TWI421083B - 用於抑制血管新生之方法及組成物 - Google Patents

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Description

用於抑制血管新生之方法及組成物 發明領域
本發明與抑制血管發生的方法和組成物有關。
本發明也與抑制內皮細胞增殖及/或遷移的方法和組成物有關。
 發明背景
血管發生是在一稱為「出芽」的過程中藉由內皮細胞的生長和遷移由已存在的血管形成。
內皮細胞的生長在血管新生的過程中為一重要步驟。器官具有被稱為基底膜的周圍無細胞結構界定的明顯邊界，該基底膜是由細胞外基質(ECM)蛋白質結構所組成，主要是層黏蛋白，第IV型膠原及醣蛋白。血管發生始於環繞與血管管腔排齊之內皮細胞的基底膜侵蝕。基底膜之侵蝕是因內皮細胞和白血球釋放的酶所引起。當被血管新生刺激物誘發時內皮細胞接著經由被侵蝕的基底膜遷移。遷移細胞形成母血管之一“芽”。遷移內皮細胞增殖，且芽合併形成微血管環，如此形成一新血管。
血管發生之控制是一受高度調控的過程，包含許多血管新生刺激物與抑制物的作用。受控制與不受控制的血管發生被認為是以類似方式進行。正常的生理學條件下，人類和動物只在非常特定的受限制情況下經歷血管發生。舉例而言，血管發生通常在傷口癒合，胎兒及胚胎發育、以 及黃體、子宮內膜和胎盤形成時被觀察到。
然而，非受抑制或非想望的血管發生與許多疾病及情況相關。血管發生之誘發為癌症之一標誌，其特徵是將腫瘤細胞散佈在身體各處。腫瘤細胞從一原發的位置遷移到一第二位置的過程為「轉移」，為良性與惡性生長之間的一項差異，代表癌症的主要臨床問題。不幸地，超過50%的實質固態瘤在診斷時已轉移。
血管發生在腫瘤生長中之角色的證據廣泛且一般公認任何實質固態瘤的生長極大程度上需仰賴此一過程。血管發生在腫瘤發展的兩個階段中扮演重要角色。首先，血管發生是一瘤體生長超過數毫米之一尺寸所需。若無新脈管系統形成，在瘤體中的細胞將不能接受發展超過此一小尺寸的充份血液供應。惟一旦腫瘤的血管形成開始，則瘤體可能擴大。
腫瘤的血管形成也在繼發性腫瘤的發展中扮演重要角色。腫瘤的血管形成使腫瘤細胞進入血流並循環於身體各處。腫瘤細胞已離開原發位置且安定於一繼發(轉移)位置之後，更進一步的血管發生會使繼發性瘤體生長且增大。因此，預防血管發生可能不僅導致腫瘤在其原發位置縮小，且亦能抑制或減少腫瘤細胞由原發位置遷移到身體其他部位(轉移)。
除腫瘤形成外，也有各種不同的疾病和情況由血管發生引起，或與不受抑制或非想望之血管發生相關。這些包括糖尿病視網膜病變、晶狀體後纖維膜增生症、新生血管 性青光眼、牛皮癬、血管纖維瘤、免疫性及非免疫性發炎(包括風濕性關節炎)、在動脈硬化斑塊、血管瘤和卡波西氏瘤中的微血管增殖。血管發生也能在一類風濕性關節中發生，因使白血球得以流入隨後釋放炎性介質而加速關節破壞。
血管發生也對特定眼病變，例如眼部新生血管性疾病患者的角膜和視網膜具有重大的關鍵性影響。此一疾病的特徵為新血管侵入眼睛結構如視網膜或角膜。這是失明的最常見的原因且和許多眼睛疾病有關。在老年黃斑病變中，相關的視力問題是因脈絡膜微血管因視網膜色素上皮下方的維管組織增殖經由布魯赫氏膜缺損向內生長所引起。
慢性發炎也可能牽涉病理血管發生。疾病症狀諸如潰瘍性結腸炎和克隆氏病隨著新血管向內生長至發炎組織內顯示組織學變化。另一與血管發生相關的病理角色在動脈粥狀硬化中被發現。血管管腔內所形成的斑塊已被證明具有血管新生的刺激活性。
生殖及傷口癒合也涉及血管發生。在生殖方面，血管發生是排卵以及受精後囊胚著床之一重要步驟。防止血管發生可利用來誘發停經、阻塞排卵、或防止囊胚著床。就傷口癒合而言，過度修復或纖維增生可能為外科手術之一有害副作用，且可能因血管發生引起或惡化。黏附是手術的一種常見術後併發症且引起種種問題諸如小腸阻塞。
目前對牽涉不受控制或非想望之血管發生的疾病治療 是不充分的。因此需要可抑制不受控制或非想望之血管發生的新方法以及組成物。
本發明起於對甾體皂苷具有抗血管新生能力的測定，且與抑制血管發生的方法及組成物有關。
本文中所參考列為習知技術的專利文件或其他內容並不視為承認該文件或內容為習知者、或其所包含的資料屬於申請專利範圍任一項之優先權日當時的普通一般性知識。
 發明概要
本發明起於對甾體皂苷抑制癌抑制血管發生能力的研究。尤其已發現甾體皂苷在許多活體內或試管內模型系統中具有抑制血管發生的能力。此一發現顯示甾體皂苷具有重要的抗血管新生能力。
因此，本發明提供一種抑制一生物系統中之血管發生的方法，該方法包括給予該生物系統一有效量的一甾體皂苷。
本發明也提供一當被使用時可在一生物系統中抑制血管發生的組成物，此組成物包括一有效量的一甾體皂苷。
本發明也提供一甾體皂苷在一種抑制一生物系統中血管發生之藥物製備上的用途。
本發明也提供一包括一甾體皂苷與一血管新生抑制劑的組成物。
本發明也提供一種可減少達成需要水平之血管新生抑 制作用的血管新生抑制劑對一生物系統之給藥量的方法，此方法包括對生物系統給予一有效量之一甾體皂苷。
本發明也提供一種抑制生物系統中之一內皮細胞增殖及/或遷移的方法，此方法包括給予生物系統一有效量之一甾體皂苷。
本發明也提供一種可被利用來抑制一生物系統中之內皮細胞增殖以及/或遷移的組成物，此組成物包括一有效量的一甾體皂苷。
本發明也提供一甾體皂苷在抑制一生物系統中內皮細胞增殖及/或遷移之藥物製備上的用途。
本發明也提供一種可減少達成需要水平之內皮細胞增殖及/或遷移抑制作用上對一生物系統之一血管新生抑制劑給藥量的方法，此方法包括給予該生物系統一有效量之一甾體皂苷。
本發明也提供一種組合產品，包括：一甾體皂苷；以及一血管新生抑制劑；甾體皂苷和血管新生抑制劑為是以對一實驗對象合併給藥的形式或對一實驗對象分開給藥的形式被提供。
本發明也提供包括一包括二角薯蕷皂苷寧的醫藥組成物。
本發明也提供二角薯蕷皂苷寧在一藥物製備上的用途。
本發明也提供一包含先桔梗皂苷元A的藥物組成物。
本發明也提供先桔梗皂苷元A在一藥劑製備中的用途。
本發明也提供一種包括阿斯匹林的藥物組成物。
本發明也提供阿斯匹林在一藥劑製備中的用途。
將被使用在說明書全文中的各種名詞所具有的意義應為說明書揭露對象之熟習發明技術範疇人士充分瞭解。但為易於參照起見，這些名詞中的某一部分將在此定義。
“醣”一詞使用在說明書中被意指一包含一醣(糖)部分(單醣、雙醣或多醣類)，連接一三萜烯或甾體或甾體生物鹼配醣體(非醣體)成分的化合物。雖然在本發明範圍內也設想到其他的連接，但在大多數的情況中，醣(糖)部分是連接配醣體的C-3位置。例如含有一接在C-26位置之醣之呋甾皂苷類，以及螺甾皂苷兩者皆為甾體皂苷的子類。
“皂苷”一詞使用在說明書中意指包含一連接配醣體之醣(糖)的糖苷，通常經由配醣體的C-3位置連接。
“甾體皂苷”一詞使用在說明書中意指一包含一或一個以上連接一不含氮原子之配醣體之醣單元(包括一或一個以上單醣、雙醣或多醣單元)的醣。
在此點上，將可了解“甾體皂苷”一詞範圍包含任何在提高抗癌療法活性之能力上功能性相當的該等化合物鹽類或其他衍生物。
一甾體“配醣體”亦稱為一“苷配基”或“皂苷元”，這些名詞在說明書中可交替使用且被理解為意指一皂苷分子的非醣部分。
“醣A-(1→n)-醣B”一詞使用在說明書中意指醣A由其C-1連接至醣B的C-n，n為一整數。
例如俗名為“查考茄三糖”的多醣為α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-[(α-L-鼠李吡喃糖基-(1→4))-(β-D-吡喃葡萄醣。依據IUPAC建議的化學命名法的縮寫形式為Rha 2, [Rha 4], Glc。
“實驗對象”一詞使用在說明書中意指任何的人類或動物實驗對象。在此點上，將可被了解的是本發明的範圍包括獸醫用途。例如，動物實驗對象可能是一哺乳類動物、一靈長類動物、一家畜動物(例如馬、母牛，綿羊，豬或山羊)，一伴侶動物(例如狗，貓)，一實驗動物(例如小鼠、大鼠、天竺鼠、鳥)，一具有獸醫價值的動物或一具有經濟價值的動物。
說明書中所使用的“治療”一詞及其變體意指用一有效量之甾體皂苷的治療介入。例如，本詞之範圍包含具有下列療效中一者或一者以上的治療介入：(i)在一實驗對象中抑制或阻止原發腫瘤的生長，包括減少切除術之後的原發腫瘤生長；(ii)在一實驗對象中抑制或者阻止一或一種以上次發腫瘤生長和形成；(iii)在一實驗對象中抑制或防止血管發生；(vi)在一實驗對象中抑制內皮細胞增殖及/或遷移；(v)改進實驗對象與未治療狀態相較的預期壽命；以及(vi)改進實驗對象與未治療狀態相較的生活品質。
“抑制”一詞在說明書中是指一程序進行中的減少，包括一方法之開始、速率、可能性、繼續或終止中的一或一者以上。
“血管發生”一詞使用在說明書全文中應理解為意指新 血管(“新生血管”生成，例如生成進入一組織或器官內。
“生物系統”一詞使用在說明書全文應理解意指任何多細胞系統且包括與整個生物體分離的細胞群。例如，生物系統可為組織培養中的細胞，一組織或器官、或一完整人類實驗對象，如受到非想望或不受控制之血管發生、或一與不受抑制或非想望之血管發生相關聯之疾病或情況影響的人類實驗對象。
“血管新生抑制劑”一詞使用在說明書全文應理解為意指一具抑制一生物系統的血管發生能力的藥劑。
圖式簡單說明
第1圖顯示增加二角薯蕷皂苷寧濃度對於從主動脈外植體上生長血管的影響。
第2圖繪示利用使用光學顯微鏡或Fitc-BS-1的凝集素染色觀察DMSO單獨對主動脈培殖體之影響的一代表性實例。
第3圖繪示使用光學顯微鏡檢查或Fitc-BS-1的的凝集素染色觀察10μM二角薯蕷皂苷寧對主動脈外植體之影響的一代表性實例。
第4圖繪示在血管海綿測定中薯蕷皂苷、二角薯蕷皂苷寧、trillin、先桔梗皂苷元A以及sorafenib對CD31之血管染色效果，此為這些化合物對於被誘導之平均血管數目之效果的指標。
第5圖繪示血管海綿中薯蕷皂苷、二角薯蕷皂苷寧、trillin、先桔梗皂苷元A及sorafenib在由bFGF誘導之血管發 生百分比上的效果。
第6圖繪示在血管腔體中薯蕷皂苷、二角薯蕷皂苷寧、trillin、先桔梗皂苷元A及sorafenib對血容量的效果。
第7圖繪示薯蕷皂苷、二角薯蕷皂苷寧、trillin、先桔梗皂苷元A及sorafenib對於血管腔體中因bFGF誘導之血管發生的效果。
 較佳實施例之詳細說明
如前文所述，本發明在一實施例中提供一種抑制一生物系統中之血管發生的方法，此方法包括給予該生物系統一有效量的一甾體皂苷。
在本發明各不同實施例中的生物系統為任何多細胞系統且包括與整個生物體分離的細胞群。例如，生物系統可為組織培養中的細胞、一組織或器官、或一完整人類實驗對象。例如，生物系統可能在組織培養，一組織或者器官或一受到非想望或不受控制之血管發生、或一與不受抑制或非想望之血管發生相關聯之疾病或情況影響的完整人類實驗對象。
在此點上，應瞭解生物系統是血管發生正在發生或可能發生的任何生物系統。
在一實施例中，生物系統是一人類的或動物實驗對象。在一特定的實施例中，生物系統是與一人類或動物實驗對象，該實驗對象中的血管發生與非想望或不受控制之血管發生引致之疾病或情況相關聯。
舉例而言，生物系統可為一罹受與以下症狀相關之血管發生或受其影響的人類或動物實驗對象：實質固態瘤之形成或擴張、血管纖維瘤、角膜新生血管、視網膜/脈絡膜新生血管、糖尿病視網膜病變、老年黃斑病變、動靜脈畸型、關節炎、類風濕性關節炎、骨關節炎、牛皮癬關節炎、狼瘡、結締組織病變、遺傳性出血性血管擴張症、粥狀動脈硬化斑塊、牛皮癬、葡萄菌腫、晶狀體後纖維組織增生症、硬皮病、肉芽形成、血管瘤、沙眼、血友病關節病變、血管黏附、增生性瘢痕，與急性或慢性發炎相關之疾病或情況，與肺慢性發炎相關之疾病或情況包括氣喘、類肉瘤病，發炎性腸疾病、克隆氏病或潰瘍性結腸炎。
在一實施例中，本發明可被用來防止及/或治療一實驗對象中之癌症。
在另一實施例中，本發明可被用來防止一原發及/或一次發腫瘤的生長，以及抑制及/或防止轉移病變。
癌症的例子包括癌、膀胱癌、骨癌、腦瘤、乳癌、子宮頸癌，大腸直腸癌，包含大腸、結腸、直腸、肛門和闌尾的癌症、食道癌、何杰金氏疾病、腎臟癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、疣與結構不良痣、多發性骨髓瘤、肌肉瘤、非何杰金氏淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌，胰臟癌，前列腺癌、肉瘤，皮膚癌，胃癌，睪丸癌，畸胎瘤，甲狀腺癌、及子宮癌。
在本發明的各不同實施例中實驗對象可能是一人類或實驗動物。
例如，動物的實驗對象可能是哺乳類動物、一靈長類動物、一家畜動物(例如馬、母牛、綿羊、豬或山羊)，一伴侶動物(例如狗、貓)，一實驗動物(例如小鼠、大鼠、天竺鼠、鳥)，一具有獸醫價值的動物或一具有經濟價值的動物。
在一實施例中，實驗對象是一人類實驗對象。
皂苷以往被分為三個主要類別：(i)三萜烯醣類；(ii)甾體糖苷類以及(iii)甾體生物鹼糖苷類。他們皆在配醣體上，通常是在C-3位置，連接有一或一個以上醣單元。甾體皂苷被一般性地記載在Hostettmann K及Marston A (2005)，Chemistry & pharmacology of natural products: Saponins. Cambridge University Press。
如前文所述，甾體皂苷在配醣體部分不含有一氮原子。
將可被理解地，在本發明的各不同實施例中的甾體皂苷包括自然存在的甾體皂苷和非自然存在的甾體皂苷(即化學合成甾體皂苷)。此外，亦將可理解在本發明的各不同實施例中的甾體皂苷也包括甾體皂苷的藥物前體，甾體皂苷的衍生物，例如包括任何酯類、酮類、羧酸類、鹽類、取代型態、鹵化型態或其他含有雜原子的型態、不飽和型態或任何其地官能衍生物。
在本發明各不同實施例中的甾體皂苷的醣部分可包括一或更多的醣單元，諸如一單醣、一雙醣單元或一多醣類單元。
亦將能被理解，本發明各不同實施例的甾體皂苷也可能包含一在配醣體部分的一或一個以上位置連接一糖的配 醣體。
在一實施例中，甾體皂苷包括一接在甾體皂苷的皂苷元成分之一單一位置上的醣。
如前文所探討，醣類單元可能是一單醣、一雙醣或一多醣。醣可由一適當單醣，諸如D-葡萄醣(Glc)、L-鼠李醣(Rha)、D-半乳醣(Gal)、D-葡萄糖醛酸(GlcA)、D-木醣(Xyl)、L-阿醣(Ara)、D-岩藻醣(Fuc)是一有取代基之糖，、D-半乳糖醛酸(GalA)所組成。醣單元也可能諸如一胺基糖、硫酸醣、醯化醣、N-醯化醣、和任何一種上述單醣的官能基衍生物。
同樣地，如前所述，一雙醣可能是二單醣的任何組合。
本發明各不同實施例的多醣可能是直線或有支鏈的，且包括兩種或兩種以上單醣的任一組合，包含前文中所記載的單醣。
在一實施例中，多醣類由1-6單醣單元所組成。
在此點上，且如前文中所述，多醣通常是記載為組成單醣的排列。
在一實施例中，甾體皂苷的醣由1單醣單元組成。單醣的一個例子是化學品名為β是葡萄醣-D-吡喃葡萄醣的葡萄糖，當其由C-3位置連接配醣體薯蕷皂苷元時有一俗名“延齡草”。
在另一實施例中，甾體皂苷的醣由二單醣單元組成。(即一雙醣)。雙醣的一個例子是Rha 2，化學名為α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)-β-d-吡喃葡萄醣的Glc，當其由C-3位置連接 配醣體薯蕷皂苷元時俗名為“先桔梗皂苷元A”。
在另一實施例中，多醣由三個3醣單元組成，即一三醣類。查考茄三糖苷是三醣單元的一個常見例子，其中三醣類的糖基包含兩個連結至一葡萄醣單元的鼠李醣單元，該葡萄糖單元再經糖苷鍵連至一皂苷元的C-3位置。查考茄三糖是α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-[α-L-鼠李吡喃糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄醣。依據IUPAC建議的命名縮寫形式Rha 2, [Rha4], Glc。
同樣地茄三糖苷是一由三醣類組成的糖基，包含一鼠李醣單元和一非鼠李醣單元，各自連接到一第三醣單元，第三醣單元復由一糖苷被鍵連至一皂苷元的C-3位置。
四醣類的一例是[Rha 4, Rha 4], Rha 2，化學名為[α-L-鼠李吡喃糖基(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖基(1→4)]-α-L-鼠李吡喃糖基(1→4)-β-d-吡喃葡萄醣的Glc，當其由C-3位置連接配醣體薯蕷皂苷元時俗名為“阿斯匹林”。
四醣類的另一例子是Glc 4, [Xyl 3], Rha 2, Ara，化學名稱為β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-[β-D-吡喃木糖-(1→3)]-α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)-α-L-阿拉伯糖苷。
如同前文中所討論，甾體皂苷在配醣體部分未含有一氮原子。
在一實施例中，本發明各實施例中的甾體皂苷是以下列化學式I或II之皂苷為基礎： 其中R1 、R2 、R4 、R6 、R7 、R11 、R12 、R14 、R15 和R17 獨立地為H，OH，=O、藥理學上可接受的酯基或藥理學上可接受的乙醚基；當C-5，C-6是一單鍵時R5 是H，當C-5，C-6是一雙鍵時不存在；B是CH2 的同時A是O，或A是CH2 的同時B是O; R27B 是CH3 的同時R27A 是H，或R27B 是CH3 的同時R27B 是H; R3 包括一經氧原子連接甾體皂苷之C-3的糖基；或一藥學上可接受的鹽、或其衍生物。
其中R1 、R2 、R4 、R6 、R7 、R11 、R12 、R14 、R15 和R17 獨立地為H，OH，=O、藥理學上可接受的酯基或藥理學上可接受的醚基；當C-5，C-6是一單鍵時R5 為H，且當C-5，C-6為一雙鍵時R5 不存在；當C-20，C-22是一單鍵時R22 是一氫氧基或一烷氧基，或當C-20，C-22是一雙鍵時R22 不存在；R27B 是CH3 的同時R27A 是H，或R27B 是H且同時R27A 是CH3 ; R28 是H或一醣類；或藥學上可接受的鹽、或其衍生物；R3 包含經氧原子連接於甾體皂苷之C-3的糖基；或一藥學上可接受的鹽、或其衍生物。
甾體皂苷元的例子包括螺甾烷醇配醣體，諸如薯蕷皂苷元、雅姆皂苷元(新皂苷元)、優卡皂苷元、菝契皂苷元、替告皂苷元、菝契皂苷元、海可皂苷元、吉托皂苷元、歐鈴蘭皂苷元、新羅斯考皂苷元和茄配質；以及呋甾烷醇配醣體，諸如原薯蕷皂苷元、偽原薯蕷皂苷元、甲基原薯蕷皂苷元、原雅姆皂苷元和甲基原雅姆皂苷元。
在一實施例中，甾體皂苷是一查考茄三糖苷-甾體皂苷。在另一實施例中甾體皂苷是一茄三糖苷-甾體皂苷。
查考茄三糖苷-甾體皂苷的例子包括“薯蕷皂苷”，其為經C-3位置連接一查考茄三糖之皂苷元“薯蕷皂苷元”，經C-3位置連接另一查考茄三糖苷之薯蕷皂苷元，經C-3位置 連接一查考茄三糖苷之替告皂苷元，經C-3位置連接一查考茄三糖苷之菝契皂苷元，經C-3位置連接一查考茄三糖苷的異菝契皂苷元，經C-3位置連接一查考茄三糖苷的優卡皂苷元，以及經C-3位置連接一查考茄三糖苷的雅姆皂苷元所組成。
茄三糖苷甾體皂苷的例子包括“纖細薯蕷皂苷”，是為經C-3位置連接茄三糖苷(Rha2, [Glc3], Glc)的薯蕷皂苷元；二角薯蕷皂苷寧(經C-3位置連接茄三糖苷Rha2、[Glc4]之薯蕷皂苷元[此一背景下，連接(Rha2, [Glc3]，Gal的薯蕷皂苷元稱為“茄三糖薯蕷皂苷元”]；經C-3位置連接另一茄三糖苷的薯蕷皂苷元；經C-3位置連接一茄三糖苷的替告皂苷元；經C-3位置連接一茄三糖苷的菝契皂苷元；經C-3位置連接一茄三糖苷的異菝契皂苷元；經C-3位置連接一茄三糖苷的優卡皂苷元，以及經C-3連接一茄三糖苷的雅姆皂苷元。
簡單的單醣甾體皂苷元類廣佈於植物界。單醣類通常經C-3位置與配醣體相連，且例子包括"trillin"，即由C-3位置連接葡萄醣的薯蕷皂苷元。其他由C-3位置連接葡萄醣的皂苷元包括菝契皂苷元、萬年青皂苷元和雅姆皂苷元。有些皂苷元由C-3位置連接另一單醣諸如阿醣，例如楊諾皂苷元和鈴蘭皂苷元或由C-3位置連接半乳醣等等。
雙醣甾體皂苷的例子包括經C-3位置連接例如(Xyl2, Gal 3);(Glc2, Glc 3);(Glc3, Glc 3)的菝契皂苷元；經C-3位置連接(Glc2, Glc3)(Glc2, Gal3)的異菝契皂苷元；經C-3 位置連接(Rha 2, Glc3)的沙漠皂苷元、替告皂苷元、吉托皂苷元、繡球蔥皂苷元(alliogenin)、羅斯考皂苷元、偏諾皂苷元、cepagenin及薯蕷皂苷元。
來自薯蕷屬品種的薯蕷皂苷元醣苷在甾體激素的起始原料上具有很大的商業利益。薯蕷皂苷元的醣和它的C-25同分異構物雅姆皂苷元最常在被證明的螺甾烷醇皂苷。
自然存在B-環中有C-5，C-6雙鍵的甾體螺甾烷醇皂苷例子列於表1中：
自然存在而在B-環有一C-5，C-6單鍵的甾體螺甾烷醇皂苷元實例列示於表2中：
自然存在且為B環中有一C-5，C-6雙鍵且E環中有一C-20，C-22單鍵之原螺甾烷醇型態的甾體呋甾烷醇皂苷元數個例子列示於表3中：
一自然存在，在B環中有一C-5，C-6雙鍵且在E-環中有一C-20，C-22雙鍵之偽螺甾烷醇型甾體呋甾烷醇皂苷元實例是原替告皂苷元。
一自然存在，在B環中有一C-5，C-6雙鍵且在E-環中有一C-20，C-22雙鍵之偽原螺甾烷醇型甾體呋甾烷醇皂苷元實例是偽原替告皂苷元。
在一實施例中，甾體皂苷是經C-3位置連接一醣的皂苷薯蕷皂苷元。
在另一實施例中，甾體皂苷是薯蕷皂苷或纖細薯蕷皂苷，其中薯蕷皂苷是經C-3位置連接查考茄三糖(Rha2, [Rha4], Glc)的皂苷薯蕷皂苷元且纖細薯蕷皂苷是由C-3位置連接茄三糖苷(Rha2, [Glc3], Glc)的薯蕷皂苷元。
在另一實施例中，甾體皂苷是二角薯蕷皂苷寧，其中二角薯蕷皂苷寧經由連接Rha 2, [Glc 4], Glc。
在另一實施例中，甾體皂苷是由C-3位置連接茄三糖(Rha2, [Glc3], Gal)的皂苷薯蕷皂苷元。此一情況下，連接(Rha2, [Glc3], Gal)的薯蕷皂苷元被稱為“茄三糖薯蕷皂苷元”。
在另一實施例中，甾體皂苷是由C-3位置連接一糖的皂苷薯蕷皂苷元。
在另一實施例中，甾體皂苷是由C-3位置連接一糖的皂苷替告皂苷元。
在另一實施例中，甾體皂苷是由C-3位置連接一糖的皂苷菝契皂苷元。
在另一實施例中，甾體皂苷是由C-3位置連接一糖的皂苷異菝契皂苷元。
在另一實施例中，甾體皂苷是由C-3位置連接一糖的皂苷優卡皂苷元。
在另一實施例中，甾體皂苷是由C-3位置連接一糖的皂苷雅姆皂苷元。
在另一實施例中，甾體皂苷是一以呋甾皂苷為基礎除鈴蘭糖苷(convallamaroside)之外的甾體皂苷。
在一特定實施例中，甾體皂苷擇自於由二角薯蕷皂苷寧(薯蕷皂苷元Rha2, [Glc4], Glc)、薯蕷皂苷(薯蕷皂苷元Rha2, [Rha4], Glc)、先桔梗皂苷元A(薯蕷皂苷元Rha2, Glc)和阿斯匹林(薯蕷皂苷元[Rha 4, Rha 4], Rha 2, Glc)所組成 之群組。
至於二角薯蕷皂苷寧，先桔梗皂苷A及阿斯匹林，這些甾體皂苷的任何一種皆可製備為一藥物組成物。
因此，此種甾體皂苷可被利用於製備一藥劑。
此一藥劑例如可作為一或抑制一癌細胞生長；抑制一原發及/或次發腫瘤形成及/或生長；防治及/或治療一癌症；抑制血管發生，抑制內皮細胞增殖及/或遷移，抑制及/或防止轉移病變以及減少被一生物系統達成需求之血管新生抑制水平的血管新生抑制劑給藥量。
如同前文中所討論，在本發明的各不同實施例的甾體皂苷可能從自然來源取得、由合成程方法製造、或為施於自然存在化合物或中間物的部分合成或修改型式。
本發明的各不同實施例中該甾體皂苷的萃取、分離與測定可由習知方法達成。
例如，一些甾體皂苷是從植物來源產生。甾體皂苷的其他來源可由文獻中輕易取得，例如由Hostettmann K與Marston A (2005)在Chemistry & pharmacology of natural products: Saponins. Cambridge University Press，第1-3章與第6章中所描述的例子。甾體皂苷俗名之使用係依據上文以及Dictionary of Natural Products, Chapman and Hall, CRC, (2004)。
本發明的各種實施例欲對生物系統給藥之甾體皂苷數量並未特別限定。且通常是一在使標靶暴露於一0.1μM至20μM範圍內之濃度的甾體皂苷。
甾體皂苷可以一適於使藥劑到達需要的作用位置並有需要之效用、諸如抑制血管發生的一種形式以及濃度被輸送。
甾體皂苷可在任何適於造成需要效果的時間內給藥。在一人類或動物實驗對象中，甾體皂苷例如可採口服、非腸道、局部或以任何其他適當方法給藥，因此藥劑通過時間必需被計入考慮。
例如，本發明的各實施例中甾體皂苷可在血管發生開始前、及/或與血管發生同時其中一者或一者以上對實驗對象給藥。例如，就抑制與一固性癌症相關之血管發生的情況而言，甾體皂苷給藥可在一腫瘤(原發及/或次發腫瘤)生長前及/或生長期間，及/或在一腫瘤(原發及/或次發腫瘤)切除之後。
在本發明各不同實施例中的甾體皂苷可以一適當形式對實驗對象給藥。
在一實施例中，甾體皂苷為一適於用來抑制血管發生的組成物形式。
因此，在另一實施例中，本發明提供一用來抑制一生物系統之血管發生的組成物，此組成物包括一有效量的一甾體皂苷。
對生物系統(例如一實驗對象)給藥的甾體皂苷有效量並未有特別限制，只要其為一大體上呈現治療效用的數量與形式即可。“治療有效量”一詞為一對需要治療之實驗對象的給藥可改進實驗對象之預後及/或狀態的數量。一實驗 對象的給藥量將取決於欲被抑制之血管發生、欲被治療的癌症特性、給藥模式，以及實驗對象之特性諸如一般健康、其他疾病、年齡、性別、基因型和體重而定。熟習該技藝之人士能夠依這些和其他因素決定適當劑量。
因此，在另一實施例中，本發明提供一甾體皂苷在一抑制一生物系統之血管發生的藥物製備上的用途。
如同前文中討論，甾體皂苷的給藥和傳輸例如可為，靜脈注射、腹腔注射、皮下注射、肌肉注射、口服、或局部給藥路徑，或直接注射至需要作用的位置。在大部份的情況下給藥模式與路徑將取決於接受治療的疾病或狀況類型。
劑量形式、劑量頻率和數量將取決於給藥模式和路徑。典型地一注射組成物給藥量將在5mg/m2 與500mg/m2 之間，通常在10mg/m2 與200mg/m2 之間藥。典型地一口服組成物給藥量將是5mg與5g之間，最好是50mg與1g之間。
例如，一有效甾體皂苷量典型地是在0.1mg/kg體重/日與1000mg/kg體重/日範圍間，且在一種型式中是1mg/kg體重/日與100/mg/kg體重/日之間。
如上文所述，一甾體皂苷組成物給藥亦可包含使用一或多於一種藥學上可接受之添加劑，包括藥學可接受的鹽、胺基酸、多胜肽、聚合物、溶劑、緩衝液、賦形劑，防腐劑和膨鬆劑，考慮被給藥之甾體皂苷的特殊物理、微生物和化學性質。
例如，甾體皂苷可製備成多種不同製藥上可接受的組 成物形式，例如一水溶液，一油質製劑，一脂肪乳劑，一乳劑，可供調製的冷凍乾燥粉、等等，且可被以一無菌且無熱原之肌內或皮下注射給藥、或以一對器官之注射給藥、抑或以一植入製劑或一轉化黏液質製劑經由鼻腔、直腸、子宮、陰道、肺臟，等等給藥。組成物可被以口服製劑的形式給藥(例如諸如片、錠、膠囊、顆粒或粉末的固體製劑；諸如糖漿、乳膠、分散液或懸浮液的液體製劑)。
含有甾體皂苷的組成物也可能包含一或一種以上的藥學可接受防腐劑、緩衝劑、稀釋劑、安定劑、螫合劑、增黏劑、分散劑、酸鹼值控制劑、溶解度調節劑或等滲劑。這些賦形劑為熟習發明技術領域者所習知。
適當之防腐劑實例是對羥苯甲酸之苯甲酸酯、酚類、苯乙醇或苄基醇。適當緩衝劑的例子是磷酸鈉鹽、檸檬酸、酒石酸及同類。適當的安定劑例子是抗氧化劑諸如α-生育酚醋酸酯、α-硫甘油、焦亞硫酸鈉、抗壞血酸、乙醯半胱胺酸、8-羥基喹啉，以及螫合劑諸如乙二胺四乙酸二鈉。適當之增黏劑、懸浮、安定或分散劑的例子是取代纖維素醚、取代纖維素酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、卡波姆、聚氧丙烯二醇、去水山梨醇單油酸酯、去水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯氫化昆麻子油60。
適當的酸鹼值控制劑的例子包括氫氯酸，氫氧化鈉、緩衝劑及類似物。適當的等滲劑為葡萄醣，D-山梨醣醇或D-甘露醇，氯化鈉。
甾體皂苷的給藥也可能為一組成物的形式，組成物包 含一藥學可接受的載體、稀釋劑、賦形劑、懸浮劑、潤滑劑、輔藥、賦形劑、輸送系統、乳化劑、崩解劑、吸收劑、保存劑、表面活化劑、著色劑、助流劑、抗黏劑、黏合劑、食用香料或甜味劑，考慮被給藥之甾體皂苷物理、化學和微生物性質。
就這些目的上而言，組成物可藉由口服給藥、藉吸入噴霧、吸附、吸收、局部、直腸、鼻、口腔、陰道的非經腸給藥，經一植入容器以含有習知無毒性藥學上可接受載體的劑量配方、或藉任何其他合宜劑量型式由心室給藥。非經腸一詞在本文中之使用包含皮下、靜脈、肌肉、腹腔、腦脊髓膜、心室、胸骨及頭顱內注射或浸劑技術。
當非經腸給藥時，組成物通常將是一單位劑量、無菌、無熱原的可注射形式(溶液，懸浮液或乳膠，可在使用之前已被調製)，通常具有一藥學可接受載體並與接受者的血液具等滲性。此種無菌可注射形式的例子是無菌可注射水性或油質懸浮液。這些懸浮液可依使用適當賦形劑、分散或潤濕劑、錯合劑、聚合物、助溶劑及懸浮劑的習知技術配方。無菌可注射形式亦可為無毒性非經腸可接受之稀釋劑或溶劑的無菌可注射溶液或懸浮液，例如1,3丁二醇之溶液。藥學可接受的賦形劑和可能被使用的溶劑中有水、乙醇、甘油、鹽水、二甲亞碸、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙醯胺、林格氏液，葡萄糖溶液，等滲性氯化鈉溶液及人工體液。此外，無菌之固定油類以往被使用作為溶劑或懸浮介質。就此一目的而言，任何無刺激性之固定油類可被利 用，包括合成的單甘油酯或甘油二酯、玉米、棉籽、花生及芝麻油。脂肪酸諸如油酸乙酯，肉豆蔻酸異丙酯和油酸及其甘油酯衍生物，包括橄欖油和蓖麻油，尤其為其聚氧乙烯化形式可被使用在血管注劑之製備中。這些油溶液或懸浮液亦可包含長鏈醇稀釋劑或分散劑。
載體可包含添加劑，諸如提高溶解度，等滲性及化學安定性的物質，例如抗氧化劑、緩衝劑和防腐劑。
此外，含有甾體皂苷的組成物可為一在給藥之前調製的型式。例子包括冷凍乾燥，噴霧乾燥等等以製成一可供與一藥學可接受的溶劑在給藥之前調製的適當固體形式。
組成物可包括一或多於一緩衝劑，膨鬆劑，等滲劑及低溫防護劑以及凍幹保護劑。賦形劑的例子包括，磷酸鹽、檸檬酸、非減少糖諸如蔗醣或海藻醣、多羥醇、胺基酸、甲胺，且溶致鹽類優先於減少糖類諸如麥芽糖或乳糖。
當以口服給藥時，甾體皂苷通常利用習知設備與業界之習知技術配製成單位劑量形式諸如錠劑、囊片、扁囊劑、粉、顆粒、珠、嚼錠、膠囊、液體，水懸浮液或溶液或相似的劑型，。此種配方典型地包括一固體，半固體或液體載劑。作為範例之載劑包括賦形劑，諸如乳醣、葡萄糖、蔗醣、山梨醣醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、礦物油，可可脂、可可豆油、藻酸鹽、膠黃蓍樹膠、明膠、糖漿、取代之纖維素乙醚、聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、滑石，硬脂酸鎂以及同類物。
一錠劑可藉由壓製或模製甾體皂苷連同可取捨的一或一種以上輔助成分被製成。壓製之錠劑藉由在一適當機器中壓縮自由流動型式諸如一粉末或顆粒的活性成分，可取捨地混合一黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性或分散劑被製成。模製錠劑可藉由在一適當機器中成型粉末化的活性成分與一以惰性液態稀釋劑潤濕之適當載劑的混合物被製成。
甾體皂苷因素的給藥也可利用控釋技術。
就局部給藥而言，組成物可為一溶液、噴霧、塗劑、乳膏(例如一非離子乳膏)、凝膠、糊或軟膏的形式。或者，組成物可經一脂質體、奈米微脂囊，核醣體或營養擴散賦形劑被輸送。
如前文中討論，欲被給藥之甾體皂苷有效量未特別被限制，只要是在一通常展現一藥理學效用或治療效果的數量及形式範圍內即可。
甾體皂苷給藥可更進一步包括一血管新生抑制劑的給藥，包括抗VEGF抗體，包含人源及嵌合抗體、抗VEGF適合體以及反義寡核苷酸、癌細胞血管阻斷素(angiostatin)、阻斷新生血管抗癌藥(endostatin)、干擾素、介白素1、介白素12，視網酸、及金屬蛋白酶-2與金屬蛋白酶-9的組織抑制劑。
血管新生抑制劑給藥路徑、劑量和治療方案可由熟習此技術範疇者決定。血管新生抑制劑以及他們的用途一般性地記載於"Biotherapy: A comprehensive Overview" (2001) 第二版，Paula Trahan Rieger, Jones and Bartlett Publishers International出版。
生物系統中之血管發生抑制作用可藉由業界習知的方法確定，諸如新生血管結構延遲出現，新生血管結構發育減緩、新生血管結構發生減少、血管新生從屬性疾病作用之減慢或嚴重程度降低、遏止血管生長、或先前的血管生長退化。
甾體皂苷抑制血管發生之能力的可藉由業界習知測定血管發生的任何適當檢測而確定。例如，一老鼠主動脈外植體模型可被利用。
或可進行雞尿囊絨毛膜(CAM)檢測或是一角膜新生血管模型。甾體皂苷抑制血管發生的能力可藉雞胚胎中之血管發生抑制作用程度、或藉一角膜新生血管中之血管發生抑制作用程度而測定。
例如，甾體皂苷在雞尿囊絨毛膜檢測中抑制血管發生的能力可由尿囊絨毛膜接觸塗在甲基纖維素圓盤上的甾體皂苷接觸被檢驗。有關角膜新生血管模型，甾體皂苷可由含有甾體皂苷之一局部組成物塗在被刮傷並被注射一新生血管誘發劑的角膜上。
另一種研究血管發生的方法是在動物身上皮下植入各種不同的人造海綿(即聚乙烯醇、明膠)。欲被評估的甾體皂苷可直接注射至已置入動物的海綿中。海綿的新生血管可採組織學、形態學(血管密度)、生物化學(血紅素含量)評價，或利用一放射性示蹤劑測量海綿脈管構造中的血流速 率評價。
已有許多動物腫瘤模型被發展用來檢驗測試化合物的抗血管新生活性。在許多情況下，腫瘤細胞被皮下移植且以規則間隔時間測定腫瘤尺寸。經常使用的腫瘤細胞包括C6大鼠神經膠質瘤、B16BL6黑色素瘤、LLC、以及Walker256肉瘤。
本發明也預期甾體皂苷將適於用來減少對一生物系統的血管新生抑制劑給藥量。
因此，在另一實施例中，本發明也提供一種可減少一生物系統達成需要水平之血管發生抑制作用的血管新生抑制劑給藥量的方法，此方法包括給與生物系統一有效量之一甾體皂苷的步驟。
欲被給藥之甾體皂苷有效量未特別限制，只要對在生物系統中達成一需求之血管發生抑制作用水平所需之藥劑量減少大體呈現一藥理學上有用之功效即可。
甾體皂苷可在任何適於產生減少一生物系統達成一需要水平之血管新生抑制作用之給藥劑量的需要效果的時間之內被給藥。如同前文中所討論，甾體皂苷對一人類或動物實驗對象之給藥例如可採口服、非經腸、局部或任何其他的適當方法，因此藥物的通過時間必需計入考慮。
如前文中所描述，血管新生抑制劑的實例包括抗VEGF抗體，包含人源及嵌合抗體、抗VEGF適合體及反義寡核苷酸、癌細胞血管阻斷素(angiostatin)、阻斷新生血管抗癌藥(endostatin)、干擾素、介白素1、介白素12，視網酸、以及 金屬蛋白酶-2及-9的組織抑制劑。
在此點上，達成一血管新生抑制作用需求水平的血管發生抑制劑用量將可藉一業界習知的方法以經驗決定，且其量將取決於血管發生欲被抑制之水平、實驗對象年齡和體重，以及給藥的頻率。
血管新生抑制劑將被以一適當形式且在一適當時間內給藥以產生所需水平之血管發生抑制效果達一需要的水平。血管新生抑制劑的配製與給藥方法在業界為習知者。
甾體皂苷可與血管新生抑制劑同時且依相同方式給藥。或者，甾體皂苷可與血管新生抑制劑分開給藥，且是在血管新生抑制劑給藥之前或之後的一藥理學適當時間給藥。
本發明也提供一種可供一甾體皂苷和一血管新生抑制劑對一實驗對象分開或共同給藥以抑制血管發生的組合產品。此一情況下組合產品包括以一適當形式對實驗對象分開給藥、或以一適當形式對實驗對象合併給藥之甾體皂苷。
因此，在另一實施例中，本發明提供一種包括一甾體皂苷和一血管新生抑制劑的組合產品，該甾體皂苷與血管新生抑制劑以一對一實驗對象合併給藥或以一對一實驗對象分開給藥的形式被提供。
組合產品的組成物可依多次或一次劑量型式個別包裝或共同包裝在一適當消毒的容器諸如安瓿、瓶或小玻璃瓶中。容器典型地被密封。組成物的包裝方法為業界習知者。
如前文中所討論，合併給藥可能是連續或同時地合併給藥，且通常意指藥劑在一指定的間隔時間存在於實驗對象中。典型地，如果第二藥劑是在第一藥劑的半生期內被給藥，此二藥劑被視為合併給藥。
本發明可用來抑制內皮細胞增殖及/或遷移。
因此，在另一實施例中，本發明提供抑制一生物系統中之內皮細胞增殖及/或遷移的方法，此方法包括對生物系統實施一有效量之一甾體皂苷給藥的步驟。
在此一點上，將可理解該生物系統是內皮細胞增殖及/或遷移正在發生或是血管發生可能發生的任何生物系統。
在一實施例中，生物系統是一人類或動物實驗對象。
在一更進一步的實施例中，生物系統是一人類或動物實驗對象，其中內皮細胞增殖及/或遷移與一種由於非想望或不受控制之內皮細胞增殖及/或遷移所引起的疾病或情況相關。
例如，生物系統可為一罹受與以下症狀相關之內皮細胞增殖及/或遷移或受其影響的人類或動物實驗對象：實質固態瘤之形成或擴張、血管纖維瘤、角膜新生血管、視網膜/脈絡膜新生血管、糖尿病視網膜病變、老年黃斑病變、動靜脈畸型、關節炎、類風濕性關節炎、骨關節炎、牛皮癬關節炎、狼瘡、結締組織病變、遺傳性出血性血管擴張症、粥狀動脈硬化斑塊、牛皮癬、葡萄菌腫、晶狀體後纖維組織增生症、硬皮病、肉芽形成、血管瘤、沙眼、血友病關節病變、血管黏附、增生性瘢痕，與急性或慢性發炎 相關之疾病或情況，與肺慢性發炎相關之疾病或情況包括氣喘、類肉瘤病，發炎性腸疾病、克隆氏病或潰瘍性結腸炎。
內皮細胞是正在經歷增殖及/或遷移的任何內皮細胞，包括一回應在一生物系統中的一或更多一血管新生刺激而遭受內皮細胞增殖的任何內皮細胞，或具有回應一或更多血管新生刺激而遭受增殖的內皮細胞。在一實施例中，內皮細胞增殖及/或遷移與生物系統的不受抑制或非想望血管發生相關。
在一實施例中，本發明可能被用來藉由抑制內皮細胞增殖及/或遷移防治及/或治療一實驗對象的癌症。
癌症的例子包括癌(carcinoma)、膀胱癌、骨癌、腦瘤、乳癌、子宮頸癌，大腸直腸癌，包含大腸、結腸、直腸、肛門和闌尾的癌症、食道癌、何杰金氏疾病、腎臟癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、疣與結構不良痣、多發性骨髓瘤、肌肉瘤、非何杰金氏淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌，胰臟癌，前列腺癌、肉瘤，皮膚癌，胃癌，睪丸癌，畸胎瘤，甲狀腺癌、及子宮癌。
生物系統的甾體皂苷給藥量未作特別限制，且通常為可使目標內皮細胞暴露於一0.1μM至20μM範圍內之甾體皂苷濃度。
甾體皂苷可以適於使藥劑到達需要之作用位置且具有抑制內皮細胞增殖及/或遷移之效果的一種形式和濃度被輸送。
甾體皂苷可在任何適於造成抑制內皮細胞增殖及/或遷移之需要效果的時間內給藥。在一人類或動物實驗對象中，甾體皂苷例如可採口服、非腸道、局部或以任何其他適當方法給藥，因此藥劑通過時間必需被計入考慮。
例如，本發明的各實施例中甾體皂苷可在內皮細胞增殖及/或遷移開始前，及/或與內皮細胞增殖及/或遷移發生之同時其中一者或一者以上對實驗對象給藥。
如前文中討論，甾體皂苷可以一適當形式且以一適當方式配方且對實驗對象給藥。
在一實施例中，甾體皂苷呈一適於用作抑制血管發生的組成物形式。
因此，在另一實施例中，本發明提供一可在一生物系統中抑制的內皮細胞增殖及/或遷移的組成物，此組成物包括一有效量之一甾體皂苷。
對一實驗對象給藥的甾體皂苷有效量並未特別限制，只要其為一大體上呈現治療效用的數量與形式即可。“治療有效量”一詞為一對需要治療之實驗對象的給藥可改進實驗對象之預後及/或狀態的數量。一實驗對象的給藥量將取決於內皮細胞增殖及/或遷移之特殊特徵，給藥模式，以及實驗對象之特徵，諸如諸如一般健康、其他疾病、年齡、性別、基因型和體重。熟習該技藝之人士能夠依這些和其他因素決定適當劑量。
因此，在另一實施例中，本發明提供利用一甾體皂苷製備一種可在一生物系統中抑制內皮細胞增殖及/或遷移 之藥物。
如同前文中討論，甾體皂苷的給藥和傳輸例如可藉由靜脈注射、腹腔注射、皮下注射、肌肉注射、口服、或局部給藥路徑，或直接注射至需要作用的位置。在大部份的情況下給藥模式與路徑將取決於接受治療的疾病或狀況類型，一如前文所討論者。
劑量形式、劑量頻率和數量將取決於給藥模式和路徑。典型地一注射組成物給藥量將5mg/m2 與500mg/m2 之間，通常在10mg/m2 與200mg/m2 之間。典型地一口服組成物給藥量是在5mg與5g之間，最好是50mg與1g之間。
例如，一有效甾體皂苷量典型地是在0.1mg/kg體重/日與1000mg/kg體重/日範圍間，且在一種型式中是1mg/kg體重/日與100/mg/kg體重/日之間。
如上文所述，一甾體皂苷組成物給藥亦可包含使用一或多於一種藥學上可接受之添加劑，包括藥學可接受的鹽、胺基酸、多胜肽、聚合物、溶劑、緩衝液、賦形劑，防腐劑和膨鬆劑，考慮被給藥之甾體皂苷的特殊物理、微生物和化學性質。
如前文中所述，含有甾體皂苷的組成物也可能包含一或一種以上的藥學可接受防腐劑、緩衝劑、稀釋劑、安定劑、螫合劑、增黏劑、分散劑、酸鹼值控制劑、或等滲劑。這些賦形劑為熟習發明技術領域者所習知。
甾體皂苷給藥可更進一步包括一血管新生抑制劑的給藥，包括抗VEGF抗體，含人源及嵌合抗體、抗VEGF適合 體以及反義寡核苷酸、癌細胞血管阻斷素(angiostatin)、阻斷新生血管抗癌藥(endostatin)、干擾素、介白素1、介白素12，視網酸、及金屬蛋白酶-2與-9的組織抑制劑。
生物系統中之內皮細胞增殖及/或的遷移的抑制作用可由業界習知之一適當方法決定。
例如，以細胞增殖而言，方法諸如有細胞計數、[3H]胸嘧啶併入分析、細胞增殖之免疫組織化學染色、新生血管構造延遲出現、新生血管結構發育減緩、新生血管結構發生減少、血管新生從屬性疾病作用之減慢或嚴重程度降低、遏止血管生長、或先前的血管生長退化。
甾體皂苷抑制內皮細胞增殖的能力可使用業界習知的試驗測定。例如，人類臍帶血管內皮細胞可在試管內於適當介質中培養且例如可藉由放射線氚-胸嘧啶吸收法測定內皮細胞增殖。在此一測定中，接著可藉內皮細胞接觸藥劑並測定在任何特別濃度之下發生的增殖抑制作用程度而測試藥劑抑制增殖的能力。
至於內皮細胞遷移，一適當的檢測是BD BioCoatTM 血管發生系統：內皮細胞遷移。
本發明也考慮甾體皂苷將適於用來減少一生的血管新生抑制劑對一生物系統的給藥量。
因此，在另一實施例中，本發明提供一種減少達成需要水平之內皮細胞增殖及/或遷移抑制作用對一生物系統的血管新生抑制劑給藥量的方法，此方法包括以一有效量甾體皂苷對生物系統給藥的步驟。
甾體皂苷給藥之有效量未受特別限制，只要減少生物系統中達成一需要水平之內皮細胞增殖及/或遷移抑制作用上一般展現一藥理學有用效果即可。
甾體皂苷可在任何適合導致減少所需給與一生物系統使其達成一需要水平之細胞增殖及/或遷移抑制作用之藥劑量效果的時間內被給藥。如前文中討論，在一人類或動物實驗對象中甾體皂苷例如可採口服、非經腸、局部或任何其他的適當方法給藥，因此藥物的通過時間必需計入考慮。
如前文中所記載，血管新生抑制劑之實例包括抗VEGF抗體，包含人源及嵌合抗體、抗VEGF適合體及反義寡核苷酸、癌細胞血管阻斷素(angiostatin)、阻斷新生血管抗癌藥(endostatin)、一干擾素、介白素1、介白素12，視網酸、以及金屬蛋白酶-2與-9的組織抑制劑。
在此點上，達成一需要之內皮細胞增殖及/或遷移抑制作用的水平所需的血管新生抑制劑數量將可藉一業界習知方法以經驗決定，且其量將取決於欲被抑制之水平、實驗對象之年齡和體重，以及給藥的頻率。
甾體皂苷可與血管新生抑制劑同時且以相同方式給藥。或者甾體皂苷可與血管新生抑制劑分開給藥，且是在血管新生抑制劑給藥之前或之後的一藥理學適當時間給藥。
本發明也提供一種可供一甾體皂苷和一血管新生抑制劑對一實驗對象分開或共同給藥以抑制內皮細胞增殖及/ 或遷移的組合產品。此一情況下組合產品包括以一適當形式對實驗對象分開給藥、或以一適當形式對實驗對象合併給藥之甾體皂苷。
因此，在另一實施例中，本發明提供一種包括一甾體皂苷和一血管新生抑制劑的一種組合產品，甾體皂苷和血管新生抑制劑係以一對一實驗對象合併給藥的形式或以對一實驗對象分開給藥的形式被提供。
組合產品的組成物可個別或一起以多劑量或以一次劑量包裝在適當消毒之容器諸如安瓿、瓶或小玻璃瓶中。容器典型地被密封。組成物的包裝方法為業界習知者。
如前文中所討論，合併給藥可能是連續或同時地合併給藥，且通常意指藥劑在一指定的間隔時間存在於實驗對象中。典型地，如果第二藥劑是在第一藥劑的半生期內被給藥，此二藥劑被視為合併給藥。
醫藥組成物的製備方法係為業界所習知，例如以下文獻有所記載：Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.; U.S. Pharmacopeia. National Formulary, 1984, Mack Publishing Company, Easton, Pa.; and M.E. Aulton, Pharmaceutics, The Science of Dosage Form Design, 2nd ed., Churchill Livingstone, Edinburgh, 2002.
特定實施例的描述
現在將提及具體實現上述本發明原則的一些實驗。惟需瞭解以下之記載對上述的通則並不構成限制。
實例1 材料
薯蕷皂苷元、薯蕷皂苷(薯蕷皂苷元Rha2, [Rha4]、Glc)，二角薯蕷皂苷寧(薯蕷皂苷元Rha2, [Glc4], Glc)及trillin(薯蕷皂苷元-Glc)購自Ningbo Hanpharm Biotech Co. Ltd，纖細薯蕷皂苷購自Chroma Dex，且trillin購自Aktin Chemicals。
先桔梗皂苷元A：薯蕷皂苷元Rha2, Glc係依據Li等人在Carbohydr. Res., (2001)331, 1-7中記載之方法合成。薯蕷皂苷和先桔梗皂苷元A亦由蚤休中被分離。Sorafenib由商業上獲得。
實倒2 二角薯蕷皂苷寧在主動脈外植體上對血管生長的效果評估
以CO2 使三隻雄性C57 BL6/J小鼠(9週齡)窒息死亡，並使用29號針心臟穿刺採血。然後將主動脈解剖(由主動脈弓至肋膜/腹膜界面)且置放在一補充10mM Hepes緩衝液及盤尼西林/鏈黴素的預冷DMEM培養基中。
圍繞主動脈的纖維性和脂肪組織以顯微鏡解剖除去且主動脈用預冷之DMEM沖洗血液。然後將主動脈縱向地切成兩份且切割成大約1mm的方塊。個別主動脈塊被浸埋於一24孔組織培養盤的一孔底部中的一滴(20μL)膠原溶液中。接著將培養盤置於37℃/5% CO2 之下10分鐘以使膠原聚合成一凝膠。然後將含有DMSO或二角薯蕷皂苷寧之DMSO溶液的介質(0.3毫升)單獨加入每一孔以形成一包圍膠原凝 膠的槽溝。每一24孔培養盤只有中央的8個孔被使用作外植體培養以防止外植體試樣孔之間有差別氣體交換及蒸發速率。外側孔填充PBS。
八個一組共九組複製品各自被測試：1.單獨介質(補充10mM Hepes與2%正常小鼠血清EBM-2(I)。
2.介質加上1μL/mLDMSO(稀釋劑控制二角薯蕷皂苷寧)(H)。
3.介質加上1μL/mL DMSO，10nM二角薯蕷皂苷寧(G)。
4.介質加上1μL/mLDMSO，30nM二角薯蕷皂苷寧(F)。
5.介質加上1μL/mL DMsO，100nM二角薯蕷皂苷寧(E)。
6.介質加上1μL/mL DMSO，300nM二角薯蕷皂苷寧(D)。
7.介質加上1μL/mL DMsO，1μM二角薯蕷皂苷寧(C)。
8.介質加上1μL/mL DMSO，3μM二角薯蕷皂苷寧(B)。
9.介質加上1μL/mL DMSO，10μM二角薯蕷皂苷寧(A)。
接著在一37℃/5% CO2 之潮溼培養箱內將外植體於培養基中培養6天。外植體藉由在每一孔內加入一等量之4%多聚甲醛與PBS混合液在室溫固定20分鐘。用Hepes緩衝鹽水(HBS, 150mM NaCl, 10mM Hepes)清洗三次後，外植體在4℃ HBS中整晚以10μg/ml FITC-BS-1外源凝集素結合 物染色(BS-1外源凝集素專一結合小鼠內皮細胞)。次日以HBS清洗外植體三次。外植體的血管新芽在螢光顯微鏡下被觀看且照相以供資料分析。每一外植體皆被拍攝多重深度焦點之螢光影像且用deconvolution軟體處理照片使每一外植體之整體血管新芽被測定。每一外植體關聯的整體細胞生長可藉由一利用解剖顯微鏡的光學顯微鏡觀看並照相建檔。為了易於觀看與分析，將每一外植體的血管新芽之多數螢光影像製成複合黑白反置影像。接著計算每一外植體的血管出芽數目和血管分枝數目，每一試樣之識別性對計數人保密。結果摘要於表4並圖解繪示於第1圖圖示於對每一試樣的數字的數字然後將生物的活組織移植於培養基中培養與人計算一起計算無法判斷每個試樣的認同作用。結果在表4被概述，並以圖表繪示於第1圖。
與不含DMSO之下培養的主動脈外植體相較，在以DMSO處理之主動脈外植體中可觀察到在血管出芽和分枝上顯著減少，故二角薯蕷皂之賦形劑DMSO單獨在血管新生反應上有一顯著的抑制效果。將生物的活組織移植於培養基中培養缺乏栽培。
然而，相較於DMSO培養之控制外植體培養物，高濃度二角薯蕷皂苷寧顯著地抑制由主動脈血管出芽(在10與3μM下)及血管分枝(在10, 3及1μM下)。
試樣的代表性實例繪示於第2圖及第3圖。
實例3 利用AngioSponge TM 測定法測定甾體皂苷之內皮細胞增殖與遷移抑制作用
AngioSpongeTM 檢測使瓊脂糖捕捉之生長因子緩慢釋放，刺激內皮細胞增殖及遷移，並提供一類組織基質供新生血管。因此檢測可被用來估計為抑制血管發生而設計之治療的效能，以CD31免疫組織化學染色內皮細胞後計算血管而測定(McCarty et al, International Journal of Oncology, 21:5-10, 2002)。
將明膠海綿(Pharmacia & Upjohn)在無菌狀態下切割成7×7×7mm之塊狀體，且以無菌磷酸鹽生理緩衝液預浸整晚。接著將含水明膠海綿部份烘乾。生長因子(bFGF)在溫熱(37℃)0.4%瓊脂糖中稀釋至一2μg/mL的起始濃度。將部份烘乾的明膠海綿置於生長因子溶液中，或置於不含生長因子的溫熱0.4%瓊脂糖中，然後轉移至一容納溫熱之0.4% 瓊脂糖(1:1稀釋，最終生長因子濃度1μg/mL)的皮氏培養皿以供聚合作用以及固化。
70隻雌C3H/Hej小鼠被植入晶片且依體重隨機分為每組10隻的7組。小鼠藉鹵乙烷吸入被麻醉以進行移植。在第三和第四乳腺之間用一套針成型一溝槽，將海綿插置在溝槽整個深度內且用一縫合夾閉合切口。
化合物配方為N-甲基吡咯烷酮(NMP):PEG300：水(1:9:10, v/v)。劑量是根據試管內IC50 資料及初步毒性研究而建立。在研究期間化合物藉腹腔注射以10mL/kg之藥量體積每天一次給藥，如表5所示。
當所有動物完全由麻醉復原後開始治療且持續10天。在第11天將血管海綿切除並置於液態氮中冷凍，OCT包埋標本在冷凍切片上作CD31染色。
CD31/PECAM-1為一內皮細胞之特有抗原，因此可使用作為一種血管標誌。將海綿的冷凍試樣冷凍切片(12μm)， 置於帶正電之Plus載玻片((Fisher Scientific))上，且風乾30分鐘。冷凍切片依序在冷丙酮、丙酮/氯仿(1:1, v/v)和丙酮中被各別固定5分鐘，然後以PBS清洗(磷酸鹽緩衝劑鹽水)。以含5%標準，馬血清和1%標準山羊血清的PBS阻斷之後，切片與PECAM-1單株小鼠抗鼠CD31抗體(阻斷溶液中1:50000, PharMingen, San Diego, CA)一同在室溫被培養4小時。接著用PBS清洗載玻片並以適當的二次抗鼠抗體培養。將載玻片在安定3,3'-二氨基聯苯胺中培養5-10分鐘觀察到陽性反應。切片用蒸餾水清洗，以吉爾氏蘇木素複染1分鐘，且裝上通用座架(ResearchGenetics)。單獨暴露於二次抗體的控制試樣未顯示特異性染色。小鼠胎盤被使用作一正控制。為定量而選擇三個獨立視野，陽性染色斑點或具有管腔之血管被計數。
以血管(CD31計數)的平均數目為對照的結果摘記於表6：
一治療之誘導百分比是在治療(+bFGF)與單獨之賦形劑(無bFGF)間之計數差除以具有bFGF之賦形劑和單獨賦形劑(不含bFGF)在CD31計數上之差，以百分比表示。
血管數目和誘導百分比相對治療繪製成第4圖和第5圖。結果證明甾體皂苷在血管海綿之模型系統中造成血管發生之減少。
實例4 利用AngioChambcy TM 測定法測定甾體皂苷的內皮細胞增殖和遷移抑制作用
AngioChamberTM 檢測利用治癒的傷口癒合的正常生理過程，此一過程促進一被植入之腔體周圍形成一纖維包膜(Wood et al, (2000)Cancer Research, 60(8):2178-89)。腔體中所包含的bFGF誘發纖維包膜中之血管發育。因此本測定法可藉計測其對纖維包膜形成之影響評估治療效能，在研究結束時藉由測量纖維包膜之濕以及藉由測定血紅素含量確定對腔體之血管供應。纖維包膜的血紅素含量是新生血管之一種量度標準，該血紅素含量由Drabkin分析法檢定。
血管腔體是由全氟烷氧基聚四氟乙烯所製成的多孔組織腔體且填充有0.8%包含具有或未具有1μg/mL人類bFGF之20IU/mL肝素的瓊脂。腔體兩端以相同材料之活動帽蓋封閉。腔體是在無菌條件下填充0.8%包含具有或未具有1μg/mL人類bFGF之20IU/mL肝素的瓊脂。瓊脂糖溶液在填充腔體前保持在37。C。
70隻雌性FvB小鼠被植入晶片，依體重隨機分為每組10 隻的7組。小鼠藉鹵乙烷吸入被麻醉以進行移植。在每隻小鼠背部肩胛骨之間皮下注射150μL的無菌過濾空氣而生成一空氣囊，在空氣囊上形成一小切口且將腔體插入。傷口用兩個1.4mm縫合夾閉合。
所有治療皆採NMP:PEG300：水(1:9:10, v/V )之配方且每天由腹腔注射給藥，如表7所示：
當所有的動物完全從麻醉復原後開始治療且持續5天。在第6天將含血管纖維腔體移除且記錄每一植入物的濕重。每一小鼠之腔體接著以液態氮冷凍並儲存在-20℃直至評估血紅素含量為止。
纖維包膜試樣在過程期間被解凍且保持在冰上。每一解凍之試樣被加上無菌水，且試樣以一UltraTourax被均質化。為了要防止交叉污染，在每一個試樣均質化後用5mL蒸餾水將UltraTourax沖洗30秒。勻漿移轉至一2mL之Eppendorf管中且存放在冰上。Eppendorf管在4℃下及高速 (14,000相對離心力(RCF))下被離心分離60分鐘。接著將1.0-1.5mL固體顆粒層與脂肪層間的中間水溶液(勻漿)移入新的1.5mL Eppendorf管並存放在放上。50μL之每一勻漿被移入至96孔培養盤的個別孔中。將50μL水移入兩孔中以作為對照。接著在每一孔中加入50μL Drabkin試劑且混合。在室溫下培養15分鐘後，測定每一試樣在540nm之吸光值且由一標準曲線計算每一試樣之血液體積。
對照平均腔體重量，平均血管含量(自血紅素含量測得)以及誘導百分比之結果摘記於表8。
一治療之誘導百分比是治療(+bFGF)與單獨之賦形劑(無bFGF)之間的血液含量差除以含有bFGF之賦形劑與單獨賦形劑(不含bFGF)之間的血液含量差，以一百分比表示。
血管腔體之平均血液含量與誘導百分比相對治療以繪製成第6圖和第7圖。結果證明甾體皂苷在血管海綿模型系 統中造成血管發生之減少。
最後，將可以理解在不脫離發明精神下，本說明書中記載的本發明方法與組成物的各種不同修改和變化為熟習本技藝之人士所知悉。雖然本發明已就特定實施例被描述，惟應了解所請求之發明不應受限於特定實施例。事實上，說明書中記載之本發明實施模式對於熟習此技藝者顯而易見的各種不同修改皆欲被涵蓋在本發明範圍內。
第1圖顯示增加二角薯蕷皂苷寧濃度對於從主動脈外植體上生長血管的影響。
第2圖繪示利用使用光學顯微鏡或Fitc-BS-1的凝集素染色觀察DMSO單獨對主動脈培殖體之影響的一代表性實例。
第3圖繪示使用光學顯微鏡檢查或Fitc-BS-1的的凝集素染色觀察10μM二角薯蕷皂苷寧對主動脈外植體之影響的一代表性實例。
第4圖繪示在血管海綿測定中薯蕷皂苷、二角薯蕷皂苷寧、trillin、先桔梗皂苷元A以及sorafenib對CD31之血管染色效果，此為這些化合物對於被誘導之平均血管數目之效果的指標。
第5圖繪示血管海綿中薯蕷皂苷、二角薯蕷皂苷寧、trillin、先桔梗皂苷元A及sorafenib在由bFGF誘導之血管發生百分比上的效果。
第6圖繪示在血管腔體中薯蕷皂苷、二角薯蕷皂苷寧、 trillin、先桔梗皂苷元A及sorafenib對血容量的效果。
第7圖繪示薯蕷皂苷、二角薯蕷皂苷寧、trillin、先桔梗皂苷元A及sorafenib對於血管腔體中因bFGF誘導之血管發生的效果。

Claims (9)

  1. 一種甾體皂苷(steroid saponin)在製備一抑制血管新生藥物中的用途，其中該甾體皂苷是擇自於由二角薯蕷皂苷寧(薯蕷皂苷元Rha2,[Glc4],Glc)[deltonin(diosgenin Rha2,[Glc4],Glc)]、薯蕷皂苷(dioscin)(薯蕷皂苷元Rha2,[Rha4],Glc)、以及先桔梗皂苷元A(prosapogenin A)(薯蕷皂苷元Rha2,Glc)所組成之群組。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該藥物進一步包括一血管新生抑制劑(anti-angiogenic agent)。
  3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該血管新生抑制劑為擇自於下列組成之群組的一種或一種以上藥劑：一抗VEGF抗體，包括人源(humanized)及/或嵌合抗體、一抗VEGF適合體(aptamer)、一VEGF反義寡核苷酸、癌細胞血管阻斷素(angiostatin)、阻斷新生血管抗癌藥(endostatin)、一干擾素、介白素1、介白素12，視網酸、以及金屬蛋白酶-2與-9的組織抑制劑。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該血管新生是與以下相關：固態瘤之形成或擴張、血管纖維瘤、角膜新生血管、視網膜/脈絡膜新生血管、糖尿病視網膜病變、老年黃斑病變、動靜脈畸型、關節炎、類風濕性關節炎、骨關節炎、牛皮癬關節炎(psoriatic arthritis)、狼瘡、結締組織病變、遺傳性出血性血管擴張症(Osler-Weber syndrome)、粥狀動脈硬化斑塊(atherosclerotic plaques)、牛皮癬(psoriasis)、葡萄菌腫、晶狀體後纖維 組織增生症、硬皮病、肉芽形成、血管瘤、沙眼(trachoma)、血友病關節病變(haemophilic joints)、血管黏附、增生性瘢痕(hypertrophic scars)、與急性或慢性發炎相關之疾病或情況、與肺慢性發炎相關之疾病或情況包括氣喘、類肉瘤病，發炎性腸疾病、克隆氏病或潰瘍性結腸炎。
  5. 一種抗血管新生組成物，包括一甾體皂苷及一血管新生抑制劑，其中該甾體皂苷是擇自於由二角薯蕷皂苷寧(薯蕷皂苷元Rha2,[Glc4],Glc)、薯蕷皂苷(薯蕷皂苷元Rha2，[Rha4],Glc)、以及先桔梗皂苷元A(薯蕷皂苷元Rha2,Glc)所組成之群組。
  6. 如申請專利範圍第5項之抗血管新生組成物，其中該血管新生抑制劑為擇自下列組成之群組的一種或一種以上藥劑：一抗VEGF抗體，包括人源及/或嵌合抗體、一抗VEGF適合體、一VEGF反義寡核苷酸、癌細胞血管阻斷素(angiostatin)、阻斷新生血管抗癌藥(endostatin)、一干擾素、介白素1、介白素12，視網酸、及一金屬蛋白酶-2及-9的組織抑制劑。
  7. 一種醫藥組成物，包括一甾體皂苷和一血管新生抑制劑，其中該甾體皂苷是擇自於由二角薯蕷皂苷寧(薯蕷皂苷元Rha2,[Glc4],Glc)、薯蕷皂苷(薯蕷皂苷元Rha2,[Rha4],Glc)、以及先桔梗皂苷元A(薯蕷皂苷元Rha2,Glc)所組成之群組。
  8. 一種甾體皂苷在製造一藥劑以供減少一實驗對象 (subject)達成一需要之血管新生抑制水平所需之血管新生抑制劑給藥數量的用途，其中該甾體皂苷是擇自於由二角薯蕷皂苷寧(薯蕷皂苷元Rha2,[Glc4],Glc)、薯蕷皂苷(薯蕷皂苷元Rha2,[Rha4],Glc)、以及先桔梗皂苷元A(薯蕷皂苷元Rha2,Glc)所組成之群組。
  9. 一種組合產品，包括：一甾體皂苷；以及一血管新生抑制劑；該甾體皂苷與該血管新生抑制劑是以一對實驗對象合併給藥之形式或一對實驗對象分開給藥之形式被提供，其中該甾體皂苷是擇自於由二角薯蕷皂苷寧(薯蕷皂苷元Rha2,[Glc4],Glc)、薯蕷皂苷(薯蕷皂苷元Rha2,[Rha4],Glc)、以及先桔梗皂苷元A(薯蕷皂苷元Rha2,Glc)所組成之群組。
TW097103707A 2006-08-03 2008-01-31 用於抑制血管新生之方法及組成物 TWI421083B (zh)

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