JP2003530101A - 抑制性Ｔ細胞を誘導するためにＴＧＦ−βを用いる移植拒絶反応を防止する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、臓器移植後レシピエントにおいて移植拒絶反応を防止するために有用な組成物および方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、２０００年４月１１日に提出のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ. ６０,１９６,４４６
の継続出願である。

【０００２】 本発明の分野は、臓器移植後レシピエントにおける移植拒絶反応を防止するた
めの、有用な組成物および方法に関する。

【０００３】 （背景技術） 臓器移植は、ヒトの生活の質を高めるために利用されてきた。実質的な進歩が
腎臓、心臓、肺、肝臓および膵臓に関する移植でなされてきた。一般的に、免疫
抑制剤は、これら臓器の直接的拒絶反応を遮断する場合に有効である。しかし、
臓器が、非近縁のドナーからである場合、即ち同種異型移植片である場合、免疫
抑制剤が慢性的同種移植片拒絶反応を遮断するのに有効でないことが多いため、
これらの薬剤は、時間経過と共に有効性が低下する。さらに、長期間の免疫抑制
治療に関連する強い副作用が存在する。毎年、おおよそ１０,０００件の肝臓移
植がアメリカでは行われている。移植が、少なくとも１年間は十分機能するとい
う見込みが増加する一方、過去２０年間、慢性的同種移植拒絶反応を防止するこ
とに進歩がなかった（参照. 図１；In Fundamental Immunology, 4th ed., Paul
, W.E.(ed.), Lippincott-Raven, Philadelphia, 1999, p.1201）。結果として
、僅か５０％の移植が数年後も依然機能している。そのため、慢性拒絶反応を防
止するための新規方法に対する緊急的な必要性が存在する。

【０００４】 レシピエントの免疫系が外来の組織適合性抗原を認識する場合に、移植拒絶反
応が生じる。まれに、拒絶反応は前もって形成されたか、又は反復輸血の結果に
より、抗体によって引き起こされる。一般的に、拒絶反応は、レシピエントから
のＴリンパ球がドナー組織適合性抗原を認識し、それに応答する場合に生じる (
Pescovitz MD, Thistlethwaite JR Jr, Auchincloss H Jr, et al. J Exp Mad 1
984;160:1495-1508)。

【０００５】 ２つの主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)座が存在する。主要および副の両方の組
織適合性抗原が、それらをコードする遺伝子とともに発表されている。１つは、
ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるＭＨＣクラスＩ抗原をコードするものでり、
もう１つは、ＣＤ４＋細胞によって認識されるＭＨＣクラスＩＩ抗原をコードす
るものである。ＭＨＣクラスＩ抗原は、体の殆どすべての組織上で発現する。
ＭＨＣＩおよびＩＩ抗原の両方は非常に多形であり、関連のない個体からの抗原
が同一であることはほとんどありえない。

【０００６】 ドナーおよびレシピエント間のＭＨＣ抗原における違いが、移植臓器の拒絶反
応をもたらすレシピエントによる強い免疫応答の引きがねとなる。外来ＭＨＣ抗
原は、レシピエントの免疫細胞によって直接認識され、ドナーＭＨＣ抗原で処置
されたレシピエントの抗原提示細胞によっても間接的に認識される。同種移植拒
絶反応の古典的モデルは、ドナーのＭＨＣクラスＩＩ抗原を認識するレピシエン
トのＣＤ４＋Ｔ細胞を力説するものであった。これら活性化ＣＤ４＋細胞は、ド
ナーＭＨＣクラスＩ抗原の直接的な認識によって感作されるレシピエントＣＤ８
＋に対するヘルパー細胞として機能する。次いで、活性化ＣＤ８＋細胞は、ドナ
ー細胞を溶解することによって殺す(Mizuochi T, Golding H, Rosenberg AS, Gl
imcher LH, Malek TR, Singer A. J. Exp Med 1985;162:427-443. 205)。さらな
る研究により、レシピエント抗原提示細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞
のさらなる関与が明らかとなり、移植拒絶反応に関与し得る機構についての複雑
さが増した。

【０００７】 移植後最初の数週間に生じる移植片破壊は、「急性拒絶反応」と呼ばれる。通
常、免疫抑制剤の使用は一時的にこの結果を防止する。残念ながら、この移植片
は、数週間もしくは数ヶ月後についに不作用となることがある。この不作用は「
慢性拒絶反応」と呼ばれる。体液および細胞の両方のメカニズムが、慢性拒絶反
応に影響する。抗ドナー抗体は、慢性拒絶反応を促進すると主張されてきたが、
これが論争点となっている。一般的に、慢性拒絶反応は、ドナーＭＨＣ抗原に対
する免疫系の永続的感作の結果であると考えられる。レシピエントの免疫細胞は
、自身ではＭＨＣ抗原を受容することを「学習」できず、移植片を攻撃すること
によって応答する。

【０００８】 移植拒絶反応を防止するために２つの方法がある。第一は非特異的免疫抑制剤
での処置によるもので、第二はドナー特異的寛容を誘導することである。

【０００９】 標準的な第一の方法は、免疫抑制剤、例えば、ステロイド、アザチオプリン、
マイコフェノレート、シクロスポリン、ＦＫ-５０６、ラパマイシン、レフルノ
マイド、または１５-デオキシスペルグアリンを使用することである。これらの
薬剤は、リンパ球遺伝子転写、サイトカインシグナルトランスダクション、ヌク
レオチド合成および細胞分化を阻害することにより免疫応答を抑制する。これら
の薬剤は、感染および悪性腫瘍のリスクを、生涯を通じて増加させかねない。さ
らに、抗Ｔ細胞抗体、例えば、抗リンパ球細胞血清または抗胸腺細胞グロブリン
は強力な免疫抑制剤である。しかし、それらは血清不調および感染合併症を含む
重い副作用を持つ。さらに近年、ＯＫＴ３、ヒトのＣＤ３抗原に対するマウス抗
体が医療用移植に広く使用されている(Cosimi AB, Burton RC, Colvin RB, et a
l Transplantation 1981;32:535-539)。別の使用されているモノクローナル抗体
には、ＩＬ-２受容体(抗ＣＤ２５)抗体および抗ＩＣＡＭ-１または抗ＴＮＦ-α
抗体があり、これらは移植拒絶反応のエフェクターメカニズムを遮断する。これ
らのモノクローナル抗体も広い毒性副作用を有する。

【００１０】 移植免疫学の最終ゴールは、レシピエントがドナー組織適合性抗原に寛容とな
るようにすることである。即ち、移植片が拒絶反応を示さないようにレシピエン
トの免疫細胞がドナー抗原を認識するのを防止することである（即ち、ドナー臓
器を"自身"として受容すること)。この分野における現状は、本明細書中もしく
は他の文献でも説明されている(See Hugh Auchincloss, Jr., Megan Sykes, and
David H. Sachs In Fundamental Immunology, 4th ad., Pau), W.E. (ed.), Li
ppincot-Raven, Philadelphia, New York, 1999 pp 1182-1222)。

【００１１】 寛容は３つのメカニズムによって達成され得る。第一番目は、「クローン削除
」、即ちドナー抗原に反応するリンパ球の排除である。第二番目は、「クローン
アネルギー」、即ちドナー抗原への応答においてＴ細胞が増殖しないことである
。一般的には、アネルギー(不応答性)は可逆的であり、抗原の感染または排除に
よって可逆的となり得る(Roche B, Tanchot C, Von Boehmer H. J Exp Mad 1993
;177:1517-1521) (Ramsdell F, Fowlkes BJ. Science 1992;257:1130-1134)。第
三番目は、「抑制」である。この抑制は非特異的もしくは抗原特異性的のいずれ
かで有り得る。非特異的抑制は、免疫機能を阻害する可溶性分子の分泌から生じ
得る。抑制分子は、プロスタグランジン(Snijdewint FGM, Kalinski P, Wiereng
a EA, Bos JD, Kapsenberg ML. J Immunol 1993;150:5321-5329; Betz M, Fox B
S. J Immunol 1991;146:108-113)、酸化窒素(Langrehr JM, Dull KE, Ochoa JB,
et al. Transplantation:1992;53:632-640)およびサイトカイン(Verbanac KM,
Carver FM, Haisch CE, Thomas JIM. Tranplantation 1994;57:893-900; Raju G
P, Belland SE, Eisen HJ. Transplantation 1994;58:392-396)を包含する。

【００１２】 「抑制性細胞」と呼ばれるＴ細胞は、非特異的に移植拒絶反応を遮断するＩＬ
-４、ＩＬ-１０、ＴＧＦ-βを包含する抑制サイトカインを産生する(Qin L, Cha
vin KD, Ding Y, Woodward JE, Favaro JP, Lin J, Bromberg JS. Ann Surg 199
4;220:508-519); (Qin L, Chavin KD, Ding Y, et al. J Immunol 1996; 156:23
16 -2323); (Zheng XX, Steele AW, Nickerson PW, Steurer W, Steiger J, Str
om TB. J Immunol 1995;154:5590-5600)。同種抗原-抑制性細胞の存在が報告さ
れているが(Pearce NW, Spinelli A, Gurley KE, Hall BM. Transplantation 19
93;55:374-379; Roser BJ. Immunol Rev 1989; 107:179-202; Tomita Y, Mayumi
H, Eto M, Nomoto K. J Immunol 1990;144:463-473)、これらの細胞はクローン
化が難しい(Koide J, Engleman EG. J Immunol 1990;144:32-40)。

【００１３】 胸腺により産生される本来の抑制性Ｔ細胞はマウスで特徴分析されてきた。こ
れらは、ＣＤ２５、細胞表面のＩＬ-２受容体α鎖を発現するＣＤ４＋細胞であ
る(Shevach, E. A. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18:423-449.; Seddon, B., an
d D. Mason, (2000) 21:95-99,; Sakaguchi, S., N. Sakaguchi, M. Asano, M.
Itoh, and M. Toda, (1995) J. Immunol. 155:1151-1164)。近年、このＴ細胞サ
ブセットは、ヒトでは十分説明されておらず、これらの細胞が末梢血管まで増え
得るかどうかは知られていなかった。

【００１４】 ＣＤ４＋細胞は、ＩＬ-１０によって繰り返して刺激されるか、未成熟デンド
リマー細胞によって活性化されると、下方調節活性を発揮する (Groux, H., A.
O'Garra, M. Bigler, M. Rouleau, S. Antojejko, J. E. De Vries, and M. G.
Roncarolo, (1997) Nature. 389:737-742; Jonuleit, H., E. Schmitt, G. Schu
ler, K. Jurgen, and A. H. Erik. (2000) J Exp Med 192:1213-1222)。これら
のＴ細胞、いわゆるＴＲ１またはＴＲ１様細胞はアネルギー性であり、それら免
疫抑制効果は、ＩＬ-１０およびＴＧＦ-βによって媒介される。アネルギーＴ細
胞は、抗原提示細胞を標的化することによって別のＴ細胞の応答を抑制する (Ta
ams, L. S., A. J. M. L. van Rensen, M. C. M. Poelen, C. A. C. M. van Els
, A. C. Besseling, J. P. A. Wagenaar, W. van Eden, and M. H. M. Wauben (
1998) Eur J Immunol 28:2902-2912; Vendetti, S., J. G. Chaff, J. Dyson, E
. Simpson, G. Lombardi and R. Lechler, (2000), J. Immunol. 165:1175-1181
)。残念ながら、これら非常に多数の細胞は抑制活性を必要とし、それらは増殖
能力が非常に乏しい。

【００１５】 Ｔ細胞によって産生されたサイトカインのプロファイルは、臓器移植片の生存
に影響し得る。炎症性Ｔｈ１応答(ＩＬ-２およびＩＦＮ−γ）から、抗炎症性Ｔ
ｈ２(ＩＬ-４、ＩＬ-１０)応答へのＴ細胞応答におけるシフトは、同種移植片の
受容に関連する(Roser BJ. Immunol Rev 989: 107: 179-202; Lancaster F, Chu
i YL, Batchelor JR. Nature 1985;315:336-337; Wilson. Immunol Rev 1989;10
7:159-176)。非常に限定されたデータが、寛容誘導におけるＴｈ２細胞の活発な
役割を示唆している(Bucy RP, Li J, Huang GO, Honjo ,, FASEB J 1995;9:A497
; Wilson. Immunol Rev 1989;107:159-176)。さらに、いくつかの場合で、Ｔｈ
２細胞は移植拒絶反応について媒介もしくは寄与し得る。

【００１６】 Ｔ細胞を阻害性サイトカインに寛容となる、もしくはそれを産生するように特
異的に方向づける方法は、移植臓器の生存を増進させるのに非常に有用である。
いくつかの寛容誘導ストラテジーが、従来の免疫抑制剤と併用して試されてきた
。齧歯類において、寛容は、マウスに致死量の照射を与え、そしてＴ細胞を涸渇
させた同系のおよび同種異系の骨髄細胞を戻して動物を生存せしめることにより
達成され得る。動物を再増殖する造血細胞はドナーおよびレシピエント細胞の両
方の組織適合性抗原を提示し、そうして、各々のマウス株からの移植片に対して
寛容となる (Singer A, Hathcock KS, Hodes RJ. J Exp Mad 1981, 153:1286)。
発表されている非骨髄性調整（コンディショニング)養生法では、マウスが致死
量以下で照射され、Ｔ細胞がモノクローナル抗体により枯渇され、共刺激分子を
遮断する抗ＣＤ１５４またはＣＴＬＡ ４ｌｇのいずれかが与えられる(Wekerle,
1999)。このストラテジーは、中枢性寛容を達成し、長い持続効果を持つが、ま
だ大きな動物には実施されていなかった。これらのストラテジーを臨床上の移植
において長期的治療に代えるために使用されることはなかった。

【００１７】 末梢性寛容は、共刺激分子を遮断することによって達成され得る。ＣＴＬＡ４
１ｇと抗ＣＤ１５４の併用は、マウスにおける一次的な皮膚同種移植片の生存を
著しく長くした(Larsen CID, Elwood ET, Alexander DZ, et al. Nature 1996;3
81:434-438; Kirk AD, Harlan DM, Armdtrong NN, et al. Proc Natl Acad Sci
U S A 1997;94:8789-8794)。共刺激分子を遮断するためのストラテジーに関する
主な問題は、ドナー抗原を認識し得るレシピエントにおいて新規Ｔ細胞の生成を
防止できないということである。

【００１８】 造血細胞移植を受けなかったヒトレシピエントの中で何年もの間生存した臓器
移植の例がある(Starzl TE, et al. (1993) Transplantaion, 55:1272-1277)。
これらの例においては、移植片からのパッセンジャー白血球が胸腺に移動し、そ
れに続いて胸腺細胞を寛容にしたのかもしれない。急性拒絶反応を防止するため
に使用される大容量の免疫抑制剤は、この胸腺の学習を遮断する。免疫抑制治療
に関する用量を低下するためのストラテジーは、この問題を克服し、長く続く中
枢性寛容を導くであろう。

【００１９】 移植拒絶反応を防止するための理想的な方法は、ドナー組織適合性抗原に対す
るレピシレントによる免疫性攻撃を抑制する能力を発達させるように、Ｔ細胞を
誘導することであろう。ＩＬ-１０の存在下で、繰り返し活性化されたＣＤ４＋
細胞は、強い抑制活性を獲得するが、これらの細胞は非常に短い生存スパンであ
り、不十分な増殖能力であった(Groux H, et al., (1997) Nature, 389:737-42)
。従って、堅固で増殖し得る抑制性Ｔ細胞を生成するための方法が必要とされる
。

【００２０】 （発明の要旨） 上記目的に従って、本発明は、実質臓器移植のレシピエント中にＴ細胞寛容を
誘導するために使用され得る組成物および方法を提供する。本組成物は、抑制活
性を発揮するようにＴ細胞群を誘導することにより免疫機能を阻害または抑制す
る化合物を包含する。本発明の組成物中の有用な化合物は、抗炎症性サイトカイ
ン、例えば、ＩＬ-４、ＩＬ-１０およびＴＧＦ-β、ケモカイン、プロスタグラ
ンジンおよび酸化窒素を包含する。

【００２１】 さらなる態様において、本発明は、ドナーおよびレシピエントから末梢単核血
液細胞(ＰＢＭＣ)を取出すこと、そのドナーおよびレシピエント細胞を共に、Ｔ
細胞抑制活性を誘導する化合物の存在下で培養すること、これらの処置細胞をレ
シピエントへ移植片の移植後に投与すること、を含むレシピエントにおける移植
拒絶反応を阻止する方法を提供する。

【００２２】 さらなる実施態様において、本発明は、Ｔ細胞群の精製、調整および増加のた
めに閉鎖系を使用し、次いでＴ細胞を患者に投与する。

【００２３】 （図面の簡単な説明） 図１は、ここ２０年間で慢性拒絶反応の防止について進歩がないことを示す。

【００２４】 図２は、細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制する細胞の発生におけるＴ細胞サブセット
に対するＴＧＦ-βの効果を示す。１方向の同種混合リンパ球反応(ＭＬＲ)を、
細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制する調節性Ｔ細胞を生成するために用いる。同種のＭ
ＬＲにおいて、１つの個体(即ち、Ａ)からのＴ細胞を、関連のない個体(即ち、
Ｂ)からの細胞と混合する。細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制する調節性Ｔ細胞がない
場合、個体ＡのＴ細胞は、Ｂの細胞を外来物質として認識し、Ｂの細胞を殺す能
力を顕出する。

【００２５】 この殺傷を防止する調節性Ｔ細胞サブセットは、負の選別によりＡからつくる
。すなわち、その細胞を適切なモノクローナル抗体で染色し、次いで免疫磁性ビ
ーズを用いて、染色された細胞を除去する。得られるＴ細胞サブセットを、ＴＧ
Ｆ-βの存在下でＢからの細胞と５日間培養する。コントロールは、ＴＧＦ−β
の非存在下で刺激細胞と培養したＴ細胞からなる。

【００２６】 ＴＧＦ-β調整したＴ細胞サブセットの同種ＭＬＲに対する作用を、調節性細
胞とエフェクター細胞とを１：４の比で混合することによって測定した。Ｂから
の刺激細胞とともに５日間培養した後、ＡからのＴ細胞の細胞毒性活性を、標準
的なクロミウム放出アッセイを用いて測定した。このアッセイにおいて、表示の
エフェクター対標的細胞比で、Ａからのエフェクター細胞をＢからのクロミウム
標識化リンパ芽球と混合してある。クロミウム放出は、４時間のアッセイで測定
した(白四角□)。ＴＧＦ-βの非存在下で刺激細胞と共に培養したコントロール
Ｔ細胞サブセットは、白丸（○）によって示した。ＴＧＦ-βの存在下で刺激細
胞と共に培養したＴ細胞サブセットは黒丸(●)として示した。全ての実験におい
て、ＴＧＦ-βは細胞毒性活性の発生を抑制するＴ細胞サブセットの能力を増強
した。

【００２７】 図３は、ＴＧＦ-βの存在または非存在下で、刺激細胞と共に培養したＣＤ４
ＣＤ４５ＲＡＴ細胞に対するＴＧＦ-βの制御効果について、２つの独立した実
験を示す。ＴＧＦ-βの非存在下で刺激細胞と培養したコントロールＣＤ４ＣＤ
４５ＲＡ細胞は、緩和な抑制活性を持っていた。一方、ＴＧＦ-β１ng/mlで起動
されたＴ細胞は、同種ＣＴＬ活性を著しく抑制または消失した。

【００２８】 図４は、ＣＤ４抑制細胞が、細胞毒性Ｔ細胞活性を阻害するために細胞接触を
必要とすることを示す。この実験において、ＣＤ４ＣＤ４５ＲＡからの調節性Ｃ
Ｄ４細胞を、図２および３に記載のＴＧＦ-βで調整した。その細胞のアリコー
トを、Ａからの応答Ｔ細胞およびＢからの刺激細胞と混合した。調節性細胞の分
離アリコートを、膜によって応答細胞および刺激細胞から分離した。結果は、そ
れらの調節効果を発揮するために抑制性Ｔ細胞が細胞接触を必要とすることを示
した。

【００２９】 図５は、ＴＧＦ-βによって誘導された調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞によるリンパ球
増殖の抑制を示す。ＡからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、上記記載のように刺激
細胞と混合し、表示の割合で新しい応答細胞と刺激細胞を添加した。このバーは
、培養７日後のトリチウム化チミジン±ＳＥＭの平均的取りこみを示す。白色バ
ー（Ｎｉｌ)は、ＣＤ４＋細胞を含まない応答Ｔ細胞の増殖性応答を示す。濃い
斜線のついたバーは、ＴＧＦ-βを含まないで刺激細胞とともに培養したコント
ロールＣＤ４+細胞の作用を示す。黒いバーは、ＴＧＦ-β(1 ng/ml)存在下に刺
激細胞とともに培養したＣＤ４＋細胞の作用を示す。培養７日後の照射した刺激
細胞に添加した新しい応答細胞の増殖性応答に対する、これらＣＤ４+細胞の作
用を示す。

【００３０】 図６は、ＴＧＦ-βによって誘導されたＣＤ４+調節性Ｔ細胞の強さを示し、そ
れらがＣＤ２５を発現することを示す。照射した同種刺激細胞±ＴＧＦ-β(1 ng
/ml)で免疫起動したナイーブＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤ４調節性細胞を、細胞分類に
よってＣＤ２５＋およびＣＤ２５−の分画に分離した。図６Ａは、１：４の割合
で新規Ｔ細胞と混合した起動ＣＤ４＋細胞の効果を示す。この抑制活性はＣＤ２
５分画に集中する。図６Ｂは、ＣＴＬ活性の発生に対する、新しい応答性細胞に
添加したこれら起動ＣＤ４＋Ｔ細胞の様々な希釈の効果を示す。表示の結果は、
エフェクターと標的細胞を１００：１の割合で実施した。顕著な抑制活性は、１
以下のＣＤ４regを１００の応答性Ｔ細胞と混合した場合に存在する。

【００３１】 図７は、ＣＤ４＋細胞によるＣＤ２５およびＣＴＬＡ-４の発現に対する調節
組成物の効果を示す。Ｔ細胞サブセットを、ＤＢＡ/２マウスの脾臓から調製し
た。ＣＤ４＋細胞を、示した日数の間、ＴＧＦ-β(０.１-１ng/ml)の存在または
不存在で、Ｃ５７ＢＬ/６マウスから照射した同種異系の脾臓リンパ球と培養し
た。細胞を、ＣＤ２５もしくはＣＴＬＡ-４について染色し、各マーカーを発現
する細胞の％をフローサイトメトリーにより測定した。５日まで、ＴＧＦ-βの
存在は、ＣＤ２５およびＣＴＬＡ-４の発現を著しく増強した。

【００３２】 図８は、同種異系抗原に対するＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の増殖性応答を示す。本
来のＣＤ４＋Ｔ細胞と照射刺激細胞(１x１０^６/ml)を、ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を
つくるために、血清不含培地中５日間±ＴＧＦ-βで培養した。その細胞を洗浄
し、１０％正常ヒト血清を含む培養培地中で３日間おいた。その細胞を、カルボ
キシフルオレッセイン(ＣＦＳＥ）で標識し、照射した同種異系刺激細胞により
再び刺激した。培養３日および５日後のＣＦＳＥ染色の強度を示す。太線はＣＤ
４調節性細胞を示し、細い線はＴＧＦ-βを含まない同種異系抗原で起動したＣ
Ｄ４＋細胞を示す。ＴＧＦ-βで起動したＣＤ４＋細胞の増殖性応答は、コント
ロールＣＤ４＋細胞よりも強かった。類似の結果を４つの別の実験で得た。

【００３３】 （発明の詳細な説明） 本発明は、長期間の移植拒絶反応を防止する方法を使用して実質臓器、例えば
ヒトの腎臓、心臓、肺、肝臓および膵臓の移植を可能とした。抑制活性を誘導す
る化合物と多数のＴ細胞を体外で混合することによって、抑制または調節性Ｔ細
胞の群を生成した。ドナー細胞の殺傷からレシピエントＴ細胞を防止し、それに
より移植片に対する寛容およびその長い生存を誘導するために、移植前、移植時
、移植後に、抑制性細胞をレシピエントに投与することができる。この方法の特
別な利点は、レシピエントの免疫系を利用して、従来の実験的治療法が達成でき
なかった機能を発揮し得ることである。

【００３４】 即ち、本発明は、レシピエントの細胞においてＴ細胞活性を抑制し、寛容状態
を誘導することによって移植拒絶反応を防止する。これは、いくつかのレシピエ
ント細胞に監視的役割を持たせて、別のレシピエント細胞が移植片に対する免疫
攻撃を持つことを防止するように誘導して達成する。正味の効果は、レシピエン
トのリンパ球がドナーの組織適合性抗原に対して寛容となり、それにより移植片
の長期生存を可能にすることである。

【００３５】 このストラテジーは、近年使用されている殆ど全ての他の治療方法とは異なる
。その理由は、全体として臓器レシピエントというよりはむしろ個々の細胞が、
強い薬理学的薬剤で処理されているからである。このストラテジーで、レシピエ
ントは、これら薬剤と関連のある重度の副作用から免れる。

【００３６】 本発明の利点は、臓器移植のレシピエントに与えねばならない高い毒性の免疫
抑制医薬品を投与する必要性を低下もしくは最小にし得るということである。本
発明において、レシピエント自身の免疫細胞が免疫応答を抑制するように誘導さ
れ、それにより、この目的のために投与される毒性免疫抑制剤の用量を低下する
ことができる。

【００３７】 即ち、本発明は、免疫応答を遮断し得る極少量の化合物をレシピエントに戻す
だけであるので、重度の副作用に関する蓋然性の低下を提供する。

【００３８】 本発明は、レシピエントＴ細胞群がドナー臓器に対する免疫攻撃を遮断するた
めに誘導され得ることを示す。理論にしばられずに、本発明の方法は単独もしく
は併用で機能し得るいくつかの手段があるということがわかる。第一に、レシピ
エント細胞を活性化して、ドナー細胞に寛容とし得る。第二に、レシピエント細
胞を活性化して、監視的役割を与え、別のレシピエント細胞がドナー細胞を殺す
ことを防止し得る。第三に、抑制化合物でのレシピエント細胞の処理は、別のレ
シピエント細胞に抑制活性を持つように誘導することによって、いくつかのレシ
ピエントＴ細胞の細胞毒性活性を阻害し得る。例えば、図２-４において、ＴＧ
Ｆ-βは、抑制活性を持ち、ドナー細胞の分解を防止するＴ細胞サブセットを誘
導するために使用されている。レシピエント細胞によるドナー細胞の分解を抑制
するので、慢性的な移植拒絶反応を低下もしくは消失する。

【００３９】 従って、本発明は、臓器移植レシピエントにおけるＴ細胞寛容を誘導する組成
物および方法を提供するものである。本発明は、レシピエントおよびドナーの両
方から末梢単核血液細胞(ＰＢＭＣ)を取出すこと、レシピエントおよびドナー細
胞を一緒に混合すること、抑制性Ｔ細胞群を生成するために調節組成物によりそ
の細胞を処置することを含む方法を提供する。これら抑制性Ｔ細胞は、移植と同
時に、もしくはその後様々な時間に、レシピエントに導入し、慢性的移植拒絶反
応を防止することが可能である。

【００４０】 本明細書で「患者」とは、臓器移植を受けようとするヒトを意味する。ある場
合において、レシピエントは、限定しないが、マウス、ラット、ハムスターなど
のゲッシ類、飼育動物、野生動物および霊長類を含む動物であってよい。同様に
、本発明の目的において、「ドナー」は、臓器を提供するヒトまたは動物である
。

【００４１】 本発明は、臓器移植で利用される方法を指向する。本明細書中で使用される「
臓器」は、実質臓器、例えば、肝臓、心臓、肺、肝臓および膵臓を意味する。

【００４２】 好ましい実施態様において、移植された臓器の拒絶反応の防止は、抑制性細胞
となるように調整されたＴ細胞の投与によりレシピエントＴ細胞における寛容を
誘導することによってなされる。「寛容」もしくは「Ｔ細胞寛容」、またはその
文法学的等価語は、ドナー細胞に対して免疫非応答性、即ち、ドナーの組織適合
性抗原に対する寛容を意味する。即ち、ドナー細胞に対するレシピエント細胞に
よる細胞毒性Ｔ細胞活性の消失である。好ましくは、レシピエントＴ細胞が、別
の抗原を外因性物質として認識し、腫瘍殺生および外因性抗原に対する一般的な
免疫応答を促進する能力を維持する。

【００４３】 Ｔ細胞は、調節組成物による処理によって抑制性細胞となるように調整する。
調節組成物は、Ｔ細胞に抑制活性を発揮するように誘導する少なくとも１つの化
合物を包含する。本明細書中における「抑制活性」は、処理された少なくともい
くつかのＴ細胞が、別のＴ細胞における細胞毒性Ｔ細胞活性を防止する能力を発
揮することを意味する。

【００４４】 細胞毒性Ｔ細胞活性を遮断するための能力を発揮するＴ細胞は、本明細書中で
「抑制性Ｔ細胞」または「調節性Ｔ細胞」という。本明細書中で「抑制性Ｔ細胞
」は、別のＴ細胞をドナー細胞の殺生から阻害する能力を発揮するＴ細胞群を意
味する。

【００４５】 本明細書中に記載した方法を用いて、移植拒絶反応を低下もしくは消失せしめ
る。本明細書中で使用される「低下」もしくは「消失」は、移植拒絶反応の少な
くとも１つの兆候が改善されるということを意味する。これは、当業者には既知
のように、患者側での客観的および主観的の両ファクターを包含する多くの方法
において評価し得る。臓器機能不全に関する臨床上のパターンは、拒絶反応の診
断を示唆するための助けとなることが多い。しかし、臨床上の兆候によって拒絶
反応を明確に診断することはできない。関連のある免疫学的メカニズムの全身的
顕現を基にした拒絶反応の症状の発現を同定する手段を決定することは有用であ
るが、拒絶反応活性(Paul, W.E. (1999) Fundamentals of Immunology)を測定す
るための十分に確立されたアッセイ法はまだない。

【００４６】 本方法では、レシピエントおよびドナーからの血液細胞を取出す。一般的に、
標準的技術を用いてレシピエントおよびドナーから末梢単核血液細胞(ＰＢＭＣ)
を取出す。本明細書中「末梢単核血液細胞」すなわち「ＰＢＭＣ」は、リンパ球
(Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など)および単核細胞を意味する。詳しく下記する
ように、調節組成物の主な効果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／または別のＴ細胞サ
ブセット(即ち、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞)に抑制活性を発揮せ
しめることである。したがって、ＰＢＭＣ群はＣＤ４＋Ｔ細胞を含まねばならな
い。赤血球細胞を患者に残すか、または患者にもどして、ＰＢＭＣのみを取出す
のが好ましい。これは既知の方法、例えば、白血球分析法(leukophoresis)によ
りなす。一般に５から７リットルの白血球分析工程を行い、患者からＰＢＭＣを
基本的に取出し、残りの血液成分を戻す。細胞サンプルの採取は、ヘパリンなど
抗凝固剤の存在下で、既知方法により行う。

【００４７】 一般に、ＰＢＭＣを含有するサンプルは、種々の方法であらかじめ処理し得る
。採取した後に、細胞を付加的に濃縮し得るが、もし採取と同時になさないなら
ば、さらに細胞を精製および／または濃縮する。細胞を洗い、計数し、緩衝液に
再懸濁する。

【００４８】 ＰＢＭＣは、当分野での標準的技術を用いて処置のためには濃縮するのが普通
である。好ましい実施態様において、白血球分析採取工程によってＰＢＭＣの濃
縮サンプルを無菌の血球パックに得る。このパックは、調節組成物の試薬や用量
を含有し得る。詳しくは下記する。一般に、追加の濃縮／精製工程、当業者には
既知のＦicoll−Ｈypaque密度勾配遠心法などを行なう。

【００４９】 好ましい実施態様において、ＰＢＭＣを洗い、血清タンパク質および溶性血液
成分、例えば自己抗体、阻害剤などを既知方法を用いて取除く。一般に、生理媒
液または緩衝液を加え、遠心法を行なう。必要に応じてこれを繰り返す。ＰＢＭ
Ｃを生理媒液、好ましくはＡＩＭ−Ｖ血清なしの培地（Technologie）（血清が
かなりの量のＴＧＦ−βの阻害剤を含有するので）に再懸濁するが、ハンクス緩
衝塩類溶液（ＨＢＢＳ）や生理塩緩衝液（ＰＢＳ）も使用できる。

【００５０】 一般的に、細胞数を数える。おおよそ１×１０⁹から２×１０⁹の白血球を５−
７リットル白血球分析法の工程から採取する。これらの細胞をおおよそ２００ｍ
ｌの緩衝液または培地に移す。

【００５１】 好ましい実施態様において、ＰＢＭＣは、１以上の細胞タイプについて富化で
きる。例えば、ＰＢＭＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＮＫＴ細胞
について富ますことができる。これは、Gray et al. (1998), J. Immunol. 160:
2248（出典明示により本明細書の一部とする）に記載のように、当業者には既知
の方法でなし得る。一般的に、これをなすためには、市販の免疫吸収カラムを用
いるか、研究的方法で行う（ＰＢＭＣをナイロンウールカラムに加え、溶出する
非接着細胞をＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７４に対する抗体で処理し、
免疫磁気ビーズで処理して、ＣＤ８＋Ｔ細胞に富んだ集団を取る）。 ある実施
態様において、細胞群をＣＤ４＋細胞について富ます。これらが本発明の方法に
おいて最も有用な細胞であるとみられるからである。

【００５２】 好ましい実施態様において、ＣＤ４＋細胞をさらに精製して、分化の生じてい
ない未熟細胞のみにすることも可能である。この方法は、モノクローナル抗体を
使用してＣＤ４５ＲＯ＋細胞からＣＤ４＋細胞を枯渇させることによってなす。
この方法は、抑制性Ｔ細胞の生成または活性を妨害するかもしれない機能を獲得
しているであろうＣＤ４＋細胞の集団を消失する。

【００５３】 別の実施態様において、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４-ＣＤ８−細胞、また
はＮＫＴ細胞を、調節組成物で処理し、抑制活性を発生させてもよい。

【００５４】 細胞に必要な前処置を一旦ほどこしてから、細胞を調節組成物で処置する。本
明細書中で用いる「処置」とは、細胞を調節組成物と共に十分な時間インキュベ
ートし、特に患者に移植したときに、Ｔ細胞寛容を得るようにすることである。
インキュベーションは一般に生理的温度で行う。

【００５５】 「調節組成物」または「寛容組成物」は、ドナー組織適合性抗原に対するＴ細
胞寛容を誘導し得る組成物を意味する。調節組成物は、抑制性Ｔ細胞をドナーの
組織適合性抗原と反応し得るものにのみ制限するためドナーからの照射されたＴ
細胞枯渇単核細胞、および抑制細胞となるようにこれら活性化Ｔ細胞を誘導する
少なくとも１つの化合物を包含する。

【００５６】 調節組成物の濃度は、組成物に含まれる化合物の性質によって変るものである
が、一般的に、生理的濃度、すなわち、所望の作用、調節性細胞の特異的な型を
高める作用が得られる濃度である。

【００５７】 ドナー血液細胞をフェレーシスによって得て、赤血球細胞の除去後、１-２x
１０^９ ＰＢＭＣを、抗Ｔ細胞抗体、例えば抗ＣＤ３抗体で処置し、陽性Ｔ細胞
を免疫磁性ビーズによって除去する。Ｔ細胞枯渇ドナー細胞を照射して、増殖さ
せないようにし、レシピエント細胞と混合する。その混合比は、ドナー細胞あた
り、０.１から１０、好ましくは約０.１から３ で、特に好ましくは０.５から２
:１であり、理想としては１:１である。

【００５８】 抑制性細胞となるようにＴ細胞を活性化するために使用した化合物は、限定し
ないが、 プロスタグランジン、酸化窒素、ケモカインおよびサイトカインを包
含する。好ましい実施態様において、Ｔ細胞を活性化するために使用した化合物
はサイトカインである。

【００５９】 好ましい実施態様において、サイトカイン、例えば、インターロイキン２(Ｉ
Ｌ-２)、インターロイキン１５(ＩＬ-１５)、インターロイキン４(ＩＬ-４)、イ
ンターロイキン１０(ＩＬ-１０)および形質転換成長因子β(ＴＧＦ-β)を、Ｔ細
胞を活性化するために使用する。

【００６０】 ２以上の化合物を含有する組成物を用いて、抑制性細胞となるＴ細胞を活性化
させることがでる。組成物は、同じ分類の化合物から２以上の化合物、即ち、２
以上のサイトカイン、ケモカインまたはプロスタグランジンを一緒に混合しても
よい。また、組成物は、異なる分類の化合物からの化合物、例えば、サイトカイ
ンおよびケモカインまたはサイトカインおよびプラオスタグランジンなどを含有
することもできる。

【００６１】 好ましい実施態様において、２以上のサイトカインを含有する組成物を用いて
、Ｔ細胞を活性化する。例えば、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βを抑制性細胞の生成を
増加するために一緒に混合する。

【００６２】 好ましい実施態様おいて、ＴＦＧ−βを、抑制性Ｔ細胞をつくるために用いる
。本明細書で「形質転換成長因子−β」すなわち「ＴＧＦ−β」は、ＴＧＦ−β
ファミリーのいずれか１つを意味する。３種のイソ型、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−
β２、ＴＧＦ−β３がある。参照、Massague,J.(1980),J.Ann.Rev.Cell Biol 6:
597。リンパ球および単球は、このサイトカインのβ１のイソ型を生成する(Kehr
l,J.H.et al.(1991),lnt J Cell Cloning 9:438-450)。ＴＧＦ−βは、処置され
るレシピエント細胞に対して活性であるＴＦＧ−βのいずれの型であってもよい
。ヒトでは、組換えＴＦＧ−βが現在のところ好ましい。ヒトＴＧＦ−β２は、
Genzyme Pharmaceuticals，Farmington，MA．から購入できる。一般に、ＴＧＦ
−βの濃度は、細胞懸濁液中、約１０pg／ｍｌから約５n／ｍｌであって、約０.
１ngから約３ng／ｍｌが好ましく、約１ng／ｍｌが理想的である。

【００６３】 ＴＧＦ-βを、レシピエント細胞および照射したドナーＰＢＭＣの群(上記のよ
うに回収した)と共にインキュベートする。ドナー細胞は、それがレシピエント
細胞を攻撃することができないように照射する。インキュベーション期間は、効
果を生じるに十分な期間であり、一般に４時間から５日であるが、より短時間お
よびより長時間の両方でもあり得る。

【００６４】 好ましい実施態様において、調節組成物によるレシピエント細胞の処置に引続
いて、レシピエント患者に移す前にこれらの細胞の増殖を行う。

【００６５】 別の実施態様において、増殖した細胞の代わりに細胞を移すことが望ましいこ
ともある。この場合では、細胞を、調節組成物を除く洗浄の直後に移し、凍結す
るかもしくは貯蔵する。

【００６６】 細胞は、処置すると、レシピエントへの移植前に評価もしは試験し得る。例え
ば、下記：滅菌試験; グラム染色、微生物学的試験; ＬＡＬ試験; マイコプラズ
マ試験：細胞タイプを同定するためのフローサイトメトリー; 機能試験など、の
ために試料を取出し得る。これらおよび別のリンパ球試験を、処置前もしくは処
置後にしてもよい。好ましい分析はドナー細胞を標識することである；標識群と
処置済寛容レシピエント細胞をインキュベートし、レシピエント細胞が寛容であ
り、かつドナー細胞を殺生しないことを確かめる。

【００６７】 例えば図２に示したアッセイを使用して、調節組成物が抑制性細胞を誘導する
かどうかを測定することができる。これは、生成した抑制性細胞とレシピエント
Ｔ細胞とを体外で混合し、ドナー細胞の生存をアッセイすることによって行う。

【００６８】 好ましい実施態様において、この処置によって、移植拒絶反応を防止するため
にドナーの組織適合性細胞に対してＴ細胞が非応答性となる。

【００６９】 好ましい実施態様において、Ｔ細胞の単離、調節組成物によるＴ細胞の調整お
よびＴ細胞の増殖を、産物への毒性の導入を最小にするために閉鎖系、例えば、
the Nexell Isolex 300 systemで行う。

【００７０】 レシピエントの処置済Ｔ細胞をレシピエント患者に戻す。これは、一般的に当
業者には既知のように行い、通常、当業者に認められているようにレシピエント
中に処置細胞を注入もしくは導入することを含む。これは、静脈もしくは動脈を
包含する血脈(ＩＶ)投与、腹膜内投与などによりなし得る。例えば、細胞は、滅
菌シリンジまたは別の滅菌移送機構を用いて注入することによって５０ml Fenwa
ll インフュージョンバッグ中に置くことも可能である。次いで、細胞を、ある
時間、例えば１５分に渡って、患者中へのフリーフローＩＶライン中にＩＶ投与
を介してすぐに注入し得る。ある実施態様において、さらなる薬剤、例えば、緩
衝液または塩をさらに添加してもよい。

【００７１】 患者中に細胞を再導入した後、処置の効果は、もし必要であれば、一般的に、
上記および従来の技術で評価することができる。

【００７２】 下記実施例は、上記記載の発明を使用する方法をより完全に説明することを目
的としており、さらに本発明の様々な実施態様を考慮した最良のモデルを例示す
るものである。これらの実施例は、この発明の真実の範囲を限定するものではな
く、むしろ例示目的で記載すると理解されたい。本明細書中に記載の文献は、出
典明示により本明細書の一部とする。

【００７３】 実施例１細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制するＴＧＦ-β活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞 ドナーおよびレシピエントの両方からの血液をフェレーシスにより得た。各個
体からのＰＢＭＣを、Nexell Isolex 500 閉鎖系を用いてＲＢＣから分離した。
レシピエントからのＣＤ４＋細胞およびドナーからのＴ細胞枯渇単核細胞を、市
販の試薬を用いて調製した。

【００７４】 レシピエントが、単核細胞を入手できないようなドナーから臓器移植を受ける
場合、レシピエントＴ細胞を、共通および非共通の組織適合性抗原の広範なパネ
ルを発現するドナープールからの照射した単核細胞で調整した。

【００７５】 レシピエントＣＤ４＋細胞を、照射したドナー単核細胞と、ＴＧＦ-β存在下
で５日間培養した。ＴＧＦ-βの存在下でドナー細胞と反応するＣＤ４+細胞を、
抑制性Ｔ細胞となるように誘導した。 該細胞をドナー同種抗原または有糸分裂
促進物質とともに、さらに１０日間インキュベートし、多数の抑制性Ｔ細胞を増
やした。

【００７６】 これらの抑制性Ｔ細胞の強さを試験するために、それらを、キラーＴ細胞を誘
導するためにドナーの照射した非-Ｔ細胞と混合したレシピエントのＴ細胞と５
日間培養した。次いで、レシピエントＴ細胞を、クロミウム標識したドナーリン
パ芽球細胞と混合し、４時間インキュベートした。レシピエント細胞毒性Ｔ細胞
がドナー細胞を殺すと、クロミウムが培養培地に放出される。クロミウム放出量
を測定することによって、殺生された細胞の割合を測定することが可能である。

【００７７】 図２-４は、ＴＧＦ-βにより生じた調節性Ｔ細胞が、レシピエントＴ細胞のド
ナーＴ細胞を殺生する能力を遮断することを示す。

【００７８】 図２-４に示した標準的な細胞毒性アッセイにおいて、レシピエント細胞を標
識ドナー細胞とともに、２５:１、５０:１および１００:１割合で培養した。レ
シピエントおよびドナー細胞のこれらの組合せを、エフェクター対標的比と呼ぶ
。殺生を、様々なシンボルによって表示する。予想されるように、最も高い殺生
は、最も高いエフェクター対標的比で見られる。ドナーの刺激細胞と共に培養し
たＣＤ４＋細胞は、穏やかな阻害効果を示した。ＴＧＦ-β１ng/mlで調整したＣ
Ｄ４＋細胞は、レシピエントＴ細胞のドナー単核細胞を殺生する能力をほぼ完全
に消滅せしめた。

【００７９】 実施例２細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制するＴＧＦ-β活性化Ｔ細胞 ドナーおよびレシピエントからの血液をフェレーシスによって得た。各個体か
らのＰＢＭＣを、Nexell Isolex 500閉鎖系を用いてＲＢＣから分離した。主要
サブセット(ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞)および副サブセット(ＴＮＫ細胞およ
びγδＴ細胞)の両方を含むレシピエントからのＴ細胞、とドナーからのＴ細胞
枯渇単核細胞を市販試薬を使用して調製した。

【００８０】 レシピエントＴ細胞を、ＴＧＦ-βの存在下、３〜５日間、照射したドナー単
核細胞と培養した。ＴＧＦ-βの存在下でドナー細胞と反応する様々なＴ細胞サ
ブセットを、抑制性Ｔ細胞となるように誘導した。同様の手順を、さらに１０日
繰り返し、抑制性Ｔ細胞の数を増やした。

【００８１】 次いで、ＴＧＦ-βの存在下にドナー同種抗原で免疫起動されたレシピエント
Ｔ細胞を抑制活性について試験した。このＴ細胞が、レシピエント前駆体キラー
細胞のドナーＴ細胞を殺す能力発揮を防止することを、実施例１に記載の方法に
よって示す。

【００８２】 実施例３移植拒絶反応を防止するため、非同一の同胞ドナーからの腎臓移植レシピエント からのＴ細胞の処置 腎臓移植の１日前に１ng/mlのＴＧＦ−βで調整したＣＤ４＋細胞をレシピエ
ントに移し、リンパ球組織に対し「向かう（ホーム）」ようにする。これらのＣ
Ｄ４＋細胞は、レシピエントのリンパ様臓器に循環し、ドナー組織適合性抗原に
応答するレシピエントＴ細胞を遮断する。結果として、レシピエントＴ細胞はド
ナー組織適合性抗原に寛容となる。この寛容により、急性拒絶反応が低下し、免
疫抑制剤の高用量についての必要性を低くする。レシピエントリンパ球は、長く
続く寛容を発揮するように「経験する」ので、慢性的の拒絶反応を低下もしくは
消失する。移植拒絶反応のサインを繰り返すなら、調節性Ｔ細胞をさらに注入し
て、この反応を改善する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ここ２０年間で慢性拒絶反応の防止について進歩がない
ことを示す。

【図２】 図２は、細胞毒性Ｔ細胞活性を抑制する細胞の発生におけるＴ細
胞サブセットに対するＴＧＦ-βの効果を示す。

【図３】 図３は、ＴＧＦ-βの存在または非存在下で、刺激細胞と共に培
養したＣＤ４ ＣＤ４５ＲＡＴ細胞に対するＴＧＦ-βの制御効果について、２つ
の独立した実験を示す。

【図４】 図４は、ＣＤ４抑制細胞が、細胞毒性Ｔ細胞活性を阻害するため
に細胞接触を必要とすることを示す。

【図５】 図５は、ＴＧＦ-βによって誘導された調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞に
よるリンパ球増殖の抑制を示す。

【図６】 図６は、ＴＧＦ-βによって誘導されたＣＤ４+調節性Ｔ細胞の強
さを示し、それらがＣＤ２５を発現することを示す。

【図７】 図７は、ＣＤ４＋細胞によるＣＤ２５およびＣＴＬＡ-４の発現
に対する調節組成物の効果を示す。

【図８】 図８は、同種異系抗原に対するＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の増殖性応
答を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 末梢単核血液細胞(ＰＢＭＣ)を活性化するために調節組成物
   を添加することを含む、該細胞におけるＴ細胞寛容を体外で誘導する方法。
2. 【請求項２】 移植拒絶反応を低下させるようにレシピエント細胞を誘導す
   る方法であって、 a）レシピエントおよびドナーから末梢単核血液細胞を単離すること、 b）ドナーおよびレシピエントの細胞を体外で混合すること、 c）調節組成物で該細胞を処理すること、 d）該細胞を増やすこと、そして e）該細胞を該レシピエントに導入すること、 を含む方法。
3. 【請求項３】 該調節組成物が刺激細胞およびＴＧＦ-βを含む、請求項１
   または２のいずれかに記載の方法。
4. 【請求項４】 該調節組成物がさらにＩＬ−２およびＩＬ−１５からなる群
   から選択されるサイトカインをさらに含む、請求項３に記載の方法。