CN113350359B - 5α-雄甾-3β,5,6β-三醇在制备治疗出血性脑卒中药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了5α‑雄甾‑3β,5,6β‑三醇、其氘代物或其药学上可接受的盐在制备治疗患者的出血性脑卒中的药物中的应用。所述出血性脑卒中是脑内出血或蛛网膜下腔出血。

Description

5α-雄甾-3β,5,6β-三醇在制备治疗出血性脑卒中药物中的 应用

本申请是申请号为201711479490.8、申请日为2017年12月29日、发明名称为“5α-雄甾-3β,5,6β-三醇在制备治疗出血性脑卒中药物中的应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及5α-雄甾-3β,5,6β-三醇（5α-androst-3β,5,6β-triol, “Triol”）的医药新用途，具体涉及5α-雄甾-3β,5,6β-三醇在出血性脑卒中的治疗中的应用。

背景技术

脑卒中是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的疾病，包括缺血性卒中（“脑梗死”）和出血性脑卒中。根据2014年WHO统计数据，以脑卒中为主的脑血管意外致死率居世界第二位，是导致严重残疾和痴呆的世界首因。2015年全球因脑血管病死亡人数为632.61 万人，其中缺血性卒中为297.8万人，出血性或其他卒中死亡334.8万人。缺血性脑卒中是指突然发生的由于各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现的疾病。依据发病机制的不同，缺血性脑中风包括血栓性脑梗塞、栓塞性脑梗塞、腔隙性脑梗塞、多发性脑梗塞和短暂性脑缺血发作（TIA）等主要类型。

不同于缺血性脑卒中，出血性脑卒中又称脑溢血，是颅内血管破裂，导致血液漏入大脑，产生相应神经系统功能障碍的一系列临床表现。与缺血性脑卒中相比，出血性脑卒中急性期的死亡率较高。根据在脑组织中出血部位的不同，出血性脑卒中主要分为脑出血(ICH)和蛛网膜下腔出血（SAH）两类。ICH发生在脑内，而SAH发生在软脑膜和蛛网膜之间。高血压性脑出血是非外伤性ICH最常见病因，其次是脑血管畸形、脑淀粉样血管病、动脉瘤、烟雾病、脑动脉炎、原发或转移性肿瘤、溶栓或抗凝治疗所致脑出血、梗死后脑出血等。而SAH常见病因为颅内动脉瘤，其次为脑血管畸形，还有高血压性动脉硬化，也可见于动脉炎、脑底异常血管网、结缔组织病、血液病、抗凝治疗等。SAH是卒中引起猝死的最常见原因。

不同类型的脑卒中，其治疗方式不同，甚至相反。区分缺血性和出血性脑卒中的方法在本领域是已知的，参见例如PCT/EP2015/078576；PCT/US2007/073272。由于一直缺乏有效的治疗手段，目前认为预防是最好的措施。因此，提供一种治疗出血性脑卒中的药物具有重要临床意义。近年随着神经影像学等交叉学科的发展，使急性脑卒中诊断更为准确和快捷，更有益于治疗方案选择与预后判断，但迄今为止还没有一种独立的治疗方法能根治脑卒中。

发明内容

本发明一方面提供5α-雄甾-3β,5,6β-三醇、其氘代物或其药学上可接受的盐在制备治疗出血性脑卒中药物中的应用。

本发明另一方面提供一种治疗患者的出血性脑卒中的方法，该方法包括向该患者施用有效量的5α-雄甾-3β,5,6β-三醇、其氘代物或其药学上可接受的盐、或包含5α-雄甾-3β,5,6β-三醇、其氘代物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

本发明再一方面提供5α-雄甾-3β,5,6β-三醇、其氘代物或其药学上可接受的盐用于患者的出血性脑卒中的治疗。

在一些实施方式中，所述出血性脑卒中表现为脑组织血管破裂或破损导致血液流出血管之外。

在一些实施方式中，所述出血性脑卒中是脑出血（ICH），如高血压性脑出血。在另一些实施方式中，所述脑出血是脑血管畸形、脑淀粉样血管病、动脉瘤、烟雾病、脑动脉炎、原发或转移性肿瘤、或溶栓或抗凝治疗所致脑出血或梗死后脑出血。

在一些实施方式中，所述出血性脑卒中是蛛网膜下腔出血（SAH），如颅内动脉瘤引起的蛛网膜下腔出血。在另一些实施方式中，所述蛛网膜下腔出血是脑血管畸形，高血压性动脉硬化、动脉炎、脑底异常血管网、结缔组织病、血液病、或抗凝治疗引起的蛛网膜下腔出血。

在一些实施方式中，所述药物还包含另外的治疗剂。

在一些实施方式中，所述患者是人。

附图说明

图1. Triol显著减少脑出血模型C57B小鼠的脑出血量。A. 脑出血第24小时的代表性脑片；B. 第24小时的脑出血量，每组n=10，**p < 0.01。

图2. Triol显著改善C57B小鼠脑出血后的感觉神经功能。A. 圆圈实验；胶黏纸实验B. 接触胶黏纸的时间；C.撕掉胶黏纸的时间；*p < 0.05，***p < 0.001，n=12~23只/组。说明：con：正常；sham：假手术；ICH：脑出血模型；vehicle：溶剂。

图3. Triol显著改善C57B小鼠脑出血后的感觉运动神经功能。改良加西亚评分（A–D）用于评价C57B小鼠脑出血后24小时的感觉运动神经功能：A. 鼻毛接触实验；B. 肢体对称性实验；C. 前肢行走实验，D. 总体神经功能评分；n = 12~23只/组，*p < 0.05，**p <0.01，***p < 0.001。说明：con：正常；sham：假手术；ICH：脑出血模型；vehicle：溶剂。

具体实施方式

如本文所用，术语“组合物”指适于给预期动物对象施用以达到治疗目的的制剂，其含有至少一种药物活性组分，例如化合物。任选地，所述组合物还含有至少一种药物学上可接受的载体或赋形剂。

术语“药学上可接受的”表示所述物质不具有这样的特性，即考虑到将被治疗的疾病或病症以及各自的施用途径，该特性将会使理性谨慎的医学从业者避免给患者服用该物质。例如，对于可注射物来说，通常要求这样的物质是基本无菌的。

在本文中，术语“治疗有效量”和“有效量”表示所述物质和物质的量对于预防、减轻或改善疾病或病症的一种或多种症状，和/或延长接受治疗的对象的存活是有效的。

本文使用的“治疗”包括给予本申请的化合物或其药学上可接受的盐，以减轻疾病或病症的症状或并发症，或消除疾病或病症。本文使用的术语“减轻”用于描述病症的迹象或症状的严重性降低的过程。症状可减轻而没有消除。在一种实施方案中，给予本申请的药物组合物导致消除迹象或症状。

5α-雄甾-3β,5,6β-三醇、其氘代物及药学上可接受的盐

5α-雄甾-3β,5,6β-三醇在本文也称为“Triol”或“本发明的化合物”，结构式如式(I)所示。业已证实，Triol是一种有效对抗急性缺血缺氧脑损伤的神经元保护剂。

（式I）

本发明的化合物可以被配制为药学上可接受盐的形式。预期的药学上可接受的盐形式包括，但不限于，单盐、双盐、三盐、四盐等。药学上可接受盐在它们被施用的量和浓度下是无毒的。在不阻止其发挥生理效应的情况下，通过改变化合物的物理特性，这样的盐的制备可以便于药理学应用。在物理性质上有用的改变包括降低熔点以便经粘膜给药，以及增加溶解度以便施用更高浓度的药物。

药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如那些含硫酸盐、氯化物、氢氯化物、延胡索酸盐、马来酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己氨基磺酸盐和奎尼酸盐的盐。药学上可接受的盐可以从酸获得，所述酸例如盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己氨基磺酸、延胡索酸和奎尼酸。

当酸性官能团例如羧酸或酚存在时，药学上可接受的盐也包括碱加成盐，例如那些含有苄星青霉素、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙醇胺、叔丁胺、乙二胺、葡甲胺、普鲁卡因、铝、钙、锂、镁、钾、钠、铵、烷基胺和锌的盐。使用合适的相应的碱可以制备此类盐。

通过标准技术，可以制备药学上可接受的盐。例如，将游离碱形式的化合物溶解在合适的溶剂中，例如含有适宜酸的水性溶液或水-醇溶液中，然后蒸发溶液进行分离。在另一个实例中，通过使游离碱和酸在有机溶剂中反应来制备盐。

因此，例如，如果特定化合物是碱，则可以通过本领域可得的任何合适方法制备所需的药学上可接受的盐，例如，用无机酸或有机酸处理游离碱，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸和类似酸，所述有机酸如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(pyranosidyl acid) 如葡糖醛酸或半乳糖醛酸、α-羟基酸如柠檬酸或酒石酸、氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸、芳香酸如苯甲酸或肉桂酸、磺酸如对甲苯磺酸或乙磺酸或类似物。

同样，如果特定化合物是酸，则可以通过任何合适方法制备所需的药学上可接受的盐，例如，用无机碱或有机碱处理游离酸，所述无机碱或有机碱例如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物或类似物。合适的盐的示范性例子包括有机盐，其衍生自氨基酸(如L-甘氨酸、L-赖氨酸和L-精氨酸)、氨、伯胺、仲胺和叔胺，以及环胺(如羟乙基吡咯烷、哌啶、吗啉和哌嗪)，以及无机盐，其衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂。

化合物的药学上可接受的盐可以作为络合物存在。络合物的例子包括8-氯茶碱络合物(类似于，例如，茶苯海明：苯海拉明8-氯茶碱(1:1)络合物；晕海宁)和各种包含环糊精的络合物。

本发明还预期包括使用该化合物的药学上可接受的氘代化合物或其他非放射性取代化合物。氘代是将药物活性分子基团中的一个或多个或全部氢替换成同位素氘，因其无毒无放射性，又比碳氢键稳定约6~9倍，可以封闭代谢位点而延长药物的半衰期，从而降低治疗剂量，同时又不影响药物的药理活性，而被认为是一种优良的修饰方法。

药物组合物

在本发明中，“药物组合物”是指包含Triol化合物和药学上可接受的载体的组合物，其中化合物和药学上可接受的载体以混合形式存在于组合物中。所述组合物一般将被用于人类对象的治疗。然而，它们也可以被用于治疗在其它动物对象中的相似的或相同的病症。在本文中，术语“对象”、“动物对象” 和类似术语指人和非人类脊椎动物，例如哺乳动物，如非人类灵长类，竞技动物和商业动物，例如马、牛、猪、绵羊、啮齿类动物，和宠物(如狗和猫)。

合适的剂型，部分地取决于用途或给药的途径，例如经口、经皮、经粘膜、吸入或通过注射(肠胃外)。此类剂型应当使该化合物能够到达靶细胞。其它因素在本领域中是熟知的，包括需要考虑的事项，诸如毒性和延迟化合物或组合物发挥其效应的剂型。

载体或赋形剂可以被用于生产组合物。所述载体或赋形剂可以被选择为促进化合物的给药。载体的例子包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、葡萄糖或蔗糖)、或淀粉类型、 纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和生理相容性溶剂。生理上相容性溶剂的例子包括注射用水(WFI)无菌溶液、盐溶液和葡萄糖。

可以通过不同的路径施用组合物或组合物的组分，包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、经口、经粘膜、 直肠、经皮或吸入。在一些实施方式中，优选注射剂或冻干粉针剂。对口服而言，例如，化合物可以被配制为常规口服剂型，例如胶囊、片剂，以及液体制剂，例如糖浆、酏剂和浓缩滴剂。

可以获得口服用途的药物制剂，例如通过将组合物或其组分与固体赋形剂组合，任选研磨所形成的混合物，以及在加入合适的辅剂之后(如需要)加工颗粒的混合物，从而获得片剂或糖衣丸。合适的赋形剂特别是，填料例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮(povidone))。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或它们的盐，例如藻酸钠。

作为选择，可以使用注射(肠胃外给药)，例如肌内的、静脉内的、腹膜内的和/或皮下的。对于注射而言，本发明的组合物或其组分被配制为无菌液体溶液，优选在生理相容的缓冲液或溶液中，例如盐水溶液、Hank溶液或Ringer溶液。另外，组合物或其组分可以被配制为固体形式，并在使用之前一刻被再溶解或悬浮。也可以生产冻干粉形式。

给药也可以通过经粘膜、局部或经皮方式。对于经粘膜、局部或经皮给药，在配方中使用适合待穿透的屏障的穿透剂。这样的穿透剂在本领域中是普遍已知的，包括，例如，对于经粘膜给药，胆汁盐和梭链孢酸衍生物。另外，去垢剂可以用于促进穿透。经粘膜给药，例如，可以通过鼻喷雾或栓剂(经直肠或阴道)。

通过标准程序可以确定待施用的各种组分的有效量，考虑的因素例如所述化合物IC₅₀、所述化合物的生物半衰期、对象的年龄、大小和体重以及与对象有关的病症。这些因素和其它因素的重要性对本领域普通技术人员而言是熟知的。一般而言，剂量将在被治疗的对象的大约0.01mg/kg至50mg/kg之间，优选在0.lmg/kg至20mg/kg之间。可以使用多次剂量。

本发明的组合物或其组分还可以与治疗相同疾病的其他治疗剂结合使用。这种结合使用包括在不同时间施用这些化合物以及一种或多种其他治疗剂，或同时使用这种化合物和一种或多种其他治疗剂。在一些实施方式中，可对本发明的一种或多种化合物或结合使用的其他治疗剂的剂量进行修改，例如，通过本领域技术人员已知的方法降低相对于单独使用的化合物或治疗剂的剂量。

要理解的是，结合使用或联用包括与其他疗法、药物、医学程序等一起使用，其中该其他疗法或程序可在不同于本发明的组合物或其组分的时间(例如，在短期内(如几个小时，如1、2、3、4-24小时)或在较长时间内(如1-2天、2-4天、4-7天、1-4周)或在与本发明的组合物或其组分相同的时间被施用。结合使用还包括与一次或不频繁施用的疗法或医学程序(如手术)一起使用，并伴随本发明的组合物或其组分在该其他疗法或程序之前或之后的短期或较长时间段内的施用。在一些实施方式中，本发明用于递送本发明的组合物或其组分和一种或多种其他药物治疗剂，它们通过相同或不同给药途径递送。

任何给药途径的结合施用包括通过相同给药途径将本发明的组合物或其组分和一种或多种其他药物治疗剂以任何制剂形式一起递送，包括两种化合物化学地相连且它们在施用时保持各自治疗活性的制剂。在一个方面，该其他药物疗法可与本发明的组合物或其组分共同施用。通过共同施用的结合使用包括施用共制剂(co-formulation)或化学上连接的化合物的制剂，或在短期内(例如，一个小时内、2小时内、3小时内、直至24小时内)施用两种或多种独立制剂形式的化合物，它们以相同或不同的途径给药。

独立制剂的共同施用包括经由一个装置的递送的共同施用，例如相同吸入装置、相同注射器等，或相对彼此短期内由不同装置施用。通过相同给药途径递送的本发明的化合物和一种或多种额外的药物疗法的共制剂包括将材料一起制备从而它们可通过一个装置被施用，包括不同化合物组合在一种制剂中，或化合物被修饰从而使得它们在化学上连接在一起但仍保持各自的生物学活性。这种化学上连接的化合物可包括将两个活性成分分开的连接体，该连接体在体内基本维持，或在体内可能降解。

实施例

材料及方法

实验动物：清洁健康级C57雄性小鼠112只。8～10周龄，体重20-22g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。饲养条件：22℃～26℃，湿度50%～60％，分笼，标准饲料和纯净水喂养，进行适应性饲养1周。

试剂耗材：主要试剂及易耗损仪器：Ⅶ型胶原酶（美国Sigma公司）、Triol（广州市赛普特医药科技股份有限公司）、血红蛋白检测试剂盒(Drabkins reagent：碳酸氢钠1.0g，氢化钾0.05g，高铁氰化钾0.2g，加蒸馏水至1000 ml， 4℃保存)恩氟烷、水合氯醛、骨蜡、微量注射针，TES buffer、氯化钙、灌注液、一次性注射器、冻存管等。

脑出血模型制作及给药：脑出血模型制作：小鼠称体质量后，5%恩氟烷诱导麻醉，2%恩氟烷混合70%N₂O及30% O₂维持麻醉。俯卧位固定于立体定位仪上，局部消毒、切开皮肤、暴露颅骨钻孔，以微量进样器缓慢注射含0.35UVII型胶原酶0.3μl，留针5min后缓慢拔针头5min，骨胶覆盖颅骨钻孔，缝合皮肤，常规消毒。假手术组以同样的方法入针，但不注射。溶剂或Triol按照60mg/kg于造模后1 h腹腔注射给药。

动物分组：将C57小鼠采用随机数字法分为5组，即正常对照组(n=12)、假手术组(n=12)、脑出血组(n=26)、脑出血+造模1h溶剂腹腔注射组(n=26)、脑出血+造模1h Triol腹腔注射组(n=26)。

神经行为学评分：神经功能测定于脑出血模型制作24小时进行。

脑出血量测定：造模24小时后水合氯醛腹腔注射麻醉，PBS经心脏灌注冲洗，立即取脑，切下小鼠出血侧大脑，生理盐水冲洗去外表面的血液，匀浆，取上清液保存，用血红蛋白检测试剂盒进行脑内血红蛋白含量的测定。

结果

Triol显著减少脑出血模型C57B小鼠的脑出血量

利用胶原酶脑内定位注射诱发C57B小鼠脑出血1小时后给予各处理，24小时后可见Triol使胶原酶注射脑半球的出血面积（体积）明显缩小（图1A）。通过血红蛋白含量测定可见，经Triol治疗的出血脑半球的血红蛋白含量即出血量与脑出血模型组相比显著下降（p < 0.01）（图1B）。上述数据说明Triol有效地减轻脑出血。

Triol显著改善C57B小鼠脑出血后的感觉神经功能

胶原酶注射诱发脑出血24小时后，C57B小鼠的各项感觉功能均大幅度钝化。而给予Triol处理后，小鼠从圆心出发走出圆边任一点的耗时有减少趋势，提示Triol使脑出血小鼠的方位感有所恢复（图2A）；胶黏纸实验中，给予Triol显著缩短了脑出血小鼠的胶黏纸接触时间（p < 0.05）和胶黏纸移除时间（p < 0.001），使小鼠因脑出血受损的体表触觉得到显著改善（图2B、2C）。

Triol显著改善C57B小鼠脑出血后的感觉运动神经功能

胶原酶注射诱发脑出血24小时后，C57B小鼠的各项感觉运动功能明显钝化。而给予Triol处理后，小鼠的胡须触碰躲避明显恢复，提示Triol使脑出血小鼠的精细触觉反应运动明显改善（p < 0.001）（图3A）；给予Triol处理后，小鼠的肢体对称性运动（p < 0.01）（图3B）及前肢行走（p < 0.05）（图3C）均明显改善，说明Triol使小鼠因脑出血受损的本体感觉及运动控制功能得到恢复。综合评价，Triol使脑出血小鼠的神经功能评分显著改善（p< 0.001）（图3D）。

Claims (5)

1.下式的化合物5α-雄甾-3β,5,6β-三醇或其药学上可接受的盐在制备治疗患者的出血性脑卒中的药物中的应用，其中所述出血性脑卒中是蛛网膜下腔出血（SAH）：

。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述蛛网膜下腔出血是颅内动脉瘤引起的蛛网膜下腔出血。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述蛛网膜下腔出血是脑血管畸形、高血压性动脉硬化、动脉炎、脑底异常血管网、结缔组织病、血液病、或抗凝治疗引起的蛛网膜下腔出血。

4.根据权利要求1所述的应用，其中所述患者是人。

5.根据权利要求1所述的应用，其中所述蛛网膜下腔出血表现为脑组织血管破裂或破损导致血液流出血管之外。

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