类(例如，庆大霉素(gentamicin))、β-内酰胺(例如，青霉素类及头孢菌素类)、喹诺酮类(例如，环丙沙星)及新生霉素。通常，会投与杀菌、抗病毒及/或抗真菌量的抗生素。
利用类胡萝卜素生物合成抑制剂的本发明方法和组合物可用作适用于解决抗生素抗性细菌菌株生长问题的光谱抗微生物剂及用于治疗及/或预防感染性疾病(包括由诸如炭疽、鼠疫、霍乱、胃肠炎、多药物抗性结核病(MDR TB)等生物恐怖因素引起的疾病)爆发。
根据本发明，包含胡萝卜素形成抑制剂的医药组合物可呈适用于借助载剂、赋形剂、及添加剂或辅助剂投与受试者的形式。经常使用的载剂或辅助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇及其它糖类、滑石粉、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动物油及植物油、聚乙二醇及溶剂(例如，无菌水、醇、甘油、及多元醇)。静脉注射用媒剂包括流体及营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂及惰性气体。其它药学上可接受的载剂包括水性溶液、无毒性赋形剂(包括盐)、防腐剂、缓冲剂及诸如此类，如在(例如)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第15版，Easton：Mack Publishing Co.，1405-1412，1461-1487(1975)及The National FormularyXIV.，第14版，Washington：American Pharmaceutical Association(1975)中所述，所述文献的内容均以引用方式并入本文中。可按照所属技术中常规技术来调节所述医药组合物的pH及各组份的确切浓度。参见Goodman and Gilman′s，The Pharmacological Basisfor Therapeutics(第7版)。
可以局部或全身方式投与本发明的医药组合物。“治疗有效剂量”是预防、治愈、或至少部分地减少细菌感染症状所需本发明药剂的数量。当然，对此用途有效的数量应取决于所述疾病的严重性及受试者的重量和总体情况。通常，于活体外所用剂量可在用于就地投与所述医药组合物的数量方面提供有用的指导，且动物模型可用于确定用于治疗感染的有效剂量。各种考虑因素阐述于(例如)Langer，Science，249：1527，(1990)；Gilman等人(编辑)(1990)中，所述文献各自以引用方式并入本文中。
如本文所用：“投与治疗有效量”意欲包括对可实施医药组合物的预期治疗功能的受试者给予或施用本发明医药组合物的方法。治疗有效量可视诸如下述等因素而有所变化：受试者受感染的程度、个体的年龄、性别和体重。可对剂量方案加以调整以得到最佳治疗反应。例如，每日可投与若干分开剂量或者所述剂量可根据治疗情形的紧急程度所示按比例减少。
所述医药组合物可以常用方式投与，例如，通过注射(皮下、静脉等)、经口投与、吸入、透皮施用或经直肠投与。视投药途径而定，所述医药组合物可用一材料涂布以保护所述医药组合物免受酶、酸及其它可能会使所述医药组合物失效的自然条件的作用。所述医药组合物也可以非经常方式或经腹膜腔内投与。分散液也可在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中及在油中制备。在一般储存及使用条件下，这些制剂包含一防腐剂以防止微生物生长。
适用于可注射用途的医药组合物包括无菌水溶液(可溶于水的情况下)或分散液和用于当场制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。在各种情况下，所述组合物均应为无菌并应为可易于注射的流体状态。所述载剂可以是溶剂或分散液介质，其包含(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，及类似物质)、其适宜混合物及植物油。通过使用(例如)一诸如卵磷脂的包覆层、通过保持所需的粒径(对于分散剂而言)以及通过使用表面活性剂可保持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对氧苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、乙基汞硫代水杨酸钠以及诸如此类)可达成防止微生物的作用。在许多情况下，所述组合物中通常可包括等渗剂，例如，糖类、多元醇类(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。通过向组合物中加入可延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)可以使可注射组合物的吸收延长。
无菌可注射溶液可通过下述来制备：将所需量的医药组合物纳入含有上述一种成份或多种成份之组合(视需要而定)的适宜溶剂中，随后进行无菌过滤。一般来说，分散液通过将所述医药组合物纳入一含有基本分散介质和所需其它成份(来自那些上文所列举者)的无菌媒剂中来制备。
所述医药组合物可经口投与，例如，借助惰性稀释剂或可吸收的食用载剂。还可将所述医药组合物及其它成份封装入硬壳或软壳明胶胶囊中、压缩成片剂或直接纳入个体的饮食中。对于口服治疗投药而言，可将所述医药组合物与赋形剂一起纳入并以可吸收片剂、口含片、含片、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、糯米纸囊剂及类似剂型等形式使用。所述组合物及制剂应含有至少0.1重量％的活性化合物。当然，所述组合物及制剂的百分比可有所变化且可方便地介于约5重量％至约80重量％之间(以剂量单元计)。
所述片剂、含片、丸剂、胶囊及类似剂型还可包含下述：粘合剂，例如，黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、或明胶；赋形剂，例如，磷酸氢钙；崩解剂，例如，玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸及类似物质；润滑剂，例如，硬脂酸镁；及甜味剂，例如，蔗糖、乳糖或糖精；或矫味剂，例如，薄荷、冬青油、或樱桃调味料。当剂量单元形式为胶囊时，其除含有上述类型物质外还可包含一液体载剂。多种其它材料可作为包衣存在或其存在可另外改进剂量单元的物理形式。例如，片剂、丸剂、或胶囊可用虫胶、糖或二者涂布。糖浆或酏剂可包括所述药剂、蔗糖(作为增甜剂)、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯(作为保存剂)、染料及调味料(例如，樱桃或橙调味品)。当然，在制备任何剂量单元形式中所使用的任何材料均应具药用纯度且在所用量上是实质上无毒/生物可兼容的。此外，可将所述医药组合物纳入缓释制剂及调配物中。
因此，“药学上可接受的载剂”意欲包括溶剂、分散介质、涂布剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及类似物质。所述介质和药剂在药学上具活性的物质中的使用在所属技术中已为人所熟知。除任何常用介质或药剂与所述医药组合物不相容的情况以外，本发明涵盖所述介质和药剂在治疗组合物及治疗方法中的用途。也可将辅助活性化合物纳入所述组合物中。
以剂量单元形式来调配非经肠组合物特别有利于方便地投药及达成剂量一致性。本文所用“剂量单元形式”是指适于作为单位剂量供拟受治疗个体使用的物理分散单元；需计算包含预定量医药组合物的每一单元以与所需医药载剂一起产生期望的治疗效果。关于本发明剂量单元形式的说明与所述医药组合物的特征及欲达成特定治疗效果有关。
对主要医药组合物加以调配以方便有效地以有效量及可接受剂量单元形式与适宜药学上可接受的载剂一起投与。在含有补充活性成份的组合物中，可参照所述成份的惯用剂量及投与方式来确定给药。
用于抑制细菌有机体(例如，葡萄球菌属)中胡萝卜素形成的药剂可与常用抗生素及/或抗微生物剂组合使用。因此，本发明的医药组合物可包含胡萝卜素形成抑制剂及一种或多种额外抗微生物剂或抗生素。
本发明阐述下列实例但不应理解将其以任何方式解释为限制本发明。
实例
金黄色葡萄球菌类胡萝卜素的生物合成途径涉及分别编码脱氢角鲨烯合酶及脱氢角鲨烯去饱和酶的基因crtM及crtN的主要功能。为了探测金黄色葡萄球菌色素的生物活性，通过对crtM实施等位基因置换产生金色人类临床分离物的同基因突变体。所述ΔCrtM突变体是无色素的并缺少野生型类胡萝卜素的特征三重峰光谱(在440、462及491nM波长下)。观测到WT与ΔCrtM金黄色葡萄球菌在生长速率、固定相密度、表面电荷、浮力或疏水性方面不存在差异。金黄色葡萄球菌crtM及crtN一起足以产生4，4′-二脱辅基链孢红素(4，4′-diaponeurosporene)。为了方便地实现功能分析，使两基因在无色素酿脓链球菌(与金黄色葡萄球菌具有类似疾病谱的人类病原体)中表达。当用pCrtMN质粒转化时，酿脓链球菌获得具有类胡萝卜素光谱特征的黄色色素沉着。金黄色葡萄球菌ΔCrtM突变体与所述pCrtMN载体的互补也会部分地恢复色素沉着。
细菌、小鼠、人类CGD患者及化学试剂：野生型金黄色葡萄球菌菌株(Pigl)，自患特应性皮炎的儿童的皮肤分离得。酿脓链球菌菌株5448是一种经充分定性的M1T1血清型临床分离物18。GD1及C57B1/6小鼠是自Charles River购得。gp91Phox-/-小鼠是在Veteran′s Administration Medical Center，San Diego饲喂并维持甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异噁唑预防直至实验前3天。使金黄色葡萄球菌及酿脓链球菌在Todd-Hewitt肉汤(THB)中或在THB琼脂(Difco，Detroit，MI)上繁殖。除非另有说明，否则所有实验均用源自金黄色葡萄球36-48小时固定相培养物或酿脓链球菌24小时固定相培养物(此时色素沉着表现型清晰可见)的细菌实施。
人类CGD患者：患者为具有gp47phox缺陷(外显子2中存在纯合ΔGT缺失)的18周岁女性。在研究时，她的健康状况良好且通过皮下注射每周三次仅对她投与药物干扰素-γ(50mcg/m2)。
缺乏类胡萝卜素的金黄色葡萄球菌突变体，ΔCrtM的产生。借助如对酿脓链球菌19或无乳链球菌20所述基于PCR的方法(其中有少许变动)用氯霉素乙酰基转移酶(cat)弹夹对金黄色葡萄球菌crtM基因实施精确的框内等位基因置换。根据公开的金黄色葡萄球菌crtMN序列6交叉参照基因组金黄色葡萄球菌菌株N31521设计引物。使用PCR借助引物crtMupF5′-TTAGGAAGTGCATATACTTCAC-3′(SEQ ID NO：1)及crtMstartR
5′-GGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATACTAGTCCTCCTATATTGAAATG-3′(SEQ ID NO：2)在crtM上游扩增～500bp以及借助引物crtMendF5′-TACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAACAAAGTATTTAGTATTGAAGC-3′(SEQ ID NO：3)及crtMdownR 5′-GGCACCGTTATACGATCATCGT-3′(SEQ ID NO：4)恰在crtM下游扩增约500bp序列。使用分别对应于cat基因的5′及3′末端的25bp 5′突出端构建crtMstartR及crtMendF引物。随后使上游及下游PCR产物与来自pACYC184的完全cat基因的650bp扩增子(在使用引物crtMupF及crtMdownR的第二轮PCR中作为模板)组合。将所得PCR扩增子(涉及用cat对crtM实施框内替换)亚克隆到温度敏感性载体pHY304中以创造基因剔除质粒。首先将这个载体转化成受纳金黄色葡萄球菌菌株RN4220(由Dr.Paul Sullam提供)且随后通过电穿孔转化成金黄色葡萄球菌菌株Pigl。使转化体在30℃下生长，转换到不准许质粒复制的温度(40℃)，并借助示差抗生素选择及色素表现型来识别候选突变体。通过证明自最终突变体ΔCrtM分离的染色体DNA中已定位插入cat且不存在crtM的PCR反应明确地证实其中crtM等位基因的等位基因置换。
互补及异源表达研究.使用引物CrtF5′-CAGTCTAGAAATGGCATTTCAATATAGGAG-3′(SEQ ID NO：5)及CrtR5′-ATCGAGATCTCTCACATCTTTCTCTTAGAC-3′(SEQ ID NO：6)来扩增来自WT金黄色葡萄球菌菌株Pigl染色体的邻接CrtM及CrtN基因。将所述片段定向克隆到往复表达载体pDCerm19中并使用重组质粒(pCrtMN)通过电穿孔转化金黄色葡萄球菌ΔCrtM突变体及酿脓链球菌菌株5448。
金黄色葡萄球菌类胡萝卜素的光谱特性.对WT金黄色葡萄球菌Pigl及其同基因ΔCrtM突变体的固定相(48h)培养物实施甲醇萃取。使用MBA 2000光谱仪(PerkinElmer)测量萃取物的吸收率特性。
氧化剂敏感性分析.在PBS(金黄色葡萄球菌)或THB  (酿脓链球菌)中实施对氧化剂敏感性的测试。添加过氧化氢(H2O2)达1.5％最终浓度，将2×109个细菌在37℃下培育1小时，随后向骤冷残留H2O2中添加1,000U/毫升过氧化氢酶(Sigma)。将稀释液置于THA上以供计数存活cfu。对于单态氧分析而言，将108个金黄色葡萄球菌或4×108个酿脓链球菌于37℃下在24-孔培养板的各孔中于1-6μg/ml亚甲基蓝存在或不存在时并在距离100-watt光源恰好10cm处培育。通过将稀释液涂覆于THA上在1-3h后评定细菌生存率。以等同方式处理对照平板但将其包裹于铝箔中或在亚甲基蓝不存在时暴露于光，并未显示明显的细菌杀伤。
全血杀伤分析.将细菌在PBS中洗涤两次，在25μl PBS中稀释至104cfu接种量并在肝素化试管中与75μl新鲜抽取人类或小鼠血液混合。边搅动边将所述试管在37℃下培育4h，此时将稀释液涂覆于THA上以供计数存活cfu。
嗜中性粒细胞细胞内存活率分析.使用Histopaque梯度剂(Sigma)按照生产商说明自健康人类志愿者纯化嗜中性粒细胞。按照下述实施细胞内存活率分析。将细菌培养物在PBS中洗涤两次，在100μl RPMI+10％FCS中稀释达4.5×106cfu浓度并在相同介质中与3×105个嗜中性粒细胞混合(多次重复感染，MOI＝15∶1)，在700×g下离心，随后于37℃下在5％CO2培养箱中培育。在10分钟后，添加庆大霉素(Gibco)(最终浓度，对于金黄色葡萄球菌为400μg/ml且对于酿脓链球菌为100μg/ml)以杀死细胞外细菌。在特定时间点，取出试样孔的内容物，离心以使嗜中性粒细胞呈球状并洗涤以去除抗生素介质。随后在0.02％triton-X中裂解嗜中性粒细胞并通过涂覆于THA上来计算cfu。借助增加一个涉及下述的步骤重复实施若干分析：用10％自体人类血清在冰上将细菌接种物预培育15分钟。
皮下感染鼠类模型.用细菌测试菌株在10周至16周大CD-1或gp91Phox-/-小鼠的一侧(随机选择)实施皮下注射且同时用不同的菌株在对侧进行注射以供直接对比。按照产生局部金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌皮下感染的确立实验方案，洗涤、稀释细菌培养物并将其重新悬浮于PBS中，以指定接种量以1∶1与无菌Cytodex珠(Amersham)混合。每日记录损伤面积，如通过显现出的溃疡的最大长度×宽度评定。累积损伤面积是每个治疗组中所有动物在某一天的损伤面积总和。在第8天(金黄色葡萄球菌)或在第5天(酿脓链球菌)，对动物实施安乐死，切除皮肤损伤部分，在PBS中匀质化并置于THA上以供定量培养。
统计学.采用非配对Students t检验评估在氧化剂敏感性、血液杀伤和嗜中性粒细胞存活率方面的实验差异显著性。采用配对Student′s t检验评估小鼠活体内激发研究的结果。
保证.所有动物实验均由动物使用及管理UCSD委员会获准并使用公认的兽医标准实施。使用人类血液的实验由双轨UCSD人类研究保护程序(Dual Tracked UCSDHuman Research Protection Program)/CHSD IRB获准。自人类受试者获得先前知情同意。
用于浮力、表面电荷及疏水性的分析.为了测量浮力，在数个5ml玻璃试管中制备连续重叠梯度的1ml Percoll(各自为70％、60％及50％)。将1ml过夜细菌培养物置于Percoll层的顶部，在转动斗式离心机中于500×g下将所述试管离心8min并记录细菌至各Percoll中间相的迁移。为了测量表面电荷，通过离心收集细菌并在吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液(20mM，pH＝7.0)中洗涤。将1ml培养物重新悬浮于0.5ml MOPS中并测量OD600。在室温下用细胞色素C(Sigma，St.Louis，MO)以0.5mg/ml的最终浓度将细菌细胞培育15分钟。对试样进行离心(13,000×g，5min)并在530nm下定量测定残留于上清液中的细胞色素C的数量。调整细胞色素C数值以反映结合/培养物OD600＝1.0。为了测量疏水性，洗涤0.5ml金黄色葡萄球菌培养物并将其重新悬浮于1.0mlPBS中，将300μl正十六烷层铺于所述细胞悬浮液顶部，并将试管涡旋60秒。将试样在RT下培育30min以便于相分离。去除水相，并测定水相的OD600与存于PBS中培养物的OD600的比率。
蛋白酶及组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)敏感性分析.自Calbiochem购得人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶及组织蛋白酶G。用Louisiana State University Protein Facility(Martha Juban，Director)合成抗微生物肽mCRAMP。在10mM磷酸缓冲液(pH 7.2)+0.5％LB中将金黄色葡萄球菌培养物稀释(1∶2,000)达～1×106CFU/ml。将90μl此细菌悬浮液添加到96-孔板中的复制孔中。在10mM磷酸缓冲液中制备组织蛋白酶G(20及100mU/ml)、人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(12.5及50μg/ml)及鼠类CRAMP(0.4-3μM)的稀释液并将其以10μl体积添加到孔中；单独的10mM磷酸缓冲液用作阴性对照。在37℃下培育2h后，在PBS中连续地稀释每孔的25μl等份并置于THB上。以一式两份的方式实施每个实验并重复之。
吞噬吸收分析.在RT下按照生产商指导用SYTOR9(BacLightTM套组(Invitrogen，Carlsbad，CA)的一种组份)标记金黄色葡萄球菌，15min。将经标记细菌洗涤3次以去除过量染剂，随后在10％自体人类血清中用冰进行预调理10min。在MOI＝15时，向3×106纯化人类嗜中性粒细胞中添加细菌，在37℃下培育5min，随后在500×g下离心6min以使嗜中性粒细胞沉降。弃置上清液并将细胞小丸重新悬浮于15ml溴化乙锭(0.1mg/ml)存于PBS的混合物中以熄灭细胞外细菌发出的荧光。通过在荧光显微镜下直接显像来列举具有细胞内细菌的嗜中性粒细胞的百分比。以一式两份方式实施实验并重复之。借助位于UCSD Digital Imaging Core Facilty中的Delta VisionDeconvolution Microscope System(Nikon TE-200Microscope)来捕获代表性影像。
用于金黄色葡萄球菌类胡萝卜素6的生物合成途径涉及分别编码脱氢角鲨烯合酶及脱氢角鲨烯去饱和酶的基因crtM及crtN的主要功能(图1a)。为了探测金黄色葡萄球菌色素的生物活性，通过对crtM实施等位基因置换产生金色人类临床分离物的同基因突变体(图1a)。与先前报导一致，野生型(WT)菌株的色素沉着在早期生长固定相中变得明显并在36-48h时达稳定之前继续加强(图1b)。所述ΔCrtM突变体是无色素的并缺少野生型类胡萝卜素的特征三重峰光谱(在440、462及491nM波长下)(图1b)。观测到WT与ΔCrtM金黄色葡萄球菌在生长速率、固定相密度、表面电荷、浮力或疏水性方面不存在差异。(图5a-d)。金黄色葡萄球菌crtM及crtN一起足以产生4，4′-二脱辅基链孢红素3。为了方便地实现功能分析，使两基因在无色素酿脓链球菌(一种与金黄色葡萄球菌具有类似疾病谱的人类病原体)中表达。当用pCrtMN质粒转化时，酿脓链球菌获得具有类胡萝卜素光谱特征的黄色色素沉着(图1b)。金黄色葡萄球菌ΔCrtM突变体与所述pCrtMN载体的互补也会完全地恢复色素沉着(图1b)。
吞噬细胞清除病原体的一个重要作用机制是通过释放由NADPH氧化酶产生的反应性氧物质7。已经有人提出诸如那些由金黄色葡萄球菌表达者等细菌类胡萝卜素可起针对这些防御分子的保护作用8，9，10。为了以实验方式测试此保护作用，在活体外对比WT与ΔCrtM金黄色葡萄球菌对氧化剂的敏感性。如图1c及1d中所示，与WT金黄色葡萄球菌菌株相比，ΔCrtM突变体可更有效地受到过氧化氢及单态氧杀伤。与pCrtMN的互补恢复了ΔCrtM突变体抵抗单态氧杀伤的能力(图1d)。类似地，葡萄球菌色素在酿脓链球菌中的异源表达导致单态氧敏感性明显降低(图1e)。
随后借助2个体内分析系统--人类或小鼠全血存活率及与纯化人类嗜中性粒细胞的共培养物来测定所观测的金黄色葡萄球菌类胡萝卜素抗氧化剂活性是否转变为细菌对先天性免疫清除的抗性增强。与位于人类嗜中性粒细胞(图2a，图6f)及正常小鼠或人类供者之全血(图2b，e)中的细胞内无色素ΔCrtM相比，WT金黄色葡萄球菌在存活率方面明显更佳。由于WT金黄色葡萄球菌与ΔCrtM突变体的摄取是相当的，因此前一种效应不能通过吞噬速率的差别来解释(图6a)。而且由于摄取的WT及突变体菌株在氮蓝四唑鎓(NBT)还原分析中产生了类似结果，因此所述效应也不能通过造成嗜中性粒细胞氧化猝发程度变化的差异来解释(图6b)。金黄色葡萄球菌ΔCrtM突变体与pCrtMN的互补作用恢复了对小鼠全血杀伤的抗性(图2b)。同样地，表达葡萄球菌类胡萝卜素的经染色酿脓链球菌在人类嗜中性粒细胞较在亲株中显示升高存活率(图2c)。
为了验证金黄色葡萄球菌类胡萝卜素表达与增强吞噬细胞抗性之间的关系是否是其抗氧化剂性质的直接结果，于氧化猝发抑制剂二亚苯基碘鎓(DPI)存在下重复进行分析。当借助DPI抑制氧化猝发时，WT与ΔCrtM金黄色葡萄球菌在人类嗜中性粒细胞(图2d)与小鼠血液(图6d)中的存活率是相同的。Gp47Phox-/-是一种经常发现于慢性肉芽肿病(CGD)患者中的遗传性吞噬细胞氧化猝发功能缺陷，且gp91Phox-/-小鼠代表一种人类X-链接CGD的模型11。WT优于无色素ΔCrtM金黄色葡萄球菌的存活率优势仅在正常人类及小鼠(CD1或C57B1/6)的血液中表现出而在缺少NADPH氧化酶活性的人类gp47Phox-/-患者或gp91Phox-/-小鼠的血液中没有表现出(图2e，f)。
近来，据报道：由反应性氧物质产生的明显的病原体嗜中性粒细胞杀伤可在很大程度上反映通过钾离子流变化调节的颗粒蛋白酶的活化。WT与ΔCrtM金黄色葡萄球菌在对组织蛋白酶G抗微生物作用的敏感性方面无差别，且两种菌株均如先前对金黄色葡萄球菌所观测得情况一般对人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶具有抗性13(图6d)。对先天性免疫防御十分重要的哺乳动物嗜中性粒细胞的其它效应分子属于抗微生物肽的组织蛋白酶抑制素家族14。当与WT菌株相比时，缺少类胡萝卜素的金黄色葡萄球菌突变体同样对鼠类组织蛋白酶抑制素mCRAMP杀伤敏感(图6e)。这些结果表明金黄色葡萄球菌类胡萝卜素的自由基清除抗氧化剂性质在抵抗嗜中性粒细胞介导的杀伤中的主要作用。
体外及体内结果均表明金黄色葡萄球菌类胡萝卜素是必需的且足以促进氧化剂抗性及提高吞噬细胞存活率。为了评估这些观测结果对疾病发病的重大意义，已研发出适于皮下激发的鼠类模型。在这些研究中，用WT金黄色葡萄球菌菌株在一侧及用ΔCrtM突变体在对侧同时对各动物进行注射。在WT注射(106cfu)位点，小鼠出现相当大的脓肿损伤，在第4天时累积面积达80mm2；同等接种量的缺乏类胡萝卜素的突变体在对侧的注射没有产生可见的损伤(图3a)。以两种不同激发剂量(106cfu至107cfu)注射时，来自皮肤损伤的定量培养物一致地表明：在各小鼠中存活WT金黄色葡萄球菌较ΔCrtM突变体明显更多(图3a)。Phox-/-为了确证抗氧化剂作用是金黄色葡萄球菌类胡萝卜素在活体内提供保护机制的关键，对gp91Phox-/-小鼠重复实施皮下感染实验。于不存在宿主NADPH氧化酶功能时，WT及ΔCrtM突变体金黄色葡萄球菌产生类似累积损伤面积并借助定量脓肿培养物检测到没有存活率优势(图3b)。随后通过对比由表达CrtMN的酿脓链球菌产生的感染过程与仅经载体转化的对照来确定金黄色葡萄球菌类胡萝卜素足以增进细菌毒力。在图3c中，由表达类胡萝卜素的菌株产生的损伤较那些由WT菌株产生的损伤明显更大并含有更多的存活细菌。于表1中提供来自活体内实验的原始数据。表1：活体内小鼠激发研究的损伤面积及细菌培养物计数
  小鼠菌株   细菌菌株   剂量(cfu)   测试编号   损伤面积(mm2)中值/平均值   损伤面积(mm2)(范围：低-高)   损伤培养物(cfu)中值/平均值   损伤培养物(cfu)(范围：低-高)
  CD1   金黄色葡萄球菌WT   106   10   5.5/8.2   0-42   4.8×104/7.0×104   1.2×103-3.2×105
  CD1   ΔCrtM突变体   106   10   0.0/0.2   0-2   1.1×104/1.9   6.0×101-7.5
  ×104   ×104
  CD1   金黄色葡萄球菌WT   107   10   13.0/17.9   0-55   4.0×106/1.2×107   4.4×104-7.9×107
  CD1   ΔCrtM突变体   107   10   2.5/6.8   0-32   3.8×105/3.3×106   7.0×102-1.5×107
  Phox-/-   金黄色葡萄球菌WT   106   11   4.0/7.0   0-18   7.7×104/2.1×105   1.6×102-1.2×106
  Phox-/-   ΔCrtM突变体   106   11   4.0/6.6   0-20   4.1×104/1.7×105   1.5×102-1.0×106
  CD1   酿脓链球菌+仅有载体   107   14   20.0/22.4   0-75   6.4×107/1.0×109   5.0×101-1.3×1010
  CD1   酿脓链球菌+pCrtMN   107   14   6.0/7.0   0-21   1.6×107/3.3×107   5.0×101-9.0×107
倘若金黄色色素供给细菌以保护作用，则抑制胡萝卜素形成的药理剂可能会致使金黄色葡萄球菌对免疫清除更敏感。多功能氧化酶抑制剂2-二乙基氨基乙基-2，2-二苯基-戊酸酯(SKF 525-A，Calbiochem)先前已经显示可抑制金黄色葡萄球菌中的色素形成，但在那些实验中应注意δ类胡萝卜素中间体的适当残余累积。如图4a中所示，在于此试剂存在下生长的金黄色葡萄球菌WT菌株中获得色素生成的剂量依赖性降低。阻断金黄色葡萄球菌色素形成导致有机体对单态氧杀伤敏感性出现剂量依赖性增加(图4b)且其使WT金黄色葡萄球菌存活于人类全血中的能力降低(图4c)。作为对照，在平行实验中使ΔCrtM突变体暴露于SKF 525-A，对氧化剂敏感性或血液存活率没有明显作用(图4b，c)。
类胡萝卜素色素赋予的金色是人类病原体金黄色葡萄球菌的齐名特征。实施配对诱变作用与异源表达的分子遗传学分析以显示此标志表现型实际上是一种通过其抗氧化剂性质来用以保护细菌免受吞噬细胞杀伤的致病因子。在本世纪中，在社会及医院中，此重要病因的有效控制受到抗微生物剂抗性迅速发展的危害。原则上，抑制胡萝卜素形成可为并发性金黄色葡萄球菌感染治疗提供一种新颖治疗方法，其可有效地致使所述病原体对由正常宿主先天免疫防御产生的清除更敏感。
另外，WT金黄色葡萄球菌较无色素ΔCrtM在人类供者全血或正常小鼠中及在人类嗜中性粒细胞细胞内以明显更佳的方式存活。由于WT金黄色葡萄球菌与ΔCrtM突变体的摄取是相当的，因此后一种效应不能通过吞噬速率的差别来解释。而且由于摄取的WT及突变体菌株在氮蓝四唑鎓(NBT)还原分析中产生了类似结果，因此所述效应也不能通过造成嗜中性粒细胞氧化猝发程度变化的差异来解释。金黄色葡萄球菌ΔCrtM突变体与pCrtMN之间的互补恢复了对小鼠全血或人类嗜中性粒细胞杀伤的抗性。同样地，表达葡萄球菌类胡萝卜素的经染色酿脓链球菌在人类嗜中性粒细胞较在亲株中显示更高存活率。
为了验证金黄色葡萄球菌类胡萝卜素表达与增强吞噬细胞抗性之间的关系是否是其抗氧化剂性质的直接结果，于氧化猝发抑制剂二亚苯基碘鎓(DPI)存在下重复进行分析。当借助DPI抑制氧化猝发时，WT与ΔCrtM金黄色葡萄球菌在人类嗜中性粒细胞与小鼠血液中的存活率是相同的。Phox-/-gp91Phox-/-小鼠代表一种人类X-链接慢性肉芽肿病(一种遗传性吞噬细胞氧化猝发功能缺陷)的模型。Phox-/-WT优于无色素ΔCrtM金黄色葡萄球菌的存活率优势仅在正常小鼠(CD1或C57B1/6)的血液中表现出而在缺少NADPH氧化酶活性的gp91Phox-/-小鼠的血液中没有表现出。
近来，据报道：由反应性氧物质产生的明显的病原体嗜中性粒细胞杀伤可在很大程度上反映通过钾离子流变化调节的颗粒蛋白酶的活化。已确定WT与ΔCrtM金黄色葡萄球菌在对组织蛋白酶G抗微生物作用的敏感性方面无差别，且两种菌株均如先前对金黄色葡萄球菌所观测得情况一般对人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶具有抗性。对先天性免疫防御十分重要的哺乳动物嗜中性粒细胞的其它效应分子属于抗微生物肽的组织蛋白酶抑制素家族。当与WT菌株相比时，缺乏类胡萝卜素的金黄色葡萄球菌突变体同样对鼠类组织蛋白酶抑制素mCRAMP杀伤敏感。这些结果表明金黄色葡萄球菌类胡萝卜素的自由基清除抗氧化剂性质在抵抗嗜中性粒细胞介导的杀伤中的主要作用。
体外及体内结果均表明金黄色葡萄球菌类胡萝卜素是必需的且足以促进氧化剂抗性及提高吞噬细胞存活率。为了评估这些观测结果对疾病发病的重大意义，已研发出适于皮下激发的鼠类模型。在这些研究中，用WT金黄色葡萄球菌菌株在一侧及用ΔCrtM突变体在对侧同时对各动物进行注射。在WT注射位点，小鼠出现相当大的皮下脓肿；同等接种量的缺乏类胡萝卜素突变体在对侧的注射没有产生可见的损伤。来自皮肤损伤的定量培养物一致地表明：在各小鼠中存活WT金黄色葡萄球菌较ΔCrtM突变体明显更多。Phox-/-为了确证抗氧化剂作用是金黄色葡萄球菌类胡萝卜素在活体内提供保护机制的关键，对gp91Phox-/-小鼠重复实施皮下感染实验。于不存在宿主NADPH氧化酶功能时，WT及ΔCrtM突变体金黄色葡萄球菌产生类似累积损伤面积且借助定量脓肿培养物检测到没有存活率优势。而且，当酿脓链球菌感染与坏死性溃疡而非脓肿形成相关时，由表达类胡萝卜素的菌株产生的损伤较那些由WT菌株产生的损伤明显更大并含有更多的存活细菌。
倘若由金黄色色素供给细菌以保护作用，则对抑制胡萝卜素形成的药理剂进行测试以确定所述药剂是否会致使金黄色葡萄球菌对免疫清除更敏感。多功能氧化酶抑制剂2-二乙基氨基乙基-2，2-二苯基-戊酸酯(SKF 525-A，Calbiochem)先前已经显示可抑制金黄色葡萄球菌中的色素形成，且在于此试剂存在下生长的金黄色葡萄球菌WT菌株中表现出类胡萝卜素生成的剂量依赖性色素降低。阻断金黄色葡萄球菌色素形成导致有机体对单态氧杀伤敏感性出现相称的剂量依赖性增加且其于人类全血中存活的能力降低。作为对照，在平行实验中使ΔCrtM突变体暴露于SKF 525-A，对氧化剂敏感性或血液存活率没有明显作用。
尽管上文已经阐述了许多实施例及特征，但熟悉所属技术的人员应理解：在不背离本发明的教示或由随附权利要求书界定的本发明范围的情况下，可对所述实施例及特征进行若干修饰及变更。本发明的附录供进一步阐明而非限制本发明。
序列表
<110>The Regents of the University of California
     Nizet，Victor
     Liu，George
<120>用于细菌感染的抗微生物疗法
<130>1034123-000222
<140>Unassigned
<141>2006-04-17
<150>US 60/672,359
<151>2005-04-18
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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Claims (29)

1.一种治疗细菌感染的方法，其包括对遭受所述感染的受试者投与可抑制所述细菌中类胡萝卜素生成及/或活性的药剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌感染是葡萄球菌感染。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌是葡萄球菌属。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述细菌是金黄色葡萄球菌。
5.一种通过靶向类胡萝卜素来预防、治疗MRSA或改进MRSA治疗有效性的方法。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述类胡萝卜素是葡萄球菌属类胡萝卜素。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述靶向类胡萝卜素涉及胡萝卜素形成抑制剂。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述胡萝卜素形成抑制剂是多功能氧化酶抑制剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述多功能氧化酶抑制剂是选自由2-二乙基氨基乙基-2，2-二苯基-戊酸酯、2，4-二氯-6-苯基苯氧基乙基胺、2，4-二氯-6-苯基苯氧基乙基二乙基胺、及胡椒基丁醚组成的群组。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述多功能氧化酶是2-二乙基氨基乙基-2，2-二苯基-戊酸酯。
11.如权利要求1或5所述的方法，其中所述靶向或抑制类胡萝卜素包括抑制类胡萝卜素的合成、增加类胡萝卜素的降解或去除、或抵消类胡萝卜素的功能。
12.一种抑制微生物生长的方法，其包括使所述微生物与抑制有效量的胡萝卜素形成抑制剂接触。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述接触是在活体外进行。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述接触是在怀疑具有微生物的表面上进行。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述微生物包含类胡萝卜素。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述微生物是细菌。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述接触是在活体内进行。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述活体内接触是通过局部投药来进行。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述细菌是革兰氏阳性菌。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述细菌是金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。
21.如权利要求16所述的方法，其中所述细菌是革兰氏阴性菌。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述细菌是选自由大肠杆菌(E.coli)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)及鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium.)组成的群组。
23.如权利要求12所述的方法，其中所述胡萝卜素形成抑制剂是与至少一种抗生素组合投与。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述抗生素属于选自由下列组成之群组的类别：氨基糖甙类、青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类(carbapenems)、单环β-内酰胺类(monobactams)、喹诺酮类、四环素类、糖肽类、氯霉素(chloramphenicol)、克林霉素(clindamycin)、甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)、磺胺甲基异噁唑(sulfamethoxazole)、呋喃妥因(nitrofuirantoin)、利福平(rifampin)及莫匹罗星(mupirocin)。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述抗生素是选自由下列组成的群组：阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、奈替米星(netilmicin)、妥布霉素(tobramycin)、链霉素(streptomycin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、红霉素(erythromycin)、依托红霉素/琥乙红霉素/葡庚糖酸红霉素/乳糖酸红霉素/硬脂酸红霉素、青霉素G、青霉素V、甲氧西林(methicillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、替卡西林(ticarcillin)、羧苄西林(carbenicillin)、美洛西林(mezlocillin)、阿洛西林(azlocillin)、哌拉西林(piperacillin)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢唑林(cefazolin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢呋辛(cefuiroxime)、头孢尼西(cefonicid)、头孢美唑(cefmetazole)、头孢替坦(cefotetan)、头孢丙烯(cefprozil)、氯碳头孢(loracarbef)、头孢他美(cefetamet)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢吡肟(cefepime)、头孢克肟(cefixime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢磺啶(cefsulodin)、亚胺培南(imipenem)、氨曲南(aztreonam)、氟罗沙星(fleroxacin)、萘啶酸(nalidixic acid)、诺氟沙星(norfloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、西诺沙星(cinoxacin)、多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、四环素、万古霉素(vancomycin)、及替考拉宁(teicoplanin)。
26.一种组合物，其包含胡萝卜素形成抑制剂及药学上可接受的载剂。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述组合物是乳液、乳霜、凝胶、软膏或喷雾剂。
28.如权利要求40所述的组合物，其中所述组合物用于局部投药。
29.一种筛选用于治疗细菌感染的MRSA治疗剂的方法，其包括使产生类胡萝卜素的细菌与怀疑可抑制类胡萝卜素生成或活性的测试药剂接触，并测量所述药剂在氧化剂存在及不存在时的效果。
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