WO2007018320A1 - 移植片喪失の予防剤、及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2007018320A1
WO2007018320A1 PCT/JP2006/316196 JP2006316196W WO2007018320A1 WO 2007018320 A1 WO2007018320 A1 WO 2007018320A1 JP 2006316196 W JP2006316196 W JP 2006316196W WO 2007018320 A1 WO2007018320 A1 WO 2007018320A1
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cells
transplantation
graft loss
nkt
production
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PCT/JP2006/316196
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Inventor
Satoshi Kojo
Masaru Taniguchi
Yohichi Yasunami
Original Assignee
Riken
Fukuoka University
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Definitions

  • the present invention relates to a preventive agent for loss of a graft at the time of islet transplantation or the like. Furthermore, the present invention relates to a screening method for a compound for prevention / treatment of the graft loss.
  • Knee islet transplantation is a very promising approach for the treatment of insulin-dependent diabetes (I DDM).
  • I DDM insulin-dependent diabetes
  • the approach remains experimental for a number of reasons, particularly because of its low efficiency for early transplant rejection of transplanted Yeouido.
  • Patients with I DDM cannot achieve insulin independence after transplantation of knee islets from a single donor spleen due to premature graft loss (Ricordi, C, et. Al., 2004, Nat. Rev. Imuriol., 4: 259-268 / Shapiro, A. ⁇ , 2000, N. Engl. J. Med. ', 343: 230-238).
  • Premature knee islet loss has been estimated to occur in up to 50% of the transplanted islet volume (Ryan, EA, et.
  • Insulin secretion 8 cells affect in vitro on pro-in f 1 a mm atory cytokines such as IFN- ⁇ , TNF-s and IL-1; 8 (Rabinovitch, A., 1993., Diabetes Rev., 1: 215-240).
  • pro-in f 1 a mm atory cytokines such as IFN- ⁇ , TNF-s and IL-1
  • 8 Ranovitch, A., 1993., Diabetes Rev., 1: 215-240.
  • the onset mechanism of early graft loss is not fully understood.Understanding this mechanism, we have developed an effective preventive agent for early graft loss and increased the efficiency of knee island transplantation. It is eager to make it happen.
  • Natural killer T 'cells are one of the lymphocytes that express two antigen receptors, the T cell receptor (TCR) and the NK receptor.
  • T cell receptor T cell receptor
  • T cell receptors on the cells are presented on CD 1 (eg, CD 1 d) molecules.
  • Glycolipids such as ⁇ -galactosylceramide ( ⁇ -GalCer) and isoglobotrihexosylceramide (Science, 278, p.1626-1629, 1997 / J. Exp .. Med., 188, + p.1521-1528, 1998 / Science, 306, p.1786-1789, 2 004).
  • the repertoire of T cell receptors on NKT cells is very limited.
  • the ⁇ chain of the T cell receptor on mouse sputum cells (Vo; sometimes referred to as 14 sputum cells) is encoded by non-polymorphic Va 14 and J ⁇ 28 1 gene segments (Proc Natl. Acad. Sci. USA, 83, p.8708 8712, 1986 / Proc. N3 ⁇ 4tl. Acad. Sci. USA, 88, p.7518-7522, 1991 / J. Exp. Med., 180, p. 1097-1106, 1994)] 90% or more of the three strands are V j8 8, and other limited repertoires such as V 7 and V0 2 can be included.
  • human cell receptors on human sputum cells are non-polymorphic Va 24 with high homology to mouse V ⁇ 14 and V ⁇ 3. It is known to be a 'combination'.
  • Natural killer sputum cells belong to different subsets of lymphocytes that bridge the natural and acquired immune system and play an important role in the acute response. Sputum cells produce a large amount of INF- ⁇ immediately after activation, which in turn is responsible for sputum cells and other cells in the natural immune system, and CD 4 T h 1 cells and CD in the acquired immune system. Activates 8-cytotoxic T cells (Brigl, M., et. Al., 2003, Nat. Immunol., 4: 1230-1237 / Taniguchi, M., 2003, Ann. Rev. Immunol., 21: 483 -513 / Taniguchi, M., et al., 2003, Nat.
  • V a 14 NKT cells are a variety of bacteria, It plays a role in the front line defense against viruses, molds, and intracellular parasites (Taniguchi, M. 2003, Ann. Rev. Immunol., 21: 483-513 / Wilson, SB, et. Al., 2003, Nat. Rev. Immunol, 3: 211—222).
  • an object of the present invention is to provide a preventive agent for graft loss based on a new mechanism, and a method for screening and sung the same. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to the following. .
  • It contains a sputum cell ligand; an agent for preventing graft loss.
  • a method of screening for a therapeutic compound for preventing graft loss comprising selecting a compound capable of suppressing IFN-0 production in CD 1 1 b + cells.
  • (B) A step of selecting a compound capable of suppressing IFN- ⁇ production from CD 1 lb + cells when NKT cells in the co-culture are stimulated.
  • a method for screening a compound for prevention / treatment of graft loss comprising selecting a compound capable of suppressing an increase in the number of CD 1 1 b + cells at the transplantation site.
  • NKT cell Use according to [10] above, wherein the ligand is ⁇ -galactosylceramide.
  • a method for preventing graft loss in a mammal comprising administering an effective amount of an NKT cell ligand to the mammal.
  • the prophylactic agent of the present invention it is possible to prevent graft loss in clinical knee islet transplantation and the like, which can contribute to the improvement of transplantation efficiency.
  • graft loss in the case of knee islet transplantation, due to early graft loss, a sufficient therapeutic effect can be achieved unless two or three donor knee islands are repeatedly transplanted for one recipient.
  • the prophylactic agent of the present invention is used, an equivalent therapeutic effect can be obtained with a smaller number of donor knee islands.
  • FIG. 1 shows that Vo! 14 NKT cells play an important role in the early loss of allogeneic syngeneic knee island grafts.
  • individual lines represent the non-fasting plasma glucose levels for each animal. * Indicates that an animal died due to severe diabetes.
  • the right panel shows a photomicrograph of a knee island graft in the liver tested 60 days after transplantation.
  • HE Hematoxylin-eosin.
  • AF Aldehyde fuchsin.
  • Original magnification X 100.
  • B Normoglycemia in S TZ-induced diabetic mice transplanted with 400 knee islands.
  • D, E 20 000 (D) or 100
  • E S TZ-induced diabetic J'a 28 1—Has normal blood glucose in mice.
  • F, G, H STZ-induced diabetes mellitus transplanted with 200 knee islands' J «2 8 1— mice, wild type (F), J 2 8.1 _Z— (G), I FN— ⁇ deficient (Eta) liver mononuclear cells from mice (5 ⁇ 1 0 6 cells) were injected into the portal vein.
  • FIG. 2 is a diagram showing the necessity of V CK 14 NK T cells for induction of IFN—y producing cells after knee islet transplantation.
  • the numbers in the figure represent the percentage of cells in the corresponding region.
  • the gated CD 3+ a -GalCer—CD Id tetramer positive cells are compared to IFN- ⁇ production (solid line), force negative control (dotted line).
  • FIG. 3 is a diagram showing induction of I F ⁇ 7 producing ⁇ G r ⁇ 1 + CD 1 l b + cells 6 hours after transplantation of the spleen.
  • the numbers in the figure represent the percentage of cells in the corresponding area. .
  • FIG. 4 shows the surface phenotype of G r-1, + CD 1 1 b + cells. Surface expression (solid line) was compared to control (dotted line).
  • FIG. 5 is a photograph showing the histological findings of G r-1 + CD l l b + cells isolated from the liver 6 hours after transplantation.
  • Original expansion rate X400.
  • FIG. 6 is a diagram showing the prevention of diabetes mellitus by 200 mg knee island transplantation and anti-Gr 1-1 or anti-CD11b antibody treatment.
  • A Control antibody
  • B Anti-Gr-1 antibody
  • C Antibody CD11b antibody.
  • FIG. 7 shows changes in cytokine profiles of NKT cells after repeated _Ga1Cer treatment.
  • One G a 1 C er or vehicle once (black color Or 3 times (white column) Purified from mice injected intraperitoneally, liver V and 14NKT cells were pulsed with d-GalCer (100 ng / m1) or vehicle Cultured with dendritic cells, cytoforce-in production was measured by ELISA.
  • FIG. 8 is a graph showing the prophylactic effect of allogeneic syngeneic knee islet graft failure by repeated a—G a 1 C er treatment. Each line represents the non-fasting plasma glucose level for each animal. * Animal death due to severe diabetes.
  • A, B Rejection of knee island graft due to single a—G a 1 C er stimulation. 400 allogeneic syngeneic islets were treated with a single intraperitoneal injection of vehicle (A) or a—G a 1 Cer (100 ⁇ g / kg) (B) at the time of knee islet transplantation.
  • Z induced diabetes was transplanted into C 5 7 BL 6 mice.
  • FIG. 9 is a diagram showing the effect of “G a 1 Cer treatment on the production of IFN- ⁇ by G r-1 + CD 1 1 b + cells”.
  • the numbers in the figure represent the percentage of cells in the corresponding region.
  • Transplant recipients of naive mice (A), wild-type (B and D—F), or J2 28 (C) isolated 6 hours after transplantation of 4,0 0 or 200 allogeneic syngeneic knee islands Liver mononuclear cells from were analyzed. Vehicles (B, C) or ⁇ -Ga1Cer (10 ⁇ . ⁇ g / kg) (D) were injected once into mice transplanted with 400 knee islands.
  • FIG. 10 shows mRNA expression in liver Va 14 NKT cells after Kashiwajima transplantation.
  • A Shows the results of mRNA expression analysis using the affimetlix gene chip. Genes that are up-regulated 6-fold more than na ⁇ ve V a 14 NKT cells are shown. a, b and c are 1 hour, 2 hours and 6 hours Indicates that the cells were isolated at the time point.
  • B IL-1 ⁇ mRNA levels in liver V 14NKT cells were measured by real-time RT-PCR. Results for IL-1 are normalized by the respective HP RT expression.
  • the present invention provides a prophylactic agent for graft loss comprising an NKT cell ligand.
  • NK T cell ligands are administered to the recipient in advance, resulting in functional modification of the NKT cells in the recipient (such as reduced IFN-V production).
  • IFN- ⁇ release from CD11b + cells (Gr-1 + CD11b + cells, etc.) that can be induced by NKTiB vesicles around the graft is strongly suppressed, and transplantation by IFN- ⁇ A single failure is prevented.
  • Vaginal cells are one of the lymphocytes that express two antigen receptors, the cell receptor (TCR) and the cell receptor.
  • a sputum cell recognizes a sputum cell ligand J on which the sputum cell receptor on the cell is presented on a CD 1 (eg CD 1 d) molecule.
  • CD 1 eg CD 1 d
  • the T cell receptor repertoire is very limited, for example, the ⁇ chain of the T cell receptor on mouse NKT cells (sometimes called V QJ 14NKT cells) is a non-polymorphic ⁇ ⁇ 14 And J «28 1 gene segment (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, p.8708-8712, 1986; Proc. Natl. Acad. Sci.
  • V j38 more than 90% of the j3 chain is V j38, and other limited repertoires such as V] 37 and V / 32
  • T cell receptors on human NKT cells are non-polymorphic V ⁇ 24, which is highly homologous to mouse Va 14, and V) 38.2.
  • V ⁇ 24 is highly homologous to mouse Va 14, and V
  • “NKT cell ligand” refers to a compound that, when presented on a CD1 molecule, is specifically recognized by the T cell receptor on NKT cells and can specifically activate NKT cells.
  • “NKT cell ligand j is For example, a-vrycosyl ceramide, isoglobotrihexo syl ceramide (Science, 306, p.1786-1789, 2004) N 2 O CH (Nature, 413: 531, 2001) and the like can be mentioned.
  • a monoglycosylceramide is a glycosphingolipid in which saccharides such as galactose and glucose are bound in an ⁇ -coordination and are glycosphingolipids.
  • NKT cystic ligand J is used to include its salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, : Physiologically acceptable acid addition salts are preferred, such as inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, bromide).
  • Hydrochloric acid, sulfuric acid) or organic ⁇ eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, .benzoic acid, .methanesulfonic acid , Benzenesulfonic acid
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, bromide
  • organic ⁇ eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succ
  • NKT cell ligand is used to mean including its solvate (hydrate, etc.).
  • graft loss means that a part or all of the graft falls into function loss or destruction after transplantation.
  • graft loss refers to loss or destruction of the graft function due to innate immune reaction or inflammation caused by ischemic degeneration due to tissue invasion or infarction, for example, proinflammatory cytokines. (IFN-y, TNF-, IL-1 etc.) refers to loss of function or destruction of the graft and does not include rejection of the graft due to an acquired immune response. Innate immune response refers to the natural defense response of an individual.
  • TCR antigen receptor
  • BCR B cell receptor
  • graft loss can be “early graft loss”. “Early” refers to a period immediately after transplantation, for example, about 3 days or more after transplantation, preferably within about 24 hours after transplantation. '.' Graft loss may be associated with any tissue transplant. Examples of the tissue include knee island, knee, liver, heart, kidney, bone marrow, skin, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), muscle and the like.
  • the preventive agent of the present invention strongly suppresses IFN- ⁇ production from NKT cells and CD 1 1 b + cells, but knee islands (including / 3 cells etc.) are particularly sensitive to IFN- ⁇ ,
  • the prophylactic agent of the present invention is extremely effective for the prevention of transplantation loss associated with Kashiwajima transplantation.
  • the tissue to be transplanted is not only a tissue that has been removed from the living body, but also a cell that can constitute the tissue, a tissue that is manufactured from a stem cell or the like in vitro by regenerative medical technology (can constitute the tissue) Cell) and the like.
  • 8 cells can be produced in vitro from ES 'cells etc. (Science, 292, 1389-1394, 2001).
  • the genotype of the tissue used for transplantation is not particularly limited, but is usually allogeneic, allogeneic or xenogeneic, preferably allogeneic or allogeneic.
  • graft loss may be accompanied by transplantation to any site in the living body.
  • the site can be appropriately selected in consideration of the type of tissue to be transplanted and the like.
  • Graft loss can be associated with, for example, intrahepatic, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intravenous, intraarterial, subrenal capsule, and the like.
  • the preventive agent of the present invention can be extremely effective in preventing graft loss associated with transplantation into the liver.
  • the agent of the present invention may contain NKT ligand alone as an active ingredient or as a mixture with any other active ingredient for treatment.
  • the agent of the present invention comprises an effective amount of an active ingredient in combination with one or more pharmacologically acceptable carriers. In the meantime, it is manufactured by any method well known in the technical field of pharmaceutics.
  • Administration forms include tablets, powders, condyles, syrups, and injections.
  • Liquid preparations such as syrups suitable for oral administration include saccharides such as water, sucrose, sorbit, fructose, glycols such as polyethylene glycol, propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil. It can be produced using preservatives such as P-hydroxybenzoate esters, flavors such as stove leaf flavors and peppermint. Tablets, powders and granules include lactose, pudou lees, sucrose, mannit etc.
  • Formulations suitable for parenteral administration preferably comprise a sterile aqueous solution containing the active compound that is isotonic with the blood of the recipient.
  • a solution for injection is prepared using a carrier made of a salt solution, a puddle sugar solution, or a mixture of shionaga and pudo sugar solution.
  • parenteral agents are also selected from diluents, preservatives, flavors, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers, etc., exemplified for oral agents.
  • auxiliary ingredients can also be added.
  • the prophylactic agent of the present invention is administered to the recipient prior to transplantation.
  • the recipient can be any mammal. Examples of mammals include, but are not limited to, experimental animals such as rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and rabbits; domestic animals such as pigs, rabbits, goats, horses, and hidges; Pets such as Inu, cats; primates such as humans, monkeys, orangutans and chimpanzees.
  • the frequency of administration of the prophylactic agent of the present invention to the recipient is not particularly limited as long as graft loss can be prevented, but more powerfully induces functional modification of NKT cells (decrease in IF N- ⁇ production ability, etc.)
  • the preventive agent of the present invention can be used before transplantation. It may be given to the recipient more than once, for example 2 to 10 times, preferably 2 to 5 times.
  • the administration interval when administering the prophylactic agent of the present invention twice or more before transplantation is not particularly limited as long as graft loss can be prevented, but for example, 1 to 30 day intervals, preferably 1 to 14 day intervals, The interval is preferably 1 to 7 days.
  • the dosing interval is preferably constant, but not specifically determined.
  • the period from administration immediately before transplantation to transplantation time is not particularly limited as long as it can prevent loss of transplantation, but is, for example, 130 days, preferably ⁇ 14 days.
  • the dose of the prophylactic agent of the present invention varies depending on the administration form, patient age, body weight, type of tissue to be transplanted, transplant site, etc. 5 ⁇ gZm 2 1000 gZm 2 , preferably 50 ⁇ g / m 2 to 100 g / m 2 .
  • parenteral administration such as intravenous administration
  • 1 ⁇ g / m 2 to 100 gm 2 preferably 10 gZ m 2 to 10 g, m 2 is administered as the amount of active ingredient per administration.
  • this dose varies depending on the various conditions described above.
  • the present inventors have found that I- / production ⁇ 1 1 b + cells (Gr—1 + CD 1 1 b + cells etc.) induced by NKT cells after transplantation are transplanted. Proven to be an essential component of loss and a major cause. It was also found that the number of CD11b + cells at the transplantation site increased rapidly after transplantation. Based on these findings, the present invention provides the following method for screening a compound for prevention and treatment of graft loss.
  • NKT cells are activated by transplantation, and expression of various genes such as inflammatory site force-in is enhanced. Moreover, graft loss was significantly suppressed in VQ; 14NKT-deficient (J a 28 1-z-) mice compared to wild-type mice. Furthermore, the repetition of ⁇ —Ga1Cer, one of the NKT cell ligands. Repeated administration results in downregulation of IFN- ⁇ production from NKT cells 1 and significantly reduces graft loss. From the above findings, it is understood that compounds capable of suppressing the activation of sputum cells are useful as compounds for the prevention and treatment of graft loss.
  • the present invention provides a method for screening a compound for preventing and treating graft loss (screening method I), which comprises selecting a compound capable of suppressing the activation of sputum cells.
  • screening method I test compounds and sputum cells are usually provided first.
  • the test compound may be any known compound or novel compound, such as a nucleic acid, a protein, a lipid, a protein, a peptide, a low-molecular-weight organic compound, a compound library prepared using combinatorial chemistry technology, Examples of solid phase synthesis include random peptide libraries prepared by the fuzzy display method, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.
  • Vaginal cells are obtained from the above-mentioned mammalian tissues (eg, liver, lymph nodes, spleen, peripheral blood, thymus, lung, etc.) containing vaginal cells by a method known per se, based on vaginal cell traits. Can be isolated. Since ⁇ cells express two antigen receptors, ⁇ cell receptor ( ⁇ CR) and ⁇ receptor, using antibodies against these receptors, double positive of ⁇ cell receptor and ⁇ receptor By isolating the cells by a cell sorter, antibody magnetic bead method, etc., sputum cells can be obtained. For example, in mice, sputum cells can be TCR J3 + NK 1.1+ cells, CD3 + NK 1.1+ cells.
  • NKT cells are also composed of galactosylceramide (such as -Ga1Cer) in which the T cell receptor on the cell is presented on a CD1 (eg, CD I d) molecule, iso-Glopotrihexosylceramide, etc. Therefore, NKT cells can be obtained by isolating cells that specifically bind soluble CD1 multimers (eg, tetramers) loaded with the glycolipid using a cell sorter or the like. (Exp. Med., 192, p.741-754, 2000; J. Exp. Med., 191, p.189 5-1903, 2000). In addition, the repertoire of T cell receptors on NKT cells is very limited, specifically recognizing the T cell receptor repertoire specific to NKT cells. NKT cells can also be obtained by isolating them with a cell sorter or the like using an antibody that recognizes them. For example, in humans, NKf cells can be 24 + V / 311 + cells. .
  • NKT cells include cells proliferated in vitro after being isolated from tissue in a living organism and cell lines established. NKT cells can be proliferated in an in vitro manner by a method known per se. For example, sputum cells proliferate when cultured in the presence of dendritic cells pulsed with galactosylceramide. In addition, sputum cells can be established using a method known per se (J. Exp. Med., 191, p.105-114, 2000). In addition, NKT cells may be used for culturing in a state of being mixed with other cells (such as lymphocytes) (such as a mononuclear cell fraction).
  • other cells such as lymphocytes
  • NKT cells are activated in the presence of the test compound.
  • Activation of NKT cells can be performed by stimulating with a substance capable of inducing activation of NK.T cells in an appropriate culture medium.
  • the substance include the above-mentioned NKT cell ligand, TLR ligand (LPS, unmethylated CpG DNA, peptidoglycan, mycobacterum umbobis, double-stranded RNA, ⁇ -glucan, etc.
  • the culture medium include a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to 20% urine fetal serum, da / rebecko modified eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, etc. I can do it.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM da / rebecko modified eagle medium
  • RPMI1640 medium 199 medium, etc. I can do it.
  • the pH of the medium is about 6 to 8
  • the culture temperature is usually about 30 to 40 ° C
  • NK T cells previously treated with the test compound may be activated.
  • the culture medium, the pH of the medium, and the culture temperature when NKT cells are treated with the test compound are the same as described above, but the culture time is preferably about 1 to 30 days.
  • the activation method, culture medium, and culture conditions when activating NKT cells previously treated with a test compound are the same as those for activating NKT cells in the presence of the test compound.
  • Treatment of NKT cells with a test compound may be performed by administering the test compound to an animal.
  • animals include the above-described non-human mammals. Examination The compound may be administered once or multiple times.
  • NKT cells isolated from animals that have received the test compound are activated in vitro.
  • the activation method, culture medium, and culture conditions for activating NKT cells are the same as in the case of activating NKT cells in the presence of the conjugated compound. .
  • the degree of activation of NK T cells in the presence of the test compound is evaluated.
  • the degree of activation of NK T cells can be evaluated by using as an index the production of cytoforce-in such as IFN- ⁇ , the expression of genes whose expression levels can be changed with the activation, and the cytotoxicity.
  • the production of cytokines such as I] ⁇ - can be quantified by methods known per se for site-in transcripts (mRNA, etc.) or translation products (polypeptides, proteins). For example, the expression level of the transcript can be measured by preparing total RNA from cells and performing RT-PCR, Northern blotting, or the like.
  • the amount of translation product produced can be measured by various immunological techniques.
  • the amount of translation products in culture supernatants and cell extracts can be measured by radioisotope immunoassay (RIA), ELISA (Methods in Enzymol., 70: 419-439 (1980)), Western blot 3 ⁇ 4lj can be determined by the Ting method. It is also possible to directly measure translation products in cells using flow cytometry. , '
  • a gene whose expression level can vary with the activation of NKT cells, it is preferable to use a gene whose expression level increases in NKT cells activated by transplantation.
  • the gene include secreted protein-related genes such as AIF1, CXCL2, CXCL7, CXCL9, IL-1 j8, IL-lra, lymphotoxin ⁇ , CCR1, CD244, Fcyrllb, IL-13R ⁇ , MGL1, PIR -Receptor-related genes such as B, signal transduction-related genes such as Hck, MARCKS, PTPRO, and RASSF4, and transcription regulatory factor-related genes such as IRF-7, MafB, Runx2, and ZFHX1B.
  • secreted protein-related genes such as AIF1, CXCL2, CXCL7, CXCL9, IL-1 j8, IL-lra, lymphotoxin ⁇ , CCR1, CD244, Fcyrllb, IL-13R ⁇ , MGL
  • the expression of these genes can be quantified by a method known per se for gene transcription products (mRNA, etc.) or translation products (polypeptides, proteins, etc.) as in the above-described evaluation of cytodynamic in production.
  • a microarray or the like can also be used to comprehensively measure the expression of a plurality of genes. Then, the degree of activation of NKT cells in the presence of the test compound (or the degree of activation of NKT cells previously treated with the test compound) depends on the NK T cells in the absence of the test compound. Of activation (or the degree of activation of NKT cells not treated with the test compound). The comparison of the degree of activation is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the value of the degree of activation of NKT cells in the absence of the test compound is the activity of NKT cells in the presence of the test compound.
  • the degree of conversion or the degree of activation of NKT cells previously treated with the test compound
  • it may be a value measured in advance or a value measured simultaneously. It is preferable that the values are measured simultaneously from the viewpoint of accuracy and reproducibility. .
  • a compound capable of suppressing NKT cell activation is selected based on the comparison result.
  • 'A compound capable of suppressing the activation of NKT cells is useful as a compound for prevention / treatment of graft loss. Therefore, it becomes possible to select a candidate compound for a drug for prevention or treatment of a transplant loss or a reagent for research using the activation in NKT cells as an index. .
  • CD 11 b + cells (Gr-l + CDllb + cells, etc.) produce high levels of IFN- ⁇ at the transplantation site, and major IFN- ⁇ It is a gamma cell.
  • graft loss was significantly suppressed in IFN- ⁇ mice-no mice compared to wild-type mice.
  • repeated administration of 1 Ga 1, Cer suppresses I FN- ⁇ production from CD 1 1 b + cells and prevents graft loss. From the above findings, it is understood that compounds capable of suppressing IFN-y production in CD 11 b + cells are useful as compounds for preventing or treating graft loss.
  • the present invention provides a screening method (screening method II) for a compound for prevention / treatment of graft loss, which comprises selecting a compound capable of suppressing IFN- ⁇ production of CD 11 b + cells. It is.
  • a test compound and CD 1 1 b + cells are provided.
  • the test compound those similar to the screening method I described above are used.
  • the 'CD 1 1 b + (CD 1 1 b positive) cells used in the present invention may further have a phenotype of G r 1 1 + (G r-1 positive).
  • CD 1 1 b + cells are further divided into CD 1 1 c— (CD 1 1 c negative), CD86— (CD 86 negative), MH C class II— (MH C class II negative), F 4/80 + It may further have at least one, preferably all phenotypes selected from the group consisting of / -(F 4/80 weak positive) and CD 68 +/- (CD 68 weak positive).
  • CD.1 1 b + cells can be neutrophils. If the phenotype of CD11b + cells is defined by the marker noon that the animal species does not naturally possess, the species difference can be taken into account, for example, the phenotype is excluded from the analysis.
  • a cell when the expression of a cell is expressed by the presence or absence or strength of a marker molecule (cell surface antigen), unless otherwise specified, the expression of the cell is expressed by the presence or absence of specific binding by the antibody to the mer molecule.
  • the type is written.
  • the determination of the phenotype of a cell based on the presence or absence of marker molecule expression is usually performed by flow cytometry analysis using a specific antibody against the marker molecule.
  • “Positive” expression of a marker molecule means that the marker molecule is expressed on the cell surface (or in the cell) and specific binding by an antibody to the marker molecule can be confirmed.
  • strongly positive means that the expression level of the marker molecule is relatively high compared to other cells (or cell populations) that are comparative controls, and the cell population with a high expression level of the marker molecule is relatively high. This means that the proportion of the cell population expressing the marker molecule is relatively large.
  • weak positive means that the amount of marker molecule expressed is relatively low compared to other cells (or cell populations) that are comparative controls, and the cell population with low marker molecule expression is relatively large. This means that the proportion of the cell population expressing the marker molecule is relatively small.
  • CD 1 lb + cells are expressed in a manner known per se from the above mammalian tissues containing CD 1 1 b + cells (eg liver, spleen, lymph nodes, peripheral blood, thymus, etc.). It is possible to isolate based on the type. For example, it can be isolated by a cell sorter, an antibody magnetic bead method, or the like using an antibody that recognizes a cell surface antigen corresponding to the phenotype of the CD 11 b + cell described above.
  • CD 1 1 b + cells include cells grown in vitro and cell lines after being isolated from tissues in the body.
  • CD 1 lb + cells may be subjected to culture in a state of being mixed with other cells (such as lymphocytes and NKT cells) (eg, mononuclear cell fraction).
  • IFN- ⁇ production of CD 11 ID + cells is induced.
  • Induction of I FN- ⁇ production from CD 11 b + cells can be performed by stimulating with a substance capable of inducing I FN- ⁇ production of CD 11 b + cells in an appropriate culture medium.
  • the substance include the above-mentioned ligands, TLR ligands (LPS, non-methylated CpG DNA, peptidoglycan, mycopactericum bovis, double-stranded RNA, glucan, etc.) and the like.
  • Examples of the culture medium include a minimum essential medium (MEM), Dulbecco's modified Ig medium (DMEM), RPMI1640 medium, and 199 medium containing about 5 to 20% urchin fetal serum. I can do it.
  • the culture conditions are: medium: H is about 6-8, culture temperature is usually about 30-40 ° C, and culture time is about 1-96 hours.
  • IFN- ⁇ production of CD 11 b + cells in the presence of the test compound is quantified.
  • I FN- ⁇ production can be measured by a method similar to Screening Method I.
  • the amount of IFN-y produced by CD 1 1 b + cells in the presence of the test compound is compared with the amount of IFN- ⁇ produced by CD 1 1 b + cells in the absence of the test compound.
  • the production amount comparison is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the amount of IFN- ⁇ produced in CD11b + cells in the absence of the test compound was calculated in advance of the measurement of IFN- ⁇ produced in CD11b + cells in the presence of the test compound. Production measured although it may be a raw amount or a production amount measured at the same time, it is preferably a production amount measured at the same time from the viewpoints of experimental accuracy and reproducibility.
  • compounds that can suppress IFN- ⁇ production in CD 1 1 b + cells are selected '.
  • a compound that can suppress I- 7 production of CD 11 b + cells is useful as a compound for preventing and treating graft loss. Therefore, it is possible to select a drug for prevention of graft loss or a candidate compound for a research reagent using IFN-V production in CD 1 lb + cells as an index.
  • the screening method can also be performed by administering a test compound to an animal. Examples of animals include the above-described non-human mammals.
  • IFN- ⁇ production of CD 11 b + cells in the animal is induced in vivo, and the test compound is administered to the animal.
  • the test compound may be administered to the animal either before or after induction of IFN- ⁇ production.
  • a method for inducing IFN- production of CD.1 1 b + cells in vivo is not particularly limited.
  • a substance capable of inducing IFN-V production of CD 1 1 b + cells described above is used.
  • any transplantation model Preferably, a transplant model is used. Any model known per se can be used as the transplantation model, and the desired tissue is transplanted to any site in the living body of the non-human mammal recipient.
  • the knee island is transplanted into the liver of a non-human mammal recipient.
  • the “tissue” to be transplanted is preferably allogeneic and syngeneic with the recipient. This is because transplanting allogeneic or xenogeneic tissues can result in an acquired immune response at the same time as the graft loss response, making it difficult to assess the effect of the compound on graft loss. .
  • the IFN- ⁇ production of CD 11 b + cells in the animals to which the test compound has been administered is measured.
  • IFN- ⁇ production of CD 11 b + cells at the transplant site is measured.
  • Transplantation site includes the transplanted tissue itself and its colonization site. For example, when transplanting Kashiwajima to the liver, Includes planted islands and liver.
  • the time period for measuring I FN- ⁇ production of CD 11 b + cells is not particularly limited, but is preferably early after transplantation (for example, 30 minutes to 48 hours after transplantation).
  • the I FN—o / production of CD 1 1 b + cells can be determined, for example, by isolating the mononuclear cell fraction from the animal and determining the I FN— y life in the CD 1 1 b + cells contained in the mononuclear cell fraction. It can be evaluated by measuring with a flow cytometer.
  • the amount of I FN— ⁇ production depends on the number (or percentage) of I FN— y + CD 1 1 b + ′ cells and the amount of anti-I FN—y + antibody bound to CD 1 1 b + cells (may be fluorescence intensity) ) Etc. .
  • the IFN- ⁇ production of CD11b + cells in animals receiving the test compound was compared with the IFN-V production of CD11b + cells in control animals not receiving the test compound. Then, based on the comparison result, a compound capable of suppressing I FN- ⁇ production in CD 11 b + cells is selected.
  • the screening method using animals is excellent in that a compound having a desired effect can be obtained in vivo. (Screw ⁇ Jung method I I I)
  • transplantation activates sputum cells and enhances the expression of various genes such as inflammatory site force-in.
  • Vo l 4NKT deficient J a 28 1-z- mice and I FN- y mice - Bruno - In, graft loss compared to wild-type mice is significantly suppressed.
  • CD 11b + cells Gr-1 + CD11b + cells, etc.
  • Va 14 NKT deficiency In J ⁇ 28 1 ⁇ ⁇ —) mice and mice, I FN- ⁇ production from CD 1 1 b + cells is suppressed.
  • the present invention comprises the following steps, graft loss Prophylaxis of therapeutic compounds (Screening Method II ⁇ ) is provided:
  • (B) A step of selecting a compound capable of suppressing IFN- ⁇ production from CD 11 b + cells when NKT cells in the co-culture are stimulated.
  • step (ii) co-cultured ⁇ cells and CD 1.1 b + cells in the presence of the test compound.
  • the test compounds, NKT cells and CD 1 lb + cells are the same as those used in the screening methods I and I I described above.
  • the culture medium include a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to 20% urine fetal serum, Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, etc. I can do it.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • RPMI1640 RPMI1640 medium
  • 199 medium etc. I can do it.
  • the pH of the medium is about 6-8, and the culture temperature is usually about 30-40 ° C.
  • step (B) NKT cells in the co-culture product are stimulated. Stimulation is performed by adding the above-mentioned NKT ligand, TLR ligand (LP S, unmethylated Cp G DNA, peptide darican, mycouterum umbobis, double stranded RNA,] 3 glucan, etc.) to the co-culture. . By this stimulation, ⁇ ⁇ cysts are activated, and the activated cells further induce IFN- ⁇ production from CD11b + cells. The incubation time after stimulation is about 1 to about 96 hours.
  • NKT ligand LP S, unmethylated Cp G DNA, peptide darican, mycouterum umbobis, double stranded RNA,] 3 glucan, etc.
  • CD11b + cell IFN- V production in the presence of the test compound is quantified.
  • I FN- ⁇ production can be measured by a method similar to Screening Method I.
  • the amount of I FN- ⁇ produced by CD 1 1 b + cells in the presence of the test compound is compared with the amount of I FN- ⁇ produced by CD 1 1 b + cells in the absence of the test compound.
  • the production amount comparison is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • CD 1 1 b + I ⁇ [-7 production in cells in non absentia of the test compound, relative to CD 1 1 b + measurement of I FN- gamma production amount of cells in the presence of a test compound The production amount measured in advance or the production amount measured at the same time may be used, but the production amount measured at the same time is preferable from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
  • a compound that can suppress IFN-y production of CD 1 1 b + cells is selected.
  • a compound capable of inhibiting I FN- ⁇ production of CD 1 lb + cells induced by activated NKT cells is useful as a compound for prevention / treatment of graft loss.
  • the present invention provides a screening method (screening method IV) for a compound for prevention / treatment of graft loss, which comprises selecting a compound capable of suppressing an increase in the number of CD 11 b + cells at the transplantation site. It is. ,
  • This screening method is performed using the above-described transplantation model using a non-human mammal. Any model known per se can be used as the transplantation model, and the desired tissue is transplanted into any part of the living body of the non-human mammal recipient.
  • the “tissue” and “site in vivo” selected in this screening method are the same as described above.
  • the island is transplanted into the liver of a non-human mammal recipient.
  • the “tissue” to be transplanted is preferably allogeneic with the recipient. This is because transplanting allogeneic or xenogeneic tissues can result in an acquired immune response at the same time as the graft loss response, making it difficult to assess the effects of the compound on graft loss. .
  • the test compound is administered to the recipient animal. Administration time may be before or after transplantation.
  • the same compounds as described in Screening Method I can be used.
  • the number of CD11b + cells at the transplantation site of the recipient to whom the test compound is administered is measured.
  • the time to measure the number of CD 1 1 b + cells is not particularly limited, An early period after transplantation (eg, 30 minutes to 48 hours after transplantation) is preferred.
  • the number of CD 1 1 b + cells is, for example, a mononuclear cell fraction isolated from the transplant site and contained in the mononuclear cell fraction.
  • the number of CD 1 1 b + cells (or percentage) It can be evaluated by measuring first.
  • the number of CD11b + cells at the transplantation site of the recipient receiving the test compound is compared with the number of CD11b + cells at the transplantation site of the control recipient not receiving the test compound. Is done. The comparison of cell numbers is preferably based on the presence or absence of significant differences.
  • the number of CD 1 l b + cells at the transplantation site of the control recipient is the value measured in advance of the measurement of the number of CD1 1 b + cells at the transplantation site of the recipient to which the test compound was administered. The values measured at the same time may be used, but the values measured at the same time are preferred from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment. '.
  • a compound that can suppress the increase in the number of CD 11 b + cells at the transplantation site is selected based on the comparison result.
  • a compound capable of suppressing the increase in the number of CD 1 lb + cells at the transplantation site is useful as a compound for prevention / treatment of graft loss. Therefore, using the number of CD 1 1 b + cells at the transplantation site as an index, it is possible to select a drug for prognosis / treatment of transplant mortality or loss, or a candidate compound for a research reagent.
  • the compound obtained by the screening methods I to IV of the present invention can prevent and treat graft loss, it can be transplanted by formulating it as a medicine in the same manner as the preventive agent of the present invention. It can be used as a prophylactic or therapeutic agent.
  • mice were purchased from harles River Jaan (Kanagawa, Japan) and maintained in our animal facility. Male C 57 BL / 6 (H- 2 b) mice ⁇ Pi C 5 7 B LZ 6 background Vo;. 14NKT cell deficiency (J alpha 28 mice (10 1 5 weeks old) was used C 57 BL / 6 background IFN- ⁇ -deficient mice were provided by Dr. Y. Iwakuma of the University of Tokyo School of Medicine (Tagawa, Y., et. Al., 1997, J. Immunol., 159: 1418-1428) Animal protection was in accordance with our institutional guidelines.
  • Knee islands were isolated by static collagenase digestion followed by centrifugation in a F ico 1 1 -C onray gradient (Sutton, R., 1986, Transpla tation, 42: 689-69 l / 0htsuka, K., et. Al., 1997, Transplantation, 64: 63 3-639), transplanted into the liver of ST Z-induced diabetic mice via the portal vein (Kerap, CB, et. Al., 1973) , Nature, 244: 447).
  • Non-fasting plasma glucose levels and body weight were monitored three times a week before and after transplantation.
  • Normoglycemia was defined as a non-fasting glucose level lower than 2 consecutive 20 Omg / d 1 after transplantation.
  • ⁇ -Galactosylceramide (Hiichi Galcer) was synthesized in the laboratory of RI KEN RCA I and was also provided by Kirin Brewery Co., Ltd. (Kawano, T., et. al., 1997, Science, 278: 1626-1629).
  • 1 G ICer 100 ⁇ g / kg
  • vehicle 1% (v / v) DMSO, 0.0 25% (w / v) .Tween 8 0
  • spleen cells were cultured in the presence of ⁇ -G a ICer (100 ng / m 1) or vehicle.
  • the levels of IFN- ⁇ and IL-14 in the culture supernatant between 3 B were measured by ELIS.
  • Liver mononuclear cells obtained by gradient centrifugation were prepared as previously described (Ohtsuka, K., et. Al., 1997, Transplantation, 64: 633-6 39). . ,.
  • mAbs Monoclonal antibody (mAbs) used for flow cytometry, anti-mouse FcR ⁇ I / IIJ (2.4G2), fluorescein thiothionate (FITC) -conjugated anti-mouse C, D 3 ⁇ (1 4 5-2 C 1 1), FI TC-anti-CD 1 1 b (M 1-7 0), arophycocyanin (AP C) —conjugated anti I FN— y (XMG 1.
  • APC anti-IL—4 (1 1 B 1 1), Per CP—junction anti-G r—1 (R b 6-8 c 5), Per CP—C y 5.5 anti-G r— 1 (8 6— 8 C 5), FITC—anti-CD lib (M 1/70), FI TC—anti-CD llc (HL 3), FI TC—anti-CD 8 6 (GL— 1), FI TC—anti-I—A b (AF 6-1 20.
  • cells are treated with anti-FcR ⁇ IIZIII and neutravidin (Molecular Probe s, Inc., Eu gene, OR) and surface stained. The cells were fixed, permeabilized in Cytofix / Cytoperm solution (PharMingen) and stained with anti-IFN_ ⁇ and anti-IL-4 mAbs according to the manufacturer's instructions. Stained cells were analyzed on a FACSC aiibur (Beeton Dickinson, Muntain View, CA) and the data were processed by CEL LQ software (B. ecton Dickinson). Live cells were analyzed.
  • FACSC aiibur Beeton Dickinson, Muntain View, CA
  • Liver mononuclear cells were prepared as previously described (Transplantation, 64, 633-639, 1997). 0 G r -l + CD llb + cells and V a 14 N'K T cells were prepared with Mof lo TM (Dako Cytoraation , Glostrup) sorted by purity ⁇ 99% and 98%, respectively. Spleen dendritic cells (DCs) force Purified by MAC S R with anti-CD11 1c-coupled magnetic beads (Myltenyi Biotec) with a purity of 95%. ,
  • Monoclonal antibodies against Gr-1 or CD11b were injected intraperitoneally at the time of transplantation into STZ diabetic mice that received .200.
  • liver 14 ⁇ cells The mRNA expression in liver 14 ⁇ cells at 1 hour, 2 hours and 6 hours after knee island transplantation was analyzed by affimetlix gene chip.
  • IL-1 i3 mRNA levels in liver Vo Measured by.
  • Results for IL-1j3 were normalized by their respective HP RTT expression.
  • ⁇ (Statistical analysis)
  • V a 14 NKT cells reduces receptor expression. This suggests that V ⁇ 14 NKT cells were no longer detected by the a—Ga ICer—CD ld tetramer.
  • 14NKT cells collected 2-6 hours after transplantation produced inflammatory cytokines such as IFN- ⁇ and IL-1] 3 (Fig. 2 and Fig. 10). It was suggested that 14NKT cells are activated by transplantation. Following the disappearance of 14NKT cells, Va l 4NKT cells were analyzed as previously reported (Int. Immunol., .16, 241-247, 2004: Proc. Natl. Acad. Sci.
  • G r 1 1 + CD 1 1 b + Itodatsuki bun is CD 1,1 c one, CD 86—, MHC class II one, F 4/80 +/— , and CD 68+ — (Fig. 4), Morphologically they were neutrophils (Figure 5), suggesting that these cells are neutrophils.
  • the neutrophils that entered the transplanted knee island (Fig. 5) appeared to be effector cells. This is because the injection of antibodies against Gr-1 or CD11b prevented the rejection of the islet graft (Fig. 6).
  • CD 1 1 b + cells have a clear force S 6 days after immunization, whereas I FN — Production Q r— 1 + CD 1 1 b + cells are noted for many obvious differences, such as the fact that they appear shortly after transplantation (6 hr).
  • the repeated infusion Galcer injection force S, Vo; 14 IKT-y production by NKT cells could be modified and affect graft viability The effect of repeated a—G a 1 Cer stimulation on knee island transplantation was examined. When STZ-induced diabetic wild-type mice that received 400 islands were treated once with vehicle at the time of transplantation, all mice became normal blood sugar (Figure 8A).
  • mice that received 400 knee islands were treated with ex-Ga1Cer single injection (l OO / i gZk g), normoglycemia, even 60 days after transplantation None of the mice became (Fig. 8 B).
  • wild type mice force three times with ⁇ : —G al C er (1 00 / zg / kg) on days 15, 5, and 7 before induction of diabetes prior to knee island transplantation
  • transplantation of only 200 allogeneic knee islets restored normoglycemia in all recipient mice within 10 days (FIG. 8D).
  • One vehicle instead of G a 1 C er The mice remained hyperglycemic 60 days after transplantation (FIG. 8C).
  • the prophylactic agent of the present invention it is possible to prevent graft loss in clinical knee islet transplantation and the like, which can contribute to improvement in transplantation efficiency. For example, in the case of knee islet transplantation, due to early graft loss, a sufficient therapeutic effect can be achieved unless two or three donor islands are transplanted repeatedly for one recipient. However, if the prophylactic agent of the present invention is used, an equivalent therapeutic effect can be obtained with a smaller number of donor knee islands. '

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Abstract

本発明は、α−ガラクトシルセラミド等のＮＫＴ細胞リガンドを含有してなる、移植片喪失の予防剤を提供する。本発明の予防剤を用いれば、臨床における膵島移植等における移植片喪失を予防することが可能であるので、移植効率の向上に寄与し得る。また、ＮＫＴ細胞の活性化、ＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生等を抑制し得る化合物を選択することを含む、移植片喪失の予防・治療用化合物のスクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムによる早期移植片喪失の予防・治療薬を創出することができる。

Description

明細書
移植片喪失の予防剤、 及びそのスクリーニング方法 技 分野
本発明は、 島移植時等における移植片'喪失の予防剤に関する。 更に、 本発明 は該移植片喪失の予防 ·治療用化合物のスクリーニング方法等に'関する。 背景技術
膝臓の膝島移植は、 インスリン依存性糖尿病 （ i n s u l i n— d e p e n d e n t d i a b e t e s m e 1 1 i t u s : I DDM) の、治療のための非常 に有望なアプローチである。 しかしながら、 その手法は多くの理由、 特に、 移植 された滕島の早期移植片拒絶のためのその低効率により、 試験的なものに留まつ ている。 I DDMの患者は、 早期移植片喪失のために、 単独のドナー瞵臓からの 膝島の移植後には、インスリン非依存性を達成することができない（Ricordi, C, et. al. , 2004， Nat. Rev. Imuriol.， 4： 259-268/Shapiro, A. Μ··, 2000， N. E ngl. J. Med.', 343:230-238)。 早期膝島喪失は、 移植された眸島量の 50 %にま で起こると見積もられていて （Ryan, E. A., et. al. , 2002, Diabetes, 51:214 8-2157)、現在、 2— 3 ドナー鸱臓からの繰り返しの移植が、単独の糖尿病のレシ ピエントの良好な処置のために必要とされる （Ricordi, C. , et. al. , 2004, Na t. Rev. Imunol. , 4:259-268/Shapiro, A. M. , 2000， N. Engl. J. Med.， 343： 230-238)。 レシピエント肝臓内への移植に引き続き、 膝島移植片は門脈の末梢中 で塞栓 （emb o 1 i ) として互いにつかえて、 対応する領域の虚血性変性を生 じる。 これが、 瞵島移植片に対して有害な炎症性サイト力インの放出を生じる自 然免疫反応を引き起こし得る。 インスリン分泌 ;8細胞は、 I FN— γ、 TNF- ひ及び I L— 1 ;8の様な炎症誘発性 （p r o— i.n f 1 a mm a t o r y ) のサ ィトカインへの暴露に対して、インビトロで影響を受けやすい（Rabinovitch, A., 1993.， Diabetes Rev., 1: 215—240)。 'しかしながら、早期移植片喪失の発症メカニズムは十分には理解さ.れておらず、 このメカニズムを解明し、それに基づく早期移植片喪失の有効な予防薬を開発し、 膝島移植の効率を上昇させることが切望されている。
ナチュラルキラー T'細胞 （NKT細胞） は、 T細胞受容体 （TCR) と NK受 容体の 2つの抗原レセプターを発現しているリンパ球の一つである。 NKT細胞 は、 当該細胞上の T細胞受容体が CD 1 (例えば CD 1 d) 分子上に提示された . α—ガラクトシルセラミド （α— G a l C e r) やイソグロボトリへキソシルセ ラミドなどの糖脂貧を認識することを特徴とする（Science, 278, p.1626-1629, 1997/J. Exp.. Med.， 188，+ p.1521—1528, 1998/Science, 306， p.1786—1789， 2 004)。 通常の T細胞とは異なり、 NKT細胞上の T細胞受容体のレパートリーは 非常に限られている。 例えばマウス ΝΚΤ細胞 （Vo; 14ΝΚΤ細胞という場合. がある) 上の T細胞受容体の α鎖.は、 非多型性の V a 14及ぴ J α 28 1遺伝子 セグメントによりコードされており （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, p.8708 一 8712， 1986/Proc. N¾tl. Acad. Sci. USA, 88， p.7518—7522， 1991/J. Exp. Med. , 180, p.1097- 1106, 1994)、 ]3鎖の 90 %以上は V j8 8であり、他に V 7 や V0 2という限られたレパートリーが含まれ得る。 また、 ヒ ト ΝΚΤ細胞上の ， Τ細胞受容体は、.マウスの V α 14と相同性の高い非多型性の V a 24、 及び V β 8. 2に近縁の V ]3 1 1の'組み合わせであることが知られている。
ナチュラルキラー Τ細胞 （ΝΚΤ細胞） は、 自然及び獲得免疫系の橋渡しをす るリンパ球の異なるサブセットに属し、 急性反応において重要.な役割を果たす。 ΝΚΤ細胞は、 活性化後すぐに大量の I NF— γを産生し、 それが今度は自然免 疫系における ΝΚ細胞及び他の細胞、 並びに獲得免疫系における CD 4 T h 1細 胞及ぴ CD 8細胞障害性 T細胞を活性化する（Brigl, M. , et. al. , 2003, Nat. Immunol. , 4： 1230-1237/Taniguchi, M.， 2003, Ann. Rev. Immunol. , 21: 483 -513/Taniguchi, M. , et al. , 2003， Nat. Immunol. , 4： 1164-1165/ ilson, S. B. , et. al. , 2003, Nat. Rev. Immunol, 3： 211-222/Cui, J. , et. al. , 199 7, Science, 278： 1623 - 1626)。即ち、 V a 14 NKT細胞は、多様なバクテリア、 ウィルス、 カビ、 及び細胞内寄生虫に対する最前線防御として役割を果たしてい る（Taniguchi, M. 2003, Ann. Rev. Immunol. , 21： 483-513/Wilson, S. B. , et. al.， 2003， Nat. Rev. Immunol, 3: 211—222)。
ひ 一 G a 1 C e r処理による NK T細胞の活性化により、 I L一 4等の T h 2 サイト力イン産生が起こり、 自己免疫性 I型糖尿病の発症及び再発を防ぎ得るこ とが報告されている （Nature Medicine, vol.7, number 9, 1057-1062, 2001)。' また、 繰り返しの α— G a 1 C e r曝露により脾臓 T細胞からの I FN— y分泌 レベルが減少することが報告されている（Burdin, Ν.', 1999, Eur. J. Immunol, 29： 2014-2025) 0
一方、 水酸化アルミユウム （ァラム） により沈降させた抗原を免疫のために用 いたときに、ァラムにより誘導された I L一 4産生 G r一 1+CD 1 1 b+細胞が 液性応答における B細胞抗原プライミングに重要な.役割を果たしていることが報 告されている （Jordan, M. B. , 2004, Science.，· 304; 1808-1810)。
し力 し、移植片拒絶への NKT細胞や G r - 1+CD 1 1 b+細胞の寄与に関し ては知られていない。 .. .
上記事情に鑑み、，本発明は、 '新たなメカニズムに基づく移植片喪失の予防剤、 , 及ぴそのスクリー.ユング方法を提供することを目的とする。 発明の開示
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、 本発明者らは、 マウス膝島移植モデ ルにおいて、 V CK 1 4 NKT細胞によって移植後に創生される I FN— γ産生 G r一 1+CD 1 1 b+細胞が、 膝臓膝島移植における早期移植片喪失の、 必須の構 成要素であり、且つ、主要な原因であることを立証した。 Va 1 4 NKT欠損（J α 28 1 ~/_) マウスは、 I FN— γ産生 G r— 1 +CD 1 1 b+細胞を創生せず に、 移植された瞵島の早期移植片喪失を生じなかった。 Vひ 14NKT細胞のた めの特異的リガンドである α—G a 1 C e rの繰り返し投与により、 早期移植片 拒絶は首尾よく予防され、 G r— 1+CD 1 1 b+細胞による I FN— γ産生の劇 的な減少を起こした。 '
以上の知見に基づき、 本発明が完成された。
即ち、 本発明は以下に関する。 .
[1] ΝΚΤ細胞リガンドを含有してなる； 移植片喪失の予防剤。
[2] Ν.ΚΤ細胞リガンドは 一ガラクトシル ラミ ドである、 上記 [1] 記载 の剤。
[3] 移植片喪失は縢島移植に伴うものである、 上記 [1] 記載の剤。
[4] 移植片喪失は肝臓内への移植に伴うものである、 上記 [1] 記載の剤。
[5〕 移植前に 2回以上投与されること 特徴とする、 上記 [1] 記載の剤。
[6] ΝΚΤ細胞の活性化を抑制し得る化合物を選択することを含む、 移植片喪 失の予防 .治療用化合物のスクリーニング方法。 ·
[7] CD 1 1 b+細胞の I FN— 0産生を抑制し得,る化合物を選択することを 含む、 移植片喪失の予防 '治療用化合物のスクリーニング方法。
[8] 以下の工程を含む、 移植片喪失の予防 ·治療用化合物のスク.リー'ユング方 法：
(A)被検化合物の存在中で NKT細胞及び CD 1 1 b+細胞を共培養する工程；
(B) 共培養物中の NKT細胞を刺激したときの CD 1 l b+細胞からの I FN 一 γ産生を抑制し得る化合物を選択する工程。
[9] 移植部位における CD 1 1 b+細胞数の上昇を抑制し得る化合物を選択す 'ることを含む、 移植片喪失の予防 ·治療用化合物のスクリーニング方法。 ·
[10] 移植片喪失の予防剤を製造するための、 NKT細胞リガンドの使用。
[1 1] NKT細胞.リガンドは α—ガラク トシルセラミドである、 上記 [10] 記載の使用。
[1 2] 移植片喪失は膝島移植に伴うものである.、 上記 [10] 記載の使用。
[1 3] 移植片喪失は肝臓内への移植に伴うものである、 上記 [10] 記載の使 用。 [14] 移植前に 2回以上投与されることを特徴とする、 上記 [1 Q] 記載の使 用。
[1 5] 哺乳動物に、 NKT細胞リガンドの有効量を投与することを含む、 該哺 乳動物における移植片喪失の予防方法。
[1 6] NK T細胞リガンドは α—ガラタトシルセラミドである、 上記 [1 5] · 記載の方法。 ' · ' . '
[1 7] 移植.片喪失は膝島移植に伴うものである、 上記 [1 5] 記載の方法。
[1 8] 移植片喪失は肝臓内への移植に伴うものである、 上記 [1 5] 記載の方 法。 . '
[1 9] 移植前に 2回以上投与されることを特徴とする、 上記 [1 5] 記載の方 法。
本発明の予防剤を用いれば、 臨床における膝島移植等における移植片喪失を予 防することが可能であるので、 移植効率の向上に寄与し得る。 例えば、 膝島移植 においては、 従来、 早期移植片喪失のため、 一人のレシピエントに対して 2〜 3, 人分のドナー膝島を繰り返し移植しなければ、 十分な治療効果を達成することが できなかつだが、 本発明の予防剤を用いれば、 より少ない数のドナー膝島により , 同等の.治療効果を挙げることができる。
また、 本発明のスクリーニング方法を用いれば、 新たなメカニズムによる早期 移植片喪失の予防 ·治療薬を創出することができる。 図面の簡単な説明 +
図 1は、 Vo! 14 NKT細胞が同種同系膝島移植片の早期喪失に重要な役割を 果たしていることを示す図である。 左パネルにおいて、 個々の線は、 それぞれの 動物の非絶食血漿グルコースレベルを表す。 *重篤な糖尿病のため動物が死亡し たことを示す。 右パネルは、 移植から 60日後において試験された肝臓中の膝島 移植片の顕微鏡写真を示す。 HE ： へマトキシリンーェォシン。 AF ：アルデヒ ド一フクシン。 原倍率： X 100。 （A) S TZの静脈内注入後の C 57 B L/6 マウスにおける高血糖。 （B) 400個の膝島を移植された S TZ誘導糖尿病マウ スにおける正常血糖。 （C) 2 0 0個の睥島を移植された S TZ誘導糖尿病マウス における高血糖。 （D， E) 2 0 0個 （D) 又は 1 0 0個 （E) の膝島を移植され た S TZ誘導糖尿病 J'a 28 1—ハマウスにおける正常血糖。 （F， G， H) 2 0 0個の膝島が移植された STZ誘導糖尿病' J « 2 8 1— マウスへ、野生型（F)、 J ひ 2 8.1 _Z— (G)、 I FN— γ欠損 （Η) マウスからの肝臓単核球細胞 （5 Χ 1 06個） を門脈内注入した。
図 2は、 膝島移植後における I F N— y産生細胞の誘導のための V CK 1 4 NK T細胞の必要性を示す図である。 図中の数字は、 対応する領域中の細胞のパーセ ンテージを表す。 中央のヒストグラムにおいて、 ゲートされた CD 3+ a -G a l C e r— CD l dテトラマー陽性細胞の I F N- γ産生（実線） 力 陰性コン トロール （点線） と比較される。
図 3は、瞵臓移植後 6時間における I F Ν— 7産^ G r - 1+CD 1 l b +細胞 の誘導を示す図である。 図中の数字は、 対応する領域中の細胞のパーセンテージ を表す。 .
図 4ほ、 G r— 1, + CD 1 1 b +細胞の表面表現型を示す図である。表面発現（実 線） がコントロール （点線） と比較された。
図 5は、移植後 6時間の肝臓から単離された G r— 1+ CD l l b +細胞の組織 学的知見を示す写真である。 （i) May- Grmwald-Giemsa染色。 原拡大率： X 5 0 0。 （ii， iii, iv) インシュリン（ii)、 G r— 1 (iii)、及ぴ F 4 8 0 (iv)の免 疫組織学的染色。 矢頭は膝島内へ移植した侵入した G r— 1+細胞を示す。 原拡 大率： X 4 00。
図 6は、 2 0 0侗の膝島移植及び抗 G r一 1又は抗 CD 1 1 b抗体処理による 糖尿病の予防を示す図である。 （A) 対照抗体 （B) 抗 G r— 1抗体 （C) 抗体 C D 1 1 b抗体。
図 7は、 繰り返しの _G a 1 C e r処理後の NKT細胞のサイトカインプロ ファイルの変化を示す図である。 ひ 一 G a 1 C e r又はビヒクルを単回 （黒カラ ム）、又は 3回 （白カラム）腹腔内に注入されたマウスから精製され 肝臓 Vひ 1 4NKT細胞が、 d— G a l C e r ( 1 0 0 n g/m 1 ) 又はビヒクルによりパ ルスされた樹状細胞とともに培養され、 サイト力イン産生が E L I S Aにより測 定された。
図 8は、 繰り返しの a— G a 1 C e r処理による同種同系膝島移植片不全の予 防効果を示す図である。 個々の線は、 それぞれの動物の非絶食血漿グルコースレ ベルを表す。 *重篤な糖尿病による動物の死。 （A、 B) 単回 a— G a 1 C e r刺 激による膝島移植片の拒絶。 400個の同種同系膝島が、 膝島移植の時にビヒク ル （A) 又は a— G a 1 C.e r ( 1 00 μ g/k g) (B) の単回腹腔内注入で処 理された ST Z—誘導糖尿病 C 5 7 B L 6マウス内へ移植された。 （C, D)繰 り返しの α—G a 1 C e r刺激による眸島移植片不全の予防。 2 00個の同種同 系膝島が移植されたマウスが、 移棹の 3日前の S TZを注入される前の d a y 1 5、 1 1及び 7に、 ビヒクル （C) 又は α— G'a 1 ς e r (l O O ^ g/k g) で 3回処理された。 ，
図 9は、 G r— 1 +CD 1 1 b+細胞による I F N— γの産生に対する 」 G a 1 C e r処理の効果を示す図である。 図中の数字は対応する領域中の細胞のパー セントを表す。 4,0 0個又は 200個の同種同系膝島の移植 6時間後に単離され たナイーブマウス （A)、 野生型 （B及び D— F) 又は J ひ 2 8 (C) の移 植レシピエントからの肝臓単核球が解析された。 400個の膝島が移植されたマ ウスへ 1回、 ビヒクル（B、 C) 又は α— G a 1 C e r ( 1 0 Ο.μ g / k g ) (D) が注入された。 同様に、 20 0個の膝島が移植されたマウスへ、 3回、 ビヒクル (E) 又はひ 一 G a l C e r ( 1 00 / § ]£ §) (?) 力 移植の 3日前の: S T Zを静脈内へ注入する前の d a y 1 5、 1 1、 及ぴ 7に注入された。
図 1 0は、 脖島移植後の肝臓 Va 1 4NKT細胞における mRNA発現を示す 図である。 （A) affimetlix遺伝子チップによる mRNA発現解析結果が示され る。 ナイーブ V a 1 4NKT細胞よりも 6倍以上アップレギュレートされた遺伝 子が示される。 a、 b、 cは、 それぞれ、 縢島移植後 1時間、 2時間、 6時間の 時点で細胞を単離したことを示す。 （B)肝臓 Vひ 14NKT細胞における I L— 1 β mRNAレベルがリアルタイム RT—PCRにより測定された。 I L— 1 の.ための結果は、 それぞれの HP RT発現により標準化されている。 発明の詳細な説明
(1. 移植片喪失の予防剤）
本発明は NKT細胞リガンドを含有してなる、 移植片喪失の予防剤を提供する ものである。 理論には束縛されないが、 移植に先立って予めレシピエントに NK T細胞リガンドを投与する.ことにより、 レシピエント内の NKT細胞の機能改変 (I FN- V産生能の低下等)が'起こり、移植片周囲において NKTiB胞により誘 導され得る CD 1 1 b+細胞 （G r— 1 + CD 1 1 b +細胞等） 等からの I FN- γ放出が強力に抑制され、 I FN— γによる移植片の障害が防止される。
ΝΚΤ細胞は、 Τ細胞受容体 （TCR) と ΝΚ受容体の 2つの抗原レセプター を発現しているリンパ球の一つである。 ΝΚΤ細胞は、 当該細胞上の Τ細胞受容 体が CD 1 (例えば CD 1 d) 分子上に提示された下記の 「ΝΚΤ細胞リガンド J を認識する。 通常の T細胞とは異なり、 NKT細胞上の T細胞受容体のレパート リーは非常に限ら,れている。 例えばマウス NKT細胞 （V QJ 14NKT細胞とい う場合がある） 上の T細胞受容体の α鎖は、 非多型性の Υ α 14及び J « 28 1 遺伝子セグメントによりコードされており （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, p.8708-8712, 1986； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88， p.7518-7522, 1991; J. Exp. Med.， 180, p.1097-1106, 1994)、 j3鎖の 90 %以上は V j38であり,、他に V ]3 7や V /3 2という限られたレパートリーが含まれ得る。 また、 ヒ ト NKT細 胞上の T細胞受容体は、 マウスの Va 14と相同性の高い非多型性の V α 24、 及び V)38. 2に近縁の V/3 1 1の組み合わせであることが知られている。
「NKT細胞リガンド」 とは、 CD 1分子上に提示されたときに、 NKT細胞 上の T細胞受容体により特異的に認識され、 NKT細胞を特異的に活性化させ得 る化合物をいう。 本発明において使用される 「NKT細胞リガンド j としては、 例えば、 a—ヴリコシルセラミ ド、 イソグロボトリへキソシルセラ ド （Scienc e, 306, p.1786-1789, 2004) N O CH (Nature, 413:531, 2001)等を挙げること ができる。 ひ 一グリコシルセラミ ドは、 ガラク トース、 グルコースなどの糖類と セラミ ドとが α配位にて結合したスフインゴ糖脂質であり、 WO 9 3/0 5 0 5 5、 WO 9 4/0 2 1 6 8 , WO 9 4/0 9 0 2 0 , W09 4/ 24 1 4 2、 お よび WO 9 8/44 9 2 8、Science, 278, p.1626-1629, 1997 等に開示されて いるものを挙げることができる。 中でも、 （2 S， 3 S， 4 R) — 1— O— (a - D—ガラク トビラノシル） 一 2—へキサコサノィルァミノ一 1， 3， 4—ォクタ デカントリオール （本明細書中、 α—ガラクトシルセラミ ド又は α— G a 1 C e rと称する） が好まレぃ。
本明細書中、「NKT鈿胞リガンド Jは、その塩をも含む意味として用いられる。 NKT細胞リガンドの塩としては生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸） や塩基 (例：アルカリ金属塩） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容 される酸付加塩が好まレぃ。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩 酸、 リン酸、臭化水素酸、硫酸） との塩、 あるいは有機^ (例えば、.酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 .安息香酸、 .メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが挙げら れる。
また、 本明細書中、 「NKT細胞リガンド」 は、 その溶媒和物 （水和物等） をも 含む意味として用いられる。 ,
本明細書中 「移植片喪失」 とは、 移植後に移植片の一部又は全部が機能喪失又 は破壌に陥ることをいう。 また、 本明細書中 「移植片喪失」 は、 特に移植時の組 織の侵傷や梗塞による虚血性変性の結果生じる自然免疫反応や炎症による移植片 の機能喪失又は破壊、例えば炎症誘発性サイトカイン（I FN— y、 TNF— 、 I L一 1 等） による移植片の機能喪失又は破壌をいい、 獲得免疫反応による移 植片の拒絶を含まない。 自然免疫反応とは、 個体に生来備わる生態防御反応をい う。 獲得免疫反応とは、 抗原受容体 （T細胞受容体 （TCR)、 B細胞受容体 （BCR)、 抗体等） により特異的に認識される抗原を排除する反応をいい、 獲得免疫反応に よる拒絶には、 同種異系 （allogenic) 拒絶、 異種異系 （xenogenic) 拒絶、 及び 自己免疫疾患における自己組織の拒絶が含まれる。
本明細書における 「移植片喪失」 は、 「早期移植片喪失」 であり得る。 「早期」 とは、 移植直後、 例えば、 移植後約 3日以內、 好ましくは移植後約 2 4時間以内 の期間のことをいう。 ' . ' 移植片喪失は、 任意の組織の移植に伴うものであってよい。 該組織としては、 例えば、 膝島、 膝臓、 肝臓、 心臓、 腎臓、 骨髄、 皮膚、 肺、 消化管 （例：大腸、 小腸）、筋肉等を挙げることができる。本発明の予防剤は、 N K T細胞や C D 1 1 b +細胞からの, I F N—γ産生 強力に抑制するが、 膝島 （/3細胞等を含む） は I F N— γに対する感受性が特に高いので、 本発明の予防剤は脖島移植に伴う移. 植片喪失の予防に極めて有効である。
移植に供される組織は、 生体から摘出されたままの組織のみならず、 該組織を 構成し得る細胞、.再生医療技術により生体外で幹細胞等から製造された組織 （該 組織を構成し得る細胞を含む） 等をも含み得る。 例えば、 膝島 |8細胞は E S'細胞 等からインビトロで製造され得る （Science, 292, 1389-1394, 2001)。
移植に供される,組織の遺伝子型は、 特に限定されないが、 通常、 同種同系、 同 種異系又は異種異系であり、 好ましくは同種同系又は同種異系である。
また、 移植片喪失は、 生体内の任意の部位への移植に伴うものであってよい。 該部位は、 移植される組織の種類等を考慮して適宜選択することが可能である。 移植片喪失は、 例えば、 肝臓内、 皮下、 皮内、 腹腔内、 静脈内、 動脈内、 腎被膜 下等への移植に伴うものであり得る。 特に、 肝臓内には N K T細胞が高頻度に存 在しているため、 本発明の予防剤は肝臓内への移植に伴う移植片喪失の予防に極 めて有効であり得る。
本発明の剤は、 活性成分として N K Tリガンド単独で、 あるいは任意の他の治 療のための有効成分との混合物として含有することができる。 また、 本発明の剤 は、 有効量の活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一 緒に混合レ、 製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造 される。
投与経路は、 治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口また は、 例えば静脈内等の'非経口を挙げることができる。 投与形態としては、 錠剤、 散剤、 顆?^剤、 'シロップ剤、 注射剤等がある。 経口投与に適当な、 例えばシロッ プ剤のような液体調製物は、 水、 蔗糖、 ソルビット、 果糖等の糖類、 ポリエチレ グリコール、 プロピレングリコール等のグリコール類、 ごま油、 オリープ油、 大豆油等の油類、 P-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、 ス ト口べリーフ レーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。また、錠剤、 散剤および顆粒剤等は、 乳糖、 プドウ獰、 蔗糖、 マンニット等の賦形剤、 澱粉、 アルギン酸ソーダ等の崩壌剤、 ステアリン酸マグネシウム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビ ールアルコール、ヒ ドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸.エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。 非経口投与に適当な製剤は、 好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物 を含む滅菌水性剤からなる。 例えば、 注射剤の場合は、 塩溶液、 プドウ糖溶液ま たは塩永とプドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製す る。 また、 これら非経口剤においても、 経口剤で例示した希釈剤、 防腐剤、 フレ 一バー類、 賦形剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 結合剤、 界面活性剤、 可塑剤等から選択さ れる 1種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
本発明の予防剤は、移植に先立ちレシピエントに投与される。,レシピエントは、 任意の哺乳動物であり得る。 哺乳動物としては、 特に限定されないが、 例えば、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 モルモッ ト等のげつ歯類やゥサギ等の実験動物； ブタ、 ゥシ、 ャギ、 ゥマ、 ヒッジ等の家畜；ィヌ、 ネコ等のぺット ；ヒト、 サル、 オランウータン、 チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
本発明の予防剤のレシピエントへの投与回数は、 移植片喪失を予防し得る限り 特に限定されないが、 より強力に N K T細胞の機能改変（ I F N- γ産生能の低下 等） を誘導し、 移植片喪失をより確実に防ぐため、 本発明の予防剤は移植前に 2 回以上、例えば 2〜 10回、好ましくは 2〜 5回、レシピエントに投 され得る。 本発明の予防剤を移植前に 2回以上投与するときの投与間隔は、 移植片喪失を予 防し得る限り特に限定されないが、 例えば 1〜30日間隔、 好ましくは 1〜 14 日間隔、 より好ましくは 1〜7日間隔である。 投与間隔は一定であることが好ま しいが、 特に琅定され.ない。 また、 移植直前の投与から移植時までの期間は、'移 植片喪失を予防し得る限り特に限定されないが、 例えば 1 30日、 好ましくは 〜 14日である。
本発明の予防剤の投与量は、 投与形態、 患者の年齢、 体重、 移植する組織の種 類、 もしくは移植部位等により異なるが、 通常経口の場合、 1回の投与につき、 活性成分量とレて、 5 β gZm2 1000 gZm2、 好ましくは 50 μ g/m2 〜 100 g/m2を投与する。 静脈内投与等の非経口投与の場合、 1回の投与に つき、 活性成分量として、 1 β g/m2〜 l 00 g m2 好ましくは 10 gZ m2〜 10 g,m2を投与する。 しかしながら、 これ 投与量に関しては、 前述の 種々の条件により変動する。
. . . (2. 移植片喪失の予防■治療用化合物のスクリーニング方法）
後述の実施例に示されるように、 本発明者らは、 移植後に NKT細胞によって 誘導される I ー /産生〇 1 1 b+細胞 （G r— 1+CD 1 1 b +細胞等） が 移植片喪失の必須の構成要素であり、 且つ、 主要な原因であることを立証した。 また、 移植後に移植部位における CD 1 1 b+細胞の数が急増すること等が見出 された。 これらの知見に基づき、 本発明は、 以下の移植片喪失の予防，治療用化 合物のスクリーユング方法を提供するものである。
(スクリー ング方法 I)
後述の実施例に示されるように、 移植により NKT細胞が活性化し、 炎症性サ イト力イン等の多様な遺伝子発現が亢進する。 また、 V Q; 14NKT欠損 （J a 28 1- z- ) マウスにおいては、 野生型マウスと比較して移植片喪失が有意に抑 制されている。 更に、 NKT細胞リガンドの 1つである α— G a 1 C e rの繰り 返し投与により、 NKT細胞からの I FN— γ産生のダウンレギュ 1/ーションが 起こり、 移植片喪失が有意に抑制される。 以上めような知見から、 ΝΚΤ細胞の 活性化を抑制し得る化合物は、 移植片喪失の予防 '治療用化合物として有用であ ることが理解される。 従って、 本発明は ΝΚΤ細胞の活性化を抑制し得る化合物 を選択することを含む、 移植片喪失の予防 '·治療用化合物のスクリーニング方法 (スクリーニング方法 I ) を提供するものである。 . ' スクリーニング方法 Iにおいては、 通常、 まず被検化合物及び ΝΚΤ細胞が提 供される。 被検化合物は、 いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、 例えば、 核酸、.糠質、 脂質、 蛋白質、 ペプチド、 有機低分子化合物、 コンビナト リアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、 固相合成ゃフ ァージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、 あるい は微生物、 動植物、 海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
ΝΚΤ細胞は自体公知の方法によって、 Ν ΚΤ細胞を含有する上述の哺乳動物 の組織 （例えば、.肝臓、. リンパ節、 脾臓、 末梢血、 胸腺、 肺等） から、 ΝΚΤ細 胞の形質に基づいて単離することが可能である。 ΝΚΤ細胞は、 Τ細胞受容体（Τ CR) と ΝΚ受容体の 2つの抗原レセプターを発現しているので、 これらの受容 体に対する抗体を用いて、 Τ細胞受容体と ΝΚ受容体の二重陽性細胞をセルソー ター、 抗体磁気ビーズ法等により単離することで、 ΝΚΤ細胞を得ることができ る。 例えばマウスにおいては、 ΝΚΤ細胞は TCR J3+NK 1. 1 +細胞、 CD 3 +NK 1. 1+細胞であり得る。 また、 NKT細胞は、 当該細胞上の T細胞受容体 が CD 1 (例えば CD I d) 分子上に提示されたひ 一ガラクトシルセラミ ド.（ひ -G a 1 C e r ) やイソグロポトリへキソシルセラミ ドなどの糖脂質を認識する ので、 当該糖脂質がロードされた可溶性の CD 1多量体 （例えば四量体） が特異 的に結合する細胞をセルソーター等により単離することで、 NKT細胞を得るこ とができる （ Exp. Med.， 192， p.741-754, 2000； J. Exp. Med. , 191， p.189 5-1903, 2000)。更に、 NKT細胞上の T細胞受容体のレパートリーは非常に限ら れているので、 NKT細胞に特異的な T細胞受容体のレパートリーを特異的に認 識する抗体を用いて、 セルソーター等により単離することで、 NKT細胞を得る こともできる。 例えば、 ヒトにおいては、 NKf細胞は 24+V/3 1 1+細胞 であり得る。 .
NKT細胞は、 生体'中の組織から単離された後に、.インビトロで増殖された細 胞ゃ、 株化された細胞をも含む。 NKT細胞は、 自体公知の方法によりインピ'ト 口で増殖させることが可能であり、 例えば、 ガラクトシルセラミ ドがパルス された樹状細胞の存在下で培養されることにより、 ΝΚΤ細胞は増殖する。また、 ΝΚΤ細胞の株化は、 自体公知の方法 （J. Exp. Med., 191， p.105-114, 2000) を用いて行うことが可能である。 また、 NKT細胞は他の細胞 （リンパ球等） と 混合された状態 （単核球画分など） で培褰に供されてもよい。
次に、 被検化合物の存在中で、 NKT細胞が活性化される。 NKT細胞の活性 化は、 適切な培養培地中で、 NK.T細胞の活性化を誘導し得るような物質で刺激 することにより行われ得る。 該物質としては、 上述の NKT細胞リガンド、 TL Rリガンド （L P S、 非メチル化 C pG DNA、 ペプチドグリカン、 マイコバ クテリゥムボビス、 二本鎖 RNA、 βグルカン等) 等を挙げることができる。 培 養培地としては、 例えば、 約 5〜 20 %のゥシ.胎仔血清を含む最少必須培地 （ME M)、 ダ/レべッコ改変イーグル培地 （DMEM)、 RPMI1640培地、 199培地などを挙げる ことが出来る。 培養条件としては、 培地の pHは約 6〜8であり、 培養温度は通 常約 30〜 40 °Cであり、 培養時間は約 1 ~ 96時間である。
また、 被検化合物の存在中で NKT細胞を活性化する代わり.に、 予め被検化合 物で処理された N K T細胞を活性化してもよい。 被検化合物で N K T細胞を処理 する際の培養培地、 培地の pH、 培養温度は上述と同様であるが、 培養時間は約 1〜30日が好ましい。 予め被検化合物で処理された NKT細胞を活性化させる 際の活性化方法、 培養培地、 培養条件は、 被検化合物の存在中で NKT細胞を活 性化させる場合と同様である。
被検化合物による NKT細胞の処理は、 被検化合物の動物への投与により行わ れてもよい。 動物としては、 例えば、 上述の非ヒト哺乳動物が挙げられる。 被検 化合物の投与回数は 1回であっても複数回であってもよい。 次に、 裨検化合物が 投与された動物から単離された N K T細胞がインビト口で活性化される。 N K T 細胞を活性化させる際の活性化方法、 培養培地、 培養条件は、 被搀化合物の存在 中で N K T細胞を活性ィ匕させる場合と同様である。 .
次に、 被検化合物の存在中での N K T細胞の活性化の程度 （又は予め被検化合 物で処理.された N K T細胞の活性化の程度） が評価される。' N K T細胞の活性化 .の程度は、 I F N— γ等のサイト力イン産生、 活性化に伴い発現量が変動し得る 遺伝子の発現、 細胞傷害性等を指標に評価することができる。 I ]^ー 等のサ ィトカイン産生は、 サイ ト.力インの転写産物 （mRNA等） 又は翻訳産物 （ポリぺプ チド、 タンパク質 ）.を対象として自体公知の方法により定量できる。 例えば、 転写産物の発現量は、 細胞から total RNAを調製し、 RT- PCR、 ノザンブロッティ ング等により測定され得る。 また > 翻訳産物の産生量は、 種々の免疫学的手法に より測定され得る。 例えば、 培養上清や細胞からの抽出物中の翻訳産物の量は、 放射性同位元素免疫測定法 （RIA法）、 ELISA法 (Methods in Enzymol. , 70： 419 -439 (1980) )、 ウェスタンブロッテイング法などにより ¾lj定することが出来る。 また、 細胞中の翻訳産物をフローサイトメ トリー等により直接測定することも出 , 来る。 , '
N K T細胞の活性化に伴い発現量が変動し得る遺伝子としては、 移植により活 性化された N K T細胞において発現量が増大する遺伝子を用いることが好ましい。 該遺伝子としては、例えば、 AIF1, CXCL2, CXCL7, CXCL9, IL-1 j8 , IL-lra, リン ホトキシン α等の分泌タンパク質関連遺伝子、 CCR1, CD244, Fc y rllb, IL-13R α、 MGL1, PIR- B等の受容体関連遺伝子、 Hck, MARCKS, PTPRO, RASSF4等のシグ ナル伝達関連遺伝子、 IRF- 7, MafB, Runx2, ZFHX1B等の転写調節因子関連遺伝子 等を挙げることができる。 これらの遺伝子発現は、 上述のサイト力イン産生の評 価と同様に、 遺伝子の転写産物 （mRNA等） 又は翻訳産物 （ポリペプチド、 タンパ ク質等） を対象として自体公知の方法により定量できる。 また、 複数の遺伝子の 発現を網羅的に測定するためにマイクロアレー等を用いることもできる。 そして、 被検化合物の存在中での NKT細胞の活性化の程度 （又は予め被検化 合物で処理された NKT細胞の活性化の程度） が、 被検化合物の不在中での NK T細胞の活性化の程度 （又は被検化合物で処理されていない NKT細胞の活性化 の程度） と比較される。 活性化の程度の比較は、 好ましくは、 有意差の有無に基 づいて行なわれる。 被検化合物の不在中での NKT細胞の活性化の程度 （又ほ被 検化合物で処理されていない NKT細胞の活性化の程度） の値は、 被検化合物の 存在中での N K T細胞の活性化の程度 （又は予め被検化合物で処理された N K T 細胞の活性化の程度） の測定に対し、 事前に測定した値であっても、 同時に測定 した値であってもよいが、 .実験の精度、 再現性の観点から同時に測定した値であ ることが好まレぃ。 .
最後に、 比較結果に基づいて、 NKT細胞の活性化を抑制し得る化合物が選択 される。' NKT細胞の活性化を抑制し得る化合物は、 移植片喪失の予防■治療用 化合物として有用である。 従って、 NKT細胞における活性化を指標として、 移 植片喪失の予防 ·治療用の医薬、 又は研究用試薬のための候補化合物を選択する ことが可能となる。 . '
(スタリ一ユング方法 I I )
後述の実施例に示されるように、 移植部位において CD 1 1 b+細胞 （G r— l + CD l l b+細胞等） が高レベルの I FN- γを産生しており、 かつ主要な I FN- γ細胞である。 また、 I FN— γマウス—ノ—においては、 野生型マウスと比 較して移植片喪失が有意に抑制されている。 更に、 一 G a 1 ,C e rの繰り返し 投与により CD 1 1 b+細胞からの I FN— γ産生が抑制され、 移植片喪失が予 防される。 以上のような知見から、 CD 1 1 b+細胞の I FN— y産生を抑制し 得る化合物は、 移植片喪失の予防 '治療用化合物として有用であることが理解さ れる。 従って、 本発明は CD 1 1 b+細胞の I FN— γ産生を抑制し得る化合物 を選択することを含む、 移植片喪失の予防 ·治療用化合物のスクリーニング方法 (スクリーニング方法 I I ) を提供するものである。 スクリ一二ング方法 I Iにおいては、 まず被検化合物及び CD 1 1 b+細胞が 提供される。 被検化合物は、 上述のスクリーニング方法 I と同様のものが用いら れる。
本発明に用いられる' CD 1 1 b+ (CD 1 1 b陽性)細胞は、更に G r一 1+ (G r— 1陽性） の表現型を有し得る。 また、 CD 1 1 b+細胞は、 更に、 CD 1 1 c— (CD 1 1 c陰性）、 CD86— (CD 86陰性）、 MH Cクラス I I— (MH Cクラス I I陰性）、 F 4/80+/- (F 4/80弱陽性）、及び CD 68 +/— (C D 68弱陽性） からなる群から選択される少なくとも 1つ、 好ましくは全ての表 現型を更に有し得る。 CD.1 1 b+細胞は好中球であり得る。 尚、 動物種が生来 的に保有していないマーカー分午により CD 1 1 b+細胞の表現型が定義される 場合には、 当該表現型は解析から除外されるなど、 種差が考慮され得る。
本明細書において、 細胞の表現犁をマーカー分子 （細胞表面抗原） 発現の有無 や強弱で表す場合、 特に断りのない限り、 当該マー 一分子に対する抗体による 特異的結合の有無や強弱で細胞の表現型が表記される。 マーカー分子の発現の有 無や強弱による細胞の表現型の決定は、 通常、 当該マーカー分子に.対する特異的 抗体等を用いたフローサイトメ トリー解析等により行われる。 マーカー分子の発 現が 「陽性」 とは、 該マーカー分子が細胞表面上 （或いは細胞内） に発現してお り、 当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合が確認できることをいう。 このうち 「強陽性」 とは、 比較対照である他の細胞 （又は細胞集団） と比べて、 マーカー分子の発現量が相対的に高い、 マーカー分子の発現量 高い細胞集団が 相対的に多い、 マーカー分子を発現している細胞集団の割合が相対的に多いこと 等をいう。 「弱陽性」 とは、 比較対照である他の細胞 （又は細胞集団） と比べて、 マーカー分子の発 ¾量が相対的に低い、 マーカー分子の発現量の低い細胞集団が 相対的に多い、 マーカー分子を発現している細胞集団の割合が相対的に少ないこ と等をいう。
CD 1 1 b +細胞の表現型について F 4 Z 80+/—、 CD 68+/—と表される場 合、 比較対照の細胞としてマクロファージが意図される。 CD 1 l b +細胞は自体公知の方法によって、 CD 1 1 b+細胞を含有する上述 の哺乳動物の組織 （例えば、 肝臓、 脾臓、 リン 節、 末梢血、 胸腺等） から、 C D 1.1 b+細胞の表現型に基づいて単離することが可能である。 例えば、 上述の CD 1 1 b+細胞の表現型に対応する細胞表面抗原を認識する抗体を用いて、 セ ルソーター、 抗体磁気ビーズ法等により単離することができる。
CD 1 1 b+細胞は、 生体中の組織から単離された後に、 'インビトロで増殖ざ れた細胞や、 株化された細胞をも含む。 また、 CD 1 l b+細胞は他の細胞 （リ ンパ球、 NKT細胞等） と混合された状態 （単核球画分など） で培養に供されて もよい。
次に被検化合物の存在中で、 CD 1 1 ID +細胞の I F N— γ産生が誘導される。 CD 1 1 b+細胞からの I FN- γ産生の誘導は、 適切な培養培地中で、 CD 1 1 b+細胞の I FN— γ産生を誘導し得るような物質で刺激することにより行われ 得る。 該物質としては、 上述の ΝΚΤリガンド、 TLRリガンド （LP S、 非メ チル化 C p G DNA、 ペプチドグリカン、 マイコパクテリゥムボビス、 二本鎖 RNA、 グルカン等） 等を挙げることができる。 培養培地としては、 例えば、 約 5〜 20 %のゥシ胎仔血清を含む最少必須培地 （MEM)、 ダルべッコ改変ィ一グ ル培地 （DMEM)、 RPMI1640培地、 199培地などを挙げることが出来る。 培養条件と しては、 培地の： Hは約 6〜8であり、 培養温度は通常約 30〜40°Cであり、 培養時間は約 1〜 96時間である。
次に、 被検化合物の存在中での CD 1 1 b+細胞の I FN— γ産生が定量され る。 I FN— γ産生は、 スク リーニング方法 Iと同様の方法により測定すること できる。
そして、 被検化合物の存在中での CD 1 1 b+細胞の I FN— y産生量が、 被 検化合物の不在中での CD 1 1 b+細胞の I FN— γ産生量と比較される。 産生 量の比較は、 好ましくは、 有意差の有無に基づいて行なわれる。 被検化合物の不 在中での CD 1 1 b+細胞における I FN—γ産生量は、 被検化合物の存在中で の CD 1 1 b+細胞における I FN— γ産生量の測定に対し、 事前に測定した産 生量であっても、 同時に測定した産生量であってもよいが、 実験の精度、'再現性 の観点から同時に測定した産生量であることが好ましい。
最後に、 比較結果に基づいて、 CD 1 1 b+細胞の I FN— γ産生を抑制し得 る化合物が選択される'。 上述の様に、 CD 1 1 b+細胞の I ー7産生を抑制 し得る化合物は、 移植片喪失の予防 ·治療用化合物として有用である。 従って、 CD 1 l b +細胞における I FN— V産生を指標として、 移植片喪失の予防 '治 療用の医薬、 又は研究用試薬のための候補化合物を選択する とが可能となる。 尚、 本スクリ一ユング方法はまた、.被検化合物の動物への投与により行われ得 る。 動物としては、 例えば、 上述の非ヒト哺乳動物が挙げられる。 動物を用いて 本発明のスクリーニング方法が行われる場合、 例えば、 インビボで動物中の CD 1 1 b+細胞の I FN— γ産生を誘導し、 該動物へ被験化合物が投与される。 動 物への被検化合物の投与は、 I FN— γ産生誘導の前でも後でもよい。 インビポ で CD.1 1 b+細胞の I FN— 産生を誘導する方法としては、 特に限定されな いが、 例えば、 上述の CD 1 1 b+細胞の I FN— V産生を誘導し得るような物 質の投与や、 任意の移植モデル等を挙げることができる。 好ましくは、 移植モデ ルが用いられる。 移植モデルとしては、 自体公知のモデルのいずれをも使用する こと 可能であり、 所望の組織が、 非ヒ ト哺乳動物レシピエントの生体内の任意 の部位へ移植される。 本スグリーニング方法において選択される 「組織」、 「生体 内の部位」 は上述と同様である。 好ましくは、 膝島が非ヒ ト哺乳動物レシピエン トの肝臓内へ移植される。 ここで、 移植に供される 「組織」 はレシピエントと同 種同系であることが好ましい。 同種異系又は異種異系の組織を移植すると、 移植 片喪失に係る反応と同時に獲得免疫反応が生じるため、 移植片喪失に対する化合 物の効果を評価することが困難となる場合があるからである。
次に被検化合物が投与された動物における CD 1 1 b+細胞の I FN— γ産生 が測定される。 移植モデルにおいては、 好ましくは、 移植部位における CD 1 1 b+細胞の I FN— γ産生が測定される。 「移植部位」 は、 移植された組織自体及 びその定着部位を含む。 例えば、瞵島を肝臓に移植した場合は、 「移植部位」 は移 植された滕島及び肝臓を含む。 CD 1 1 b+細胞の I FN— γ産生を.測定する時 期は、 特に限定されないが、 移植後の早い時期 （例えば移植の 30分〜 48時間 後） .が好ましい。 CD 1 1 b+細胞の I FN—o/産生は、 例えば、.動物から単核 球画分を単離し、 該単核球画分中に含まれる CD 1 1 b+細胞における I FN— y產生をフローサイ トメ一ターなどで測定することにより評価することができる。
I FN— γ産生量は、 I FN— y +CD 1 1 b+'細胞の数 （又は割合） や、 CD 1 1 b+細胞への抗 I FN— y+抗体の結合量 （蛍光強度であり得る） 等として決定 される。 . .
そして、 被検化合物が投与された動物に ける CD 1 1 b+細胞の I FN— γ 産生が、 被検化合物を投与されていない対照動物における CD 1 1 b +細胞の I FN— V産生と比較され、 比較結果に基づいて、 CD 1 1 b+細胞の I FN— γ 産生を抑制し得る化合物が選択される。 動物を用いたスクリーニング方法は、 ィ ンビボ.において所望の効果を奏する化合物を得ることが出来る点で優れている。 (スクリ ^ユング方法 I I I )
後述の実施例に示されるように、 移植により ΝΚΤ細胞が活性化し、 炎症性サ イト力イン等の多様な遺伝子発現が亢進する。 また、 Vo! l 4NKT欠損 （J a 28 1—z— ) マウス及び I FN— yマウス—ノ—においては、 野生型マウスと比較 して移植片喪失が有意に抑制されている。 野生型マウスにおいては、 移植部位に おいて CD 1 1 b+細胞 （G r— 1+CD 1 1 b +細胞等） が高レベルの I FN - γを産生しているが、 Va 14 NKT欠損（ J α 28 1— κ— )マ,ウスにおいては、 CD 1 1 b+細胞からの I FN- γ産生が抑制されている。 更に、 ΝΚΤ細胞リガ ンドの 1つであるひ一 G a 1 C e rの繰り返し投与により、 NKT細胞の機能を 改変することにより.、 CD 1 1 +細胞からの I F N— γ産生が抑制され、 移植 片喪失が予防される。 これらの知見から、 移植時に活性化された ΝΚΤ細胞が C D 1 1 b+細胞の I FN— γ産生を誘導し、 これが移植片喪失の主要な原因であ り、 この誘導を阻害し得る化合物は、 移植片喪失の予防 ·治療用化合物として有 用であることが理解される。 従って、 本発明は、 以下の工程を含む、 移植片喪失 の予防 '治療用化合物のスクリーニング方法 （スクリーニング方法 I I Γ) を提 供するものである ：
(A)被検化合物の存在中で NKT細胞及び CD 1 1 b+細胞を共培養する工程；
(B) 共培養物中の NKT細胞を刺激したときの CD 1 1 b+細胞からの I FN 一 γ産生を抑制し得る化合物を選択する工程。
工程 （Α) では 被検化合物の存在中で ΝΚΤ細胞及び CD 1.1 b +細胞を共 培養する。 被検化合物、 NKT細胞及び CD 1 l b+細胞は、 上述のスクリー二 ング方法 I、 I Iと同様のものが用いられる。 培養培地としては、，例えば、 約 5 〜 20 %のゥシ胎仔血清を含む最少必須培地 （MEM)、 ダルべッコ改変最少必須培 地（DMEM)、 RPMI1640培地、 199培地など'を挙げることが出来る。 培養条件として は、 培地の pHは約 6〜8であり、 培養温度は通常約 30〜40°Cである。
工程'（B) では、 まず、 共培養.物中の NKT細胞が刺激される。 刺激は、 上述 の NKTリガンド、 TLRリガンド （LP S、 非メチル化 Cp G DNA、 ぺプ チドダリカン、 マイコ クテリゥムボビス、 二本鎖 RNA、 ]3グルカン等) 等を 共培養物に添加することにより行われる。 この刺激により、 · ΝΚΤ^Β胞が活性化 し、 更 活性化された ΝΚΤ細胞が CD 1 1 b+細胞からの I FN—γ産生を誘 導する。. 刺激後の培養時間は約 1〜約 96時間である。
次に、 被検化合物の存在中での CD 1 1 b+細胞の I FN— V産生が定量され る。 I FN— γ産生は、 スク リーニング方法 Iと同様の方法により測定すること できる。
そして、 被検化合物の存在中での CD 1 1 b+細胞の I FN— γ産生量が、 被 検化合物の不在中での CD 1 1 b+細胞の I FN— γ産生量と比較される。 産生 量の比較は、 好ましくは、 有意差の有無に基づいて行なわれる。 被検化合物の不 在中での CD 1 1 b+細胞における I ^[ー7産生量は、 被検化合物の存在中で の CD 1 1 b+細胞における I FN— γ産生量の測定に対し、 事前に測定した産 生量であっても、 同時に測定した産生量であってもよいが、 実験の精度、 再現性 の観点から同時に測定した産生量であることが好ましい。 最後に、 比較結果に基づいて、 CD 1 1 b+細胞の I FN— y産生.を抑制し得 る化合物が選択される。 活性化された NKT細胞により誘導される CD 1 l b + 細胞.の I FN— γ産生を阻害し得る化合物は、 移植片喪失の予防 ·治療用化合物 として有用である。 '
(スクリーニング方法 I V) '
後述の実施例に示されるように、 移植を行った後に、 移植部位における CD 1 1 b+細胞の数が劇的に上昇する。 そして、 この CD 1 1 b+細胞が移植部位にお ける主要な I FN— γ産生である。 このような知見から、 移植部位における CD 1 1 b+細胞の数の上昇を抑制し得る化合物は、 移植片喪失の予防■治療用化合 物として有用であることが理解される。 従って、 本発明は、 移植部位における C D 1 1 b+細胞数の上昇を抑制し得る化合物を選択することを含む、 移植片喪失 の予防 ·治療用化合物のスクリーニング方法 （スクリーニング方法 I V) を提供 するものである。 ，
本スクリーニング方法は、 上述の非ヒト哺乳動物を用いた移植モデルを使用し て行われる。 移植モデルとしては、 自体公知のモデルのいずれをも.使用すること が可能 あり、 所望の組織が、'非ヒ ト哺乳動物レシピエントの生体内の任意の部 位へ移植される。 .本スクリーニング方法において選択される 「組織」、 「生体内の 部位」 は上述と同様である。 '好ましくは、 縢島が非ヒ ト哺乳動物レシピエントの 肝臓内へ移植される。 ここで、 移植に供される 「組織」 はレシピエントと同種同 系であることが好ましい。 同種異系又は異種異系の組織を移植すると、 移植片喪 失に係る反応と同時に獲得免疫反応が生じるため、 移植片喪失に対する化合物の 効果を評価することが困難となる場合があるからである。
被検化合物はレシピエント動物へ投与される。 投与時期は移植の前後いずれで あってもよい。 被検化合物は、 スクリーニング方法 Iに記載されたものと同様の ものを使用することができる。
次に被検化合物が投与されたレシピエントの移植部位における CD 1 1 b+細 胞数が測定される。 CD 1 1 b+細胞数を測定する時期は、特に限定されないが、 移植後の早い時期 （例えば移植の 30分〜 48時間後） が好ましい。. CD 1 1 b +細胞数は、 例えば、 移植部位から単核球画分を単離し、 該単核球画分中に含ま れる. CD 1 1 b+細胞数 （或いは割合） をフローサイトメータ一等で測定するこ とにより評価することができる。
そして、 被検化合物が投与されたレシピ ントの移植部位における CD 1 1 b +細胞数が、 被検化合物を投与されていない対照レシピエントの移植部位におけ ,る CD 1 1 b+細胞数と比較される。 細胞数の比較は、 好ましくは、 有意差の有 無に基づいて行なわれる。 対照レシピエントの移植部位における CD 1 l b+細 胞数は、 被検化合物が投与されたレシピエントの移植部位における CD 1 1 b + 細胞数の測定に対し、 事前に測定した値 あっても、 同時に測定した値であって もよいが、 実験の精度、 再現性の観点から同時に測定した値であることが好まし い。 ' .
最後に、 比較結果に基づいて、 移植部位における CD 1 1 b+細胞数の上昇を 抑制し得る化合物が選択される。 上述の様に、 移植部位における CD 1 l b+細 胞数の上昇を抑制し得る化合物は、 移植片喪失の予防 ·治療用化合物として有用 である。'従って、 移植部位における CD 1 1 b+細胞数を指標として、 移植片喪 , 失の予 ·治療用の医薬、 又は研究用試薬のための候補化合物を選択することが 可能となる。
本発明のスクリーユング方法 I〜 I Vにより得られた化合物は、 移植片喪失を 予防 '治療し得るので、 上記本発明の予防剤と同様に、 医薬と.して製剤化するこ とによって、 移植片喪失の予防■治療剤とすることができる。
以下、 実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、 本発明は以下に示す 実施例によって何ら限定されるものではない。 実施例
実験材料及び方法
(動物) マウスはじ h a r l e s R i v e r J a a n (神奈川、 日キ） より購入 され、 本発明者らの動物施設にて維持された。 雄 C 57 B L/6 (H- 2b) マ ウス及ぴ C 5 7 B LZ 6バックグラウンドの Vo; 14NKT細胞欠損 （ J α 28 マウス （10— 1 5週齢） が使用された。 C 57 B L/6バックグラウ ンドの I FN— γ欠損マウスは、 東京大学医学部の Y. I wa k uma博士より 供与された（Tagawa, Y. , et. al. , 1997, J. Immunol. , 159： 1418-1428)。動物 保護は、 本発明者らの施設のガイドラインに従った。
(糖尿病誘導） .
糖尿病は、 ストレプトゾトシンの静脈内注入によってレシピエントマウス中に 誘導された （S, TZ、. 180mg k g、 S i gma、 S t. L o u i s , M O) (Schein, P. S.， et. al. , 1968, Diabetes, 17: 760- 765)。血漿グルコースレ ベノレ fま、' B e c kma n g l u c o s e a n a l y z e r (B e c kma n I n s t r ume n t s J a a n, T k y o, J a a n) 【こ'より 測定された。 S T Z注入後、 非絶食血漿グルコースレベルは d a y 2までに 40 OmgZd 1を超え、 膝島移植の時にはマウスは高血糖のままであった。 · (膝島単離及び移植） '
, 膝島は、 静的なコラゲナーゼ消化と、 それに引続く F i c o 1 1 -C o n r a yグラディエント中での遠心分離により単離され （Sutton, R.， 1986, Transpla ntation, 42： 689-69 l/0htsuka, K. , et. al. , 1997, Transplantation, 64： 63 3-639)、門脈を介して ST Z誘導糖尿病マウスの肝臓中へ移植きれた（Kerap, C. B. , et. al. , 1973, Nature, 244:447)。非絶食時血漿グルコースレベル及ぴ体重 力 移植の前後において、週 3回モニターされた。正常血糖は、移植後における、 2回連続した 20 Omg/d 1より低い非絶食グルコースレベルとして定義され た。
( α—ガラタトシルセラミ ド処理）
α—ガラクトシルセラミ ド （ひ一 G a l C e r) は、 R I KEN RCA Iの 実験室において合成され、キリンビール株式会社からも供与された（Kawano, T. , et. al. , 1997, Science, 278: 1626 - 1629)。 マウスへ、 一 G a I C e r ( 1 00 μ g/k g) 又はビヒクル （1 % ( v / v ) DMSO、 0. 0 2 5 % (w/ v) .Tw e e n 8 0) を、 腹腔内に、 1回又は 3回 （ 4日インターパルで） 注入 した。 最後の注入から' 4日後、脾臓細胞が α— G a I C e r ( 1 00 n g /m 1 ) 又はビヒクルの存在中で培養された。 3 B間培養上清中の I FN— γ及ぴ I L一 4のレベルが E L I S Αにより測定された。 "
(細胞移入）
P e r'c o 1 1グラディエント遠心分離により獲得された肝臓単核球が既述の ように調製された (Ohtsuka, K. , et. al. , 1997, Transplantation, 64： 633-6 39)。 ， .
(フローサイトメ トリー）
フローサイトメ トリーのために俾用されたモノクローナル抗体（mAb s )、抗 マウス F c R Γ I / I I J (2. 4 G 2), フルォ ッセィンィソチオシァネー ト（F I TC)接合抗 C,D 3 ε (1 4 5 - 2 C 1 1), F I TCー抗 CD 1 1 b (M 1ノ7 0), ァロフィコシァニン （AP C) —接合抗 I FN— y (XMG 1. 2), A P C—抗 I L— 4 (1 1 B 1 1)， P e r C P—接合抗 G r— 1 (R b 6 - 8 c 5)， P e r C P— C y 5. 5 抗 G r— 1 ( 8 6— 8 C 5 ) , F I T C—抗 C D l i b (M 1 / 7 0 ) , F I TC—抗 CD l l c (H L 3 ) , F I TC—抗 CD 8 6 (GL— 1)， F I TC—抗 I— Ab (AF 6 - 1 20. 1)， F I TC—抗 I g G 1 (A 8 5— 1)， フィコエリスリン （P E) —接合抗 CD 1 l b (Ml/ 7 0)，及びそれらのアイソタイプ適合コントロールは、 P h a r M i n g e n (S a n D i e g o, C A) から購入された。 F I丁〇ー抗 4ノ80 (A 3— 1 ) 及び F I TC—抗 CD 6 8 (FA— 1 1) は S EROTEC (O x f o r d, U K) から獲得された。 P E—接合 a— G a I C e rロード CD l d (a— G a l C e r—CD 1 d)テトラマーは既述のように調製された（Matsuda, J. L. , et. al. , 2000, J. Exp. Med. 192:741- 753)。細胞内染色のために、細胞は抗 F c R γ I I Z I I I及ぴ n e u t r a v i d i n (M o l e c u l a r P r o b e s , I n c ., Eu g e n e, OR) と共にィンキュベートされ、 そして表面染色 された。 細胞は固定され、 C y t o f i x/C y t o p e r m溶液 （P h a r M i n.g e n) 中で浸透化され、 抗 I FN_ γ及び抗 I L一 4 mAb sにより、 製造者の指示書に従い染色された。 染色された細胞は、 FAC S C a i i b u r (B e e t o n D i c k i n s o n, M u n t a i n V i ew, CAリ 上 で解析され、データは CE L LQ u e s t s o f t w a r e (B .e c t o n D i c k i n s o n) により処理された。 1 0000個の生細胞が解析された。
(セルソーティング及び移入）
肝単核球が既述の様に調製された（Transplantation, 64, 633-639, 1997) 0 G r - l+CD l l b +細胞及び V a 14 N'K T細胞が Mof lo™ (Dako Cytoraation, Glostrup) により、 それぞれ、 純度≥ 99 %及び 98 %でソートされた。 脾臓 樹状細胞 （DC s ) 力 抗 CD 1 1 c結合磁性ビーズ （Myltenyi Biotec) を用い て MAC SRにより、 純度 95 %で精製された。 ，
(抗体処理）
G r - 1又は CD 1 1 bに対するモノクローナル抗体が、.200.個の瞵島を受 • けた STZ糖尿病マウス内へ、 移植時に、 腹腔内注入された。
(組織学）
移植レシピエントからの肝臓及ぴ瞵臓が B o u i n， s溶液中で固定され、 光 学顕微鏡試験のためにパラフィン中へ処理され、 包埋された。 切片はへマトキシ リン一ェォシン及びアルデヒ ド一フクシンにより染色された。 ^疫組織化学解析 力 ストレプトアビジン一ピオチン一パーォキシダーゼ複合体法により行われた (Int. J. Cancer. , 83, 732-737, 1999)。
(遺伝子発現解析）
膝島移植後 1時間、 2時間、 6時間の時点での肝臓 14ΝΚΤ細胞におけ る mRNA発現が affimetlix遺伝子チップにより解析された。また、肝臓 Vo; 1 4NKT細胞における I L— 1 i3 mRNAレベルがリアルタイム RT— PCR により測定された。 I L一 1 j3のための結果は、 それぞれの HP RTT発現により 標準化された。 · (統計学的解析）
F i s h e r ' s e x t r a c t t e s tが、 13萃島移植後のストレプトゾ トシン誘導糖尿病マウスにおける正常血糖'（e tig 1 y c em i a) の割合の統 計学的有意性を決定するために使用された。 ' ' 結果及ぴ考察
(Va 14 NKT細胞は早期膝島移植片喪失の原因である） ，
Va 14 NKT細胞が膝島移植片不全に関わっている可能性を調べるために、 本発明者らは賻島移植の試験系 確立することを試みた。 本発明者らは、 ストレ ブトゾトシン （STZ) 誘導糖尿病マウスにおける高血糖を改善するために必要 とされるドナ一眸島の最低限数を^験した。 C 57 Bし/6マゥスは3丁2の静 脈内注入の後すぐに高血糖性及び糖尿病性となった（図 1 A)。 STZ誘導糖尿病 マウスでは、 肝臓内に移植された 400個の同種同系瞵島が正常血糖を達成する ために十分であることが見出された （図 1 B、 左）。 一方、 正常血糖は、 単独のマ ウス膝臓から単離することのできる瞵島の数である、 200個の同種同系膝島の 移植では達成する.ことができなかった （図 1 C、 左）。 400個の滕島 （n = 6) 又は 200個の膝島 （η= ΓΟ) の移植後の糖尿病野生型マウスにおける正常血 糖（e u g l y c em i a)の割合の差異は、統計学的に有意であった（Pく 0. 001)。 生化学的データに合致して、 400個の瞵島を受け マウスにおいて， よく顆粒化された （w e l l— g r a nu l a t e d) ]3細胞を有するそのまま の膝島が組織学的にみられたが、 一方 200個のみの瞵島を受けたマウスにおい ては、 脱顆粒化された （d e— g r a nu l a t e d) j3細胞を有する傷害され た膝島が観察された （図 I B及び C、 右）。
本発明者らは、 Va 14 NKT細胞が早期膝島移植片喪失に関与するかどうか 試験した。 全ての糖尿病性 J a 28 I—,—マウスは、 200個又はたつた 100 個の膝島の移植後 1 1日までに正常血糖となった （図 I D及ぴ£、左）。組織学的 試験もまた、 よく顆粒化された （we l l— g r a n u l a t e d). 細胞を有 するそのままの陴島の存在を明瞭に立証し （図 ί D、右）、 V CK 1 4NKT細胞が 移植片拒絶 （及び移植された瞵島の早期移植片喪失） に重要な役割を果たしてい ることが示唆された。 '
移植された脖島に対する Vひ 14 NKT細胞の有害な効果を証明するため 、 ナイーブな野生型、 J o; 28 1— Z—、 又は I FN— γ欠損 ウスから単離された 肝臓単核球 （5 X 106個） 力 200個の同種同系膝島を受ける糖尿病性の J ひ 28 1—ノ—マウスめ門脈中に、 移植のときに注入された。 野生型マウスからの 細胞を注入された糖尿病の. J a 28 1一 z—マウスは、 移植後 60日間、 高血糖の ままであった （図 1 F.、 左）。 一方、 J 28 I—,—、 又は I FN— γ欠損マウス からの細胞を注入された糖尿病の J « 28 I— 一マウスは、正常血糖となった（図 1 G及び H、 左）。 組織学的試験も.また、 Jひ 28 、 又は I FN— γ欠損マ ウスからの細胞のレシピエントにおいてそのままの眸島が存在し、 野生型マウス からの細胞のレシピエ /トにおいてそうではないごとを証明した （図 1 F、 G、 H、右）。該結果から、 Vo; 14NKT細胞及び I FN— γが、早期移植片不全（喪 失） のだめの必須の構成要素であることが示唆された。
(移植により誘導された G r— 1+CD 1 1 b+細胞は早期移植片喪失のェフエ クタ一細胞である）
膝島移植片不全に関連した細胞変化を明らかにするために、 肝単核球が眸島移 植後に定期的に単離され、 α— G a 1 C e rがロードされた CP 1 d (a— G a I C e r -CD I d) テトラマーを用いた F A C Sにより試験された。 FAC S 解析は、 α—G a l C e r— CD l d テトラマー + V α 14 N K T細胞のパー センテージは、 はじめ、 O h rでの 10. 3%から 6 h r sでの約 5%へ減少し たが、 しかし膝島移植後 24時間では 1 9. 2%に急上昇したことを示した （図 2、 左パネル）。 この知見は、 報告されているように （Int. Immunol. , 16, 241- 247, 2004： Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 10913-10918, 2003： J. Immuno 1. , 171， 4020-4027, 2003)、 V a 14 N K T細胞の活性化により受容体発現がダ ゥンレギユレ一トされ、 その結果 a— G a I C e r— CD l d テトラマーによ つて V α 14 NKT細胞が検出されなくなつたことを示唆する。 更に、 移植後 2 〜 6.時間において採取された 14NKT細胞は、 I FN- γや I L一 1 ]3の様 な炎症性サイトカイン'を産生したことから （図 2及ぴ図 1 0)、 Va 14NKT細 胞が移植により活性化されることが示唆された。 14NKT細胞の消失に引 き続き、 Va l 4NKT細胞は、 既報のように'（Int. Immunol. , .16, 241-247, 2004： Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 10913 - 10918, 2003： J. Immunol. , 1 71， 4020-4027, 2003)、 図 2 (24 h r s ) に示すように、 早急に増殖した。 興 味深いことに、 高レベルの I FN— γを産生するひ一 G a l C e r -CD l d テトラマー一細胞の割合が、 鸱島移植後 6時間で 0. 5 °/oから 14. 3 %へ著し く増加した （図 2、 左パネル）。 ひ一 G a l C e r—CD l d テトラマー—細胞 が更にゲートされ、 G r一 1及ぴ CD 1 1 b発現が I FN— y産生と関連して解 析され、 G r一 1+CD 1 1 b+細胞であると決定された （図 3)。 G r一 1+CD 1 1 b+糸田月包は、 CD 1 ,1 c一、 CD 86—、 MHCクラス I I一、 F 4/80+/—、 及び CD 68+ —であり （図 4)、 形態学的に好中球であったことから （図 5)、 これらの細胞は好中球であることが示唆された。 移植された膝島の中へ侵入した 好中球 （図 5) は、 エフェクター細胞のようであった。 なぜなら、 G r— 1又は CD 1 1 bに対する抗体の注入により、 滕島移植片の拒絶が予防されたからであ る （図 6)。
野生型マウスと著しく対照的に、 J α 28 1— マウスにおいては I FN— γ 産生 G r— 1 + CD 1 1 b+細胞の増加がみられず （図 2、 左パネル）、 滕島移植 に引続く Va 14NKT細胞の活性化が I FN— γ産生 G r一 1 +CD 1 1 b + 細胞の誘導を引き起こすことが示唆された。 Va 14 NKT細胞の存在又は不在 に関わらず、 I L一 4産生細胞の有意な増加は認められなかった （図 2、 右パネ ル）。
a— G a 1 C e rの単回注入が G r― 1+CD 1 1 b+細胞における I FN— γ産生を劇的に増進し （図 7)、 Va 14ΝΚΤ細胞が G r— 1+CD 1 1 b+細 胞を活性化し、 I FN— yを産生させることが示唆された。 即ち、 G r— 1 +C D 1 1 b+細胞による増加した I FN— y産生は、 膝島移植により誘導された V a 1,4 NKT細胞の直接的な結果であるようであった。
I FN— γ産生 G r '— 1+CD 1 1 b+細胞と同様に、 水酸化アルミニウム （ァ ラム） により沈降させた抗原を免疫のために用いたときに、 ァラムにより誘導さ れた I L「 4産生 G r - 1 +CD 1 1 b +細胞が B細胞活性化に重要な役割を果 ' たしている （Jordan, M. B.， 2004, Science, 304： 1808-1810)。 これらの 2つの 集団の、 抗原非依存性及び免疫反応における重要性に関する類似性にもかかわら ず、 I L— 4産生 G r— 1.+ CD 1 1 b+細胞は免疫後 6日ではっきり現れる力 S、 一方 I FN— 産生 Q r— 1+CD 1 1 b+細胞は移植後すぐ （6 h r ) に現れる という事実のような、 多くの明らかな差異が言及される。 該知見は G r— 1+C
D 1 1 b+細胞の機能的多様性を示唆する。
(Va 1 4 NKT細胞機能の改変による早期移植片齊失の予防）
Va l 4NKT細胞ゆ、 α— G a 1 C e rにより刺激された後すぐに著量の I FN— γを分泌するが、 繰り返しの a— G a 1 C e r刺激後では I.F N— γ'を産 生するごとを停止した （図 7)。 本発明者らは、繰り返しのひ一 G a l C e r注入 力 S、 Vo; 1 4 NKT細胞による I FN— y産生を改変し、 移植片生存性に影響を 与え得る可能性をテストするために、 膝島移植に対する繰り返しの a— G a 1 C e r刺激の効果を調べた。 400個の滕島を受けた S TZ誘導糖尿病野生型マウ スが、 移植の際にビヒクルにより 1回処理されたときに、 全てのマウスは正常血 糖となった （図 8A)。 4 0 0個の膝島を受けた糖尿病野生型マウスが、 ex— G a 1 C e rの単回注入 （l O O /i gZk g) により処理されたときに、 移植後 6 0 日でも正常血糖になったマウスはいなかった （図 8 B)。対照的に、野生型マウス 力 膝島移植より前の糖尿病の誘導の前の d a y 1 5、 1 1、 及ぴ 7に、 α:— G a l C e r ( 1 00 /z g / k g ) により 3回処理されていたときには、 200個 の同種同系膝島のみの移植が、 1 0日以内に、 全てのレシピエントマウスにおい て正常血糖を復活させた（図 8D)。 一 G a 1 C e rの替わりにビヒクルで処理 されたマウスは、移植 60日後、 高血糖のままであった （図 8 C)。 これらの結果 は、 膝島移植より前の繰り返しのひ一 G a 1 C e r注入により I FN— γ産生の ダウンレギュレーションが起こり、 これが膝島移植に陽性に影響を与えたことを
A J正した。 '
(Va 1 4NKT細胞により引き起こされた G r一 1 +CD 1 1 b+細胞による I FN- γ産生） . · . ' そこで、 本発明者らは、 α— G a 1 C e rの G r— 1 +CD 1 1 b+細胞による I FN- の産生への効果を調べた。 F AC S解析は、 膝島移植後直ち G r - 1+CD 1 1 b+細胞力 S、非移植対照と比較して、増加したことを明らかとした（図 9 B)。 G r— .1+CD 1 1 b+細胞の流入は 1 4NKT細胞とは独立であつ た。 なぜなら、 G r— 1 + CD l l b +細胞の増加は、 移植後の J α 2 8 1一,—マ ウスにおいても検出されたからである （図 9 C)。 このことは、 G r— 1+CD 1 1 b+細胞数が移植により上昇したことを示唆する。 ，しかしながら、 G r— 1 +C D 1 1 b+細胞による I F N— γ産生が a—G a 1 C e rの単回注入によって劇 的に増進されたが（図 9 D)、 a-G a 1 C e rの繰り返し注入が与えられたとき は、 ビ クル処理 a.ントロール （図 9 E) と同等のレベルにまで減少した （図 9 。従って、 G r— 1+CD 1 1 b+細胞による I FN- γ産生は、全体としては、 Va 1 4 NKT細胞の活性化状態に依存していることが示唆された。
以上より、 インビボでの繰り返しのひ一 G a 1 C e r刺激による V 1 4NK T細胞機能の改変は、 G r _ l+CD 1 1 b+細胞による I FN— γ産生を操作し、 即時の移植片不全及び膝島移植片の早期の喪失を予防し、 そして良好な膝島膝臓 移植に寄与し得ることが示唆された。
マウスにおける Vひ 1 4ΝΚΤ細胞と同様に、 ヒ ト Va 24 NKT細胞も活性 化により大量の I FN- γを放出する （J. Exp. Med.， 186， 109-120, 1997) こと から、 ヒ トにおける瞵島の早期移植片拒絶も Va 24NKT細胞により調節され ることが示唆される。従って、 ヒト Va 24 NKT細胞による I 1^-7産生のダ ゥンレギュレーションを標的とした治療法は、 臨床における膝島移植片の早期喪 失を予防することを助長し、 瞎臓膝島移植の効率の向上することを助長し得る。 産業上の利用可能性
本発明の予防剤を用いれば、 臨床における膝島移植等における移植片喪失を予 防することが可能であるので、 移植効率の向上に寄与し得る。 例えば、 膝島移植 においては、 従来、 早期移植片喪失のため、 一人のレシピエントに対して 2〜 3 人分のドナー瞵島を繰り返し移植しなければ、 十分な治療効果を達成することが できなかったが、 本発明の予防剤を用いれば、 より少ない数のドナー膝島により 同等の治療効果を挙げることが きる。 '
また、 本発明のスクリーニング方法を用いれば、 新たなメカニズムによる早期 移植片喪失の予防 ·治療薬を創出することができる。 本出願は 0本で出願きれた特願 2 0 0 5 - 2 3 3 2 5 0 (出願日 ： 2 0 0 5年 8月 1 1日） を基礎としており、 その内容は本明細書に全て包含されるものであ る。

Claims

請求の範囲
1. .NKT細胞リガンドを含有してなる、 移植片喪失の予防剤。 ！^ 丁細胞リガンドは^ーガラクトシルセラミドである、請求項 1記載の剤。
3. 移植片喪失は膝島移植に伴うものである、 請求項 1記載の剤。
4. 移植片喪失は肝臓内 の移植に伴うものである、 請求項 1記載の剤。
5. 移植前に 2回以上投与される.ことを特徴とする、 請求項 1記載の剤。
6. NKT細胞の活性化を抑制し得る化合物を選択することを含む、 移植片喪失 の予防 ·治療用化合物 φスクリ一二ング方法。
7. CC) 1 1 b+細胞の I FN— γ産生を抑制し得る化合物を選択することを含 む、 移植片喪失の予防■治療用化合物のスクリ一二ング方法。
8.以下の工程を含む、移植片喪失の予防'治療用化合物のスクリーニング方法： (Α)被検化合物の存在中で ΝΚΤ細胞及び CD 1 1 b +細胞を共培養する工程；
(B) 共培養物中の NKT細胞を刺激したときの CD 1 1 b+細胞からの I FN 一 γ産生を抑制し得る化合物を選択する工程。
9. 移植部位における CD 1 1 b+細胞数の上昇を抑制し得る化合物を選択する ことを含む、 移植片喪失の予防■治療用化合物のスクリーニング方法。
0. 移植片喪失の予防剤を製造するための、 NKT細胞リガンドの使用
1 1. 哺乳動物に、' NKT細胞リガンドの有効量を投与することを含む、 該哺乳 動物における移植片喪失の予防方法。
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