CN103211821A - 药物和用途 - Google Patents

药物和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN103211821A
CN103211821A CN2013100543094A CN201310054309A CN103211821A CN 103211821 A CN103211821 A CN 103211821A CN 2013100543094 A CN2013100543094 A CN 2013100543094A CN 201310054309 A CN201310054309 A CN 201310054309A CN 103211821 A CN103211821 A CN 103211821A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
androstane
alkene
cell
people
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2013100543094A
Other languages
English (en)
Inventor
詹姆斯·M·弗林克
克里斯托弗·L·雷丁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbor Biosciences Inc
Original Assignee
Hollis Eden Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hollis Eden Pharmaceuticals Inc filed Critical Hollis Eden Pharmaceuticals Inc
Publication of CN103211821A publication Critical patent/CN103211821A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Abstract

本发明涉及药物和用途，特别涉及治疗特定临床病症例如高血糖症、2型糖尿病、关节炎和多发性硬化的方法。本发明还提供鉴定和表征药物的方法，所述药物部分地通过在一个时间引发对生物分子不同生物学治疗作用和在另一个时间点使所述生物分子的相对正常化来表征的。所述化合物包括17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇或雄甾-5-烯-3β,4β,16α,17β-四醇，其都可以用作参考标准来促进这种候选药物的评价和表征。

Description

药物和用途
本申请为国际申请PCT/US2007/067235于2008年12月16日进入中国国家阶段、申请号为200780022449.6、发明名称为“药物和用途”的分案申请。
技术领域
本发明涉及方法和化合物，例如雄甾-5-烯-3β,4β,16α,17β-四醇，用于调节炎症、代谢性病症和本文中所述的其它病况。使用化合物调节炎症可用于以下病况的治疗、改善、预防或延缓其进展，例如2型糖尿病、高血糖症、肺炎症状态(例如，囊性纤维化)、急性或慢性哮喘/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或慢性阻塞性肺病(COPD)以及自身免疫病症例如多发性硬化、关节炎或红斑狼疮。
背景技术
有许多因素有助于许多慢性自身免疫病症和炎症的形成和维持。通常，这种病症的病因学没有得到充分了解。肿瘤坏死因子-α(TNFα)是首先由单核吞噬细胞应答多种免疫刺激剂而释放的细胞因子。在对动物或人给予时，其引起炎症、发烧、心血管作用、出血、血凝固和与急性感染和休克状态过程中所看到的那些相似的急性期应答。因此，过量的或不受调节的TNFα生成牵涉许多疾病状态。这其中包括内毒素血症和/或中毒性休克综合征，例如，Tracey等人，Nature330:662-664(1987)和Hinshaw等人，Circ.Shock 30:279-292(1990)；恶病质，例如，Dezube等人，Lancet,335(8690):662(1990)；和ARDS，其中已经在ARDS患者的肺抽出物中发现了高的TNFα浓度。例如，Millar等人，Lancet2(8665):712-714(1989)。
TNFα还似乎牵涉骨吸收疾病，包括关节炎。在被活化时，白细胞可以产生骨-再吸收，TNFα可以对这一活性有所贡献，例如，Bertolini等人，Nature 319:516-518(1986)和Johnson等人，Endocrinology 124(3):1424-1427(1989)。TNFα还已经表现出在体外和体内通过刺激破骨细胞形成和活化以及抑制成骨细胞功能而刺激骨吸收和抑制骨形成。已经证明用单克隆的抗-TNFα抗体阻断TNFα在类风湿性关节炎(Elliot等人，Int.J.Pharmac.17(2):141-1451995)和克隆病(von Dullemen等人，Gastroenterology,109(1):129-1352005)中是有利的。
核因子-κB(NF-κB)分子在许多临床病况中是炎症的递质。用于治疗炎症的一些治疗剂例如地塞米松、泼尼松或氢化可的松是糖皮质激素受体(GR)激动剂，它们通过增加GR的活性而间接地抑制NF-κB，例如，H.Harkonarson等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.25:761-771,2001。然而，天然的GR激动剂的升高水平和合成的GR激动剂的药理学水平通常产生不需要的毒性，包括显著的免疫抑制和骨质量损失或骨质减少，例如，T.L.Popper等人，Antiinflammatory agents:Anti-inflammatory steroids,RA.Scherer&M.W.Whitehouse编辑,Academic Press,New York,第9章，第1卷，第245-294页，1974。与糖皮质激素有关的许多不需要的毒性都是由GR的活化引起的。因此，鉴定可以抑制NF-κB活性而不通过活化GR引起这些毒性的化合物代表了一类可用于治疗炎症和相关症状例如疼痛、发烧或疲劳的药物。
不需要的或损坏性的炎症发生在许多慢性或急性病况中，例如，ARDS、COPD和脓毒病中。活化的单核细胞和嗜中性粒细胞在介导炎症相关的病理学中起作用。特别重要的是活化的嗜中性粒细胞，其表现出细胞核中的NFκ-B转录调节因子的积累增加和促炎细胞因子的产生增加。嗜中性粒细胞也是毒性氧物质的来源，毒性氧物质的产生至少部分地通过活化巨噬细胞来介导肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌，这可能是在脓毒病中所见的器官损伤和衰竭所必需的。
与炎症有关的信号转导可以通过不同的途径发生，并且这可以提高受影响的细胞中的NF-κB活性。NF-κB被肿瘤坏死因子-α(TNF-α)活化从TNF-α结合于细胞膜上的TNF-α受体开始，随后是一系列信号转导物(包括MAP激酶)的活化。NF-κB在细胞质中的活化引起其易位到细胞核中并且引起在启动子中包含NF-κB应答成分的基因活化。细胞质的NF-κB被细菌脂多糖(LPS)活化从LPS结合于细胞表面上的Toll样受体4开始，并且随后发生胞内信号转导物的活化，包括磷脂酰肌醇-3-激酶的活化。已知TNF-α和LPS都在体内和在体外在细胞中诱导强烈的炎症性应答。应答这种促炎性信号的细胞包括巨噬细胞、单核细胞和其它类型的免疫细胞。
有多种T细胞亚群似乎在某些疾病状态的发展过程中起作用。已经提出了包括调节性和/或抑制性T细胞在内的独特的T细胞群在介导免疫力的各个方面中的重要作用，例如，E.Suri-Payer等人，J.Immunol.,160(3):1212-1218,1998；J.Shimizu等人，J.Immunol.,163(10):5211-5218,1999；M.Itoh等人，J.Immunol.,162(9):5317-5326,1999；A.M.Miller等人，J.Immunol.,177:7398-7405,2006。CD4+CD25+T细胞可以在抑制一些免疫应答中起作用。
已经描述了在动物模型中对这些T细胞亚群中的一些进行的研究，例如在美国专利6,593,511中。例如，在scid/scid CD4+CD45Rbhi模型中考查了对于研究人自身免疫病况的作用。这个动物模型已经用于研究失调的免疫应答，例如炎症状况和用于评价实验药物和治疗规程，例如，K.Hong等人，J.Immunol.,162:7480-7491,1999；Powrie等人，J.Exp.Med.,183(6):2669-2674,1996。
由胸腺上皮诱导的Foxpro3基因可以在诱导T细胞形成CD4+CD25+或CD4+CD25high(TregT细胞或调节性T细胞)表现型中起作用。CD25表面抗原是IL-2受体α-链。在一些自身免疫疾病的动物模型中，Foxpro3基因缺乏与自身免疫疾病的发生有关，例如，美国专利申请2006/0111316。这种基因的恢复似乎是减少自身免疫异常。已经描述了用于CD4+CD25+细胞的各种试剂或试验规程，例如，H.Yagietal.,International Immunol.,16(11):1643-1656,2004；W.R.Godfrey等人，Blood,105(2)750-758,2005。
早已经认识到了不耐受葡萄糖的受试者的胰岛素耐受。Reaven等人(American Journal of Medicine,60(1):80-88,1976)使用连续输注的葡萄糖和胰岛素(胰岛素/葡萄糖钳夹技术)和口服葡萄糖耐量试验来证明在不同的非肥胖、非酮症受试者组中存在胰岛素耐受。这些受试者从临界葡萄糖耐受到明显的空腹高血糖症而不同。这些研究中的糖尿病组包括胰岛素依赖型的(IDDM)和非胰岛素依赖型(NIDDM)的受试者。
与持续的胰岛素耐受一致的是更容易确定的高胰岛素血症，其可以通过精确测定受试者血浆中的循环血浆胰岛素浓度来测量。高胰岛素血症可以作为胰岛素耐受的结果出现，例如在肥胖和/或糖尿病(NIDDM)受试者中和/或葡萄糖不耐受受试者中，或者在IDDM受试者中，是作为与内分泌腺胰腺正常生理学释放的胰岛素相比过量注射胰岛素的结果出现的。
已经通过实验性的临床和流行病学研究描述了高胰岛素血症与肥胖症和与大血管缺血性疾病(例如，动脉粥样硬化)的关联(Stout,Metabolism,34:7,1985；Pyorala等人，Diabetes/Metabolism Reviews,3:463,1987)。在口服葡萄糖负荷之后的1和2小时出现的统计学显著性的血浆胰岛素上升与增加的冠心病危险有关。
人糖尿病的一种模型是db/db小鼠。对db/db小鼠模型已经有所描述，例如，D.Koya等人，The FASEB Journal,14:439-447,2000；K.Kobayashi等人，Metabolism,49(1):22-31,2000；J.Berger等人，J.Biol.Chem.,274(10):6718-6725,1999。db/db小鼠在编码瘦素受体的基因上具有突变，随着其功能性胰腺β-细胞团块随时间恶化，赋予了以食欲过盛、肥胖症、胰岛素耐受和糖尿病为特征的表型，特别是对于C57BL/Ks遗传背景的动物而言。db/db小鼠典型地在约3到4周龄时变得明显肥胖并且在10到14天血浆胰岛素开始上升。可以在4到8周龄观察到血糖升高，具有失控的血糖增加，胰岛的生产胰岛素的β-细胞严重耗竭，并且在约10月龄时死亡。这个模型已经被用于表征药物候选物影响与糖尿病的形成和维持有关的参数(例如，高血糖症和体重增加)的进展开始或其速率的能力。
用PPAR-γ激动剂治疗糖尿病已经涉及心脏肥大，或者心脏重量增加。用马来酸罗格列酮(一种PPAR-γ激动剂)治疗显示，患者可能经历积液和液体容积相关事件，例如浮肿和充血性心力衰竭。与PPAR-γ激动剂治疗有关的心脏肥大典型地通过中止治疗来处理。
氢化可的松的生理作用在于其对胰岛素的拮抗作用。肝脏中高的氢化可的松浓度可以降低该器官中的胰岛素敏感性，其倾向于增加糖原异生和增加血糖水平(M.F.Dallman等人，Front Neuroendocrine.,14:303-347,1993)。这种作用加重了葡萄糖耐量低减或糖尿病。在由过多的氢化可的松的循环浓度引起的库氏综合征中，在易感个体中的对胰岛素的拮抗作用可以引起糖尿病(E.J.Ross等人，Lancet,2:646-649,1982)。
氢化可的松可以在体内通过11β-羟类固醇脱氢酶的11β-脱氢酶活性转化为可的松。其逆反应，即无活性的可的松转化为活性的氢化可的松，是在某些器官中由这些酶的11β-还原酶活性实现的。这种活性又称为皮质类固醇11β-还原酶活性。11β-羟类固醇脱氢酶有至少两种独特的同功酶。在多种细胞系中11β-HSD 1型的表达产生双向的酶或占优势的11β-还原酶，其可以从否则为无活性的11-酮类固醇母体再生11β-羟类固醇。
线粒体磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(又称为PEPCK-线粒体，PEPCK-M，PCK2和mtPEPCK)在各种人组织中表达，主要在肝脏、肾脏、胰脏、肠和成纤维细胞中表达(Modaressi等人，Biochem.J.,333:359-366,1998)。尽管没有充分记载，但是PEPCK-线粒体缺乏已经涉及发育停滞、低血糖和肝脏异常。与胞浆形式(PEPCK-C)不同，线粒体形式(PEPCK-线粒体)是组成型表达的，并且不受激素刺激调节(Hanson和Patel，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.,69:203-281,1994)。两种形式都位于单独的染色体上，定位在染色体14q11，而PEPCK-C存在于染色体20q11上(Stoffel等人，Hum.Mol.Genet,2:1-4,1993)。
多发性硬化(MS)是作为中枢神经系统炎性疾病的一种自身免疫疾病(Bar-Or,A.,J.Neuroimmunol.100:252-259,1999)。尽管最近该疾病的自然过程通过用免疫调节性-免疫抑制性化合物例如干扰素(IFN)-β、共聚物、环磷酰胺和米托蒽醌进行治疗而得到改善(Hafler,D.A.和Weiner,H.L.，Immunological Reviews144:75,1995；Goodkin,D.E.,Lancet352:1486,1998)，但是这些药物中没有一个可以阻断疾病的进展，并且他们中有一些具有限制其长期应用的严重副作用。另外，显著数量的患者表现出差的对IFN-β的应答，包括复发缓解型患者和继发进展型MS患者。因此，需要新的化合物，用于在单独治疗或在联合治疗中通过例如延缓MS的进展来改善其进程。
目前需要有成本有效的药物或治疗方法来更有效地治疗上述的病况。本发明提供用于治疗这些病况中的一种或多种的治疗剂和治疗方法。因此，所述药物和方法可用于减少与本文中所述病况有关的一种或多种症状。另外，本发明的药物和方法的应用可以与用于这些病症的一种或多种常规疗法联合。
发明内容
实施方案简述
本发明提供用于治疗、预防、延缓有此需要的哺乳动物中的不期望的炎症状况、自身免疫性疾病或代谢病症或其症状的进展或改善所述不期望的炎症状况、自身免疫性疾病或代谢病症或其症状的化合物或组合物，任选地，其中所述哺乳动物是人或非人类的灵长类动物，其中组合物包括式1化合物(“F1C”)，
Figure BDA00002844272200071
其中一个R1是-H或任选被取代的烷基，另一个R1是-H、-OH、酯或醚，或者两个R1一起为=O或肟例如=NOH或=NOCH3；酯或醚；一个R2为-H或任选被取代的烷基，另一个R2为-H、-OH、酯或醚，或者两个R2一起为=O或肟例如=NOH或=NOCH3；一个R3为-H或任选被取代的烷基，另一个R3为-H、-OH、酯或醚或任选被取代的烷基，或者两个R3一起为=O或肟例如=NOH或=NOCH3；一个R4为-H或任选被取代的烷基，另一个R4为-OH、酯或醚，或者两个R4一起为=O或肟例如=NOH或=NOCH3；R5为任选被取代的烷基，任选地选自-CH3、-C2H5和-CH2OH；R6为-H或任选被取代的烷基，任选地选自-CH3、-C2H5和-CH2OH；一个R7为-H或任选被取代的烷基，另一个R7为-H、-OH、酯或醚，或者在4位不存在双键时，两个R7一起为=O或肟例如=NOH或=NOCH3；R9为-O-或-C(R12)(R12)-，其中一个R12为-H、-F、-Br或任选被取代的烷基，另一个R12为-H、-OH、酯或醚或任选被取代的烷基，或两个R12一起为=O或肟例如=NOH或=NOCH3；R10为-H或卤素例如-F或-Cl；和一个R11为-H或任选被取代的烷基，另一个R11为-H、-OH、酯或醚或任选被取代的烷基，或者两个R11一起为=O或肟例如=NOH或=NOCH3。这些化合物的实施方案包括如下的化合物，其中(i)R2、R7、R11和R12中的一个、两个或三个独立地为-OH、C2-8酯、C1-8醚或=O，(ii)R1、R7、R11和R12中的一个或两个是-OH、C2-8酯或C1-8醚和(iii)R1、R2、R7、R11和R12中的一个或两个为=O或=NOH，并且其余的一个、两个或三个独立地为-OH、C2-8酯或C1-8醚。5位的氢原子在存在时可以处于α或β构型。在4位存在双键时，有一个R7基团是不存在的。
本发明还提供鉴定或表征具有用于治疗或改善哺乳动物的代谢病症的潜力的化合物的生物活性的方法，包括选择以下的化合物(i)与体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外不使人或哺乳动物细胞中的PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-δ中的一种、两种或三种活化超过约30%；(ii)与体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外使人或哺乳动物细胞中的NF-κB的转录活性或水平抑制或减少约20-80%；(iii)与适当的阴性对照或正常对照相比，减轻高血糖症，延缓高血糖症的进展或延迟其发病，增加胰岛素敏感性，降低葡萄糖不耐性，延缓胰腺β-小岛细胞数量或它们分泌胰岛素的能力丧失的进展和速率，增加胰腺β-小岛细胞数量或它们分泌胰岛素的能力，延缓db/db小鼠或患有膳食诱导的或膳食相关的肥胖症的受试者的体重增加速率，降低升高的甘油三酯水平，较低升高的总的血液或血清胆固醇水平，降低血液或血清中正常或升高的LDL、VLDL、apoB-100或apoB-48水平，或增加血液或血清中正常或较低的HDL或apoA1水平或降低血液或血清中升高的纤维蛋白原水平；和(iv)任选地，与体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外不使人或哺乳动物细胞中的以下的一种或多种活化超过约30%：糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、孕激素受体、雄激素受体、雌激素受体-α、雌激素受体-β或这些生物分子中的任一种的生物学活性变体。所述方法允许鉴定或表征具有用于治疗或改善人或另外的哺乳动物中的代谢病症的潜力的化合物。
实施方案还包括包含式1化合物的组合物，用于预防或治疗自身免疫病况、不期望的炎症状况或代谢病症或任何这些病况的症状。
其它实施方案如说明书中其它地方的描述，包括在此处所述的实施方案。
定义。如本文中使用的和除非上下文另有说明或暗示，本文中使用的术语具有此处定义的含义。所描述的对实施方案和实施例的说明用于举例说明本发明，它们不打算以任何方式构成限制。除非另有限制或暗示，例如，通过包括相互排斥的元素或选项，在这些定义中以及在本说明书中，术语“一”和“一个”是指一个或多个，术语“或”是指和/或。
“制剂”和类似的术语是指可以对受试者(例如，人或动物)给予的组合物。所述制剂适合于人或兽医应用并且典型地具有对于所述制剂而言所期望的特征，例如，用于人的非肠道制剂通常是无菌的溶液剂或悬浮剂。
“赋形剂”、“载体”“药学可接受的载体”或类似术语是指在与本发明的组合物或制剂的其它成分相容并且不会对给予所述制剂的患者、动物、组织或细胞产生过分伤害的意义上是可接受的一种或多种组分或成分。
“受试者”是指人或动物。通常，动物为哺乳动物，或者例如非人类的灵长类动物、啮齿动物、兔类动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猿和猕猴，例如，恒河猴或黑猩猩属。啮齿类和兔类动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。
本文中使用的“烷基”是指连接的正链碳、仲碳、叔碳或环状碳原子，即，直链、支链、环状或其任何组合。如本文中使用的烷基可以是饱和的或不饱和的，即，所述基团可以包括一个、两个或更多个独立选择的双键或三键。不饱和的烷基包括如下对于烯基和炔基所述的基团。除非另作说明，烷基中的碳原子数目为1到约50，例如，约1-30或约1-20，例如，C1-8烷基是指包含1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的烷基。在详细说明烷基时，所述基团可以包括甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、2-丙基(异丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(正丁基)、2-甲基-1-丙基(异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(仲丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、-(CH2)n-(CHCH3)m-(CH2)o-CH3和-(CH2)n-(CHC2H5)m-(CH2)o-CH3，其中n、m和o独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8。
本文使用的“烯基”是指包括连接的正链碳、仲碳、叔碳或环状碳原子的基团，即，直链、支链、环状或其任何组合，其包括一个或多个双键(例如，-CH=CH-)，例如，1、2、3、4、5、6或更多个双键，典型地为1或2个双键。除非另作说明，烯基中的碳原子数目为2到约50个，例如，约2-30个或约2-20个，例如，C2-8烯基或C2-8烯基是指包含2、3、4、5、6、7或8个碳原子的烯基。在详细说明烯基时，该物质可以包括乙烯基、烯丙基、-(CH2)n-(CH=CH)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-(CCH3=CH)-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-(CH=CCH3)-(CH2)m-CH3和-(CH2)n-(CH=CH)0-1-(CH2)m-CH2CH=CH2，其中n和m独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8。
本文使用的“炔基”是指包括连接的正链碳、仲碳、叔碳或环状碳原子的基团，即，直链、支链、环状或其任何组合，其包括一个或多个三键(-C≡C-)，例如，1、2、3、4、5、6个或更多个三键，典型地为1或2三键，任选地包括1、2、3、4、5、6更多个双键，其余的键为单键。除非另作说明，否则炔基中的碳原子数目为2到约50，例如，约2-30或约2-20，例如，C2-8炔基或C2-8炔基是指包含2、3、4、5、6、7或8个碳原子的炔基。在详细说明炔基时，所述基团可以包括-CCH、-CCCH3、-CCCH2CH3、-CCC3H7、-CCCH2C3H7、-(CH2)n-(C≡C)-(CH2)m-CH3和-(CH2)n-(C≡C)0-1-(CH2)m-CH2C≡CH，其中n和m独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8。
“取代的烷基”、“取代的烯基”、“取代的炔基”和类似的术语是指本文中定义的烷基、烯基、炔基或其它基团，其具有取代基、或者包括代替氢原子并且结合于碳原子的取代基、或中断碳原子链的取代基。取代基包括1、2、3、4、5、6或更多个独立选择的-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-ORPR、-SH、-SCH3、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)ORPR、-CHO、-CH2SH、-C=N-、-C(O)ORPR、-C(O)CH3，其中RPR独立地为氢、保护基或两个RPR都是氢或都是保护基。
“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
“酯”是指包括-C(O)-O-结构的基团。典型地，本文中使用的酯包括含约1-50个碳原子(例如，约2-20个碳原子)和0到约10个独立选择的杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机基团，其中有机基团在例如R1或R2处通过-C(O)-O-结构结合于式1的类固醇核，例如，有机基团-C(O)-O-类固醇或有机基团-O-C(O)-类固醇。有机基团通常包括上述任何有机基中的一种或多种，例如，C1-20烷基、C2-20烯基、C2-20炔基、芳基、C2-9杂环或这些中任一种的被取代的衍生物，例如，包括1、2、3、4或更多个取代基，其中每个取代基是独立选择的。酯包括丁二酸、二羧酸和氨基酸的酯，例如-O-C(O)-(CH2)n-C(O)-ORPR、-O-C(O)-(CH2)n-NHRPR、和-NH-(CH2)n-C(O)-ORPR，其中n为1、2、3、4、5、6、7或8和RPR为-H或保护基，例如C1-4烷基。酯还包括结构例如-O-C(O)-O-(CH2)n-H和-O-C(O)-NH-(CH2)n-H。
这些有机基的氢或碳原子的示例性取代如上述对于取代的烷基所述的，并且包括1、2、3、4、5、6或更多个，通常1、2或3个-O-、-S-、-NRPR-(包括-NH-)、-C(O)-、-CHO、-CHS、-C=NH、-C(S)、=O、=S、-N(RPR)2(包括-NH2)、-C(O)ORPR(包括-C(O)OH)、-OC(O)RPR(包括-O-C(O)-H)、-ORPR(包括-OH)、-SRPR(包括-SH)、-NO2、-CN、-SCN、-C6H5、-CH2C6H5、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-O-A8、-S-A8、-C(O)-A8、-OC(O)-A8、-C(O)O-A8、=N-、-N=、=N-OH、-OPO3(RPR)2、-OSO3H2或卤素基团或原子，其中每个RPR为-H、独立选择的保护基或两个RPR都包括保护基，并且A8为C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C1-4烷基-芳基(例如，苄基)、芳基(例如，苯基)或C0-4烷基-C2-9杂环。取代是独立选择的。有机基团包括通过R4变量定义的化合物。所述有机基团排除明显不稳定的基团，例如，-O-O-，除非这种不稳定的基团是用于制备具有足够化学稳定性的用于本文所述的一种或多种应用的化合物的过渡物质，包括用于合成式1化合物或其它化合物。上述列举的取代典型地是可用于代替一个或多个碳原子的取代基，例如，-O-或-C(O)-，或用于代替一个或多个氢原子的取代基，例如，卤素、-NH2或-OH。示例性的酯包括一个或多个独立选择的乙酸酯、庚酸酯、丙酸酯、异丙酸酯、环丙酸酯、异丁酸酯、正丁酸酯、戊酸酯、已酸酯、异已酸酯、己酸酯、庚酸酯、辛酸酯、壬酸酯、癸酸酯、十一烷酸酯、苯乙酸酯或苯甲酸酯，其典型地是羟基酯。酯还包括氨基酸酯、碳酸酯和氨基甲酸酯，包括-O-C(O)-CH2-NHRPR、-O-C(O)-CH2CH2-NHRPR、-O-C(O)-CH(CH3)-NHRPR、-O-C(O)-CH2CH(CH3)-NHRPR、-O-C(O)-CH(NHRPR)-CH(ORPR)-CH3、-O-C(O)-O-(CH2)m-H和-O-C(O)-NH-(CH2)m-H，其中RPR为-H或保护剂例如C1-4烷基(-CH3、-C2H5、-C3H7等)或-C(O)-CH3或-CH2CH2-O-CH3，和m为0、1、2、3、4、5或6。酯还包括-O-C(O)-(CF2)n-CF3、-O-C(O)-(CH2)n-CH3、-O-C(O)-CH(CH3)-(CH2)n-CH3和-O-C(O)-C(CH3)2-(CH2)n-CH3，其中n为0、1、2、3、4、5或6。
“醚”是指包括1、2、3、4或更多个(通常1或2个)-O-基团的如对于酯所述的有机基团。在一些实施方案中，-O-基团在不同的基团(例如R1、R2、R3、R4或R11)处连接于类固醇核，例如，有机基团-O-类固醇。所述有机基团如上述对于酯所述的。醚包括-O-(CH2)n-CH3、-O-CH2(CH2)n-O-CH3、-O-CH2(CH2)n-S-CH3和-O-CH(CH3)-(CH2)n-CH3，其中n为0、1、2、3、4、5或6。
式1化合物。在一些实施方案中，式1化合物具有3、4或5个羟基，任选地，其中的一个、两个或更多个被相同或不同的酯基酯化。在这些实施方案中的一些中，羟基或酯处于3-、4-、16-、和17-位，其中处于3-、4-和16-位的羟基或酯分别处于β,β,α、β,β,β、α,β,α、α,β,β、β,α,α、β,α,β、α,α,α或α,α,β构型。17-位的羟基或酯典型地处于β构型，但是可以为α构型。这些化合物中的R10典型地为-H或卤素，例如-F，R5任选地为-CH3或-C2H5，和R6任选地为-H或-CH3。对于这些化合物中的一些，可以在7-位或11-位存在有β构型或α构型的另外的羟基或酯。
对于式1化合物，取代的C1-8烷基包括-CH2F、-CF3、-CH2OH和-C2F5。任选被取代的C2-8炔基包括-CCH、-CCCH3、-CCCH2OH、-CCCH2Cl和-CCCH2Br。
示例性的式1化合物包括雄甾-5-烯-3β,4β,7β,16α,17β-五醇和这个化合物的其中一个或两个羟基差向异构化的差向异构体，例如，雄甾-5-烯-3α,4β,7β,16α,17β-五醇、雄甾-5-烯-3β,4α,7α,16α,17β-五醇和雄甾-5-烯-3β,4β,7α,16β,17β-五醇。其它的式1化合物包括其中存在有5个独立选择的-OH、酯或醚基团的那些，例如，雄甾-5-烯-3β,4β,11β,16α,17β-五醇以及这个化合物的其中一个或两个羟基差向异构化的差向异构体，例如，雄甾-5-烯-3α,4β,11β,16α,17β-五醇、雄甾-5-烯-3β,4β,11β,16α,17α-五醇、雄甾-5-烯-3β,4β,11α,16α,17β-五醇和雄甾-5-烯-3β,4α,11β,16β,17β-五醇。对于这种化合物，5个羟基中的一个、两个或更多个可以被衍生化，例如，衍生为酯或醚，例如甲氧基、乙氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、-O-C(O)-(CH2)3-H、-O-C(O)-(CH2)4-H或-O-C(O)-(CH2)5-H衍生物。其它酯包括-O-C(O)-CH2-C(O)OH、-O-C(O)-(CH2)2-C(O)OH、-O-C(O)-(CH2)3-C(O)OH、-O-C(O)-(CH2)4-C(O)OH、-O-C(O)-(CH2)5-C(O)OH和-O-C(O)-(CH2)6-C(O)OH。
在这些实施方案中的一些中，在式1化合物的2-、3-、4-、7-、11-、16-和17-位中的四个位置存在有四个独立选择的羟基、酯或醚。这种取代基可以结合于例如，2-、3-、16-和17-位；2-、3-、7-和17-位；2-、3-、11-和17-位；3-、4-、7-和17-位；3-、4-、11-和17-位；3-、7-、16-和17-位；3-、4-、16-和17-位或3-、11-、16-和17-位。在4-没有双键时，所述羟基、酯或醚可以分别地为2-和/或3-β,β,β,β-17；2-和/或3-β,β,β,α-17；2-和/或3-β,β,α,β-17；2-和/或3-β,α,β,β-17；2-和/或3-α,β,β,β-17；2-和/或3-β,β,α,α-17；2-和/或3-β,α,β,α-17构型，或者为2-和/或3-α,β,β,α-17构型。术语“2-和/或3-β,β,β,β-17”是指2-位任选被羟基、酯或醚取代和3-位和17-位被羟基、酯或醚取代。在4-没有双键时，所述羟基、酯或醚可以分别地为2-和/或3-β,α,α,β-17；2-和/或3-α,β,α,β-17；2-和/或3-α,α,β,β-17；2-和/或3-β,α,α,α-17；2-和/或3-α,β,α,α-17；2-和/或3-α,α,β,α-17；2-和/或3-α,α,α,β-17；2-和/或3-β,α,α,α-17构型。这些化合物中的R10典型地为-H或-F，R5任选地为-CH3或-C2H5，和R6任选地为-H、-CH3、-CH2OH、-CCH或-CCCH3。对于这些化合物，2-、3-、4-、7-、11-、16-和17-位中的一个、两个或更多个位置被-H或任选被取代的烷基例如-CH3、-C2H5、-CH2=CH2、-CCH、-CF3或-C2F5取代。
在式1化合物的一些实施方案中，可以存在有五个独立选择的羟基、酯和/或醚基团。对于这些化合物，羟基、酯和/或醚基团通常处于3-位和17-位和处于3个其它位置。这些取代基可以处于2-、3-、7-、11-和17-位，2-、3-、7-、16-和17-位或2-、3-、11-、16-和17-位。独立选择的羟基、酯和/或醚基团可以处于3-、4-、7-11-和17-位；3-、4-、11-、16-和17-位；3-、4-、7-、16-和17-位或3-、7-、11-、16-、17-位。对于这些化合物，在4-位不存在双键时，每个基团可以处于α构型或β构型。因此，这些化合物中的取代基可以分别地处于2-和/或3-β,β,β,β,β-17、2-和/或3-β,β,β,β,α-17、2-和/或3-β,β,β,α,β-17、2-和/或3-β,β,α,β,β-17、2-和/或3-β,α,β,β,β-17、2-和/或3-α,β,β,β,β-17、2-和/或3-β,β,β,α,α-17、2-和/或3-β,β,α,β,α-17、2-和/或3-β,α,β,β,α-17、2-和/或3-α,β,β,β,α-17、2-5和/或3-β,β,α,α,β-17、2-和/或3-β,α,β,α,β-17、2-和/或3-α,β,β,α,β-17、2-和/或3-β,α,α,β,β-17、2-和/或3-α,β,α,β,β-17,2-和/或3-α,α,β,β,β-17构型或分别处于2-和/或3-β,β,α,α,α-17构型。这些化合物中的取代基也可以分别处于2-和/或3-β,α,β,α,α-17、2-和/或3-β,α,α,β,α-17、2-和/或3-β,α,α,α,β-17、2-和/或3-α,β,β,α,α-17、2-和/或3-α,β,α,β,α-17、2-和/或3-α,β,α,α,β-17、2-和/或3-α,α,β,β,α-17、2-和/或3-α,α,β,α,β-17、2-和/或3-α,α,α,β,β-17、2-和/或3-β,α,α,α,α-17、2-和/或3-α,β,α,α,α-17、2-和/或3-α,α,β,α,α-17、2-和/或3-α,α,α,β,α-17、2-和/或3-α,α,α,α,β-17构型或处于2-和/或3-α,α,α,α,α-17构型。
对于本文中所述的式1化合物，16-位可以是未被取代的，即，一个或者两个R3为-H，并且在17-位没有双键时，第二个R4可以以α构型或β构型存在于17-位。这种第二个R4基团包括任选被取代的C1-8烷基，例如-CH3、-C2H5、-CF3、-C2F5、-C=CH2、-CCH、-CCCH3或-CCCH2OH。
对于这些化合物中的任一个，2-位可以是未被取代的，即，R9为-CH2-。在一些实施方案中，R9是被取代的，例如，-O-、-CH(OH)-、-CH(酯)-或-CH(醚)-，其中羟基、酯或醚基团处于α或β构型。示例性的R9基团为-CH(α-OH)-、-CH(β-OH)-、-C(p-CH3)(α-OH)-、-C(α-CH3)(β-OH)-、-CH(α-OCH3)-、-CH(β-OCH3)-、-CH(α-OC(O)CH3)-和-CH(β-OC(O)CH3)-。其它R9基团为-CH(α-OC(O)CH2CH3)-、-CH(β-OC(O)CH2CH3)-、-CH(α-OCH2CH3)-、-CH(β-OCH2CH3)-、-C(β-CH3)(α-OC(O)CH3)-和-C(α-CH3)(β-OC(O)CH3)-。
生物动力学化合物。鉴定或表征生物动力学化合物的方法可以如上所述进行。所述方法任选地另外包括执行一种规程来测定试验化合物是否在体外试验中使急性生物学应答的递质的活性或水平受到约20%或约25%到约70%或约75%的调节，任选地，与糖皮质激素受体的适当的参考活化剂或拮抗剂例如地塞米松或氢化可的松相比，其中试验化合物不使糖皮质激素受体受到超过约10%、约20%或约30%的活化或拮抗。在这些实施方案中，急性刺激或生物学损害可以是使受试者暴露于充分量的电离辐射或促炎性信号、化合物或组合物，任选地，其中促炎性信号、化合物或组合物为细菌LPS或TNFα、和/或任选地其中急性生物学应答的递质为NF-κB或IκB。
急性刺激或生物学损害可以是对充分数量的用药物治疗的小鼠和充分数量的用媒介物对照小鼠给予充足的细菌LPS并且测量试验化合物对急性生物学应答的递质的影响，所述测量在以下时间进行：(i)所述急性应答为最大或接近最大，任选地在通过腹膜内注射给予细菌LPS之后的约1.5小时，例如，约70-110分钟或75-105分钟和(ii)在给予充足的细菌LPS之前和/或之后的一个或两个其它时间点，任选地在给予充足的细菌LPS之前的一个时间点和在急性应答为最大或接近最大之后的一个较晚的时间，任选地在通过腹膜内注射给予细菌LPS之后的约2.0或2.5小时，并且任选地其中急性生物学应答的递质为NF-κB或IκB。
给予充足的细菌LPS可以任选地实质上根据本文中所述的方法或其适当的变体进行，并且任选地，其中化合物部分地调节急性生物学应答的递质的水平或活性的能力实质上根据本文中所述的方法或其适当的变体进行。
可以分析的其它刺激或生物学损害包括缺血和一种或多种缺血组织的再灌注；相对低、中或高强度的热或化学灼伤；或暴露于其它毒素或毒物下。生物学损害的影响可以在多种组织或器官中进行评价，例如，脾、血液、骨髓、肺、脑、肝脏、肠、结肠或心脏。
可以评价的变量典型地包括受试者对于所给予的生物学损害产生最大应答的时间或时间段。通常，急性生物学损害在受试者接受损害的前30分钟到48小时内产生最大的生物学应答。给定的生物分子对急性生物学损害的最大应答通常持续约15分钟到约2小时，尽管一些应答在给定的时间段开始，并且随后在数天或更长时间内累积。最大生物学应答的时间段对于评价药物候选物的效力或作用机理来说是方便的时间段。
17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇发挥短暂的、但是非常有效的作用(所述作用消退并且恢复正常功能)的能力在本文中被称为生物动力学应答(参见实施例9)。由‘生物动力学试剂’例如17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇引起的生物动力学应答与化合物例如地塞米松引起的其效应物生物分子例如糖皮质激素受体或NF-κB的‘生物静力学应答’完全不同，所述生物静力学应答是通过糖皮质激素受体的活化进行的间接抑制。生物静力学应答实质上是“在所有的时间下都应答”，即，‘生物静力学药物’例如地塞米松的生物学效力在靶细胞或组织中在给定的浓度下有相对小的变化。
因此，生物静力学药物的药效作用主要随其浓度或药代动力学性质改变。相反，生物动力学试剂例如17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇的特征在于药效作用受到靶细胞或组织的浓度以及作为基础的生物学刺激的性质和强度的组合的影响。因此，生物学刺激是通过例如暴露于可能致死量的电离辐射例如γ-射线或X-射线或接触细菌LPS、TNFα、或可以活化或抑制炎症递质的其它试剂例如NF-κB、IKB、IL-6、C反应蛋白所引起的。在这方面，生物动力学药物可以在药代动力学和药效学作用之间表现出比生物静力学药物通常观察到的更不确定的统计学相关性。
生物动力学药物的一个方面在于其降低与可以至少部分地通过调节相同或类似的靶生物分子的生物静力学药物相关的系统毒性的潜在能力。生物静力学药物例如地塞米松可以在临床上用于治疗各种各样的炎症状况，但是‘在所有的时间下都应答’的生物活性可以引起毒性。在抑制NF-κB的情况中，其活性在大多数或所有组织中长时间(例如，超过1、2或4小时到约1、2、3天或更久)的恒定且相对完全的抑制(例如，被抑制约75%、80%、85%、90%、95%或实质上100%)可以导致可观察到的不需要的副作用，因为NF-κB活性的某些基础水平是大多数组织的正常生物学功能所需要的。与使用糖皮质激素例如地塞米松有关的已知的毒性可能在受影响的生物分子例如NF-κB被相对完全地关闭时至少部分地出现。相比之下，生物动力学药物可以发挥更短暂的应答，可以改善或减少可观察到的毒性副作用。
生物动力学药物的另一个方面在于它们可能以组织特异性的方式发挥治疗作用的能力。因此，动物对攻击例如暴露于生物学损害(例如可能致死量的细菌LPS或在短暂缺血之后再灌注受影响的组织)的应答可能在不同组织中表现为不同程度的NF-κB活化。生物动力学药物可以在其中动物的应答相对较大的组织中起作用，例如，小鼠的脾或心脏组织，而其它组织例如脑中的NF-κB功能相对未受影响，而对于至少部分介导对生物学损害的应答的目标生物分子来说，对生物学损害的应答相对较低。
生物动力学药物可以部分地由于它们部分地抑制目标生物分子的能力起作用。如实施例7中所述的，17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇和本文中描述的一些其它化合物在体外部分地抑制细胞中的NF-κB活化，但是在任何浓度下都没有观察到完全的抑制。这与生物静力学药物地塞米松的活性形成对比，生物静力学药物地塞米松在足够高的浓度完全地抑制NF-κB活性。体外的NF-κB的这种部分抑制似乎部分地通过该实施例中所述的其活性得以反映。因此，在至少一些情况中，生物动力学药物的特征在于在例如实施例7中所述的体外试验的系统中部分抑制或活化目标生物分子的能力。NF-κB的抑制似乎是间接的，因为目前不认为17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇和本文中描述的其它化合物直接结合于细胞质或细胞核中的NF-κB。
在这个实施例中描述的规程或其适合的变体，可用于表征其它化合物通过在体内调节(可检测地活化或可检测地拮抗或抑制)分子例如NF-κB而作为生物动力学或生物静力学试剂起作用的能力。化合物还可以在体外试验中进行分析，例如在实施例7中所述的试验中，以便进一步表征它们的作用机理。这个实施例中描述的体内规程的适合的变体包括使用不同剂量的试验化合物和不同的给药途径，例如约0.1mg/kg到约350mg/kg的剂量范围，将其以经口、经颊、舌下或非肠道(例如皮内、皮下、静脉内或肌肉内注射)给予、或通过鼻内给予或吸入到鼻部通道、梨鼻器或肺泡或通向肺泡的气道(例如，支气管或细支气管)中。适合的试验剂量典型地为约1-150mg/kg。可以在体内测量的生物分子例如IκB、激酶如src激酶、map激酶或本文中描述的其它信号递质。这种表征方法可以在多种受试者中的一种或多种中进行，例如啮齿类例如大鼠、狗、非人类的灵长类动物例如恒河猴或食蟹猴。可以对每组包括约3-12只动物，例如每组4-8只动物的动物组应用适合的媒介物或安慰剂对照、可能是生物动力学药物的试验化合物、阳性的生物动力学药物对照例如17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇、阳性的生物静力学药物对照例如地塞米松，并且将在不同细胞群或组织中试验化合物的应答的组与一个或多个对照组进行比较，例如，媒介物对照组、阳性或阴性生物动力学药物对照或阳性或阴性生物静力学药物对照。
在将这种分析应用于人类时，实验选项的范围与其它动物相比自然地减少。人的组织或样品例如血液、骨髓或肺灌洗液比需要通过侵入性技术获得的其它组织类型例如脾或肝脏更容易得到用于分析。因此，通常，在使用人类进行应答评价之前或同时进行动物研究。
炎症治疗。式1化合物的活性的一个方面在于它们可以通过影响炎症的递质例如NF-κB、IL-6或TNFα而减少炎症。NF-κB分子通常是重要的炎症递质。增加的NF-κB活化涉及多种炎症性疾病和自身免疫病况。
式1化合物可用于治疗或改善与以下病况有关的症状：炎症，例如疼痛、发烧或疲劳、子宫内膜异位症；发烧；纤维肌痛；肾小球肾炎；移植物抗宿主疾病；器官或组织移植排斥，例如，肾、肺、骨髓或肝脏移植；失血性休克；纤维肌痛；痛觉过敏；炎性肠病；胃炎；肠易激综合征；溃疡性结肠炎；消化性溃疡；应激性溃疡；出血性溃疡；胃酸过多；消化不良；胃轻瘫；胃食管返流疾病；关节的炎症性病况，包括骨关节炎、牛皮癣性关节炎和类风湿性关节炎；炎症性眼病，如可能与例如角膜的移植有关的；缺血，包括脑缺血(例如，外伤、癫痫症、出血或卒中引起的脑损伤，其每一种都可以引起神经变性)；川崎病；学习损伤；肺病(例如，ARDS)；多发性硬化；肌病(例如，肌肉蛋白代谢，特别是脓毒病)；神经毒性(例如，由HIV诱导的)；骨质疏松症；疼痛，包括癌症相关的疼痛；帕金森病；阿尔茨海默病；牙周病；早产；牛皮癣；再灌注损伤；脓毒性休克；放射治疗的副作用；暂时性下颌关节病；酒精诱导的肝损伤，包括酒精性肝硬化；风湿热；肉状瘤病；硬皮病；慢性疲劳综合征；冠状动脉的病况和迹象，包括充血性心力衰竭、冠状动脉再狭窄、心肌梗塞、心肌功能异常(例如，与脓毒病有关的)、和冠状动脉旁路移植术；睡眠紊乱；葡萄膜炎；血清阴性的多发性关节炎；强直性脊椎炎；瑞特氏综合征和反应性关节炎；斯提耳病；牛皮癣性关节炎；肠病性关节炎；多肌炎；皮肤肌炎；硬皮病；系统性硬化；血管炎(例如，川崎病)；由于例如，张力、扭伤或软骨损坏引起的炎症；创伤愈合；皮肤薄或皮肤脆弱；瘀点或瘀癍；红斑；和外伤。外伤包括创伤、化学灼伤、热灼伤、辐射烧伤和与外科手术例如矫形外科或腹部外科手术有关的组织或器官损伤。
炎症状况可以包括与再灌注损伤有关的炎症、血管成形术之后的再狭窄、心肌梗塞或脑梗塞。不期望的炎症状况或症状包括肺的炎症状况，例如，囊性纤维化、急性哮喘、慢性哮喘、类固醇抵抗性哮喘、急性支气管炎、慢性支气管炎、气肿、牛皮癣、湿疹、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)或慢性阻塞性肺病(COPD)。
自身免疫病况。式1化合物(F1C)和本文中所述的组合物可用于治疗、预防或延缓自身免疫病况的进展，例如1型糖尿病、克隆病、关节炎、接触性皮炎、狼疮和多发性硬化(MS)病况。MS病况包括复发-缓解型MS和继发进展型MS。狼疮病况包括系统性红斑狼疮、红斑狼疮相关的关节炎、红斑狼疮相关的皮肤改变、红斑狼疮相关的血液学异常、红斑狼疮相关的肾损伤、红斑狼疮相关的心脏或肺疾病、红斑狼疮相关的神经精神病学改变、红斑狼疮相关的组织炎症、盘状红斑狼疮、亚急性皮肤性红斑狼疮和药物诱导的红斑狼疮。关节炎和相关病况包括类风湿性关节炎、骨关节炎、纤维肌痛、原发性骨关节炎、继发性骨关节炎、牛皮癣性关节炎、红斑狼疮相关的关节炎、与急性或慢性炎性肠病或结肠炎相关的关节炎、与强直性脊椎炎有关的关节炎、关节炎相关的组织炎症、关节疼痛、连接硬化、关节运动损害、关节肿胀、连接炎症和滑膜炎症。
F1C或包含F1C和一种或多种赋形剂的组合物可用于治疗、预防、延迟以下病况的发作或延缓其进展，例如强直性脊椎炎、牛皮癣、湿疹、结肠炎、克隆病、急性或慢性炎性肠病、自身免疫性肾损伤和肝损伤。F1C可用于治疗肺和气道病况，包括哮喘病况，例如类固醇非相关性哮喘、重症哮喘、特异性哮喘、急性哮喘或慢性哮喘、变应性鼻炎、慢性支气管炎、急性支气管炎、囊性纤维化、气肿、肺部纤维化、肺气道高反应性、慢性阻塞性肺病、肺水肿和急性呼吸窘迫综合征。
实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)是在动物中进行的试验条件，其具有与人MS相似的临床、组织病理学和免疫学特征，并且与MS一样，表现为渗透到CNS的T细胞和单核细胞中。可以通过用在适当助剂中的蛋白脂质脂蛋白(PLP)免疫在易感小鼠中诱导EAE。EAE动物模型是用于研究MS的发病机理和用于表征新的用于治疗MS的药物的人MS体内模型。
代谢性病症的治疗。式1化合物可用于治疗、预防或延缓代谢性病症的进展，例如1型糖尿病、2型糖尿病、X综合征、高胆固醇血症、高血糖症、胰岛素耐受(例如，与肥胖症有关的)、葡萄糖不耐性、高甘油三酯血症、高脂蛋白血症、脂肪营养不良病况、X综合征、动脉硬化、动脉粥样硬化和肥胖症。X综合征(包括代谢综合征)定义为两种或多种异常的集合，包括高胰岛素血症；肥胖症；甘油三酯、尿酸、纤维蛋白原、低密度LDL粒子和血纤蛋白溶酶原活化物抑制剂1(PAI-1)水平升高；和HDL-c水平降低。许多具有胰岛素耐受但尚未形成2型糖尿病的患者也处于形成代谢综合征的危险中，也称为X综合征、胰岛素耐受综合征或多型代谢综合征(plurimetabolic syndrome)。X综合征典型地发生在具有高脂血症、高胰岛素血症、肥胖症、胰岛素耐受、引起2型糖尿病的胰岛素耐受及其糖尿病并发症(即，其中胰岛素耐受是病理生理学的一部分的疾病)中的两种或更多种的患者中。
可以用F1C治疗已经涉及与代谢病症有关的心血管疾病的独立的危险因素。这些危险因素包括高血压、纤维蛋白原水平增加、高甘油三酯水平、LDL胆固醇升高、总胆固醇升高和低的HDL胆固醇水平。所述治疗可以导致刺激胰腺β-细胞分泌更多的胰岛素和/或延缓可能在糖尿病患者或肥胖患者中随时间发生的胰腺β-细胞损失的速率。
用式1化合物治疗代谢病症可以与其它治疗方法结合。可以用式1化合物和多种治疗剂中的一种或多种来治疗糖尿病，所述多种治疗剂包括胰岛素敏化剂，例如PPAR-γ激动剂例如格列酮类；双胍类；蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B抑制剂；二肽基肽酶IV抑制剂；胰岛素；胰岛素模拟物；磺酰脲类；氯茴苯酸类；α-糖苷水解酶抑制剂；和α-淀粉酶抑制剂。二甲双胍、苯乙双胍、阿卡波糖和罗格列酮是已经用于治疗一些类型糖尿病的药物。
如上所述，包含F1C的组合物可用于治疗、预防或延缓胰岛素耐受或其症状的进展。胰岛素耐受是胰岛素在广泛范围的浓度内发挥其生物学作用的能力减弱，产生小于所期望的生物学作用。胰岛素耐受的人适当代谢葡萄糖的能力减弱，并且对胰岛素疗法的应答差，即使有一些应答。胰岛素耐受的症状包括肌肉中葡萄糖摄入、氧化和储存的不充分的胰岛素活化以及脂肪组织中脂解和细胞中葡萄糖产生和分泌的不充分的胰岛素抑制。胰岛素耐受可以引起或者有助于多囊性卵巢过度刺激综合征、葡萄糖耐量低减、妊娠期的糖尿病、高血压、肥胖症和动脉粥样硬化。F1C组合物可用于降低胰岛素耐受患者的甘油三酯水平。
如上所述，本发明的实施方案包括鉴定具有用于治疗、延缓其进展、延缓其发作或缓解人或其它哺乳动物的代谢病症或其症状的潜力的化合物(或“试验化合物”)的方法。通过所述方法鉴定的化合物通常被描述为具有一种或多种所述活性的体外的PPAR的非活化剂和体外的NF-κB不完全抑制剂，所述活性典型地得自体内观察结果，例如，高血糖症的发病延迟或现有糖尿病病况的进展延缓。具有这些特征的化合物是可以作为用于治疗这些病症的药物进行评价的一类新的化合物。
在这些实施方案中，所述方法包括选择以下的试验化合物，(i)与在体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外不使人或哺乳动物细胞中的PPAR-α、PPAR-κ和PPAR-δ中的一种、两种或三种活化超过约10%、约20%、约30%或约40%；(ii)与在体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外使人或哺乳动物细胞中的NF-κB的转录活性或水平抑制或减少约20-80%或约25-75%或约30-70%或约35-65%；(iii)与适当的阴性对照或正常对照相比，减轻高血糖症、延缓高血糖症的进展或延迟其发病，增加胰岛素敏感性，减少葡萄糖不耐性、延缓胰腺β-小岛细胞数量或其分泌胰岛素的能力丧失的进展或速率，增加胰腺β-小岛细胞数量或其分泌胰岛素的能力，延缓db/db小鼠或患有膳食诱导的肥胖症的小鼠的体重增加速率，降低升高的甘油三酯水平，降低升高的总的血液或血清胆固醇水平，降低血液或血清中正常或升高的LDL、VLDL、apoB-100或apoB-48的水平，或增加血液或血清中正常或升高的HDL或apoA1水平或降低血液或血清中升高的纤维蛋白原水平；和(iv)任选地，与在体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外不使人或哺乳动物细胞中的糖皮质激素受体、雄激素受体、雌激素受体-α、雌激素受体-β、盐皮质激素受体、孕激素受体或这些生物分子中任一种的生物学活性的变体或同工型活化超过约5%、约10%、约20%或约30%。这使得允许鉴定或至少部分地表征具有用于治疗或改善哺乳动物的代谢病症的潜力的化合物。
在一些实施方案中，可以将试验化合物的活性与适当的参考化合物例如式1化合物相比较。式1化合物可在所述方法中用作符合所述方法提供的特征的阳性对照或阳性参考标准。这种化合物包括17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇和雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇。其它式1化合物可以用作可能表现出三种所需特征中的0种、1种或2种的阴性对照或参考标准。这种化合物包括16α-溴表雄酮、16α-溴-3β,17β-二羟雄甾-5-烯和16α-羟基表雄酮。
本发明的实施方案包括测定试验化合物对与代谢病症或疾病有关的一种或多种病况或症状的作用。典型地，将这种测定与适当的阴性对照或正常对照相比较，或与适当的阳性对照相比较，并且所述测定在人或动物体内进行，尽管所述测定有时可以在全细胞或细胞溶胞产物中在体外进行。
高血糖症的减轻可以在血液或血清葡萄糖水平降低到正常空腹范围内时被观察到，对于至少2岁的人来说，所述范围为约70mg/dL到105mg/dL或115mg/dL，而高血糖症的空腹葡萄糖水平为约135mg/dL或约140mg/dL到200mg/dL、300mg/dL或350mg/dL。超过约400mg/dL的葡萄糖水平是危及生命的。血液或血清中的饭后葡萄糖在摄入碳水化合物之后的2小时测量，对于人来说最低为75g，随后抽取血液测量葡萄糖。人的140mg/dL to 200mg/dL的饭后血液或血清葡萄糖水平表示高血糖症病况，而超过200mg/dL的葡萄糖水平则确定人患有糖尿病。对于人来说，典型地对于70-115mg/dL的正常空腹葡萄糖水平的患者来说，可以进行使用血液的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。在人的OGTT中，如果峰葡萄糖水平(典型地在进食之后的30分钟或1小时)和2小时后的碳水化合物值在两种或更多种情况中超过200mg/dL，则表示该患者患有糖尿病。
作为人的血糖的替代物，使用糖基化的血红素或Hb A1c的测量值用于例如监控糖尿病治疗。测量Hb A1c允许在试验之前的100到120天内评价血糖或糖水平，并且其对例如刚刚进餐或空腹状态的短期变化不敏感。2.2-48%的Hb A1c水平对于成年人来说是正常的，而2.5-5.9%的水平表示糖尿病得到好的控制，6-8%的水平表示中等的糖尿病控制，超过8%的Hb A1c水平表示对糖尿病病况的差的控制。对于进行和解释这些和相关规程的方法已经描述在例如，K.D.Pagana和T.J.Pagana,Mosby's Diagnostic and Laboratory Test Reference，第5版，2001,Mosby Inc.,第441-448、451-458、507-509页中。用式1化合物进行治疗用于降低Hb A1c，其与改善的糖尿病控制或治疗相关。
使用本文中所述的方法可以使葡萄糖、葡萄糖替代物或其它值例如相反应性蛋白(phase reactive proteins)或脂质组分例如总胆固醇的水平正常化，例如，使其回到正常限度或范围，或靠近正常限度或范围。葡萄糖或替代物值的正常化典型地作为升高的葡萄糖或替代物水平下降到正常葡萄糖水平的约1%、约2%、约3%或约5%范围内或正常葡萄糖替代物值的约5%或约8%范围内观察到。其它物类的葡萄糖值已经有所描述，并且可以将类似的测量或试验用于对于那些物类进行的本发明的方法中。其它值的正常化典型地作为异常高或低的水平返回到对于受试者物类来说的所述值的正常范围的上端或下端值的约2%或约4%到约6%、约10%或约12%范围内。
通过本发明方法鉴定的化合物可用于延缓高血糖症的进展或延迟其发病，或者用于增加其中已有或者有理由预期形成胰岛素耐受的患者的胰岛素敏感性。化合物的其它作用包括降低葡萄糖不耐性、延缓胰腺β-小岛细胞数量或它们分泌胰岛素能力损失的进展或速率、或增加胰腺β-小岛细胞数量或其分泌胰岛素的能力。
在一些实施方案中，可以在肥胖受试者中进行所述方法。如本文中使用的人的肥胖症或“超重”泛指(1)体重指数为约26kg/m2，27kg/m2，28kg/m2，29kg/m2，30kg/m2，31kg/m2，32kg/m2或更大的成年男性，和体重指数至少为约26kg/m2，27kg/m2，28kg/m2，29kg/m2，30kg/m2，31kg/m2，32kg/m2或更大的成年女性，或(2)由卫生保健人员例如医生或护士评价为肥胖或过重的状况。对于例如人来说，肥胖症的确定可能要考虑到身体脂肪含量和分布，因为一些具有高体重指数的人可能由于高的肌肉组织量代替脂肪或脂质组织、或者由于在不同于腹部的身体区域例如臀部或骨盆中显著量的身体脂肪或脂质而在学术上不认为是肥胖。肥胖症和体重指数已经有所描述，例如，G.A.Colditz,Med.Sci.Sports Exerc,31(11),Suppl.,第S663-S667页,1999；F.J.Nieto-Garcia等人，Epidemiology,1(2):146-152,1990,R.H.Eckel,Circulation,96:3248-3250,1999。
在一些实施方案中，典型地如体外试验测定的，与适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，通过本发明方法鉴定的化合物在体外不使人或哺乳动物细胞中的以下的一种或多种显著地活化超过约10%、约20%或约30%：盐皮质激素受体、孕激素受体、糖皮质激素受体、雄激素受体、雌激素受体-α、雌激素受体-β或任何这些生物分子的生物学活性变体。测量这些活性的方法已经描述在例如美国专利5,298,429中。在一个示例性的方法中，评价试验是否是激素受体蛋白质的功能性配体或其功能性工程化或修饰形式的测定法包括：(a)培养细胞，所述细胞包含：表达激素受体蛋白质、或其功能性工程化或修饰形式的非内原性DNA，和编码与报道基因有关的动作性激素反应元件的DNA，其中培养在至少一种试验化合物的存在下进行，所述化合物即要设法测定其作为激素受体蛋白质的配体或调节剂、或其功能性工程化或修饰形式的能力的化合物，和(b)测定所述细胞中所述报道基因转录的证据。这种测定法典型地使用哺乳动物细胞进行，例如，CV-1或COS细胞。报道基因可以包含在报道基因质粒中，而表达激素受体蛋白质或其功能性修饰形式的非内原性DNA包含在表达质粒中，其中所述报道基因和表达质粒还包含SV-40的复制起点。此外，报道基因可以包含在报道基因质粒中，其中表达激素受体蛋白质或其功能性修饰形式的非内原性DNA包含在表达质粒中，其中报道基因和表达质粒还包含选择性标记。相关测定法可以使用具有可检测的报道基因的稳定转染的细胞，例如，对于雌激素受体-β(基于ERβ-UAS-bla GripTiteTM细胞的测定法，目录编号K1091,Invitrogen Corp.)、雌激素受体-α(基于ERα-UAS-bla GripTiteTM293细胞的测定法，目录编号K1090,InvitrogenCorp.)、雄激素受体(基于AR-UAS-bla GripTiteTM293MSR细胞的测定法，目录编号K1082,Invitrogen Corp.)或孕激素受体(孕酮受体-UAS-blaHEK293T试验，目录编号K1103,Invitrogen Corp.)所述的。
本发明的实施方案包括确定或表征具有用于治疗或改善哺乳动物的代谢病症的潜力的化合物的方法，所述方法包括选择如下的化合物：(i)与体外的适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外不使PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-δ中的一种、两种或三种活化超过约30%；(ii)与体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外使人或哺乳动物细胞中NF-κB的转录活性或水平抑制或减少约20-80%；(iii)与适当的阴性对照或正常对照相比，减少高血糖症、延缓高血糖症的进展或延迟其发病，增加胰岛素敏感性，降低葡萄糖不耐性，延缓胰腺β-小岛细胞数量或它们分泌胰岛素能力损失的进展或速率，增加胰腺β-小岛细胞数量或它们分泌胰岛素能力，延缓db/db小鼠或患有膳食诱导的或膳食相关的肥胖症的受试者的体重增加速率，降低升高的甘油三酯水平，降低升高的总血液或血清胆固醇水平，降低正常或升高的血液或血清LDL、VLDL、apoB-100或apoB-48水平，或增加正常或低的血液或血清HDL或apoA1水平，或降低升高的血液或血清纤维蛋白原水平；(iv)任选地，与体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外不使糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、孕激素受体、雄激素受体、雌激素受体-α、雌激素受体-β或任何这些生物分子的生物学活性变体中的一种或多种活化超过约30%；和(v)任选地在体外在肝细胞或肝脏衍生的细胞中或在体内在肝细胞或得自肝细胞或肝组织的肝细胞或组织中抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)或11β-羟类固醇脱氢酶(11β-HSD)、任选的11β-HSD1型或11β-HSD2型的水平或活性；所述方法允许鉴定或表征具有用于治疗或改善人或另外的哺乳动物中的代谢病症的潜力的化合物。PEPCK酶可以是细胞溶质或线粒体来源的。
骨损失病况。包含F1C和一种或多种赋形剂的组合物可用于本文中所述的骨损失或骨质减少病症的治疗、预防、延迟其发病或延缓其进展，例如，骨质疏松症病况，例如原发性骨质疏松症、绝经后或1型骨质疏松症、更年期或2型骨质疏松症、自发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症例如糖皮质激素相关的骨损失病况和与外伤例如第一、第二或第三级的热、化学或辐射灼伤有关的骨损失。用F1C治疗可以改善骨质量、骨密度和/或骨强度。
药物产品。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗炎症状况的药物产品。所述药物产品典型地包括(a)适合于例如口服或非肠道给予的剂型例如固体或液体剂型的药物。药物的包装和/或包装说明书或标签具有关于药物效力、作用机理、预定患者人群、剂量、剂量给药方案、给药途径、生物学损害的毒性或所述药物可用于治疗的损害的严重程度的信息，如果这些是已知的。在生物学损害是射线照射时，包装说明书或标签可以包含关于可以应用或被批准应用所述药物产品的辐射剂量或剂量范围的信息。药物产品可以任选地包含日志或使用指令，以便患者记录何时或如何使用药物，或在使用药物过程中或之后使用者经历了什么症状或药物作用。这可以帮助药物效力或副作用的IV期或销售后分析。药物产品的其它实施方案如本文这描述的其它实施方案中所述。
如本文中使用的的药物产品是指已经由有权检查或批准销售或医疗应用的申请的管理机构或组织检查并且批准用于上市或销售的产品，所述管理机构或组织例如，美国食品和药品管理局（U.S.Food andDrug Administration）或欧洲药品局(European Medicines Agency)或欧洲药品评价局(European Medicines Evaluation Agency)。药品产品的应用包括其上市或销售和销售要约或购买考虑(buy it for consideration)。这些活动典型地遵守可以影响或管理上市、销售、购买或产品处理的规章批准的限定。药品产品中的药物可以新药物、普通药品、生物制品、医疗器材或用于这些中任一项应用的规程。药物产品通常获得了美国食品和药品管理局或欧洲药品评价局的美国或非美国新药申请、简化的新药申请、生物制品许可证申请或销售医疗器材申请的销售批准。药物产品的应用包括将其卖给政府或私人的买主，例如美国国防部、美国能源部、美国健康和公共事业部或私人药物买主或经销商组织。其它应用包括使用所述药物治疗指出或批准的医疗病况和医生批准的应用或未适应症外用途(off label use)。批准前的药物产品是本发明的其它方面，其可能实质上与本文中所述的药物产品相同，但是其可用于在上市批准之前制备用于销售或用于管理部门审查的药物。
药物产品确定的预定患者人群也可以指定被排除的人群，如果有的话，排除将其应用于例如小儿科患者或老年患者。关于剂量的信息典型地具体说明药物的每天剂量，而剂量给药方案描述给予或服用药物的频率和持续时间。给药途径确定适合于药物应用的一种或多种路径，尽管给定的制剂典型地被批准只用于一种给药途径。包装或标签可以确定的剂量、剂量给药方案和给药途径如本文中其它地方所述。
在一个实施方案中，药物产品用于治疗、预防或改善炎症状况或本文中描述的另一种病况，并且其包括或包含制剂和包装说明书或标签，所述制剂包含与1、2、3、4或更多种用于口服或非肠道(例如，肌肉、皮下或真皮下注射)给予的赋形剂配制的化合物例如式1化合物，所述包装说明书或标签描述在疾病或包括确诊或以其它方式观察到之后开始给予式1化合物的日剂量(例如，0.5mg、1mg、4mg、5mg、10mg、20mg、25mg、50mg、100mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg或500mg)，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续日。包装说明书或标签的信息可以包含关于对药物或治疗方案的生物学应答的信息。所述信息可以包括对以下的一种或多种情况的说明：(a)与人或哺乳动物例如非人类灵长类动物中使用所述药物有关的一种或多种副作用或毒性，(b)其对炎症或其它病况的作用，(c)将另外的治疗剂例如地塞米松或其它糖皮质激素与所述药物一起应用的规程或指导和(d)为了获得最佳或已知的治疗利益开始关于所述药物的时间或时间段。
在一些方面中，本发明提供鉴定可能用于可检测地调节哺乳动物中的CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25+CD103+调节性T细胞、CD4+CD25highCD103+调节性T细胞、或CD4+CD25high调节性T细胞的数量或活性的化合物的方法，其包括选择如下的化合物：(i)与体外的适当的对照人或哺乳动物细胞相比，在体外不使人或哺乳动物细胞中的糖皮质激素受体、雄激素受体、雌激素受体-α、雌激素受体-β或任何这些生物分子的生物学活性变体中的一种或多种活化或抑制超过约30%；(ii)分子量为约100-1000道尔顿，任选地，分子量为约250-850道尔顿；(iii)与适当的阴性对照或正常对照相比，在适当的测定法中使CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25+CD103+调节性T细胞、CD4+CD25highCD103+调节性T细胞、或CD4+CD25high调节性T细胞的数量或活性增加或减少超过20%；和(iv)与体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外任选地使人或哺乳动物细胞中的NF-κB转录活性或水平抑制或降低约20-80%。式1化合物和其它化合物可用于实质上如以下实施例20或21中所述的这些实施方案中。
在体外或体内增加或减少某些T细胞亚群例如CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25highT细胞的活性或数量的化合物是用于治疗或延缓自身免疫病况、癌症、神经病学外伤或病症(例如外伤如缺血之后的神经元损失)和代谢疾病如I型糖尿病、动脉粥样硬化、自体移植中的细胞、器官或组织排斥、以及在存在或可能发生这些状况的位置的移植物抗宿主疾病的发病或进展的候选物。所述治疗可用于改善创伤愈合、治疗再灌注损伤、狭窄、血管成形术之后的再狭窄、心肌梗塞或脑梗塞。实施方案包括分子量小于约2,000道尔顿、小于约1,000道尔顿、或小于约500道尔顿的化合物。一组化合物的分子量为约285或290到约500或650道尔顿。Treg细胞应答可以作为与适当的阴性对照相比在用化合物治疗的受试者或在用化合物处理的体外试验中使Treg细胞增加或减少约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约60%、约70%、约80%、约100%、约200%、约400%、约600%、约1000%、约2000%、约5000%、约10000%或更多而观察到，Treg细胞典型地为CD4+CD25+T细胞或CD4+CD25high T细胞。这些改变可以作为Treg细胞数量或体外或体内的它们在循环血液或在细胞中中的活性的增加或降低而观察到。
分析亚群细胞模式例如T细胞模式的方法可以通过多种方法中的任一种得到，包括流式细胞光度术(FACS)，例如，Levy等人，Clin.Immunol.Immunopathol.35:328,1985。在FACS分析中，各种亚群细胞的单克隆抗体结合于并且鉴定存在于细胞上的表型表面抗原。存在有市售的可以检测这些指示物存在的抗体，使得通常不需要制备抗体。预期鉴定相同或紧密相关的抗原指示物的抗体给出相似的诊断结果。因此，在说明书或权利要求书中引证与其结合的具体的单克隆抗体(例如，CD4或CD25)指定指示物抗原时，这种指定包括该指示物，即使在鉴定中使用了不同的单克隆抗体。所关心的表型指示物包括用于多种亚群细胞型的一般指示物，包括用于总T细胞的CD3、用于辅助/诱导性T细胞的CD4、用于抑制性T细胞/细胞毒性T细胞的CD8、和用于NK细胞的CD16/56；表达CD8的子集指示物，例如用于抑制性T细胞的CD11b、用于活化的抑制性T细胞/细胞毒性T细胞的cd38、用于活化的抑制性T细胞/细胞毒性T细胞的HLA-DR、和CD57；以及表达CD4的指示物，例如CD25和用于活化的辅助/诱导性T细胞的HLA-DR，包括Treg细胞。
剂量给药规程或方法。在治疗本文中公开的任何病况或症状时，可以对患有所述病况或症状或对病况或症状敏感的受试者连续地(每天)或周期性地给予式1化合物。在用式1化合物治疗病况例如炎症状况或本文中公开的另一种病况时，间歇的剂量给药可以避免或改善通常与非连续剂量给药有关的一些不期望的方面。这种不期望的方面包括患者或受试者没能遵守每天的剂量给药方案或降低其它治疗剂例如糖皮质激素的剂量和/或与它们相关的不期望的副作用或毒性，例如骨损失或再吸收。
在一些实施方案中，只要疾病或症状是明显的，则继续每天的剂量给药，典型地对于慢性病况来说如此。在其它实施方案中，每天的剂量给药持续1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续日，然后随后是一段时间的无剂量给药，直到或如果再次需要剂量给药。这些实施方案典型地涉及治疗可能不时地复发或不复发的急性病况。慢性病况的治疗典型地涉及长时间的连续的每天剂量给药。
在任何连续(每天)或间歇的剂量给药方案中，或在治疗本文中所述的任何疾病、病况或症状时，式1化合物可以通过一种或多种适当的路径给予，例如，口服、经颊、舌下、局部、肌肉内、皮下、真皮下、静脉内、皮内、或通过气雾剂给予。
日剂量通常为约0.05mg/kg/天到约200mg/kg/天。典型的剂量范围为约0.1到约100mg/kg/天，包括约0.2mg/kg/天,0.5mg/kg/天、约1mg/kg/天、约2mg/kg/天、约4mg/kg/天、约5mg/kg/天、约6mg/kg/天、约8mg/kg/天、约10mg/kg/天、约20mg/kg/天、约40mg/kg/天或约100mg/kg/天。也可以在兽医应用的情况中采用更高的剂量，例如，约250mg/kg/天、约300mg/kg/天或约350mg/kg/天。可以将式1化合物以约2到约50mg/kg/天或约2-40mg/kg/天口服或通过非肠道给予。这种剂量给药典型地产生约4ng/mL或约8ng/mL到约125ng/mL或约250ng/mL的式1化合物的血清水平，例如，约15ng/mL到约120ng/mL或约20ng/mL到约100ng/mL。这种血清水平可以是短暂的，例如，持续约30分钟或约60分钟到约2小时或约8小时，我可以出现在给予化合物的当天，或者对于储库制剂在较迟的时间出现。
连续的每天剂量给药通常用于治疗本文中所述的慢性病况。日剂量通常作为单独的剂量给予，但是可以将日剂量再分成2或3个亚剂量。间歇的剂量给药规程包括每隔1天或每隔两天给予式1化合物，持续适当的时间段。在治疗血细胞缺乏时，剂量给药通常从受试者经历短期清髓事件(short-lived myeloablative event)例如射线照射的当天开始。对于持续较久的情况，例如，癌症的化学疗法，剂量给药式1化合物可以在已经对受试者给予化疗剂之后的约12小时、约1天、约2天或约3天开始。每天的剂量给药可以持续确定的时间段，随后是固定或可变的没有剂量给药的时间段。在这些实施方案中，疾病活动例如多发性硬化、关节炎、哮喘、结肠炎或克隆病活动的治疗可以为持续3-14个连续日或5-10个连续日的每天剂量给药，之后在另一个疾病活动发生或开始之前不再给予治疗。
临床病况和症状。本文中所述的化合物和方法可用于使本文中所述的病况和/或它们的一种或多种症状得到治疗、改善、预防或延缓其进展。这种应用包括抑制骨吸收，减少与化学疗法(例如，抗炎剂糖皮质激素)有关或由其引起的不期望的副作用，治疗、预防或延缓骨质疏松症和骨折，抑制血管再狭窄，和治疗糖尿病性视网膜病、黄斑变性、炎症。**1**，不期望的炎症状况或症状，例如肺的炎症状况，例如，囊性纤维化、急性或慢性哮喘、支气管哮喘、特异性哮喘、ARDS或COPD，或自身免疫病症例如骨关节炎、类风湿性关节炎、胰腺炎例如自身免疫胰腺炎，系统性红斑狼疮、红斑狼疮相关的组织炎症、红斑狼疮相关的关节炎、红斑狼疮相关的皮肤改变、红斑狼疮相关的血液学异常、红斑狼疮相关的肾脏损伤、红斑狼疮相关的心脏或肺疾病、和不期望的红斑狼疮相关的神经精神病学或神经病学改变。
可以治疗的病况的症状包括发烧、关节疼痛(关节痛)、关节炎和浆膜炎(胸膜炎或心包炎)。也可以给予其它药物用于本发明的治疗中。因此，疼痛可以使用非甾体抗炎药例如阿司匹林、水杨酸酯、布洛芬、萘普生、舒林酸、奥沙普秦和托美丁来治疗。系统性红斑狼疮的皮肤特征可以用抗疟药治疗，例如羟氯喹、氯喹和米帕林。维A酸类例如异维甲酸(istretinoin)和阿维A酯也可与本文中所述的化合物组合用于治疗皮肤症状。器官损坏可以用通常口服或静脉内给予的皮质类固醇治疗。可使用的皮质类固醇包括氢化可的松(Cortisol)、皮质酮、醛甾酮、ACTH、曲安西龙和衍生物例如双乙酸曲安西龙、己曲安奈德、和曲安奈德，倍他米松和衍生物例如二丙酸倍他米松、苯甲酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、乙酸倍他米松、和戊酸倍他米松，氟尼缩松、泼尼松及其衍生物、肤轻松和衍生物例如氟轻松、二氟拉松和衍生物例如双醋酸二氟拉松、哈西奈德，地塞米松和衍生物例如二丙酸地塞米松和戊酸地塞米松，去羟米松(去羟基倍他米松)，二氟可龙和衍生物例如戊酸二氟可龙)，氟氯奈德，醋酸氟轻松，氟可龙，氟泼尼定，氟氢缩松，氯倍他索，氯倍他松和衍生物例如丁酸氯倍他松阿氯米松，二氟美松，和氟可龙。
在皮质类固醇的口服给药不能胜任时，静脉注射甲基氢化泼尼松脉冲疗法(高剂量)可用于治疗狼疮肾炎和其它严重的非肾表现，例如溶血性贫血、中枢神经系统炎症(大脑炎)、低血小板计数和严重的胸膜心包炎。
式1化合物可用于使骨质疏松症或骨折得到治疗、预防或延缓其进展。受试者的治疗可以引起骨增强和/或骨质量或矿物质损失减少，引起对骨折的抵抗力增加。如本文中使用的，“治疗”本文中所述的那些病况是指所述治疗可以引起所述病况得到改善、预防或延缓其进展，和/或这种病况的一种或多种症状得到改善、预防或延缓其进展。
式I化合物可用于代谢疾病的治疗、预防、延缓其进展或延迟其发病，例如I型糖尿病、II型糖尿病、高血糖症、胰岛素耐受、葡萄糖不耐性、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高脂蛋白血症、脂肪营养不良、X综合征和动脉粥样硬化。
制剂和用于制备制剂的组合物。本发明的实施方案包括本文中和在本公开的其它地方描述的制剂。尽管式1化合物有可能单独给予，但是通常将其作为制剂提供。所述制剂，对于兽医学和人类应用，包括至少一种式1化合物以及一种或多种赋形剂和任选的一种或多种另外的治疗成分。
制剂包括含1、2、3、4或更多种药学可接受的赋形剂或载体的组合物。组合物用于制备适合于人或动物应用的制剂。适合的制剂给药途径包括口服、直肠、经鼻、局部(包括经颊和舌下)、阴道、直肠和非肠道(包括皮下、肌肉内、静脉内、真皮内、鞘内、眼内和硬膜外)。通常，含水和非水液体或霜剂制剂通过非肠道、口服、或局部途径递送。在其它实施方案中，例如在本发明的间歇剂量给药方法中，式1化合物可以作为适合于通过本文中公开的任何途径给药的含水或非水液体制剂或固体制剂存在，例如，口服、局部、经颊、舌下、非肠道、吸入气雾剂或储库例如皮下仓库或腹膜内或肌肉内储库。应该理解，优选的途径可以随例如受试者的病理学状况或体重、或受试者对所使用的式1化合物或其它治疗方法进行治疗的应答的不同而异，或者对于所述情况来说是适当的。
制剂包括适合于上述给药途径的那些。制剂可以方便地作为单位剂型存在，并且可以通过制药领域中已知的任何方法制备。所述技术、赋形剂和制剂通常在例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,PA1985,第17版；Nema等人，PDA J.Pharm.Sci.Tech.199751:166-171；G.Cole等人编辑的Pharmaceutical CoatingTechnology,1995,Taylor&Francis,ISBN0136628915；H.A.Lieberman等人编辑的Pharmaceutical Dosage Forms,1992第二次修订版，第1和2卷,Marcel Dekker,ISBN0824793870；J.T.Carstensen.PharmaceuticalPreformulation,1998，第1-306页,Technomic Publishing Co.ISBN1566766907中发现。用于制剂的示例性赋形剂包括乳化蜡、没食子酸丙酯、柠檬酸、乳酸、聚山梨酯80、氯化钠、棕榈酸异丙酯、甘油、白矿脂和本文公开的其它赋形剂。
适合于通过本文中公开的途径给予的制剂、或本文中公开的用于生产制剂的组合物任选地包括约0.01到约500微米、约0.1到约100微米或约0.5到约75微米的平均粒径。平均粒径包括以0.05微米或0.1微米或其它增量介于0.01到500微米的范围内(例如，约0.05、0.1、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、85、100、120等微米数)的平均粒径。在式1化合物或包括式1化合物的组合物被用作中间体来生产制剂时，它们可以包括这些平均粒径或粒度范围中的一种、两种、三种或更多种。在制备本文中公开的并且包括式1化合物(和任选的一种或多种赋形剂)的任何组合物或制剂时，可以任选地将化合物或组合物研磨、过筛或以另外方式造粒，以得到期望的粒径。
在一些实施方案中，可使用的式1化合物的特征在于没有可以感知的男化性能(androgenicity)。在这些实施方案中，式1化合物的特征在于具有雄激素例如睾酮、丙酸睾酮、二氢睾酮或丙酸二氢睾酮的约30%或更低、约20%或更低、约10%或更低、约5%或更低的男化性能，如使用适合的阳性和/或阴性对照进行的适合的测定法所测量的。用于各种化合物的男化性能的适合的测定法已经描述在例如，J.R.Brooks,等人，Prostate 1991,18:215-227；M.Gerrity等人，Int.J.Androl.19814:494-504；S.S.Rao等人，Indian J.Exp.Biol.19697:20-22；O.Sunami等人，J.Toxicol.Sci.200025:403-415；G.H.Deckers等人，J.SteroidBiochem.Mol.Biol.200074:83-92中。式1化合物的男化性能任选地如这些测定法或任何其它测定法中的一种或多种所述或者实质上如这些测定法或任何其它测定法中的一种或多种所述进行测定。
因此，这种实施方案之一包括治疗本文中所述病况的方法，包括对有此需要的受试者给予有效量的式1化合物，或为受试者的组织递送有效量的式1化合物，其中在适合的测定法(例如，上述引证文献中所述的)中测量时，式1化合物具有雄激素例如睾酮、丙酸睾酮、二氢睾酮或丙酸二氢睾酮的约30%或更低、约20%或更低、约10%或更低、约5%或更低的男化性能。在进行这种方法时，任选地对受试者或哺乳动物，例如，啮齿类动物、人或灵长类动物，监控例如，疾病、病况或症状是否得到改善、预防、或降低其严重程度。这种监控可以任选地包括在适当的时间下测量循环中的以下的一种或多种：细胞因子((例如，TNFα、IL-13、IL-1β)、WBC、血小板、粒细胞、嗜中性粒细胞、RBC、NK细胞、巨噬细胞或其它免疫细胞类型，例如，在本文中或在引用的参考文献中描述的，例如，在开始治疗之前的基线和在用式1化合物治疗后的不同时间，例如在用式1化合物治疗结束后的约2-45天。
如上所述，在一些实施方案中，将用式1化合物进行治疗与皮质类固醇或糖皮质激素联合使用。皮质类固醇在许多临床情况中使用，用于例如，在例如急性或慢性类风湿性关节炎、急性或慢性骨关节炎、结肠炎病况例如溃疡性结肠炎、急性或慢性哮喘、支气管哮喘、牛皮癣、系统性红斑狼疮、肝炎、肺纤维化、I型糖尿病、II型糖尿病或恶病质等条件下降低炎症或自身免疫反应的发生或急性发作的强度或频率。然而，许多皮质类固醇具有显著的副作用或毒性，这限制了它们的应用和功效。式1化合物可用于抵消这种副作用或毒性，而不会对抗皮质类固醇的全部的所期望的治疗能力。这使得允许继续应用皮质类固醇或修改其剂量，例如，以增加的剂量使用，而不会增强副作用或毒性或降低皮质类固醇剂量。可以治疗、预防、改善或减少的副作用或毒性包括以下的一种或多种：骨损失、骨生长减少、骨吸收增强、骨质疏松症、免疫抑制、对感染的敏感性增加、情绪或个性改变、抑郁症、头痛、眩晕、高血压或过度紧张、肌肉虚弱、疲劳、恶心、不适、消化性溃疡、胰腺炎、皮肤薄或皮肤脆弱、儿童或成年期前受试者的生长抑制、血栓栓塞、白内障和浮肿。式1化合物的剂量、给药途径和剂量给药方案实质上如本文中所述。在给予皮质类固醇的过程中和任选地在皮质类固醇的剂量给药结束后的约1周到约6个月或更长时间的时间段内给予约0.5到约20mg/kg/天的示例性剂量的式1化合物。皮质类固醇实质上使用已知的剂量、给药途径和剂量给药方案给予，参见例如，Physicians Desk Reference，第54版,2000,第323-2781页，ISBN1-563632,Medical Economics Co.,Inc.,Montvale,NJ。然而，任选地可以控制皮质类固醇的剂量，例如，超过正常剂量增加约10%到约300%，而与皮质类固醇相关的全部的副作用或毒性没有相应增加。这种增加是在充分长的时间段并且根据受试者的临床状况逐渐地进行的，例如，在约2周到约1年的时间内，皮质类固醇的日剂量增加约10%到约20%到约300%的最大值。
治疗方法可用于治疗、预防或改善急性外伤，例如心肌梗塞、出血例如脑出血或卒中或骨折、骨质疏松症或过量的或不期望的骨吸收或损失。治疗可用于促进对如下损坏或损伤的修复，所述损伤或伤害是对皮肤、粘膜、软骨、肝脏、心脏组织、骨或CNS、或其中具有损伤的位置的神经组织的损伤或伤害，例如，化学或热灼伤、骨关节炎、类风湿性关节炎、肝硬化、骨质疏松症、骨折、心肌梗塞、卒中或头外伤。所述还可以用于减少由于治疗(例如，在狼疮病况中或在患有炎性肠病、克隆病、急性或慢性结肠炎或肾病症例如急性或慢性肾衰竭或自身免疫性肾损伤的患者中用糖皮质激素治疗)引起的骨损失。
以下实施方案描述本发明的一个或多个方面。
1.鉴定或表征生物动力学化合物的方法，包括：在受试者暴露于引发可检测的对急性刺激或生物学损害的应答的急性刺激或生物学损害之后测量试验化合物在受试者中的体内生物学应答，其中所述试验化合物在以下时间或时间段对刺激或生物学损害的急性生物学应答的递质引起有利的治疗应答：(i)急性应答为最大的或接近最大的，或(ii)急性应答在长的急性生物学应答时间段增加，并且其中在时间(i)或(ii)的有利的治疗应答不同于其在一个、两个、三个、或更多个较早或较晚的时间或时间段的对急性生物学应答的递质的作用，并且在较早或较晚的时间或时间段的这种作用，与在相同或实质上相同的较早或较晚的时间或时间段的适当的媒介物或安慰剂对照相比，急性生物学应答的递质的水平或活性增加或降低小于约50%，从而鉴定对急性生物学应答的递质产生有利的治疗应答以及在时间(i)或(ii)产生不同于其在一个、两个、三个、或更多个较早或较晚的时间或时间段的对急性生物学应答的递质的作用的有利的治疗应答的化合物为生物动力学化合物。
2.实施方案1的方法，其另外包括执行一种规程来测定试验化合物是否在体外试验中使急性生物学应答的递质的活性或水平受到约25%到约75%的调节，任选地，其中与糖皮质激素受体的适当的参考活化剂或拮抗剂相比，试验化合物不使糖皮质激素受体受到超过约20%的活化或拮抗。
3.实施方案1或2的方法，其中所述急性刺激或生物学损害是使受试者暴露于充分量的电离辐射或促炎性信号、化合物或组合物，任选地其中促炎性信号、化合物或组合物为细菌LPS或TNFα，和/或任选地其中急性生物学应答的递质为NF-κB或IκB。
4.实施方案1、2或3的方法，其中所述急性刺激或生物学损害是对充分数量的用药物治疗小鼠和充分数量的用媒介物对照小鼠给予足够的细菌LPS，并且在以下时间测量试验化合物对急性生物学应答的递质的作用：(i)所述急性应答为最大或接近最大时，任选地在通过腹膜内注射给予细菌LPS之后的约1.5小时，和(ii)在给予足够的细菌LPS之前和/或之后的一个或两个其它时间点，任选地在给予足够的细菌LPS之前的一个时间点和在急性应答最大或接近最大的之后的一个较晚的时间点，任选地在通过腹膜内注射给予细菌LPS之后的约2.0或2.5小时，和任选地其中急性生物学应答的递质是NF-κB或IκB。
5.实施方案4的方法，其中给予足够的细菌LPS是实质上根据实施例9中所述的方法或其适合的变体进行的，并且任选地，其中化合物部分地调节急性生物学应答的递质的水平或活性的能力是实质上根据实施例7中所述的方法或其适合的变体进行的。
6.实施方案1、2、3、4或5的方法，包括使用阳性生物动力学药物对照(任选地为17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇)来评价试验化合物的相对功效或效力，并且使用生物静力学药物对照来评价试验化合物的相对功效或效力。
7.药物产品或批准前的药物产品，包括处于药物的剂型和包装中的药物以及包装说明书或标签，所述包装说明书或标签包括关于药物的效力、作用机理、或临床应用的信息，其中效力、作用机理或临床应用信息至少部分地得自包括实施方案1、2、3、4或5的方法在内的表征方法。
8.药物产品或批准前的药物产品，包括处于药物的剂型和包装中的药物以及包装说明书或标签，所述包装说明书或标签包括关于药物的效力、作用机理、或临床应用的信息，其中效力、作用机理或临床应用信息至少部分地得自以下的表征方法，所述表征方法包括(a)使细胞在体外与足够量的NF-κB活性的活化剂接触足够的时间，其中所述细胞可以通过可检测到的细胞中NF-κB水平或活性增加来应答NF-κB活化剂。(b)使细胞在体外与足够量的药物接触足够的时间，其中与适合的对照相比，所述药物可检测到地抑制NF-κB活性的活化；和(c)任选地将药物抑制NF-κB活化的能力与参考化合物进行对比，其中参考化合物为本文中所述的式1化合物，其具有在表征方法中使NF-κB活化受到约25%到约75%的抑制的能力，其中在表征方法中，所述药物使NF-κB活化抑制约25%到约75%并且任选地其中参考化合物或药物不会可检测到地或显著地直接结合于糖皮质激素受体，或者任选地其中参考化合物或药物不会可检测到地或显著地激动糖皮质激素受体，任选地，与适合的激动剂对照相比，所述药物不使糖皮质激素受体有超过约20%的激动。
9.实施方案7或8的药物产品，其中剂型包括口服、非肠道、局部或吸入制剂。
10.实施方案8或9的药物产品，其中在表征方法中参考化合物或药物使NF-κB活化受到约35%到约70%或约40%到约65%的抑制。
11.实施方案8、9或10的药物产品，其中细胞中的NF-κB被TNF-α、TNF-β、TGF-β、IL-1、表皮生长因子、细菌LPS、细菌肽聚糖、酵母聚糖、细菌脂蛋白、细菌或病毒的抗原或基因产物、紫外线照射、热或温度升高、淋巴因子或氧化自由基、或H2O2中的一种、两种、三种或更多种活化。
12.实施方案8、9、10或11的药物产品，其中参考化合物或药物在适合的结合试验中以>10μm的kd直接结合于糖皮质激素受体，或者其中参考化合物或药物在适合于检测糖皮质激素受体介导的基因表达的活化或增加的试验中在等于或大于约10μM的浓度不会可检测到地激动糖皮质激素受体。
13.实施方案8、9、10、11或12的药物产品，其中体外细胞是哺乳动物、啮齿动物或人的细胞，任选地选自人THP-1细胞、大鼠RAW细胞、巨噬细胞、单核细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、树状细胞、胶质细胞、枯否细胞、肝细胞、嗜中性粒细胞、白细胞、和得自全血的细胞。
14.实施方案7或8的药物产品，其中包括关于药物的效力、作用机理或临床应用的信息以符合管理机构或检查组织检查或批准所述药物产品的商业用途或上市的规范。
15.治疗哺乳动物中的炎症状况或自身免疫性疾病的方法，包括对受试者给予、或为受试者的组织递送有效量的通过实施方案1、2、3、4、5或6的方法鉴定的生物动力学化合物，其中使用阳性生物动力学化合物作为参考标准，或者其中生物动力学化合物在适合的体外试验中部分地抑制急性生物学应答的递质，其中适合的体外试验任选地实质上是实施例7的方法或其适合的变体。
16.具有以下结构的纯的化合物
其中，一个R1为-H或任选被取代的C1-8烷基，另一个R1为-OH、C2-8酯或C1-8醚；一个R2为-H或任选被取代的C1-8烷基，另一个R2为-H、-OH、C2-8酯或C1-8醚；一个R3为-H或任选被取代的C1-8烷基，另一个R3为-OH、C2-8酯、C1-8醚或任选被取代的C1-8烷基；一个R4为-H或任选被取代的C1-8烷基，另一个R4为-OH、C2-8酯或C1-8醚；R5为-CH3、-C2H5或-CH2OH；R6为-H、-CH3、-C2H5或-CH2OH；一个R7为-H或任选被取代的C1-8烷基，另一个R7为-H、-OH、C2-8酯或C1-8醚；R10为-H或卤素；和一个R11为-H或任选被取代的C1-8烷基，另一个R11为-H、-OH、C2-8酯、C1-8醚或任选被取代的C1-8烷基。
17.实施方案16的纯化的化合物，其中R2、R7或R11中的一个、两个或三个为-OH、C2-8酯、C1-8醚、=O或=NOH。
18.实施方案17的纯化的化合物，其选自17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇、雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇、17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3β,7α,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3β,4β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3α,4β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3β,11β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3α,11β,16α,17β-四醇、3β,11β,16β,17β-四醇、雄甾-5-烯-3α,11β,16β,17β-四醇或任何这些化合物的C2-4单酯或C2-4二酯类似物，任选地，其中(1)C2-4单酯为3-位或17-位上的乙酸酯或丙酸酯或(2)C2-4二酯为3-位和17-位上的乙酸酯或丙酸酯。
19.实施方案17或18的纯化的化合物，其中化合物为(a)最低为80%纯、最低为95%纯或最大为98%纯的粉末或颗粒或(b)最低为80%纯、最低为95%纯或最大为98%纯的溶液或悬浮液。这些化合物包括17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇、雄甾-5-烯-3β,4β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3β,11β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇和其中一个或两个羟基的构型从α变为到β或从β变为α的这些化合物的差向异构体，例如，17β-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17α-三醇、雄甾-5-烯-3β,4β,16α,17α-四醇、17α-乙炔基雄甾-5-烯-3α,7β,17β-三醇或雄甾-5-烯-3α,4β,16α,17β-四醇。
20.实施方案17、18或19的纯化的化合物，其中所述化合物为约80%、约85%、约90%、约95%、约97%或约98%到约99.5%或约99.9%纯，任选地，其中所述化合物为粉末或颗粒的形式，任选地，其中通过适当的测定法例如光散射法测量的粉末的平均粒径为约50nm或约100nm到约5μm、约10μm或约25μm。
21.鉴定化合物的方法，所述化合物具有可检测到地调节哺乳动物中的CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25+CD103+调节性T细胞、CD4+CD25highCD103+调节性T细胞或CD4+CD25high调节性T细胞的数量或活性的潜力，所述方法包括选择以下的化合物：(i)与在体外的适合的对照人或哺乳动物细胞相比，在体外使人或哺乳动物细胞中的糖皮质激素受体、雄激素受体、雌激素受体-α、雌激素受体-β或任何这些生物分子的生物学活性变体中的一种或多种受到超过约30%的活化或抑制；(ii)分子量为约100-1000道尔顿，任选地分子量为约250-850道尔顿；(iii)与适合的阴性对照或正常对照相比，在适合的试验中使CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25+CD103+调节性T细胞、CD4+CD25highCD103+调节性T细胞、或CD4+CD25high调节性T细胞的数量或活性有超过20%的增加或降低；和(iv)与体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外任选地使人或哺乳动物细胞中NF-κB的转录活性或水平抑制或减少约20-80%；从而鉴定化合物。
22.实施方案21的方法，其中哺乳动物为啮齿动物或人。
23.实施方案21或22的方法，其中通过一种规程测定CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25+CD103+调节性T细胞、CD4+CD25highCD103+调节性T细胞、或CD4+CD25high调节性T细胞的数量或活性，所述规程包括以下的一种、两种或三种：(a)实施例20的方法或其适合的变体；(b)实施例21的方法或其适合的变体；或(c)在本文中引用的参考文献中的方法或其适合的变体，其中所述方法或其适合的变体允许评价CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25+CD103+调节性T细胞、CD4+CD25highCD103+调节性T细胞、或CD4+CD25high调节性T细胞的数量或活性。
24.实施方案21、22或23的方法，其中所述化合物用于以下疾病的治疗或预防：自身免疫性疾病或不期望的炎症状况，其任选地为关节炎病况例如骨关节炎(原发性或继发性骨关节炎)、类风湿性关节炎、与脊椎炎有关的关节炎例如强直性脊椎炎、多发性硬化、阿尔茨海默病、腱鞘炎、狼疮病况例如系统性红斑狼疮或盘状红斑狼疮、腱炎、粘液囊炎、肺炎症状况例如哮喘、气肿、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、囊性纤维化、急性或成人呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、急性支气管炎、细支气管炎、闭塞性纤维性细支气管炎、伴有机化性肺炎的闭塞性细支气管炎。所述化合物可以是本文中所述的式1化合物。
这些实施方案以及本公开的其它部分的变体和改进对于阅读了本公开的本领域技术人员来说是显而易见的。这种变体和改进都在本发明范围内。本文中引用的所有引证文献或参考文献都被在这个位置或在这段后面的另外的段落中全文并入本文作为参考。
实施例。以下实施例进一步举例说明本发明，并且它们不意在以任何方式对其进行限制。
实施例1。肺炎症的治疗。实质上如(D.Auci等人，Ann.New YorkAcad.Sci.1051:730-742 2005，新引用的)中所述，使用三个化合物，3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷、3α,16β,17β-三羟基雄甾烷和3α,16α,17α-三羟基雄甾烷治疗小鼠的炎症。在研究中使用5到8周龄的CD1雄性小鼠(Charles River,Calco,Italy)。将动物圈养在受控环境中并且为其提供标准的啮齿动物食物和水。动物护理遵循可适用的关于保护动物的规章。将小鼠分配到以下组之一中：(1)用在盐水中的2%角叉菜胶-λ处理的小鼠(角叉菜胶-λ治疗对照组)，(2)在给予角叉菜胶-λ之前的24小时和1小时通过皮下注射(s.c)0.1mg、0.01mg或0.001mg的3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷处理的小鼠，(3)在角叉菜胶之前24和1小时通过s.c注射0.1mg、0.01mg或0.001mg的3α,16α,17α-三羟基雄甾烷处理的小鼠；(4)在给予角叉菜胶-λ之前的24小时和1小时通过s.c注射用0.1mg、0.01mg或0.001mg的3α,16β,17β-三羟基雄甾烷处理的小鼠；(5)在给予角叉菜胶-λ之前的24小时和1小时通过s.c注射用媒介物(0.1%的羧甲基纤维素、0.9%盐水、2%吐温80、0.05%苯酚)处理的小鼠；(6)在给予角叉菜胶-λ之前的24小时和1小时通过将兔抗小鼠多克隆抗-TNF-α抗体(200μg)作为腹膜内浓集注射处理的小鼠(阳性对照组)；和(7)没有用角叉菜胶-λ处理的伪操作小鼠。每个组由10只小鼠组成。所有的处理都以100μL的最终容积给予。如下诱导肺(胸膜腔)炎症。将小鼠用异氟烷麻醉并且在左侧第六肋间隙的水平面皮肤切口制造皮肤切口。将下面的肌肉剖开并且将0.1mL盐水(对照)或含2%λ-角叉菜胶的0.1mL盐水注射到胸膜腔中。角叉菜胶-λ为炎症的有效诱导物，其在这个规程中表现为胸膜腔中的积液和嗜中性粒细胞积聚。通过缝合关闭切口并且使动物复苏。
在注射角叉菜胶-λ之后的4小时，通过暴露于CO2将动物无痛处死。小心地将胸部打开并将胸膜腔用包含肝素(5U/mL)和吲哚美辛(10μg/mL)的1mL盐水溶液漂洗。通过抽出将渗出物和洗涤液除去并且测量总体积。将被血液污染的任何渗出物抛弃。通过回收的总的胸膜腔容积减去注射的1mL体积计算渗出物的量。将渗出物中的嗜中性粒细胞悬浮在磷酸盐缓冲盐水中并且在锥虫蓝染色之后在Burker室中借助光学显微镜计数。结果通过单因素ANOVA进行分析，随后进行用于多重比较的Bonferroni post-hoc检验。认为小于0.05的p-值是显著的。对于统计分析，将每个组与用角叉菜胶-λ和未接受其它治疗的小鼠的对照组进行比较。
用角叉菜胶-λ攻击的和未经处理的所有小鼠都发展为急性胸膜炎，产生混浊的渗出物并且胸膜的嗜中性粒细胞数量增加。在用媒介物处理的小鼠的胸膜中，观察到渗出物体积和白细胞数量的增加与用角叉菜胶-λ攻击和没有接受治疗的对照小鼠相似。相对于这两个对照小鼠组，用3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷处理的动物在0.1mg和0.01mg剂量下表现出胸膜中嗜中性粒细胞的数目、胸膜渗出物体积的明显减少，而更低的0.001mg剂量下没有活性。用0.1mg剂量的3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷处理的胸膜渗出物体积显著降低，但是在更低的0.01mg和0.001mg剂量下没有出现这种情况。用3α,16α,17α-三羟基雄甾烷处理的动物在0.1mg和0.01mg剂量下表现出胸膜中的嗜中性粒细胞数量的明显减少。用3α,16β,17β-三羟基雄甾烷处理还在0.1mg和0.01mg剂量表现出胸膜中嗜中性粒细胞数量的明显减少。3α,16α,17α-三羟基雄甾烷和3α,16β,17α-三羟基雄甾烷的效力与使用多克隆的抗-TNF-α抗体对照的观察结果相似，而3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷效力相对较差。
下表描述了接受处理的动物组相对于暴露于角叉菜胶-λ但是未用任何其他物质处理的未经处理的对照动物(阴性对照组)的嗜中性粒细胞数量。将阴性对照组的嗜中性粒细胞数量设置为100%，并且将其它组与之相比较。用抗-TNF-α抗体治疗的动物组(阳性对照组)的嗜中性粒细胞数量为阴性对照组的嗜中性粒细胞数量的29%，表明该抗体具有针对角叉菜胶-λ暴露的抗炎作用。媒介物对照组没有表现出相对于阴性对照组的嗜中性粒细胞数量的显著减少(91%)，表明单独的媒介物没有显著的抗炎作用。
在这个模型中具有统计显著的抗炎症活性的其它化合物是17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇(通过口服强饲法给予1mg和0.1mg)和17β-氨基雄甾-5-烯-3β-醇(通过口服强饲法给予40mg/kg，约0.5mg/小鼠)。与用作媒介物对照的小鼠组相比，这些化合物是有活性的。
可以将本文中描述的其它式1化合物以这种方式使用，以表征它们治疗或改善炎症的相对能力。这些化合物包括3β,16β,17β-三羟基雄甾烷、3β,16α,17α-三羟基雄甾烷、3β,16β,17α-三羟基雄甾烷、3β,16β-二羟基雄甾-5-烯-17-肟、3β,16α-二羟基雄甾-5-烯-17-肟、3α,16α-二羟基雄甾-5-烯-17-肟、3β,16α-二羟基雄甾烷-17-肟和这些化合物的如下的类似物(1)在7-位包含α构型或β构型的羟基和/或(2)在5-位或4-位包含双键，和/或(3)这些中任一种的酯、醚、氨基酸、氨基甲酸酯或肟(=NOH)衍生物、结合物、或类似物。
实施例2。免疫应答的分析。发现化合物3α,16α,17α-三羟基雄甾烷具有使得所述化合物作为优异的用于治疗炎症状况例如哮喘的药物的生物学特性。具体地，所述化合物的应用没有伴随有IL-13的反弹，IL-13的反弹是抗炎糖皮质激素化合物例如地塞米松的已知副作用。在应用糖皮质激素之后的IL-13反弹使得哮喘患者更倾向于发生随后的急性发病，因此，没有这种副作用的抗炎药是有利的。不发生IL-13反弹是出乎意料的。
在卵清蛋白(OVA)敏化的哮喘小鼠模型中观察到了3α,16α,17α-三羟基雄甾烷限制嗜曙红细胞载荷和减少关键炎症递质(IL-5、IL-13、半胱氨酰基白细胞三烯)的能力。通过在第1和第12天腹膜内注射OVA(在明矾辅助剂中)使BALB/c小鼠敏化。通过在第28和第30天向肺递送OVA用OVA攻击气道，或者向肺递送盐水。在第31天，将用盐水处理的6只小鼠和用OVA攻击的6只小鼠处死并且分析肺组织。其余的动物被分成6组(每组6只小鼠)。如下对小鼠的组通过每天一次皮下注射进行治疗。第1组媒介物对照(0.1%羧甲基纤维素，0.9%盐水，2%吐温80，0.05%苯酚)。第2组地塞米松(5mg/kg)。第3组3α,16α,17α-三羟基雄甾烷(1mg/小鼠)。在第35天在最后一次治疗之后的1小时将第1-3组中的三只动物处死，将第1-3组中的剩余三只动物在第38天处死。
如下表所示，3α,16α,17α-三羟基雄甾烷没有产生在用地塞米松治疗的动物中观察到的IL-13增加。
治疗组 IL-13(pg/mL)
盐水对照 220
卵清蛋白 230
媒介物(第35天) 220
地塞米松(第35天) 340
3α,16α,17α-三羟基雄甾烷(第35天) 195
媒介物(第38天) 190
地塞米松(第38天) 390
3α,16α,17α-三羟基雄甾烷(第38天) 210
在攻击之后第38天，除了IL-13反弹减少之外，与地塞米松治疗组(145pg/mL)相比，用3α,16α,17α-三羟基雄甾烷治疗的动物肺组织中的IL-5水平降低(90pg/mL)。在第38天，媒介物对照组中的IL-5水平为75pg/mL。将本文所述的其它式1化合物以这种方式使用，以鉴定它们治疗或改善炎症而没有IL-13和/或IL-5反弹效应的能力，包括3β,16β,17β-三羟基雄甾烷、3β,16α,17α-三羟基雄甾烷、3β,16β,17α-三羟基雄甾烷、雄甾-5-烯-2α,3β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇和17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇。这些结果表明，F1C可用于在体内治疗肺炎症或哮喘。
在另一种规程中，如下从鼠科动物骨髓培养肥大细胞群。简而言之，使用PBS和27g针头从股骨冲洗(flush)得自Balb/C小鼠的骨髓。将细胞在含19%FBS和分泌IL-3的细胞的2/3RPMI-1640中培养。在用于实验之前使骨髓细胞在包含IL-3的混合物中分化18-25天。如此培养的骨髓细胞具有与粘膜肥大细胞类似的表现型并且被称为骨髓来源的肥大细胞(BMMC)。
通过常规的流细胞计数技术核对体外繁殖的肥大细胞的均质性并且用细胞类型特异性标示物染色。在繁殖的第14和21天，收获成熟的肥大细胞并且准备用于试验培养。目的是要评价化合物例如脱氢异雄甾酮对肥大细胞刺激结合的脱粒的影响。将制备的肥大细胞以1×107细胞/mL的密度分配在试验培养孔中。在对照培养中，在IgE受体与IgE抗原-抗体复合物交联之后诱导肥大细胞脱粒。在平行的培养组中，将肥大细胞与不同剂量的脱氢异雄甾酮预孵育，随后使用抗-IgE抗体活化。如通过从细胞的细胞溶质贮藏粒释放β-葡糖苷酸酶所测量的，在没有刺激的存在下，肥大细胞没有可检测到的脱粒。向培养物引入抗-IgE受体抗体引起β-葡糖苷酸酶的显著释放。在肥大细胞暴露于单独的脱氢异雄甾酮时，没有可测量的脱粒。然而，在用抗-IgE抗原-抗体复合物活化之前，预先暴露于100μM剂量的脱氢异雄甾酮5到10分钟的肥大细胞表现出大约70%的脱粒抑制。较低水平的脱氢异雄甾酮表现出抑制脱粒的能力成比例地变小。在类似的规程中，F1C例如17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇、雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇或雄甾-5-烯-3α,7β,16α,17β-四醇比脱氢异雄甾酮的效力大10-1000倍。
实施例3。致命性炎症/休克的治疗。在致命性休克规程中使用两种化合物，16α-溴表雄酮(3β-羟基-16α-溴雄甾烷-17-酮)和3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷。在一个规程中，将3mg的16α-溴表雄酮通过口服强饲法给予一组动物，而另一组通过皮下注射接受3mg的16α-溴表雄酮。一组对照动物接受安慰剂对照。在这个规程中，在给予致死量的细菌脂多糖(LPS)之前的24小时和之后的1小时对小鼠给予16α-溴表雄酮。在观察期(在给予LPS之后的72小时)结束时，媒介物治疗的安慰剂对照动物中没有一只存活，而接受通过口服给予16α-溴表雄酮的动物有65%的存活。通过皮下注射接受16α溴表雄酮的动物有50%的存活。存活72小时的动物都从LPS接触恢复健康。
在第二个试验中，在给予致死量的LPS之前的24小时和之后的1小时通过口服强饲法对小鼠给予16α-溴表雄酮或3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷。将媒介物治疗组的动物用作安慰剂对照。在72小时，安慰剂对照小鼠有25%的存活，用3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷治疗的小鼠有50%的存活，用16α-溴表雄酮治疗的小鼠有80%的存活。
在另一个试验中，显示了16α-溴表雄酮和3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷防止通过使小鼠暴露于亚致死量的LPS而诱导的肺损伤的能力。在这个试验中，在浅度麻醉情况下对动物的气管和肺给予100μg的LPS之前的24小时和之后的1小时通过口服强饲法对5只小鼠的组给予化合物、无菌盐水(阴性对照)或媒介物(媒介物对照)。在48小时，将动物处死并且通过肺泡灌洗(BAL)从动物的肺取得样品。将BAL液体中的细胞计数，细胞数多表示肺的炎症和损伤。在这个试验中，介导炎症和肺损伤的细胞应答于LPS的存在而透过到肺中。在阴性对照和媒介物对照组中，BAL液体包含约6×107细胞/mL。用16α-溴表雄酮(p=0.02)或3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷(p=0.04)治疗的动物组的细胞数具有显著减少的BAL流体中的细胞计数(约4.4×107细胞/mL)。这个结果显示，化合物在其中肺损伤或损害与不受控制的或过量的炎症有关的例如哮喘或COPD的临床病况中有活性。可以按类似方式表征其它化合物，例如，17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇或17β-氨基雄甾-5-烯-3β-醇。
实施例4。从肺组织清除细菌。使用预先公开的规程来证明16α-溴表雄酮从肺组织清除铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染的能力，A.van Heeckeren等人，J.Clin.Invest.,100(11):2810-28151977；A.van Heeckeren等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.,161:271-2792000。所述规程在CFTR小鼠中进行，其被用作人囊性纤维化的动物模型，S.D.Freedman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96(24):13995-140001999；W.Zeng等人，Am.J.Physiol.Cell.Physiol.273:C442-C455 1997。使用包含细菌的琼脂糖小珠(50μL，包含约6.1×104CFU/动物)建立慢性铜绿假单胞菌感染在先前有所公布，J.R.Starke等人，Pediatr.Res.,22:698-7021987。将两组小鼠(每组n=9)用40mg/kg的16α-溴表雄酮或媒介物(对照)处理并且在将琼脂糖小珠引入到肺中之后的10天测定动物肺中的细菌载荷。在第10天，媒介物对照动物的肺中的细菌载荷为约6×106CFU/动物，而用16α-溴表雄酮处理的动物具有降低的细菌载荷(p=<0.04)。这个结果表明，16α-溴表雄酮不仅抗炎，而且其还可用于治疗或减少肺感染，这对于用于治疗其中炎症和感染可能共存的例如囊性纤维化的病况的药物来说是所希望的性质。
实施例5。在人细胞中的体外抗炎活性。使用暴露于LPS的人全血证明16α-溴表雄酮和3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷在体外减少人细胞中的炎症的能力。与暴露于单独的LPS(阳性对照)或不含化合物的媒介物(二甲基亚砜)(媒介物对照)的细胞相比，在16α-溴表雄酮(100ng/mL)和3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷的存在下观察到细胞产生的γ-干扰素减少。在已经将细胞在LPS的存在下培养24小时时，测量生长培养基中的γ-干扰素的量。
实施例6。自身免疫神经变性的治疗。对三种化合物，17β-氨基雄甾-5-烯-3β-醇、17β-二甲基氨基雄甾-5-烯-3β-醇和17β-甲基氨基雄甾-5-烯-3β-醇，表征其改善小鼠的实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的能力。这种脱髓鞘病况被广泛用作人多发性硬化模型和用于试验治疗多发性硬化的治疗方法的模型，例如，B.F.Bebo Jr等人，J.Neurosci.Res.52:420-4261998；R.R.Voskuhl等人，Neuroscientist,7:258-2702001；H.Offner等人，J.Neuroimmunol.,130:128-1392002。在这些模型中的活性表示试验化合物预防与EAE疾病进展有关的神经元死亡或延缓神经元死亡速率的能力。
在这种规程中，在疾病症状发作时通过口服强饲法对雌性SJl/J小鼠给予化合物。使用抗原来引发小鼠中的EAE病况。用于主动免疫法的抗原是小鼠蛋白脂质蛋白(PLP)139-151(HCLGKWLGHPDKF)。使用这种肽抗原进行免疫引发中枢神经系统的自身免疫Th1介导的脱髓鞘疾病。所述抗原通过固相合成制备并且通过高效液相色谱法纯化。通过用包含200μg结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的完全弗氏佐剂中的150μg的PLP139-151肽进行免疫在雌性SJL/J小鼠中引发EAE病况。免疫规程是在第0天在后肋的四个位置上皮下注射。在免疫之后，每天使用以下的标准评价小鼠的EAE临床迹象：0=没有临床迹象或症状；1＝尾部无力；2=轻度的后肢虚弱和尾部无力；3=中度的后肢虚弱和尾部无力或轻度的共济失调；4=严重的后肢虚弱和轻度的前肢虚弱，伴随中度的共济失调；5=截瘫伴有不超过中度的前肢虚弱；6=截瘫伴有不超过重度的前肢虚弱或严重的共济失调或濒死状态。
媒介物对照组的小鼠在用PLP抗原免疫之后的约10-11天表现出可观察到的EAE症状，这对于EAE疾病模型来说是典型的。从第1天开始，通过口服强饲法对动物每天给予17β-氨基雄甾-5-烯-3β-醇、17β-二甲基氨基雄甾-5-烯-3β-醇或17β-甲基氨基雄甾-5-烯-3β-醇，所述第一天是指免疫之后的第一天。在观察期结束时，所有三种化合物在5mg/kg的剂量下都具有活性，并且它们降低在第26天前观察到的症状的临床严重程度。在小鼠中，在约10ng/mL的血液水平观察到化合物的治疗活性。这些结果表明，化合物对于治疗这种慢性自身免疫神经变性疾病是具有生物学活性的。
实施例7。NF-κB的体外抑制。有许多化合物可用于在体外抑制人细胞中NF-κB被TNF-α或LPS活化。NF-κB的活化增加介导炎症的许多基因的表达。这个规程使用人THP-1细胞，其是具有单核细胞表现型的人单核血细胞。被称为NF-κB-bla THP-1的细胞系包含在NF-κB应答元件的控制之下的β-内酰胺酶报道基因(Invitrogen,CellSensorTM，产品编号K1176)。在这个细胞系中，β-内酰胺酶报道基因被稳定地整合到THP-1细胞中。这个细胞系用于检测NF-κB信号转导通道的激动剂或拮抗剂。这些NF-κB-bla THP-1细胞应答于肿瘤坏死因子α(TNFα)或细菌脂多糖(LPS)的存在而增加β-内酰胺酶报道基因的表达。β-内酰胺酶酶活性的水平通过荧光共振能量传递比率检测来测量。TNFα和LPS都是活化THP1细胞中的NF-κB的有效的炎症诱导试剂。在这个试验中，在TNFα或LPS的存在下降低NF-κB活性、并且从而减少β-内酰胺酶的化合物具有抗炎活性。
通过传代或根据需要喂养来维持NF-κB-bla THP-1细胞。将在悬浮液中生长的细胞保持在2×105个细胞/mL到2×106个细胞/mL的密度。将细胞以20,000个细胞/孔在384孔黑色壁、透明底的试验板(Costar#3712-TC低荧光背景板)中铺板，之后约24小时加入10ng/mL的TNFα或0.2ng/mL的LPS，以活化NF-κB。在活化NF-κB的阳性对照试验中，在β-内酰胺酶底物培育1小时之后，TNFα的EC50浓度为0.20ng/mL。LPS的EC50剂量为0.15ng/mL。在这个试验中的TNF-α或LPS的EC50浓度是指引起NF-κB最大活化的TNF-α或LPS的浓度的50%。合成的糖皮质激素地塞米松(一种强力的抗炎药)在这个试验中以0.47nM(5次试验的平均值)的EC50降低TNFα的影响。已经在其它体外细胞试验中报告了相似的地塞米松生物学活性，在约1nM的IC50下观察到对NF-κB活化的完全抑制(M.K.A.Bauer等人，Eur.J.Biochem.243:726-731,1977)。
使用这个试验，在LPS刺激之后在NF-κB-bla THP-1细胞中抑制NF-κB活化的化合物的IC50显示如下。用于这个试验中的化合物的IC50浓度是指引起化合物能够诱导的对NF-κB活化的50%最大抑制的化合物的浓度。所述试验通常对于每种化合物进行2-4次，如下所示的值是每种化合物的平均值。以下表1中的数据表明，这些化合物中有许多都可以在极低的水平抑制这些人巨噬细胞细胞中的NF-κB。
表1
*μM=10-6M；nM=10-9M；pM=10-12M；fM=10-15M
在这个规程中表现出抗炎活性的其它化合物是3α-五氟乙基雄甾-4-烯-3β,17β-二醇(IC503.1nM)、3α-五氟乙基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇(IC5017nM；最大的NF-κB抑制为50%)、3α/β,17α-乙炔基雄甾烷-3α/β,17β-二醇(IC50200pM)、17α-三氟甲基雄甾烷-3α,17β-二醇(IC50190nM)、17β-甘氨酰基雄甾烷-3β-醇(IC500.42pM)、3β-甘氨酰基雄甾烷-17β-醇(IC501nM)、雄甾烷-3β,16β-二醇-17-肟(IC501.9fM)17α-乙炔基雄甾-4-烯-3-酮-17β-醇(IC502.9fM；最大的NF-κB抑制为80%)、16α-氟雄甾-5-烯-17-酮(IC5030pM)、16β-氟雄甾-5-烯-7β-醇-17-酮(IC501.5nM)、雄甾烷-3α,16α,17β-三醇(IC506.9fM)、雄甾烷-3α,16β,17β-三醇(IC5019fM)、雄甾-5-烯-3β-醇-17β-琥珀酰基酯(IC500.2nM)、3β-乙酰氧基-7β,17β-二羟基-11-氧代雄甾-5-烯(IC501fM；最大的NF-κB抑制为65%)。这些化合物的NF-κB最大抑制为约25%到80%，与合成的糖皮质激素地塞米松在这个规程中的对NF-κB活化的100%抑制有区别。
在这个规程中有两个化合物增加NF-κB活性，为雄甾-5-烯-3β,7α,16α-三醇-17-酮(IC501.3nM；相对于对照细胞为140%的NF-κB活性)和3β,17α-二甲基雄甾烷-3α,17β-二醇(IC5040nM)。
在这个规程中表没有表现出抗炎活性的化合物是3α,17α-甲基雄甾烷-3β,17β-二醇、3β-乙酰氧基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇、17α-甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇-7-酮、16α-氟雄甾-5-烯-7β-醇-17-酮、16α-氟雄甾-5-烯-7α-醇-17-酮、17α-甲基雄甾烷-3β,7α,17β-三醇、雄甾-5-烯-3β,11β,17β-三醇、16α-氟雄甾烷-17-酮、雄甾-5-烯-3α,17β-二醇、雄甾烷-2β,3α,16α,17β-四醇和雄甾烷-3α,16α,17α-三醇，都具大于10μM的IC50。
化合物在低的水平下降低NF-κB活性的能力表明它们可用于治疗炎症，特别是在其中NF-κB的过量水平或由NF-κB介导的细胞核转录活性在所述疾病或病况的病理学中起到主要作用的情况中。
在上述测定法中，由地塞米松、16α-溴表雄酮和16β-溴表雄酮引起的NF-κB的最大抑制为100%，并且在这些化合物的浓度超过这些化合物的IC50时没有可检测到的NF-κB活化。相比之下，其它化合物例如，3β,7β,16α,17β-四羟基雄甾-5-烯、3α,7β,16α,17β-四羟基雄甾-5-烯或3β,7β,17β-三羟基-17α-甲基雄甾-5-烯引起的NF-κB的最大抑制低于约80%，增加化合物的量到超过其IC50水平不能提供显著的对NK-κB活化的另外的抑制活性。对于这些化合物中的大多数，在这个测定法中的NF-κB的最大抑制程度为约25-80%，主要为约30-65%或约30-70%。这些结果表明，化合物例如3β,7β,16α,17β-四羟基雄甾-5-烯通过不能完全地阻止其生物活性的机制抑制NF-κB活化。
表1中的几个化合物不具有可检测到的在体外细胞测定法中发挥抗炎活性的能力。进行了试验并且在所述测定法中没有活性(IC50>10μM)的其它化合物包括3β,17α-二羟基雄甾-5-烯、脱氢表雄酮(3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮)、3β-羟基雄甾烷-7,17-二酮、16α-溴-3β,17β-二羟基雄甾-5-烯和16β-溴-3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮。尽管如此，在这个体外细胞试验中无活性的那些化合物中有一些，例如，16α-羟基表雄酮，仍然发现其在动物中具有体内抗炎活性。这个结果表明，所述化合物可能通过不同的机制起作用或者它们的活性需要来自不止一个细胞系的细胞。这种化合物的体内抗炎活性可以来自于，例如，引起前列腺素合成和在肝脏中的其它活性，从而产生系统性抗炎应答。或者，这种化合物的抗炎活性可以来自于化合物抑制由于不同于LPS的来源引起的NF-κB刺激的能力。有许多不同的物质可以活化NF-κB活性，包括LPS、TNF-α、IL-1、某些病毒或细菌基因产物的存在、B细胞或T细胞的活化、或细胞暴露于紫外辐射。不是所有的细胞型都可以应答所有这些刺激，因为不是所有的细胞表达应答这些刺激中的每一种所需的信号机制。大多数细胞型可以应答于这些信号中的一种或几种，但是某种细胞型应答于所有信号很少见。在本文使用的测定法中，NF-κB的活化来自于细菌LPS-诱导的刺激，因此，与其具有有限的抑制LPS信号转导通道能力的化合物在这个测定法中具有有限的降低NF-κB活性的能力。
已经有所描述并且可以并入本发明或用于实践本发明的调节NF-κB的方法包括在以下公开中描述的那些。美国专利5,989,835、6,410,516、6,545,027、6,831,065和6,998,383。NF-κB活性的其它方面已经有所描述，并且也可以并入到本发明的方法中，例如，A.S.Baldwin,Annual Rev.Immunol.14:649-6831996；M.Muller等人.,Mol.Cell.Biol.22((4)1060-1072 2002；P.A.Baeuerle,Cell95:729-7311998。
实施例8。通过与上述相似的规程考查所选择的化合物治疗小鼠中LPS诱导的休克/炎症的能力。将每组三只体重约30g的ICR小鼠的五个组各自通过腹膜内注射120μL媒介物(含30%磺基丁基醚-环糊精的水)、含雄甾-5-烯-3α,7β,16α,17β-四醇的媒介物、含雄甾-5-烯-3β,4β,16α,17β-四醇的媒介物、或含4β-乙酰氧基雄甾-5-烯-3β,16α,17β-三醇的媒介物处理。所有的药物和媒介物制剂都是溶液而不是悬浮液。磺基丁基醚-环糊精通过购买得到(CaptisolTM,www.cydexinc.com)。有两个媒介物对照组，一个组接受单独的媒介物，另一个组接受媒介物和LPS。在通过腹膜内注射对小鼠给予LPS(约LD50/24剂量，即，在给予LPS之后的24小时有50%致死)之前的24小时和之后的1小时给予媒介物和药物。药物以约40mg/kg(对于药物的每次给予为1.2mg药物/动物)给予。在注射LPS之后的1.5小时从动物收获脾脏，将脾细胞溶胞并通过从脾细胞分离细胞核并且从溶胞的细胞核测量NF-κB测定活化的NF-κB。结果表明，与LPS+媒介物对照组相比，所有的三种化合物都使NF-κB活化的水平降低约50%。得自用媒介物而没有LPS处理的动物的脾脏细胞中的活化的NF-κB水平与得自药物处理的动物的脾脏细胞中的活化的NF-κB水平实质上相同。这些结果表明了在动物中的有效的抗炎作用，这是通过与对照动物相比，在用药物治疗的动物中活化的NF-κB降低所现出来的。
在LPS攻击之后的1.5小时分析NF-κB或TNFα的类似规程中使用的其它化合物为：雄甾烷-3α,16α,17β-三醇、雄甾烷-3α,17β-二醇-16-酮、17α-三氟甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇、雄甾-5-烯-3α,17β-二醇、雄甾-5-烯-3α,16α,17β-三醇、3α-三氟甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇、雄甾烷-3α,17β-二醇-16-肟和雄甾-5-烯-3β,17β-二醇-7-酮。所有这些化合物都是作为化合物在含磺基丁基醚-环糊精的水中的溶液(而非悬浮液)给予。这些化合物在LPS攻击之前的24小时和在LPS攻击的同时(代替如上所述的在LPS攻击之后的1小时)给予，随后在PLS攻击之后的1.5小时分析脾脏中的NF-κB或血液中的TNFα。化合物以40mg/kg的剂量给予，对于3α-三氟甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇，还将其以4mg/kg、0.1mg/kg和0.05mg/kg的剂量给予。相对于媒介物对照，对于所有这些化合物都观察到NF-κB和TNFα抑制。对于3α-三氟甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇，在0.1mg/kg的剂量水平下经治疗的动物中观察到NF-κB和TNFα的最大抑制。
实施例9。体内NF-κB抑制的动力学分析。考查了小鼠中在注射细菌LPS之后的NF-κB抑制的动力学，以便进一步探索化合物例如17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇的作用机理，如实施例7中所述，所述化合物在体外只是部分地抑制免疫细胞(巨噬细胞或单核细胞)中由LPS或TNFα诱导的NF-κB活化。在这项研究中，将小鼠通过腹膜内注射如实施例8中所述的化合物在媒介物中的溶液(不是悬浮液)用17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇(约40mg/kg、约1.2mg/动物)处理。在腹膜内注射细菌LPS(约LD50/24)之前的24小时注射药物。所述研究使用每组12只动物的两个组，在LPS攻击之前的24小时给予媒介物对照或药物。在即将进行LPS攻击之前和在给予LPS之后的1.5、2.0和2.5小时分别从两个组的3只动物收获脾脏。收获脾脏细胞并且通过实质上如实施例8中所述测定细胞核中的NF-κB来测量活化的NF-κB的水平。
在媒介物对照中在1.5小时出现给予LPS之后的NF-κB活化的最大值，其相对于给予LPS之前的活化的NF-κB的水平有4倍的升高。结果显示如下。媒介物对照和药物处理的动物的数值都是对得自脾脏细胞的细胞核中的NF-κB进行ELISA测量得到的相对光密度单位。
Figure BDA00002844272200601
在1.5小时时间点的对NF-κB的深远的抑制和在其它时间点的NF-κB活性的相对正常水平表明，化合物在LPS接触之后的关键时间发挥了短暂的但是有效的对LPS诱导的外伤的抑制。在其它研究中的相似测定法表明，在注射LPS之后的30分钟和60分钟，媒介物对照小鼠中的活化的NF-κB的水平与这项研究中LPS处理前的时间点相似。这个结果表明，在这个模型中，LPS对脾脏细胞中NF-κB活化的影响在LPS攻击之后的约1.5小时时最大。这个时间点揭示了用于体内评价抗炎药物候选物活性的适当时间或窗口，即，在LPS攻击之后的约75分钟到约105分钟。所述窗口可以取决于生物学损害的给药途径而改变，例如，通过腹膜内注射给予的LPS或TNFα与通过皮下或肌肉注射给予的LPS或TNFα相对比。同样地，生物学损害可以是其它情况，例如，受试者暴露于约50-60cGy/分钟的电离辐射相对于受试者暴露于约500-1000cGy/分钟或约5-10cGy/分钟的电离辐射。
对小鼠中的LPS诱导的TNFα表达的分析表明，TNFα水平在LPS攻击(通过腹膜内注射给予500μg的LPS)之后的1.5小时达峰，在LPS攻击之后的1-2小时观察到TNFα的最高水平。在LPS之后的30分钟和在2.5小时的TNFα水平较低。
可以分析作为生物动力学药物起作用的能力的其它化合物包括雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3α,7β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3β,7α,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3β,4β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3β,4α,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3α,4β,16α,17β-四醇、17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇、17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7α,17β-三醇、17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,17β-三醇-7-酮和任何这些化合物的药学可接受的类似物，例如，在1个、2个或更多个羟基处的羟基酯或醚衍生物的类似物。适合的酯和醚包括乙酸酯、正丙酸、异丙酸酯、琥珀酸酯、-O-C(O)-(CH2)n-CH2R、-O-C(O)-O-(CH2)n-CH2R、-O-C(O)-NH-(CH2)n-CH2R、氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸(-O-C(O)-CHCH3-COOH)、羟基酯，和甲基、乙基、正丙基、异丙基-O-(CH2)n-CH2R、-O-(CH2)n-O-CH2R(例如，-O-CH2CH2-O-CH3)醚，其中n为1、2、3、4、5或6，并且R为-H、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-C(O)OH(或可接受的盐，例如，钠盐或钾盐)、-C(O)OCH3、-C(O)OC2H5。
实施例10。实质上如前所述考查式1化合物在被动胶原诱导的关节炎模型中影响关节炎进程的能力(E.Simelyte等人，Arthritis&Rheumatism,52(6):1876-1884,2005；Z.Han等人，Arthritis&Rheumatism 46(3):818-823,2002；H.Miyahara等人Clin.Immunol.ImmunopathoL,89(1):89-76,1993)。在这个规程中，通过给予抗II型胶原抗体在DBA/1小鼠中诱导被动胶原诱导的关节炎，所述抗II型胶原抗体在动物中诱导针对关节组织的免疫应答。在这个关节炎模型中的效力表示主要针对炎症的效力，在得自在关节炎中起作用的细胞作用的分离物中进行评价。使用半定量的临床评分系统评价关节炎的严重程度。将每组8只动物的组通过口服强饲法用40mg/kg/天的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇处理14天或者用媒介物处理14天。媒介物是含30%环糊精-磺基丁基醚的水，药物溶液是含20mg/mL药物的媒介物。
通过测量踝厚度对动物进行检查，更高的关节炎评分(4分/爪)表示更严重的关节炎。实验在约14天之后结束，并且进行组织学和基因表达测量。对于组织学，收获左后爪，在10%福尔马林中固定24小时，脱钙，并且包埋在石蜡中。将组织切片用用于番红O-耐绿的苏木精和曙红染色，以测定蛋白多糖含量。使用半定量评分系统评价滑液炎症、关节外炎症、腐蚀和蛋白多糖损失。
在给予抗体之后开始用化合物处理。所述规程允许观察治疗对关节炎进展的影响。结果表明，与第4组动物相比，在第7-14天，第1组中的胶原诱导的关节炎减少。与第1组动物在第7天的5.1的最大临床评分相比，用媒介物处理的动物中在第8天的最大临床评分为10.2。在第14天规程结束时，与对照组的4.1的评分相比，媒介物处理组的临床评分为7.8。在接受处理的动物中在第7-14天的临床评分之差是明显的，这表明，与媒介物对照动物组相比，接受治疗的动物中出现了炎症水平的降低。用17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇进行处理的作用与用地塞米松进行处理相似，其也在这个动物模型中抑制炎症和降低关节炎的严重程度。17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇降低关节炎严重程度的能力与在这种关节炎模型中几乎没有效力的细胞免疫抑制剂例如甲氨蝶呤或抗TNFα药物形成对比。
实施例11。研究了式1化合物影响小鼠中的LPS诱导肺损伤的能力。LPS诱导的肺损伤模型以前已经用于评价对于急性肺损伤(ALI)、急性成人呼吸窘迫综合征(ARDS)和内毒素休克或脓毒病的治疗(Metz等人，C,Chest 100(4):1110-9,1991；Windsor,A.C.等人，Ann.J.Med.Sci.306(2):111-6,1993；Brigham K.L.等人，Am.Rev.Respir.Dis.133(5):913-27,1986)。
所述规程实质上如Su,X.等人，Intenstive Care Med.30:133-140,2004中所述进行。将得自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)的6-8周龄雌性C57/BL6小鼠(平均体重25g)随机分为七个动物组并且提供标准的圈养和食物供给。所述各组为(1)用盐水和LPS处理的小鼠，(2)用媒介物和LPS处理的小鼠，(3)用125μg地塞米松处理的小鼠，(4)用40mg/Kg雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇和LPS处理的小鼠，(5)用40mg/Kg5α-雄甾烷-3β,16α-二醇-17-酮和LPS处理的小鼠，(6)用40mg/Kg 5α-雄甾烷-3β,17β-二羟基-16-肟处理的小鼠，(7)用40mg/Kg雄甾-5-烯-3α,7β,16α,17β-四醇处理的小鼠。
在第1天，小鼠用化合物或媒介物预处理。在第0天，小鼠用第二剂量的化合物或媒介物处理。在第0天+60分钟，将小鼠在浅度麻醉的情况下在气管的直接显象情况下用100μg的大肠埃希氏杆菌LPS(Sigma)攻击。在第2天(即，LPS攻击之后的第48小时的时间点)，将小鼠处死，并且取得BAL(将细胞计数并且测量TNFα/IL6水平)。取出肺，粉碎并且用于髓过氧物酶(MPO)研究。通过在直接显象的情况下将含50mg LPS(大肠埃希氏杆菌0111:B4,Sigma-Aldrich)的100mLPBS滴入到浅度麻醉(异氟烷)的气管中预先形成LPS诱导的急性肺部炎症。在第48小时的时间点，将小鼠处死。此后，在使下颈部的气管暴露之后进行气管切开。将钝头的20号针头插入到暴露的气管中，然后将其结扎并且用于进行支气管肺泡灌洗(BAL)。为了使气道出血和外伤最小化，使用0.5mL的无菌PBS×3进行BAL。典型地从这个过程回收总共1300mL。使用血细胞计数器测定BAL流体(BALF)中的细胞分类白细胞计数。对80-100个细胞进行分类。在得到BAL之后，将胸腔打开并通过右心室穿刺用3mL的无菌盐水灌注心/肺。然后收获所有的肺组织并且准备用于MPO测定。对于这个测定法，将肺分别地在磷酸钾缓冲液(pH 6.0，包含0.5%的十六烷基三甲基溴化铵)中匀化。F在离心(14,000Xg，10分钟，4℃)之后，将50μL的上层清液加入到包含0.2mg/mL邻联茴香胺二盐酸盐(Sigma-Aldrich)和0.00002%过氧化氢的950μL磷酸钾缓冲液中。在460ηm测量吸光度的变化。使用市售的ELISA通过用于TNFα、IL-6的ELISA(R&D Systems)测定BALF无细胞的上层清液(200Xg，10分钟，4℃)中的细胞因子水平。特别惊人的是雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇的结果，发现通过口服该化合物处理的动物的BAL中的MPO、TNFα和IL-6水平与媒介物处理的动物相比降低。对MPO(其是肺中嗜中性粒细胞载荷的度量)和促炎症细胞因子TNFα的影响是特别深远的。这提示化合物阻断促炎性细胞迁移到炎症组织中以及减少促炎症细胞因子信号转导的能力。在这个模型中，急性炎症大概是由先天免疫成分的LPS刺激驱动的。这些相同的介质症有一些有所增加，并且被认为是与涉及几种病症的肺部炎症有关，包括囊性纤维化、慢性阻塞性肺病、急性和慢性支气管炎、甚至是某些传染病如肺结核。用雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇进行处理在48小时显著降低BALF中MPO和促炎症细胞因子水平的观察结果与本文中关于雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇在慢性炎症的疾病特异性模型(包括EAE)中报告的抗炎活性一致。
实施例12。人混合淋巴细胞反应(MLR)。3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷、3β,17β-二羟基-16-氧代雄甾烷、17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇和17β-氨基雄甾-5-烯-3β-醇影响其中人T淋巴细胞应答于特异性异源抗原(主要组织相容性复合体)的抗原特异性刺激的能力。MLR用作迟发型超敏反应应答的体外模型并且表示化合物可以在体内对人抗原特异性T细胞应答的影响。化合物抑制MLR表示化合物对淋巴细胞的免疫抑制作用。不抑制MLR的化合物对于应答性淋巴细胞的抗原特异性活化来说不是免疫抑制性的。
从23-31岁的3名(2名男性，1名女性)禁食健康人类志愿者获得血样。受试者在研究之前的三个月中没有使用过免疫调节剂、抗过敏药或抗生素。受试者在上午9点和10点之间取血，以限制可能对淋巴细胞体外应答有影响的循环中激素或细胞因子水平的可能波动。通过在Ficoll-Hypaque(密度1.077，Biochrom AG,Berlin,Germany)梯度进行离心分离外周血单核细胞(PBMC)，并且将其再悬浮在培养基((RPMI1640，补充有2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100U/mL)和链霉素(100mg/mL)(Invitrogen s.rl.,Milan,Italy)中。使用10%的自体(效应器)失活的血浆。将五十万效应器PBMC(PBMCr)和500,000异源辐射(30Gy)的刺激物PBMC(PBMCs)以1:1的比例混合在200μL培养基中并且以4种化合物的每一种为300nM或30nM的浓度在平底96孔板(Nunc,Roskilde,Denmark)中培养6天。将化合物溶解于乙醇种，然后用培养基稀释到所需浓度，产生包含0.01%乙醇的最终溶液。将这种媒介物用作对照。对照还包括分别培养的PBMCr和PBMCs。在培养期的最后8小时过程中，将PBMC用1μCi/孔的[3H]胸腺嘧啶核苷(Amersham,Milan,Italy)脉冲处理。然后收获细胞并且使用β-细胞计数器测量放射性活度结合。计算一式四份的孔的平均cpm。T细胞的增殖表示为刺激指数：S1=cpm(PMBCs×PBMCr)/cpm(PBMCr)+cpm(PBMCs)。使用学生t检验进行统计分析。将得自每种试验化合物的一式四份的cpm数与在媒介物存在下培养的对照PBMCr和PBMCs中得到的增殖应答相比较。在p<0.05时认为差异是显著的。
结果表明，除了300nM的17β-氨基雄甾-5-烯-3β-醇之外，4种化合物中没有一种表现出MLR抑制。这表明，3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷、3β,17β-二羟基-16-氧代雄甾烷和17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇在这个测定中在300nM或30nM下没有可测量的免疫抑制性(p>0.05)，而300nM的17β-氨基雄甾-5-烯-3β-醇与对照反应相比具有适当的免疫抑制性(p<0.05)。这些结果表明，3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷、3β,17β-二羟基-16-氧代雄甾烷和17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇在体内对人淋巴细胞不具有免疫抑制性。这些结果与化合物是没有免疫抑制性的抗炎药的能力(参见例如，实施例7)相一致。
实施例13。免疫抑制的分析。糖皮质激素甾体例如地塞米松或氢化可的松典型地具有免疫抑制性并且具有显著的与其使用相关的毒性。实质上如前所述在小鼠中的报道基因抗原腘淋巴结测定法中考查免疫抑制(C.Goebel等人，Inflamm.Res.,45(Suppl.2):S85-S90,1996；R.Pieters等人，Environmental Health Perspectives107(Suppl.5):673-677,1999)。这个规程用于分析17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇在腘淋巴结(PLN)测定法中的活性，以表明该化合物在体内没有明显的免疫抑制活性。在这个规程中，媒介物是0.1%的羧甲基纤维素、0.9%盐水、2%吐温80和0.05%苯酚，在用药物治疗的动物中使用包含17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇的悬浮液。活性的评价包括(1)在腘淋巴结细胞中测量对淋巴细胞总数、抗原特异性IgM、IgG1和IgG2a抗体分泌细胞(ASC)(ELISPOT测定法)的抑制；(2)通过对悬浮液中的活细胞进行流细胞计数法分析细胞表面标示物(CD4、CD8、CD19、F480、CD80、CD86)表达；和(3)体外测量(ELISA)淋巴细胞的IL-4、TNFα和IFNγ产生。
使用无特异病原的BALB/C小鼠的组(每组n=5只)。阳性对照组用媒介物(口服强饲法)处理并且通过皮下注射5ng/天的地塞米松以诱导免疫抑制。媒介物对照动物(阴性对照)用单独的媒介物(口服强饲法)处理。一个动物组通过口服强饲法用0.1mg/天的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇处理。另一个动物组用通过口服强饲法对动物给予1mg/天的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇处理。通过等方差的双尾学生t检验分析结果。为动物的右后脚掌注射50μL的致敏量的新制备的TNP-OVA。每天在用TNP-OVA敏化之后立即通过皮下注射将地塞米松(磷酸地卡特隆注射剂；地塞米松磷酸钠)给予到颈部中。之后立即通过强饲法给予17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇。在注射TNP-OVA之后的五天，通过眼眶穿刺抽取血液，并且通过颈部脱位将小鼠无痛处死，取出淋巴结并且除去附着的脂肪组织。制备单细胞悬浮液，再悬浮在1mL的PBS-BSA(1%)中并且计算。测量细胞数IL-4、IL-5和IFNγ。
得自媒介物对照组的PLN中的淋巴细胞平均数是每个淋巴结7.8×106个，与用地塞米松治疗的动物组中每个淋巴结为2.9×106个相比。淋巴细胞计算的这种减少明显地表现出使用地塞米松或其它糖皮质激素化合物时典型地看见的显著的免疫抑制。相反，用1mg/天的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇处理的组的每个淋巴结具有8.2×106个淋巴细胞，用0.1mg/天的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇处理的组的每个淋巴结具有11.1×106个淋巴细胞。结果表明，17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇不具有免疫抑制性，而是具有免疫增强性能。与媒介物对照组相比，用1.0mg/天和0.1mg/天的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇处理使IFNγ、IL-4和IL-5水平增加，也表明了免疫增强性能。0.1mg/天的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇对IFNγ、IL-4和IL-5水平的影响大于用1.0mg/天处理的组。相反，与媒介物对照组或与药物处理组相比，用地塞米松处理的组的IFNγ、IL-4和IL-5水平降低。
实施例14。免疫抑制的分析。表征了几种化合物影响免疫应答的能力。这个规程考查化合物在标准免疫测定法中的免疫作用。卵清蛋白(OVA)特异性免疫应答试验是用于测量既往(细胞介导的和抗体介导的)免疫应答的稳定的系统。在第0和7天通过腹膜内注射(总体积200μL)在盐水中包含的在明矾(25mg/mL)中沉淀的100μg OVA使BALB/c小鼠免疫。将小鼠(每组n=5只)每天用化合物处理(口服强饲法，40mg/kg，约1mg/动物)，进行20天。在第20天，抽取许也并且在ELISA中测定对OVA的抗体滴度。试验的化合物为3β,16α-二羟基-17-氧代雄甾烷、16α-溴表雄酮、17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇、3β,16α-二羟基雄甾烷-17-肟、17β-氨基雄甾-5-烯-3β-醇和3α,16α,17β-三羟基雄甾烷。这些化合物中没有一个被发现具有深远的免疫抑制性，OVA抗体滴度与媒介物对照组中的结果相似。
实施例15。降低葡萄糖和改善胰岛素耐受。在人糖尿病和胰岛素耐受的糖尿病性db/db小鼠模型中评价降低葡萄糖作用和改善胰岛素耐受。在这些研究中，将约8到10周龄的db/db C57BL/Ks小鼠分为每组10只的组，然后通过口服强饲法用媒介物对照(没有药物)或17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇处理。将化合物以20mg/kg/天(每天两次，以10mg/kg给予)、40mg/kg/天(每天两次，以20mg/kg给予)、80mg/kg/天(每天两次，以40mg/kg给予)每天给予两次，直到28天。使用少量血液(尾部切口取血)，在剂量给药过程中每周两次监控血糖水平，以便通过糖度计试纸测量葡萄糖浓度。在剂量给药过程中的特定时间(第14天和第28天)，还通过给予1g/kg葡萄糖(对于40mg的小鼠为约40mg)的标准口服剂量并且然后在葡萄糖剂量给予之后的15、30、60和120分钟后迅速地监控血糖水平的波动来进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。在药物处理组中，在db/db小鼠中观察到高血糖的血糖水平有约40%的降低。在媒介物对照组中，血糖接近380mg/dL，而在药物处理组中在剂量给药的至少10天之后血糖为<230mg/dL。以80mg/kg b.i.d.的药物处理28天使在媒介物处理组中所见的口服葡萄糖剂量给药30分钟后的约400mg/dL的峰值高血糖偏离降低到药物处理组中的<200mg/dL。
实施例16。膳食诱导的肥胖症(DIO)小鼠的高血糖症治疗。可以在其中通过为动物喂食高脂肪膳食(总热量摄入的60%)至少6周获得的胰岛素耐受状态的小鼠模型中研究药物增强外周的对胰岛素的敏感性的作用。这个模型已经描述在例如，J.N.Thupari等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99(14):9498-9502,2002,H.Xu等人，J.Clin.Invest,112:1821-1830,2003,H.Takahashi等人，J.Biol.Chem.,278(47):46654-46660,2003中。在这些膳食条件下，小鼠表现出体重增加(+35g)和葡萄糖不耐性的状态，表现为在标准OGTT(口服葡萄糖耐量试验)过程中口服给予的葡萄糖的清除时间有显著的延迟。
对于这些研究，将约4周龄的动物分为每组10只动物的组，然后通过口服强饲法用媒介物对照(没有药物)或17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇处理。17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇以20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg给予，每天两次，直到28天。在剂量给药过程中的第14天和第28天，进行OGTT。在这个胰岛素耐受的DIO模型中，如OGTT血糖偏差的显著改善所示，与媒介物对照动物相比，17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇显著降低葡萄糖不耐性。这些发现表明，用17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇处理增强了外周的胰岛素敏感性或摄入，其改善这些动物中的葡萄糖不耐性。
实施例17。使用比实施例15中所述动物更年轻的db/db小鼠进行与实施例15中所述相似的治疗规程。将动物(每组n=8到10只)通过口服强饲法每天两次用40mg/kg/天(20mg/kg剂量，每天给予两次)和80mg/kg/天(40mg/kg剂量，每天给予两次)的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇或媒介物处理。在剂量给药开始时，在葡萄糖水平升高或高血糖症发病之前，动物为6周龄。媒介物或药物剂量给药维持32天，以测定治疗对动物的高血糖症的发病和进展速率的影响。在对照组中，在剂量给药25天之后观察到高血糖症发病，并且其持续恶化，即，在32天剂量给药时间结束时，血糖水平从正常水平上升到明显的高血糖症。相反，两个药物治疗组的葡萄糖水平都没有在32天剂量给药时间结束时升高到超过正常水平，表明在所述规程的过程中，药物治疗延迟了高血糖症的发病。
对8周龄的雄性糖尿病db/db小鼠给予17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇显著地抑制基础血糖的高血糖水平，这个作用在剂量给药10天之后变得显而易见，并且在连续的、每天两次处理的40mg/kg剂量组中持续另外的18天。在较年轻的6周龄雄性db/db小鼠中，用40mg/kg的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇处理在剂量给药25天之后完全阻断了在媒介物处理组中观察到的动物发展为高血糖状态的进展。经过治疗的动物保持与瘦型db/+同窝小鼠相当的血糖水平。此外，在经过治疗的动物模型中进行的OGTT的结果显示，与媒介物对照动物相比葡萄糖不耐性有显著的改善。
实施例18。在8周龄db/db糖尿病小鼠中葡萄糖降低。进行高胰岛素-正糖钳夹规程，以便测量体内的胰岛素敏感性。在这个操作中，给予胰岛素以便使胰岛素浓度上升，同时输注葡萄糖以保持血糖正常或固定的正常血糖水平(约180mg/dL)。维持血糖正常所需的葡萄糖输注速率(GIR)显示了这些动物中的胰岛素作用。这个规程的目的是要调查或表征17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇和雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇在高胰岛素-正糖钳夹模型中改善系统性胰岛素耐受和改善整体葡萄糖消除的能力。还评价了骨骼肌和肝脏的胰岛素敏感性和组织特异性的葡萄糖摄取的程度。在第14天通过口服强饲法对每天剂量给药。在处理的第10天，在颈动脉和颈静脉中植入导管。在钳夹的当天(第14天)，在上午7:30给予化合物。
在处理的第0、7和14天评价体重和葡萄糖浓度。在第14天进行高胰岛素正糖钳夹处理。在7:30取走食物并在10:30持续输注[3-3H]-葡萄糖(0.05μC/分钟)进行加强。在12:50(-10分钟)取得基线血样，并且在1:00(0分钟)通过给予10mU/kg/分钟的胰岛素引发高胰岛素正糖钳夹处理。以不同的速率输注葡萄糖，以使葡萄糖浓度固定在～180mg/dl。在研究结束时给予[14C]2-脱氧葡萄糖的浓集注射以评价组织特异性的葡萄糖摄取。在122、125、130、135、145分钟评价血浆的14C2-脱氧葡萄糖。然后用静脉内输注的戊巴比妥钠将动物麻醉并且取得选定的组织，立即在液氮中冷冻并且在分析之前存储在-70℃。
如下进行分析。将血浆样品用Ba(OH)2(0.3N)和ZnSO4(0.3N)脱去蛋白，干燥，并且在闪烁计数器(Packard TRICARB 2900 TR,Meriden,CT)上评价放射性活度。将冷冻的组织样品在0.5%高氯酸中匀化，离心并且中和。直接对一个上层清液进行计数，以测定来自[14C]DG和[14C]DGP二者的放射性活度。将第二个等分试样用Ba(OH)2和ZnSO4处理以除去14C DGP和结合到糖原中的任何示踪剂，然后测定来自游离[14C]DG(2)的放射性活度。[[14C]DGP计算为两个等分试样之间的差值。将[14C]DGP的累积相对于组织重量和示踪剂浓集注射归一化。如前所述计算组织特异性葡萄糖摄取指数Rg(E.W.Kraegen等人，Am.J.Physiol.,248:E353-E362,1985)。整体葡萄糖周转计算为3H葡萄糖液输注速率(dpm/kg/分钟)和动脉血浆葡萄糖比放射性(dpm/mg)之间的比值。将内原性葡萄糖产生计算为整体葡萄糖周转和异源葡萄糖液输注速率之间的差值(R.N.Bergman等人，Endocr.Rev.,6:45-86,1985)。处理组概述在以下所示的表中。
Figure BDA00002844272200711
*媒介物：在水中的30%磺基丁基醚(对于B-D组，在溶液中含20mg/mL的药物)
**化合物1：17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇
化合物2：雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇
***马来酸罗格列酮(31493r,AApin Chemicals Limited(UK),
CMC-羧甲基纤维素(中级,C4888,Sigma)
胰岛素剂量为10mU/kg/分钟。在正常动物中，这个胰岛素剂量需要输注～90mg/kg/分钟的葡萄糖以保持葡萄糖水平固定在～150mg/dl。所有处理组中的平均葡萄糖要求为正常值的～50%。结果表明，与媒介物对照相比，17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇和雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇二者都增加葡萄糖液输注速率，这意味着在B、C、D和E组中的胰岛素作用得到改善。
使用3-3H葡萄糖示踪剂，在基础时期过程中计算肝葡萄糖产生的速率和在钳夹过程中胰岛素抑制肝葡萄糖产生的能力。在严重的胰岛素耐受动物中，在所使用的胰岛素剂量，内源的葡萄糖产生减少约50%。在C、D和E组中，胰岛素完全地抑制内源性葡萄糖产生(p<0.05)，这表示肝脏胰岛素作用的改善。
为了评价外周的胰岛素作用，使用14C-2-脱氧葡萄糖评价高胰岛素正糖钳夹过程中的组织特异性葡萄糖摄取。在120分钟给予14C-2-脱氧葡萄糖的浓集注射。在25分钟后收集组织。分析组织的14C-2-脱氧葡萄糖磷酸酯的总累积量。在这个规程中，脑葡萄糖摄取不受大多数治疗方案的影响，所以将其用作内部对照。结果表明，所有组之间的脑的葡萄糖摄取都具有可比性。在处理组中，在心脏和隔膜中的葡萄糖摄取比媒介物对照组更高。雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇和罗格列酮二者都更有效地增加腓肠肌肌肉中的肌肉葡萄糖摄取(p<0.05)。在作为非氧化性肌群的白色股肌肌肉中，除雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇和罗格列酮之间的差别以外，没有检测到差别。
实施例19。使大鼠自由接触包含0.45%重量/重量的雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇的标准实验室食物6天，随后在第6天对肝脏组织进行分析，分析肝脏的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(“PEPCK”)和11β-羟基类固醇脱氢酶(“11β-HSD”)的水平。对照动物饲喂正常食物，并且在第6天通过RT-PCR测量信使RNA(mRNA)来考查PEPCK和11β-HSD水平。对照和处理的动物都自由取得水。发现在食物中给予化合物6天降低肝脏组织中11β-HSD1型(“11βHSD1”)和PEPCK的水平，如下所示。这些动物中的PPARαmRNA水平没有受到饲喂雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇的影响。
Figure BDA00002844272200721
在另一项研究中，发现对小鼠给予化合物17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇使成骨细胞中的11β-HSD1减少约50%，这与化合物在用体内诱导骨损失的糖皮质激素地塞米松处理的小鼠中具有骨保留的作用(bone-sparing effects)的观察结果一致。
在另一项研究中，从用20mg/kg的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇处理的瘦型db/+或糖尿病db/db小鼠的性腺周围的脂肪组织分离总的RNA并且处理用于定量RT/PCR，所述定量RT/PCR使用iCycler iQ多色实时检测系统(Bio-Rad)，用对于单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)为特异性的引物进行。使RNA表达水平相对于媒介物对照归一化。发现化合物使单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的水平降低约50%。对于这项研究，还对与瘦型的杂合子db/+小鼠同龄的对照组(n=7)给予媒介物。
以类似的方式考查了其它化合物例如17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇、雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3β,7α,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3α,7β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3β,4β,16α,17β-四醇、雄甾-5-烯-3α,4β,16α,17β-四醇或这些化合物的单酯或二酯，例如，在3或17位包含一个或两个乙酸酯或丙酸酯的化合物，考查它们降低肝细胞或肝脏来源的细胞中或其它组织或细胞(例如肾脏、肌肉、骨组织或细胞、脂肪组织或细胞、或CNS组织或细胞例如神经元或神经胶质)中的PEPCK或11β-HSD(例如11β-HSD 1型或11β-HSD 2型)的水平或活性的能力。
实施例20。在体内抑制CD4+CD25+T调节性细胞的产生或它们的活性。将得自每组同类系B6.SJL小鼠(CD45.1)的纯化的CD4+CD25-T细胞(5×106个细胞)继承性转移到五只B6小鼠(CD45.2)的每一只中。通过对供体细胞进行荧光活化的细胞分选(FACS)至少两次得到纯化的CD4+CD25-T细胞。在从CD45.1供体动物转移细胞之前皮下注射媒介物(0.1%羧甲基纤维素、0.9%盐水、2%吐温80、0.05%苯酚)或含16α-溴表雄酮的媒介物(1mg/动物/天，在100μL媒介物中)，并且每天注射持续14天。在第15天从动物收集胸腺、淋巴结和脾脏。从个体得到胸腺、淋巴结和脾脏的样品，并且将细胞用结合于CD4、CD25、CD103或Foxp3的荧光抗体标记。然后通过流细胞计数法分析细胞，以便计数不同细胞型的数目。将得自每个处理组的淋巴结和脾脏的其余细胞汇集，预先富集CD4+CD25+细胞，然后分析由宿主(内源CD45.2细胞)和供体细胞(在体内停留15天之后从CD4+CD25-供体表现型转化为CD4+CD25+表现型的CD45.1细胞)产生的CD4+CD25+。通过细胞分类器分析细胞。对于调节功能的试验，将不同数量的纯化的转换CD45.1CD4+CD25+细胞或内源CD45.2 CD4+CD25+细胞与2000个CD4+CD25-效应器细胞、作为抗原递呈细胞的1×105个辐射的脾脏细胞、和0.5mg/ml的抗CD3抗体共培养。使用新鲜的CD4+CD25+细胞作为对照。通过测量在培养开始之后4天摄取的3H-胸腺嘧啶核苷来测定增殖。
结果表明，与得自媒介物对照动物的脾脏的CD45.1 CD4+CD25+Treg细胞数目相比，得自药物治疗组动物的脾脏的供体CD45.1CD4+CD25+Treg细胞数目更低。媒介物对照CD45.1 CD4+CD25+的平均细胞数为1.97×105个细胞，而得自药物治疗组动物的CD45.1CD4+CD25+细胞平均数为0.62×105个细胞。
与得自媒介物对照动物的脾脏的CD45.1 CD4+CD25+Treg细胞数目相比，得自药物治疗组动物的脾脏的内源CD45.2 CD4+CD25+Treg细胞的数目也更低。媒介物对照CD45.2 CD4+CD25+的平均细胞数为9.54×106个细胞，而药物治疗组动物的平均数为5.49×106个CD45.2CD4+CD25+细胞。
媒介物对照动物的胸腺中的内源CD45.2 CD4+CD25+细胞的平均数为3.10×105，而药物治疗组动物为1.59×105。
与媒介物对照动物的脾脏中的CD45.1 CD4+CD25+CD103+Treg细胞数目占总的供体CD4+CD25+细胞的百分比相比，药物治疗组动物的脾脏中的供体CD45.1 CD4+CD25+CD103+细胞占总的供体CD4+CD25+细胞的百分比更低。得自媒介物对照动物的脾脏中的内源CD45.2CD4+CD25+CD103+Treg细胞的比例(13.85%)与药物治疗组动物(13.40%)相比大约相同。媒介物对照的供体CD45.1 CD4+CD25+CD103+细胞平均数是29.06%，而药物治疗组动物的平均数为9.63%。CD103表面抗原由活化的Treg细胞表达。这表明，在药物治疗组动物中的活化的CD45.1 CD4+CD25+细胞的相对比例比媒介物对照中更低，这与体内抑制供体细胞的Treg细胞活性一致。
这个规程的适合的变体包括(1)对每只动物使用更大数量的供体CD4+CD25-T细胞，例如，1×106个/动物、1.5×106个/动物或2×106个/动物，(2)药物的不同日剂量，(3)药物的不同给药途径，(4)不同的化合物作为药物，和(5)包含另外的动物组，例如，接受另一种治疗剂例如抗炎药或免疫抑制性糖皮质激素例如地塞米松或氢化可的松的组。这些变体中有一些可以应用于实施例3或一些所引用的参考文献的规程。
实施例21。增加CD4+CD25+T调节性细胞或它们的体内活性。实质上如先前描述的胶原诱导的关节炎动物模型中所述对小鼠给予化合物17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇。H.Offner等人.,Clin.Immunol.,110:181-190,2006。
这项研究使用DBA/1Lac/J小鼠。小鼠得自Jackson Laboratories(BarHarbor,Harbor,MA)并且根据适用的制度原则圈养。通过使用以1:1的比例用包含200μg结核分枝杆菌(100μL；Difco,Detroit,MI)的CFA乳化的200μg的bCII使8周龄小鼠免疫，使用牛II型胶原(bCII)诱导胶原诱导的关节炎(CIA)。将抗原真皮内注射到尾巴根部。监控动物4-7周，以便观察免疫后疾病的发病和进展。根据以下标准用分级系统对每个爪评价关节炎的严重程度：0=没有发红或肿胀；1＝轻微的踝肿胀或脚发红；2=发展的肿胀和炎症并且从踝到脚中部的发红；3=整个脚出现肿胀和炎症；4=整个脚(包括脚趾)出现肿胀和炎症。
在免疫之后，在可观察到的临床疾病出现时开始(从免疫之后的约26-27天开始)通过口服强饲法用包含在媒介物周的40mg/kg/天的药物治疗小鼠。用于这个规程的媒介物是含30%环糊精-磺基丁基醚的水。环糊精-磺基丁基醚是商购得到的(CaptisolTM，得自cydexinc.com)。药物制剂是20mg药物/mL媒介物。
得自药物治疗组动物的结果表明，给予17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇增加全脾细胞中表达Foxp3+和CD4+Foxp3+的细胞的频率，如下所示。
             媒介物(n=3)   药物(n=3)      p值
总的Foxp3+    1.6%±0.16    2.39%±0.16    0.00001
CD4+Foxp3+    1.1%±0.09    1.34%±0.05    <0.00001
细胞分类分析表明，药物治疗组动物值的Foxp3+CD4+细胞(1.4%)相对于对照动物(1.0%)有所增加。Foxp3蛋白涉及CD4+CD25-分化或转化为CD4+CD25+Treg细胞，并且表达Foxp3的细胞数目增加表明从Treg细胞的前体细胞发育为Treg细胞有所增加。在免疫之后，在可观察到的临床疾病出现时开始(从免疫之后的约26-27天开始)通过口服强饲法用包含在媒介物周的40mg/kg/天的药物治疗小鼠得自药物治疗组动物的结果表明，给予17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇增加全脾细胞中表达Foxp3+和CD4+Foxp3+的细胞的频率，如下所示。与这个结果一致的是，与媒介物对照相比，在免疫之后的44-49天，药物治疗组动物的临床评分有统计上的改善。在第34天到第49天，媒介物对照动物的平均临床评分为约6.8-8，而药物治疗组动物在第34天的最大平均临床评分为约5，并且缓慢减小到第49天的平均评分为约3。这些结果表明，与媒介物对照动物相比，化合物延缓关节炎的进展并且降低其最大严重程度。
实施例22。化合物的合成如下所述。
雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇(7)
Figure BDA00002844272200771
5-雄甾烯-3β,16α-二醇-17-酮二乙酸酯(3)。如下制备16α-溴脱氢表雄酮2：使DHEA(1)在甲醇中与溴化铜(II)回流。向含15.0g的2(40.8mmol)的吡啶(129mL)和水(309mL)中加入120mL的1N氢氧化钠水溶液并将混合物在空气中搅拌15分钟。将反应混合物倾倒在用氯化钠饱和的并且包含过量盐酸的冰/水中。将粗产物过滤，用水洗涤直到中性，并且在55-60℃在无水氯化钙下真空干燥。从甲醇重结晶得到8.21g的16α-羟基-DHEA(Mp 194.4-195.1℃)。然后通过用吡啶中的过量乙酸处理将产物转化为而乙酸酯，并且通过快速色谱法纯化。
5-雄甾烯-3β,16α-二醇-7,17-二酮(5)。向在包含硅藻土(60g)和重铬酸吡啶盐(75g)的苯中的3(20.1g,51.7mmol)的溶液加入22mL的70%叔丁基过氧化氢。在室温下搅拌2天之后，加入乙醚(600mL)，并且将沉淀过滤和用乙醚洗涤(2×100mL)。残余物通过快速色谱法纯化(含60%乙酸乙酯的己烷)并且重结晶，得到16.0g(39.8mmol,77%)的5，为棱晶。Mp 205.6-206.2℃。
5-雄甾烯-3β,7β,16α,17β-四醇(7)。在0℃向5(10.0g,24.8mmol)在二氯甲烷(75mL)和甲醇(255mL)中的溶液加入1.5g的氢化硼钠并将混合物在0℃搅拌1小时。在用乙酸(3.5mL)猝灭之后，将反应混合物在二氯甲烷和水之间分配。将有机物层浓缩为7α和7β二乙酸酯四醇的混合物。将这个通过快速色谱法和HPLC纯化，得到2.90g的7β-差向异构体(9.5mmol,38%)。Mp216.8-220.8℃。在室温下在甲醇(100mL)中用1N氢氧化钠(60mL)皂化2天并且通过HPLC纯化，得到7(1.41g,4.4mmol,46%)从乙腈水溶液得到，为细针状结晶。Mp 202.1-206.4℃；[a]D+1.35(甲醇,c=1)。选择的1H NMR峰(CD3OD):d0.77(s,3H),1.01(s,3H),3.39(d,1H),3.46(m,1H),3.74(t,1H),4.04(m,1H),5.55(dd,1H)。
3α,7α,17β-三乙酰氧基雄甾-5-烯-16α-醇(8)，雄甾-5-烯-3α,7α,16α,17β-四醇(9)
Figure BDA00002844272200781
16α-溴-5-雄甾烯-3α-醇-17-酮(2)。在搅拌下使5-脱氢雄甾酮(1)(17.8g,61.7mmol)的甲醇(1.35L)溶液与溴化铜(II)(36.4g,163mmol)回流19小时。向冷却的反应混合物加入水(1.35L)和二氯甲烷(1.5L)。将有机层过滤通过无水硫酸钠并且产物作为细针状结晶从甲醇结晶(16.7g,45.5mmol,74%)。Mp 195-207℃。
3α,16α-二乙酰氧基-5-雄甾-17-酮(4)。在空气下向2(12.0g,32.7mmol)在吡啶(1.032L)和水(0.247L)中的溶液加入1N氢氧化钠水溶液(90mL)并将混合物在室温搅拌15分钟。将反应混合物加入到包含1.2L的1N盐酸的冰/水混合物中。在将溶液用氯化钠饱和之后，将其用乙酸乙酯提取(2×1L)。合并的有机层用盐水(250mL)洗涤，过滤通过无水硫酸钠并且浓缩。粗的5-雄甾烯-3α,16α-二醇-17-酮(3)在室温下用含过量乙酸酐的吡啶处理过夜并且过柱纯化，得到4(7.46g,19.2mmol,59%)为得自甲醇的棱晶。Mp 172.7-173.7℃。
5-雄甾烯-3α,16α,17β-三醇3,16-二乙酸酯(5)。在0℃向烯二酮(enediolone)二乙酸酯4(7.46g,19.2mmol)在二氯甲烷(45mL)和甲醇(120mL)中的溶液加入硼氢化钠(950mg)。将溶液在0℃搅拌1小时。在加入过量乙酸之后，将反应混合物在二氯甲烷和水之间分配。将有机层过滤通过无水硫酸钠并且浓缩，得到17α(次要)和17β(主要)差向异构体的混合物。将这个混合物通过快速色谱法(含25%乙酸乙酯的己烷)纯化，得到6.1g(15.6mmol,81%)的17β差向异构体5。Mp126.9-128.6℃。通过在室温下用含过量乙酸酐的吡啶处理过夜并且通过过柱纯化，从5制备三乙酸酯6，得到6.0g(13.9mmol,89%)。
5-雄甾烯-3α,16α,17β-三醇-7-酮三乙酸酯(7)。将三乙酸酯6(6.0g,13.9mmol)的苯(255mL)溶液用硅藻土(25.5g)、重铬酸吡啶盐(31.5g)和70%叔丁基过氧化氢(9.0mL)处理并且在室温下搅拌19小时。加入无水乙醚(255mL)并将反应混合物在冰浴中冷却1小时。将产生的固体滤掉并且用乙醚洗涤(2×50mL)。将合并的有机部分浓缩并且通过快速色谱法纯化(含29%乙酸乙酯的己烷)，得到3.45g的7(7.7mmol,55%)。
5-雄甾烯-3α,7α,16α,17β-四醇(9)。在0℃向7(3.45g,7.7mmol)在二氯甲烷(15mL)和甲醇(30mL)中的溶液加入硼氢化钠(1.0g)并将溶液在0℃搅拌2小时。在加入过量的乙酸(1.5mL)之后，将反应混合物在二氯甲烷和水之间分配。将有机层过滤通过无水硫酸钠并且浓缩，得到7α(次要)和7β(主要)差向异构体的混合物。将这个混合物在甲醇(100mL)中在室温下用1N氢氧化钠(60mL)皂化过夜。通过将皂化混合物在乙酸乙酯和盐水之间分配回收粗的四醇。通过HPLC分离差向异构体，得到220mg的9(0.68mmol,9%)。Mp 243-248.3℃。。选择的1H NMR峰(CD3OD):δ0.77(s,3H),1.02(s,3H),2.11(m,1H),2.57(m,1H),3.34(s,1H),3.44(d,1H),3.70(brt,1H),4.04(m,2H),5.55(dd,1H)。通过HPLC分离8的差向异构体，得到纯化的8及其7β-乙酸酯差向异构体。
雄甾-5-烯-3β,7β,11β,17β-四醇-3β-乙酸酯(8)、雄甾-5-烯-3β,7β,11β,17β-四醇(9)、雄甾-5-烯-3β,7β,11β,17β-四醇-3β-乙酸酯-11-肟(10)。
Figure BDA00002844272200801
I:向1(4g)在150ml Ac2O中的溶液加入p-TsOH2.8g,在室温下，过夜，后处理为加入700mL冰水、搅拌1小时，直到形成固体，将固体滤出，得到固体产物2，4.55g。
II:在0℃向1.5g NaBH4在35ml EtOH和5ml MeOH中的溶液缓慢加入2(1.2g)在30ml EtOH和10ml氯仿中的溶液。将溶液继续在0℃搅拌2小时，然后在室温下搅拌2小时。在这个时间之后，加入4ml乙酸以猝灭NaBH4，然后加入50ml水。通过用EtoAc提取50ml×3分离产物，在真空中溶剂除去，得到粗产物。通过柱色谱法纯化，得到3，250mg。
III:向3(200mg)在8ml MeOH中的溶液加入0.36g H5IO6在2ml水中的溶液，在室温下搅拌1小时，真空除去溶剂，加入水并用二氯甲烷提取。柱色谱法纯化，得到产物4，60mg。
IV:在0℃向4(0.4g)的5ml吡啶溶液中缓慢加入0.5ml乙酰氯，继续在0℃搅拌15分钟，然后室温搅拌30分钟。通过加入20ml水将反应猝灭，用EtoAc提取15ml×3，用1N HCl、饱和NaHCO3、盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥。真空浓缩得到5，520mg。
V:向5(0.5g)和0.13g CuI在15ml乙腈中的溶液缓慢加入3ml的70%t-BuOOH，搅拌1小时，然后在50℃搅拌2小时。加入12ml 10%Na2S2O5溶液，用EtOAc提取，用Na2SO4干燥，除去溶剂，过柱，得到6，80mg。
VI:向6(50mg)在1.5ml THF和3ml MeOH中的溶液加入260mgCeCl3·7H2O，然后在0℃缓慢加入75mg NaBH4，搅拌30分钟,加入0.5mL1N HCl和5ml水,用EtoAc提取5ml×3,用Na2SO4干燥,除去溶剂，得到7，49mg。
VII:向300mg NaBH4在4ml EtOH和1ml MeOH中的溶液加入7(40mg)在0.5ml EtOH和0.5ml氯仿中的溶液，在0℃搅拌8小时然后在冷冻器中过夜。加入乙酸以猝灭反应，加入水并且用EtoAc提取，得到8，30mg。mp>250℃；1H NMR(CD3OD)δ0.86(s,3H),1.35(s,3H),1.95(s,3H),3.55(t,1H,J=7.5Hz),3.71(dd,1H,J=7Hz,J=2.5Hz),4.32(d,1H,J=2.7Hz),4.55(m,1H),5.21(s,1H)。
VIII:向8(30mg)在1mL MeOH中的溶液加入含50mg NaOH的0.25mL水溶液。在50℃搅拌15分钟，然后加入1N HCl 1mL、水5mL，用EtoAc提取5mL×3，除去溶剂，得到9,20mg。mp170-172℃；1HNMR(CD3OD)δ0.95(s,3H),1.32(s,3H),3.41(m,1H),3.51(t,1H,J=8.0Hz),3.78(dd,1H,J=7.1Hz,J=2.5Hz),4.31(d,1H,J=2.5Hz),5.15(s,1H)。
IX:向29mg NH2OH·HCl和17mg NaOH在热的1mL EtOH中的溶液加入9(50mg)在热的1mL EtOH中的溶液，在100℃回流2小时，将盐滤出，在EtOH/H2O中重结晶，得到10，40mg。mp>250℃；1HNMR(CD3OD)δ0.72(s,3H),1.02(s,3H),2.03(s,3H),3.86(t,1H,J=8.5Hz),4.08(dd,1H,J=8.0Hz,J=2.6Hz),4.60(m,1H,),5.19(s,1H)。
17α-甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇-3β-乙酸酯-7,11-二酮(7)、17α-甲基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇-3β-乙酸酯-11-酮(8)、甲基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇-11-酮(9)。
Figure BDA00002844272200831
I:向1(4g)在150ml Ac2O中的溶液加入p-TsOH2.8g，室温过夜，后处理为加入700mL冰水、搅拌1小时，将固体滤出，得到白色产物2，4.55g。
II:在0℃缓慢向1.5g NaBH4在35mL EtOH和5mL MeOH中的溶液加入2(1.2g)在30mL EtOH和10mL氯仿中的溶液，继续在0℃搅拌2小时，并且室温搅拌2小时，加入4mL乙酸以猝灭NaBH4，加入50mL水，用EtoAc提取50Ml×3，然后除去溶剂，得到粗的产物。过柱得到3，250mg。
III:向3(200mg)在8ml MeOH中的溶液加入0.36g H5IO6在2ml水中的溶液，在室温搅拌1小时，除去溶剂，加入水并且用DCM提取，然后过柱，得到产物4，60mg。
IV:在-78℃在N2下向4(250mg)在1.5mL THF和3.5mL乙醚中的溶液缓慢加入1mL含22%MeMgCl的THF，在-78℃搅拌1.5小时，然后室温搅拌1小时，然后在75℃回流1小时。在0℃加入4mL1N HCl和10mL水。用EtoAc提取，除去溶剂，得到粗品249mg。过柱，得到5，46mg。
V:在0℃向5(1.0g)在15mL吡啶中的溶液缓慢加入1.1mL乙酰氯，在0℃搅拌15分钟，然后室温搅拌30分钟。加入50mL水，用EtoAc提取50mL×3，用1N HCl、饱和NaHCO3、盐水洗涤并且用Na2SO4干燥。除去溶剂，得到6，1.02g。
VI:向6(1.0g)和0.3g CuI在40mL乙腈中的溶液缓慢加入6mL70%t-BuOOH，在室温搅拌1小时，然后在50℃搅拌2小时。加入24mL10%Na2S2O5溶液，用EtoAc提取，用Na2SO4干燥，除去溶剂，过柱，得到7，285mg。mp>250℃；1H NMR(CD3Cl)δ0.82(s,3H),1.29(s,3H),2.05(s,3H),4.70(m,1H,),5.75(s,1H)。
VII:向7(45mg)在1.5mL THF和3mL MeOH中的溶液加入150mg CeCl3·7H2O，然后在0℃缓慢加入30mg NaBH4，搅拌10分钟，加入0.5mL1N HCl和5mL水，用EtoAc提取5mL×3，用Na2SO4干燥，除去溶剂，得到8，41mg。mp 108-110℃；1H NMR(CD3OD)δ0.725(s,3H),1.25(s,3H),2.01(s,3H),4.02(dd,1H,J=8.2Hz,J=2.4Hz),4.53(m,1H,),5.29(s,1H)。
VIII:向8(22mg)在1mL MeOH中的溶液加入23mg NaOH在0.1mL水中的溶液。在50℃搅拌10分钟，然后加入1N HCl1mL、水5mL，用EtoAc提取5mL×3。除去溶剂，得到9，10mg。mp>250℃；1H NMR(CD3OD)δ0.75(s,3H),1.24(s,3H),3.41(m,1H),3.99(dd,1H,J=8.2Hz,J=2.5Hz),5.23(s,1H)。
17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇(8)、17β-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17α-四醇(9)
I:向1(1.0g)和0.56g咪唑在15ml DMF中的溶液加入TBDMS-Cl1.24g，室温过夜，后处理包括加入50ml水，有固体形成，过滤得到白色固体产物2，1.75g。
II:向冷却到-78℃的2(1.64g)在50ml THF中的溶液加入2.3mlLDA，在30分钟之后，缓慢加入0.62ml TMSCl，在-78℃搅拌30分钟，然后回温到室温搅拌1小时，TLC显示RXN完成，用乙醚提取150mlx2，用水和盐水洗涤,用Na2SO4干燥得到黄色产物3，1.87g。
III和IV:向冷却到-20℃的3(10g)在250ml THF中的溶液加入m-CPBA4.2g，搅拌3小时以形成4，然后缓慢加入250ml MeOH，在-20℃搅拌30分钟，然后在-20℃缓慢加入200ml Na2SO3溶液，搅拌1小时。回温到室温，用乙醚提取150mL×3，用饱和NaHCO3、盐水洗涤,用Na2SO4干燥，得到粗的11g，为了除去产物中的一些额外的m-CPBA，过短柱，用100%Hex 50mlx5洗脱，然后用50%Hex/EtoAc100ml×5洗脱，收集粗产物5，8.5g。
V:通过注射器泵向10g 90%乙炔锂乙二胺络合物在250ml无水THF中的溶液加入5(5g)在50mL无水THF中的溶液，这个过程花费约8小时。使其室温搅拌过夜。在0℃加入500mL水，用EtOAc提取150mL×3，用200mL0.1N HCl、150mL饱和NaHCO3、100mL盐水洗涤，用Na2SO4干燥,除去溶剂，得到粗品5.5g，过柱，得到两个异构体，17-β-OH，6(1.5g)和17-α-OH，7(1.2g)。
VI:向6(265mg)在4mL MeOH和3mL THF中的溶液加入4mL1N HCl，在室温1.5小时。加入10mL饱和的NaHCO3，室温除去有机溶剂，加入10mL水，储存在冷冻器中过夜以除去水，向固体加入THF，过滤，除去THF，得到白色固体产物8,130mg。mp 214-216℃；1H NMR(CD3OD)δ0.92(s,3H),1.06(s,3H),2.99(s,1H),3.42(m,1H),3.72(dt,1H,J=7.2Hz,J=2.5Hz),4.17(dd,1H,J=8.2Hz,J=2.7Hz),5.24(d,1H,J=1.0Hz)。
VII:向7(500mg)在8mL MeOH和6mL THF中的溶液加入8mL1N HCl，在室温1.5小时。加入饱和的NaHCO3以中和溶液到pH=8。加入50ml水，得到的白色固体，过滤，用水洗涤，真空干燥，得到白色固体产物9，225mg。mp>250℃；1H NMR(CD3OD)δ0.90(s,3H),1.06(s,3H),2.75(s,1H),3.42(m,1H),3.72(dt,1H,J=7.0Hz,J=2.0Hz),.4.37(dd,1H,J=8.1Hz,J=2.6Hz),5.24(t,1H,J=2.0,J=1.0Hz)。
4β-乙酰基雄甾-5-烯-3β,16α,17β-三醇(7)、雄甾-5-烯-3β,4β,16α,17β-四醇(化合物8)。
步骤1:将化合物1(24.0g,0.0832mol)和溴化铜(56.0g,0.20mol)在无水甲醇(800mL)中的混合物回流16小时。真空下除去大部分溶剂并且加入水(500mL)。通过过滤收集产生的沉淀，并且用水洗涤。使固体在甲醇中重结晶两次，得到化合物2，为浅黄色固体(19.7g)
步骤2:向搅拌的化合物2(22.0g,0.060mol)在200mL N,N-二甲基甲酰胺中的溶液加入1N氢氧化钠水溶液(66mL,0,066mol)。将反应混合物在室温搅拌1小时。加入1N盐酸(8mL)和400mL水。通过过滤收集产生的沉淀并用水洗。粗产物通过从甲醇重结晶进行纯化，得到化合物3，为白色固体(11.8g)。
步骤3:在0℃向化合物3(11.8g,0.0387mol)在吡啶(50mL)中的溶液加入乙酰氯(11.8g,0.128mol)。将反应混合物在0℃搅拌1小时。使得到的混合物回温到室温并且搅拌另外的1小时。加入水。通过过滤收集沉淀，并用水洗涤。将固体真空干燥，得到化合物4(12.6g)，其不经纯化用于随后反应。
步骤4:在氮气下向冷却(0℃)的化合物2(3.10g,0.00916mol)在80mL无水乙醚中的溶液加入氢化铝锂(1.13g,0.030mol)。除去冰浴并将得到的混合物在室温搅拌0.5小时，然后回流1小时。通过加入6N盐酸将反应猝灭。减压下除去乙醚。将产生的固体过滤并用水洗。粗产物5在甲醇中重结晶，得到化合物5(1.1g)，为白色固体。
步骤5:向5(914mg,2.98mmol)在20mL氯仿中的溶液加入溴(303mg,3.16mmol)。将反应混合物在室温搅拌20分钟。减压除去溶剂，得到化合物6，其不经进一步纯化用于随后反应。
步骤6:4β-乙酰基雄甾-5-烯-3β,16α,17β-三醇(7)的制备。
将化合物6溶解于30mL的无水乙醚和10mL无水吡啶中。加入乙酸银(1.03g,1(914mg,2.98mmol)在5mL无水吡啶中的溶液。将反应混合物在暗处搅拌0.5小时。有大量的浅绿色沉淀产生。加入乙醚(50mL)并将沉淀滤掉。将滤液在真空下干燥。残余物通过硅胶上快速色谱法纯化，用50:50乙酸乙酯:己烷洗脱，得到标题化合物7(124mg)，为白色固体。选择的1H NMR数据:(CD3OD,300MHz):δ5.78(d,1H,J=2.2Hz),5.34(br,1H),4.02(t,1H,J=4.5Hz),3.52(dt,1H,J=7.7Hz,3.0Hz),3.37(d,1H,J=4.9Hz),2.03(s,3H),(1.12(s,3H),0.75(s,3H)。熔点:152-153℃。
步骤7:雄甾-5-烯-3β,4β,16α,17β-四醇(8)的制备。
将化合物7(50mg,0.137mmol)溶解于1N氢氧化钠水溶液(1mL)的甲醇(5mL)中并将得到的溶液回流1小时。在真空下除去甲醇并将残余物用乙酸乙酯提取(3×30mL)。将合并的提取物用硫酸镁干燥，过滤并且真空浓缩，得到固体。粗产物通过从甲醇重结晶进行纯化，得到标题化合物8(23mg)，为白色固体。选择的1H NMR数据:(CD3OD,300MHz):δ5.62(d,1H,J=3.2Hz),4.05(d,1H,J=2.4Hz),4.02(m,1H),3.43(dt,br,1H,J=11.7Hz,3.6Hz),3.36(d,1H,J=4.2Hz),1.197(s,3H),0.76(s,3H)。熔点:238-241℃。
雄甾-5-烯-3β,4β,7β,17β-四醇(12)(方法2)、雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三乙酰氧基-4β-醇(11)。
Figure BDA00002844272200891
步骤1:在0℃向化合物9(5.0g,0.0138mol)的吡啶(20mL)溶液中加入乙酰氯(11.8g,0.128mol)。将反应混合物在0℃搅拌5小时，然后在真空下除去大部分溶剂。将残余的浆状物在乙酸乙酯(80ml)和水(20ml)之间分配。有机层用1N盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用硫酸镁干燥，过滤并且蒸发为固体。粗产物从乙酸乙酯和己烷重结晶，得到化合物10(4.8g)，为白色固体。
步骤2:向化合物10(720mg,1.66mmol)在二氧杂环己烷(15mL)和乙酸(10mL)中的溶液加入在水(1.5mL)和二氧杂环己烷(5mL)中的二氧化硒(185mg,1.66mmol)。将反应混合物在95℃加热36小时。混合物冷却到室温，用乙酸乙酯稀释，并且顺序地用水、饱和碳酸氢钠、和盐水洗涤，然后用硫酸镁干燥，过滤并且真空浓缩到干燥。粗产物通过硅胶上的快速色谱法纯化，用3:2的己烷:乙酸乙酯洗脱，得到化合物11(174mg)，为白色固体。
步骤3:将化合物11(148mg,0.33mmol)溶解于1N氢氧化钠水溶液(3ml)和甲醇(10ml)中并将得到的溶液回流1小时。在真空下除去大部分甲醇。加入水并将混合物声处理和过滤。将收集的固体真空干燥，得到12(82mg)，为白色固体。选择的1H NMR数据:(CD3OD,500MHz)δ5.48(d,1H,J=2.8Hz),4.04(d,1H,J=2.7Hz),3.74(dd,J=8.3Hz,J=2.5Hz),3.56(t,1H,J=8.5Hz),3.43(dt,1H,J=7.6Hz,J=4.2Hz),1.25(s,3H),0.75(s,3H)。熔点:144-147℃。
(VI)、16α-溴雄甾-5-烯-3β-醇-11β-乙酰氧基-17-酮(VII)、(VIII)、雄甾-5-烯-3β,11β,16α-三乙酰氧基-17-酮(IX)、雄甾-5-烯-3β,11β,16α-三乙酰氧基-17β-醇(X)、雄甾-5-烯-3β,11β,16α,17β-四醇(XI)。
Figure BDA00002844272200911
II.将化合物I(4.0g,11.4mmol)溶解于100ml无水1,4-二氧杂环己烷。加入甲醇钠(3.0g,55.2mmol)并将混合物w在无水条件下回流3小时，通过HPLC监控。除去溶剂到1/3体积并将混合物用2N HCl酸化到pH=5~6。混合物用3×50ml DCM提取。将有机层合并并且用50ml饱和碳酸氢钠和50ml盐水洗涤。在用硫酸钠干燥并且蒸发溶剂之后，分离得到3.56g的95%纯的产物。
III.将化合物II(13.5g)和对甲苯磺酸(2.45g)在175ml无水乙酸酐中搅拌18小时。然后将混合物倾倒在800g冰中并且搅拌1小时。过滤通过短的硅胶短柱，得到3.14g的化合物III。
IV.将化合物III(100mg)溶解于1.55ml乙二醇中，随后加入原甲酸三乙酯(3.77ml)和对甲苯磺酸(50mg)。然后将混合物回流1.5小时，并且倾倒在6ml甲醇和0.08ml吡啶的热的混合物中。将混合物冷却并且加入15ml水。混合物用3×30ml乙酸乙酯提取并且用饱和碳酸氢钠(20ml)和盐水(20ml)洗涤。用硫酸钠干燥并且蒸发溶剂，得到50mg的97%纯的V。
V.在室温向50mg IV的2ml DMF溶液中加入溶解于0.5ml水中的27mg硼氢化钠。在剧烈搅拌下将溶液加热到100℃，维持15分钟，随后冷却到室温。将反应倾倒在18ml水中，随后加入0.2ml乙酸。混合物用乙酸乙酯(2×10ml)提取并且用饱和碳酸氢钠(10ml)和盐水(10ml)洗涤。用硫酸钠干燥并且蒸发溶剂，得到39mg的化合物V。
VI.将化合物V(50mg)和对甲苯磺酸(2mg)悬浮于2ml丙酮和0.21ml水的混合物中，回流1.5小时。在蒸发丙酮之后，加入10ml水，产物从溶液沉淀析出。过滤，得到42mg的95%纯的所需产物。
VII.将化合物VI(315mg)和CuBr2(611mg)加入到7ml无水甲醇并且回流24小时。然后将反应混合物沥冷却并且倾倒在15ml热水中并将粗产物滤出。然后将粗产物溶解于25ml甲醇/THF(1:1)中，加入200mg活性炭。将溶液煮沸10分钟并将活性炭滤掉。粗产物从甲醇重结晶，得到426mg的75%纯度的产物。
VIII.将化合物VII(420mg)溶解于18ml DMF和7ml水的混合物中。在搅拌下加入氢氧化钠水溶液(1N,1.31ml)。在10分钟之后，将溶液倾倒在包含1.5ml1M HCl的冰/水混合物中。敬爱那个溶液用NaCl饱和并且用2×5ml乙酸乙酯提取。在用硫酸钠干燥并且蒸发溶剂之后，粗产物通过柱色谱法纯化，得到300mg的95%纯的VIII。
IX.将化合物VIII(300mg)溶解于6ml吡啶中，随后加入0.34ml乙酰氯。将反应搅拌18小时，然后倾倒在30ml冰水中。将粗产物滤出，然后过柱纯化，得到180mg的纯产物。
X.将化合物IX(120mg)溶解于5ml甲醇并且在冰浴中冷却。在5分钟内加入硼氢化钠(11.5mg)并且除去冰浴。在1小时之后，反应用0.2ml乙酸猝灭并且加入15ml水。混合物用3×20ml乙酸乙酯提取并且用饱和碳酸氢钠(20ml)和盐水(20ml)洗涤。用硫酸钠干燥，随后进行柱色谱纯化，得到86mg的所需产物。
XI.将化合物X(180mg)溶解于5ml无水乙醚中并且冷却到-78℃。滴加甲基溴化镁(1.2ml,1M，在乙醚中)。使反应回温到室温，回流3小时。然后将反应冷却并用1M HCl中和。将沉淀的产物滤出并且从甲醇/水重结晶3次，得到36mg的纯的XI。熔点=220.3-221.6℃。选择的NMR位移：1H NMR(CD3OD):5.20ppm(bs,1H),4.26ppm(dd,J=3Hz,5Hz,1H),3.88ppm(m,1H),3.32ppm(m,1H),3.19ppm(d,J=8Hz,1H),1.24ppm(s,3H),0.92ppm(s,3H)。
雄甾-5-烯-3β,16α-二乙酰氧基-7,17-二酮(4)，雄甾-5-烯-3β,16α-二乙酰氧基-7β,17β-二醇(HE3467)。
2的合成。向冷却到-78℃的1(3.44g,10mmol)和TMS-Cl(2.15ml,16.5mmol)的THF(100ml)溶液中滴加2.0M LDA(7.5ml,15mmol)。将溶液搅拌30分钟并且回温到室温。将反应混合物在100ml 1:1己烷/乙醚和100ml水之间分配。有机层用盐水(3×30mL)洗涤并且用Na2SO4干燥。在除去溶剂之后得到黄色油状物。粗品通过硅胶色谱法纯化，用5-20%EtOAc/己烷洗脱，回收1.9g的1和2(600mg,1.54mmol)，为白色固体，收率31%。
3的合成。向冷却到0℃的2(100mg,0.26mmol)的THF(3ml)溶液中加入mCPBA(77%,62.2mg,0.27mmol)并且回温到室温。加入0.5NHCl(3ml)并且搅拌20分钟，用乙醚提取。提取液用饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，用Na2SO4干燥。在除去溶剂之后得到产物3(90mg，0.26mmol)，100%收率。
4的合成。向冷却到0℃的3(721mg,2.0mmol)的吡啶(10mL)溶液中滴加乙酰氯并且在0℃搅拌2小时。反应用水(300mL)猝灭并且搅拌15分钟。有固体形成，通过过滤将其收集。固体用水、1N HCl和水洗涤，并且真空干燥，得到灰白色固体4(737mg)，收率90%。
HE3467的合成。在15分钟内向冷却到-15℃的4(300mg,0.75mmol)在1:1MeOH/THF(15ml)中的溶液加入NaBH4(42.5mg,1.12mmol)。加入冷却到-15℃的氯化铈(300mg,0.81mmol)的甲醇溶液并且搅拌2分钟。反应用1N HCl猝灭，然后倾倒在90mL水中。有固体形成，通过过滤将其收集。固体用1N HCl和水洗涤，真空干燥，得到HE3467(183mg,0.45mmol)，收率60%。1HNMR(CD3OD):δ5.29(s,1H),4.89(m,1H),4.55(m,1H),3.74(d,1H,J=6.52),3.60(d,1H,J=4.76),2.36(d,2H,J=1.27),2.15-2.18(m,2H),2.05(s,3H),2.01(s,3H),1.9-1.1(m,11H),1.11(s,3H),0.82(s,3H)。
5α-雄甾烷-2β,3α,16α,17β-四醇(22)。
Figure BDA00002844272200951
步骤1:在0℃向13(50.0g,0.172mol)的吡啶(150mL)溶液中加入对甲苯磺酰氯(47.0g,0.24mol)。将反应混合物在0℃搅拌2小时，然后室温搅拌过夜。加入水。通过过滤收集得到的沉淀并用水洗涤。粗产物通过从甲醇重结晶进行纯化，得到14(75.2g)，为白色固体。
步骤2:将化合物14(75g,0.169mol)在2,4,6-三甲基吡啶(200mL)中的混合物回流5小时。在冷却之后，加入水(500mL)，将得到的沉淀通过过滤收集并用水洗涤。固体在甲醇中重结晶，得到粗产物(42.5g)。将粗产物(20.0g)溶解于氯仿(113mL)和乙酸酐中(37mL)。在0℃向这个溶液中加入浓硫酸(3mL)的氯仿(37mL)溶液和13mL乙酸酐。将反应混合物在0℃搅拌0.5小时，然后加入700mL水并且室温搅拌6小时。将得到的沉淀通过过滤收集并且用水洗涤，真空干燥，得到15(17.2g)，为白色固体。
步骤3:将15(8.17g,0.030mol)和溴化铜(510.8g,0.046mol)在无水甲醇(220mL)中的混合物回流18小时。在冷却之后，在真空下除去大部分溶剂并且加入水(150mL)。通过过滤收集产生的沉淀，并且用水洗涤。使固体在甲醇中重结晶，得到16，为白色固体(6.76g)。
步骤4:向搅拌的16(6.69g,0.019mol)的N,N-二甲基甲酰胺(180mL)溶液加入1N氢氧化钠水溶液(22mL,0.022mol)。将反应混合物在室温搅拌0.5小时。加入1N盐酸(3ml)和100ml水。得到的溶液用乙酸乙酯提取(3×250mL)。将合并的提取物用硫酸镁干燥，过滤和真空浓缩，得到17(4.37g)，为蜡状固体。
步骤5:在0℃向17(3.74g,0.013mol)的吡啶(20mL)溶液中加入乙酰氯(2.18,0.028mol)。将反应混合物在0℃搅拌1小时。使得到的混合物回温到室温并且搅拌另外的1小时。加入水。通过过滤收集沉淀，并用水洗涤。将固体真空干燥，得到18(4.25g)，为白色固体。
步骤6:在0℃向18(2.4g,0.0072mol)的甲醇(80mL)溶液中加入硼氢化钠(1.2g,0.031mol)。将反应混合物在0℃搅拌1小时。通过加入乙酸(6mL)和水(15mL)将反应猝灭。在减压下除去大部分甲醇。残余的浆状物在乙酸乙酯(80mL)和水(20mL)之间分配。有机层用1N盐酸洗涤，用饱和碳酸氢钠水溶液中和，然后用硫酸镁干燥，过滤并且蒸发，得到粗产物19(1.92g)，为白色固体。
步骤7:在0℃向19(1.9g,0.0057mol)的吡啶(20mL)溶液中加入乙酰氯(1mL,0.014mol)。将反应混合物在0℃搅拌1小时。将得到的混合物回温到室温并且搅拌另外的1小时，然后在真空下除去大部分溶剂。将残余的浆状物在乙酸乙酯(80mL)和水(20mL)之间分配。有机层用1N盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用硫酸镁干燥，过滤并且蒸发，得到粗产物。粗产物通过硅胶上的快速色谱法纯化，并用1:10乙酸乙酯:己烷洗脱，得到20(1.4g)，为白色固体。
步骤8:向20(980mg,2.61mmol)的氯仿(25mL)溶液中加入间氯过氧苯甲酸(3.6mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。有机层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，用水洗涤，然后用硫酸镁干燥，过滤并且蒸发，得到粗产物。粗产物通过硅胶上的快速色谱法纯化，用1:10乙酸乙酯:己烷洗脱，得到21(780mg)，为白色蜡状固体。
步骤9:将21(625mg,1.61mmol)的乙酸(8mL)溶液回流5小时。在冷却之后，在真空下除去溶剂，得到油状物，将其进一步在真空干燥过夜。将得到的蜡状固体溶解于2N氢氧化钠水溶液(8mL)和甲醇(15mL)中并将反应回流1小时。在真空下除去甲醇并且加入水。通过过滤收集产生的沉淀，并且用水和热的丙酮洗涤。将收集的固体真空干燥，得到雄甾烷-2β,3α,16α,17β-四醇或22(295mg)，为白色固体。选择的1H NMR数据:(CD3OD,500MHz)δ3.98(d,1H,J=4.8Hz),3.79(br,1H),3.74(br,1H),3.35(d,1H,3.6Hz),0.99(s,3H),0.77(s,3H)。mp:260-263℃。
显而易见，上述化合物可用于制备其它的式1化合物，例如，这些化合物的其它酯或醚。用于制备标题化合物的中间体也可以用于本文所述的方法中。
实施例23。实质上如上述实施例6中所述在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中评价式1化合物治疗多发性硬化(MS)的能力。实施EAE动物模型的规程描述在(D.Auci等人，Ann.NY.Acad.Sci.USA,1051:730-42,2005)中。将得自Charles-River的雌性SJL小鼠(6-8周龄，平均体重25g)保持在标准实验室条件下(不含非特异性病原体细菌)，自由接触食物和水，并且在开始研究之前允许适应环境一周。将动物随机分为每组七只动物的六个组，并且如下处理：(1)小鼠用媒介物处理，(2)小鼠用SU5416(Z-3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚酮)处理，(3)小鼠用17β-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17α-三醇处理，(4)小鼠用雄甾-5-烯-3α,7β,16α,17β-四醇处理，(5)小鼠用雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇处理，(6)小鼠用3α-三氟甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇处理，(7)小鼠用17α-三氟甲基-雄甾-5-烯-3β,17β-二醇处理和(8)小鼠用5α-雄甾烷-3β,17β-二醇-16-肟处理。用200μL的1:1乳剂(75μg蛋白脂质蛋白(PLP)和在完全弗氏佐剂(CFA)中的6mg/mL结核分枝杆菌H37RA)诱导EAA。将200μL注射剂在引流到副淋巴结和腹股沟淋巴结中的四个位置之间分配。将百日咳毒素用作辅佐剂并且在第零天和免疫后的第二天以200ng/小鼠i.p.给予。在疾病的临床发病时开始将各个组用含0.1mg化合物的100μL媒介物处理，或者用单独的媒介物处理，q.d.po(口服强饲法)，并且继续直到免疫后的30天。临床发病定义为在25%小鼠中疾病的临床症状达到2-3级的时间。临床分级通过没意识到治疗的观察者进行：0=没有疾病，1=尾巴软垂，2=中度的下肢轻瘫，3=重度的下肢轻瘫，4=垂死状态，5=死亡。通过对不成对数据的ANOVA和非参数的Mann-Whitney检验进行对临床评分的显著差异的统计分析。<0.05的P值被认为是统计显著。对于统计分析，死于EAE的小鼠只在死亡当天赋值为5，然后从实验组中删除。
不出所料，在免疫后的第19天内，媒介物处理组的小鼠中8/8(100%)都发展出标准的EAE征兆。发病的平均天数为15.5±3.9(SD)。在这个动物组中，疾病的持续时间是12.3±4.3天。从第1天到第30天的平均累积评分为24.8±7.8，从(处理后)第31天到第54天的平均累积评分为22.7±15.8。在用SU5416、雄甾-5-烯-3α,7β,16α,17β-四醇和5α-雄甾烷-3β,17β-二醇-16-肟处理的动物中观察到与在媒介物处理组的小鼠中观察到的非常相似的EAE进程，如此处理的小鼠表现出可与对照相比的累积发病率、疾病持续时间和平均累积发病。相比之下，用雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇、3α-三氟甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇或17α-三氟甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇处理的小鼠表现出与媒介物处理组小鼠相比得到显著改善的EAE进程，引起平均累积评分和持续时间中的一种或多种都显著降低。并且在进一步对比中这些化合物中没有一种显著影响EAE的累积发生率或致死率。最后尽管17β-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17α-三醇只表现出相对于媒介物处理组小鼠的累积EAE发作和持续时间降低的倾向，但是这种作用似乎是生物学重要的(14.9±17.6和7±7.9对24.8±7.8和12.3±4.3)。这个化合物没有统计显著性可能是由于在整个观察期大量小鼠被赋予0的评分，因此引起高的标准偏差。
在第30天处理结束时，监控小鼠直到另外的24天。有可能观察到媒介物处理组小鼠中疾病变为慢性病，其累积评分可与处理过程中的累积评分相比较。与处理时间相比，在SU5416组中观察到在跟进时间过程中累积评分的显著增长，从25.5±8.9的平均累积评分增加到35.5±13.2，而17β-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17α-三醇的增长则更小，为从14.9±17.6增长到18.4±20.6。在用17β-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17α-三醇处理的小鼠中，还有可能观察到EAE发病率从处理时间结束时的57.1%增加到跟进时间结束时的85.7%。另一方面，其它化合物似乎是在跟进时间中保持了与处理时间中相似的累积评分。这对于3α-三氟甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇来说是特别显著的，其在处理时间过程中11.2±4.8的平均累积评分增加到跟进时间结束时的10.8±10.3。
这些结果表明，17β-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17α-三醇、雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇、3α-三氟甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇和17α-三氟甲基-雄甾-5-烯-3β,17β-二醇在SJL小鼠中的PLP诱导的EAE模型中发挥了强大的抗炎性能。对于将这些发现转化为临床情况特别相关的是如下的观察结果，即，即使在免疫后的第12天开始的规程中在24%的小鼠已经发展出EAE临床征兆时给予，化合物在这种EAE模型中仍是有活性的。特别指出的是，发现SU5416在这种情况中是无效的。先前已经有报道说SU5416在EAE中是有效的(L.Bouerat等人，J.Med.Chem.48:5412-5414,2005)。然而，为了得到这样的结果，SU5416化合物是在动物接受免疫的同时给予的。相比之下，在这个规程中，直到级别症状明显之后才对动物给予化合物例如17β-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17α-三醇，这表明化合物可用于有效地治疗已有的疾病和用于预防或延迟疾病发病。
实施例25。电离辐射暴露的治疗。将选择的F1C对经过致死性辐射的雌性B6D2F1小鼠的作用与用单独的媒介物处理的对照动物相比较。使用137Cs来源以2.5Gy/分钟剂量使动物暴露于10Gy的全身照射。使用每组12只动物的总共5组。对于第1、2、3和5组，试验物品作为100μL体积通过皮下注射给予，进行三个连续日，第一剂量在暴露于辐射之后的2到4小时给予。对于第4组，试验物品作为50μL体积通过肌肉注射给予三个连续日。制剂是包含0.1%w/v羧甲基-纤维素、0.9%w/v氯化钠和0.05%v/v苯酚的悬浮液。在注射之前搅拌制剂以使F1C均匀地再悬浮，并且在抽入注射器之后的几分钟内注射到动物中，以防止在注射器中沉降。
对动物组进行如下处理。第1组只接受媒介物，每天皮下注射，持续3个连续日。第2组通过每天皮下注射接受在100μL悬浮液中的0.6mg的3β,17β-二羟基雄甾-5-烯，持续3个连续日。第3组通过每天皮下注射接受在100μL悬浮液中的3.0mg的3β,17β-二羟基雄甾-5-烯，持续3个连续日。第4组通过每天皮下注射接受在50μL悬浮液中的0.6mg的3β,17β-二羟基雄甾-5-烯，持续3个连续日。第5组通过每天皮下注射接受在100μL悬浮液中的0.6mg的3β-羟基-17β-氨基雄甾-5-烯，持续3个连续日。在照射之后对动物进行存活监控，进行21天，得到以下结果。显示了第6、7、12和21天的存活动物数。
Figure BDA00002844272201011
实施例25。胃肠炎症的治疗。使用炎性肠病的动物模型证明式1化合物限制或抑制炎症或炎症症状的能力。每组使用3只雄性Wistar大鼠(180±20克)，在禁食24小时之后用2,4-二硝基苯磺酸(DNBS)或盐水攻击。通过结肠内滴注0.5mL的DNBS乙醇溶液(在0.5mL的含30%乙醇的盐水溶液中的30mg)诱导远端的结肠炎，之后通过套管注入2mL空气以保证溶液保留在结肠中。使用的体积是每次注射液体制剂形式的0.1mL的2和20mg/mL的化合物，例如，雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇，将其每天皮下注射给予，持续6天(0.2mg/动物/天或2.0mg/动物/天)。制剂为在无水悬浮液(例如，2%的苄醇w/v，0.1%Brij 96w/v和等体积的PEG300和丙二醇)中包含100mg/mL的化合物。通过用不含化合物的媒介物稀释20mg/mL制剂得到2mg/mL和20mg/mL的浓度。
第一剂量在DNBS攻击之后的30分钟给予。每天一次口服(PO)给予柳氮磺吡啶(30mg/mL，在含2%土温80的蒸馏水中)(10mL/kg/天)，持续7天，前两个剂量在DNBS攻击之前的24小时和2小时开始。通过检查肛门区域每天记录腹泻的出现。将动物禁食24小时，然后处死。在第7天或第8天将动物处死，并且取出它们的结肠和称重。在取出结肠之前，记录结肠和其它器官之间的粘连迹象。此外，在将每个结肠称重之后记录溃疡的存在。将结肠对体重(BW)比例的“净”改变相对于盐水攻击的基线组归一化。“净”的结肠对体重比例的25-30%减小被认为是显著的。结果表明，雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇对于疾病的进程有有限的影响(净的结肠对体重比例有约15-20%的降低)，而用17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇或雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇进行处理是有效的(净的结肠对体重比例有约25-35%的降低)。
这个规程的变体包括使用上述的剂量水平和/或0.05mg/动物/天、0.1mg/动物/天、0.5mg/动物/天和1.0mg/动物/天中的一个或多个的剂量水平给予在含30%磺基丁基醚-环糊精的水中的化合物。
实施例26。与外伤有关的神经元损失和骨质疏松症或骨损失状况的治疗。免疫能力是一种复杂的功能，其可以在外伤诱导的内源性糖皮质激素(GC)水平升高之后受到剧烈的削弱。使用化合物5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇通过发挥营养或同化代谢活性来保持这些免疫功能。在沙鼠的两侧颈动脉闭塞之后发生的急性脑缺血卒中的动物模型中，与单独的的卒中相比用5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇治疗显著地改善认识能力(p=0.03)。因此，对于空白组，测量的每组中的觅食潜伏期为6.9±0.9秒(sec)，单独的卒中组为46.9±13.6sec，用5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇治疗的卒中组为14.8±4.8sec。附随地，卒中诱导的CA1海马神经元计数损失显著地被5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇中止(abrogated)(空白=362,247±6,839；卒中=152,354±11,575；和卒中+5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇=207,854±47,334)。
在骨损失状况中，5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇影响主要的骨结构，即，致密层和海绵层和生长面。在用5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇处理的热伤害的小鼠(20%的总体表面积)中，致密骨(股骨)和海绵骨/网状骨质(胫节)骨质量的损失，以及近侧的胫骨松果体生长面中的软骨细胞增殖的抑制都通过5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇处理得到显著的预防(p<0.01)。股骨皮层骨的组织形态测定术显示骨形成速率有所增加。我们观察到了对骨矿物含量损失的部分预防作用，如通过双重X射线吸收光度法测量的。股骨灰重量显著地大于(p<0.01)媒介物处理的灼伤小鼠，表明5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇保持了骨的矿物含量。脑中长期的高GC水平的促炎症性作用提示升高的GC水平使神经病学损害的后果恶化。已经证明作为5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇的上游代谢前体的肾上腺类固醇DHEA(5-雄甾烯-3β-羟基-17-酮)预防地塞米松诱导的小鼠的胸腺退化(K.L.Blauer等人.,Endocrinology,129:3174,1991)。合起来看，这些发现表明，5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇抑制了GC诱导的功能性神经组织损失并且在热损伤之后保存骨结构。
在人MG-63骨肉瘤细胞系中证明包括5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇、17α-乙炔基-5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇和4-己雌酚-3α,17β-二醇的化合物反转糖皮质激素在骨生长中的副作用的能力。MG-63细胞是成骨细胞，是介导骨生长的细胞。这些细胞系已经广泛地用于研究骨生物学和用于表征化合物治疗骨损失状况的生物活性(例如，B.D.Boyan等人，J.Biol.Chem.,264(20):11879-11886,1989；L.C.Hofbauer等人，Endocrinology,140(10):4382-4389,1999)。与糖皮质激素水平升高有关的不利的毒性包括：包括MG-63细胞系在内的成骨细胞产生的IL-6和IL-8减少和11β-羟基类固醇脱氢酶1型酶(11P-HSD)的表达增加。11β-羟基类固醇脱氢酶1型酶增加通过使内源的可的松转化为抑制骨生长的活性的氢化可的松而导致内源糖皮质激素活性的水平增加。11β-HSD酶在肝脏、脂肪组织、脑和骨组织中表达。11β-HSD-1产生的氢化可的松有助于骨质疏松症、胰岛素耐受、2型糖尿病、异常脂血症、肥胖症、中枢神经系统异常例如卒中、神经元死亡、抑郁症和帕金森病。IL-6、IL-8和骨保护素的减少涉及由成骨细胞引起的骨生长减少。初步研究表明，地塞米松抑制MG-63细胞产生IL-6的IC50是10nM，地塞米松抑制MG-63细胞生长的IC50为15.3nM。
在这个规程中，使MG-63细胞在有或者没有30nM浓度的合成糖皮质激素地塞米松的存在下和在有或没有10nM的式1化合物的存在下生长。下表中的化合物1是5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇，化合物2是17α-乙炔基-5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇，和化合物3是4-己雌酚-3α,17β-二醇。这些化合物的结果显示如下。
Figure BDA00002844272201041
这些结果表明，10nM的化合物部分地反转30nM的地塞米松的副作用，这表明，化合物可以反转与成骨细胞中糖皮质激素水平升高有关的多重毒性，所述成骨细胞是介导骨生长的细胞。在相关的规程中，1nM的化合物17α-乙炔基-5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇还在细胞在30nM地塞米松的存在下生长7小时之后使MG-63细胞的骨保护素合成减少得到完全反转。骨保护素是与骨生长相关的因子，骨保护素合成减少与骨损失有关。使在30nM地塞米松的存在下减少MG-63细胞的骨保护素合成得到完全或部分反转的其它化合物是17α-三氟甲基-5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇(在1μM化合物的存在下的正常或基线骨保护素水平，与不含化合物或地塞米松的媒介物对照相比)、5-雄甾烯-3β,7β,16α,17β-三醇(在1μM为正常骨保护素水平)、3β,7α,16α,17β-四羟基雄甾-5-烯(在10nM为接近正常骨保护素水平)、3α,7β,16α,17β-四羟基雄甾-5-烯(在10nM为正常骨保护素水平)、17α-甲基雄甾-5-烯-3β,17β-二醇-7-酮(在100nM增加骨保护素水平)、17α-甲基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-二醇(在10nM为正常骨保护素水平)。使在30nM地塞米松的存在下的骨保护素减少得到部分反转的其它化合物包括雄甾-5-烯-3β,17β-二醇-7-肟。
在相似的规程中，化合物3α,17β-二羟基雄甾-4-烯表现出对地塞米松-诱导的对由MG-63细胞产生IL-8和IL-6的抑制和地塞米松诱导的11β-HSD mRNA减少的统计上显著的反转。
为了证明可以在体内得到相应的效果，将化合物17α-乙炔基-5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇给予持续23天每天用地塞米松处理以降低动物中骨保护素水平的小鼠。用媒介物和10μg地塞米松处理的小鼠(阳性对照组)中的骨保护素水平为3.3pmol/L骨保护素，而用媒介物、地塞米松和4mg/kg/天的17α-乙炔基-5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇处理的动物具有6.4pmol/L骨保护素(p<0.05)。
考查了与雌激素缺乏有关的鼠科动物脊椎骨中成骨细胞和骨细胞的细胞程序死亡程度。将Swiss Webster小鼠(四个月大)切除卵巢。二十八天之后，将动物处死，分离椎骨，固定并且包埋，然后在异丁烯酸盐中进行非脱钙处理(undecalcified)。通过采用CuSO4增强的TUNEL方法测定成骨细胞和骨细胞细胞程序死亡的发病率，发现在没有雌激素之后有所增加。发现用参考化合物例如17β-雌二醇和用F1C例如4-己雌酚-3α,17β-二醇和或17α-乙炔基-5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇处理减少细胞程序死亡，这与骨损失减少一致。
总起来说，在这个实施例中描述的结果证明，化合物例如17α-乙炔基-5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇通过增加骨生长和抑制骨损失二者来影响骨组织。化合物例如17α-乙炔基-5-雄甾烯-3β,7β,17β-三醇和5-雄甾烯-3β,7β,16α,17β-四醇不与雄激素受体、雌激素受体-α、或雌激素受体-β相互作用，这与它们治疗骨损失状况而不发挥不期望的性激素活性的能力是一致的。
实施例27。使用小鼠耳组织的热损伤模型表征化合物治疗与热外伤有关的炎症的能力。所述状况是最小的灼伤损伤，其在暴露的未经处理的小鼠耳中在灼伤后24-72小时进展为组织坏死。对多组约九周龄的Balb/c小鼠赋予识别标记，然后分为对照小组和治疗小组。记录要被浸入热水中的耳的厚度，然后麻醉小鼠的整个耳在52℃水中浸蘸24秒。在注射丙二醇媒介物(对照)或含100mg化合物的丙二醇之后，将每只小鼠送回笼中。在灼伤之前和在热损伤之后的多个时间对每只小鼠监控耳肿胀改变。在损伤之前和在热损伤之后的1、3、6、9、12、18、24和48小时对每只小鼠监控耳肿胀改变。将动物用溶解于丙二醇中的100mg脱氢表雄酮(DHEA)处理。在对照和DHEA处理的小鼠中对水肿形成和消退的分析显示，在DHEA处理的和未经处理的灼伤小鼠中在损伤之后的六小时发生作为水肿度量的最大耳肿胀。
在未经处理的对照组中，肿胀的程度在12小时内开始下降，并且在随后的12小时时间内继续迅速下降。在灼伤后的24和48小时，耳组织表现出淤滞的原发区域的微管闭塞。化合物雄甾-5-烯-3β,17β-二醇和16α-溴脱氢表雄酮保护接受治疗的动物免于发生耳的热损伤所致的许多缺血性后果。化合物16α-羟基脱氢表雄酮的保护性较差即，其降低了进行性缺血的程度，但是没有完全地预防进行性缺血，而16α-氯脱氢表雄酮只是对进行性缺血有些微的保护性。
在另一个规程中考查了化合物对失血性休克和缺血的影响。使用甲氧基氟烷将6-8月龄的CF-1小鼠麻醉，并且准备腹部外科手术。对每只小鼠测量呼吸的水平、眨眼应答和对皮夹痛的应答，以便确保麻醉的水平适合于外科手术。腹部外科手术的持续时间是大约两个小时，这期间，在30分钟时间段内除去35-40%的动物血液体积。以受控的方式除去血液模拟了失血性休克的效果。将移除的血液和2X体积的复苏流体(乳酸盐林格氏溶液)缓慢静脉内输注到中央静脉中。复苏流体补充有2mg的脱氢表雄酮-3β-硫酸酯或作为安慰剂的赋形剂。分别将腹膜和上层的皮肤缝合。将动物保持在38℃-39℃，直到完全复苏。在这些条件下，安慰剂处理组的动物中的大多数在24-48小时内死亡。在外科手术之后的四小时，进行细菌的菌落形成单位(CFU)试验并且使用常规计数测定肝脏中的丙二醛。将肠系膜淋巴结(MLN)取出并且在血液琼脂板上培养，在培养之后将CFU数计数。将肝脏取出并且测量丙二醛的量。用脱氢表雄酮-3β-硫酸酯处理引起15/15小鼠存活，而媒介物对照动物有1/15的存活。
在出血性外伤的大鼠模型中考查了治疗效果。使二十四只大鼠发生40%血液总量损失，包括导管插入和剖腹手术(软组织损伤)来模拟外伤和出血。在出血开始一小时之后，用结晶状流体和浓集的红细胞(PRBC)使动物复苏。十二只动物在开始出血之后的一小时，但是在流体复苏之前以100μL/kg体重接受一个浓度为40mg/kg体重的含雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇的甲基纤维素悬浮液的皮下注射。十二只动物接受100μL/kg体重的皮下甲基纤维素对照注射。在诱导出血三天之后，接受雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇的十二只动物的存活率为100%；而未经处理的组中死亡率为25%(P<0.04，使用两个二项式比例之差的优效性Barnard非条件检验)。
还实施了血压降低的出血性外伤规程作为第二个出血性外伤的模型。在这个规程中，如上所述使15只大鼠出血到约35-40mmHg的平均动脉压，并且在出血开始一个小时时用晶质和PRBC复苏。七只动物在开始出血之后的一小时，但是在流体复苏之前以100μL/kg体重接受一个浓度为40mg/kg体重的含雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇的甲基纤维素悬浮液的皮下注射。八只动物接受100μL/kg体重的皮下甲基纤维素对照注射。在诱导出血之后的两天，未经处理的组(n=8)中的死亡率是75%。雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇-处理的动物的死亡率是43%，证明该化合物在血压降低的出血性外伤的情况中具有保护性。
实施例28。代谢稳定性。根据以下规程使用得自肝脏组织的微粒体体外考查所选择的化合物的代谢稳定性。这个规程中的微粒体能够进行羟基化反应和使类固醇分子上的羟基和酮互变的氧化还原反应。微粒体不介导结合反应，例如，3β-羟基的硫酸酯化或3α-羟基的葡糖醛酸化。
所述规程如下进行。(1)制备含0.5mM化合物的乙腈/水35:65。对于雄甾-5-烯-3β,17β-二醇，制备0.145mg/mL或29.0μL的1mg/mL原液加上171μL溶剂。对于标准曲线，使用0.5mM原液的稀释物获得10μM、5μM、1μM的雄甾-5-烯-3β,17β-二酚的最终浓度。(2)如下建立样品。每个测定包括雄甾-5-烯-3β,17β-二醇对照和1-8个未知化合物。对于每个化合物的管如下：1-0'2-0'3-0'4-0'*5-0'*6-5μM7-1μM8-30'9-30'10-30'，其中*表示变性的微粒体阴性对照反应管。对于另外的化合物，编号从11、21、31等开始。(3)向每个管加入315μL PBS(pH7.3-7.5)。向每个管加入10μL的适合的测试物溶液。(4)内标准/乙腈溶液。(5)NADPH再生系统(NRS)为每个管125μL。向PBS加入1.7mg/mlNADP、7.8mg/ml的6-磷酸葡萄糖、6单位/mL的6-磷酸葡萄糖脱氢酶。用于每个实验的新鲜的NRS在使用之前保持在冰上。(6)每个反应在每个管中使用125μL的NRS。(7)从-80℃冷冻器中取出肝微体制备物，并且在室温水浴中解冻。微粒体制备物的浓度为20mg/ml。每个反应使用0.25mg/管，并且在PBS中稀释到5mg/ml的浓度(即，4倍稀释)并且保持在冰上。(8)对于零时间和变性的微粒体控制管，在-20℃加入500μL乙腈。零时间管转移到冰上并且变性的微粒体对照在37℃预先孵育5分钟。(9)包含微粒体制备物的试验管也在37℃预先孵育5分钟。(10)对于每个孵育管，通过加入50μL的微粒体制备物并且涡流混合来启动反应。(11)通过在-20℃加入500μL乙腈并且涡流来结束每个反应。(12)在反应结束之后，将得自每个反应管的100μL转移到新鲜的管中并且向每个管加入200μL水和1400μL的甲基-叔丁基醚。使管涡流并且在microfuge上在13,000rpm离心10分钟。然后将管置于干冰-甲醇浴上，直到水层变为冷冻的固体。(13)将每个管中的甲基-叔丁基醚转移到新鲜的管中并且在氮气下蒸发溶剂，然后将沉淀物再悬浮在100μL乙腈/水35:65中并且通过LCMS分析。结果表示在以下表中，孵育时间如下所示。
Figure BDA00002844272201091
*大鼠微粒体代替小鼠制备物
结果表明，四醇化合物对氧化还原反应有耐受性，这和与雄甾-5-烯-3β,17β-二醇参考化合物相比代谢程度大大降低是一致的。这个观察结果是相当出乎意料的，因为四个羟基中的每一个都有可能转化为酮，但是实际上没有一个受到影响。考查的其它化合物包括雄甾-5-烯-3β,16α,17β-三醇、雄甾烷-3β,16α-二醇-17-酮和雄甾烷-3α,16α,17α-三醇，其全部都以与雄甾-5-烯-3β,17β-二醇参考化合物相似的速率由微粒体代谢。
实施例29。测量CaCo-2细胞的药物吸收。这个规程用于度量化合物通过CaCo-2细胞单层的流入。CaCo-2细胞是表现出肠内吸收细胞表现型的、极化的、高度分化的细胞系的人类细胞(J.Hunter等人，J.Biol.Chem.,268(20):14991-14997,1993)。这个细胞系用于研究各种化合物通过细胞单层的速率。典型地，使用Caco-2细胞的汇合的单层来模仿肠内上皮和用于得到试验化合物稳态通量的渗透系数。这可以提供关于化合物口服生物可利用的可能性的信息。
在这个规程中，将细胞保持在37℃的培养基中，使用在50ml的无菌管中的每孔100μL的温热培养基。使细胞与每孔600μL的分化培养基在24孔无菌板上生长。每个孔包含跨孔插入物(transwell insert)以允许孔有两个隔室。将100μL的分化培养基小心地加入到每个孔中，使移液管端部接触孔侧壁。将细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度培养48小时，以形成单层。对于每个板，将管编号为第1-24号管，底侧缓冲液作为底侧零时间点(T0)。26到49号管为包含试验物的上侧缓冲液，作为上侧T0。51-74号管是T20时间点(20分钟)，76-99号管是T40时间点，76-99号管是T40时间点，101-124号管是T80时间点，126-149号管是T120时间点和151-174号管是用于物质平衡测定的T120上侧样品。175-179号管是化合物1的5点标准曲线，180-184号管是化合物2的5点标准曲线，依此类推，230-234号管是化合物12的5点标准曲线。将1-49号管置于搁物架1中的4行，号管置于搁物架2中，101-149号管置于搁物架3中，151-174号管置于搁物架4中，和175-234号管置于搁物架5和6中。
如下制备缓冲液：从新鲜的1000mL瓶中取出150mL的转移缓冲液(用1N HCl调节到pH7.4)。这个缓冲液就是‘底侧缓冲液’。剩余的850mL用1N HCl调节到6.5，作为‘上侧缓冲液’。将150mL的上侧缓冲液置于单独的容器中，并将剩余的700mL用于漂洗。将缓冲液储存在4℃，但是对于所述规程是在室温下使用。
在分化培养基达到室温之后，将约20mL倾倒在小的烧杯中。使探针在这个培养基中平衡15分钟。将24孔板从保温箱取出并且使其回到室温。如下用探针对每个孔进行测量：将探针插入到孔中而不接触细胞单层；在探针接近培养基表面时按下TEST按钮并且在探针接触表面时读数从0000变为一个数字；>1000Ω的读数是可以接受的。然后将上侧缓冲液从跨孔插入物倾析掉并且将整个板在包含漂洗缓冲液1000mL烧杯中漂洗，以除去全部分化缓冲液。然后将跨孔插入物置于T20板中。通过向10mL的上侧缓冲液加入0.1μmol(例如，29μl的1mg/ml雄甾-5-烯-3β,17β-二醇参考溶液)将10μM的试验化合物和对照(卡马西平MW 236；氢氯噻嗪MW 351)加入到上侧缓冲液中。然后向所有的孔加入0.6mL的底侧缓冲液。
通过将150μL的化合物(1mg/mL，在乙醇中)加入到10mL乙腈/水(25:75)中制备作为内标准的50μg/ml3α,7β,16α,17β-四羟基雄甾-5-烯溶液。在底侧缓冲液中形成每种化合物的标准曲线。由于10μM的上侧缓冲液在加入底侧隔室时被稀释六倍，因此在更低六倍的浓度下形成标准曲线。
对于T0对照，将600μl的底侧缓冲液置于1-24号管中。将100μl的上侧缓冲液加上试验物加上500μl的上侧缓冲液(使得浓度在标准曲线范围内)加入到26-49号管中作为上侧T0。将100的上侧缓冲液加上化合物置于上侧。将跨孔插入物置于板中的时间作为时间零点(T0)。在T=20，将跨孔插入物转移到T40板中并且将T20板的600μL样品加入到适合的管中。在T=40，将跨孔插入物转移到T80板中并且从T40板取得600μl的样品到适合的管中。在T=80，将跨孔插入物转移到T120板中。从将600μl样品从T80板移液到适合的管中，对于剩余的时间点依此类推。将100μl的上侧缓冲液加入到适合的管中用于物质平衡。立即对样品进行提取，并且立即置于冷冻器中。
除了151-174号管(其只含100μL)之外，将300μL的每种样品从试验管中转移到标记的2ml管中；将这些样品的50μL转移并且加入到250μL的底侧缓冲液(产生6倍的稀释物)中。将20μL的3α,7β,16α,17β-四羟基雄甾-5-烯内标准加入每个管中并将向每个管中加入1500μL的甲基叔丁基醚。使管涡流，在microfuge中离心10分钟，并且置于甲醇/干冰浴中，直到冷冻。将新鲜的管标记并且将甲基叔丁基醚从每个冷冻管倾析掉新鲜的管中。然后在氮气下将甲基叔丁基醚蒸发并且在120μL乙腈/水(35:65)中重构并且通过LCMS分析。在以下表中，化合物1为3β,7β,16α,17β-四羟基雄甾-5-烯、化合物2为17α-乙炔基雄甾-5-3β,7β,17β-三醇、化合物3为3α,17β-二羟基-17α-乙炔基雄甾烷、化合物4为3α,7β,16α,17β-四羟基雄甾-5-烯、化合物5为2β,3α,16α,17β-四羟基雄甾烷、化合物6为3β,16α-二乙酰氧基-7β,17β-二羟基雄甾-5-烯、化合物7为3β-乙酰氧基-17α-乙炔基雄甾-5-7β,17β-二醇、化合物8为3β-乙酰氧基雄甾-5-7β,16α,17β-三醇和化合物9为17α-乙炔基雄甾-5-3α,7β,17β-三醇。
Figure BDA00002844272201121
使用CaCo-2细胞系的研究表明，四醇化合物例如雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇不具有高的渗透性，因此估计是口服不能被生物利用。尽管如此，如上所述在糖尿病治疗模型中将化合物雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇口服给予小鼠时仍具有活性。其它规程表明，四醇化合物例如3β,7β,16α,17β-四羟基雄甾-5-烯和3α,7β,16α,17β-四羟基雄甾-5-烯的硫酸酯化程度和葡糖醛酸化程度比二醇类化合物低。这种活性至少部分地来自于四醇化合物在体内的低的代谢。

Claims (15)

1.用于治疗炎症状况、关节炎、外伤、2型糖尿病、高血糖症、1型糖尿病、胰岛素耐受、骨损失病况或癌症的组合物，其中该组合物包含一定量的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇的口服制剂，所述量足以维持约1ng/mL到约250ng/mL的血清水平历时至少约30分钟到约8小时。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物是包含约5mg到约80mg的17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇的单位剂型。
3.鉴定具有用于治疗或改善哺乳动物的代谢病症的潜力的化合物的方法，该方法包括：
(i)在体外使试验化合物与人或哺乳动物细胞接触，并测量PPAR-α、PPAR-γ或PPAR-δ的活性；
(ii)在体外使试验化合物与人或哺乳动物细胞接触，并测量NF-κB的转录活性或水平；
(iii)对人或另外的哺乳动物给药试验化合物，并测量下列中的一种或多种：(a)高血糖症，(b)高血糖症的进展，(c)高血糖症的发病，(d)黄斑变性的进展，(e)黄斑变性的发病，(f)血管溃疡的出现或发生，(g)血管溃疡的严重程度，(h)胰岛素敏感性，(i)葡萄糖不耐受，(j)胰腺β-小岛细胞数量或它们分泌胰岛素的能力丧失的进展或速率(k)胰腺β-小岛细胞数量或它们分泌胰岛素的能力，(l)在db/db小鼠或患有饮食诱导的肥胖症的小鼠中体重增加的速率，(m)甘油三酯水平，(n)总的血液或血清胆固醇水平，(o)血液或血清中LDL、VLDL、apoB-100或apoB-48的水平，(p)血液或血清中HDL或apoA1的水平(q)血液或血清中相反应蛋白的水平，任选C反应蛋白或纤维蛋白原(r)血红素A1C的水平，(s)空腹血糖水平，(t)在口服葡萄糖耐量试验中的血清或血液葡萄糖，(u)在膳食葡萄糖检验后2小时内的血清或血液葡萄糖，(v)整体或组织葡萄糖消除或摄取；以及
(iv)并选择步骤(i)、(ii)和(iii)中的试验化合物，使得
(1)在体外与适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，不使体外人或哺乳动物细胞中的PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-δ中的一种、两种或三种活化超过约30%；以及
(2)与体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外使人或哺乳动物细胞中的NF-κB的转录活性或水平抑制或减少约20-80%；以及
(3)与适当的阴性对照或正常对照相比，(a)减轻高血糖症，(b)延缓高血糖症的进展，(c)延迟高血糖症的发病，(d)降低黄斑变性的速率，(e)延迟黄斑变性的发病，(f)降低血管溃疡的出现或发生，(g)降低血管溃疡的严重程度，(h)增加胰岛素敏感性，(i)降低葡萄糖不耐受，(j)延缓胰腺β-小岛细胞数量或它们分泌胰岛素的能力丧失的进展和速率，(k)增加胰腺β-小岛细胞数量或它们分泌胰岛素的能力，(l)延缓db/db小鼠或患有膳食诱导的肥胖症的小鼠的体重增加速率，(m)降低升高的甘油三酯水平，(n)降低升高的总的血液或血清胆固醇水平，(o)降低血液或血清中正常或升高的LDL、VLDL、apoB-100或apoB-48水平，(p)增加血液或血清中正常或较低的HDL或apoA1水平，(q)降低或正常化血液或血清中相反应蛋白，任选C反应蛋白或纤维蛋白原的升高的水平，(r)降低或正常化血红素A1C，(s)降低或正常化空腹血糖水平，(t)在口服葡萄糖耐量试验中使血清或血液葡萄糖正常化，(u)在膳食葡萄糖检验后2小时内使血清或血液葡萄糖正常化，(v)在体内在人或另外的哺乳动物中增加整体或组织葡萄糖消除或摄取，用于上列中的一种或多种，其中鉴定具有用于治疗或改善人或哺乳动物的代谢病症的潜力。
4.权利要求3的方法，其中代谢病症是II型糖尿病、高血糖症、升高的单酯化脂肪酸或胰岛素耐受。
5.权利要求3的方法，其中所述化合物是17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇。
6.鉴定生物动力学化合物的方法，该方法包括
(a)对个体给药试验化合物；
(b)将个体暴露于急性刺激或生物学损害下；
(c)测量试验化合物对急性刺激或生物学损害的急性生物学应答的递质的影响；以及
(d)鉴定步骤(c)的发挥对急性刺激或生物学损害的递质的瞬时影响的化合物，从而鉴定生物动力学化合物。
7.权利要求6的方法，该方法还包括
(e)将试验化合物或生物动力学化合物的生物学作用与一种或多种参考化合物的生物学作用进行比较。
8.权利要求7的方法，其中一种或多种参考化合物是选自氢化可的松、地塞米松和17α-乙炔基雄甾-5-烯-3β,7β,17β-三醇中的一种或多种。
9.药物产品或批准前的药物产品，其包含处于药物的剂型和包装中的药物以及包装说明书或标签，所述包装说明书或标签包括关于药物的效力、作用机理或临床应用的信息，其中效力、作用机理或临床应用信息至少部分地得自这样的方法，所述方法包括(a)使细胞在体外与足够量的NF-κB活性的活化剂接触足够的时间，其中所述细胞可以通过可检测到的细胞中NF-κB水平或活性增加来应答NF-κB活化剂；(b)使细胞在体外与足够量的药物接触足够的时间，其中与适合的对照相比，所述药物可检测到地抑制NF-κB活性的活化；和(c)任选地将药物抑制NF-κB活化的能力与参考化合物进行对比，其中参考化合物为本文中所述的式1化合物，其具有在表征方法中使NF-κB活化受到抑制的能力，其中所述药物使NF-κB活化抑制约25%到约75%，以及任选地其中(1)参考化合物或药物不会可检测到地或显著地直接结合于糖皮质激素受体或者任选地其中参考化合物或药物不会可检测到地或显著地激动糖皮质激素受体或(2)与适合的激动剂对照相比，所述药物不使糖皮质激素受体有超过约20%的激动。
10.权利要求9的药物产品，其中药物使NF-κB活化受到约35%到约70%或约40%到约65%的抑制。
11.鉴定化合物的方法，所述化合物具有可检测到地调节哺乳动物中的CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25+CD103+调节性T细胞、CD4+CD25highCD103+调节性T细胞或CD4+CD25high调节性T细胞的数量或活性的潜力，所述方法包括选择以下的化合物：
(i)与在体外的适合的对照人或哺乳动物细胞相比，在体外使人或哺乳动物细胞中的糖皮质激素受体、雄激素受体、雌激素受体-α、雌激素受体-β或任何这些生物分子的生物学活性变体中的一种或多种受到超过约30%的活化或抑制；
(ii)分子量为约100-1000道尔顿，任选地分子量为约250-850道尔顿；
(iii)与适合的阴性对照或正常对照相比，在适合的试验中使CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25+CD103+调节性T细胞、CD4+CD25highCD103+调节性T细胞、或CD4+CD25high调节性T细胞的数量或活性有超过20%的增加或降低；和
(iv)与体外适当的阴性对照人或哺乳动物细胞相比，在体外任选地使人或哺乳动物细胞中NF-κB的转录活性或水平抑制或减少约20-80%；从而鉴定化合物。
12.权利要求11的方法，其中哺乳动物为啮齿动物或人。
13.产品，其中所述产品是通过以下方法获得的雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇的固体形式，所述方法包括(1)获得纯化的雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇，和(2)从乙腈水溶液回收雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇。
14.组合物，其包含一种或多种赋形剂和通过以下方法获得的雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇的固体形式，所述方法包括(1)获得纯化的雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇，和(2)从乙腈水溶液回收雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇。
15.制备液体制剂的方法，该方法包括将雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇的固体形式与液体赋形剂混合，所述雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇的固体形式通过以下方法获得，所述方法包括：(1)获得纯化的雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇，和(2)从乙腈水溶液回收雄甾-5-烯-3β,7β,16α,17β-四醇的方法获得。
CN2013100543094A 2006-04-22 2007-04-23 药物和用途 Pending CN103211821A (zh)

Applications Claiming Priority (20)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79379206P 2006-04-22 2006-04-22
US60/793,792 2006-04-22
US84311206P 2006-09-08 2006-09-08
US60/843,112 2006-09-08
US82556906P 2006-09-13 2006-09-13
US82556406P 2006-09-13 2006-09-13
US60/825,569 2006-09-13
US60/825,564 2006-09-13
US82984806P 2006-10-17 2006-10-17
US60/829,848 2006-10-17
US86639506P 2006-11-17 2006-11-17
US60/866,395 2006-11-17
US86670006P 2006-11-21 2006-11-21
US60/866,700 2006-11-21
US86804206P 2006-11-30 2006-11-30
US60/868,042 2006-11-30
US88500307P 2007-01-15 2007-01-15
US60/885,003 2007-01-15
US88805807P 2007-02-02 2007-02-02
US60/888,058 2007-02-02

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200780022449.6A Division CN101472579B (zh) 2006-04-22 2007-04-23 药物和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103211821A true CN103211821A (zh) 2013-07-24

Family

ID=39230844

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2013100543094A Pending CN103211821A (zh) 2006-04-22 2007-04-23 药物和用途

Country Status (13)

Country Link
EP (2) EP2486924B1 (zh)
JP (2) JP5130591B2 (zh)
KR (1) KR20080112413A (zh)
CN (1) CN103211821A (zh)
AU (2) AU2007300404B2 (zh)
CA (1) CA2649940C (zh)
DK (2) DK2486924T3 (zh)
EA (1) EA200802167A1 (zh)
ES (2) ES2710288T3 (zh)
HU (1) HUE042925T2 (zh)
IL (1) IL194751A0 (zh)
PL (2) PL2012773T3 (zh)
WO (1) WO2008039566A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109369760A (zh) * 2018-12-18 2019-02-22 湖南科瑞生物制药股份有限公司 一种制备去氢甲基睾丸素的方法
CN109369761A (zh) * 2018-12-18 2019-02-22 湖南科瑞生物制药股份有限公司 一种去氢甲基睾丸素的制备方法

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8569275B2 (en) 2002-08-28 2013-10-29 Harbor Therapeutics, Inc. Steroids having 7-oxgen and 17-heteroaryl substitution
US8217025B2 (en) 2006-11-17 2012-07-10 Harbor Therapeutics, Inc. Drug screening and treatment methods
US8354396B2 (en) 2006-11-17 2013-01-15 Harbor Therapeutics, Inc. Drug identification and treatment method
US8486926B2 (en) 2006-11-17 2013-07-16 Harbor Therapeutics, Inc. Steroid tetrol solid state forms
EP2249838A4 (en) * 2008-02-05 2012-05-02 Harbor Biosciences Inc PHARMACEUTICAL FORMS IN SOLID STATE
HUE028337T2 (en) 2008-04-03 2016-12-28 Neurmedix Inc Shapes of a drug in a solid state
WO2009149392A1 (en) * 2008-06-06 2009-12-10 Hollis-Eden Pharmaceuticals, Inc. Methods for preparing 17-alkynyl-7-hydroxy steroids and related compounds
WO2011156673A2 (en) * 2010-06-10 2011-12-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of phosphoenolpyruvate carboxykinase-mitochondrial (pepck-m) expression
WO2012083201A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-21 Harbor Biosciences, Inc. Steroid tetrol solid state forms-2
ES2951664T3 (es) * 2011-09-08 2023-10-24 Sage Therapeutics Inc Esteroides neuroactivos, composiciones y usos de los mismos
ITMI20121472A1 (it) * 2012-09-04 2014-03-05 Ind Chimica Srl Processo per la preparazione di 11-metilen-18-metilestr-4-en-3,17-dione, utile come intermedio per la sintesi di molecole ad attivita' farmacologica
KR101687061B1 (ko) * 2014-02-25 2016-12-16 순천향대학교 산학협력단 나이에 따른 당뇨병 진단을 위한 글루코코르티코이드 수용체의 검출제제를 포함하는 타입 2 당뇨 진단 키트
CN105017361A (zh) * 2015-07-16 2015-11-04 湖北竹溪人福药业有限责任公司 一种去氢表雄酮的合成方法
CN113350359B (zh) 2017-12-29 2022-08-16 广州市赛普特医药科技股份有限公司 5α-雄甾-3β,5,6β-三醇在制备治疗出血性脑卒中药物中的应用
CN113318114B (zh) 2020-02-28 2023-02-17 广州市赛普特医药科技股份有限公司 小分子化合物在治疗肺上皮细胞损伤和/或血管内皮细胞损伤介导的疾病中的用途
CN114195844B (zh) * 2021-12-29 2023-03-17 湖北武当安泰药业有限公司 一种去氢表雄酮的制备方法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6150090A (en) 1986-01-09 2000-11-21 Massachusetts Institute Of Technology Nuclear factors associated with transcriptional regulation
US5071773A (en) 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US4898694A (en) * 1987-11-25 1990-02-06 Schwartz Arthur G 17-Hydroxy-steroids
WO1995010527A1 (en) * 1993-10-13 1995-04-20 Neurocrine Biosciences, Inc. 3,17-dihydroxy-3,7,16 and/or 17-methyl-androst-5-ene compounds, derivatives thereof, and their use
US6545027B1 (en) 1995-06-07 2003-04-08 Eli Lilly And Company Methods of modulating NF-kB transcription factor
US5989835A (en) 1997-02-27 1999-11-23 Cellomics, Inc. System for cell-based screening
US5753266A (en) * 1996-12-03 1998-05-19 Youssefyeh; Parvin Safflower seed powder compositions for the treatment of rheumatoid based arthritic diseases
US20030083231A1 (en) * 1998-11-24 2003-05-01 Ahlem Clarence N. Blood cell deficiency treatment method
US6667299B1 (en) * 2000-03-16 2003-12-23 Hollis-Eden Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions and treatment methods
AU2005211675B2 (en) * 1999-03-23 2009-09-24 Harbor Biosciences, Inc. Immunomodulatory steroids, in particular the hemihydrate of 16.alpha.-bromoepiandrosterone
EP1422234A3 (en) * 1999-03-23 2010-12-08 Harbor BioSciences, Inc. Immunomodulatory steroids, in particular the hemihydrate of 16.alpha.-bromoepiandrosterone
EP1231264A1 (en) * 1999-08-06 2002-08-14 Glaxo Wellcome, S.A. New protein
EP1832598A3 (en) * 1999-09-30 2008-01-02 Hollis-Eden Pharmaceuticals Inc. Therapeutic treatment of androgen receptor driven conditions
US6864355B1 (en) 2000-05-02 2005-03-08 Yale University Inhibition of NF-κB activation by blockade of IKKβ-NEMO interactions at the NEMO binding domain
US6593511B1 (en) 2000-05-12 2003-07-15 Bioseek, Inc. Models of chronic and acute inflammatory diseases
JP2004537506A (ja) * 2001-03-01 2004-12-16 ホリス − イーデン ファーマスーティカルズ、 インコーポレイテッド 血液細胞欠乏症を治療するためのある種のステロイドの使用
AU2002256518B2 (en) 2001-05-11 2007-07-19 Research Development Foundation Inhibitors of receptor activator of NF-kappaB and uses thereof
US20040214190A1 (en) * 2001-10-09 2004-10-28 Butz Eric A Mammalian c-type lectins
WO2004019953A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Hollis-Eden Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic treatment methods
US20040097475A1 (en) * 2002-11-07 2004-05-20 Wuts Peter Guillaume Marie Processes for preparing C-7 substituted steroids
US7884196B2 (en) 2004-10-06 2011-02-08 Oliver Lawless Vaccine composition comprising methylated DNA and immunomodulatory motifs

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109369760A (zh) * 2018-12-18 2019-02-22 湖南科瑞生物制药股份有限公司 一种制备去氢甲基睾丸素的方法
CN109369761A (zh) * 2018-12-18 2019-02-22 湖南科瑞生物制药股份有限公司 一种去氢甲基睾丸素的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2486924A3 (en) 2013-01-09
EP2486924A2 (en) 2012-08-15
CA2649940A1 (en) 2008-04-03
ES2710288T3 (es) 2019-04-24
JP2009534427A (ja) 2009-09-24
DK2012773T3 (da) 2012-09-24
DK2486924T3 (en) 2019-03-04
WO2008039566A3 (en) 2008-11-27
HUE042925T2 (hu) 2019-07-29
EP2486924B1 (en) 2018-12-26
AU2010201023B2 (en) 2012-02-09
JP5130591B2 (ja) 2013-01-30
EP2012773B1 (en) 2012-06-20
KR20080112413A (ko) 2008-12-24
EP2012773A4 (en) 2010-01-13
EA200802167A1 (ru) 2009-04-28
AU2007300404A1 (en) 2008-04-03
PL2486924T3 (pl) 2019-07-31
CA2649940C (en) 2012-08-07
WO2008039566A2 (en) 2008-04-03
IL194751A0 (en) 2009-08-03
AU2010201023A1 (en) 2010-04-08
ES2389743T3 (es) 2012-10-31
JP2012255033A (ja) 2012-12-27
EP2012773A2 (en) 2009-01-14
AU2007300404B2 (en) 2009-12-17
PL2012773T3 (pl) 2012-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103211821A (zh) 药物和用途
CN101472579B (zh) 药物和用途
US20080153792A1 (en) Drug Identification and Treatment Method
US8486926B2 (en) Steroid tetrol solid state forms
US20130164780A1 (en) Drug Identification Method
Salimi Elizei et al. Kynurenic acid downregulates IL-17/1L-23 axis in vitro
Balhara et al. Pentraxin 3 deletion aggravates allergic inflammation through a TH17-dominant phenotype and enhanced CD4 T-cell survival
MX2009001167A (es) Metodos y composiciones para inhibir la angiogenesis.
Bongiovanni et al. Conjugates of adrenal corticoids in human plasma.
CN105377260A (zh) 用二氢吡嗪并-吡嗪类对癌症的治疗
She et al. STING activation in alveolar macrophages and group 2 innate lymphoid cells suppresses IL-33–driven type 2 immunopathology
Fuhst et al. Toxicity profile of the GATA-3-specific DNAzyme hgd40 after inhalation exposure
Ye et al. Impacts of immunometabolism on male reproduction
Rosenkranz et al. Regulatory interactions of αβ and γλ T cells in glomerulonephritis
Pinto et al. Captopril-induced pemphigus vegetans with Charcot-Leyden crystals
Zai et al. Estrogen antagonizes ASIC1a-induced chondrocyte mitochondrial stress in rheumatoid arthritis
Gul et al. N-(2-Hydroxyphenyl) acetamide: a Novel Suppressor of RANK/RANKL Pathway in Collagen-Induced arthritis model in rats
CN107132357B (zh) 一种逆转乙型肝炎病毒慢性感染的抗Tim-3抗体和α-galcer的组合及应用
JP2021191804A (ja) 二重ｐｉ３ｋデルタ‐ガンマキナーゼ阻害剤及びコルチコステロイドを含む治療方法及び組成物
TW202138005A (zh) 癌症治療方法及醫藥
Däbritz et al. Activation‐dependent cell death of human monocytes is a novel mechanism of fine‐tuning inflammation and autoimmunity
CN116173016A (zh) 5-羟基色氨酸的用途及其与pd-1抗体的组合物及其用途
WO2007018320A1 (ja) 移植片喪失の予防剤、及びそのスクリーニング方法
Niu et al. Paeonol interferes with lupus nephritis by regulating M1/M2 polarization of macrophages
Zou et al. Dehydrozaluzanin C-derivative protects septic mice by alleviating over-activated inflammatory response and promoting the phagocytosis of macrophages

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130724