JP2020022460A - 多能性哺乳動物幹細胞に由来する心筋細胞を成熟させるための培地組成物 - Google Patents

多能性哺乳動物幹細胞に由来する心筋細胞を成熟させるための培地組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】インビトロ培養で多能性胚性幹細胞に由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟を促進させる既知組成培地組成物、及びより効率的であり、心臓研究及び臨床用途に対する一般的要件を満たす成体様心筋細胞の大規模産生を助けるインビトロ培養で成体様心筋細胞を作製するための方法を提供する。【解決手段】多能性胚性幹細胞（ＰＥＳＣ）及び／又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から成体様心筋細胞を作成する方法として、アルブミン及びアスコルビン酸を含む水性培地組成物中でＰＥＳＣ又はｉＰＳＣを胎児様心筋細胞に分化させるステップと、甲状腺ホルモン様化合物、脂質混合物、およびカルニチン化合物を含む水性培地組成物からなる培地組成物に胎児様心筋細胞を接触させるステップを含む方法を開示する。【選択図】図２−１

Description

本発明は、広義には細胞培養及び幹細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、多能性胚性幹細胞（ＰＥＳＣ）に由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟に関する。特に、本発明は、インビトロで哺乳動物ＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞から成体様心筋細胞を作製するための既知組成組成物及び方法を提供する。本発明の幾つかの態様では、インビトロで哺乳動物ＰＥＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から成体様心筋細胞を作製するための本発明の既知組成組成物を用いる方法を提供する。本発明の既知組成培地組成物、作製した成体様心筋細胞及び方法は、創薬、薬物誘発性心毒性アッセイ、予測中毒スクリーニングアッセイ、候補薬物の前臨床スクリーニング、心血管系研究及び心疾患モデリング、再生医療、及び成人の心臓状態をモデリングまたは治療することを目的とする他の用途の分野で用いられる。
新規のより有効な薬物を必要としている医学の幾つかの領域（すなわち、メンタルヘルス、心臓学、免疫等）の進歩は、創薬パイプラインにおける幾つかの候補リード化合物に伴う望ましくない薬物誘発性副作用により生ずる異常なコストにより大幅に妨げられている。すべての薬物開発に対する現在の創薬プロセスの１つの重大な欠点は、しばしば創薬パイプラインの初期相よりも後期相で検出される薬物の予期せぬ副作用、特に心毒性作用により引き起こされるリード化合物の高い損耗率である。それ自体不心整脈として発現する恐れがある薬物誘発性心毒性の予防は、このタイプの毒性の発現は直ちに生命を脅かすので、規制当局及び（バイオ）製薬会社にとって最優先事項に相当する。臨床研究での有害な安全性事象の３３％が通常被験者に突然死または重篤な心臓系合併症をもたらす恐れがある心不整脈作用に起因していることが判明している（Ｍｏｒｄｗｉｎｋｉｎら（２０１３），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ：６（１）：２２−３０）。
従って、薬物開発／創薬の従来のプロセスを改善するための、例えば薬物誘発性心毒性作用を排除するための新規なコスト効率が高い戦略が緊急要望されている。特に、薬物パイプライン開発の初期段階で薬物誘発性心毒性を予測するための緊急のまだ満たされてない要望がある。過去１０年にわたり、この目的に対してかなりの研究努力が費やされてきた。例えば、多能性幹細胞の使用、イオンチャネルアッセイ及びコンビューターによる計算ルールを含めた幾つかの生物学的モデル及びツールが開発された。特に、薬物開発中の心毒性に関連する問題を解決するための革新的な予測アッセイの開発における多能性幹細胞に由来する心筋細胞の使用が現在の興味の中心である。
多能性胚性幹細胞（ＰＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のような多能性幹細胞は、インビトロ培養で心筋細胞を作製するための細胞の可能性あるソースである。心筋細胞の使用は、開発中のすべての薬物に対する薬物誘発性毒性を予測するためのアッセイを開発するために重要なだけでなく、心臓研究のために、及び一般的に心筋細胞が新しい薬物標的を明らかにし、心臓薬の安全性を評価するために使用され得る新しい心臓薬の開発のためにも重要である。インビトロでＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣから心筋細胞を作製する能力は、他の治療手段、例えばＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来心筋細胞を例えばその必要がある患者における損傷した心組織を直接修復するために使用し得る再生医療も広げている。
薬物開発／創薬、薬物安全性アッセイ、心血管系疾患モデリング、心臓研究、再生医療及び他の生物学的目的において心筋細胞を使用できることは、あるレベルの機能特性（例えば、成体様電気生理学的パターン）及び／または遺伝子プロフィール（例えば、細胞運命特異的遺伝子マーカーの成体様発現）、及び／または形態学的態様（例えば、成体様形状及び組織学的性質）のような幾つかの表現型要件を満たさなければならないＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する心筋細胞をインビトロ培養で培養し得る能力に大きく依存している。
この点で、当業界の主な制限は、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣから心筋細胞を作製するための現在の方法及び培地組成物は、準最適であり、「現実の」事情（すなわち、成体様状態）に適した心筋細胞を必要とする用途、例えば薬物開発／創薬、薬物安全性アッセイ、心疾患モデリング、心臓研究、再生医療に対する要件を全くまたは部分的にしか適合しない結果しか生じない。これは、現在の方法及び培地組成物が胎児（胎児様）心筋細胞に同種の未熟な心筋細胞を生ずるためである。そのような心筋細胞は、薬物開発／創薬、薬物安全性アッセイ、心疾患モデリング、心臓研究、再生医療、及び典型的には成人期で生ずるが、初期の発達段階では生じない心臓状態をモデリングまたは治療することを目的とする他の目的のような用途で使用するためには不適切である。よって、これらの目的のためには、成体様（成熟）心筋細胞が未熟心筋細胞または胎児様心筋細胞よりもより適している。
従って、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣから成体様心筋細胞（未熟心筋細胞とは対照的に）を作製するための改良された方法及び培地組成物が要望されている。それ自体幹細胞のインビトロ分化でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞に由来する成体様心筋細胞を大量に（より高い収率で）産生するための改良された方法及び培地組成物も要望されている。
Ｍｏｒｄｗｉｎｋｉｎら（２０１３），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ：６（１）：２２−３０
本発明の目的は、それ自体インビトロ培養で多能性胚性幹細胞に由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟を促進させる既知組成培地組成物、及びより効率的であり、心臓研究及び臨床用途に対する一般的要件を満たす成体様心筋細胞の大規模産生を助けるインビトロ培養で成体様心筋細胞を作製するための方法を提供することにより当業界の主要な制限を解消することである。
インビトロ培養でヒト多能性胚性幹細胞（ＰＥＳＣ）に由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟に対するＴ３の効果を示す。ＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞の成熟度をα−アクチニンに対する抗体を用いて免疫組織化学（免疫蛍光）方法により評価したその形態学的特徴から明らかにした。パネルＡ及びＢは、本明細書中に教示されている、ただしＴ３を欠いている基本分化培地（対照状況１）において培養したＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞の形態学的特徴を示す。パネルＣ及びＤは、本明細書中に教示されている、ただしＴ３を欠いている培地組成物（すなわち、成熟培地組成物）（対照状況２）において培養したＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞の形態学的特徴を示す。パネルＥ及びＦは、本発明の、ただし１００ｎｇ／ｍｌのＴ３を含む培地組成物において培養したＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞の形態学的特徴を示す。パネルＢ、Ｄ及びＦはそれぞれパネルＡ、Ｃ及びＥの拡大に相当する。これらの結果から、対照状況１及び２（パネルＡ〜Ｄを参照されたい）と比較して、Ｔ３を含む本発明の培地組成物において培養したＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞（パネルＥ及びＦを参照されたい）は、細胞の極性化、改善されたサルコメア構造及び細長い形状を含めた成体心筋細胞表現型に最も類似しているかまたは最も近似している形態学的特徴を示したことが分かる。対照１（パネルＡ及びＢを参照されたい）と比較して、本明細書中に教示されている、ただしＴ３を欠いている培地組成物において培養した心筋細胞（対照２，パネルＣ及びＤを参照されたい）は、Ｔ３の存在下で観察されたもの（パネルＥ及びＦを参照されたい）よりも少ない程度に（低い効率、少ないロバスト）成体心筋細胞表現型を連想させる形態学的特徴も示した。 インビトロ培養でヒト多能性胚性幹細胞（ＰＥＳＣ）に由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟に対するＴ３の効果を示す。ＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞の成熟度をパッチクランプ法により評価したその電気生理学的特性から明らかにした。ＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞をＴ３を欠いている本明細書中に教示されている培地（対照状況，グラフの黒色バーを参照されたい）、または１００ｎｇ／ｍｌのＴ３を含む本明細書中に教示されている培地（グラフの白色バーを参照されたい）において１２日間培養した。パネルＡは最大立ち上がり速度に対するＴ３の効果を示す。パネルＢは静止膜電位に対するＴ３の効果を示す。これらの結果から、対照状況と比較して、Ｔ３で処理したＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞は、より大きい最大立ち上がり速度（パネルＡを参照されたい）、及びより低い静止膜電位（パネルＢを参照されたい）を含めた幾つかの電気生理学的パラメーターの改善を示すことが分かる。データは平均±ＳＥＭとして表す。 インビトロ培養でヒト多能性胚性幹細胞（ＰＥＳＣ）に由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟に対するＴ３の効果を示す。ＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞の成熟度をパッチクランプ法により評価したその電気生理学的特性から明らかにした。ＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞をＴ３を欠いている本明細書中に教示されている培地（対照状況，グラフの黒色バーを参照されたい）、または１００ｎｇ／ｍｌのＴ３を含む本明細書中に教示されている培地（グラフの白色バーを参照されたい）において１２日間培養した。パネルＣは活動電位の振幅に対するＴ３の効果を示す。この結果から、対照状況と比較して、Ｔ３で処理したＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞は、活動電位のより大きい振幅（パネルＣを参照されたい）の改善を示すことが分かる。データは平均±ＳＥＭとして表す。 インビトロ培養でＰＥＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟に対するＴ３の効果を示す。ＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞の成熟度をその代謝特性により明らかにし、前記代謝特性は電位差測定赤色蛍光染料である一般的にＴＭＲＭとして公知のテトラメチルローダミンメチルエステルを用いるＴＭＲＭアッセイを使用することにより評価した。ＴＭＲＭで処理すると、健康に機能しているミトコンドリアの内膜領域内にＴＭＲＭがミトコンドリア膜電位駆動で蓄積される。ＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞をＴ３を欠いている本明細書中に教示されている培地組成物（ＣＭ）（対照状況）、または１００ｎｇ／ｍｌのＴ３を含む本明細書中に教示されている培地組成物（ＣＭ）（成熟培地（ＭＭ）とも称される）において１７日間培養した。いずれの処理群もＴＭＲＭアッセイにかけた。これらの結果から、対照状況と比較して、Ｔ３で処理したＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞は高いミトコンドリア活性を示すＴＭＲＭ関連橙色蛍光の高い増加を示すことが分かる。
一般的定義
以下の説明及び実施例中に多数の用語が使用されている。その用語に与えられるべき範囲を含めた明細書及び特許請求の範囲の明瞭且つ一貫した理解を与えるために、以下の定義を提示する。本明細書中に別段の定義がない限り、すべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解しているのと同一の意味を有する。刊行物、特許出願明細書、特許文献及び他の参考文献は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書中で使用されている用語「幹細胞」は、自己再生始原細胞、非再生始原細胞及び最終分化細胞を含めた子孫細胞を産生させるべく単一細胞レベルで自己再生及び分化する能力により規定される未分化細胞を指す。幹細胞は培養で無期限に分裂する能力を有している。幹細胞は、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から各種細胞系列の機能細胞に分化する能力、移植後複数の胚葉の組織が生じる能力、及び胚盤胞に注入後実べてではないが殆どの組織に実質的に寄与する能力によっても特徴づけられる。幹細胞は体性（成体）幹細胞または胚性幹細胞として分類される。体性幹細胞は、それ自体再生（クローン）し得、その起源に由来する組織のすべての特殊化細胞型を生ずるように（ある程度の限定で）分化し得る分化組織中に見られる未分化細胞である。
本明細書中で使用されており、当業界では「ＥＳ細胞」または「ＥＳＣ」（また、ヒト起源ならば、「ｈＥＳ細胞」または「ｈＥＳＣ」）と略されている用語「胚性幹細胞」は、当業者により一般的に理解されており、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性胚性幹細胞（ＰＥＳＣ）を指す。当業者は、例えばＣｈｕｎｇ（Ｃｈｕｎｇら（２００８），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ，Ｖｏｌ．２（２）：１１３−１１７）が記載しているようにドナー胚を破壊させない方法を用いる胚性幹細胞を得る方法を理解している。
本明細書中で使用されている用語「多能性」は、当業者により一般的に理解されており、１つ以上の組織または臓器、例えば３つの胚葉：内胚葉（例えば、胃内部壁、胃腸管、肺）、中胚葉（例えば、心臓、筋肉、骨、血液、尿生殖路）、または外胚葉（例えば、表皮組織及び神経系）のいずれかを構成するすべての細胞に分化する可能性を有している多能性幹細胞の属性を指す。
本明細書中で使用されており、「ＰＥＳＣ」と略されている用語「多能性胚性幹細胞」は、初期胚に由来する多能性幹細胞を指す。ＰＥＳＣは３つの胚葉のいずれかに由来する細胞に分化し得る。ＰＥＳＣは、マーカーまたは系列特異的マーカーを使用することにより他の型の細胞と区別され得、前記マーカーにはＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＧＣＴＭ−２、ＳＳＥＡ３及びＳＳＥＡ４が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用されており、通常ｉＰＳＣと略されている用語「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞の「幹細胞性」を維持するために重要な因子を発現させることにより胚性幹細胞様状態に入るように再プログラミングされる体（成体）細胞を指す。典型的には、ｉＰＳＣは、細胞に再プログラミング因子を導入するかまたは他の方法で接触させることにより非多能性細胞（すなわち、成体体細胞または最終分化細胞）、例えば線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞等から人工的に作られる。用語「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は胚性幹細胞を含まない。
本明細書中で使用されている用語「甲状腺ホルモン様化合物」は、甲状腺ホルモン（トリヨードサイロニン（Ｔ３）とも称される）、及び甲状腺ホルモンＴ３に類似しているかまたは甲状腺ホルモンＴ３の作用によく似ている化合物を指す。甲状腺ホルモン様化合物の非限定例には、甲状腺ホルモン受容体アゴニスト化合物、例えばＤＩＴＰＡ（３，５−ジヨードチロプロピオン酸またはＤＩＴＰＡとも称される）、ＧＣ−１化合物（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ製の甲状腺ホルモン受容体サブタイプβ（ＴＲｂｅｔａ）選択的アゴニストである）、ＲＯ化合物（Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製の甲状腺ホルモン受容体サブタイプβ１（ＴＲｂｅｔａ）選択的アゴニストである）、ＣＯ２３化合物（ＫａｒｏＢｉｏ製の甲状腺ホルモンサブタイプα１（ＴＲａｌｐｈａｌ）選択的アゴニストである）、ＫＢ２１１５（ＫａｒｏＢｉｏ製の甲状腺ホルモン受容体サブタイプβ（ＴＨｂｅｔａ）選択的アゴニストである）が含まれる。
本発明において、本明細書中で使用されている用語「増殖」、「増加」、または「増大」は、インビトロ培養でコントロール条件下で指数関数的に１つのＰＥＳＣまたはｉＰＳＣ（母細胞）が増殖し、分裂して、２つのＰＥＳＣまたは２つのｉＰＳＣ細胞（娘細胞）等を産生する生物学的プロセスを指す。ＰＥＳＣまたはｉＰＳＣの増殖、増大または増加のプロセス中ＰＥＳＣまたはｉＰＳＣは自己再生すると理解される。細胞の自己再生は、未分化状態を維持しながら、所与の細胞が細胞分裂の複数のサイクルを進む能力である。
本発明において、本明細書中で使用されている用語「分化」は、インビトロ培養でコントロール条件下で非特殊化ＰＥＳＣまたはｉＰＳＣが特殊化細胞、例えば心細胞（例えば、心筋細胞）、肝細胞または筋細胞の特徴を獲得する生物学的プロセスを指す。分化は、通常細胞表面に埋め込まれたタンパク質を伴うシグナル化経路を介して細胞遺伝子と細胞の外側の物理的及び化学的状態との相互作用によりコントロールされる。幾つかの実施形態では、多能性幹細胞（例えば、ＰＥＳＣまたはｉＰＳＣ）は、多能性幹細胞の胎児様心筋細胞への分化を促進するように本発明の培地組成物及び方法に曝され得る。心分化は、非限定的にＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、α−アクチニン、トロポニン及びトロポミオシンから選択されるマーカーを使用することにより検出され得る（Ｂｕｒｒｉｄｇｅら（２０１２），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０（１）：１６−２８；ＵＳ２０１３／００２９３６８）。
当業者は、幹細胞（例えば、ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ）由来心筋細胞を得るための各種方法を認識している。幹細胞を分化制御状態から取り出したとき及び／または胚葉体と称される懸濁集合体中で増殖させたとき、３つの胚葉の細胞への自然分化が生ずる。心筋細胞は中胚葉から派生し、よって幹細胞の心筋細胞への分化は中胚葉系列に向かう効率的分化を必要とする。心系列への定方向分化は、主に、例えば幹細胞由来心筋細胞を得るために幹細胞をマウスＥＮＤ−２と一緒に培養することにより、またはアクチビンＡ及びＢＭＰ４で順次処理することによりマトリゲル上に接種した幹細胞の高密度での単層培養を用いることにより（Ｌａｆｌａｍｍｅら，２００７；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５，１０１５−１０２４）、心臓発生に影響を及ぼすことが公知の増殖因子及びリプレッサーの存在下での胚葉体の形成（例えばＫｅｈａｔら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００１；１０８，４０７−４１４を参照されたい）、胚形成中の心分化に対する内胚葉の影響に対する信頼（Ｍｕｍｍｅｒｙら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３；１０７，２７３３−２７４０）を含めた幾つかの戦略により達成される。
本明細書中で使用されている用語「未分化」は、より特殊化されている細胞の特性を発現していないＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣを指す。当業者に認識されているように、用語「未分化」及び「分化」は相互に相対的である。「分化された」ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣはより特殊化した細胞の特性を有している。分化及び未分化細胞は、相対的サイズ及び形状、細胞質体積に対する核体積の比のような形態学的特性；及び分化の公知（遺伝子）マーカーの検出可能な存在のような発現特性を含めた幾つかの十分に確立されている基準により相互に区別される。
本発明において、本明細書中で使用されている用語「成熟」は、発達の未熟状態（または、胎児状態）を示すＰＥＳＣまたはｉＰＳＣに由来する分化細胞がインビトロ培養でコントロール条件下で発達の（遺伝及び形態を含めて）より機能的または完全に機能的な状態を達するために必要である生物学的プロセスを指す。従って、ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞の成熟は、胎児遺伝子／タンパク質発現、胎児形態特性及び関連する機能特性の損失、及び成体（または、成体様）または成熟細胞に関連する遺伝子発現、形態学的特性及び機能的特性の獲得を伴い得る。ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞を「成熟させる」プロセスにより、発達のより成体様または成熟状態を有しているＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来心筋細胞が生ずる。
本明細書中で使用されている用語「心筋細胞」または「心臓筋細胞」は通常心筋細胞系列細胞を指し、別段の特定がない限り心筋細胞個体発生の任意の段階の細胞に適用するために採取され得る。例えば、心筋細胞は心筋細胞前駆体細胞（未熟心筋細胞または胎児心筋細胞）及び成熟心筋細胞（成体様心筋細胞）の両方を含み得る。更に、心筋細胞はサブタイプに細分化され得るが、これらのサプタイプには心房心筋細胞、心室心筋細胞、洞房結節（ＳＡ）結節心筋細胞、末梢ＳＡ結節心筋細胞、または中心ＳＡ結節心筋細胞が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用されている用語「胎児様心筋細胞」または「未熟心筋細胞」は、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来し、成体または成体様心筋細胞に比べて所望の表現型及び／または遺伝子型を有していない心筋細胞を指す。例えば、胎児様（未熟）心筋細胞は、自動性（自発収縮）、及び／または胎児型イオンチャネル発現、及び／または胎児型電気生理学的シグナル、及び／または胎児様遺伝子発現パタ―ン、及び／または胎児型物理的表現型を示し得る。胎児様（未熟）心筋細胞は、例えばマーカーまたは系列特異的マーカーを用いることにより他の細胞型と区別され得、これらのマーカーには、ＭＹＨ６、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＭＬＣ２Ｖ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＳＩＲＰＡ、ＶＥＣＡＭ、及び発達の胎児または胎児様段階を評価するのに適している他のマーカーが含まれるが、これらに限定されない（Ｂｕｒｒｉｄｇｅら（２０１２），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０（１）：１６−２８）。代謝的成熟度は当業者に公知の方法により、例えば表現型で形態、遺伝子発現、代謝マーカー、細胞表面マーカー、電気生理学的特性を見る方法、及び／または細胞の細胞機能アッセイにより調べられ得る。例えば、成熟について、「胎児」状態または心肥大状態に関連する遺伝子、例えばＮＰＰＡ（ＢＮＡ）及びＮＰＰＢ（ＢＮＰ）の少ない発現を調べることができ、好ましくは成熟している幹細胞由来心筋細胞の電気生理学的特性を調べることができ、本明細書中に詳細に検討されているようにより成体または成体様の心筋細胞特性がより成熟した幹細胞由来心筋細胞の場合見られ得る。
加えて、幹細胞由来心筋細胞の相対的成熟度は、胎児状態に関連する遺伝子、例えばＮＰＰＡ、ＮＰＰＢ、平滑筋アクチン及び骨格アクチンの少ない発現、または成体遺伝子／タンパク質、例えばミオシン軽鎖２Ｖ、カルセケストリン及びリアノジン受容体の多い発現の存在により調べられ得る。
本明細書中で使用されている用語「成体様心筋細胞」または「成熟心筋細胞」は、成体心筋細胞に比べて所望の表現型及び／または遺伝子型を有している心筋細胞を指す。１つの実施形態では、成熟細胞は、非限定例的に成体心筋細胞、心房心筋細胞、心室心筋細胞、ＳＡ結節心筋細胞、末梢ＳＡ結節心筋細胞または中心ＳＡ結節心筋細胞の表現型及び／または遺伝子型を有している。他の実施形態では、「成体様心筋細胞」または「成熟心筋細胞」は、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞と比較したとき、より成熟した電気生理学的パターン、及び／またはより成熟したカルシウムハンドリングパターン、及び／またはより成体型のイオンチャネル発現、及び／またはより成体型の電気生理学的シグナル、及び／またはより成体様の収縮特性、及び／またはより成体様の遺伝子発現パターン、及び／またはより成体型の物理的（形態学的）表現型を示す。成体様心筋細胞は、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞では少なくしかまたは不十分にしか発現しない特徴である筋原線維組織及びサルコメア線条も高度に有し得る。
当業者は、例えば特定の発達段階に適切な公知の心筋細胞特異的マーカーまたは系列特異的マーカー、及び成体様（成熟）心筋細胞を胎児様（未熟）心筋細胞と区別するように当業界で利用可能な方法を用いることにより、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来心筋細胞の成熟度を評価する方法を知っている。本発明において、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来心筋細胞の成熟度を評価するための１つの方法は、非限定的に例示されるＮＰＰＡ、ＮＰＰＢ、平滑筋アクチン及び骨格アクチンのような胎児（未熟）状態に関連する遺伝子マーカーの発現を評価することである。１つ以上の胎児（未熟）マーカーの低い（遺伝子）発現は成体様（成熟）状態を示す。インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来心筋細胞の成熟度を評価するための別の方法は、非限定的に例示されるミオシン軽鎖２Ｖ、カルセケストリン及びリアノジン受容体のような成体様（成熟）状態に関連する遺伝子マーカーの発現を評価することである。１つ以上の成体様（成熟）マーカーの高い（遺伝子）発現は成体様（成熟）状態を示す（Ｂｕｒｒｉｄｇｅら（２０１２），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０（１）：１６−２８）。
インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来心筋細胞の成熟度を評価するための別の方法は、その電気生理学的特性、例えば細胞のインビトロで活動電位を形成及び／または伝搬させる能力を評価することである。インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来心筋細胞の電気生理学的成熟度は、例えば他の方法の中でパッチクランプ法により評価され得る。胎児様（未熟）電気生理学的表現型と比較して成体様（成熟）電気生理学的表現型を示す変化には、成体心筋細胞の品質証明である上昇した最大立ち上がり速度、より低い静止膜電位及び活動電位のより大きい振幅が非限定的に含まれる。
インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来心筋細胞の成熟度を評価するための別の方法は、その代謝プロフィール、例えばインビトロ培養でのミトコンドリア活性を評価することである。インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来心筋細胞の代謝プロフィールの成熟度は、例えば（他の方法の中で）一般的にＴＭＲＭとして公知の電位差測定赤色蛍光染料のテトラメチルローダミンメチルエステルを利用するＴＭＲＭアッセイを用いることにより評価され得る。ＴＭＲＭで処理すると、健康的に機能しているミトコンドリアの内膜領域内にＴＭＲＭがミトコンドリア膜電位駆動により蓄積する。胎児様（未熟）代謝プロフィールと比較して成体様（成熟）代謝プロフィールを示す特徴的な変化の非限定例は、胎児様（未熟）ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する成体様（成熟）心筋細胞のミトコンドリア中のより多くのＴＭＲＭの蓄積であり、これはＴＭＲＭアッセイにおけるＴＭＲＭ関連橙色蛍光の増加により検出される。
インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来心筋細胞の成熟度を評価するための別の方法は、その形態学的特徴、例えば細胞骨格の形状及び／または超構造組織を評価することである。インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来心筋細胞の形態学的特徴の成熟度は、（他の方法の中で）例えば免疫蛍光（Ｃｙ３またはＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ６４７）及びα−アクチニンのような細胞骨格の不可欠成分に対する抗体を用いる免疫組織化学的方法により評価され得る。胎児様（未熟）代謝プロフィールと比較して成体様（成熟）形態学的特徴を示す特徴的変化の非限定例は細胞のより大きい極性化、改善されたサルコメア組織及び細長い形状である。
本発明において、本明細書中で使用されている用語「マーカー」または「系列特異的マーカー」は、当該系列の細胞の表現型に特異的に関連している特性を指し、未定型細胞の当該系列への分化を評価するために使用され得る。例えば、「マーカー」または「系列特異的マーカー」は、当該細胞において差別的に発現される核酸またはポリペプチド分子を指し得る。マーカー核酸またはポリペプチドの検出可能なレベルは、当該細胞が当業界で公知の各種方法を用いて同定され、他の細胞から区別され得るように他の細胞と比較して当該細胞において十分により高いか低い。
本明細書中で使用されている用語「水性組成物」は、水を主成分とする組成物、または溶媒が水である組成物を指す。例えば、水性組成物は水溶性物質を水中に溶解させることにより得られ得る。
本明細書中で使用されている用語「固体組成物」は固体形態の組成物を指す。用語「固体組成物」は半液体形態または半固体形態である組成物も包含する。例えば、固体組成物は粉末、顆粒、錠剤、ペースト、ピューレ、ウェット混合物、ペレット、凍結乾燥形態、フリーズドライ形態等の形態であり得る。本発明の幾つかの実施形態では、固体組成物は、本明細書中に教示されている水性組成物を得るために適量の溶媒、例えば水中に溶解され得る。
本明細書中で使用されている用語「脂質」は、脂肪、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫ）、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質等を含む分子の群を指す。脂質は、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質及び（ケトアシルサブユニットの縮合により誘導される）ポリケチド；並びにステロール脂質及び（イソプレンサブユニットの縮合により誘導される）プレノール脂質を含めた幾つかのカテゴリーに分類され得る。用語「脂質」は、分子、例えば脂肪酸及びその誘導体（例えば、トリ−、ジ−、モノグリセリド、及びリン脂質）、及びコレステロールのような他のステロール含有代謝物をも包含する。脂質の更なる非限定例には、リノレン酸、リノール酸、パルミチン酸、アラキドン酸、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、トゥイーン８０等が含まれる。本明細書中で使用されている用語「脂質混合物」は少なくとも２つ以上の脂質の組合せを指す。
本明細書中で使用されている用語「無血清培地」は当業者により一般的に理解されており、実質的に血清を含まない培地を指す。定義によれば、無血清培地は成分として全血清を欠いているが、血清由来産物が完全に除外されていなくてもよい。例えば、高純度アルブミン、例えばウシまたはヒト（組換え）アルブミンを無血清培地中に含めてもよい。例えば、最高１０重量％、好ましくは最高５重量％、更により好ましくは最高２重量％、最高１重量％、最高０．５重量％、最も好ましくは最高０．２５重量
％のアルブミンを含み得、例えばＢｏｖｏｇｅｎ（オーストラリア国キラー・イーストＶＩＣ ３０３３，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ａｖｅ）製のＢｏｖｏｓｔａｒ ＢＳＡからなり得る。血清の使用に対する技術的欠点には、既知ではない血清の種類、組成のバッチ間変動及び汚染のリスクが含まれる。高純度アルブミンのような既知の血清由来産物を存在させることにより、上記欠点が無血清培地中に再導入されない。
本明細書中で使用されている用語「哺乳動物」は、哺乳網のメンバーを指し、この中には、非限定的にヒト及び非ヒト霊長類、例えばチンパンジー及び他の類人猿、及び他のサル種；家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ；愛玩哺乳動物、例えばイヌ及びネコ；実験動物、例えばマウス、ラット及びモルモットを含めた齧歯類等が含まれる。この用語は特定の年齢または性別を示さない。よって、雄または雌に関係なく、成体、新生被験者及び胎児がこの用語の範囲に含まれると意図される。
本明細書中で使用されている単数形の用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り複数形を含む。例えば、「ａ」ＤＮＡ分子を単離するための方法は、複数の分子（例えば、１０個、１００個、１０００個、１万個、１０万個、１００万個またはそれ以上の分子）を単離することを含む。
本明細書中で使用されており、具体的に記述されていないが、文脈上明白でない限り、用語「約」は当業界で一般公差の範囲内、例えば平均の２標準偏差の範囲内と理解される。約は記述されている値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％の範囲内である。
本明細書中で使用されている用語「及び／または」は、１つ以上の記述されている事例が単独で、または記述されている事例の少なくとも１つ、最大すべてと一緒に起こり得る状況を指す。
本明細書中で使用されている用語「少なくとも」は、具体的な値がその具体的な値と同一であるかまたはそれ以上である状況を指す。例えば、「少なくとも２」は、「２以上」と同一、すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５…等であると理解される。
本明細書中で使用されている用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用形は、単語の後の事項が含まれるが、具体的に挙げられていない事項が排除されないことを意味すべくその用語が非限定的な意味で使用されることを指す。より限定的動詞「からなる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」も含む。加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の言及は、文脈上１つの要素または要素のうち１つしか存在しないことが明確に要求されている場合を除き、要素の２つ以上が存在する可能性を排除しない。よって、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は通常「少なくとも１つ」を意味する。更に、本明細書中で「配列」を言及するとき、通常サブユニットのある配列を有する実際の物理的分子（例えば、アミノ酸）を言及すると理解される。
本明細書中で使用されている用語「従来技術」は、本発明の方法において使用される従来技術を実施する方法が当業者に明白である状況を指す。分子生物学、生化学、細胞培養、ゲノム科学、配列決定及び関連分野における従来技術の実施は当業者に公知であり、例えば以下の文献：Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，出版社：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＬＴＤ，編集者（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｓ．，Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｅｇｇａｎ，Ｋ．）Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ（２００７）；Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ（第２版），Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｓ．，ａｎｄ Ｌｏｒｉｎｇ，Ｊ．Ｆ．（２０１２）で検討されている。
別段の定めがない限り、本明細書中で使用されている用語「一般科学用語」は、本発明が属する当業者が一般的に理解しているのと同一の意味を有する本明細書中で使用されている技術的及び科学的用語を指す。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）；Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第４版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１）は、当業者に対して本明細書中で使用されている多くの用語に対する一般的ガイドを与える。当業者は、本発明を実施する際に使用され得る本明細書中に記載されている方法及び材料に類似または均等の多くの方法及び材料を認識している。実際、本発明は決して記載されている方法及び材料に限定されない。
本明細書中で使用されている用語「未満」、「以下」等は、０〜示されている値を含めたその値までの範囲を指す。例えば、「１０未満」または「１０以下」は０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０と理解される。
本明細書を通じて、例えば用語「２．５μｇ／ｍｌのコレステロール」が記述されているとき、当業者は「２．５μｇ／ｍｌのコレステロール」は２．５μｇのコレステロール／ｍｌの培地を指すことを意味する。
本明細書中で使用されている用語「三次元培養」は当業者により一般的に理解されており、３次元組織形成を助けることができる人工構造物に細胞を移植または接種する細胞の培養方法を指す。典型的にはスキャフォールドと呼ばれているこれらの構造物はインビボ環境を反復し、細胞がそれ自身のミクロ環境に影響を与えるためにエクスビボ及びインビトロで重要である。
本明細書中で使用されている用語「等張液」は、その有効オスモル濃度が比較対照の別の溶液の溶質濃度、または別の細胞及び／または組織と同一である溶液を指す。これは、例えば水及び全溶質分子の濃度が細胞含有物と外液において同一であるときに生ずる。水分子は血漿膜を介して両方向に拡散し、水拡散速度が両方で同一であるので細胞は水を得ることも失うこともない。本発明において、等張性組成物は、外液と本発明の組成物を用いて保存、輸送または貯蔵しようとする細胞の細胞含有物において、または本発明の組成物を用いて保存、輸送及び／または貯蔵しようとする組織及び／または臓器の一部である細胞の細胞含有物において同一である溶液を指す。
本明細書中で使用されている用語「被験者」は任意の脊椎動物を指すが、典型的には哺乳動物、例えばヒト患者、愛玩動物（例えば、イヌまたはネコ）、家畜（例えば、ウマ、ウシまたはヒツジ）、または実験動物（例えば、ラット、マウス、非ヒト霊長類またはモルモット）に関する。好ましい実施形態では、被験者はヒト、好ましくは成人である。
本発明の培地組成物
第１の態様において、本発明は水ベースの水性培地組成物に関する。特に、本発明は、本質的に無血清であり且つ甲状腺ホルモン様化合物、脂質混合物及びカルニチン化合物を含む培地組成物に関する。
本発明の培地組成物を作製する場合、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟及び維持を助ける能力の血清のロット間変動を避けるために、（既知組成）無血清培地を使用することが特に有利であり得る。（既知組成）無血清培地の使用は、結果の再現性を確保し、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞を成熟させることにより得られる成体様（成熟）心筋細胞の収率及び品質を維持するためにも有利である。（既知組成）無血清培地の使用は、起こりうる病原体汚染のリスクを避け、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様心筋細胞の免疫原性を低下させるためにも望ましい。既知組成無血清培地は当業界で公知であり、市販されている。当業者は、本発明の培地組成物を作製するために好適な（既知組成）無血清培地の選択方法を知っている。市販されている（既知組成）無血清培地の非限定例には、Ｆ−１２栄養混合物（ハム）、Ｆ−１０栄養混合物、リーボビッツＬ−１５、マッコイズ５Ａ、ＭＣＤＢ １３１、Ｇ−ＭＥＭ、改良ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ−１６４０、ウェィマスＭＢ ７５２／１、ウィルアム培地Ｅ、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉａ １９９、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、最少必須培地（ＭＥＭ）、ＢＧＪｂ（フィットン−ジャクソン改変）、ＣＭＲＬ、ＢＭＥが含まれる。１つ以上の既知組成無血清培地の混合物を本発明の培地組成物中に使用し得る。２つの既知組成無血清培地の混合物の非限定例は、例えばＩＭＤＭ及びＦ１２栄養（Ｈａｍ）を含む混合物である。前記混合物は本発明の培地組成物を作製するために特に適していることが分かった。
本発明者は、本発明の培地組成物中に甲状腺ホルモン様化合物を添加すると、インビトロ培養でＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞から得た心筋細胞の成熟が大きく促進し、改善することを知見した。具体的には、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞を少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物に曝すと、電気生理学的及び機械的属性の高い成熟（例えば、成体様活動電位、より低い静止膜電位及び心筋細胞のより強い律動性収縮）が生じたことが知見された。カルシウムホメオスタシス（すなわち、カルシウム電流）の高い成熟、心筋細胞の超微細構造組織の高い成熟（すなわち、成体表現型に似ている組織化線状パターンの外観及び細長い形状）、並びに代謝プロフィール（例えば、高いミトコンドリア活性）及び成体段階特異的遺伝子マーカー（例えば、トロポニンＩ及びαアクチニン等）の検出のような成体または成体様（成熟）心筋細胞表現型に特有の他の特性の高い成熟も検出され得る。
驚くことに、本発明者は、本発明の培地組成物中に少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を添加すると、甲状腺ホルモン様化合物が本発明の培地組成物中に存在していない状況と比較して、インビトロ培養でＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様（成熟）心筋細胞の生存が強化されることを知見した。この効果により、本発明の方法により得られ得るインビトロ培養でＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様心筋細胞の収率も全体的に増加したことが観察された。
本発明の培地を作製するために好適な甲状腺ホルモン様化合物には、Ｔ３、Ｔ４（５’−ヨージナーゼによりＴ３に変換され得る甲状腺ホルモンである，以下を参照されたい）、ＤＩＴＰＡ及び甲状腺ホルモンアゴニスト化合物（例えば、ＧＣ−１化合物、ＲＯ化合物、ＣＯ２３化合物、ＫＢ２１１５化合物等）が含まれるが、これらに限定されない。Ｔ３は個体発生中に産生される甲状腺により産生される天然に存在するチロシンベースのホルモンである。血液中の別の形態の甲状腺ホルモンは、Ｔ３よりも半減期の長いチロキシン（Ｔ４）である。血液中に放出されるＴ３に対するＴ４の比はおおよそ２０：１である。Ｔ４は細胞内でデヨージナーゼ（５’−ヨージナーゼ）により活性Ｔ３（Ｔ４よりも３〜４倍強力）に変換される。Ｔ３及びＴ４は当業界で公知であり、市販されている。
実施形態では、甲状腺様ホルモン化合物はトリヨードサイロニン（Ｔ３）及び／または３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）である。
１つの実施形態では、本発明の培地組成物は約１．０〜約１５０ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物、好ましくは約１０〜約１２５ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物、好ましくは約２５〜約１００ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物、好ましくは約３０〜約７５ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物、好ましくは約４０〜約６０ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物、好ましくは約５３〜約５５ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物を含む。
例えば、本明細書中に教示されている培地組成物及び／または本明細書中に教示されている方法及び／または本明細書中に教示されているキットにおいて使用され得る甲状腺ホルモン様化合物の濃度の非限定例は、約０．０００１〜約５００ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物、好ましくは約０．００１〜約４００ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物、好ましくは約０．０５〜約３００ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物、好ましくは約０．０７５〜約２００ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物、より好ましくは約０．０９〜約１１０ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物を含み得る。
実施形態では、本発明の培地組成物は約２５〜約１５０ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物を含む。
好ましい実施形態では、本発明の培地組成物は約５０ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物、例えば４０〜６０ｎｇ／ｍｌの甲状腺ホルモン様化合物を含む。
１つの実施形態では、本発明の培地組成物は約１．０〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＴ３、好ましくは約１０〜約１２５ｎｇ／ｍｌのＴ３、好ましくは約２５〜約１００ｎｇ／ｍｌのＴ３、好ましくは約３０〜約７５ｎｇ／ｍｌのＴ３、好ましくは約４０〜約６０ｎｇ／ｍｌのＴ３、好ましくは約５３〜約５５ｎｇ／ｍｌのＴ３を含む。
例えば、本明細書中に教示されている培地組成物及び／または本明細書中に教示されている方法及び／または本明細書中に教示されているキットにおいて使用され得る甲状腺ホルモン様化合物の濃度の非限定例は約０．０００１〜約５００ｎｇ／ｍｌのＴ３、好ましくは約０．００１〜約４００ｎｇ／ｍｌのＴ３、好ましくは約０．０５〜約３００ｎｇ／ｍｌのＴ３、好ましくは約０．０７５〜約２００ｎｇ／ｍｌのＴ３、より好ましくは約０．０９〜約１１０ｎｇ／ｍｌのＴ３を含み得る。
実施形態では、本発明の培地組成物は約２５〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＴ３を含む。
好ましい実施形態では、本発明の培地組成物は約５０ｎｇ／ｍｌのＴ３、例えば４０〜６０ｎｇ／ｍｌのＴ３を含む。
実施形態では、本発明の培地組成物は約２５ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＴ３及び／または約１μＭ〜約２μＭのＤＩＴＰＡを含む。
実施形態では、本発明の培地組成物はＴ３及びＤＩＴＰＡからなる群から選択される少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含む。
本発明の実施形態では、Ｔ３及びＤＩＴＰＡは本発明の培地組成物及び／または方法において交換できるように、または組み合わせて使用され得る。好ましい実施形態では、本発明の培地組成物及び／または方法においてＴ３が使用される。
別の実施形態では、Ｔ３及び／またはＤＩＴＰＡはＴ４、甲状腺ホルモンアゴニスト化合物（例えば、ＧＣ−１化合物、ＲＯ化合物、ＣＯ２３化合物、ＫＢ２１１５化合物等）から選択される１つ以上の甲状腺ホルモン様化合物と組み合わせて使用され得る。
別の実施形態では、本発明の培地組成物は約０．０１ｎＭ〜１０μＭのＤＩＴＰＡ、好ましくは約０．１ｎＭ〜８μＭのＤＩＴＰＡ、好ましくは約０．２ｎＭ〜６μＭのＤＩＴＰＡ、好ましくは０．３ｎＭ〜５μＭのＤＩＴＰＡ、好ましくは約０．４ｎＭ〜４μＭのＤＩＴＰＡ、好ましくは約０．５ｎＭ〜３μＭのＤＩＴＰＡ、好ましくは約０．６ｎＭ〜２μＭのＤＩＴＰＡ、より好ましくは約０．７５ｎＭ〜１．５μＭのＤＩＴＰＡを含む。
実施形態では、本発明の培地組成物は少なくとも約１ｎＭのＤＩＴＰＡ、好ましくは約１μＭのＤＩＴＰＡを含むが、好ましくは約１０μＭ以下のＤＩＴＰＡを含む。
好ましい実施形態では、本発明の組成物は約０．１〜１００ｎｇ／ｍｌのＴ３及び約１ｎＭ〜１μＭのＤＩＴＰＡを含む。
実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物はＴ３及びＤＩＴＰＡの両方を含み得る。Ｔ３及びＤＩＴＰＡの好適な量または濃度は、本明細書中に開示されている情報に基づいて当業者により決定され得る。例えば、Ｔ３及びＤＩＴＰＡの好適な濃度は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍｌのＴ３及び少なくとも約１ｎＭのＤＩＴＰＡ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌのＴ３及び約１μＭのＤＩＴＰＡであり得る。好適な濃度の別の例は少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌのＴ３及び少なくとも約１ｎＭのＤＩＴＰＡ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌのＴ３及び約１μＭのＤＩＴＰＡであり得る。
他の甲状腺ホルモン様化合物、甲状腺ホルモン誘導体及び甲状腺ホルモンの前駆体も本明細書中に教示されている本発明に従う培地組成物を作製するために使用され得るが、Ｔ３及び／またはＤＩＴＰＡが好ましい。当業者は好適で有効な甲状腺ホルモン様化合物、甲状腺ホルモン誘導体及び甲状腺ホルモンの前駆体を選択する方法も知っており、本明細書中に開示されている情報に基づいて有効な用量を決定する方法を知っている。
１つの実施形態では、脂質混合物はコレステロール、及びリノレン酸、リノール酸及びパルミチン酸から選択される１つ以上の脂質を含む。
本発明者は、本明細書中に教示されている培地組成物への脂質混合物の添加は、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様心筋細胞を成体様（成熟）に培養し、成熟させ、該成体様心筋細胞をインビトロ培地環境を用いて長期間維持するために有利であることを知見した。理論に束縛されないが、本発明の培地組成物の（既知組成）脂質混合物への添加は、ＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞が成体様（成熟）心筋細胞に成熟する天然のインビボ環境に前記培地をより一致させるようになると考えられる。本発明者は、本発明の培地組成物中に既知組成の脂質混合物を存在させると、インビトロ培養でＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞の成熟及び生存が最適化されることを知見した。本発明の培地組成物中に既知組成の脂質混合物を存在させることは、インビトロ培養でＰＥＳＣ由来胎児（未熟）心筋細胞及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞から作製した心筋細胞の成熟の際に生ずるエネルギー代謝（すなわち、ミトコンドリア代謝）の変化を助け、適合させるのに特に有利と考えられる。
好ましい実施形態では、脂質混合物はコレステロール、リノレン酸、リノール酸及びパルミチン酸を含む。コレステロール、リノレン酸及びリノール酸は当業界で公知であり、市販されている。
実施形態では、本発明の組成物の培地は約１μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌのコレステロールを含む。
実施形態では、本発明の組成物の培地は約０．０１〜５μｇ／ｍｌのコレステロール、好ましくは約０．１〜４．５μｇ／ｍｌのコレステロール、好ましくは約１．０〜４．０μｇ／ｍｌのコレステロール、好ましくは約１．５〜３．０μｇ／ｍｌのコレステロール、より好ましくは約２．０〜２．５μｇ／ｍｌのコレステロールを含む。
本発明の実施形態では、培地組成物は約０．０１〜約２０μｇ／ｍｌのリノレン酸、好ましくは約０．０４〜約１８μｇ／ｍｌのリノレン酸、好ましくは約０．０６〜約１６μｇ／ｍｌのリノレン酸、好ましくは約０．０８〜約１４μｇ／ｍｌのリノレン酸、好ましくは約０．０９〜約１２μｇ／ｍｌのリノレン酸、好ましくは約０．０９５〜約１１μｇ／ｍｌのリノレン酸、より好ましくは約０．１〜約１０μｇ／ｍｌのリノレン酸を含む。
例えば、本明細書中に教示されている培地組成物及び／または本明細書中に教示されている方法及び／または本明細書中に教示されているキットにおいて使用され得るリノレン酸の濃度の非限定例は０．００１〜０．５μｇ／ｍｌのリノレン酸、好ましくは約０．００５〜０．４μｇ／ｍｌのリノレン酸、好ましくは約０．００７５〜０．３μｇ／ｍｌのリノレン酸、好ましくは約０．０１〜０．２μｇ／ｍｌのリノレン酸、より好ましくは約０．０７５〜０．１５μｇ／ｍｌのリノレン酸を含む。
好ましい実施形態では、培地組成物は約０．１μｇ／ｍｌのリノレン酸、例えば０．０５〜０．３μｇ／ｍｌのリノレン酸を含む。
本発明の実施形態では、培地組成物は約０．０１〜約２０μｇ／ｍｌのリノール酸、好ましくは約０．０４〜約１８μｇ／ｍｌのリノール酸、好ましくは約０．０６〜約１６μｇ／ｍｌのリノール酸、好ましくは約０．０８〜約１４μｇ／ｍｌのリノール酸、好ましくは約０．０９〜約１２μｇ／ｍｌのリノール酸、好ましくは約０．０９５〜約１１μｇ／ｍｌのリノール酸、より好ましくは約０．１〜約１０μｇ／ｍｌのリノール酸を含む。
例えば、本明細書中に教示されている培地組成物及び／または本明細書中に教示されている方法及び／または本明細書中に教示されているキットにおいて使用され得るリノール酸の濃度の非限定例は約０．００１〜０．５μｇ／ｍｌのリノール酸、好ましくは約０．００５〜０．４μｇ／ｍｌのリノール酸、好ましくは約０．００７５〜０．３μｇ／ｍｌのリノール酸、好ましくは約０．０１〜０．２μｇ／ｍｌのリノール酸、より好ましくは約０．０７５〜０．１５μｇ／ｍｌのリノール酸を含む。
好ましい実施形態では、培地組成物は約０．１μｇ／ｍｌのリノール酸、例えば０．０５〜０．３μｇ／ｍｌのリノール酸を含む。
本発明の実施形態では、培地組成物は約０．０１〜約２０μｇ／ｍｌのパルミチン酸、好ましくは約０．０４〜約１８μｇ／ｍｌのパルミチン酸、好ましくは約０．０６〜約１６μｇ／ｍｌのパルミチン酸、好ましくは約０．０８〜約１４μｇ／ｍｌのパルミチン酸、好ましくは約０．０９〜約１２μｇ／ｍｌのパルミチン酸、好ましくは約０．０９５〜約１１μｇ／ｍｌのパルミチン酸、より好ましくは約０．１〜約１０μｇ／ｍｌのパルミチン酸を含む。
例えば、本明細書中に教示されている培地組成物及び／または本明細書中に教示されている方法及び／または本明細書中に教示されているキットにおいて使用され得るパルミチン酸の濃度の非限定例は約０．００１〜０．５μｇ／ｍｌのパルミチン酸、好ましくは約０．００５〜０．４μｇ／ｍｌのパルミチン酸、好ましくは約０．００７５〜０．３μｇ／ｍｌのパルミチン酸、好ましくは約０．０１〜０．２μｇ／ｍｌのパルミチン酸、より好ましくは約０．０７５〜０．１５μｇ／ｍｌのパルミチン酸を含み得る。
好ましい実施形態では、培地組成物は約０．１μｇ／ｍｌのパルミチン酸、例えば０．０５〜０．３μｇ／ｍｌのパルミチン酸を含む。
実施形態では、本発明者は、本発明の培地組成物が約２．２μｇ／ｍｌのコレステロール、約０．１μｇ／ｍｌのリノレン酸、約０．１μｇ／ｍｌのリノール酸及び約０．１μｇ／ｍｌのパルミチン酸を含んでいる場合には、本発明の培地組成物がこの特定の脂質混合物を欠いている状況と比較して、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞を成体様（成熟）心筋細胞に成熟する際特に有効であることを知見した。
実施形態では、必須ではないが、本発明の培地組成物中に他の脂質を添加することにより脂質混合物を広げることが有利であり得る。
１つの実施形態では、脂質混合物は、更にアラキドン酸、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸及びトゥイーン８０の群から選択される１つ以上の成分を含み得る。
実施形態では、脂質混合物は、更にアラキドン酸、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸及びトゥイーン８０から選択される２つ以上の脂質を含み得る。本発明者は、本明細書中に教示されている培地組成物中にアラキドン酸、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸及びトゥイーン８０から選択される２つ以上の脂質を添加すると、本明細書中に教示されている培地組成物がこの特定の脂質混合物を含有していない状況と比較して、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟を促進し、強化する能力の点でより効率的であったことを知見した。
好ましい実施形態では、脂質混合物はコレステロール、リノール酸、リノレン酸、パルミチン酸、アラキドン酸、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸及びトゥイーン８０を含む。
本発明者は、本明細書中に教示されている培地組成物中にコレステロール、リノール酸、リノレン酸、パルミチン酸、アラキドン酸、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸及びトゥイーン８０を含む脂質混合物を添加すると、本発明の培地組成物がこの特定脂質混合物を欠いている状況と比較して、成体様（成熟）心筋細胞を得るためのインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟に対して一層大きい効果が生じたことを知見した。
当業者は、本明細書中に開示されている情報を用いて適切な脂質混合物を作製する方法を知っている。コレステロール、リノール酸、リノレン酸、パルミチン酸、アラキドン酸、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸及びトゥイーン８０を含む既知組成脂質混合物は当業界で公知であり、商用業者から購入可能である。本発明のために好適である市販の脂質混合物の非限定例は、２．０ｍｇ／Ｌのアラキドン酸、２２０ｍｇ／Ｌのコレステロール、７０ｍｇ／Ｌの酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、信頼レベルのエチルアルコール１００％、１０ｍｇ／Ｌのリノール酸、１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸、１０ｍｇ／Ｌのミリスチン酸、１０ｍｇ／Ｌのオレイン酸、１０ｍｇ／Ｌのパルミチン酸、１０ｍｇ／Ｌのパルミトレイン酸、９００００ｍｇ／ＬのプルロニックＦ−６８、１０ｍｇ／Ｌのステアリン酸、２２００ｍｇ／Ｌのトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（Ｒ）を含有していることを特徴とするギブコの既知組成脂質濃厚物（カタログ番号１１９０５−０３１，量：１００ｍＬ）である。更に、類似のまたは異なる濃度で存在している脂質及びその誘導体の異なる組成物を含む他の脂質混合物も本発明の培地中に使用し得るが、本明細書中に教示されている脂質混合物を使用することが好ましい。当業者は、本発明に従う培地の本明細書中に開示されている有効性を保存するための代替脂質混合物の作製方法を知っており、個々の脂質及びその誘導体の選択方法を知っており、適切な有効用量の選択方法を知っている。
本明細書中に教示されている培地組成物を作製する際、培地組成物にカルニチンを添加することが特に有利である。理論に束縛されないが、本発明者は、カルニチンがインビトロ培養でＰＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の分化及び成熟中に生体エネルギー経路（例えば、ミトコンドリア活性）を促進させるために有利であることを知見した。
１つの実施形態では、本発明の培地組成物は約０．５ｍＭ〜約３．５ｍＭのカルニチンを含み得る。
別の実施形態では、本発明の培養組成物は約０．０１〜５ｍＭのカルニチン、好ましくは約０．１〜４ｍＭのカルニチン、好ましくは約０．５〜３ｍＭのカルニチン、好ましくは約１．０〜２．５ｍＭのカルニチン、より好ましくは約１．５〜２．２５ｍＭのカルニチンを含み得る。
１つの実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は、更にクレアチン化合物及びタウリン化合物を含み得る。
理論に束縛されないが、本発明者は、本発明の培地組成物に細胞死を予防または緩和するためにクレアチン、インビトロ培養での虚血誘発性細胞壊死及びアポトーシスを予防または緩和するためにタウリンを添加することが有利であり得ることを知見した。本発明者は、本発明の培地組成物中にＴ３、カルニチン、クレアチン及びタウリンを存在させることは、本明細書中に教示されている培地組成物中の前記組合せの存在がインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟を強化し、同時にインビトロ培養でその生存を促進する点で強力な組合せに相当することも観察した。この効果は、本明細書中に教示されている方法によりインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から得られる成体様（成熟）心筋細胞の収率の上昇（より多い数）にも関連している。
１つの実施形態では、本発明の培地組成物は約３．０ｍＭ〜約７．０ｍＭのクレアチンを含み得る。
実施形態では、本発明の培地組成物は約２．０ｍＭ〜約７．０ｍＭのタウリンを含み得る。
実施形態では、本発明の培地組成物は約１〜１０ｍＭのクレアチン、好ましくは約２〜８ｍＭのクレアチン、好ましくは約３〜７ｍＭのクレアチン、好ましくは約３．５〜６．０ｍＭのクレアチン、より好ましくは約４．５〜５．５ｍＭのクレアチンを含み得る。
実施形態では、本発明の培地組成物は約１．０〜約２５ｍＭのタウリン、好ましくは約２．０〜約２０ｍＭのタウリン、好ましくは約３〜約１５ｍＭのタウリン、好ましくは約４．０〜約１０ｍＭのタウリン、好ましくは約４．５〜約７ｍＭのタウリン、より好ましくは約５ｍＭのタウリンを含み得る。
例えば、本明細書中に教示されている培地組成物及び／または本明細書中に教示されている方法及び／または本明細書中に教示されているキットにおいて使用され得るタウリンの濃度の非限定例は約０．０１〜約５ｍＭのタウリン、好ましくは約０．１〜約４ｍＭのタウリン、好ましくは約０．５〜約３ｍＭのタウリン、好ましくは約１．０〜約２．５ｍＭのタウリン、より好ましくは約１．５〜約２．２５ｍＭのタウリンを含み得る。
好ましい実施形態では、本発明の培地組成物は約０．０１〜５ｍＭのカルニチン、好ましくは約０．１〜４ｍＭのカルニチン、好ましくは約０．５〜３ｍＭのカルニチン、好ましくは約１．０〜２．５ｍＭのカルニチン、より好ましくは約１．５〜２．２５ｍＭのカルニチン；約１〜１０ｍＭのクレアチン、好ましくは約２〜８ｍＭのクレアチン、好ましくは約３〜７ｍＭのクレアチン、好ましくは約３．５〜６．０ｍＭのクレアチン、より好ましくは約４．５〜５．５ｍＭのクレアチン；及び約１．０〜２５ｍＭのタウリン、好ましくは約２．０〜２０ｍＭのタウリン、好ましくは約３〜１５ｍＭのタウリン、好ましくは約４．０〜１０ｍＭのタウリン、好ましくは約４．５〜７ｍＭのタウリン、より好ましくは約５ｍＭのタウリンを含み得る。
本発明の好ましい実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物が約２ｍＭのカルニチン、約５ｍＭのクレアチン及び約５ｍＭのタウリンを含んでいるときに最適の結果が得られこと、Ｌ−カルニチンが本明細書中に教示されている培地組成物を作製するために特に好適であったことも知見された。
実施形態では、本発明の培地は、更に約１ｍｇ／Ｌ〜約５０ｍｇ／Ｌのインスリン、好ましくは約３ｍｇ／Ｌ〜約４０ｍｇ／Ｌのインスリン、好ましくは約５ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌのインスリン、好ましくは約７ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌのインスリン、好ましくは約９ｍｇ／Ｌ〜約１２ｍｇ／Ｌのインスリン、好ましくは約９．５ｍｇ／Ｌ〜約１０．５ｍｇ／Ｌのインスリン、より好ましくは約１０ｍｇ／Ｌのインスリンを含み得る。
別の実施形態では、本発明の培地は、更に約１ｍｇ／Ｌ〜約２５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、好ましくは約１．５ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、好ましくは約２ｍｇ／Ｌ〜約１５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、好ましくは約２．５ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、好ましくは約３ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、好ましくは約３．５ｍｇ／Ｌ〜約７ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、好ましくは約４ｍｇ／Ｌ〜約６ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、好ましくは約４．５ｍｇ／Ｌ〜約５．７ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、より好ましくは５．５ｍｇ／Ｌのトランスフェリンを含み得る。
更なる実施形態では、本発明の培地は、更に約０．００１ｍｇ／Ｌ〜約０．０１ｍｇ／Ｌのセレン（または、亜セレン酸ナトリウム）、好ましくは約０．００２ｍｇ／Ｌ〜約０．００９ｍｇ／Ｌのセレン（または、亜セレン酸ナトリウム）、好ましくは約０．００３ｍｇ／Ｌ〜約０．００８ｍｇ／Ｌのセレン（または、亜セレン酸ナトリウム）、好ましくは約０．００４ｍｇ／Ｌ〜約０．００７５ｍｇ／Ｌのセレン（または、亜セレン酸ナトリウム）、好ましくは約０．００５ｍｇ／Ｌ〜約０．００７ｍｇ／Ｌのセレン（または、亜セレン酸ナトリウム）、好ましくは約０．００６ｍｇ／Ｌ〜約０．００６９ｍｇ／Ｌのセレン（または、亜セレン酸ナトリウム）、好ましくは約０．００６５ｍｇ／Ｌ〜約０．００６８ｍｇ／Ｌのセレン（または、亜セレン酸ナトリウム）、より好ましくは約０．００６７ｍｇ／Ｌのセレン（または、亜セレン酸ナトリウム）を含み得る。
好ましい実施形態では、本発明の培地は、更に約５ｍｇ／Ｌ〜約１５ｍｇ／Ｌのインスリン、約３ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌのトランスフェリン及び約０．００５ｍｇ／Ｌ〜約０．００７５ｍｇ／Ｌのセレン（または、亜セレン酸ナトリウム）を含み得る。
好ましい実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は約１０ｍｇ／Ｌのインスリン、約５．５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン及び約０．００６７ｍｇ／Ｌのセレン（または、亜セレン酸ナトリウム）を含み得る。
インスリン、トランスフェリン及びセレンは当業界で公知であり、市販されている。インスリン、トランスフェリン及びセレンを含む市販製剤の非限定例は、１０００ｍｇ／Ｌ（０．１７ｍＭ）のインスリン、５５０ｍｇ／Ｌ（６．８７ｍＭ）のトランスフェリン、０．６７ｍｇ／Ｌ（０．００３８ｍＭ）の亜セレン酸ナトリウム、２００ｍｇ／ｍｌ（３．２７ｍＭ）のエタノールアミンを含有していることを特徴とするギブコのインスリン−トランスフェリン−セレンエタノールアミン溶液（ＩＴＳ−Ｘ）製剤（カタログ番号５１５００，量：１０ｍＬ）である。
実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は、更に１つ以上の微量元素を含み得る。本発明者は、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成熟を促進させるために、培地中に１つ以上の微量元素を存在させることが本明細書中に教示されている培地組成物が１つ以上の微量元素を欠いている状況と比較して特に有利であることを知見した。インビトロ培養でＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様（成熟）心筋細胞を長期間、例えば最長数ヶ月間維持するために、１つ以上の微量元素の存在が本明細書中に教示されている培地組成物が１つ以上の微量元素を欠いている状況と比較して有利であることも知見された。本発明者は、インビトロ培養でＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞から得た成体様（成熟）心筋細胞の収率（量）及び品質を高めるために、本明細書中に教示されている培地組成物が１つ以上の微量元素を欠いている状況と比較して１つ以上の微量元素を添加することが有利であったことも知見した。理論に束縛されないが、１つ以上の微量元素の存在は他の有利な生物学的作用の中で酸化防止活性を与える。１つ以上の微量元素をイオンまたはキレート化複合体として存在させることが好ましい。イオンは、１つの単一元素しか含まない単純イオンであり得、または２つ以上の元素を含む複合イオンであり得る。好ましくは、元素は遷移金属元素、例えばＳｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｂｒ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｐ、Ｙ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｒｂ、Ｃｅ、Ａｇ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｆ、Ｔｅ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｂｉ、Ｉｒ、Ｏｓ、Ｒｅ、Ｗ、Ｔａ及びＨｆからなる群から選択される元素であり得る。
１つの実施形態では、本発明の培地組成物はＭｎ、Ｓｉ、Ｍｂ、Ｖ、Ｎｉ、Ｓｎ、Ａｌ、Ａｇ、Ｂａ、Ｋ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆ、Ｇｅ、Ｉ、Ｒｂ及びＺｒの群から選択される微量元素の１つ以上、好ましくはすべてを含み得る。
別の実施形態では、１つ以上の微量元素はＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、モリブデン酸アンモニウム塩（（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ）、ＮＨ４ＶＯ３、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＳｎＣｌ２（無水）、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ＡｇＮＯ３、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、ＫＢｒ、ＣｄＣｌ２、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｒＣｌ３（無水）、ＮａＦ、ＧｅＯ２、ＫＩ、ＲｂＣｌ及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏから選択され得る。
好ましい実施形態では、本発明の培地組成物はＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、モリブデン酸アンモニウム塩（（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ）、ＮＨ４ＶＯ３、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＳｎＣｌ２（無水）、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ＡｇＮＯ３、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、ＫＢｒ、ＣｄＣｌ２、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｒＣｌ３（無水）、ＮａＦ、ＧｅＯ２、Ｋｌ、ＲｂＣｌ及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏを含み得る。
本明細書中に教示されている培地を作製するのに好適である微量元素処方物は当業界で公知であり、市販されている。例えば、市販されている微量元素処方物Ｂ（Ｃｏｒｎｉｎｇのカタログ番号２５−０２）及び微量元素処方物Ｃ（Ｃｏｒｎｉｎｇのカタログ番号２５−０２３）が本発明において使用され得る。本発明者は、最適の結果のためには、処方物Ｃを処方物Ｂと３０：１〜１：３０の比、好ましくは５：１〜２０：１の比、より好ましくは１０：１の比（すなわち、処方物Ｂに比して１０倍以上の処方物Ｃ）で混合することが好ましいことを知見した。当業者は微量元素混合物の調製方法及び有効な比の選択方法を知っている。例えば、処方物Ｃを処方物Ｂと１０：１の比（すなわち、処方物Ｂに比して１０倍以上の処方物Ｃ）で混合することにより生ずる微量元素混合物は、１０，０００ｍｌの培地に約０．０５ｍｌ〜５ｍｌの処方物Ｂ、好ましくは１０，０００ｍｌの培地に約０．０１〜４ｍｌの処方物Ｂ、好ましくは１０，０００ｍｌの培地に約０．５ｍｌ〜３ｍｌの処方物Ｂ、好ましくは１０，０００ｍｌの培地に０．７５ｍｌ〜２ｍｌの処方物Ｂ、より好ましくは１０，０００ｍｌの培地に約１ｍｌの処方物Ｂ；及び１，０００ｍｌの培地に約０．０５ｍｌ〜５ｍｌの処方物Ｃ、好ましくは１０００ｍｌの培地に約０．０１〜４ｍｌの処方物Ｃ、好ましくは１，０００ｍｌの培地に約０．５ｍｌ〜３ｍｌの処方物Ｃ、好ましくは１，０００ｍｌの培地に０．７５ｍｌ〜２ｍｌの処方物Ｃ、より好ましくは１，０００ｍｌの培地に約１ｍｌの処方物Ｃを１０：１のＣ：Ｂの比のような上に挙げた比で添加することにより得られ得る。他の微量元素処方物、または自家製処方物または混合物の使用により生ずる他の均等な微量元素混合物も本発明に従う培地組成物を作製するために使用し得るが、本明細書中に教示されている微量元素及び微量元素混合物が好ましい。
１つの実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は、更にポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含み得る。理論に束縛されないが、本発明者は、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞間に３次元配置の形成及び維持を促進させるために、本発明の培地組成物中にＰＶＡを存在させることが本明細書中に教示されている培地組成物がＰＶＡを欠いている状況と比較して特に有利であることを知見した。同じ作用効果がインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様（成熟）心筋細胞の場合も観察された。
ＰＶＡは当業界で公知であり、商業的に購入可能である。ＰＶＡアナログまたは誘導体も本発明に従う培地を作製するために使用され得るが、本明細書中に開示されているＰＶＡが好ましい。当業者は、適当なＰＶＡ液体形態を得るためにＰＶＡを調製し、溶解させる方法を知っている。
実施形態では、本発明の培地は、更に２ｍｇ／ｍｌ〜約７ｍｇ／ｍｌのＰＶＡを含み得る。
本発明の実施形態では、培地組成物約０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのＰＶＡ、好ましくは約３〜８ｍｇ／ｍｌのＰＶＡ、より好ましくは約４〜６ｍｇ／ｍｌのＰＶＡを含み得る。
好ましい実施形態では、培地組成物は少なくとも約１．２５ｍｇ／ｍｌのＰＶＡ、好ましくは約５ｍｇ／ｍｌのＰＶＡを含み得る。
実施形態では、本発明の培地は、更に必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、有機成分、無機塩、高純度ウシ血清アルブミン、成長サプリメント（例えば、ハムＦ１２栄養ミックス）、抗酸化剤、抗生物質、モノチオールグリセロール、グルタミン及びグルコースの群から選択される１つ以上化合物を含み得る。培地組成物は、更に生理的に許容され得る食塩液、好ましくは等張性食塩液をも含み得る。
好ましい実施形態では、本発明の培地組成物は、更にウシ血清アルブミン、グルコース、ビタミン、抗生物質、モノチオールグリセロール、グルタミン、アミノ酸及びハムＦ１２栄養ミックスを含み得る。
本発明者は、本発明の培地を作製するために標準無血清培地に比してグルコース含量が低い無血清培地を使用することが有利であり得ることを知見した。例えば、標準無血清培地は約３０００ｍｇ／Ｌのグルコース（１７．５ｍＭ）を含有している。市販されている低グルコース無血清培地は約１０００ｍｇ／Ｌのグルコース（５．５ｍＭ）を含有している。
実施形態では、そのような低グルコース無血清培地処方物が本発明の培地組成物を作製するために使用され得る。市販されている低グルコース無血清培地または他の自家製処方物の希釈物を本発明に従う培地組成物を作製する際に使用し得る。
実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は約１〜１０ｍＭのグルコース、好ましくは約２〜８ｍＭのグルコース、好ましくは３〜７ｍＭのグルコース、好ましくは４．５〜６．５ｍＭのグルコース、より好ましくは約５．０〜６．０ｍＭのグルコースを含み得る。
好ましい実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は少なくとも約１ｍＭのグルコース、約５．５ｍＭ以下のグルコースを含み得る。
更なる実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は約１０〜２００μＭのグルコース、好ましくは約２５〜１５０μＭのグルコース、より好ましくは約４５〜１２０μＭのグルコースを含み得る。好ましくは、培地組成物は少なくとも約５５μＭのグルコース、約１１１μＭ以下のグルコースを含み得る。
実施形態では、本発明の培地組成物はグルコース非含有であり得る。さらに別の実施形態では、グルコースはＤ−グルコースである。
１つの実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は液体形態、半液体形態、固体形態、または半固体形態であり得る。好ましい実施形態では、本発明の培地組成物は液体形態である。
１つの実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は、本明細書中に教示されている組成物を得るために該組成物を水溶液中に溶解し得る固体組成物、好ましくは粉末組成物であり得る。
固体形態の非限定例には、粉末、顆粒、結晶、錠剤、ペースト、ピューレ、ウェット混合物、ペレット、凍結乾燥形態、フリーズドライ形態等が含まれる。
好ましい実施形態では、固体は粉末である。
本明細書中に教示されている培地組成物は「成熟培地組成物」とも称され得る。
本明細書中に教示されている培地組成物が甲状腺ホルモン様化合物を欠いていてもよい。換言すると、上に詳記したのと同一の組成を有するが、甲状腺ホルモン様化合物が添加も存在もされていない同一培地は本明細書中に開示されている方法またはキットを用いてインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞を成熟させるために使用し得る。
本発明者は、実施例から立証され得るように、本発明のこの代替培養組成物培地（すなわち、甲状腺ホルモン様化合物を含まない）がインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞を成熟させるために使用し得ることを知見した。しかしながら、本発明者は、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様心筋細胞の成熟に対する本明細書中に教示されている、ただし甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地組成物の効果は、少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる本発明の培地組成物で達成され得る（本明細書中に教示されている）効果ほど顕著でない（低い効率、低いロバスト）ことを観察した。この代替培地、すなわち上記したのと同一の組成を有する、ただし甲状腺ホルモン様化合物が存在していない培地は、単独でまたは本明細書中に開示されている、ただし少なくとも甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる培地と一緒に使用され得る。例えば、好ましい実施形態では、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様心筋細胞を成熟させるために、胎児様心筋細胞をまず本明細書中に開示されている、ただし甲状腺ホルモン様化合物を含んでいない培地に曝し、次いで例えば１、２、３、４、５、６または７日間インキュベートした後、前記培地を本明細書中に開示されている、ただし少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる培地と交換し得る。
本発明の方法
第２の態様において、本発明は、ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ、特にＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣから分化した胎児様心筋細胞から成体様心筋細胞を作製するための方法に関し、その方法は、
（ａ）ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する１つ以上の胎児様心筋細胞を用意する段階；
（ｂ）前記胎児様心筋細胞を本明細書中に教示されている培地組成物と接触させて、前記胎児様心筋細胞を成体様心筋細胞に成熟させる段階；
を含む。
段階（ａ）では、胎児様（未熟）心筋細胞はインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣから得られ得、または市販されている細胞株のような他のソースから得られ得る。当業者は本発明の方法で使用するのに好適であるように前記胎児様（未熟）心筋細胞を得、培養する方法を知っている。
実施形態では、胎児様（未熟）心筋細胞は哺乳動物起源、例えばマウス、ラット、ウマ、イヌ、ウシまたは非ヒト霊長類等起源であり得る。
好ましい実施形態では、胎児様（未熟）心筋細胞は、例えばＣｈｕｎｇ（Ｃｈｕｎｇら（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２（２）：１１３−１１７）に記載されている方法のような方法により得られるヒト起源であり得る。
段階（ｂ）では、本明細書中で使用されている用語「接触させる」は、本明細書中に教示されている培地組成物と細胞（例えば、心筋細胞）または細胞培養物（例えば、心筋細胞培養物）との直接相互作用を指す。
１つの実施形態では、段階（ｂ）の胎児様心筋細胞を本明細書中に教示されている培地組成物と少なくとも約１日間〜最長約４週間接触させる。
実施形態では、段階（ｂ）の胎児様心筋細胞を本明細書中に教示されている培地組成物と少なくとも約１日間、好ましくは約２日間、好ましくは約３日間、好ましくは約４日間、好ましくは約５日間、好ましくは約６日間、好ましくは約７日間、好ましくは約８日間、好ましくは約９日間、好ましくは約１０日間、好ましくは約１１日間、好ましくは約１２日間、好ましくは約１３日間、好ましくは約１４日間、より好ましくは約１５日間接触させる。
実施形態では、段階（ｂ）の胎児様心筋細胞を本明細書中に教示されている培地組成物と少なくとも約３日間〜最長約１５日間接触させる。
好ましい実施形態では、段階（ｂ）の胎児様心筋細胞を本明細書中に教示されている培地組成物と約１５日間接触させる。
実施形態では、段階（ｂ）の胎児様心筋細胞をまず本明細書中に教示されている、ただし甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地組成物と例えば１〜１０日間、例えば１、２、３、４、５、６または７日間接触させた後に、少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる本明細書中に教示されている培地組成物と接触させる。例えば、段階（ｂ）の胎児様心筋細胞を本明細書中に教示されている、ただし甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地組成物において２日間培養した後、該培地組成物を本明細書中に教示されている、ただし少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物（例えば、Ｔ３）を含んでいる培地組成物と交換し、胎児様心筋細胞を本明細書中に教示されている、ただし少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる培地組成物と処理の残りの間、例えば３日目〜４日目、３日目〜５日目、３日目〜６日目、３日目〜７日目、３日目〜８日目、３日目〜９日目、３日目〜１０日目、３日目〜１１日目、３日目〜１２日目、３日目〜１３日目、３日目〜１４日目、または３日目〜１５日目接触させ得る。換言すると、本明細書中に教示されている方法を使用する成熟方法を甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地組成物を用いて開始し、その後少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる本明細書中に教示されている培地組成物を用いて継続させ得る。
本発明者は、インビトロ培養で心筋細胞の単層の形成を改善または促進させるために、まずインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様心筋細胞を本明細書中に教示されている、ただし甲状腺ホルモン様化合物を欠いている本発明の培地組成物と接触させた後、本明細書中に教示されている、ただし少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる本発明の培地組成物と接触させることが有利であり得ることを知見した。
別の実施形態では、（未分化）ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣを心筋細胞に分化することにより得た胎児様心筋細胞を漸増量の甲状腺ホルモン様化合物、例えばＴ３の条件下で培養する。換言すると、甲状腺ホルモン様化合物の濃度を（培地に添加することにより、または培地を本明細書中に開示されている、ただし前の培地と比較してより高濃度のＴ３を有している新規培地と交換することにより）ちょうどよい時に増加させる。例えば、（未分化）ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣを分化することにより得た胎児様心筋細胞をまず本明細書中に開示されている、ただし甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地を用いて例えば１、２、３または４日間（または、それ以上）培養し得る。１、２、３または４日間（または、それ以上）後に、培地を例えば１０ｎｇ／ｍｌのＴ３を有する本発明の培地と交換し、更に１、２、３または４日間（または、それ以上）培養する。次に、培地を高濃度の甲状腺ホルモン様化合物、例えばＴ３を含む本発明に従う新鮮培地と交換する。例えば、次の段階での培地組成物は５０ｎｇ／ｍｌのＴ３を含む。所望ならば、細胞を所望の日数培養するときに同一濃度の高濃度の甲状腺ホルモン様化合物を用いる追加ステップを加えてもよい。
１つの実施形態では、段階（ｂ）の胎児様心筋細胞を少なくとも２１℃の温度〜実質的に３７℃を超えない温度の本明細書中に教示されている培地組成物と接触させる。
別の実施形態では、段階（ｂ）の胎児様心筋細胞を約３０℃、好ましくは約３１℃、好ましくは約３２℃〜約３３℃、好ましくは約３４℃、好ましくは約３５℃、好ましくは約３６℃、より好ましくは約３７℃の温度の本明細書中に教示されている培地組成物と接触させる。好ましい実施形態では、段階（ｂ）の胎児様心筋細胞を約３７℃の温度の本明細書中に教示されている培地組成物と接触させる。
１つの実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物を本明細書中に教示されている処理期間にわたり毎日補充する。
好ましい実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物を本明細書中に教示されている処理期間中２日または３日毎に補充する。
実施形態では、段階（ｂ）の培地組成物は、段階（ｂ）の液体培地が得られるように水溶液中に溶解され得る固体形態、好ましくは粉末形態である。
１つの実施形態では、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様（成熟）心筋細胞の成熟度は、該成体様心筋細胞の形態学的特徴を評価し、その結果を成体被験者（または、細胞株のような他のソース）から得た成体心筋細胞の形態学的特徴、及び少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を欠いている本明細書中に教示されている培地組成物に曝されたインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の形態学的特徴と比較することにより調べられ得る。所与の細胞の形態及び外観に関する情報を得るための細胞（例えば、心筋細胞）の形態学的特徴（例えば、形状）及び／または組織学的特徴（例えば、幾つかの構造または細胞成分の存在、細胞骨格の組織化等）を評価するための方法は当業界で公知である。例えば、本発明では、特定細胞マーカーまたは心細胞の細胞骨格マーカーを検出するかまたは明らかにするために免疫組織学的方法が使用され得る。前記マーカーの代表的非限定例はα−アクチニンである。マーカーの他の非限定例には、トロポニンＣ、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ミオシン重鎖６、ミオシン重鎖７、ｍｙｂｐｃ３、ミオシン軽鎖、トロポミオシン、チチン、ミオメシン等が含まれる。
本発明者は、細胞の極性化、改善されたサルコメア構造及び細長い形状のような成体（または、成体様）段階を連想させる形態学的特徴の変化から明らかなように、少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる本明細書中に教示されている培地組成物に曝された胎児様（未熟）心筋細胞が成体様心筋細胞に成熟したことを知見した。形態学的特徴のそのような変化は、インビトロ培養での成熟プロセス中に少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物に曝されなかった胎児様（未熟）心筋細胞では余り観察されなかった。
別の実施形態では、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から本明細書中に教示されている方法により作製した成体様（成熟）心筋細胞の成熟度は、該成体様心筋細胞の機能特性を評価し、その結果を成体被験者（または、細胞株のような他のソース）から得た成体心筋細胞の機能特性、及び本明細書中に教示されている、ただし少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地組成物に曝されたインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の機能特性と比較することにより調べられ得る。所与の細胞の機能的表現型に関する情報を得るために細胞（例えば、心筋細胞）の機能特性を評価するための方法は当業界で公知である。例えば、本発明では、細胞（例えば、心筋細胞）の特定の機能または機能的表現型を検出するかまたは明らかにするために（他の方法の中で）電気生理学的方法が使用され得る。電気生理学的方法の非限定例は所謂「パッチクランプ」法である。
パッチクランプ法は、細胞中の１つまたは複数のイオンチャネルを研究することができる公知の検査方法である。この方法は各種の細胞に対して適用し得るが、興奮性細胞、例えばニューロン、心筋細胞、筋繊維及び膵臓β−細胞の研究において特に有用である。本発明において、前記方法は電気インパルスを１つの細胞から別の細胞に運ぶ細胞（例えば、心筋細胞）の能力の指標として役立つ所謂「活動電位」の特性を研究するために使用され得る。例えば、最大立ち上がり速度、活動電位持続時間、静止膜電位及び活動電位の振幅に関する情報がパッチクランプ法を使用することにより得られ得る。
本発明者は、上昇した最大立ち上がり速度、より低い静止膜電位及び活動電位のより大きい振幅のような成体（または、成体様）段階を連想させる電気生理学的特徴の変化から明らかなように、少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる本明細書中に教示されている培地組成物に曝された胎児様（未熟）心筋細胞が成体様心筋細胞に成熟したことを知見した。電気生理学的特性のそのような変化は、インビトロ培養での成熟プロセス中に少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物に曝されなかった胎児様（未熟）心筋細胞では余り観察されなかった。
更なる実施形態では、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様（成熟）心筋細胞の成熟度は、該成体様心筋細胞の代謝プロフィールを評価し、その結果を成体被験者（または、細胞株のような他のソース）から得た成体心筋細胞の代謝プロフィール、及び本明細書中に教示されている、ただし少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地組成物に曝されたインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の代謝プロフィールと比較することにより調べられ得る。所与の細胞の代謝的機能または経路の効率及び成熟度に関する情報を得るために細胞（例えば、心筋細胞）の代謝プロフィールを評価するための方法は当業界で公知である。例えば、本発明では、所与の細胞（例えば、心筋細胞）のミトコンドリア活性を検出するかまたは明らかにするために所謂「ＴＭＲＭアッセイ」を使用し得る。当業者はＴＭＲＭアッセイを周知しており、インビトロ培養で心筋細胞のミトコンドリア活性のレベルに関する情報を得るための前記アッセイの実施方法を知っている。
本発明者は、高いミトコンドリア活性のような成体（または、成体様）段階を連想させる代謝プロフィールの変化から明らかなように、少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる本明細書中に教示されている培地組成物に曝された胎児様（未熟）心筋細胞が成体様心筋細胞に成熟したことを知見した。代謝プロフィールのそのような変化は、インビトロ培養での成熟プロセス中に少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物に曝されなかった胎児様（未熟）心筋細胞ではより少ない程度しか観察されなかった。
さらに別の実施形態では、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様（成熟）心筋細胞の成熟度は、該成体様心筋細胞の遺伝子発現プロフィールを評価し、その結果を成体被験者（または、細胞株のような他のソース）から得た成体心筋細胞の遺伝子発現プロフィール、及び本明細書中に教示されている、ただし少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地組成物に曝されたインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の遺伝子発現プロフィールと比較することにより調べられ得る。所与の遺伝子マーカーの存在（不在）に関する情報を得るために、また所与の遺伝子（例えば、心筋細胞）に対する所与の遺伝子マーカーの発現レベルに関する情報を得るために、細胞（例えば、心筋細胞）の遺伝子発現プロフィールを評価する方法は当業界で公知である。例えば、本発明では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法及び／または所謂「遺伝子チップ」アッセイがある発達段階（例えば、胎児及び成体段階）に特異的な遺伝子マーカーの発現レベルを検出する及び／または測定するために使用され得る。例えば、本発明では、少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる本明細書中に教示されている培地組成物に曝されたインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞が成体様（成熟）心筋細胞に成熟したかを確証するために、成体または成体様段階を示す遺伝子マーカーが使用され得る。成体（または、成体様）段階を示す遺伝子マーカーの非限定例には、ミオシン軽鎖２Ｖ、カルセケストリン及びリアノジン受容体等が含まれる。１つ以上の成体様（成熟）マーカーの高い（遺伝子）発現は成体様（成熟）状態を示す。
インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞が成体様（成熟心筋細胞）に成熟するかしないかを確証するために、胎児様（未熟）段階を示す遺伝子マーカーも使用され得る。典型的には、本明細書中に教示されている、ただし少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地組成物に曝されたインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞は胎児様（未熟）段階を示す遺伝子マーカーを発現する。胎児様（未熟）段階を示す遺伝子マーカーの非限定例には、ＮＰＰＡ、ＮＰＰＢ、平滑筋アクチン及び骨格アクチンが含まれる。１つ以上の胎児（未熟）マーカーの低い（遺伝子）発現は成体様（成熟）状態を示す。
１つの実施形態では、本発明の方法において使用するのに好適である適量の胎児様（未熟）心筋細胞を得るために、本明細書中に教示されている方法の段階（ａ）の前に成体様心筋細胞を作製するための出発材料として未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣが使用され得る。
胎児様（未熟）心筋細胞は、未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣから、該未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣを未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣを胎児様（未熟）心筋細胞に分化するのに適している分化培地組成物に曝すことにより得られ得る。当業者は、インビトロ培養で未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣを胎児様（未熟）心筋細胞に分化するのに適している方法及び培地組成物を十分に熟知している。例えば、本発明では、未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣを胎児様（未熟）心筋細胞に分化させるのに適している基本分化培地組成物は、無血清であり且つ（組換え）アルブミン及びアスコルビン酸を含む培地組成物であり、更に脂質混合物、インスリン、トランスフェリン及びセレン、及び１つ以上の微量元素を含み得る。
別の実施形態では、本明細書中に教示されている基本分化培地組成物は、更にアミノ酸、ウシ血清アルブミン、グルコース、ビタミン、抗生物質、モノチオールグリセロール、グルタミン及び増殖因子、または小細胞（例えば、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、アクチビンＡ（ＡＣＴ−Ａ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））、Ｃｈｉｒ９９０２１（ＧＳＫ３β−インヒビター））、及び他の成分を含み得る。当業者は、未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣを本発明の方法において使用するのに好適である胎児様（未熟）心筋細胞に分化させるのに好適であるように本明細書中に教示されている基本分化培地にどの成分または物質（及び、用量）を加えるかを知っている。
本発明者は、本明細書中に教示されている、ただし甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地組成物もすぐ上に記載されている幾つか成体様特徴を発現するが、本明細書中に教示されている、ただし少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる培地組成物を用いて達成され得るよりも少ない程度（余り効率的でない、余りロバストでない）であることを知見した。
１つの実施形態では、未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣは、例えば樹立細胞株のような市販されているソースから得られ得る。当業者は、本発明の方法において使用するのに好適であるように未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣを得る方法及び培養する方法を知っている。
実施形態では、未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣは哺乳動物起源、例えばマウス、ラット、ウマ、イヌ、ウシ、非ヒト霊長類等起源であり得る。
好ましい実施形態では、未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣは、例えばＣｈｕｎｇ（Ｃｈｕｎｇら（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２（２）：１１３−１１７）に記載されている方法により得られるようなヒト起源であり得る。
１つの実施形態では、未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣは、分化プロセスをスピン胚様体（ＥＢ）において実施する方法を用いて本明細書中に教示されている方法において使用するのに好適である胎児様（未熟）心筋細胞に分化され得る。当業者はスピンＥＢにおいて実施する分化方法を周知している。
別の実施形態では、未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣは、分化プロセスを単層で実施する方法を用いて本明細書中に教示されている方法で使用するのに好適である胎児様（未熟）心筋細胞に分化され得る。当業者は単層で実施する分化方法も周知している。
本発明の培地組成物の好適な使用
第３の態様において、本発明は本明細書中に教示されている培地組成物の好適な使用に関する。
１つの実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞を本発明の方法によりインビトロ培養で成体様（成熟）心筋細胞に成熟させるのに好適である。
実施形態では、ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ細胞は哺乳動物起源、好ましくはヒト起源から得られ得る。哺乳動物起源、好ましくはヒト起源の樹立ＰＥＳＣ細胞株を使用してもよい。例えば、各種のマウスＰＥＳＣ細胞株及びヒトＰＥＳＣ細胞株は当業界で公知であり、この成長及び増殖のための条件は十分規定されている。当業者は、（ヒトまたは他の哺乳動物由来の）適当なＰＥＳＣ細胞株を例えばＣｈｕｎｇ（Ｃｈｕｎｇら（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２（２）：１１３−１１７）に記載されている方法またはＣｈｕｎｇら（上掲）の方法に類似の他の方法により得る方法を知っている。
別の実施形態では、ｉＰＳＣを使用する。当業者は、本発明の方法で使用するのに好適であるようにｉＰＳＣを得、培養する方法を知っている。
実施形態では、ｉＰＳＣは哺乳動物起源、好ましくはヒト起源であり得る。
実施形態では、本発明の培地組成物は、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様（成熟）心筋細胞を長期間、例えば１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、６週間、最長６ヶ月間維持するために使用され得る。本発明者は、本明細書中に教示されている培地組成物がインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から本明細書中に教示されている方法により作製した成体様（成熟）心筋細胞の生存を長期間にわたり強化した（すなわち、細胞死を予防または軽減した）ことを知見した。この効果は、本発明の方法によるインビトロ培養での成体様心筋細胞の高い収率（より多い量）にも関係していた。
１つの実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は、通常インビトロ細胞培養において、好ましくは３次元培養において使用するのに好適であり得る。
別の実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は、インビトロ培養でＰＥＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞及び／またはｉＰＳＣ由来胎児様（未熟）心筋細胞の成体様（成熟）心筋細胞への成熟を促進させながら、前記胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様（成熟）心筋細胞の生存を上昇または増加させるために使用され得る。実際、本発明者は、本明細書中に教示されている培地組成物がインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞の成体様心筋細胞への成熟を促進させ、改善させるだけでなく、インビトロ培養でのその生存を延長させることを驚くことに知見した。この効果が本明細書中に教示されている方法を用いるインビトロ培養での成体様心筋細胞の高い収率にも関係していることも知見された。
更なる実施形態では、本明細書中に教示されている培地組成物は、本発明の方法によりインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から作製した、または他のソースから得た成体様（成熟）心筋細胞を輸送するために使用され得る。例えば、本発明の培地組成物は、成体様（成熟）心筋細胞を容器、例えばチューブ、ペトリ皿、エッペンドルフ、フラスコ、ボトル等を用いて輸送するのに特に好適であり得る。
実施形態では、本発明の方法によりインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様（成熟）心筋細胞は、インビトロで候補薬物及び他の薬物をスクリーニングするために、例えばハイスループットスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。
別の実施形態では、本インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から発明の方法により作製した成体様（成熟）心筋細胞は、予測中毒学スクリーンアッセイにおいて使用され得る。
更なる実施形態では、本発明の方法によりインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から作製した成体様（成熟）心筋細胞は、心血管研究において使用され得る。
更に別の実施形態では、インビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞から本発明の方法により作製した成体様（成熟）心筋細胞は、心疾患または他の疾患の治療のために、及びその必要がある被験者または心血管疾患または障害を発症するリスクを有している及び／または心臓組織損傷または外傷を受けている被験者における心組織損傷または心外傷の治療のために使用され得る。
本発明の実施形態では、被験者は哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウマ等であり得る。
好ましい実施形態では、被験者はヒト被験者、好ましくは成人被験者であり得る。
心疾患及び障害の非限定例には、アテローム性動脈硬化症、卒中、先天性心疾患、鬱血性心不全、狭心症、心筋炎、冠動脈疾患、心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、心内膜炎、心筋梗塞（心臓発作）、拡張機能障害、脳血管疾患、弁疾患、高血圧（高血圧症）、僧帽弁逸脱症及び静脈血栓塞栓症が含まれるが、これらに限定されない。リスクのある被験者には、家族歴（高血圧、心臓病）、遺伝的素因（高コレステロール血症）を有しているもの、または以前心疾患または障害で苦しんでいたものが含まれる。リスクのある被験者には、更に遺伝的素因または高脂肪のような食事、または喫煙のような環境的暴露のために高血圧または高コレステロールを有しているかまたはそのリスクがあるものが含まれる。
本発明のキット
第４の態様において、本発明は、本明細書中に教示されている培地組成物を含むインビトロ培養で成体様心筋細胞を作製するのに好適なキットに関する。
実施形態では、本明細書中に教示されているキットは、更に本明細書中に教示されている、ただし甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地組成物を含み得る。
１つの実施形態では、本明細書中に教示されているキット中に含まれる本明細書中に教示されている培地組成物は液体形態で提供され得る。
別の実施形態では、本明細書中に教示されているキット中に含まれる本明細書中に教示されている培地組成物は固体形態、好ましくは粉末形態で提供され得る。
更なる実施形態では、本明細書中に教示されているキットは、更に（ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来の、好ましくはヒトの）胎児様心筋細胞を含み得る。すなわち、キットは、（ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来の）胎児様心筋細胞と一緒に少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる本明細書中に開示されている培地組成物を含み得る。または、例えば、キットは（ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来）胎児様心筋細胞及び甲状腺ホルモン様化合物を欠いている本明細書中に教示されている培地組成物と一緒に少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる本明細書中に開示されている培地組成物を含み得る。
１つの実施形態では、胎児様（未熟）心筋細胞はＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来し得、哺乳動物起源（例えば、ラット、マウス、イヌ、ウマ、ウシ及び非ヒト霊長類）、好ましくはヒト起源であり得る。
実施形態では、本明細書中に教示されているキットは、更に未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣを含み得る。
１つの実施形態では、未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣは哺乳動物起源（例えば、ラット、マウス、イヌ、ウマ、ウシ及び非ヒト霊長類）、好ましくはヒト起源から得られ得る。
別の実施形態では、本明細書中に教示されているキットは、ＰＥＣＳ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞を出発物質として用いて本発明の方法に従って成体様心筋細胞を作製する方法に関する説明書を含み得る。
別の実施形態では、本明細書中に教示されているキットは、未分化ＰＥＳＣ及び／または未分化ｉＰＳＣを出発物質として用いて本発明の方法に従って成体様心筋細胞を作製する方法に関する説明書を含み得る。
例えば、説明書は、出発物質がＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞、または未分化ＰＥＳＣ及び／または未分化ｉＰＳＣであるかに応じて、インビトロ培養で成体様（成熟）心筋細胞を培養、増大または増殖、分化、成熟、維持及び／または保存する方法を与え得る。
更に別の実施形態では、本明細書中に教示されているキットは、更にインビトロ培養で未分化ＰＥＳＣ及び／または未分化ｉＰＳＣを胎児様（未熟）心筋細胞に分化するために使用され得る本明細書中に教示されている基本分化培地組成物を含み得る。
実施形態では、本明細書中に教示されているキットの成分は適当な包装材料を用いて供給され得る。本明細書中で使用されている用語「包装材料」は、キットの成分を収容する物理的構造物を指す。包装材料は成分を滅菌状態で維持し得、その目的のために通常使用されている材料（例えば、紙、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル等）から作られ得る。例えば、本明細書中に教示されている培地組成物はバイアル、エッペンドルフプラスチックまたはガラスビン、またはその目的のために慣用されている他の適当なキャリア中に包装され得る。
本明細書中に教示されている方法により得られ得る、または他のソースから得られ得る成体様（成熟）心筋細胞は組織培養皿、チューブ、フラスコ、ローラーボトルまたはプレート（例えば、１つのマルチウェルプレートまたは皿、例えば８、１６、３２、６４、９６、３８４及び１５３６マルチウェルプレートまたは皿）、またはその目的のために慣用されている適当なキャリア中に包装され、本明細書中に教示されているキット中にそのまま含まれ得る。
１つの実施形態では、本明細書中に教示されているキットは、更に追加成分、例えば細胞増殖培地組成物、緩衝剤、保存剤、細胞安定化剤等を含み得る。
実施形態では、本明細書中に教示されているキットの各成分を個々の容器またはディスペンサー内に供給してもよく、または混合して供給してもよい。更に、別の実施形態では、本明細書中に教示されているキットの各種容器またはディスペンサーのすべてが商業的または非商業的目的に応じて１つまたは複数のパッケージ内に供給され得る。
下記実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されない。上記検討及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特性を確認することができ、本発明の教示及び範囲を逸脱することなく、各種の使用及び条件に適合させるべく本発明の各種改変及び修飾をなし得る。よって、本明細書中に示し、記載されているものに加えて、本発明の各種修飾は先の記載から当業者には自明であろう。そのような修飾も添付されている特許請求の範囲内に入ると意図される。
［実施例１］スピン胚様体（ＥＢ）の分化
ヒトＰＥＳＣ（ｈＰＥＳＣ）またはヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）を幹細胞培地において有糸分裂的に不活化させたマウス線維芽細胞上で培養し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて経代させた。幹細胞培養は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１１３２０−０３３）、２０％（ｖ／ｖ）ノックアウト血清代替物（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１０８２８−０２８）、１０ｍＭ 非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１１１４０−０５０）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号２５０３０−０８１）、２ｂ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号２１９８５−０２３）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦを含有している。
分化の１日前に、細胞をマトリゲル被覆した６ウェルプレート上で幹細胞培地において１００万個の細胞／ウェルの密度で経代させた。
細胞を胚様体（ＥＢ）中で分化させた。０日目に、細胞を収集し、本明細書中に教示されており、脂質混合物（２．２μｇ／ｍｌのコレステロール、０．１μｇ／ｍｌのリノール酸、０．１μｇ／ｍｌのリノレン酸及び０．１μｇ／ｍｌのパルミチン酸）、インスリン（１ｍｇ／Ｌ）、トランスフェリン（０．５５ｍｇ／Ｌ）、セレン（０．０００６７ｍｇ／Ｌ）、本明細書中に記載されている微量元素ミックスＢ（０．０１％）、本明細書中に記載されている微量元素ミックスＣ（０．１％）、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び３０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、４０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１．５μΜ Ｃｈｉｒ９９０２１（Ａｘｏｎ ｍｅｄｃｈｅｍ）を含む基本分化培地（無血清）中に６×１０４個の細胞／ｍｌで再懸濁した。５０μｌの量のこのミックスを９６ウェルの丸底非接着性プレートの各ウェルに入れて、３，０００個の細胞からなるＥＢを得た。３日目、７日目、１０日目、１４日目及び１７日目に、培地を増殖因子を含まない分化培地と交換した。
この方法により産生された胎児様（未熟）心筋細胞は本明細書中に教示されている本発明の方法において使用するのに好適である。すなわち、前記胎児様（未熟）心筋細胞を培地組成物及び方法を用いて成体様（成熟）心筋細胞に成熟させると、本明細書中に教示されている成体様（成熟）心筋細胞が作製され得る。
［実施例２］単層での分化
ヒトＰＥＳＣまたはヒトｉＰＳＣをＤａｍｂｒｏｔら（２０１４），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．（印刷中）（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．Ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｅｘｃｒ．２０１４．０５．００１）に記載されている方法に従って単層で培養した。要するに、細胞をマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）被覆した組織培養皿を用いてｍＴｅＳＲＩにおいて製造業者のプロトコル（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って培養した。心筋細胞への分化を開始させるために、細胞を細胞の小クラスターに解離し、マトリゲル被覆した組織培養皿を用いてｍＴｅＳＲＩに接種した。３日後（分化日（ｄ）０）、培地を低インスリン（１ｍｇ／ｌ）の（ＬＩ）−ＢＰＥＬ培地と交換し、ＢＭＰ４（０日目〜３日目）、アクチビンＡ（０日目〜３日目）、ＣＨＩＲ９９０２１（０日目〜３日目）及びＸＡＶ９３９（３日目〜６日目）を補充した。６日目以降は、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１及びＸＡＶ９３９は培地に存在させなかった。
この方法により産生させた胎児様（未熟）心筋細胞は本明細書中に教示されている本発明の方法において使用するのに好適である。すなわち、前記胎児様（未熟）心筋細胞を培地組成物及び方法を用いて成体様（成熟）心筋細胞に成熟させると、本明細書中に教示されている成体様（成熟）心筋細胞が作製され得る。
［実施例３］インビトロ培養で胎児様（未熟）心筋細胞から成体様（成熟）心筋細胞の作製
組織培養プラスチックをＤＭＥＭ中１／１００の濃度でマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて室温で４５分間被覆した。いずれもインビトロ培養でＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する解離胚様体、解離単層、または（商業的に入手した）凍結胎児様（未熟）心筋細胞に由来する単細胞懸濁液をマトリゲル被覆した組織培養プラスチックに適切な濃度（例えば、９６ウェルプレートの１ウェルあたり２０〜４０ｋ細胞、例えば１２ウェルプレートの１ウェルあたり２０〜２００ｋ）で接種した。平板培養から１日目に、胎児様（未熟）心筋細胞を本発明の培地組成物に曝した。前記培地組成物は、４６．５重量％のＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ ２１０５６）及びグルタマックス（Ｇｉｂｃｏ ３１７６５）を有している４６．５重量％のＨＡＭ Ｆ−１２中に５０ｎｇ／ｍｌのＴ３（Ｓｉｇｍａ Ｔ６３９７）、２ｍＭのカルニチン、５ｍＭのクレアチン、５ｍＭのタウリン、２．２μｇ／ｍｌのコレステロール、０．１μｇ／ｍｌのリノール酸、０．１μｇ／ｍｌのリノレン酸、０．１μｇ／ｍｌのパルミチン酸（脂質，例えばＧｉｂｃｏ １１９０５から）、１０ｍｇ／ｍｌのインスリン、５．５ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、０．００６７ｍｇ／ｍｌのセレン（インスリン、トランスフェリン及びセレン，例えばＧｉｂｃｏ ５１５００から）、０．０１％の微量元素ミックスＢ（本明細書中に記載されている；Ｃｅｌｌｇｒｏ ９９−１７５−ＣＬ）、０．１％の微量元素ミックスＣ（本明細書中に記載されている；Ｃｅｌｌｇｒｏ ９９−１７６−ＣＬ）、０．５重量％の抗生物質（Ｇｉｂｃｏから市販されているペニシリン−ストレプトマイシン混合物（Ｇｉｂｃｏ １２０７０；５０００Ｕ／ＭＬ））、０．０５ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸、２ｍＭのグルタマックスサプリメント（すなわち、０．８５％ ＮａＣｌ中Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチド，Ｇｉｂｃｏで市販されている，例えばＧｉｂｃｏ ３５０５０）、０．１２５重量％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、４５０ｎＭのαモノチオールグリセロール（ＭＴＧ）（市販されている）、０．２５重量％のＢＳＡ（Ｂｏｖｏｓｔａｒ ＢＳＡＳ１．０）を含む無血清培地組成物から構成されている。濃度はすべて培地組成物中の最終濃度として表示されている。
翌日、本明細書中に教示されている培地組成物をリフレッシュさせた。この段階を１５日目まで２〜３日毎に繰り返した。
或いは、胎児様心筋細胞を平板培養してから３日目または７日目に５０ｎｇ／ｍｌのＴ３を含む直ぐ上に記載されている培地組成物での処理を開始し、実験の残りの間、すなわち１５日目まで継続させ得る。この場合、５０ｎｇ／ｍｌのＴ３を含む上記した培地組成物を用いる処理を開始するまで、細胞を本明細書中に教示されている、ただしＴ３を欠いている培地組成物中に維持する。個々の成分の濃度を変えながら、本明細書中に開示されている培地の範囲内で各種の他の培地を使用し得る。成分を本明細書中に具体的に開示されている濃度で含む培地を用いて最良の結果が得られた。
［実施例４］Ｔ３の形態学的特徴に対する効果の評価
インビトロ培養でＰＥＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞を２つの実験群に分けた。第１群は本明細書中に教示されている、ただしＴ３を欠いている培地組成物（対照状況）に曝した。第２群は本明細書中に教示されている、ただしＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地組成物に曝した。両群をそれぞれの培地組成物において５日間インキュベートした。処理の終わりに、両実験群からの心筋細胞を４％ パラホルムアルデヒドで固定し、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）／０．１％ トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて透過処理し、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）／０．１％ トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１％ ＢＳＡを用いてブロックした。サンプルをα−アクチニンに対して特異的な一次抗体（Ｅｐｔｏｍｉｃｓ Ａｂ ６８１６７）を（１／４００の濃度で）用いて室温で１時間インキュベートした。一次抗体をＣｙ３−またはＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートした二次抗体を（１／２５０の濃度で）用いて検出した。像をＬｅｉｃａ ＳＰ５−ＳＴＥＤまたはＬｅｉｃａ ＳＰ５共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて取得した。
結果を図１に示す。具体的には、これらの結果は、例えば細胞の極性化、改善されたサルコメア構造及び細長い形状のような成体（または、成体様）段階を連想させる形態学的特徴の変化から明らかなように、Ｔ３を含む本明細書中に教示されている培地組成物に曝されたインビトロ培養でＰＥＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞（図１中のパネルＥ及びＦを参照されたい）がより効率的に且つよりロバストに成体様心筋細胞に成熟したことを示している。インビトロ培養での成熟プロセス中にＴ３に曝されなかった胎児様（未熟）心筋細胞（図１中のパネルＡ〜Ｄを参照されたい）では、前記した形態学的特徴の変化は余り明白に観察されず、インビトロでの成熟プロセスにおける本明細書中に詳記されている培地組成物中のＴ３、特にＴ３の重要性が分かる。
［実施例５］Ｔ３の電気生理学的特性に対する効果の評価
インビトロ培養でＰＥＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞を２つの実験群に分けた。第１群は本明細書中に教示されている、ただしＴ３を欠いている培地組成物（対照状況）に曝した。第２群は本明細書中に教示されている、ただしＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地組成物に曝した。両群をそれぞれの培地組成物において１２日間インキュベートした。処理期間の終わりに、両実験群からの胎児様（未熟）心筋細胞をパッチクランプ法にかけた。
パッチクランプ電気生理学的方法は少し改変してＢｅｌｌｉｎ，Ｍ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ，３２，３１６１−３１７５（２０１３））に記載されているように実施した。小細胞群（５〜１０個の細胞）からの活動電位をＡｘｏｐａｔｃｈ ２００ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）及び低抵抗パッチピペット（１．５〜２．５ΜΩ）を用いる穿孔パッチクランプ法で測定した。活動電位のデータ獲得及び分析をｐＣｌａｍｐ １０（ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及び特別注文ソフトウェアを用いて実施した。活動電位を計算した液界電位（−１５ｍＶ）に対して補正した。
自然拍動細胞からの活動電位を１４０ ＮａＣｌ、５．４ ＫＣｌ、１．８ ＣａＣｌ２、１．０ ＭｇＣｌ２、５．５ グルコース、５．０ ＨＥＰＥＳ（単位ｍＭ）を含有しているｐＨ７．２（ＮａＯＨ）の改変タイロード液を用いて３７±０．２℃で測定した。ビペット溶液は１２５ Ｋ−グルコネート、２０ ＫＣｌ、５ ＮａＣｌ、０．２２ アンホテリシンＢ、１０ ＨＥＰＥＳ（単位ｍＭ）を含有しており、ｐＨ７．２（ＫＯＨ）であった。静止膜電位（ＲＭＰ）、最大立ち上がり速度（ｄＶ／ｄｔ ｍａｘ）、ＡＰ振幅（ＡＰＡ）（単位ｍＶ）及び２０、５０及び９０％ 再極性化でのＡＰ持続時間（ＡＰＤ）（単位ミリ秒）（それぞれ、ＡＰＤ５０及びＡＰＤ９０）を分析した。立ち上がり速度は、時間の関数としての電圧の変化の一次導関数から計算した。よって、最大立ち上がり速度（ｄＶ／ｄｔ ｍａｘ）は活動電位の一次導関数の最大正値に等しい。１０個の連続活動電位からのデータを平均化した。
結果を図２に示す。具体的には、これらの結果は、上昇した最大立ち上がり速度（図２中のパネルＡを参照されたい）、より低い静止膜電位（図２中のパネルＢを参照されたい）及び活動電位のより大きい振幅（図２中のパネルＣを参照されたい）のような成体（または、成体様）段階を連想させる電気生理学的特徴の変化から明らかなように、Ｔ３を含む培地組成物に曝されたインビトロ培養でＰＥＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞がインビトロ培養での成熟プロセス中にＴ３に曝されなかった胎児様（未熟）心筋細胞について得たデータ（図２中のパネルＡ、Ｂ及びＣの黒色バーを参照されたい）と比較してより効率的且つよりロバストに成体様心筋細胞に成熟したことを示している。
［実施例６］Ｔ３の代謝プロフィールに対する効果の評価
インビトロ培養でＰＥＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞を２つの実験群に分けた。第１群は本明細書中に教示されている、ただしＴ３を欠いている培地組成物（対照状況）に曝した。第２群は本明細書中に教示されている、ただしＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地組成物に曝した。両群をそれぞれの培地組成物において１７日間インキュベートした。測定の前の日にある量の５ｎＭ ＴＭＲＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれの培地に添加した。細胞を５×Ｔｒｙｐｌｅを用いて解離したが、すべての溶液中にＴＭＲＭを含め、測定中も存在させた。測定はＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳｑｕａｎｔ ＶＹＢフローサイトメトリーを用いて実施した。
結果を図３に示す。具体的には、これらの結果は、高いミトコンドリア活性のような成体（または、成体様）段階を連想させる代謝プロフィールの変化から明らかなように、Ｔ３を含む本明細書中に教示されている培地組成物に曝されたインビトロ培養でＰＥＳＣに由来する胎児様（未熟）心筋細胞がインビトロ培養での成熟プロセス中にＴ３に曝されなかった胎児様（未熟）心筋細胞と比較してより効率的に且つよりロバストに成体様心筋細胞成熟したことを示している。

Claims (28)

  1. 水性培地組成物が無血清であり、甲状腺ホルモン様化合物、脂質混合物及びカルニチン化合物を含む、前記水性培地組成物。
  2. 前記甲状腺ホルモン様化合物が、トリヨードサイロニン（Ｔ３）及び／または３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記組成物が、約２５ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍｌのＴ３及び／または約１μＭから約２μＭのＤＩＴＰＡを含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記脂質混合物が、コレステロール、及びリノレン酸、リノール酸及びパルミチン酸から選択される１つ以上の脂質を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記組成物が、約１μｇ／ｍｌから約４μｇ／ｍｌのコレステロールを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載組成物。
  6. 前記脂質混合物が、更にアラキドン酸、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸及びトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０の群から選択される１つ以上の成分を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記組成物が、約０．５ｍＭから約３．５ｍＭのカルニチンを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記組成物が、クレアチン化合物及びタウリン化合物を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記組成物が、約３．０ｍＭから約７．０ｍＭのクレアチンを含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 前記組成物が、約２ｍＭから約７ｍＭのタウリンを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記組成物が、約５ｍｇ／Ｌから約１５ｍｇ／Ｌのインスリン、及び約３ｍｇ／Ｌから約８ｍｇ／Ｌのトランスフェリン並びに約０．００５ｍｇ／Ｌから約０．００７５ｍｇ／Ｌのセレンを含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記組成物が、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｍｂ、Ｖ、Ｎｉ、Ｓｎ、Ａｌ、Ａｇ、Ｂａ、Ｋ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆ、Ｇｅ、Ｉ、Ｒｂ及びＺｒの群から選択される微量元素の１つ以上、好ましくはすべてを含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 前記組成物が、約２ｍｇ／ｍｌから約７ｍｇ／ｍｌのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記組成物が、ウシ血清アルブミン、グルコース、ビタミン、抗生物質、モノチオールグリセロール、グルタミン、アミノ酸及びハムＦ１２栄養ミックスを含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 請求項１から１４のいずれか１項に記載の組成物を得るために水溶液中に溶解され得る固体組成物、好ましくは粉末組成物。
  16. 多能性胚性幹細胞（ＰＥＳＣ）及び／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化した胎児様心筋細胞から成体様心筋細胞を作製するための方法であって、その方法は、
    （ａ）１つ以上の胎児様心筋細胞を用意する段階；
    （ｂ）前記胎児様心筋細胞を請求項１から１５に記載の培地組成物と接触させて、前記胎児様心筋細胞を成体様心筋細胞に成熟させる段階；
    を含む前記方法。
  17. 前記胎児様心筋細胞を前記培地組成物と約３日間〜最長約１５日間接触させる、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記培地組成物が、段階（ｂ）の液体培地を得るために水溶液中に溶解され得る固体形態、好ましくは粉末形態である、請求項１６及び１７に記載の方法。
  19. 前記胎児様心筋細胞を、甲状腺ホルモン様化合物を欠いている請求項１から１５のいずれか１項に記載の培地組成物と約２日間接触させた後、少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を含んでいる請求項１から１５のいずれか１項に記載の培地組成物と接触させる、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. インビトロでＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する心筋細胞を成熟させるための請求項１から１５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  21. インビトロでＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣに由来する心筋細胞を成熟させるための請求項１から１５のいずれか１項に記載の、ただし甲状腺ホルモン様化合物を欠いている組成物の使用。
  22. 請求項１から１５のいずれか１項に記載の培地組成物を含む、インビトロ培養で成体様心筋細胞を作製するのに適したキット。
  23. 請求項１から１５のいずれか１項に記載の、ただし少なくとも１つの甲状腺ホルモン様化合物を欠いている培地組成物を含む、請求項２２に記載のキット。
  24. 前記培地組成物が液体形態である、請求項２２及び２３に記載のキット。
  25. 前記培地組成物が、固体形態、好ましくは粉末形態である、請求項２２及び２３に記載のキット。
  26. 胎児様心筋細胞を含む、請求項２０から２５のいずれか１項に記載のキット。
  27. 未分化ＰＥＳＣ及び／またはｉＰＳＣを含む、請求項２０から２５のいずれか１項に記載のキット。
  28. 請求項１６から１９に記載の成体様心筋細胞を作製する方法の説明書を含む、請求項２０から２５のいずれか１項に記載のキット。
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