CN103333216A - 5α-6-酮-胆甾烷类似物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种5α-6-酮-胆甾烷类似物及其应用，所述5α-6-酮-胆甾烷类似物的结构通式为：
。所述类似物治疗中枢神经系统疾病的作用与其可作为甾体类神经抗炎制剂有关，无明显细胞毒性，能够有效减少脑出血面积，在全新型的中枢神经系统疾病治疗药物的制备中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型医药制剂，具体涉及一种5α-6-酮-胆甾烷类似物以及其作为甾体类神经抗炎制剂在制备治疗中枢神经系统疾病的药物中的应用，属于医药领域。
背景技术
中枢神经系统疾病，包括阿尔茨海默症、老年痴呆、帕金森病、中风、多发性硬化病等，具有发病率高、死亡率高、致残率高等特点。在我国仅老年痴呆发病人数就超过300万，并且随着年龄增加发病率不断提高。以中枢神经系统疾病为主要特征的老年性疾病不仅病残率高、病程周期长、医疗和护理负担重，而且病死率高，已经成为严重威胁老龄人群生活质量及生命安全的重要原因，同时也给家庭和社会带来了沉重的负担。随着各国老龄化程度的加剧，与年龄相关的中枢神经系统疾病已经不只是一个医学问题，甚至成为了一个困扰全球的社会问题。因此，中枢神经系统疾病的防治成为社会和医学界关注的重要课题，中枢神经系统疾病药物研究都是制药领域优先重点关注的方向。
中枢神经系统疾病涉及多种重要神经功能缺损，目前研究人员大多关注由于神经元损害引起的脑功能改变，治疗上也大多采用维护和促进神经功能的药物。但是，近年来，越来越多的证据表明中枢神经系统疾病，无论是急性病变，如：外伤、中风等，还是慢性退行性病变，如：阿尔茨海默症、帕金森病、多发性硬化病等在发生和发展过程中，均有明显的炎症病变。在中枢神经系统中，任何中枢神经病理变化均可激活平时处于静止状态的小胶质细胞，当小胶质细胞在致炎因素的作用下被激活时，产生并释放大量的炎症因子，引起神经细胞死亡，从而进一步加重神经变性的发生，因此神经变性性疾病发病与脑内炎症密切相关。
因此，需要开发更多的新型药物，用以消除炎症反应、抑制小胶质细胞激活，从而达到改善临床症状，减慢或逆转中枢神经系统疾病的目的。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种5α-6-酮-胆甾烷类似物、包含所述类似物的药物组合物，及该类似物作为甾体类神经系统炎症抑制剂在制备治疗中枢神经系统疾病的药物中的应用。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
一种5α-6-酮-胆甾烷类似物，其具有通式(I)的结构式：
式中，R1选自-CH2CH2COOR5、、
、-CH2CH2CONHR6；其中R5、R6选自C1-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C3-C10的环烷基、苯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基或吡咯基；
R2、R3、R4选自氢、氟、溴、氯、碘、-OH、-OR7、-OCOR7、-OCO(CH2)nNH2 (n=0-6)、-OCONHR7、-OCONR8R9或-OSO2R7，其中R7为C1-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C3-C10的环烷基、苯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基或吡咯基；R8、R9选自C2-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C3-C10的环烷基、C5-C20的芳香基。
上述技术方案中，所述C5-C20的芳香基为苯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、恶唑基、吲唑基、吲哚基、喹啉基、萘基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基或苯并噻唑基。
本发明同时保护上述5α-6-酮-胆甾烷类似物在制备治疗中枢神经系统疾病的药物中的应用。
上述技术方案中，所述的疾病为阿尔茨海默症、老年痴呆、帕金森病、中风或多发性硬化病。
本发明所述5α-6-酮-胆甾烷类似物可以单独使用或者与一种以上可接受的载体组合剂制成制剂给药，例如溶剂、稀释剂等；可以口服剂型给药，如片剂、胶囊、可分散粉末、颗粒剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如0.05%~90%重量活性成分，更常见约15%~60%之间的活性成分。本发明化合物剂量可以为0.005~5000mg/kg/天，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围。
本发明的5α-6-酮-胆甾烷类似物的制备方法概括如下：以廉价易得的猪去氧胆酸为起始物，在酸的醇溶液或者酰胺缩合剂作用下羧基成酯、成酰胺或者在醋酸碘苯或者醋酸铅的条件下脱羧成烯化合物1，化合物1在PDC的作用下生成6-酮化合物2，然后将化合物2在5%的盐酸甲醇溶液中异构化生成化合物3，将化合物3的羟基进行翻转、取代或者脱水成烯得化合物4，化合物4在LDA和三甲基氯硅烷作用下形成烯醇硅醚，再生成7-位取代产物5，即5α-6-酮-胆甾烷类似物。具体反应式如下：
上述制备方法中，所述的酸包括盐酸，硫酸，硝酸，高碘酸，高氯酸；碱包括溴化锂，氢氧化锂，碳酸钠，碳酸钾，氢氧化钠，氢氧化钾，甲醇钠，乙醇钠，乙醇钠，乙醇钾，氢化钠，氢化钾。
上述制备方法中，所述的酰胺缩合剂为羰基二咪唑（CDI），二环己基碳二亚胺（DCC），二异丙基碳二亚胺（DIC），1-（-3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDCI），2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 （HATU），苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU），6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HCTU），O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU），6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯（TCTU），2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯（TSTU）或者2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸季铵盐（TNTU）。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1．本发明的化合物具有治疗中枢神经系统疾病的作用，而且其治疗作用与抑制诱导小胶质细胞的炎症反应有关，显示了这类化合物作为全新型的中枢神经系统疾病药物治疗的良好前景。
2．本发明以廉价易得的猪去氧胆酸为起始物制备的多种结构式的5α-6-酮-胆甾烷类似物对炎症反应均表现出不同程度的抑制作用，无明显细胞毒性，能够有效减少脑出血面积。
附图说明
图1：实施例二中对药物组与对照组细胞上清液NO释放量比较图；
图 2： 实施例三中对照组与药物组细胞生存率的比较图；
图3：实施例四中不同浓度药物组与对照组细胞液NO释放量比较图；
图4：实施例五中不同浓度药物组与对照组细胞抑制率比较图；
图5：实施例六中药物组与空白组的iNOS、TNF-α mRNA表达检测结果图；
图6：实施例七中药物组与空白组的COX-2蛋白表达检测结果图；
图7：实施例八中给药以及未给药的脑片结果图；
图8：实施例八中给药以及未给药的脑梗死体积统计图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
本发明实施例中给出的5α-6-酮-胆甾烷类似物的名称见下表：
| 化合物编号 | 名称 |
| 8a | 3α-羟基-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 8b | 3β-羟基-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 8c | 3β-氟-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 9a | 3α, 7α-二羟基-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 9b | 3β, 7α-二羟基-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 9c | 3β-氟-7α-羟基-5α-6-酮-胆烷酸甲 |
| 10a | 3α-羟基-7α-氟-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 10b | 3β-羟基-7α-氟-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 10c | 3β, 7α-二氟-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 14a | 3α-羟基-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 14b | 3β-羟基-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 14c | 3β-氟-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 15a | 3α, 7α-二羟基-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 15b | 3β, 7α-二羟基-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 15c | 3β-氟-7α-羟基-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 16a | 3α-羟基-7α-氟-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 16b | 3β-羟基-7α-氟-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 16c | 3β, 7α-二氟-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 18 | 2, 3α-环氧-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 19 | 2β, 3α-二羟基-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 20 | 2β-氟-3α-羟基-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 21 | 2, 3α-环氧-7α-氟-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 22 | 2β, 3α-二羟基-7α-氟-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 23 | 2β, 7α-二氟-3α-羟基-5α-6-酮-胆烷酸甲酯 |
| 25 | 2, 3α-环氧-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 26 | 2, 3α-环氧-7α-氟-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 27 | 2β, 3α-二羟基-7α-氟-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 28 | 2β, 7α-二氟-3α-羟基-22-烯-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 29 | 3α, 22α, 23-三羟基-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 30 | 3β-氟-22α, 23-二羟基-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 31 | 3α, 7α, 22α, 23-四羟基-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 32 | 3α, 22α, 23-三羟基-7α-氟-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 33 | 3β-氟-7α, 22α, 23-三羟基-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
| 34 | 2, 3α-环氧-22α, 23-三羟基-5α-6-酮-24-降胆甾烷 |
实施例一：制备实施例
1H-NMR用Varian Mercury plus-400和BrukerAM-400型核磁共振仪测定；MS用Agilent 6110型质谱仪测定，除注明外均为EI源（70ev）；所有溶剂在使用前均经过重新蒸馏，所使用的无水溶剂均是按标准方法干燥处理获得；产品的纯化除说明外均使用硅胶（200~300目）柱色谱法；其中硅胶（200~300目）由青岛海洋化工厂生产，GF254薄层硅胶板由烟台市化工研究院生产。
1. 化合物9a的合成
参见下列反应式：
将原料猪去氧胆酸(3.9g，10 mmol)溶于30 ml甲醇，加入0. 5ml浓盐酸，加热回流至原料完全反应，减压蒸出甲醇后，二氯甲烷萃取，碳酸氢钠饱和溶液及饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥浓缩得黄色固体化合物6 (4 g，定量)；化合物6：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.06 (m, 1 H), 3.67 (s, 3 H), 3.62 (m, 1 H), 2.36 (m, 1 H), 2.24 (m, 1 H), 0.92 (d, J = 6.2 Hz, 3 H), 0.91 (s, 3 H), 0.64 (s, 3 H)；
将化合物6 (2 g，5 mmol)溶于100ml无水二氯甲烷，分批加入PDC (2.1 g，5.6 mmol)，反应5小时后过滤，滤饼用二氯甲烷洗，有机层用0.5 M的盐酸，饱和亚硫酸钠溶液，水及饱和食盐水洗，干燥得柱层析的白色固体化合物7 (1.3 g，收率65%)；化合物7：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.66 (s, 3 H), 3.62 (m, 1 H), 2.35 (m, 1 H), 2.24 (m, 1 H), 0.91 (d, J = 6.3 Hz, 3 H), 0.83 (s, 3 H), 0.64 (s, 3 H)；
将化合物7(1.3 g，3.2 mmol)溶于5%盐酸甲醇溶液(30 ml)，搅拌12小反应至原料完全转化得5-羟基异构化产物白色固体化合物8a(1.15 g，收率88%)；化合物8a：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.15 (m, 1 H), 3.66 (s, 3 H), 2.71 (t, J = 7.8 Hz, 1 H), 2.28 (m, 4 H), 0.91 (d, J = 6.3 Hz, 3 H), 0.72 (s, 3 H), 0.65 (s, 3 H). EIMS: m/z (%) 404 [M]+ (100), 331 (50)；
在0℃，Ar保护下将0.12 mL 二异丙基胺溶于2 mL 干燥的四氢呋喃溶液中，滴加1.6 M浓度的正丁基锂0.5 mL，搅拌半小时制成LDA。再将制好的LDA溶液冷却至-78℃，依次加入底物8a (148 mg, 0.37 mmol)，新蒸的TMSCl (0.09 mL)，Et3N (0.86 mL)自然回温反应2 小时，加入氯化铵水溶液萃灭反应，后处理得到的烯醇硅醚再溶解于5 mL二氯甲烷，直接进入下一步反应。加入m-CPBA (90 mg)，室温反应1小时，再经过酸处理后得到化合物9a，EA:PE = 1:2柱层析得化合物9a（108 mg，产率70%）；化合物9a：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.15 (m, 1 H), 3.78 (m, 1 H), 3.66 (s, 3 H), 3.43 (dd, J = 12.0, 3.0 Hz, 1 H), 0.92 (s, 3 H), 0.68 (d, J = 6.3 Hz, 3 H), 0.64 (s, 3 H).EIMS: m/z (%) 420 [M]+ (70), 402 (100)。
2. 化合物9b的合成
参见下列反应式：
氩气保护下，将上述制备的化合物7(200 mg，0.5 mmol)，三苯基膦(270 mg，0.75 mmol)，甲酸(35 mg，0.75 mmol)溶于干燥四氢呋喃20 mL，于0℃加入偶氮二甲酸二乙酯(130 mg，0.75 mmol)，50℃下反应20小时，乙酸乙酯萃取，浓缩后的产物溶于甲醇，加入碳酸钾(138 mg，1.0 mmol)，反应后浓缩，柱层析的白色固体化合物8b(128 mg，收率64%)；化合物8b：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ3.65 (s, 3H), 3.55 (m, 1H), 2.25 (m, 4H), 0.90 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.73 (s, 3H), 0.64 (s, 3H). EIMS: m/z (%) 404 [M]+ (100), 331 (50)；
9b的合成方法同9a，由化合物8b可以得到化合物9b；化合物9b：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 3.78 (s, 1H), 3.65 (s, 3 H), 3.60 (m, 1H), 3.05 (s, 1H), 2.96 (dd, J = 12.5, 2.8 Hz, 1H), 2.26 (m, 3H), 0.91 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.70 (s, 3H), 0.64 (s, 3H). EIMS: m/z (%) 420 [M]+ (100), 402 (94)。
3. 化合物9c的合成
参见下列反应式：
在Ar保护下，将干燥的上述制备的化合物7 (634 mg, 1.57 mmol)溶于20 mL二氯甲烷中，冷却至-78℃，滴加双(2-甲氧基乙基)氨基三氟化硫(BAST, 0.4 mL)，反应15分钟原料溶解，加入40 mL二氯甲烷稀释，Na2CO3水溶液洗涤数次，水洗，干燥浓缩，EA:PE = 1:10柱层析得化合物8c（253，产率40%）；化合物8c：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.54-4.37 (m ,1 H), 3.65 (s, 3 H), 0.91 (d, J = 6.4 Hz, 3 H), 0.77 (s, 3 H), 0.66 (s, 3 H). 19F NMR (282.3 MHz, CDCl3): δ -170.71 (d, J = 48.8 Hz, 1 H). EIMS: m/z (%) 406 [M]+ (95), 333 (100)。
从化合物8c出发按照9a的制备方法可得白色固体化合物9c；化合物9c：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.59-4.41 (m, 1 H), 3.82 (s, 1 H), 3.65 (s, 3 H), 3.36 (s, 1 H), 2.95 (d, J = 15.0 Hz, 1 H), 0.91 (s, 3 H), 0.67 (d, J = 6.3 Hz, 3 H), 0.65 (s, 3 H). 19F NMR (282.3 MHz, CDCl3): δ -170.54 (d, J = 47.6 Hz, 1 H). EIMS: m/z (%) 422 [M]+ (72), 404 (100)。
4. 化合物10a-10c的合成
在0℃，Ar保护下将0.12 mL 二异丙基胺溶于2 mL 干燥的四氢呋喃溶液中，滴加1.6 M浓度的正丁基锂0.5 mL，搅拌半小时制成LDA。将制好的LDA溶液冷却至-78℃，依次加入上述制备的化合物8a (148 mg, 0.37 mmol)，新蒸的TMSCl (0.09 mL)，Et3N (0.86 mL)自然回温反应2小时，加入氯化铵水溶液萃灭反应，后处理得到的烯醇硅醚再溶解于5 mL二氯甲烷，直接进入下一步反应。加入1-氯甲基-4-氟-1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷二(四氟硼酸)盐(144 mg，0.41mmol)，室温反应3小时，EA萃取，柱层析得化合物10a（116 mg，产率75%）；化合物10a：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 4.42 (m, 1H), 4.16 (m, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.34 (m, 1H), 2.27 (m, 2H), 0.91 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.69 (s, 3H), 0.64 (s, 3H). EIMS: m/z (%) 422 [M]+ (14), 402 (100)；
从化合物8b出发按照10a的制备方法可得白色固体化合物10b；化合物10b：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ4.45 (m, 1H), 3.64 (s, 3H), 3.60 (m, 1H), 2.80 (m, 1H), 2.26 (m, 2H), 0.90 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.71 (s, 3H), 0.64 (s, 3H). EIMS: m/z (%) 422 [M]+ (17), 402 (100)；
从化合物8c出发按照10a的制备方法可得白色固体化合物10c；化合物10c：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 4.50 (m, 2H), 3.65 (s, 3H), 2.79 (m, 1H), 2.28 (m, 2H), 0.91 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.74 (s, 3H), 0.65 (s, 3H). EIMS: m/z (%) 424 [M]+ (17), 404 (100)。
5. 化合物15a的合成
猪去氧胆酸(5 g, 12.8 mmol)溶于20 mL 90%的甲酸，搅拌溶解后，滴加4滴HClO4，升温至60℃，搅拌2小时后，停止加热，撤去油浴。当温度降至40℃时，滴加Ac2O，保持温度不高于60℃，直到有大量气泡产生；将上述体系倒入到200 mL水中，收集沉淀，大量水洗，干燥得到固体化合物11(产率，100%)。化合物11：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 8.04 (s, 1 H), 8.01 (s, 1 H), 5.30 (m, 1 H), 4.83 (m, 1 H), 2.39 (m, 1 H), 2.26 (m, 1 H), 0.99 (s, 3 H), 0.92 (d, J = 6.3 Hz, 3 H), 0.65 (s, 3 H)；
化合物11(2.61 g, 5.8 mmol)加入到100 mL甲苯溶液中，加入0.37g吡啶(0.7 eq.)和0.24g一水合醋酸铜(0.2 eq.)，搅拌10 min. 后，分批加入 9.4g PhI(OAc)2, 加热回流8小时，加入水淬灭反应，乙酸乙酯萃取，水洗。EA:PE = 1:10柱层析，得主产物化合物12( 1.59 g，产率68%)；化合物12：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 8.01 (s, 1 H), 7.98 (s, 1 H), 5.63 (m, 1 H), 5.28 (m, 1 H), 4.84 (m, 3 H), 2.01 (m, 2 H), 1.01 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.98 (s, 3 H), 0.66 (s, 3 H)；
化合物12 (1.2 g, 3 mmol)溶于甲醇中，加入碳酸钾（1.66g，12mmol），室温搅拌1小时，反应完全，浓缩EA萃取，水洗，干燥浓缩得化合物13 (1.04 g, 定量)。不进行纯化，直接将化合物13用于下一步反应；
从化合物13出发按照8a的制备方法可得白色固体化合物14a；化合物14a：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 5.80-5.54 (m, 1 H), 4.88 (dd, J = 23.7, 13.6 Hz, 2 H), 1.05 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.96 (s, 3 H), 0.72 (s, 3 H)；EIMS: m/z (%) 344 [M]+ (30), 271 (100)；
从化合物14a出发按照9a的制备方法可得白色固体化合物15a；化合物15a：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 5.65 (ddd, J = 17.1, 10.1, 8.4 Hz, 1 H), 5.03-4.69 (m, 2 H), 4.17 (s, 1 H), 3.80 (s, 1 H), 3.43 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 1.04 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.70 (s, 3 H), 0.68 (s, 3 H)； EIMS: m/z (%) 360 [M]+ (100), 269 (80)。
6. 化合物15b的合成
从化合物14a出发按照8b的制备方法可得白色固体化合物14b；化合物14b：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 5.76-5.48 (m, 1H), 4.86 (dd, J = 24.1, 13.7 Hz, 1H), 3.66 – 3.39 (m, 1H), 2.31 (dd, J = 13.0, 4.3 Hz, 1H), 2.20 (dd, J = 12.4, 1.9 Hz, 1H), 1.03 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.75 (s, 3H), 0.68 (s, 3H). EIMS: m/z (%) 344 [M]+ (100), 387 (60)；
从化合物14b出发按照9a的制备方法可得白色固体化合物15b；化合物15b：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 5.65 (ddd, J= 17.1, 10.1, 8.4 Hz, 1H), 4.85 (m, 2H), 3.78 (s, 1H), 3.61 (m, 1H), 3.03 (m, 1H), 1.02(d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.71 (s, 3H), 0.67(s, 3H)； EIMS: m/z (%) 360 [M]+ (100), 303 (60)。
7．化合物15c的合成
从化合物14a出发按照8b的制备方法可得白色固体化合物14b；化合物14b：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 5.65 (m, 1 H), 4.88 (m, 2 H), 4.54-4.38 (m, 1 H), 2.34 (dd, J = 13.5, 4.3 Hz, 1 H), 1.03 (d, J = 6.4 Hz, 3 H), 0.78 (s, 3 H), 0.69 (s, 3 H). 19F NMR (282.3 MHz, CDCl3): δ -170.70 (d, J = 48.1 Hz, 1 H). EIMS: m/z (%) 346 [M]+ (15), 149 (100)；
从化合物14b出发按照9a的制备方法可得白色固体化合物15b；化合物15b：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 5.65 (ddd, J = 17.1, 10.1, 8.4 Hz, 1 H), 5.03-4.69 (m, 2 H), 4.17 (s, 1 H), 3.80 (s, 1 H), 3.43 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 1.04 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.70 (s, 3 H), 0.68 (s, 3 H). 19F NMR (282.3 MHz, CDCl3): δ -170.34 (d, J = 47.1 Hz, 1 H). EIMS: m/z (%) 362 [M]+ (15), 231 (100)。
8. 化合物16a-c的合成
分别从化合物14a-c出发按照10a的制备方法可得白色固体化合物16a-c。
化合物16a ： 1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ5.64 (ddd, J = 17.1, 10.2, 8.5 Hz, 1H), 4.90 (dd, J = 17.1, 1.5 Hz, 1H), 4.82 (dd, J = 10.2, 1.5 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 52.5 Hz, 1H), 4.16 (s, 1H), 3.32 (m, 1H), 2.02 (m, 2H), 1.02 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.69 (s, 3H), 0.67 (s, 3H). EIMS: m/z (%) 362 [M]+ (8), 334(72), 305(100)。
化合物16b： 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.64 (ddd, J = 17.1, 10.2, 8.6 Hz, 1H), 4.90 (dd, J = 17.1, 1.5 Hz, 1H), 4.82 (dd, J = 10.2, 1.5 Hz, 1H), 4.44 (d, J = 53.1 Hz, 1H), 3.64 (m, 1H), 2.82 (ddd, J = 12.3, 6.3, 2.7 Hz, 1H), 1.03 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.73 (s, 3H), 0.67 (s, 3H). EIMS: m/z (%) 362 [M]+ (8), 334(72), 305(100)。
化合物16c： 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.65 (ddd, J = 17.1, 10.2, 8.6 Hz, 1H), 4.91 (dd, J = 17.1, 1.5 Hz, 1H), 4.83 (dd, J = 10.2, 1.5 Hz, 1H), 4.50 (m, 2H), 2.79 (m, 1H), 1.03 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.76 (s, 3H), 0.68 (s, 3H). EIMS: m/z (%) 364 [M]+ (44), 336(100)。
9．化合物19的合成
先将化合物8a (203 mg, 0.5 mmol)在吡啶和甲磺酰氯的作用下制成3-位磺酰化产物，将粗品直接溶于四氯乙烯，加入氢氧化锂(1 mmol)，加热回流反应3小时，冷却后用二氯甲烷多次萃取，水洗干燥，浓缩后上柱，EA:PE = 1:10柱层析，得脱水化合物17 ( 104 mg，产率75%)；化合物17：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 5.64 (m, 1 H), 5.52 (m, 1 H), 3.62 (s, 3 H), 2.29 (m, 3 H), 2.19 (m, 2 H), 0.89 (d, J = 6.4 Hz, 3 H), 0.66 (s, 3 H), 0.63 (s, 3 H)；
0℃下，化合物17 (175 mg, 0.45 mmol)溶解在4 mL 氯仿中，加入m-CPBA (117 mg, 2 eq.)回到室温反应过夜，加入5%硫代硫酸钠溶液，搅拌十分钟。氯仿萃取，水洗，食盐水洗，干燥，浓缩，EA:PE = 1:8柱层析得化合物18 (127 mg，产率70% )；化合物18：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.66 (s, 3 H), 3.26 (m, 1 H), 3.11 (t, J = 4.5 Hz, 1 H), 0.92 (d, J = 6.4 Hz, 3 H), 0.70 (s, 3 H), 0.64 (s, 3 H). EIMS: m/z (%) 402 [M]+ (100), 329 (95)；
化合物18 (160 mg, 0.39 mmol)溶于40 mL丙酮中，再加入1.2 mL水和0.5 mL 70%高氯酸，反应体系在50℃下反应2小时，减压浓缩溶剂，残留物用EA稀释水洗，食盐水洗，干燥浓缩，EA:PE = 1:2柱层析得化合物19 (125 mg，产率75%)；化合物19：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.98 (m, 1 H), 3.92 (m, 1 H), 3.66 (s, 3 H), 2.72 (d, J = 9.1 Hz, 1 H), 0.95 (s, 3 H), 0.92 (d, J = 6.4 Hz, 3 H), 0.66 (s, 3 H). EIMS: m/z (%) 420 [M]+ (100), 347 (66)。
10. 化合物20的合成
将化合物18 (201 mg, 0.5 mmol)直接溶解于5 mL Et3·HF，加热回流3小时，反应结束后加入乙酸乙酯稀释，水洗，食盐水洗，干燥浓缩,EA:PE = 1:6柱层析得化合物20(116 mg，产率55%)；化合物20：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.70-4.55 (m, 1 H), 4.14 (m, 1 H), 3.66 (s, 3 H), 2.70 (d, J = 9.1Hz, 1 H), 0.92 (d, J = 6.4 Hz, 3 H), 0.87 (s, 3 H), 0.66 (s, 3 H). EIMS: m/z (%) 422 [M]+ (100), 349 (88)。
11. 化合物22的合成
从化合物18出发按照10a的制备方法可得白色固体化合物21；化合物21：1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.42 (d, J = 52.6 Hz, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.27 (s, 1H), 3.11 (s, 1H), 3.05 – 2.84 (m, 1H), 2.43-2.15 (m, 2H), 0.91 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 0.67 (s, 3H), 0.63 (s, 3H); EIMS m/z (%) 420 [M]+ (4), 400 [M-20]+ (36), 149 (100)；
从化合物21出发按照的制备19方法可得白色固体化合物22；化合物22：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.26 (s, 1H), 4.51 (s, 1H), 4.42 (d, J = 51.9 Hz, 2H), 4.33 (s, 1H), 3.95 (d, J = 12.2 Hz, 5H), 3.95 (d, J = 12.2 Hz, 5H), 3.66 (s, 8H), 3.34 (dd, J = 10.0, 6.6 Hz, 3H), 0.92 (d, J = 2.7 Hz, 17H), 0.65 (s, 8H)；EIMS m/z (%) 438 [M]+ (9), 418 [M-20]+ (100), 403 (25)。
12. 化合物23的合成
从化合物21出发按照20的制备方法可得白色固体化合物23；化合物23：1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.63 (d, J = 45.6 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 53.0 Hz, 1H), 4.15 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.33 (dd, J = 11.5, 5.4 Hz, 1H), 2.47-2.12 (m, 2H), 0.91 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 0.83 (s, 3H), 0.64 (s, 3H); EIMS m/z (%) 440 [M]+ (13), 420 [M-20]+ (100), 367 (33)。
13. 化合物27的合成
从化合物14a出发按照17的制备方法可得白色固体化合物24；化合物24:1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 5.79-5.48 (m, 3H), 4.85 (dd, J = 25.0, 13.6 Hz, 2H), 2.36-2.19 (m, 1H), 1.03 (d, J = 6.6, 3H), 0.70 (s, 3H), 0.69 (s, 3H)；
0℃下，化合物24 (163 mg, 1.5 mmol)溶解在5 mL 氯仿中，加入m-CPBA (70 mg, 1.0 eq.)回到室温反应过夜，加入5%硫代硫酸钠溶液，搅拌十分钟。氯仿萃取，水洗，食盐水洗，干燥，浓缩。EA:PE = 1:8柱层析得化合物25 (171 mg，产率68%)；化合物25：EIMS: m/z (%) 342 [M]+ (18), 149 (100); 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 5.64 (m, 1 H), 4.84 (m, 2 H), 3.26 (m, 1 H), 3.12 (t, J = 4.5 Hz, 1 H), 1.03 (s, 3 H), 0.68 (s, 3 H)；
从化合物25出发按照10a的制备方法可得白色固体化合物26；化合物26：1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.72-5.51 (m, 1H), 4.96-4.74 (m, 2H), 4.41 (d, J = 53.1 Hz, 1H), 3.26 (s, 1H), 3.17-3.06 (m, 1H), 2.98 (dt, J = 11.2, 5.5 Hz, 1H), 1.02 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.67 (s, 3H), 0.65 (s, 3H)；EIMS m/z (%)360 [M]+ (31), 345 [M-15]+ (19), 332 [M-28]+ (96)，303[M-57]+（100）；
从化合物26出发按照19的制备方法可得白色固体化合物27；化合物27：1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.75-5.55 (m, 1H), 4.87 (dd, J = 24.3, 13.7 Hz, 2H), 4.42 (d, J = 51.8 Hz, 1H), 3.98 (s, 1H), 3.94 (s, 1H), 3.34 (dd, J = 11.3, 5.3 Hz, 1H), 1.04 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.68 (s, 3H) ；EIMS m/z (%)378 [M]+ (6), 363 [M-15]+ (10), 350 [M-28]+ (56)，321[M-57]+（100）。
14. 化合物28的合成
从化合物26出发按照20的制备方法可得白色固体化合物28。化合物28：1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.73-5.47 (m, 1H), 4.96-4.78 (m, 2H), 4.63 (d, J = 45.5 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 51.8 Hz, 1H), 4.16 (s, 1H), 3.41-3.26 (m, 1H), 1.03 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.84 (s, 3H), 0.68 (s, 3H)。 EIMS m/z (%)380 [M]+ (4), 365 [M-15]+ (9), 352 [M-28]+ (54)，323[M-57]+（100）。
15. 化合物29-34的合成
将NaIO4 (1.5 eq., 0.3 mL/mmol)和CeCl3 . 7H2O (0.1 eq) 中加入水，搅拌，形成黄色悬浊液后，加入RuCl3 (0.05 eq.) 搅拌2分钟，0℃下将上述体系加入到化合物8a (344 mg, 1 mmol)的乙腈和乙酸乙酯的混合溶液中，搅拌几分钟后，加入饱和NaS2O3溶液淬灭反应，EA萃，水洗，无水硫酸钠干燥。EA:PE = 1:1柱层析，得化合物29(283 mg，产率76%)。化合物29：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.17 (s, 1 H), 3.80 (d, J = 9.6 Hz, 1 H), 3.65 (d, J = 10.4 Hz, 1 H), 3.51 (t, J = 10.1 Hz, 1 H), 2.71 (t, J = 7.9 Hz, 1 H), 2.53-2.24 (m, 3 H), 0.96 (d, J = 6.9 Hz, 3 H), 0.73 (s, 3 H), 0.67 (s, 3 H); EIMS: m/z (%) 378 [M]+ (30), 149 (100)；
从化合物8c出发按照29的制备方法可得白色固体化合物30。化合物30：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.84 (s, 1 H), 4.70-4.22 (m, 1 H), 3.80 (m, 1 H), 3.64 (m, 1 H), 3.51 (m, 1 H), 2.33 (dd, J = 13.1, 4.2 Hz, 1 H), 2.15-2.06 (m, 2 H), 0.95 (d, J = 6.9 Hz, 1 H), 0.77 (s, 1 H), 0.68 (s, 1 H). 19F NMR (282.3 MHz, CDCl3): δ -170.57 (d, J = 48.0 Hz, 1 H). EIMS: m/z (%) 380 [M]+ (28), 349 (100)；
从化合物15a出发按照29的制备方法可得白色固体化合物31。化合物31：1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6): d 5.55-5.54 (m, 1 H), 4.33-4.25 (m, 3 H), 3.88 (s, 1 H), 3.51-3.48 (m, 2 H), 3.32 (m, 1 H), 3.18 (m, 1 H), 1.86 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 0.82 (d, J = 6.3 Hz, 3 H), 0.59 (s, 3 H), 0.58 (s, 3 H). EIMS: m/z (%) 394 [M]+ (40), 345 (100)；
从化合物16a出发按照29的制备方法可得白色固体化合物32。化合物32：1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 4.47 (s, 0.5H), 4.41 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 4.31 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.30-4.29 (s, 0.5H), 4.27 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.91 (s, 1H), 3.56-3.46 (m, 1H), 3.41 (dd, J = 10.8, 6.1 Hz, 1H), 3.21 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.16 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 0.85 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.64 (s, 3H), 0.62 (s, 3H); EIMS m/z (%)396 [M]+ (10), 376 [M-20]+ (41), 365 [M-31]+ (24)，347[M-59]+（100）；
从化合物15c出发按照29的制备方法可得白色固体化合物33。化合物33：1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6): d 4.65-4.49 (m, 1 H), 4.27-4.21 (m, 2 H), 3.53-3.48 (m, 2 H), 3.36 (m, 1 H), 3.17 (m, 1 H), 2.92 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 0.83 (d, J = 6.3 Hz, 3 H), 0.63 (s, 3 H), 0.58 (s, 3 H). 19F NMR (282.3 MHz, CDCl3): δ -167.08 (d, J = 47.9 Hz, 1 H). ESIMS m/z 397.3 [M+H]+；
从化合物25出发按照29的制备方法可得白色固体化合物34。化合物34：1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.80 (m, 1 H), 3.63 (m, 1 H), 3.50 (m, 1 H), 3.26 (m, 1 H), 3.11 (t, J = 4.5 Hz ,1 H), 2.38-2.28 (ddd, J = 12.7, 3.0 Hz, 2 H), 0.94 (d, J = 6.9 Hz, 1 H), 0.69 (s, 1 H), 0.66 (s, 1 H). EIMS: m/z (%) 376 [M]+ (62), 345 (100)。
实施例二 受试化合物对BV-2小胶质细胞NO释放量的检测
1、受试化合物：
化合物9a，9b，9c···33，34等34个5α-6-酮-胆甾烷类似物。
化合物的配制：所有化合物均用DMSO溶解至10 mM，然后用培养液稀释至工作浓度。
2、实验方法：
取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×104个细胞/孔接种于96孔板，每孔100 μL，过夜。给药分为四组：(1).空白对照组加100 μL培养液；(2).LPS组加脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）100 ng/mL；(3).化合物对照组加20μM 受试化合物；(4).LPS+化合物组同时加入LPS 100ng/ml和受试化合物20μM。
24小时后取50 μL样品试样和50 μL Griess在96孔板中混合，25℃下孵化10 min；在分光光度计上测定570 nm下吸光度；NaNO2用作计算NO2 ˉ浓度的标准。
附图1为上述药物组与对照组细胞上清液NO释放量比较图，可以看出：(1).与空白对照组相比，LPS明显诱导小胶质细胞NO释放；(2).单独加化合物（20μM）不影响NO释放；(3).LPS组相比LPS+受试化合物(20μM)组明显抑制LPS诱导的NO释放。
实施例三 MTT检测细胞生存率
1、受试化合物：
化合物9a，9b，9c···33，34等34个5α-6-酮-胆甾烷类似物。
化合物的配制：所有化合物均用DMSO溶解至10 mM，然后用培养液稀释至工作浓度。
2、实验方法：取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×104个细胞/孔接种于96孔板，每孔100 μL，过夜。给药分为四组：(1).空白对照组加100 μL培养液；(2).LPS组加LPS 100 ng/mL；(3).化合物对照组加20μM 受试化合物；(4).LPS+化合物组同时加入LPS 100ng/ml和受试化合物20μM。
24h 后弃上清，加入MTT(0.5μg/mL)继续培养4h，用酶标仪检测570nm处吸光度值OD570，按下列公式计算抑制率(IR)：IR(%) = (1-给药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%，每组设三个复孔。
附图2为上述对照组与药物组细胞生存率的比较图，可以看出：(1).化合物8b,10a,10b,16b,22,27抑制小胶质细胞生存率，说明其有一定毒性；(2).其他化合物对小胶质细胞生存率无明显影响。
实施例四 不同剂量受试化合物对BV-2小胶质细胞NO释放量的检测
1、受试化合物：
化合物9a，9c，14c, 18, 23, 29, 30, 32等8个5α-6-酮-胆甾烷类似物。
化合物的配制：所有化合物均用DMSO溶解至10 mM，然后用培养液稀释至工作浓度。
2、实验方法与结果：
方法：取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×104个细胞/孔接种于96孔板，每孔100 μL，过夜。给药分为四组：(1).空白对照组加100 l培养液；(2).LPS组加LPS 100 ng/mL；(3).化合物对照组加受试化合物（10-40μM）；(4).LPS+化合物组同时加入LPS 100ng/ml和受试化合物（10-40μM）。
24小时后取50 μL样品试样和50 μL Griess在96孔板中混合，25℃下孵化10 min；在分光光度计上测定570 nm下吸光度；NaNO2用作计算NO2 ˉ浓度的标准。
附图3为上述不同浓度药物组与对照组细胞液NO释放量比较图，可以看出：受试化合物剂量依赖性抑制LPS刺激小胶质细胞NO分泌。
实施例五 MTT检测细胞毒性
1、受试化合物：
化合物9a，9c，14c, 18, 23, 29, 30, 32等8个5α-6-酮-胆甾烷类似物。
化合物的配制：所有化合物均用DMSO溶解至10 mM，然后用培养液稀释至工作浓度。
2、实验方法与结果：
方法：取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×104个细胞/孔接种于96孔板，每孔100 μL，过夜。给药分为四组：(1).空白对照组加100 μL培养液；(2).LPS组加LPS 100 ng/mL；(3).化合物对照组加受试化合物（10-40 μM）；(4).LPS+化合物组同时加入LPS 100ng/ml和受试化合物（10-40 μM）。
24h 后弃上清，加入MTT(0.5 μg/ml)继续培养4h，用酶标仪检测490nm处吸光度值OD490，按下列公式计算抑制率(IR)：IR(%) = (1-给药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%，每组设三个复孔。
附图4为上述不同浓度药物组与对照组细胞抑制率比较图，可以看出：受试化合物浓度为10-40 μM时，对小胶质细胞生存率无明显影响。
实施例六 RT-PCR法检测iNOS和TNF-α mRNA表达
1、受试化合物：
化合物9a用DMSO溶解至10 mM，然后用培养液稀释至工作浓度。
2、实验方法与结果：
方法：取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×104个细胞/孔接种于6孔板，每孔2ml，过夜。给药分四个组：(1).空白对照组加2ml培养液；(2).LPS组加LPS 100 ng/mL；(3).化合物9a 20μM 受试化合物；(4).LPS+化合物,加入LPS 100ng/ml和受试化合物9a 20μM。药物作用8h之后，收集细胞并加入1.0 mL TRIzol Reagent提取总RNA，用逆转录试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA，具体操作按试剂盒说明书中的建议进行。利用一氧化碳合酶 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）或β-actin的引物，PCR扩增在94℃30 s，53.5 ℃30 s，72 ℃ 1 min，重复25个循环，接着72 ℃孵化7 min。
引物的核苷酸序列为iNOS forward：CCC TTC CGA AGT TTC TGG CAG CAG C；iNOS reverse：GGC TGT CAG AGC CTC GTG GCT TTG G；TNF-Forward：CAT CTT CTC AAA ATT CGT GAC AA；TNF-α Reverse：ACT TGG GCA GAT TGA CCT CAG；β-actin Forward：ATC CTG AAA GAC CTC TAT GC；β-actin reverse：AAC GCA GCT CAG TAA CAG TC。β-actin被用作内参来评估iNOS 、TNF-α的相对表达。
附图5为上述药物组与空白组的iNOS、TNF-α mRNA表达检测结果图，可以看出：化合物9a明显抑制脂多糖诱导BV-2细胞炎症炎症相关基因iNOS和TNF-α的表达。
实施例七 Western blot法检测COX-2表达
1、受试化合物：化合物9a用DMSO溶解至10 mM，然后用培养液稀释至工作浓度。
2、实验方法：
方法：取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×104个细胞/孔接种于6孔板，每孔2mL，过夜。给药分四个组：(1).空白对照组加2mL培养液；(2).LPS组加LPS 100 ng/mL；(3).化合物9a 20μM 受试化合物；(4).LPS+化合物,加入LPS 100 ng/ml和受试化合物9a 20μM。药物作用24小时之后，细胞裂解液提取细胞总蛋白，定量后取40g样本行SDS-PAGE电泳分离，然后将蛋白转移至PVDF膜上，将膜在封闭液中封闭2小时，分别与环氧酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）以及α-tubulin的一抗4°C孵育过夜。洗膜后再与二抗室温孵育1小时；TBST室温洗膜5分钟′3次；将膜转入新鲜配制的ECL化学发光孵育液中，室温孵育5分钟；转入X光暗盒中曝光5分钟，显影，定影。α-tubulin被用作内参来评估COX-2的相对表达。
附图6为上述药物组与空白组的COX-2蛋白表达检测结果图，可以看出：化合物9a明显抑制LPS诱导炎症相关蛋白COX-2的表达。
实施例八 化合物9a 对小鼠脑缺血模型的影响
1、受试化合物：
化合物9a用DMSO溶解至10 mM，然后用培养液稀释至工作浓度。
2、实验方法：
（1）大脑中动脉栓塞模型（MCAO）制作步骤：小鼠称重，腹腔注射4%水合氯醛麻醉，做颈部正中切口，暴露右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，在颈外动脉距其始端约1 mm处做一小切口，将制备好的线栓自切口处插入颈外动脉，再经颈内动脉至大脑中动脉始端，栓塞大脑中动脉，造成局灶性脑缺血。小鼠缺血1小时后，拔出栓子，恢复脑组织供血(血流再灌注24小时后，处死动物)；假手术组小鼠只进行手术操作，不进行线栓阻断脑血流。术后于安静清洁环境中分笼饲养。手术前1小时腹腔注射不同浓度9a(7.5-120 mg/kg)。
（2）TTC染色法检测脑梗死体积：小鼠缺血再灌注24小时后，麻醉迅速断头取脑，切成2 mm脑片，置于1%TTC溶液中染色，37℃避光温浴，每隔15分钟翻面一次，共温浴30分钟。染色后用4%多聚甲醛溶液固定24小时，数码相机拍照后输入计算机，用图像分析软件（Image J）分析计算梗死体积（梗死组织呈白色，正常组织被染成红色）。
附图7为上述给药以及未给药的脑片照片以及梗死体积图，从中可以看出化合物9a能有效减少C57MCAO模型小鼠的脑缺血面积，且在有效剂量下9a未见明显的毒副反应。*p<0.05, **p<0.01，表示统计学上具有显著性差异。
附图8为上述给药以及未给药的脑梗死体积统计图，结合附图7、8可以看出：在小鼠脑缺血模型中，与模型中相比，化合物9a （30mg/kg,120mg/kg）明显抑制脑缺血面积。
Claims (4)
1.一种5α-6-酮-胆甾烷类似物，其特征在于，所述类似物具有通式(I)的结构式：
式中，R1选自-CH2CH2COOR5、
、、-CH2CH2CONHR6；其中R5、R6选自C1-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C3-C10的环烷基、苯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基或吡咯基；
R2、R3、R4选自氢、氟、溴、氯、碘、-OH、-OR7、-OCOR7、-OCO(CH2)nNH2 (n=0-6)、-OCONHR7、-OCONR8R9或-OSO2R7，其中R7为C1-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C3-C10的环烷基、苯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基或吡咯基；R8、R9选自C2-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C3-C10的环烷基、C5-C20的芳香基。
2.根据权利要求1所述的5α-6-酮-胆甾烷类似物，其特征在于：所述C5-C20的芳香基为苯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、恶唑基、吲唑基、吲哚基、喹啉基、萘基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基或苯并噻唑基。
3.权利要求1或者2 所述的5α-6-酮-胆甾烷类似物在制备治疗中枢神经系统疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的疾病为阿尔茨海默症、老年痴呆、帕金森病、中风或多发性硬化病。
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