MX2009001167A

MX2009001167A - Metodos y composiciones para inhibir la angiogenesis.

Info

Publication number: MX2009001167A
Application number: MX2009001167A
Authority: MX
Inventors: Michael John Story; Kenneth Michael Wayne
Original assignee: Oncology Res Int Ltd
Priority date: 2006-08-03
Filing date: 2007-08-03
Publication date: 2009-03-20
Also published as: WO2008014564A1; EP2049122A1; JP2013241427A; JP2010500287A; CN101511369B; CN101511369A; TW200932245A; CA2659542A1; CA2659542C; EA200970175A1; US20090263349A1; EP2049122B1; ES2523463T3; EP2049122A4; EA016653B1; BRPI0715073A8; JP5714816B2; BRPI0715073A2; TWI421083B; AU2007281038B2

Abstract

La presente invención se refiere a un método para inhibir la angiogénesis en un sistema biológico. El método incluye administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esteroide.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA INHIBIR LA ANGIOGÉNESIS Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud de patente provisional Australiana No. 2006904195 presentada el 3 de Agosto de 2006, cuyos contenidos se van a incorporar en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y composiciones para inhibir la angiogénesis . La presente invención también se refiere a métodos y composiciones para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La angiogénesis es el proceso para formar nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos preexistentes mediante el desarrollo y la migración de células endoteliales en un proceso denominado "brote". El crecimiento de las células endoteliales es una etapa crítica en el proceso de angiogénesis. Los órganos tienen límites perfectamente marcados, definidos por estructuras acelulares circunvecinas denominadas membranas de basamento que están constituidas de una red de proteínas de matriz extracelular (ECM) , predominantemente lamininas, colágeno tipo IV y protoglicanos. La angiogénesis comienza con la erosión de la membrana de basamento que rodea a las células endoteliales las cuales forran el lumen de los vasos sanguíneos. La erosión de la membrana de basamento se activa por enzimas liberadas por células endoteliales y leucocitos. Después las células endoteliales migran a través de la membrana de basamento erosionada cuando ésta se induce por estimulantes angiogénicos . Las células migrantes forman un "brote" fuera del vaso sanguíneo progenitor. Las células endoteliales migrantes proliferan, y los brotes se fusionan para formar bucles capilares, formando así un nuevo vaso sanguíneo. El control de la angiogénesis es un proceso altamente regulado que implica las acciones de diversos estimulantes e inhibidores angiogénicos. Se piensa que tanto la angiogénesis controlada como la descontrolada proceden de una manera similar. Bajo condiciones fisiológicas normales, los humanos y los animales solamente pasan por la angiogénesis en algunas situaciones restringidas muy específicas. Por ejemplo, la angiogénesis solamente se observa normalmente en la cicatrización de heridas, el desarrollo fetal y embrionario, y en la formación del cuerpo lúteo, el endometrio y la placenta. No obstante, la angiogénesis descontrolada o no deseada está asociada con muchas enfermedades y condiciones. La inducción de angiogénesis es un rasgo característico del cáncer, caracterizado por la dispersión de células tumorales en todo el organismo. El proceso por medio del cual las células tumorales migran desde un sitio primario hacia un sitio secundario se denomina "metástasis" que es la diferencia fundamental entre un crecimiento benigno y uno maligno y representa el mayor problema clínico del cáncer. Desafortunadamente, cerca del 50% de los tumores sólidos han sufrido metástasis en el momento del diagnóstico. La evidencia del papel de la angiogénesis en el desarrollo tumoral es amplia y generalmente se acepta que el crecimiento de cualquier tumor sólido depende críticamente de este proceso. La angiogénesis juega un papel crítico en dos etapas del desarrollo tumoral. En primer lugar, se requiere la angiogénesis para que una masa tumoral crezca más allá de un tamaño de unos pocos milímetros. Sin la formación de nueva vasculatura, las células en la masa tumoral no recibirán suficiente suministro sanguíneo para desarrollarse más allá de este tamaño pequeño. No obstante, una vez que comienza la vascularización del tumor, la masa tumoral se puede expandir posteriormente. La vascularización del tumor también juega un papel significativo en el desarrollo de tumores secundarios. La vascularización del tumor permite que las células tumorales entren al torrente sanguíneo y circulen en todo el organismo. Después de que las células tumorales han dejado el sitio primario y se asientan en un sitio secundario (metastásico) , entonces la angiogénesis adicional permite que la masa tumoral secundaria crezca y se expanda. Por lo tanto, la prevención de la angiogénesis no solamente puede conducir a una reducción en el crecimiento de un tumor en su sitio primario, sino que la prevención de la angiogénesis también puede inhibir o reducir la migración de células tumorales desde el sitio primario a otras partes del organismo (metástasis) . Además de la formación de tumores, también existen varias enfermedades y condiciones inducidas por angiogénesis o asociadas con angiogénesis descontrolada o no deseada. Éstas incluyen retinopatía diabética, fibroplasia retrolenticular , glaucoma neovascular, psoriasis, angiofibroma, inflamación inmunitaria y no inmunitaria (que incluye artritis reumática) , propagación de vasos capilares en placas de arteriesclerosis, angioma y sarcoma de Kaposi. La angiogénesis también puede ocurrir en una articulación reumatoide, destrucción de articulación apresurada al permitir un influjo de leucocitos con liberación posterior de mediadores inflamatorios. La angiogénesis también juega un papel primordial en la córnea y retina de pacientes con ciertos trastornos oculares, por ejemplo enfermedad neovascular ocular. Esta enfermedad se caracteriza por invasión de nuevos vasos sanguíneos en las estructuras del ojo tales como la retina o la córnea. Ésta es la causa más común de la ceguera y está asociada con un gran número de enfermedades del ojo. En la degeneración macular relacionada con la edad, los problemas visuales asociados se provocan por un crecimiento hacia dentro de los capilares coroidales a través de los defectos en la membrana de Bruch con proliferación de tejido fibrovascular debajo del epitelio pigmentario retinal . La inflamación crónica también puede implicar angiogénesis patológica. Los estados de enfermedad tales como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn muestran cambios histológicos con el crecimiento hacia dentro de nuevos vasos sanguíneos en los tejidos inflamados. Otro papel patológico asociado con la angiogénesis se encuentra en la aterosclerosis . Se ha demostrado que las placas formadas dentro del lumen de los vasos sanguíneos tienen actividad estimuladora angiogénica. La angiogénesis también está implicada en la reproducción y en la cicatrización de heridas. En la reproducción, la angiogénesis es una etapa importante en la ovulación y también en la implantación de la blástula después de la fertilización. La prevención de la angiogénesis se puede utilizar para inducir amenorrea, para bloquear la ovulación, o para prevenir la implantación por la blástula. En la cicatrización de heridas, la reparación excesiva o fibroplasia puede ser un efecto secundario nocivo de procedimientos quirúrgicos y se puede provocar o exacerbar por la angiogénesis. Las adhesiones (no adherencias) son una complicación frecuente de la cirugía y conducen a problemas tales como la obstrucción del intestino delgado. El tratamiento actual de enfermedades que implican angiogénesis descontrolada o no deseada, es inadecuado. Por consiguiente, existe una necesidad por nuevos métodos y composiciones que inhiban la angiogénesis descontrolada o no deseada. La presente invención surge a partir de la determinación de que las saponinas esteroides tienen capacidad antiangiogénica , y se refiere a métodos y composiciones para inhibir la angiogénesis. Una referencia en la presente a un documento de patente u otro material que se dé cómo técnica anterior, no se va a considerar como una admisión de que el documento o material fue conocido o que la información que contiene fue parte del conocimiento general común en cuanto a la fecha de prioridad de cualquiera de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención surge de estudios respecto a la capacidad de las saponinas esteroides para inhibir la angiogénesis . En particular, se descubrió que las saponinas esteroides tienen la capacidad para inhibir la angiogénesis en diversos sistemas de modelo in vivo y ex vivo. Este descubrimiento indica que las saponinas esteroides tienen capacidad antiangiogénica significativa. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para inhibir la angiogénesis en un sistema biológico, el método incluye administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esteroide. La presente invención también proporciona una composición cuando se utiliza para inhibir la angiogénesis en un sistema biológico, la composición incluye una cantidad eficaz de una saponina esteroide. La presente invención también proporciona el uso de una saponina esteroide en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis en un sistema biológico .

La presente invención también proporciona una composición que incluye una saponina esteroide y un agente antiangiogénico . La presente invención también proporciona un método para reducir la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico para lograr un nivel deseado de inhibición de angiogénesis, el método incluye administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esteroide. La presente invención también proporciona un método para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales en un sistema biológico, el método incluye administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esteroide. La presente invención también proporciona una composición cuando se utiliza para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales en un sistema biológico, la composición incluye una cantidad eficaz de una saponina esteroide. La presente invención también proporciona el uso de una saponina esteroide en la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales en un sistema biológico. La presente invención también proporciona un método para reducir la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico para lograr un nivel deseado de inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales, el método incluye administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esteroide. La presente invención también proporciona un producto de combinación que incluye: una saponina esteroide; y un agente antiangiogénico; la saponina esteroide y el agente antiangiogénico se proporcionan en una forma para la coadministración a un sujeto o en una forma para la administración separada a un suj eto . La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que incluye deltonina. La presente invención también proporciona el uso de deltonina en la preparación de un medicamento. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que incluye prosapogenina A. La presente invención también proporciona el uso de prosapogenina A en la preparación de un medicamento. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que incluye asperina. La presente invención también proporciona el uso de asperina en la preparación de un medicamento.

Varios términos que se utilizarán en toda la especificación tienen significados que se comprenderán perfectamente por un destinatario experto. No obstante, para el caso de referencia, algunos de estos términos se definirán ahora. El término "glicósido" como se utiliza en toda la especificación se debe entender que significa un compuesto que contiene una porción de sacárido (azúcar) (monosacárido, disacárido o polisacárido) , enlazada a un componente triterpeno o esteroide o aglicona alcaloide esferoide (no sacárido) . En la mayoría de las circunstancias, la porción de sacárido (azúcar) está enlazada a la posición C-3 de la aglicona, aunque se contemplan otros enlaces dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, los furostanol-glicósidos , que contienen un sacárido acoplado a la posición C-26, y espirostanol-glicósidos ambos son subclases de las saponinas esferoides. El término "saponina" como se utiliza en toda la especificación se debe entender que significa un glicósido que incluye un sacárido (azúcar) acoplado a la aglicona, generalmente a través de la posición C-3 de la aglicona. El término "saponina esteroide" como se utiliza en toda la especificación se debe entender que significa un glicósido que incluye una o varias unidades de sacáridos (que incluye una o varias unidades de monosacáridos, disacáridos o polisacáridos) acopladas a una aglicona, la cual no contiene un átomo de nitrógeno. A este respecto, se entenderá que el término "saponina esteroide" incluye dentro de su alcance algunas sales o algunos otros derivados de los compuestos que son equivalentes funcionalmente en términos de su capacidad para aumentar la actividad de una terapia anticáncer. Una "aglicona" esteroide también se denomina como una "genina" o "sapogenina" y los términos se pueden utilizar indistintamente en toda la especificación y se debe entender que todos significan la porción de no sacárido de una molécula de saponina. El término "sacárido A- ( 1—n) -sacárido B" como se utiliza en toda la especificación se debe entender que significa que el sacárido A está enlazado por su C-l al C-n del sacárido B, n es un número entero. Por ejemplo, el polisacárido con el nombre común "chacotriosa" es a-L-ramnopiranosil- ( 1?2 ) - [a-L-ramnopiranosil- ( l-»4 ) ] -ß-D-glucopiranósido . Una forma abreviada de nomenclatura de acuerdo con las recomendaciones de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC, por sus siglas en inglés) utilizada en la presente es Rha 2, [Rha 4], Glc. El término "sujeto" como se utiliza en toda la especificación se debe entender que significa cualquier sujeto humano o animal. A este respecto, se entenderá que la presente invención incluye dentro de su alcance, aplicaciones veterinarias. Por ejemplo, el sujeto animal puede ser un mamífero, un primate, un animal de ganado (por ejemplo, un caballo, una vaca, una oveja, un cerdo, o una cabra) , un animal de compañía (por ejemplo un perro, un gato) , un animal para pruebas de laboratorio (por ejemplo un ratón, una rata, un cobayo, un pájaro) , un animal de importancia veterinaria, o un animal de importancia económica . El término "tratar" y sus variantes como se utilizan en toda la especificación, se debe entender que significa la intervención terapéutica con una cantidad eficaz de una saponina esteroide. Por ejemplo, el término incluye dentro de su alcance, intervención terapéutica para obtener uno o varios de los siguientes resultados: (i) inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor primario en un sujeto, que incluye reducir el crecimiento del tumor primario después de la extirpación; (ii) inhibir o prevenir el crecimiento y la formación de uno o varios tumores secundarios en un sujeto; (iii) inhibir o prevenir la angiogénesis en un sujeto; (iv) inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales en un sujeto; (v) mejorar la esperanza de vida del sujeto en comparación al estado sin tratar; (vi) mejorar la calidad de vida del sujeto en comparación al estado sin tratar. El término "inhibir" como se utiliza en toda la especificación se debe entender que significa una reducción en el progreso de un proceso, que incluye uno o varios de los términos inicio, velocidad, probabilidad, continuación o terminación de un proceso. El término "angiogénesis" como se utiliza en toda la especificación se debe entender que significa la generación de nuevos vasos sanguíneos ("neovascularización") , por ejemplo en un tejido u órgano. El término "sistema biológico" como se utiliza en toda la especificación se debe entender que significa cualquier sistema multicelular e incluye grupos aislados de células hasta organismos completos. Por ejemplo, el sistema biológico puede ser células en cultivo tisular, un tejido u órgano, o un sujeto humano completo, tal como un sujeto humano que sufra los efectos de angiogénesis no deseada o descontrolada, o una enfermedad o condición asociada con la angiogénesis descontrolada o no deseada. El término "agente antiangiogénico" como se utiliza en toda la especificación se debe entender que significa un agente que tiene la capacidad de inhibir la angiogénesis en un sistema biológico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el efecto de incrementar la concentración de deltonina sobre el crecimiento de vasos a partir de explantes aórticos. La Figura 2 muestra un ejemplo representativo del efecto de sulfóxido de dimetilo (DMSO, por sus siglas en inglés) solo sobre explantes aórticos utilizando microscopio luminoso o tinción con lectina Fitc-BS-1. La Figura 3 muestra un ejemplo representativo del efecto de deltonina 10 µ? sobre explantes aórticos utilizando microscopio luminoso o tinción con lectina Fitc-BS-1. La Figura 4 muestra el efecto de dioscina, deltonina, trilina, prosapogenina A y sorafenib sobre tinción de CD31 de vasos sanguíneos en angioesponj as , como un indicador del efecto de estos compuestos, sobre el número promedio de vasos sanguíneos inducidos. La Figura 5 muestra el efecto de dioscina, deltonina, trilina, prosapogenina A y sorafenib sobre la inducción porcentual de angiogénesis por el factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF, por sus siglas en inglés) en angioespon as . La Figura 6 muestra el efecto de dioscina, deltonina, trilina, prosapogenina A y sorafenib sobre el volumen sanguíneo en angiocámaras . La Figura 7 muestra el efecto de dioscina, deltonina, trilina, prosapogenina A y sorafenib sobre la inducción de angiogénesis por bFGF en angiocámaras.

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INVENCIÓN Como se mencionó anteriormente, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para inhibir la angiogénesis en un sistema biológico, el método incluye la etapa de administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esferoide. El sistema biológico en las diversas modalidades de la presente invención es cualquier sistema multicelular e incluye grupos aislados de células hasta organismos completos. Por ejemplo, el sistema biológico puede ser células en cultivo tisular, un tejido u órgano, o un sujeto humano completo que sufra los efectos de la angiogénesis no deseada o descontrolada, o una enfermedad o condición asociada con la angiogénesis descontrolada o no deseada. A este respecto, será evidente que el sistema biológico es cualquier sistema biológico en el cual está ocurriendo la angiogénesis, o en el cual puede ocurrir la angiogénesis . En una modalidad, el sistema biológico es un sujeto humano o animal. En una modalidad específica, el sistema biológico es un sujeto humano o animal en el cual la angiogénesis está asociada con una enfermedad o condición que se debe a la angiogénesis no deseada o descontrolada . Por ejemplo, el sistema biológico puede ser un sujeto humano o animal que sufra de, o que sea susceptible a, la angiogénesis asociada con la formación o expansión de tumores sólidos, angiofibroma, neovascularizacion corneal, neovascularizacion retinal/coroidal, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, malformaciones arteriovenosas , artritis, artritis reumatoide, osteoartritis , artritis psoriática, lupus, trastornos del tejido conectivo, síndrome de Osler- eber, placas ateroscleróticas , psoriasis, granuloma piogénico, fibroplasias retrolenticulares , escleroderma, granulaciones, hemangioma; tracoma, articulaciones hemofílicas, adhesiones vasculares, cicatrices hipertróficas, enfermedades o condiciones asociadas con inflamación aguda o crónica, enfermedades o condiciones asociadas con inflamación crónica del pulmón que incluyen asma, sarcoidosis, enfermedades inflamatorias del intestino, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. En una modalidad, la presente invención se puede utilizar para prevenir y/o tratar el cáncer en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención se puede utilizar para prevenir el crecimiento de un tumor primario y/o uno secundario, e inhibir y/o prevenir la metástasis. Ejemplos de cánceres incluyen carcinoma, cáncer de vejiga, cáncer óseo, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colorrectal, que incluye cáncer del colon, recto, ano, y apéndice, cáncer del esófago, enfermedad de Hodgkin, cáncer renal, cáncer de la laringe, leucemia, cáncer hepático, cáncer pulmonar, linfoma, melanoma, molas y nevos displásicos, mieloma múltiple, cáncer muscular, linfoma no de Hodgkin, cáncer oral, cáncer ovárico, cáncer del páncreas, cáncer de la próstata, sarcoma, cáncer de la piel, cáncer del estómago, cáncer testicular, teratoma, cáncer tiroideo, y cáncer del útero. El sujeto en las diversas modalidades de la presente invención puede ser un sujeto humano o animal. Por ejemplo, el sujeto animal puede ser un mamífero, un primate, un animal de ganado (por ejemplo, un caballo, una vaca, una oveja, un cerdo, o una cabra), un animal de compañía (por ejemplo un perro, un gato) , un animal para pruebas de laboratorio (por ejemplo un ratón, una rata, un cobayo, un pájaro) , un animal de importancia veterinaria, o un animal de importancia económica. En una modalidad, el sujeto es un sujeto humano. Las saponinas se dividen convencionalmente en tres clases principales: (i) glicósidos de triterpeno; (ii) glicósidos esteroides; y (iii) glicósidos alcaloides esteroides. Todas ellas tienen en común el acoplamiento de una o varias unidades de azúcar a la aglicona, generalmente en la posición C-3. Las saponinas esteroides generalmente son como se describen en Hostettmann K y Marston A (2005) . Chemistry & pharmacology of natural products: Saponins Cambridge University Press. Como se analizó previamente en la presente, las saponinas esteroides no contienen un átomo de nitrógeno en la porción de aglicona. Será evidente que las saponinas esteroides en las diversas modalidades de la presente invención incluyen saponinas esteroides de origen natural y saponinas esteroides de origen no natural (es decir, saponinas esteroides sintetizadas químicamente) . Además, también será evidente que las saponinas esteroides en las diversas modalidades de la presente invención también incluyen profármacos de las saponinas esteroides, derivados de saponinas esteroides, que incluyen por ejemplo, cualesquiera ésteres, cetonas, ácidos carboxílicos, sales, formas sustituidas, formas halogenadas u otras formas que contengan heteroátomo, formas insaturadas, o cualquier otro derivado funcional. La porción de sacárido de las saponinas esteroides en las diversas modalidades de la presente invención puede incluir una o varias unidades de sacárido, tales como un monosacárido, una unidad de disacárido o una unidad de polisacárido . También será evidente que las saponinas esteroides en las diversas modalidades de la presente invención también pueden incluir una aglicona con un sacárido acoplado en una o varias posiciones de la porción de aglicona. En una modalidad, la saponina esteroide incluye un sacárido acoplado a una posición simple del componente de sapogenina de la saponina esteroide. Como se describió anteriormente, la unidad de sacárido puede ser un monosacárido, un disacárido o un polisacárido. El sacárido puede estar compuesto de un monosacárido adecuado, tal como D-glucosa (Glc) , L-ramnosa (Rha) , D-galactosa (Gal) , ácido D-glucurónico (GlcA) , D-xilosa (Xyl) , L-arabinosa (Ara), D-fucosa (Fue), ácido D-galacturónico (GalA) . La unidad de sacárido también puede ser un azúcar sustituido, tal como un amino-azúcar, un azúcar sulfatado, un azúcar acilado, un azúcar N-acilado, y derivados funcionales de cualquiera de los monosacáridos mencionados anteriormente. Similarmente, un disacárido puede ser cualquier combinación de dos monosacáridos, como se describe anteriormente . Los polisacáridos en las diversas modalidades de la presente invención pueden ser lineales o ramificados, e incluyen cualquier combinación de dos o más monosacáridos, que incluyen el monosacárido descrito previamente en la presente . En una modalidad, el polisacárido está compuesto de 1 a 6 unidades de monosacárido. A este respecto, y como se describe anteriormente en la presente, los polisacáridos generalmente se describen en el contexto del arreglo de los monosacáridos componentes . En una modalidad, el sacárido de la saponina esteroide está compuesto de 1 unidad de monosacárido. Un ejemplo de un monosacárido es la glucosa con el nombre químico ß-D-glucopiranósido, el cual cuando está acoplado a la aglicona-diosgenina por medio de la posición C-3, tiene el nombre común de "trilina". En otra modalidad, el sacárido de la saponina esteroide está compuesto de 2 unidades de monosacárido, es decir un disacárido. Un ejemplo de un disacárido es Rha 2, Glc con el nombre químico a-L-ramnopiranosil ( 1?2 ) -ß-D-glucopiranósido, el cual cuando se acopla a la aglicona-diosgenina por medio de la posición C-3, tiene el nombre común de "prosapogenina A" .

En otra modalidad, el polisacárido está compuesto de 3 unidades de sacárido, es decir un trisacárido. El chacotriósido es un ejemplo común de una unidad de trisacárido, en donde el grupo glicosilo de tres sacáridos tiene dos unidades ramnosa enlazadas a una unidad de glucosa, la cual a su vez está enlazada por medio de un enlace glicosidico en la posición C-3 de una sapogenina. La chacotriosa es -L-ramnopiranosil- ( 1?2 ) - [a-L-ramnopiranosil- ( 1?4 ) ] -ß-D-glucopiranósido . Una forma abreviada de nomenclatura de acuerdo con las recomendaciones de la IUPAC utilizada en la presente es Rha 2, [Rha 4 ] , Glc. Similarmente, el solatriósido es un grupo glicosilo de tres sacáridos, que tiene una unidad de ramnosa y una unidad de sacárido no ramnosa, cada una enlazada a una tercera unidad de sacárido, la cual a su vez está enlazada por medio de un enlace glicosidico a la posición C-3 de una sapogenina. Un ejemplo de un tetrasacárido es [Rha 4, Rha 4], Rha 2, Glc con el nombre químico [oc-L-ramnopiranosil ( 1?4 ) -oc-L-ramnopiranosil) ( 1?4 ) ] -a-L-ramnopiranosil ( l-?4 ) -ß-D-glucopiranósido, el cual cuando está acoplado a la aglicona-diosgenina por medio de la posición C-3 tiene el nombre común de "asperina". Otro ejemplo de un tetrasacárido es Glc 4, [Xyl 3], Rha 2, Ara, con el nombre químico ß-D- glucopiranosil (1?4) - [ß-D-xilopiranosil- (1-3) ] -a-L- ramnopiranosil (1—2) -a-L-arabinósido . Como se describió previamente, las saponinas esteroides no contienen un átomo de nitrógeno en la porción de aglicona. En una modalidad, la saponina esteroide en las diversas modalidades de la presente invención se basa en una sapogenina con la fórmula química I o II como sigue: Fórmula I R27A en donde Rx, R2, R4, Re, 7, R11, 12 Ri4, R15 y Rn son independientemente H, OH, =0, grupos éster farmacológicamente aceptables o grupos éter farmacológicamente aceptables; R5 es H cuando C-5, C-6 es un enlace simple, y ninguno cuando C-5, C-6 es un enlace doble; A es O simultáneamente con B que es CH2, o B es O simultáneamente con A que es CH2; R27A es H simultáneamente con R27B que es CH3, o R27A es CH3 simultáneamente con R27B que es H; R3 comprende un grupo glicosilo enlazado a través del átomo de oxigeno a la sapogenina esteroide en C-3; o una sal o derivado del mismo, farmacéuticamente aceptable. en donde : Ri/ R2, R4 e R?, R11, R12, R14, R15 y Rn son independientemente H, OH, =0, grupos éster farmacológicamente aceptables o grupos éter farmacológicamente aceptables; R5 es H cuando C-5, C-6 es un enlace simple, y ninguno cuando C-5, C-6 es un enlace doble; R22 es un grupo hidroxilo o uno alcoxilo cuando C- 20, C-22 es un enlace simple, o ninguno cuando C-20, C-22 es un enlace doble; R27A es H simultáneamente con R27B que es CH3, o R27A es CH3 simultáneamente con R27B que es H; R28 es H o un sacárido; o una sal, o derivado del mismo farmacéuticamente aceptable; R3 comprende un grupo glicosilo enlazado a través de un átomo de oxigeno a la saponina esteroide en C-3; o una sal, o derivado del mismo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de sapogeninas esteroides incluyen espirostanol-agliconas tales como diosgenina, yamogenina (neodiosgenina) , yucagenina, sarsasapogenina , tigogenina, esmilagenina , hecogenina, gitogenina, convalamarogenina , neoruscogenina , y solagenina; y furostanol-agliconas tales como protodiosgenina, pseudoprotodiosgenina, metil-protodiosgenina, protoyamogenina, y metil-protoyamogenina . En una modalidad, la saponina esteroide es una chacotriósido-saponina esteroide. En otra modalidad, la saponina esteroide es una solatriósido-saponina esteroide. Ejemplos de chacotriósido-saponinas esteroides incluyen "dioscina" que consiste de la saponina "diosgenina" enlazada a través de la posición C-3 a chacotriosa, diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a otro chacotriósido, tigogenina enlazada a través de la posición C-3 a un chacotriósido, sarsasapogenina enlazada a través de la posición C-3 a un chacotriósido, esmilagenina enlazada a través de la posición C-3 a un chacotriósido, yucagenina enlazada a través de la posición C-3 a un chacotriósido, y yamogenina enlazada a través de la posición C-3 a un chacotriósido. Ejemplos de solatriósido-saponinas esteroides incluyen "gracilina", que es diosgenina enlazada a través de la posición C-3 al solatriósido (Rha 2, [Glc 3], Glc) ; deltonina (diosgenina enlazada a través de la posición C-3 al solatriósido (Rha 2, [Glc 4], Glc); diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a solatriosa (Rha 2, [Glc 3], Gal) [en este contexto, diosgenina enlazada a (Rha 2, [Glc 3], Gal) se denomina "diosgenina-solatriosa" ] ; diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a otro solatriósido; tigogenina enlazada a través de la posición C-3 a un solatriósido; sarsasapogenina enlazada a través de la posición C-3 a un solatriósido; esmilagenina enlazada a través de la posición C-3 a un solatriósido; yucagenina enlazada a través de la posición C-3 a un solatriósido, y yamogenina enlazada a través de la posición C-3 a un solatriósido . Las saponinas esteroides de monosacáridos simples son muy abundantes en el reino vegetal. El monosacárido generalmente está enlazado a la aglicona a través de la posición C-3 y ejemplos incluyen "trilina", que es diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a glucosa. Otras sapogeninas enlazadas a glucosa a través de la posición C-3 incluyen sarsasapogenina, rodeasapogenina y yamogenina. Algunas sapogeninas están enlazadas a través de la posición C-3 a otro monosacárido tal como arabinosa, por ejemplo, yonogenina y convalagenina o enlazada a través de la posición C-3 a galactosa y asi sucesivamente. Ejemplos de saponinas esteroides de disacáridos incluyen sarsasapogenina enlazada a través de la posición C-3 por ejemplo a (Xyl 2, Gal 3); (Glc 2, Glc 3); (Glc 3, Glc 3); esmilagenina enlazada a través de la posición C-3 a (Glc 2, Glc 3); (Glc 2, Gal 3); samogenina, tigogenina, gitogenina, aliogenina, ruscogenina, penogenina, cepagenina, y diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a (Rha 2, Glc 3) . Los glicósidos de diosgenina provenientes de la especie Dioscorea son de gran interés comercial como materiales de partida para hormonas esteroides. Los glicósidos de diosgenina y su isómero C-25 yamogenina están entre las espirostanol-saponinas documentadas más frecuentemente . Ejemplos de espirostanol-sapogeninas esteroides de origen natural con un enlace doble C-5, C-6 en el anillo B se listan en la Tabla 1: Tabla 1 Ejemplos de espirostanol-sapogeninas esteroides de origen natural con un enlace simple C-5, C-6 en el anillo B se listan en la Tabla 2: Tabla 2 Ejemplos de furostanol-sapogeninas esteroides de origen natural del tipo protospirostano con un enlace doble C-5, C-6 en el anillo B y un enlace simple C-20,C-22 en el anillo E se listan en la Tabla 3: Tabla 3 Un ejemplo de una furostanol-sapogenina esteroide de origen natural del tipo protospirostano con un enlace simple C-5, C-6 en anillo B y un enlace simple C-20, C-22 en el anillo E, es prototigogenina . Un ejemplo de una furostanol-sapogenina esteroide de origen natural del tipo pseudospirostano con un enlace doble C-5, C-6 en el anillo B y un enlace doble C-20, C-22 en el anillo E es pseudodiosgenina . Un ejemplo de una furostanol-sapogenina esteroide de origen natural del tipo pseudoprotospirostano con un enlace doble C-5, C-6 en el anillo B y un enlace doble C- 20,C-22 en el anillo E es pseudoprotodiosgenina . En una modalidad, la saponina esteroide es la sapogenina diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. En otra modalidad, la saponina esteroide es dioscina o gracilina, en donde la dioscina es la sapogenina diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a chacotriosa (Rh 2, [Rha 4], Glc) y la gracilina es diosgenina enlazada a través de la posición C-3 al solatriósido (Rha 2, [Glc 3], Glc). En otra modalidad, la saponina esteroide es deltonina, en donde la deltonina es la saponina diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a Rha 2, [Glc 4], Glc. En otra modalidad, la saponina esteroide es la sapogenina diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a solatriosa (Rha 2, [Glc], Gal). En este contexto, la diosgenina enlazada a (Rha 2, [Glc 3] , Gal) se denomina "diosgenina solatriosa". En otra modalidad, la saponina esteroide es la saponina diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. En otra modalidad, la saponina esteroide es la sapogenina tigogenina, enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. En otra modalidad, la saponina esteroide es la sapogenina sarsasapogenina, enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. En otra modalidad, la saponina esteroide es la sapogenina esmilagenina, enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. En otra modalidad, la saponina esteroide es la sapogenina yucagenina, enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. En otra modalidad, la saponina esteroide es la sapogenina yamogenina, enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. En otra modalidad, la saponina esteroide es una saponina esteroide basada en furostanol, excepto convalamarósido . En una modalidad especifica, la saponina esteroide se selecciona entre el grupo que consiste de deltonina (diosgenina Rha2, [Glc4], Glc) , dioscina (diosgenina Rha2, [Rha4], Glc), prosapogenina A (diosgenina Rha2, Glc) y asperina (diosgenina [Rha 4, Rha 4], Rha 2, Glc) . En el caso de deltonina, prosapogenina A y asperina, cualquiera de estas saponinas esteroides se puede preparar en una composición farmacéutica. Por consiguiente, tales saponinas esteroides se pueden utilizar en la preparación de un medicamento.

Tal medicamento se puede utilizar, por ejemplo, para una o varias de inhibición del crecimiento de una célula cancerosa; inhibición de la formación y/o crecimiento de un tumor primario y/o secundario; prevención y/o tratamiento de un cáncer, inhibición de angiogénesis , inhibición de proliferación y/o migración de células endoteliales, inhibición y/o prevención de metástasis y reducción de la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico para lograr un nivel deseado de inhibición de angiogénesis. Como se describió previamente en la presente, la saponina esteroide en las diversas modalidades de la presente invención se puede obtener a partir de fuentes naturales, fabricarse a partir de procesos de síntesis, o como síntesis parcial o modificación aplicada a compuestos o intermediarios de origen natural. La extracción, aislamiento e identificación de la saponina esteroide en las diversas modalidades de la presente invención se pueden lograr por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, algunas saponinas esferoides se producen a partir de fuentes vegetales. Otras fuentes de saponinas esferoides se pueden obtener fácilmente de la literatura, por ejemplo como se describe en Hostettmann K and Marston A (2005) . Chemistry & pharmacology of natural producís : Saponins . Cambridge University Press, capítulos 1-3 y 6. Los nombres comunes de las saponinas esteroides se han utilizado de acuerdo con el texto anterior y el Diccionario de Productos Naturales, Chapman and Hall, CRC, (2004). La cantidad de la saponina esteroide administrada al sistema biológico en las diversas modalidades de la presente invención no está' limitada particularmente, y generalmente se encontrará en tal intervalo que el objetivo se expondrá a una concentración desde 0.1 µ? hasta 20 µ de la saponina esteroide. La saponina esteroide se puede administrar en una forma y a una concentración adecuada para permitir que el agente alcance el sitio deseado de acción y tenga el efecto deseado, tal como inhibición de la angiogénesis . La administración de la saponina esteroide puede estar dentro de cualquier tiempo adecuado para producir el efecto deseado. En un sujeto humano o animal, la saponina esteroide se puede administrar por ejemplo oralmente, parenteralmente, tópicamente o por cualquier otro medio adecuado, y por lo tanto se debe tomar en cuenta el tiempo de tránsito del agente. Por ejemplo, la administración de la saponina esteroide al sujeto en las diversas modalidades de la presente invención puede ser en una ocasión o más antes de la angiogénesis, y/o simultáneamente con la aparición de la angiogénesis . Por ejemplo, en el caso de inhibición de angiogénesis ' asociada con un cáncer sólido, la administración de la saponina esteroide puede ser antes y/o durante el crecimiento de un tumor (tumores primarios y/o secundarios) , y/o antes o después de la extirpación de un tumor (tumores primarios y/o secundarios). La saponina esteroide en las diversas modalidades de la presente invención se puede administrar al sujeto en una forma adecuada. En una modalidad, la saponina esteroide está en la forma de una composición adecuada para utilizarse con el fin de inhibir la angiogénesis. Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención proporciona una composición cuando se utiliza para inhibir la angiogénesis en un sistema biológico, la composición incluye una cantidad eficaz de una saponina esteroide. La cantidad eficaz de la saponina esteroide que se va a administrar al sistema biológico (por ejemplo un sujeto) no está limitada particularmente, siempre y cuando se encuentre dentro de tal cantidad y en tal forma que muestre generalmente un efecto útil o terapéutico. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" es la cantidad que, cuando se administra a un sujeto que necesita tratamiento, mejora el pronóstico y/o estado del sujeto. La cantidad que se va a administrar a un sujeto dependerá de las características particulares de la angiogénesis que se va a inhibir, el cáncer que se va a tratar, el modo de administración, y las características del sujeto, como la salud general, otras enfermedades, la edad, el sexo, el genotipo y el peso corporal. Una persona experta en la técnica tendrá la capacidad de determinar las dosificaciones apropiadas, dependiendo de estos y de otros factores . Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención proporciona el uso de una saponina esteroide en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis en un sistema biológico. Como se describió previamente en la presente, la administración y distribución de la saponina esteroide puede ser, por ejemplo, por la ruta intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, oral, o tópica, o por inyección directa en el sitio deseado de acción. El modo y la ruta de administración en la mayoría de los casos dependerán del tipo de enfermedad o condición que se va a tratar . La forma de dosificación, la frecuencia y la cantidad de dosis dependerán del modo y la ruta de administración. Típicamente, una composición inyectable se administrará en una cantidad de entre 5 mg/m2 y 500 mg/m2, generalmente entre 10 mg/m2 y 200 mg/m2. Típicamente, una composición administrada oralmente se administrará en una cantidad de entre 5 mg y 5 g, preferentemente entre 50 mg y 1 g. Por ejemplo, una cantidad eficaz de la saponina esteroide típicamente oscila entre aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal por día y aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal por día, y en una forma entre 1 mg/kg de peso corporal por día y 100 mg/kg de peso corporal por día. Como se describe anteriormente, la administración de las composiciones de saponina esteroide también puede incluir el uso de uno o varios aditivos farmacéuticamente aceptables, que incluyen sales, aminoácidos, polipéptidos , polímeros, solventes, amortiguadores, excipientes, conservadores y agentes de volumen farmacéuticamente aceptables, tomando en consideración las características particulares físicas, microbiológicas y químicas de la saponina esteroide que se va a administrar. Por ejemplo, la saponina esteroide se puede preparar en una gama de composiciones farmacéuticamente aceptables en la forma de, por ejemplo, una solución acuosa, una preparación oleosa, una emulsión grasosa, una emulsión, un polvo liofilizado para la reconstitución, · etc . y se puede administrar como una inyección intramuscular o subcutánea sin pirógenos, y estéril o como inyección a un órgano, o como una preparación incrustada o como una preparación transmucosa a través de la cavidad nasal, el recto, el útero, la vagina, el pulmón, etc. La composición se puede administrar en la forma de preparaciones orales (por ejemplo, preparaciones sólidas tales como tabletas, caplets, cápsulas, gránulos o polvos; preparaciones liquidas tales como jarabe, emulsiones, dispersiones o suspensiones) . Las composiciones que contienen la saponina esteroide también pueden contener uno o varios conservadores, agentes amortiguadores, diluyentes, estabilizantes, agentes quelantes, agentes mejoradores de la viscosidad, agentes dispersantes, controladores del pH, agentes modificadores de la solubilidad o agentes isotónicos farmacéuticamente aceptables. Estos excipientes son muy conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de conservadores adecuados son ésteres del ácido benzoico de ácido para-hidroxibenzoico, fenoles, alcohol feniletilico o alcohol bencílico. Ejemplos de amortiguadores adecuados son sales de fosfato de sodio, ácido cítrico, ácido tartárico y similares. Ejemplos de estabilizantes adecuados son antioxidantes tales como acetato de alfa-tocoferol, alfa-tioglicerina, metabisulfito de sodio, ácido ascórbico, acetilcisteína, 8- hidroxiquinolina, y agentes quelantes tales como edetato disódico. Ejemplos de agentes mejoradores de la viscosidad, de la suspensión, agentes solubilizantes o dispersantes, adecuados son éteres de celulosa sustituidos, ésteres de celulosa sustituidos, alcohol polivinilico, polivinilpirrolidona, polietilenglicoles , carbómero, polioxipropilenglicoles, monooleato de sorbitano, sesquioleato de sorbitano, aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno 60. Ejemplos de controladores del pH, adecuados incluyen ácido clorhídrico, hidróxido de sodio, amortiguadores y similares. Ejemplos de agentes isotónicos adecuados son glucosa, D-sorbitol o D-manitol, cloruro de sodio. La administración de la saponina esteroide también puede ser en la forma de una composición que contenga un portador, diluyente, excipiente, agente de la suspensión, agente lubricante, adyuvante, vehículo, sistema de distribución, emulsificante, desintegrador, absorbente, conservador, surfactante, colorante, deslizante, antiadherente, aglutinante, saborizante o edulcorante farmacéuticamente aceptables, tomando en cuenta las propiedades físicas, químicas y microbiológicas de la saponina esteroide que se va a administrar. Para estos propósitos, la composición se puede administrar oralmente, parenteralmente, por roció en inhalación, adsorción, absorción, tópicamente, rectalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente, intraventricularmente, por medio de un depósito implantado en formulaciones de dosificación que contengan portadores convencionales, no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, o mediante cualquier otra forma de dosificación conveniente.

El término parenteral como se utiliza en la presente incluye la administración subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal , intratecal, intraventricular, intrasternal, y técnicas de inyección intracraneal o de infusión. Cuando se administra parenteralmente, la composición normalmente estará en una forma inyectable de dosificación unitaria, estéril, sin pirógeno (solución, suspensión o emulsión, la cual puede haber sido reconstituida antes del uso) que es usualmente isotónica » con la sangre del receptor, con un portador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales formas inyectables estériles son suspensiones acuosas u oleaginosas estériles inyectables. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo a las técnicas conocidas en el arte utilizando vehículos, agentes humectantes o de la dispersión, agentes formadores de complejos, polímeros, auxiliares de la solubilidad y agentes de la suspensión adecuados. Las formas inyectables estériles también pueden ser soluciones o suspensiones inyectables estériles en diluyentes o solventes no tóxicos, parenteralmente aceptables, por ejemplo, como soluciones en 1 , 3-butanodiol . Entre los vehículos y solventes farmacéuticamente aceptables que se pueden emplear se encuentran el agua, etanol, glicerol, solución salina, sulfóxido de dimetilo, N-metilpirrolidona , dimetilacetamida, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de cloruro de sodio isotónico y solución de Hank. Además, los aceites fijos, estériles se emplean convencionalmente como solventes o medios de la suspensión. Para este propósito, se pueden emplear aceites fijos insípidos que incluyen mono- o diglicéridos sintéticos, aceite de maíz, de semilla de algodón, de cacahuate y de ajonjolí. Ácidos grasos tales como oleato de etilo, miristato isopropílico, y ácido oleico y sus derivados de glicérido, que incluyen aceite de oliva y aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas, son útiles en la preparación de inyectables. Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener diluyentes o dispersantes de alcohol de cadena larga. El portador puede contener aditivos, tales como sustancias que mejoren la solubilidad, la isotonicidad, y la estabilidad química, por ejemplo antioxidantes, amortiguadores y conservadores. Además, la composición que contiene la saponina esteroide puede estar en una forma para reconstituirse antes de la administración.. Ejemplos incluyen liofilización, secado por rocío y similares para producir una forma sólida adecuada para la reconstitución con un solvente farmacéuticamente aceptable antes de la administración . Las composiciones pueden incluir uno o varios amortiguadores, agentes de volumen, agentes isotónicos y crioprotectores y lioprotectores . Ejemplos de excipientes incluyen, sales de fosfato, ácido cítrico, azúcares no reductores tales como sacarosa o trehalosa, alcoholes de polihidroxi, aminoácidos, metilaminas, y sales liotrópicas, son los preferidos para los azúcares reductores tales como maltosa o lactosa. Cuando se administra oralmente, la saponina esteroide usualmente se formulará en formas de dosificación unitaria tales como tabletas, caplets, cachets, polvo, gránulos, esferas, pastillas masticables, cápsulas, líquidos, suspensiones o soluciones acuosas, o formas de dosificación similar, utilizando equipo y técnicas convencionales conocidos en el arte. Tales formulaciones típicamente incluyen un portador sólido, semisólido o líquido. Portadores ejemplares incluyen excipientes tales como lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma de acacia, fosfato de calcio, aceite mineral, manteca de cacao, aceite de teobroma, alginatos, tragacanto, gelatina, jarabe, éteres celulósicos sustituidos, monolaurato de polioxietilen-sorbitano, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio, y similares. Una tableta se puede elaborar al comprimir o moldear la saponina esferoide opcionalmente con uno o varios ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas se pueden preparar al comprimir, en una máquina adecuada, el ingrediente activo en una forma que fluya libremente tal como un polvo o gránulos, mezclados opcionalmente con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, surfactante, o agente dispersante. Las tabletas moldeadas se pueden elaborar mediante el moldeo en una máquina adecuada, una mezcla del ingrediente activo en polvo y un portador adecuado humedecido con un diluyente líquido inerte. La administración de la saponina esferoide también puede utilizar tecnología de liberación controlada. Para la administración tópica, la composición puede estar en la forma de una solución, rocío, loción, crema (por ejemplo una crema no iónica) , gel, pasta o ungüento. Alternativamente, la composición se puede distribuir por medio de un liposoma, nanósoma, ribosoma, o vehículo difusor de nutrientes. Como se analizó previamente en la presente, la cantidad eficaz ' de la saponina esferoide que se va a administrar no está limitada particularmente, siempre y cuando se encuentre dentro de tal cantidad y en tal forma que presente generalmente un efecto terapéutico o útil farmacológicamente . La administración de la saponina esferoide puede incluir además la administración de un agente antiangiogénico, que incluyen anticuerpos anti-VEGF, que incluyen anticuerpos quiméricos y humanizados, aptámeros anti-VEGF y oligonucleótidos antisentido, angiostatina, endostatina, interferones interleucina 1, interleucina 12, ácido retinoico, e inhibidores tisulares de metaloproteinasa-2 y -9. La ruta de administración, dosis y regímenes de tratamiento de agentes antiangiogénicos se pueden determinar por una persona experta en la técnica. Los agentes antiangiogénicos y su uso generalmente son como se describen en "Biotherapy: A comprehensive Overview" (2001) Segunda Edición, editado Por Paula Trahan Rieger, Jones and Bartlett Publishers International. La inhibición de la angiogénesis en el sistema biológico se puede determinar por un método adecuado conocido en la técnica, tal como la aparición retrasada de estructuras neovasculares, desarrollo lento de estructuras neovasculares, aparición disminuida de estructuras neovasculares, severidad lenta o disminuida de los efectos de la enfermedad dependientes de la angiogénesis, crecimiento angiogénico detenido, o regresión del crecimiento angiogénico previo. La determinación de la capacidad de la saponina esteroide para inhibir la angiogénesis puede ser mediante cualquier ensayo adecuado de medición de la angiogénesis que sea perfectamente conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un modelo de explante aórtico de ratón. Alternativamente, se puede realizar el ensayo de membrana corioalantoica de pollo (CAM) o un modelo de neovascularización corneal. La capacidad de la saponina esteroide para inhibir la angiogénesis se puede determinar por el grado de inhibición de la angiogénesis en el embrión de pollo o el grado de inhibición de la angiogénesis en un modelo de neovascularización corneal. Por ejemplo, la capacidad de una saponina esteroide para inhibir la angiogénesis en un ensayo de membrana corioalantoica de pollo se puede probar mediante el contacto de la membrana corioalantoica con la saponina esteroide aplicada a un disco de metilcelulosa . Para el modelo de neovascularización corneal, la saponina esteroide se puede aplicar como una composición tópica que contenga la saponina esteroide a la cornea, la cornea se raspa y se inocula con un agente para inducir la neovascularización. Otro método para estudiar la angiogénesis es la implantación subcutánea de varias esponjas artificiales (es decir de alcohol polivinilico, gelatina) en animales. La saponina esteroide que se va a evaluar se puede inyectar directamente en las esponjas, las cuales se colocan en el animal. La neovascularización de las esponjas se evalúa ya sea histológicamente, morfométricamente (densidad vascular), bioquímicamente (contenido de hemoglobina) o al medir la velocidad del flujo sanguíneo en la vasculatura de la esponja utilizando un marcador radioactivo. También se han desarrollado numerosos modelos tumorales animales para probar la actividad antiangiogénica de los compuestos de prueba. En muchos casos, las células tumorales se injertan subcutáneamente y se determina el tamaño del tumor en intervalos de tiempo regulares. Las células tumorales utilizadas frecuentemente incluyen glioma de rata C6, melanoma B16BL6, LLC, y carcinoma de Walker 256. También se contempla que la saponina esteroide de la presente invención será adecuada para utilizarse con el fin de reducir la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico. Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención también proporciona un método para reducir la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico para lograr un nivel deseado de inhibición de la angiogénesis, el método incluye la etapa de administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esteroide. La cantidad eficaz de la saponina esteroide que se va a administrar no está limitada particularmente, siempre y cuando se encuentre dentro de tal cantidad que presente generalmente un efecto farmacológicamente útil para reducir la cantidad de agente necesario para lograr un nivel deseado de inhibición de la angiogénesis en el sistema biológico. La administración de la saponina esteroide puede estar dentro de cualquier tiempo adecuado para producir el efecto deseado de reducir la cantidad de un agente administrado a un sistema biológico, necesaria para lograr un nivel deseado de inhibición de la angiogénesis en el sistema biológico. Como se analizó previamente en la presente, en un sujeto humano o animal, la saponina esteroide se puede administrar por ejemplo oralmente, parenteralmente , tópicamente o por cualquier otro medio adecuado, y por lo tanto se debe tomar en cuenta el tiempo de tránsito del fármaco. Como se describió previamente en la presente, ejemplos de agentes antiangiogénicos incluyen anticuerpos anti-VEGF, que incluyen anticuerpos humanizados y quiméricos, aptámeros anti-VEGF y oligonucleótidos antisentido, angiostatina, endostatina, interferones, interleucina 1, interleucina 12, ácido retinoico, e inhibidores tisulares de metaloproteinasa-2 y -9. A este respecto, la cantidad del agente antiangiogénico, necesaria para lograr un nivel deseado de inhibición de la angiogénesis se determinará empíricamente por un método conocido en la técnica, y como tal dependerá del nivel deseado de la angiogénesis que se va a inhibir, la edad y el peso corporal del sujeto, y la frecuencia de la administración. La administración del agente antiangiogénico estará en una forma adecuada y dentro de un tiempo adecuado para producir el efecto deseado de inhibir la angiogénesis al nivel deseado. Los métodos para formular y administrar agentes antiangiogénicos son conocidos en la técnica. La administración de la saponina esteroide puede ocurrir al mismo tiempo y de la misma manera que la administración del agente antiangiogénico.

Alternativamente, la administración de la saponina esteroide puede ser separada a la administración del agente antiangiogénico, y ocurrir en un momento farmacológicamente apropiado, antes o después de la administración del agente.

La presente invención también proporciona un producto de combinación para la coadministración o separada de una saponina esteroide y un agente antiangiogénico a un sujeto para inhibir la angiogénesis . En este caso, el producto de combinación incluye la saponina esteroide para la administración separada al sujeto de una forma adecuada, o alternativamente, para la coadministración al sujeto de una forma adecuada . Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención proporciona un producto de combinación que incluye una saponina esteroide y un agente antiangiogénico, la saponina esteroide y el agente antiangiogénico se proporcionan en una forma para la coadministración a un sujeto o en una forma para la administración separada a un suj eto . Los componentes del producto de combinación se pueden envasar separadamente o juntos en recipientes esterilizados adecuadamente tales como ampolletas, botellas, o frascos, ya sea en formas de dosificación unitaria o de dosis múltiples. Los recipientes típicamente están herméticamente sellados. Los métodos para el envasado de los componentes son conocidos en la técnica. Como se analizó previamente en la presente, la coadministración puede ser secuencial o simultánea y generalmente significa que los agentes están presentes en el sujeto durante un intervalo de tiempo especificado. Típicamente, si se administra un segundo agente dentro de la vida media del primer agente, los dos agentes se consideran como coadministrados. La presente invención se puede utilizar para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales . Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención proporciona un método para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales en un sistema biológico, el método incluye la etapa de administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esteroide. A este respecto, será evidente que el sistema biológico es cualquier sistema biológico en el cual está ocurriendo la proliferación y/o migración de células endoteliales o en el cual puede ocurrir la angiogénesis . En una modalidad, el sistema biológico es un sujeto humano o animal. En una modalidad adicional, el sistema biológico es un sujeto humano o animal en el cual la proliferación y/o migración de células endoteliales está asociada con una enfermedad o condición que se debe a la proliferación y/o migración no deseada o descontrolada de células endoteliales.

Por ejemplo, el sistema biológico puede ser un sujeto humano o animal que sufre de, o es susceptible a, la proliferación y/o migración de células endoteliales asociada con la formación o expansión de tumores sólidos, angiofibroma, neovascularización corneal, neovascularización retinal/coroidal, retinopatia diabética, degeneración macular relacionada con la edad, malformaciones arteriovenosas, artritis, artritis reumatoide, osteoartritis , artritis psoriática, lupus, trastornos del tejido conectivo, síndrome de Osler- eber, placas ateroscleróticas, psoriasis, granuloma piogénico, fibroplasias retrolenticulares , escleroderma, granulaciones, hemangioma; tracoma, articulaciones hemofílicas, adhesiones vasculares, cicatrices hipertróficas, enfermedades o condiciones asociadas con inflamación aguda o crónica, enfermedades o condiciones asociadas con inflamación crónica del pulmón que incluyen asma, sarcoidosis, enfermedades inflamatorias del intestino, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. La célula endotelial es cualquier célula endotelial que está experimentando proliferación y/o migración, que incluye una célula endotelial que experimenta proliferación en respuesta a uno o a varios estímulos angiogénicos en un sistema biológico, o células endoteliales que tienen la capacidad de experimentar proliferación en respuesta a uno o varios estímulos angiogénicos . En una modalidad, la proliferación y/o migración de células endoteliales está asociada con la angiogénesis descontrolada o no deseada en el sistema biológico . En una modalidad, la presente invención se puede utilizar para prevenir y/o tratar el cáncer en un sujeto, mediante la inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales. Ejemplos de cánceres incluyen carcinoma, cáncer de vejiga, cáncer óseo, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colorrectal que incluye cáncer del colon, recto, ano y apéndice, cáncer del esófago, enfermedad de Hodgkin, cáncer renal, cáncer de la laringe, leucemia, cáncer hepático, cáncer pulmonar, linfoma, melanoma, molas y nevos displásicos, mieloma múltiple, cáncer muscular, linfoma no de Hodgkin, cáncer oral, cáncer ovárico, cáncer del páncreas, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer de la piel, cáncer del estómago, cáncer testicular, teratoma, cáncer de la tiroides, y cáncer del útero. La cantidad de la saponina esteroide administrada al sistema biológico no está limitada particularmente, y generalmente se encontrará en el intervalo tal que las células endoteliales objetivo se expondrán a una concentración desde 0.1 µ? hasta 20 µ? de la saponina esteroide . La saponina esteroide se puede distribuir en una forma y a una concentración adecuada para permitir que los agentes alcancen el sitio deseado de acción y tengan el efecto de inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales . La administración de la saponina esteroide puede estar dentro de cualquier tiempo adecuado para producir el efecto deseado de inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales. En un sujeto humano o animal, la saponina esteroide se puede administrar por ejemplo oralmente, parenteralmente, tópicamente o por cualquier otro medio adecuado, y por lo tanto se debe tomar en cuenta el tiempo de tránsito del agente. Por ejemplo, la administración de la saponina esteroide al sujeto en las diversas modalidades de la presente invención puede ser en un momento o más, antes del inicio de la proliferación y/o migración de células endoteliales, y/o simultáneamente con la proliferación y/o migración de células endoteliales que esté ocurriendo. Como se analizó previamente en la presente, la saponina esteroide se puede formular y administrar al sujeto en una forma adecuada y de una manera adecuada. En una modalidad, la saponina esteroide está en la forma de una composición adecuada para utilizarse con el fin de inhibir la angiogénesis . Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención proporciona una composición cuando se utiliza para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales en un sistema biológico, la composición incluye una cantidad eficaz de una saponina esteroide. La cantidad eficaz de la saponina esteroide que se va a administrar al sujeto no está limitada particularmente, siempre y cuando se encuentre dentro de tal cantidad y en tal forma que generalmente muestre un efecto útil o terapéutico. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" es la cantidad que, cuando se administra a un sujeto que necesita tratamiento, mejora el pronóstico y/o el estado del sujeto. La cantidad que se va a administrar a un sujeto dependerá de las características particulares de la proliferación y/o migración de células endoteliales que se va a inhibir, el modo de t administración, y las características del sujeto, tales como la salud general, otras enfermedades, la edad, el sexo, el genotipo, y el peso corporal. Una persona experta en la técnica tendrá la capacidad de determinar las dosificaciones apropiadas, dependiendo de estos y de otros factores . Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención proporciona el uso de una saponina esteroide en la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales en un sistema biológico. Como se analizó previamente en la presente, la administración y distribución de la saponina esteroide puede ser, por ejemplo, por la ruta intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, oral, o tópica, o por inyección directa en el sitio deseado de acción. El modo y la ruta de la administración en la mayoría de los casos dependerán del tipo de enfermedad o condición que se va a tratar, como se analizó previamente en la presente. La forma de dosificación, la frecuencia y la cantidad de dosis dependerán del modo y la ruta de administración. Típicamente, una composición inyectable se administrará en una cantidad de entre 5 mg/m2 y 500 mg/m2, preferentemente entre 10 mg/m2 y 200 mg/m2. Típicamente, una composición administrada oralmente se administrará en una cantidad de entre 5 mg y 5 g, preferentemente entre 50 mg y 1 g . Por ejemplo, una cantidad eficaz de la saponina esteroide típicamente oscila entre aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal por día y aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal por día, y en una forma entre 1 mg/kg de peso corporal por día y 100 mg/kg de peso corporal por día. Como se describió previamente en la presente, la administración de las composiciones de la saponina esteroide también puede incluir el uso de uno o varios aditivos farmacéuticamente aceptables, que incluyen sales, aminoácidos, polipéptidos, polímeros, solventes, amortiguadores, excipientes, conservadores y agentes de volumen, farmacéuticamente aceptables, tomando en consideración las características particulares físicas, microbiológicas y químicas de la saponina esteroide que se va a administrar. Como se describió previamente en la presente, las composiciones que contienen la saponina esteroide también pueden contener uno o varios agentes conservadores, amortiguadores, diluyentes, estabilizantes, agentes quelantes, agentes mejoradores de la viscosidad, agentes dispersantes, controladores del pH, o agentes isotónicos farmacéuticamente aceptables. Estos excipientes son muy conocidos por los expertos en la técnica . La administración de la saponina esteroide puede incluir además la administración de un agente antiangiogénico, que incluyen anticuerpos anti-VEGF, que incluyen anticuerpos humanizados y quiméricos, aptámeros anti-VEGF y oligonucleótidos antisentido, angiostatina , endostatina, interferones, interleucina 1, interleucina 12, ácido retinoico, e inhibidores tisulares de metaloproteinasa-2 y -9.

La inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales en el sistema biológico se puede determinar por un método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, en el caso de proliferación celular, se pueden utilizar métodos tales como conteo celular, incorporación de 3 [H] -timidina, tinción inmunohistoquimica para proliferación celular, aparición retrasada de estructuras neovasculares, desarrollo lento de estructuras neovasculares, ocurrencia disminuida de estructuras neovasculares, severidad disminuida o lenta de efectos de la enfermedad dependientes de la angiogénesis, crecimiento angiogénico detenido, o regresión del crecimiento angiogénico previo. La determinación de la capacidad de una saponina esteroide para inhibir la proliferación de células endoteliales puede ser mediante un ensayo adecuado conocido en la técnica, en el cual se tratan las células y se mide la proliferación de células endoteliales. Por ejemplo, las células endoteliales vasculares umbilicales humanas se pueden cultivar in vi tro en el medio apropiado y se puede medir la proliferación de células endoteliales, por ejemplo, mediante la captación de timidina tritiada. La capacidad de un agente para inhibir la proliferación en tal ensayo entonces se puede probar al contactar las células endoteliales con el agente y determinar el grado de inhibición de proliferación que ocurre en cualquier concentración particular. En el caso de migración de células endoteliales, un ensayo adecuado es el Sistema de Angiogénesis BD BioCoatMR: Migración de Células Endoteliales. También se contempla que la saponina esteroide de la presente invención será adecuada para utilizarse con el fin de reducir la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico. Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención proporciona un método para reducir la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico para lograr un nivel deseado de inhibición de proliferación y/o migración de células endoteliales, el método incluye la etapa de administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esteroide. La cantidad eficaz de la saponina esteroide que se va a administrar no está limitada particularmente, siempre y cuando esté dentro de tal cantidad que muestre generalmente un efecto farmacológicamente útil para reducir la cantidad de agente necesario para lograr un nivel deseado de inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales en el sistema, biológico. La administración de la saponina esteroide puede estar dentro de cualquier tiempo adecuado para producir el efecto deseado de reducción de la cantidad de un agente administrado a un sistema biológico, necesario para lograr un nivel deseado de inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales en el sistema biológico. Como se analizó previamente en la presente, en un sujeto humano o animal, la saponina esteroide se puede administrar por ejemplo oralmente, parenteralmente, tópicamente o por cualquier otro medio adecuado, y por lo tanto se debe tomar en cuenta el tiempo de tránsito del fármaco. Como se describió previamente en la presente', los ejemplos de agentes antiangiogénicos incluyen anticuerpos anti-VEGF, que incluyen anticuerpos humanizados y quiméricos, aptámeros anti-VEGF y oligonucleótidos antisentido, angiostatina , endostatina, interferones , interleucina 1, interleucina 12, ácido retinoico, e inhibidores tisulares de metaloproteinasa-2 y -9. A este . respecto, la cantidad del agente antiangiogénico necesaria para lograr un nivel deseado de inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales, se determinará empíricamente por un método conocido en la técnica, y como tal dependerá del nivel deseado que se va a inhibir, de la edad y peso corporal del sujeto, y de la frecuencia de administración. La administración del agente antiangiogénico estará en una forma adecuada y dentro de un tiempo adecuado para producir el efecto deseado de inhibir la angiogénesis al nivel deseado. Los métodos para formular y administrar agentes antiangiogénicos son conocidos en la técnica. La administración de la saponina esteroide puede ocurrir al mismo tiempo y de la misma manera que la administración del agente antiangiogénico .

Alternativamente, la administración de la saponina esteroide puede ser separada a la administración del agente antiangiogénico, y ocurrir en un tiempo farmacológicamente apropiado, antes o después de la administración del agente. La presente invención también proporciona un producto de combinación para la coadministración o separada de una saponina esteroide y un agente antiangiogénico a un sujeto, para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales . En este caso, el producto de combinación incluye la saponina esteroide para la administración separada al sujeto de una forma adecuada, o alternativamente, para la coadministración al sujeto de una forma adecuada . Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención proporciona un producto de combinación que incluye una saponina esteroide y un agente antiangiogénico, la saponina esteroide y el agente antiangiogénico proporcionados en una forma para la coadministración a un sujeto o en una forma para la administración separada a un sujeto. Los componentes del producto de combinación se pueden envasar separadamente o juntos en recipientes esterilizados adecuadamente tales como ampolletas, botellas, o frascos, ya sea en formas de dosificación unitaria o de dosis múltiples. Los recipientes típicamente están herméticamente sellados. Los métodos para el envasado de los componentes son conocidos en la técnica. Como se analizó previamente en la presente, la coadministración puede ser secuencial o simultánea y generalmente significa que los agentes están presentes en el sujeto durante un intervalo de tiempo especificado. Típicamente, si se administra un segundo agente dentro de la vida media del primer agente, los dos agentes se consideran coadministrados. Los métodos para la preparación de composiciones farmacéuticas son conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe en Remiñgton' s Pharmaceutical Sciences, 18a ed., 1990, Mack Publishing Co . , Easton, Pa . ; U.S. Pharmacopeia : National Formulary, 1984, Mack Publishing Company, Easton, Pa . ; y M.E. Aulton, Pharmaceutics , The Science of Dosage Form Design, 2a ed., Churchill Livingstone, Edinburgh, 2002. La distribución terapéutica de biomoléculas se describe generalmente en Bladon, C. (2002) "Pharmaceutical Chemistry: Therapeutic Aspects of Biomolecules" John Wiley & Sons Ltd.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ESPECÍFICAS Ahora se hará referencia a experimentos que ejemplifican los principios generales anteriores de la presente invención. Sin embargo, se debe entender que la siguiente descripción no es para limitar la generalidad de la descripción anterior.

Ejemplo 1 Ma teriales Diosgenina, dioscina (diosgenina Rha2, [Rha4], Glc) , deltonina (diosgenina Rha2, [Glc4], Glc) y trilina (diosgenina-Glc) se obtuvieron comercialmente de Ningbo Hanpharm Biotech Co. Ltd., la gracilina de ChromaDex, y la trilina de Aktin Chemicals. Prosapogenina A: diosgenina Rha2, Glc se sintetizó de acuerdo con el método descrito por Li et al Carbohydr, Res., (2001) 331, 1-7. La dioscina y la prosapogenina A también se aislaron de París polyphylla. Sorafenib se obtuvo comercialmente.

Ejemplo 2 Evaluación de los efectos de deltonina sobre el crecimiento de vasos en explantes aórticos Tres ratones machos C57BL6/J (de 9 semanas de edad) se sacrificaron por asfixia de C02 y se recolectó la sangre por punción cardiaca utilizando una aguja de calibre 29. Después la aorta se disecó (del arco aórtico hacia la interfaz pleural/peritoneal) y se colocó en DMEM enfriado en hielo suplementado con Hepes 10 mM y penicilina/estreptomicina . Los tejidos fibrosos y adiposos que rodean a la aorta se eliminaron por disección microscópica y la aorta se lavó con sangre abundantemente utilizando DMEM enfriado en hielo. Después la aorta se bisecó longitudinalmente y se cortó en cuadros de aproximadamente 1 mm. Las piezas individuales de la aorta se incrustaron en una gota (20 µ?) de solución de colágeno en el fondo de un pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos. Después las placas se colocaron a 37°C/5% de C02 durante 10 minutos para polimerizar el colágeno en un gel. Después se agregó Medio (0.3 mi) solo, que contenia DMSO o deltonina en DMSO a cada pozo para formar un foso alrededor del gel de colágeno. Solamente los 8 pozos centrales de cada placa de 24 pozos se utilizaron para cultivos de explantes, para evitar intercambio gaseoso diferencial y velocidades de evaporación entre los pozos de muestras de explantes. Los pozos externos se llenaron con PBS. Se probaron nueve grupos de 8 réplicas cada uno: 1. Medio solo (EBM-2 suplementado con Hepes 10 mM y 2% de suero de ratón normal (I) ) . 2. Medio más 1 µ?/ml de DMSO (control diluyente para deltonina) (H) . 3. Medio más 1 µ?/ml de DMSO, deltonina 10 nM (G) 4. Medio más 1 µ?/ml de DMSO, deltonina 30 nM (F) 5. Medio más 1 µ?/ml de DMSO, deltonina 100 nM (E) 6. Medio más 1 µ?/ml de DMSO, deltonina 300 nM (D) 7. Medio más 1 µ?/ml de DMSO, deltonina 1 µ? (C) Medio más 1 µ?/ml de DMSO, deltonina 3 µ? 9. Medio más 1 µ?/ml de DMSO, deltonina 10 µ? (A) . Después los explantes se cultivaron a 37°C/5% de C02 en un incubador humidificado durante 6 días. Los explantes se fijaron a temperatura ambiente durante 20 minutos al agregar un volumen igual (0.3 mi) de 4% de paraformaldehído en PBS a cada pozo. Después de lavar tres veces con solución salina amortiguada con Hepes (HBS, NaCl 150 mM, Hepes 10 mM) los explantes se tiñeron con 10 µg/ml de conjugado de FITC-BS-l-lectina (lectina BS-1 específicamente se enlaza a células endoteliales de ratón) en HBS toda la noche a 4°C. Al siguiente día los explantes se lavaron tres veces con HBS. Las excrecencias de los vasos provenientes de los explantes se visualizaron por microscopio de fluorescencia y se tomaron fotografías para el análisis de los datos. Se fotografiaron múltiples imágenes fluorescentes con foco a múltiples profundidades para cada explante y las fotografías se procesaron utilizando software deconvolution de modo que se pudo determinar la excrecencia del vaso total para cada explante. El crecimiento celular total asociado con- cada explante también se visualizó por microscopio luminoso utilizando un microscopio de disección y se documentó por fotografía. Para facilidad de visualización y análisis, se preparó una imagen en blanco y negro, invertida compuesta a partir de las múltiples imágenes fluorescentes de las excrecencias de los vasos para cada explante. El número de brotes de los vasos y el número- de ramas de los vasos para cada explante también se contó con el conteo personal en ciego para la identidad de cada muestra. Los resultados se resumen en la Tabla 4, y se muestran gráficamente en la Figura 1.

Tabla 4 Nota: Los brotes y las ramificaciones de los vasos en explantes cultivados con Deltonina 0.01 µ? no son estadísticamente diferentes de cultivos de explantes control tratados con DMSO a pesar de una reducción aparente en la gráfica.

Existió un efecto inhibidor significativo solo de DMSO, el vehículo para deltonina, sobre la respuesta angiogénica como se observó por reducciones significativas en los brotes y ramificaciones de vasos en explantes aórticos tratados con DMSO en comparación con explantes aórticos cultivados sin DMSO. No obstante, altas concentraciones de deltonina inhibieron significativamente los brotes de vasos (a 10 y 3 µ?) y las ramificaciones de vasos (a 10, 3 y 1 µ?) a partir de explantes aórticos en comparación a cultivos de explantes control tratados con DMSO. Ejemplos representativos de las muestras se indican en las Figuras 2 y 3.

Ejemplo 3 Determinación de inhibición de proliferación y migración de células endoteliales por saponinas esteroides utilizando el método de ensayo AngioSpongeMR El ensayo AngioSpongeMR hace posible la liberación lenta del factor de crecimiento capturado por agarosa, el cual estimula la proliferación y migración de células endoteliales, y proporciona una matriz similar a tejido para la neovascularización . Por lo tanto el ensayo se puede utilizar para medir la eficacia de los tratamientos diseñados para inhibir la angiogénesis , determinada por conteo de vasos sanguíneos después de la tinción inmunohistoquimica con CD31 de las células endoteliales (McCarty et al, International Journal of Oncology, 21:5-10, 2002) . Espumas de gel (Pharmacia & Upjohn) se cortaron en piezas de aproximadamente 7x7x7 mm, bajo condiciones estériles, y se prerremojaron toda la noche con solución salina amortiguada con fosfato, estéril. Las espumas en gel hidratadas después se secaron parcialmente. El factor de crecimiento (bFGF) se diluyó a una concentración inicial de 2 pg/ml en agarosa al 0.4% caliente (37°C). Las espumas en gel secadas parcialmente se colocaron en la solución de factor de crecimiento, o en agarosa al 0.4% caliente sin factor de crecimiento, y después se transfirieron a una cápsula de Petri que contenia agarosa al 0.4% caliente (dilución 1:1, concentración del factor de crecimiento final 1 pg/ml) para la polimerización y solidificación. A 70 ratones hembras C3H/Hej se les colocaron microchips, se pesaron y se clasificaron aleatoriamente con base en el peso corporal en 7 grupos, con 10 ratones por grupo. Para la implantación, los ratones se anestesiaron por inhalación de halotano. Se forjó un pequeño canal con una aguja de trocar entre la 3a y la 4a glándulas mamarias, la esponja se insertó a toda la profundidad del canal y la incisión se cerró con un clip para heridas. Los compuestos se formularon en N- metilpirrolidona (NMP) : PEG300 :Agua (1:9:10, v/v) . Se estableció la dosis con base en los datos de IC5o in vitro y los estudios de toxicidad preliminares. Los compuestos se administraron diariamente por inyección intraperitoneal, a un volumen de dosificación de 10 ml/kg, una vez al día durante el periodo de estudio como se muestra en la Tabla Tabla 5 Tratamiento Dosificación una vez al día Vehículo NMP: PEG300 : Agua (1:9: 10, v/v) Vehículo + bFGF NMP: PEG300 : Agua (1:9: 10, v/v) Dioscina + bFGF 10 mg/kg Deltonina + bFGF 10 mg/kg Trilina + bFGF 60 mg/kg Prosapogenina A + bFGF 20 mg/kg Sorafenib + bFGF 60 mg/kg El tratamiento se inició cuando todos los animales se hubieron recuperado totalmente de la anestesia, y se continuó durante 10 días. En el día 11, se extirparon las angioesponj as y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido con OCT por la tinción con CD31 en secciones congeladas . CD31/PECAM-1 es un antígeno presente específicamente en células endoteliales y por lo tanto se puede utilizar como un marcador para los vasos sanguíneos. Las muestras congeladas de la esponja se crioseccionaron (12 µ?) , se montaron sobre portaobjetos Plus positivamente cargados (Fisher Scientific) , y se secaron en el aire durante 30 minutos. Las secciones congeladas se fijaron a su vez en acetona fría, acetona/cloroformo (1:1, v/v) , y acetona durante 5 minutos cada una, y luego se lavaron con PBS (solución salina amortiguada con fosfato) . Después de bloqueo con PBS que contenía suero de caballo normal al 5% y suero de cabra normal al 1%, las secciones se incubaron con anticuerpo CD31 antirratón de rata monoclonal PECAM-1 (1:5000 en solución de bloque, PharMingen, San Diego, CA) durante 4 horas a temperatura ambiente. Los portaobjetos después se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con anticuerpo antirrata secundario adecuado. Las reacciones positivas se visualizaron mediante la incubación de los portaobjetos en 3, 3' -diaminobencidina estable durante 5-10 minutos. Las secciones se enjuagaron con agua destilada, se contratiñeron con hematoxilina de Gilí durante 1 minuto y se montaron con Universal Mount (Research Genetics) . Las muestras control expuestas a anticuerpo secundario solo, mostraron tinción inespecífica . Se utilizó placenta de ratón como un control positivo. Para la cuantificación , se eligieron 3 campos visuales independientes y se contaron las manchas o los vasos teñidos positivos con lumen. Los resultados se presentan como el número promedio de vasos sanguíneos (cuentas de CD31) y se resumen en la Tabla 6: Tabla 6 La Inducción Porcentual para un tratamiento es la diferencia en las cuentas de CD31 entre el tratamiento (+bFGF) y el vehículo solo (sin bFGF), dividida entre la diferencia en las cuentas de CD31 entre el vehículo con bFGF y el vehículo solo (sin bFGF), expresado como un porcentaje . El número de vasos sanguíneos y la inducción porcentual se presentan gráficamente contra los tratamientos en las Figuras 4 y 5. Los resultados demuestran que las saponinas esteroides provocan una reducción en la angiogénesis en el sistema de modelo de angioesponja.

Ejemplo 3 Determinación de inhibición de proliferación y migración de células endoteliales por saponinas esteroides utilizando el método de ensayo AngioChamber1* El ensayo AngioChamberMR utiliza el proceso fisiológico normal de curación de heridas, el cual promueve la formación de una cápsula fibrosa alrededor de una cámara implantada (Wood et al, (2000) Cáncer Research, 60 (8) :2178-89) . La inclusión de bFGF en la cámara induce el desarrollo de los vasos sanguíneos en la cápsula fibrosa. Por lo tanto el ensayo evalúa la eficacia de los tratamientos al medir su efecto tanto en la formación de la cápsula fibrosa, medida por el peso húmedo de la cápsula al final del estudio y mediante la determinación del suministro de vasos sanguíneos a la cámara al probar el contenido de hemoglobina. El contenido de hemoglobina de la cápsula fibrosa es una medida de la neovascularización, la cual se evalúa por el ensayo de Drabkin. Las angiocámaras fueron cámaras de tejido poroso elaboradas de perfluoro-alcoxi-Teflón y se llenaron con agar al 0.8% que contenia 20 Ul/ral de heparina, con o sin 1 pg/ml de bFGF humano. Ambos extremos de la cámara se sellaron con tapas removibles del mismo material. Las cámaras se sellaron bajo condiciones estériles con agar al 0.8% que contenia 20 Ul/ml de heparina, con o sin 1 g/ml de bFGF humano. La solución de agarosa se mantuvo a 37 °C antes de llenar las cámaras. A 70 ratones hembras FvB se les colocaron microchips, se pesaron y se clasificaron aleatoriamente con base en el peso corporal en 7 grupos, con 10 ratones por grupo. Para la implantación, los ratones se anestesiaron por inhalación de halotano. Se inyectaron aproximadamente 150 µ? de aire filtrado estéril subcutáneamente en el lomo de cada ratón, entre los omóplatos, dando por resultado una bolsa de aire en la cual se efectuó una pequeña incisión y se insertó la cámara. La herida se cerró con dos clips para heridas de 1.4 mm. Todos los tratamientos que se formularon en NMP: PEG300 : Agua (1:9:10, v/v) y se administraron diariamente por inyección intraperitoneal , se dan en la Tabla 7: Tabla 7 Tratamiento Dosificación una vez al día Vehículo NMP: PEG300: Agua (1:9: 10, v/v) Vehículo + bFGF NMP: PEG300: Agua (1:9: 10, v/v) Dioscina + bFGF 10 mg/kg Deltonina + bFGF 10 mg/kg Trilina + bFGF 60 mg/kg Prosapogenina A + bFGF 20 mg/kg Sorafenib + bFGF 60 mg/kg El tratamiento se inició cuando todos los animales se hubieron recuperado totalmente de la anestesia y se continuó durante 5 días. En el día 6, se retiraron las cámaras fibrosas vascularizadas y se registró el peso húmedo para cada implante. La cámara proveniente de cada ratón después se congeló rápidamente con nitrógeno líquido y se almacenó a -20°C hasta que se evaluó para el contenido de hemoglobina. Las muestras de cápsula fibrosa se descongelaron y se mantuvieron en hielo durante el procedimiento. Se agregó agua estéril a cada muestra descongelada, y la muestra se homogeneizó con un aparato UltraTourax a alta velocidad. Para evitar la contaminación cruzada, el aparato UltraTourax se lavó abundantemente durante 30 segundos con 5 mi de agua destilada, después de la homogeneización de cada muestra. El homogeneizado se transfirió en tubos Eppendorf de 2 mi y se almacenó en hielo. Los tubos Eppendorf se centrifugaron a 4°C y a alta velocidad (fuerza centrifuga relativa (RCF) de 14,000) durante 60 minutos. 1.0-1.5 mi de la solución acuosa intermediaria (homogeneizado) , entre la pella y la capa grasa, se transfirieron a tubos Eppendorf de 1.5 mi recién marcados y se almacenaron en hielo. 50 µ? de cada homogeneizado se transfirieron en pozos separados de una placa de 96 pozos. 50 µ? de agua se transfirieron en 2 pozos como blancos. 50 µ? del reactivo de Drabkin se agregaron a cada pozo y se mezclaron. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, se midió la absorbancia de cada muestra a 540 nm y el volumen de la sangre para cada muestra se calculó a partir de una curva estándar . Los resultados se presentan como el peso de la cámara promedio, el contenido promedio de sangre (a partir del contenido de hemoglobina, y la Inducción Porcentual) , y se resumen en la Tabla 8 : Tabla 8 La Inducción Porcentual para un tratamiento es la diferencia en el contenido de sangre entre el tratamiento (+bFGF) y el vehículo solo (sin bFGF) , dividido entre la diferencia en el contenido de sangre entre el vehículo con bFGF y el vehículo solo (sin bFGF) , expresado como un porcentaj e . El contenido promedio de sangre de las angiocámaras y la inducción porcentual se presentan gráficamente contra los tratamientos en las Figuras 6 y 7. Los resultados demuestran que las saponinas esteroides provocan una reducción en la angiogénesis en el sistema de modelo de angioesponja . Finalmente, se apreciará que varias modificaciones y variaciones de los métodos y composiciones de la presente invención, descritas en la presente serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en relación con modalidades específicas, se debe comprender que la invención como se reclama no se debe limitar indebidamente a tales modalidades específicas. Desde luego, se pretende que varias modificaciones a los métodos descritos para llevar a cabo la invención que sean evidentes para los expertos en la técnica, estén dentro del alcance de la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Método para inhibir la angiogénesis en un sistema biológico, el método incluye administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esteroide. 2. Método según la reivindicación 1, en donde la saponina esteroide incluye un sacárido acoplado a una posición simple del componente de sapogenina de la saponina esteroide . 3. Método según la reivindicación 2, en donde el sacárido está acoplado a la posición C-3 de la sapogenina . 4. Método según las reivindicaciones 2 ó 3, en donde el sacárido incluye una o varias unidades de monosacárido seleccionadas entre D-glucosa (Glc) , L-ramnosa (Rha) , D-galactosa (Gal), ácido D-glucurónico (GlcA) , D-xilosa (Xyl), L-arabinosa . (Ara), D-fucosa (Fue), ácido D-galacturónico (GalA) . 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el componente de sapogenina de la sapogenina esteroide se basa en una sapogenina seleccionada entre el grupo que consiste de un espirostanol, que incluye diosgenina, yamogenina (neodiosgenina) , yucagenina, sarsasapogenina, tigogenina, esmilagenina, hecogenina, gitogenina, convalamarogenina, neoruscogenina, y solagenina; un furostanol que incluye protodiosgenina, pseudoprotodiosgenina, metil-protodiosgenina, protoyamogenina y metil-protoyamogenina. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la saponina esteroide es una chacotriósido-saponina esteroide. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la saponina esteroide es una solatriósido-saponina esteroide. 8. Método según la reivindicación 6, en donde la chacotriósido-saponina esteroide se selecciona entre el grupo que consiste de diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a chacotriosa ; diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a otro chacotriósido; tigogenina enlazada a través de la posición C-3 a un chacotriósido; sarsasapogenina enlazada a través de la posición C-3 a un chacotriósido; esmilagenina enlazada a través de la posición C-3 a un chacotriósido; yucagenina enlazada a través de la posición C-3 a un chacotriósido; y yamogenina enlazada a través de la posición C-3 a un chacotriósido. 9. Método según la reivindicación 7, en donde la solatriósido-saponina esteroide se selecciona entre el grupo que consiste de gracilina; deltonina; diosgenina-solatriosa; diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a otro solatriósido; tigogenina enlazada a través de la posición C-3 a un solatriósido; sarsasapogenina enlazada a través de la posición C-3 a un solatriósido; esmilagenina enlazada a través de la posición C-3 a un solatriósido; yucagenina enlazada a través de la posición C-3 a un solatriósido; y yamogenina .enlazada a través de la posición C-3 a un solatriósido. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, " en donde la saponina esteroide tiene la fórmula química: R27B en donde Ri R2, 4, e, R , R11, 12/ i4r R15 y R17 son independientemente H, OH, =0, grupos éster farmacológicamente aceptables o grupos éter farmacológicamente aceptables; R5 es H cuando C-5,C-6 es un enlace simple, y ninguno cuando C-5,C-6 es un enlace doble; A es O simultáneamente con B que es CH2, o B es 0 simultáneamente con A que es CH2; R27A es H simultáneamente con R27B que es CH3, o R27A es CH3 simultáneamente con R27B que es H; R3 comprende un grupo glicosilo enlazado a través del átomo de oxigeno a la sapogenina esteroide en C-3; o una sal o derivado del mismo, farmacéuticamente aceptable. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la saponina esteroide tiene la fórmula química: R27A R, en donde Ri, R2, R4/ Re, 7, R11, R12, Ri4 R15 y Rn son independientemente H, OH, =0, grupos éster farmacológicamente aceptables o grupos éter farmacológicamente aceptables; R5 es H cuando C-5,C-6 es un enlace simple, y ninguno cuando C-5,C-6 es un enlace doble; R22 es un grupo hidroxilo o uno alcoxilo cuando C-20, C-22 es un enlace simple, o ninguno cuando C-20, C-22 es un enlace doble; R27A es H simultáneamente con R27B que es CH3, o R27A es CH3 simultáneamente con R27B que es H; R28 es H o un sacárido; o una sal, o derivado del mismo farmacéuticamente aceptable; R3 comprende un grupo glicosilo enlazado a través de un átomo de oxigeno a la sapogenina esferoide en C-3; o una sal, o derivado del mismo farmacéuticamente aceptable. 12. Método según la reivindicación 1, en donde la saponina esferoide es diosgenina enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. 13. Método según la reivindicación 1, en donde la saponina esferoide es tigogenina enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. 14. Método según la reivindicación 1, en donde la saponina esteroide es sarsasapogenina enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. 15. Método según la reivindicación 1, en donde la saponina esteroide es esmilagenina enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. 16. Método según la reivindicación 1, en donde la saponina esteroide es yucagenina enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. 17. Método según la reivindicación 1, en donde la saponina esteroide es yamogenina enlazada a través de la posición C-3 a un sacárido. 18. Método según la reivindicación 1, en donde la saponina esteroide se selecciona entre el grupo que consiste de deltonina (diosgenina Rha2, [Glc4], Glc) , dioscina (diosgenina Rha2, [Rha4], Glc), prosapogenina A (diosgenina Rha2, Glc) y asperina (diosgenina [Rha 4, Rha ] , Rha 2, Glc) . 19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde el método incluye además la administración de un agente antiangiogénico al sistema biológico . 20. Método según la reivindicación 19, en donde el agente antiangiogénico es uno o varios agentes seleccionados entre el grupo que consiste de un anticuerpo anti-VEGF, que incluye un anticuerpo humanizado y/o quimérico, un aptámero anti-VEGF, un oligonucleótido antisentido del VEGF, angiostatina, endostatina, un interferón, interleucina 1, interleucina 12, ácido retinoico, y un inhibidor tisular de metaloproteinasa-2 y -9. 21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el sistema biológico es un sujeto humano o animal. 22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en donde la angiogénesis en el sistema biológico es angiogénesis asociada con la formación o expansión de tumores sólidos, angiofibroma, neovascularización corneal, neovascularización retinal/coroidal , retinopatia diabética, degeneración macular relacionada con la edad, malformaciones arteriovenosas , artritis, artritis reumatoide, osteoartritis , artritis psoriática, lupus, trastornos del tejido conectivo, síndrome de Osler-Weber, placas ateroscleróticas, psoriasis, granuloma piogénico, fibroplasias retrolenticulares, escleroderma, granulaciones, hemangioma; tracoma, articulaciones hemofílicas, adhesiones vasculares, cicatrices hipertróficas, enfermedades o condiciones asociadas con inflamación aguda o crónica, enfermedades o condiciones asociadas con inflamación crónica del pulmón que incluyen 4' asma, sarcoidosis, enfermedades inflamatorias del intestino, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. 23. Uso de una saponina esteroide en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis en un sistema biológico. 24. Composición que incluye una saponina esteroide y un agente antiangiogénico . » 25. Método para reducir la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico para lograr un nivel deseado de inhibición de la angiogénesis, el método incluye administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esteroide. Método para inhibir la proliferación migración de células endoteliales en un sistema biológico, el método incluye administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esferoide. 27. Composición cuando se usa para inhibir la proliferación y/o migración de células endoteliales en un sistema biológico, la composición incluye una cantidad eficaz de una saponina esferoide. 28. Uso de una saponina esferoide en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis por proliferación y/o migración de células endoteliales en un sistema biológico. 29. Método para reducir la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico para lograr un nivel deseado de inhibición de proliferación y/o migración de células endoteliales, el método incluye administrar al sistema biológico una cantidad eficaz de una saponina esferoide. 30. Producto de combinación que incluye: una saponina esferoide; y un agente antiangiogénico; la saponina esferoide y el agente antiangiogénico se proporcionan en una forma para la coadministración a un sujeto o en una forma para la administración separada a un suj eto . 31. Composición farmacéutica que incluye deltonina . 32. Uso de deltonina en la preparación de un medicamento . 33. Uso de deltonina según la reivindicación 32, en donde el medicamento se utiliza para una o varias de inhibición de angiogénesis , inhibición de proliferación y/o migración de células endoteliales , prevención y/o tratamiento de un cáncer en un sujeto, prevención del crecimiento de un tumor primario y/o uno secundario, inhibición y/o prevención de metástasis y reducción de la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico para lograr un nivel deseado de inhibición de la angiogénesis. 34. Composición farmacéutica que incluye prosapogenina A. 35. Uso de prosapogenina A en la preparación de un medicamento. 36. Uso de prosapogenina A según la reivindicación 35, en donde el medicamento se utiliza para una o varias de inhibición de angiogénesis , inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales, prevención y/o tratamiento de un cáncer en un sujeto, prevención del crecimiento de un tumor primario y/o uno secundario, inhibición y/o prevención de metástasis y reducción de la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico para lograr un nivel deseado de inhibición de la angiogénesis. 37. Composición farmacéutica que incluye asperina . 38. Uso de asperina en la preparación de un medicamento . 39. Uso según la reivindicación 38, en donde el medicamento se utiliza para una o varias de inhibición de angiogénesis, inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales, prevención y/o tratamiento de un cáncer en un sujeto, prevención del crecimiento de un tumor primario y/o uno secundario, inhibición y/o prevención de metástasis; y reducción de la cantidad de un agente antiangiogénico administrado a un sistema biológico para lograr un nivel deseado de inhibición de la angiogénesis.