CN114317440A - 一种肿瘤类器官形成能力的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种肿瘤类器官形成能力的测定方法，能够动态观察所采集到的肿瘤组织（穿刺或手术标本）中癌细胞的数量、存活状态和增殖能力，并根据观察结果确定肿瘤类器官形成能力为OFP‑Ⅰ、OFP‑Ⅱ、OFP‑Ⅲ和OFP‑Ⅳ，确保经过培养所得到的形成能力为OFP‑Ⅰ和OFP‑Ⅱ的类器官为肿瘤类器官，提高了构建肿瘤类器官的可靠性，所得到的肿瘤类器官可作为细胞分子生物学、实验治疗学、肿瘤遗传学、基因组学、新药研发和药敏测试等基础和转化医学研究的理想离体实验模型。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种肿瘤类器官形成能力的测定方法。
背景技术
肿瘤类器官（Tumor organoid）是一种在半固态基质凝胶中由具有干细胞属性的肿瘤细胞形成的多细胞三维（3D）结构，因在表型和功能上完好地保留了其来源（癌细胞和癌组织）特征，故可作为离体实验模型，应用于生物医学科学研究和药物研发等领域。目前，肿瘤类器官大多是取自患者标本制成细胞悬液，离心细胞悬液富集细胞后基于Matrigel@的体外三维（3D）肿瘤类器官培养，所形成的肿瘤类器官称为患者肿瘤来源类器官（Patient-derived tumor organoid；PDO）。然而，并非所有患者的肿瘤组织都能形成肿瘤类器官（PDO），经过培养后所看到的多细胞球体也未必都有持续增殖的能力，因此有必要对组织内癌细胞的类器官形成能力（Organoid Formation Potential；OFP）加以评估，以确定具有增殖能力的肿瘤类器官。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种肿瘤类器官形成能力的测定方法。
本发明的技术解决方案是：一种肿瘤类器官形成能力的测定方法，依次按照如下步骤进行：
步骤1：收集新鲜肿瘤样本；
步骤2：对部分样本冰冻切片及苏木素/伊红组织学染色；
步骤3：判断是否有肿瘤细胞存在，是，进行步骤4，否，返回步骤1；
步骤4：将剩余样本处理成细胞悬液；
步骤5：取部分细胞悬液台盼蓝染色并记录死活细胞数；
步骤5：判断活细胞数与总细胞数相比是否大于10%，是，进行步骤6，否，剩余细胞悬液作废并返回步骤1；
步骤6：离心剩余细胞悬液富集细胞；
步骤7：基于Matrigel@的体外三维肿瘤类器官培养；
步骤8：观察并记录肿瘤类器官形成状态；
步骤9：判断一周内是否有肿瘤类器官形成，是，进行步骤10，否，确定为OFP-Ⅳ，所述OFP-Ⅳ为肿瘤类器官形成能力无；
步骤10：判断肿瘤类器官增殖是否小于一周，否，进行步骤11，是，确定为OFP-Ⅲ，所述OFP-Ⅲ为肿瘤类器官形成能力弱；
步骤11：判断肿瘤类器官增殖是否大于三周，否，确定为OFP-Ⅱ，是，确定为OFP-Ⅰ；所述OFP-Ⅰ为肿瘤类器官形成能力很强，所述OFP-Ⅱ为肿瘤类器官形成能力强。
本发明能够动态观察所采集到的肿瘤组织（穿刺或手术标本）中癌细胞的数量、存活状态和增殖能力，并根据观察结果确定肿瘤类器官形成能力为OFP-Ⅰ、OFP-Ⅱ、OFP-Ⅲ和OFP-Ⅳ，确保经过培养所得到的形成能力为OFP-Ⅰ和OFP-Ⅱ的类器官为具有增殖能力的肿瘤类器官，提高了构建肿瘤类器官的可靠性，所得到的肿瘤类器官可作为细胞分子生物学、实验治疗学、肿瘤遗传学、基因组学、新药研发和药敏测试等基础和转化医学研究的理想离体实验模型。
附图说明
图1是本发明实施例的流程图。
具体实施方式
本发明的一种肿瘤类器官形成能力的测定方法如图1所示，依次按照如下步骤进行：
步骤1：收集新鲜肿瘤样本，所述新鲜肿瘤样本即肿瘤患者穿刺或手术标本；
步骤2：对所收集的部分样本冰冻切片及苏木素/伊红（HE）组织学染色；
步骤3：根据苏木素/伊红（HE）组织学染色结果判断是否有肿瘤细胞存在，是，进行步骤4，否，返回步骤1；
步骤4：按照现有技术的方法将剩余样本处理成细胞悬液；
步骤5：取部分细胞悬液台盼蓝染色并记录死活细胞数；
步骤5：判断活细胞数与总细胞数相比是否大于10%，是，进行步骤6，否，剩余细胞悬液作废并返回步骤1；
步骤6：离心剩余细胞悬液富集细胞；
步骤7：基于Matrigel@的体外三维（3D）肿瘤类器官培养；
步骤8：光镜下定时观察并用图像记录肿瘤类器官形成状态，观察结果可通过EdU细胞增殖实验和Calcein/PI死活细胞荧光标记加以验证；
步骤9：判断一周内是否有肿瘤类器官形成，是，进行步骤10，否，确定为OFP-Ⅳ，所述OFP-Ⅳ为肿瘤类器官形成能力无（-）；
步骤10：判断肿瘤类器官增殖是否小于一周，否，进行步骤11，是，确定为OFP-Ⅲ，所述OFP-Ⅲ为肿瘤类器官形成能力弱（+）；
步骤11：判断肿瘤类器官增殖是否大于三周，否，确定为OFP-Ⅱ，是，确定为OFP-Ⅰ；所述OFP-Ⅰ为肿瘤类器官形成能力很强（+++），所述OFP-Ⅱ为肿瘤类器官形成能力强（++）。
对本发明实施而得到的肿瘤类器官形成能力评级为OFP-Ⅰ和OFP-Ⅱ的肿瘤类器官，做肿瘤标志物CD133的免疫组织化学染色和/或免疫荧光标记以及HE细胞病理学染色实验，结果均确定其为恶性表型。
Claims (1)
1.一种肿瘤类器官形成能力的测定方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
步骤1：收集新鲜肿瘤样本；
步骤2：对部分样本冰冻切片及苏木素/伊红组织学染色；
步骤3：判断是否有肿瘤细胞存在，是，进行步骤4，否，返回步骤1；
步骤4：将剩余样本处理成细胞悬液；
步骤5：取部分细胞悬液台盼蓝染色并记录死活细胞数；
步骤5：判断活细胞数与总细胞数相比是否大于10%，是，进行步骤6，否，剩余细胞悬液作废并返回步骤1；
步骤6：离心剩余细胞悬液富集细胞；
步骤7：基于Matrigel@的体外三维肿瘤类器官培养；
步骤8：观察并记录肿瘤类器官形成状态；
步骤9：判断一周内是否有肿瘤类器官形成，是，进行步骤10，否，确定为OFP-Ⅳ，所述OFP-Ⅳ为肿瘤类器官形成能力无；
步骤10：判断肿瘤类器官增殖是否小于一周，否，进行步骤11，是，确定为OFP-Ⅲ，所述OFP-Ⅲ为肿瘤类器官形成能力弱；
步骤11：判断肿瘤类器官增殖是否大于三周，否，确定为OFP-Ⅱ，是，确定为OFP-Ⅰ；所述OFP-Ⅰ为肿瘤类器官形成能力很强，所述OFP-Ⅱ为肿瘤类器官形成能力强。
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| CN (1) | CN114317440A (zh) |
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- 2021-12-28 CN CN202111618532.8A patent/CN114317440A/zh active Pending
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