CN105294799B - 3β‑羟基‑雄甾‑5‑烯‑17‑类二肽化合物及其制备和应用 - Google Patents

3β‑羟基‑雄甾‑5‑烯‑17‑类二肽化合物及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了3β‑羟基‑雄甾‑5‑烯‑17‑类二肽化合物及其制备和应用。所述的3β‑羟基‑雄甾‑5‑烯‑17‑类二肽化合物，其特征在于，其通式为：

Description

3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种新型医用药物，具体涉及一种3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物及其制备和作为新型神经抗炎抑制剂在治疗中枢神经系统疾病中的应用，属于医药领域。
背景技术
长期以来大脑中淋巴系统的缺如和血脑屏障的存在给人一种大脑不受免疫系统监视的错觉。近年来，大量证据表明神经炎症在许多疾病的发生和发展过程中都起主要作用。在中枢神经系统疾病中，无论是急性病变，如：外伤、中风等，还是慢性退行性病变，如：阿尔茨海默症、帕金森病、多发性硬化病等在发生和发展过程中，均有明显的炎症病变。神经变性性疾病发病与脑内炎症密切相关，炎症会激活脑内与免疫功能相关的细胞-小胶质细胞。小胶质细胞是中枢神经系统中的主要吞噬细胞，是神经炎症的主要参与者。在健康的脑中，静息状态的小胶质细胞发挥正常吞噬功能，当小胶质细胞被中度激活时，它能清除过多的神经毒素、死亡细胞及细胞碎片，维持中枢神经系统的稳态，当小胶质细胞被持续激活时，它可与单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等化学因子结合，继而与神经元结合，从而在炎症、创伤、缺血及中枢神经系统的变性疾病中发挥作用。在中枢神经系统中，任何中枢神经病理变化均可激活平时处于静止状态的小胶质细胞。当小胶质细胞在致炎因素的作用下被激活时，会发挥类似淋巴细胞的功能，产生并释放大量的炎症因子，引起神经细胞死亡，从而导致神经变性的发生。
由于中枢神经系统疾病涉及多种重要神经功能缺损，传统的研究多关注于神经元损害引起的脑功能改变，治疗上也大多采用维护和促进神经功能的药物。近几十年来，临床流行病学上，大量研究证实抗炎药物与阿尔茨海默症等中枢神经系统疾病(CNS)有密切的关系，由此抗炎药物在CNS疾病领域越来越受到重视。越来越多研究证明抑制小胶质细胞激活及炎症反应是一种有效的手段减少甚至阻止神经元的变性，从而达到改善临床症状，减慢或逆转中枢神经系统疾病的目的。虽然目前神经退行性疾病的病因还并不明确，但是通过抑制神经炎症治疗神经退行性疾病已成为一个新的有效治疗途径。因此，需要开发新型神经炎症抑制剂类药物，用于抑制小胶质细胞激活，降低或消除脑内炎症，从而有效治疗中枢神经系统疾病.
发明内容
本发明的目的是提供一种3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物，包含所述类似物的药物组合物的制备，以及该类化合物作为新型神经炎症抑制剂在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
一种3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物，其特征在于，其通式为：
式中，R1选自直链、支链或环状烷烃，苄基，苯基或其它芳香基；R2选自直链、支链或环状烷烃，苄基，苯基或其它芳香基；R3选自直链、支链或环状烷烃，苄基，苯基或其它芳香基；为单键或双键，当为双键时，X不存在，Y为-H，当为单键时，X为-H，Y为-H，直链、支链或环状烷基，-OH，-OR4，-OCOR4，-OCONHR4，或OSO2R4，其中R4为直链或支链烷基、环状烷基或芳香基。
本发明还提供了上述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物的制备方法，其特征在于，包括：将式(II)所示的酸同式(III)所示的醛、式(IV)所示的胺及式(V)所示的异腈在路易斯酸的作用下发生四组分ugi反应，得到目标产物，即如式(I)所示的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物；
式中，R1选自直链、支链或环状烷烃，苄基，苯基或其它芳香基；R2选自直链、支链或环状烷烃，苄基，苯基或其它芳香基；R3选自直链、支链或环状烷烃，苄基，苯基或其它芳香基；为单键或双键，当为双键时，X不存在，Y为H，当为单键时，X为H，Y为H，直链、支链或环状烷基，-OH，-OR4，-OCOR4，-OCONHR4，或OSO2R4，其中R4为直链或支链烷基、环状烷基或芳香基。
优选地，所述的四组分ugi反应的具体步骤为：在式(II)所示的酸的悬浮甲醇溶液中，加入1～1.2当量的式(III)所示的醛和1～1.2当量的式(IV)所示的胺及0.05～0.2当量的Sc(OTf)3，所得混合物常温搅拌，再加入1～1.2当量的式(V)所示的异腈，该反应液在常温下搅拌，直至原料酸消耗完全，减压蒸出溶剂，乙酸乙酯萃取，氢氧化钠水溶液及饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析或制备高效液相色谱分离纯化。
更优选地，所述的硅胶柱层析的洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚体系，制备高效液相色谱流动相为甲醇/水或乙腈/水体系。
优选地，所述的路易斯酸为镧系元素的三氟甲磺酸盐，氯化铝，氯化铁，三氟化硼，四氯化钛和四异丙基氧基钛中的至少一种。
更优选地，所述的镧系元素的三氟甲磺酸盐为三氟甲磺酸钪。
优选地，当式(II)中的为单键，X为-H，Y为-H时，其所示的酸的具体结构如式(VII)所示，其制备方法包括：以式(VI)所示的孕烯醇酮为起始物，在强碱条件下与次溴酸盐作用，并酸化后，得到如式(VII)所示的酸；
当式(II)中的为双键时，所述的其所示的酸的具体结构如式(IX)所示，其制备方法包括：以式(VIII)所示的妊娠双烯醇酮为起始物，在强碱条件下与次溴酸盐作用，并酸化后，得到如式(IX)所示的酸；
当式(II)中的为单键，X为-H，Y为直链、支链或环状烷基，-OH，-OR4，-OCOR4，-OCONHR4，或OSO2R4时，其所示的酸的具体结构如式(XI)所示，其制备方法包括：以式(VIII)所示的妊娠双烯醇酮为起始物，先发生Micheal加成，在C-16位引入基团，得到如式(X)所示的酮后，再转化得到式(XI)所示的酸；
更优选地，所述的强碱为氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种，所述的次溴酸盐为次溴酸钠和次溴酸钾中的至少一种；所述的酸化采用盐酸，硫酸和柠檬酸中的至少一种。
更优选地，当式(II)中的为单键，X为-H，Y为-H时，其所示的酸的具体结构如式(VII)所示，其制备方法为：冰浴下，孕烯醇酮的1，4-二氧六环和水溶液中，加入次溴酸钠溶液，整个过程中，保持反应体系温度为8-10℃当反应变为无色后，继续搅拌1-3小时，然后加入亚硫酸钠溶液淬灭反应，再将该混合物加热回流10-30分钟，冷却至85-95℃时，用稀盐酸酸化到PH为5.5-6.5，冷却到常温，静置，过滤，水洗，干燥，所得白色固体即为所需产物。
更优选地，当式(II)中的为双键时，所述的其所示的酸的具体结构如式(IX)所示，其制备方法为：冰浴下，妊娠双烯醇酮的1，4-二氧六环和水溶液中，加入次溴酸钠溶液，整个过程中，保持反应体系温度为8-10℃，当反应变为无色后，继续搅拌1-3小时，然后加入亚硫酸钠溶液淬灭反应，再将该混合物加热回流10-30分钟，冷却至85-95℃时，用稀盐酸酸化到PH为5.5-6.5，冷却到常温，静置，过滤，水洗，干燥，所得白色固体即为所需产物。
更优选地，当式(II)中的为单键，X为-H，Y为-CH3时，其所示的酸的具体结构如式(XI)所示，其制备方法为：妊娠双烯醇酮常温下溶解在1，4-二氧六环中，加入CuBr，氩气保护下搅拌10-30分钟，加入三甲基铝的甲苯溶液，继续搅拌20-40分钟，加入水和1，4-二氧六环的混合溶液淬灭反应，过滤，1，4-二氧六环洗涤，溶液浓缩，过柱纯化，即得式(X)所示的酮；冰浴下，式(X)所示的酮的1，4-二氧六环和水溶液中，加入次溴酸钠溶液，整个过程中，保持反应体系温度为8-10℃，当反应变为无色后，继续搅拌1-3小时，然后加入亚硫酸钠溶液淬灭反应，再将该混合物加热回流10-30分钟，冷却至85-95℃时，用稀盐酸酸化到PH为5.5-6.5，冷却到常温，静置，过滤，水洗，干燥，所得白色固体即为所需产物。
本发明还提供了上述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用。
优选地，所述的中枢神经系统疾病为外伤、中风、阿尔茨海默症、帕金森病和多发性硬化病中的至少一种。
本发明还提供了一种治疗中枢神经系统疾病药物，其特征在于，由上述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物组成或含有上述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物和至少一种载体。
优选地，所述的治疗中枢神经系统疾病药物的剂型为溶剂、稀释剂、片剂、胶囊、可分散粉末或颗粒剂。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。
本发明公开了一种3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物及其制备和应用。所述化合物治疗中枢神经系统相关疾病的作用与其可作为新型甾体类神经炎症抑制剂有关。所述化合物体外剂量依赖性的抑制相关炎症因子的产生，体内能够有效减少动物体内脑缺血面积，且无明显毒副作用，在中枢神经系统疾病治疗药物的制备中具有良好的应用前景。本发明的制备流程如图1所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明所述化合物具有治疗中枢神经系统疾病的作用，而且其治疗作用与抑制小胶质细胞活化而引起的神经炎症相关，显示了这类化合物作为新型治疗中枢神经系统疾病药物的良好前景。
2.本发明以四组分的ugi反应一步法制备的结构多样性的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物对激活小胶质细胞的诱导的炎症反应均表现出不同程度的抑制作用，大多无明显细胞毒性，体外剂量依赖型抑制炎症因子的产生，体内能够有效减少脑缺血面积。
附图说明
图1为本发明的制备流程图；
图2为化合物18b对LPS-诱导的BV-2、HAPI及原代小胶质细胞或IFN-γ-诱导的原代星形胶质细胞NO释放量有剂量依赖性的抑制作用图
图3为药物组18b与空白组的iNOS、TNF-α、COX-2、IL-6mRNA表达检测结果图。
图4为上述药物组18b与空白组的iNOS、TNF-α、COX-2、IL-6及PGE-2蛋白表达检测结果图；
图5为高活性化合物18b对小鼠脑缺血模型的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本发明实施例中给出的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物，其通式为：
式中，各字母含义如表1所示。
表1：
所述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物的合成通用方法：
将式(II)所示的酸同式(III)所示的醛、式(IV)所示的胺及式(V)所示的异腈在路易斯酸的作用下发生四组分ugi反应，得到目标产物，即如式(I)所示的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物；式中，各字母含义如表1所示。
所述的四组分ugi反应的具体步骤为：在式(II)所示的酸(0.1mmol)的悬浮甲醇(1mL)溶液中，加入1.1当量的式(III)所示的醛和1.1当量的式(IV)所示的胺及0.1当量的Sc(OTf)3，所得混合物常温搅拌15分钟后，再加入1.1当量的式(V)所示的异腈。该反应液在常温下搅拌，直至原料酸消耗完全。减压蒸出溶剂，乙酸乙酯萃取，用重量浓度为5％的氢氧化钠水溶液及饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化(洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚体系)。
当式(II)中的为单键，X为-H，Y为-H时，其所示的酸的具体结构如式(VII)所示，其制备方法为：以式(VI)所示的孕烯醇酮为起始物，在强碱条件下与次溴酸盐作用，并酸化后，得到如式(VII)所示的酸；具体为：-5℃下，氢氧化钠(7.3g，182.5mmol)的水溶液(63ml)中，搅拌下加入Br2(7.5g，45mmol)，并且滴加的过程中保持温度低于零度。然后用冷的1，4-二氧六环(42ml)稀释，所得次溴酸钠溶液置于冰水浴中待用。冰浴下，孕烯醇酮(5g，15.8mmol)的1，4-二氧六环(191ml)和水溶液(55ml)中，缓慢加入上述的次溴酸钠溶液，整个过程中，保持反应体系温度为8-10℃当反应变为无色后，继续搅拌2小时。然后加入20ml重量浓度为10％的亚硫酸钠溶液淬灭反应。再将该混合物加热回流15分钟，冷却至90℃时，用稀盐酸酸化到PH为6，冷却到常温，静置24小时。过滤，水洗，干燥，所得白色固体即为所需产物。
当式(II)中的为双键时，所述的其所示的酸的具体结构如式(IX)所示，其制备方法为：以式(VIII)所示的妊娠双烯醇酮为起始物，在强碱条件下与次溴酸盐作用，并酸化后，得到如式(IX)所示的酸；具体步骤为：-5℃下，氢氧化钠(7.3g，182.5mmol)的水溶液(63ml)中，搅拌下加入Br2(7.5g，45mmol)，并且滴加的过程中保持温度低于零度。然后用冷的1，4-二氧六环(42ml)稀释，所得次溴酸钠溶液置于冰水浴中待用。冰浴下，妊娠双烯醇酮(5g，15.9mmol)的1，4-二氧六环(191ml)和水溶液(55ml)中，缓慢加入上述的次溴酸钠溶液，整个过程中，保持反应体系温度为8-10℃，当反应变为无色后，继续搅拌2小时。然后加入20ml重量浓度为10％的亚硫酸钠溶液淬灭反应。再将该混合物加热回流15分钟，冷却至90℃时，用稀盐酸酸化到pH为6，冷却到常温，静置24小时。过滤，水洗，干燥，所得白色固体即为所需产物。
当式(II)中的为单键，X为-H，Y为-CH3时，其所示的酸的具体结构如式(XI)所示，其制备方法为：以式(VIII)所示的妊娠双烯醇酮为起始物，先发生Micheal加成，在C-16位引入基团，得到如式(X)所示的酮后，再转化为式(XI)所示的酸。具体步骤为：妊娠双烯醇酮(3g，9.6mmol)常温下溶解在20ml的1，4-二氧六环中，加入CuBr(144mg，1.0mmol)，氩气保护下搅拌15分钟，加入重量浓度为10％的三甲基铝的甲苯溶液(9.4ml，11mmol)，继续搅拌半小时。加入6ml水和1，4-二氧六环的混合溶液(水和1，4-二氧六环的体积比为1∶5)淬灭反应。过滤，1，4-二氧六环洗涤，溶液浓缩，乙酸乙酯/石油醚体系过柱纯化，即得式(X)所示的酮。-5℃下，氢氧化钠(1.5g，37.5mmol)的水溶液(13ml)中，搅拌下加入Br2(2.5g，9mmol)，并且滴加的过程中保持温度低于零度。然后用冷的1，4-二氧六环(9ml)稀释，所得次溴酸钠溶液置于冰水浴中待用。冰浴下，式(X)所示的酮(1g，3mmol)的1，4-二氧六环(36ml)和水溶液(10ml)中，缓慢加入上述的次溴酸钠溶液，整个过程中，保持反应体系温度为8-10℃，当反应变为无色后，继续搅拌2小时。然后加入4ml重量浓度为10％的亚硫酸钠溶液淬灭反应。再将该混合物加热回流15分钟，冷却至90℃时，用稀盐酸酸化到pH为6，冷却到常温，静置24小时。过滤，水洗，干燥，所得白色固体即为所需产物。
上述方法合成的各化合物的核磁和质谱数据如下，其中1H-NMR和13C-NMR用VarianMercury plus-400或BrukerAM-400型核磁共振仪测定；MS用Agilent6110型质谱仪测定。
化合物9a-18b的结构和谱图数据：
1.化合物9a的结构和谱图数据
1H NMR(400MHz，Acetone-D6)δ6.75(s，1H)，5.81(s，1H)，5.35(d，J＝4.9Hz，1H)，4.44(d，J＝10.8Hz，1H)，3.70(d，J＝4.5Hz，1H)，3.46-3.34(m，1H)，2.97(s，3H)，1.32(s，9H)，1.06(s，6H)，0.95(d，J＝6.4Hz，3H)，0.81(d，J＝6.4Hz，3H)；13C NMR(126MHz，Acetone-D6)δ205.51，205.36，205.20，169.29，169.04，148.87，141.84，130.30，120.41，70.78，70.66，62.53，56.71，50.78，50.44，48.54，42.47，37.26，36.67，34.49，32.17，31.97，31.63，31.41，30.27，27.98，25.32，20.54，19.09，18.85，18.01，16.24.MS(EI，m/z)＝484(M+)；HRMS(EI)：calculated for C30H48N2O3：484.3665，found：484.3659.
2.化合物9b的结构和谱图数据
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.26(s，1H)，5.87(s，1H)，5.38(s，1H)，4.42(d，J＝10.6Hz，1H)，3.62-3.43(m，1H)，2.96(s，3H)，1.30(s，9H)，1.12(s，3H)，1.05(s，3H)，0.97(d，J＝6.1Hz，3H)，0.86(d，J＝6.4Hz，3H)；13C NMR(126MHz，)δ170.87，169.22，148.50，141.23，132.58，121.16，71.65，62.70，56.63，50.97，50.54，48.70，42.28，37.21，36.75，34.07，32.78，32.42，31.59，30.20，28.68，25.19，20.65，19.84，19.35，18.54，16.71；MS(EI，m/z)＝484(M+)；HRMS(EI)：calculated for C30H48N2O3：484.3665，found：484.3668.
3.化合物10a的结构和谱图数据
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.03(s，1H)，5.35(d，J＝5.0Hz，1H)，4.52(d，J＝10.9Hz，1H)，3.59-3.45(m，1H)，2.99(s，3H)，2.73(t，J＝8.8Hz，1H)，2.35-2.13(m，5H)，1.30(s，9H)，1.01(s，3H)，0.94(d，J＝6.4Hz，3H)，0.78(s，3H)，0.77(d，J＝6.6Hz，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ174.73，169.59，140.69，121.29，71.57，56.54，51.32，50.87，49.91，45.54，42.12，39.32，37.15，36.44，31.91，31.79，31.49，28.59，25.91，25.00，24.73，20.88，19.65，19.31，18.35，14.04；MS(ESI，m/z)＝509.5[M+23]+；HRMS(ESI)：calculated for C30H50N2O3Na：509.3719，found：509.3709.
4.化合物10b的结构和谱图数据
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.15(s，1H)，5.35(d，J＝5.2Hz，1H)，4.42(d，J＝10.7Hz，1H)，3.58-3.46(m，1H)，2.98(s，3H)，2.77(t，J＝8.9Hz，1H)，2.37-2.15(m，5H)，1.28(s，10H)，1.00(s，3H)，0.95(d，J＝6.4Hz，3H)，0.84(d，J＝6.6Hz，3H)，0.72(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ175.07，169.57，140.66，121.32，71.57，56.63，51.46，50.88，49.97，45.35，42.14，38.93，37.17，36.44，31.90，31.77，31.51，28.57，25.33，25.29，24.67，21.00，19.67，19.29，18.83，13.68；MS(ESI，m/z)＝509.5[M+23]+；HRMS(ESI)：calculated for C30H50N2O3Na：509.3719，found：509.3706.
5.化合物11a的结构和谱图数据
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.40-7.09(m，6H)，5.32(s，1H)，4.95(d，J＝17.9Hz，1H)，4.64(d，J＝18.5Hz，1H)，4.22(s，1H)，3.49(s，1H)，2.63(t，J＝9.0Hz，1H)，2.34-2.11(m，3H)，1.30(s，9H)，1.00(s，4H)，0.90(d，J＝6.4Hz，3H)，0.86(s，3H)，0.71(d，J＝6.0Hz，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ176.54，170.21，140.77，138.03，128.55，127.20，126.39，121.37，71.64，56.40，52.58，51.00，49.92，45.73，42.21，38.92，37.23，36.54，31.90，31.81，31.58，28.64，27.06，26.70，24.80，20.86，19.93，19.86，19.40，14.19；MS(EI，m/z)＝562(M+)；HRMS(EI)：calculated for C36H54N2O3：562.4134，found：562.4131.
6.化合物11b的结构和谱图数据
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.32-7.13(m，3H)，7.05(d，J＝7.6Hz，2H)，6.28(s，1H)，5.31(s，1H)，4.73(dd，J＝54.3，17.3Hz，2H)，4.47(s，1H)，3.50(s，1H)，2.53(t，J＝8.9Hz，1H)，1.20(s，9H)，1.00(s，3H)，0.94(d，J＝6.3Hz，3H)，0.88(d，J＝6.3Hz，3H)，0.77(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ176.31，169.05，140.69，138.24，128.44，126.89，125.92，121.45，71.68，56.51，52.83，51.14，49.96，45.70，42.23，39.16，37.27，36.54，31.93，31.79，31.61，28.54，26.99，26.36，24.73，21.10，19.74，19.39，19.17，14.07；MS(EI，m/z)＝562(M+)；HRMS(EI)：calculated for C36H54N2O3：562.4134，found：562.4142.
7.化合物12a的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.29-7.06(m，5H)，6.29(s，1H)，5.40(dd，J＝11.0，5.6Hz，1H)，5.34-5.27(m，1H)，3.60-3.40(m，1H)，3.17(dd，J＝15.1，5.7Hz，1H)，2.87(s，3H)，2.58(t，J＝8.8Hz，1H)，2.34-2.09(m，3H)，1.29(s，10H)，0.97(s，3H)，0.37(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ175.28，169.94，140.78，137.43，129.09，128.51，126.41，121.38，71.70，57.80，56.69，51.48，50.98，50.01，45.15，42.23，37.75，37.22，36.48，33.52，31.97，31.86，31.59，31.39，28.71，25.04，24.65，20.73，19.36，12.98；MS(EI，m/z)＝534(M+)；HRMS(EI)：calculated for C34H50N2O3：534.3821，found：534.3825.
8.化合物12b的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.32-7.11(m，5H)，6.03(s，1H)，5.47-5.21(m，2H)，3.59-3.40(m，1H)，3.28(dd，J＝14.5，8.1Hz，1H)，2.96(s，3H)，2.89(dd，J＝14.1，9.3Hz，1H)，2.60(t，J＝9.3Hz，1H)，2.37-1.92(m，4H)，1.28(s，9H)，1.01(s，3H)，0.78(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ174.72，169.62，140.75，137.51，128.95，128.36，126.41，121.42，71.69，57.10，56.64，51.30，51.01，50.03，45.51，42.23，39.44，37.26，36.54，33.37，31.98，31.88，31.60，30.96，28.68，25.94，24.76，21.01，19.42，14.17；MS(EI，m/z)＝534(M+)；HRMS(EI)：calculated for C34H50N2O3：534.3821，found：534.3827.
9.化合物13a的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.41-7.27(m，5H)，6.14(s，1H)，5.71(s，1H)，5.35(d，J＝5.0Hz，1H)，3.58-3.44(m，1H)，2.90(s，3H)，2.82(t，J＝8.7Hz，1H)，1.36(s，9H)，1.01(s，3H)，0.78(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ174.62，169.34，140.70，136.26，128.98，128.76，127.99，121.53，71.71，61.25，56.65，51.62，51.43，50.08，45.60，42.26，39.15，37.27，36.55，33.45，32.05，31.90，31.62，29.73，28.71，26.93，25.49，24.80，21.14，19.41，14.05；MS(EI，m/z)＝520(M+)；HRMS(EI)：calculated for C33H48N2O3：520.3665，found：520.3669.
10.化合物13b的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.42-7.28(m，6H)，6.24(s，1H)，5.66(s，1H)，5.35(d，J＝5.4Hz，1H)，3.60-3.43(m，1H)，2.89(s，3H)，2.78(t，J＝9.0Hz，1H)，1.36(s，11H)，1.02(s，3H)，0.79(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ174.55，169.24，140.85，135.61，129.39，128.65，128.03，121.43，71.73，60.91，56.73，51.52，50.08，45.80，42.26，39.29，37.29，36.58，32.88，32.06，31.94，31.63，29.73，28.67，26.93，25.74，24.89，21.14，19.42，13.88；MS(EI，m/z)＝520(M+)；HRMS(EI)：calculatedfor C33H48N2O3：520.3665，found：520.3661.
11.化合物14a的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.09(s，1H)，5.34(s，1H)，4.53(d，J＝11.1Hz，1H)，3.63-3.41(m，1H)，2.97(s，3H)，2.83-2.60(m，1H)，1.29(s，9H)，1.00(s，3H)，0.93(d，J＝6.6Hz，6H)，0.82(s，3H)，0.77(d，J＝6.5Hz，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ174.11，169.27，140.39，120.90，71.17，60.65，55.02，50.50，49.69，46.45，41.77，39.02，36.80，36.13，34.38，32.94，31.38，31.13，28.26，24.52，21.24，20.39，19.26，18.96，17.91，14.31；MS(EI，m/z)＝500(M+)；HRMS(EI)：calculated forC31H52N2O3：500.3978，found：500.3973.
12.化合物14b的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.20(s，1H)，5.35(s，1H)，4.48(d，J＝11.1Hz，1H)，3.69-3.39(m，1H)，2.95(s，3H)，2.89-2.66(m，1H)，2.35(d，J＝8.9Hz，1H)，1.27(s，9H)，0.99(s，3H)，0.96(d，J＝4.2Hz，3H)，0.93(d，J＝4.7Hz，3H)，0.81(d，J＝6.6Hz，3H)，0.76(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ174.40，169.16，140.35，120.96，71.22，60.74，55.10，50.44，49.75，46.31，41.80，38.53，36.81，36.13，33.69，32.77，31.41，31.34，31.16，28.25，24.66，21.32，20.49，19.35，18.94，18.33，13.86；MS(EI，m/z)＝500(M+)；HRMS(EI)：calculated for C31H52N2O3：500.3978，found：500.3977.
13.化合物15a的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.12(s，1H)，5.75(s，1H)，5.35(d，J＝3.7Hz，1H)，4.51(d，J＝10.6Hz，1H)，3.58-3.42(m，1H)，2.94(s，3H)，1.30(s，9H)，1.04(s，6H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ170.03，168.57，148.32，140.74，130.00，120.68，71.17，56.37，50.68，50.08，48.46，41.80，36.71，36.27，33.99，33.74，31.89，31.13，31.10，29.82，29.59，28.24，28.14，25.91，25.23，25.17，20.25，18.87，16.34；MS(EI，m/z)＝524(M+)；HRMS(EI)：calculated for C33H52N2O3：524.3978，found：524.3970.
14.化合物15b的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.29(s，1H)，5.84(d，J＝1.5Hz，1H)，5.35(d，J＝4.8Hz，1H)，4.50(d，J＝11.2Hz，1H)，3.59-3.42(m，1H)，2.94(s，3H)，1.28(s，9H)，1.09(s，3H)，1.04(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ170.37，168.63，148.04，140.75，131.93，120.67，71.16，56.15，50.53，50.07，48.23，41.79，36.73，36.27，33.84，33.59，32.41，31.93，31.11，29.73，29.69，28.36，28.21，25.97，25.22，25.17，20.18，18.87，16.24；MS(EI，m/z)＝524(M+)；HRMS(EI)：calculated for C33H52N2O3：524.3978，found：524.3980.
15.化合物16a的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.12-6.97(m，3H)，5.82(s，1H)，5.37(d，J＝5.3Hz，1H)，3.61-3.40(m，1H)，3.05(s，3H)，2.19(s，6H)，1.09(d，J＝6.4Hz，3H)，1.06(s，3H)，1.05(s，3H)，0.92(d，J＝6.6Hz，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ170.88，168.09，148.83，141.18，135.17，133.65，131.30，128.14，127.27，121.19，71.70，56.91，50.50，49.00，42.26，37.17，36.74，34.49，32.44，31.61，31.57，30.32，29.74，25.06，20.75，19.78，19.37，18.55，18.47，16.84；MS(EI，m/z)＝532(M+)；HRMS(EI)：calculated for C34H48N2O3：532.3665，found：532.3663.
16.化合物16b的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.84(s，1H)，7.13-6.97(m，3H)，6.00(s，1H)，5.37(d，J＝4.5Hz，1H)，4.69(d，J＝11.2Hz，1H)，3.62-3.45(m，1H)，3.06(s，3H)，2.17(s，6H)，1.13(s，3H)，1.08(d，J＝6.5Hz，3H)，1.05(s，3H)，0.95(d，J＝6.6Hz，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ171.10，168.18，148.35，141.22，135.27，134.88，133.73，128.08，127.21，121.17，71.70，56.50，50.47，48.46，42.26，37.18，36.74，34.36，32.51，31.61，31.58，30.19，29.73，25.45，20.67，19.88，19.36，18.58，16.74，0.04；MS(EI，m/z)＝532(M+)；HRMS(EI)：calculated for C34H48N2O3：532.3665，found：532.3660.
17.化合物17a的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.42-7.28(m，5H)，6.16(s，1H)，5.81(s，1H)，5.35(d，J＝5.2Hz，1H)，3.57-3.44(m，1H)，2.91(s，3H)，2.42(d，J＝8.5Hz，1H)，1.35(s，9H)，1.01(s，3H)，1.00(d，J＝6.6Hz，3H)，0.84(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ174.48，169.00，140.72，135.98，128.86，128.68，127.87，121.51，71.70，61.20，60.98，55.49，51.51，50.17，46.94，42.25，39.09，37.23，36.58，34.29，33.50，33.35，31.87，31.81，31.60，28.68，21.95，20.95，19.42，14.54；MS(EI，m/z)＝534(M+)；HRMS(EI)：calculated for C34H50N2O3：534.3821，found：534.3829.
18.化合物17b的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.40-7.29(m，5H)，6.27(s，1H)，5.73(s，1H)，5.35(d，J＝5.1Hz，1H)，3.59-3.45(m，1H)，2.89(s，3H)，2.37(d，J＝8.8Hz，1H)，1.36(s，9H)，1.01(s，3H)，0.97(d，J＝6.9Hz，3H)，0.84(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ174.30，169.14，140.83，135.68，129.14，128.67，127.96，121.44，71.73，61.10，60.82，55.46，51.52，50.16，47.13，42.24，39.31，37.25，36.60，34.41，33.49，33.00，31.86，31.61，28.68，22.05，20.95，19.43，14.51；MS(EI，m/z)＝534(M+)；HRMS(EI)：calculated for C34H50N2O3：534.3821，found：534.3817.
19.化合物18a的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.32-7.08(m，5H)，6.21(s，1H)，5.57(s，1H)，5.37-5.25(m，2H)，3.58-3.45(m，1H)，3.24(dd，J＝14.5，5.4Hz，1H)，3.05(dd，J＝15.7，11.7Hz，5H)，2.88(s，3H)，2.36-2.16(m，3H)，1.31(s，9H)，1.02(s，3H)，0.94(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ170.48，169.37，148.40，141.17，137.28，130.83，128.93，128.46，126.47，121.17，71.68，57.23，56.73，51.12，50.44，48.77，42.25，37.16，36.70，34.13，33.13，33.01，32.28，31.58，31.54，30.26，28.71，20.62，19.32，16.74；MS(EI，m/z)＝532(M+)；HRMS(EI)：calculated for C34H48N2O3：532.3665，found：532.3668.
20.化合物18b的结构和谱图数据
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.34-7.09(m，5H)，6.36(s，1H)，5.48(s，1H)，5.40-5.26(m，2H)，3.59-3.43(m，1H)，3.25(dd，J＝15.1，6.4Hz，1H)，3.01(dd，J＝15.0，10.1Hz，1H)，2.87(s，3H)，2.35-2.12(m，3H)，1.30(s，9H)，1.03(s，3H)，1.02(s，3H)；13C NMR(126MHz，CDCl3)δ171.10，169.49，148.07，141.16，137.42，132.91，128.79，128.46，126.46，121.17，71.67，56.62，56.44，51.02，50.52，48.56，42.26，37.19，36.74，34.01，32.87，32.36，31.59，31.55，30.13，28.70，20.61，19.35，16.58；MS(EI，m/z)＝532(M+)；HRMS(EI)：calculated for C34H48N2O3：532.3665，found：532.3661；
实施例2
受试化合物对LPS-诱导BV-2小胶质细胞NO释放量的抑制作用：
1.受试化合物9a-18b共20个3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物。所有化合物均用DMSO溶解至10mM，然后用含10％FBS、1％青霉素的DMEM培养液(5％CO2)稀释至工作浓度。
2.实验方法：
(1)取对数增长期BV-2细胞(上海市肿瘤研究所)用含10％FBS、1％青霉素的DMEM培养液(5％CO2)制成悬液，以2×105个细胞/孔接种于96孔板，每孔100μL过夜。给药分为四组：(1)空白对照组：只加100μL培养液；(2)脂多糖组：加脂多糖100ng/ml；(3)化合物对照组：加20μM受试化合物；(4)脂多糖组加化合物组：同时加入脂多糖100ng/ml和受试化合物20μM。
(2)MTT检测细胞生存率
给药24小时后弃上清，加入MTT(0.5μg/mL)继续培养4小时，用酶标仪检测570nM处吸光度值OD570，以脂多糖组作为对照，按下列公式计算脂多糖组加化合物组的抑制率(IR)：IR(％)＝(1-给药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100％，每组设三个复孔。
3.实验结果
本发明中给出的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物9a-18b对20μMLPS-诱导BV-2小胶质细胞NO释放量的抑制作用见下表：
Comp. ％of inhibition ％of cell viability
9a 31.77 83.54±2.84
9b 72.26 88.14±3.30
10a 52.86 97.41±1.04
10b 20.31 99.22±1.35
11a 56.51 77.10±4.8
11b 45.57 13.62±1.57
12a 10.42 74.12±1.55
12b 80.47 60.71±4.86
13a 15.09 104.53±1.76
13b 63.75 94.31±4.75
14a 73.48 78.90±2.62
14b 45.99 90.76±5.16
15a 77.86 71.40±3.0
15b 68.86 92.06±3.71
16a 77.88 36.06±3.17
16b 74.24 89.50±4.66
17a 28.18 96.69±4.00
17b 83.33 93.60±3.07
18a 87.58 92.05±3.37
18b 89.39 96.33±5.88
实施例3
选择高效低毒化合物测定LPS-诱导BV-2小胶质细胞NO释放量的IC50
1.受试化合物：化合物9b、10a、12b、13b、14a、15a、15b、18a、18b共9个3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物。
2.化合物的配制：所有化合物均用DMSO溶解至10mM，然后用含10％FBS、1％青霉素的DMEM培养液(5％CO2)稀释至工作浓度。
3.实验方法：
取对数增长期BV-2细胞用含10％FBS、1％青霉素的DMEM培养液(5％CO2)制成悬液，以2×105个细胞/孔接种于96孔板，每孔100μL过夜。给药分为四组：(1)空白对照组：只加100μL培养液；(2)脂多糖组：加脂多糖100ng/ml；(3)化合物对照组：加受试化合物20μM；(4)脂多糖组加化合物组：同时加入脂多糖100ng/ml和受试化合物2.5、5、10、20、40μM。
24小时后取50μL样品试样和50μL Griess试剂在96孔板中混合，25℃下孵化10分钟，在分光光度计上测定570nm下吸光度；NaNO2用为计算NO2 -浓度的标准。
4.实验结果
本发明中给出的9b、10a、12b、13b、14a、15a、15b、18a、18b对LPS-诱导BV-2小胶质细胞NO释放量的IC50(由软件Graphpad Prism 5.0计算所得)见下表：
化合物 IC50(μM) 化合物 IC50(μM)
9b 21.398±1.330 15a 14.181±1.152
10a 12.428±1.094 15b 17.411±1.241
12b 17.265±1.237 18a 14.255±1.154
13b 16.189±1.209 18b 8.546±0.932
14a 12.844±1.109
实施例4
选择高活性化合物测定LPS或IFN-γ-诱导BV-2、HAPI、原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞对NO释放量的抑制作用：
1.受试化合物18b，检测浓度2.5、5、10μM三个浓度梯度；
2.实验方法：分别取对数增长期BV-2细胞、HAPI细胞及原代小胶质细胞和IFN-γ(1000IU/ml)诱导的原代星形胶质细胞(所有原代细胞均由上海肿瘤研究所的(ICR)提供的新生小鼠(1-2天)脑皮层细胞按照常规方法培养而来。用含10％FBS、1％青霉素的DMEM培养液(5％CO2)制成悬液，以2×105个细胞/孔接种于96孔板，每孔100μL过夜。给药分为四组：(1)空白组：只加100μL培养液；(2)脂多糖组：加脂多糖100ng/ml；(3)脂多糖组加化合物组：同时加入脂多糖100ng/ml和受试化合物2.5、5、10μM。
给药24小时后取50μL样品试样和50μL Griess试剂在96孔板中混合，25℃下孵化10分钟，在分光光度计上测定570nm下吸光度；NaNO2用为计算NO2-浓度的标准。
3.实验结果：如图2所示。化合物18b对LPS-诱导的BV-2、HAPI及原代小胶质细胞或IFN-γ-诱导的原代星形胶质细胞NO释放量有剂量依赖性的抑制作用。
实施例5
检测高活性化合物在mRNA水平对LPS-诱导的BV-2细胞中炎症因子iNOS、TNF-α、COX-2、IL-6的抑制作用：
1.受试化合物18b，检测浓度2.5、5、10μM三个浓度梯度；
2.实验方法：
取对数增长期BV-2细胞用含10％FBS、1％青霉素的DMEM培养液(5％CO2)配制成悬液，以2×105个细胞/孔接种于6孔板，每孔2ml过夜。给药分为三组：(1)空白组：只加2ml培养液；(2)化合物对照组：加受试化合物18b 10μM；(3)脂多糖组：加脂多糖100ng/ml；(4)脂多糖组加化合物组：同时加入脂多糖100ng/ml和受试化合物18b2.5、5、10μM。
药物作用8小时后，收集细胞并加入1.0ml TRIzol Reagent提取总RNA，用逆转录试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA，具体操作按试剂盒说明书中的建议进行。利用一氧化碳合酶，肿瘤坏死因子或GAPDH的引物，PCR扩增在94℃30秒，53.5℃30秒，72℃1分钟，重复25个循环，接着72℃孵化7分钟。
引物的核苷酸序列为GAPDH forward，TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA；GAPDHreverse，TTG CTG TTG AAG TCG CAG GAG；TNF-α forward，CAG GAG GGA GAA CAG AAA CTCCA；TNF-α reverse，CCT GGT TGG CTG CTT GCT T；IL-6 forward，TTC CAT CCA GTT GCCTTC TT；IL-6 reverse)CAG AAT TGC CAT TGC ACA AC；iNOS forward，TAG GCA GAG ATTGGA GGC CTT G；iNOS reverse，GGG TTG TTG CTG AAC TTC CAG TC；COX-2 forward，CAGGCT GAA CTT CGA AAC A；COX-2 reverse，GCT CAC GAG GCC ACT GAT ACC TA。GAPDH被用作内参来评估iNOS、TNF-α、COX-2、IL-6的相对表达。
3.实验结果：如图3所示，为上述药物组18b与空白组的iNOS、TNF-α、COX-2、IL-6mRNA表达检测结果图，可以看出化合物18b明显抑制脂多糖诱导BV-2相关细胞炎症因子的表达。
实施例6
检测高活性化合物在蛋白水平对LPS-诱导的BV-2细胞中炎症因子iNOS、TNF-α、COX-2、IL-6和PGE-2的抑制作用：
1.受试化合物18b，检测浓度2.5、5、10μM三个浓度梯度
2.实验方法
取对数增长期BV-2细胞用含10％FBS、1％青霉素的DMEM培养液(5％CO2)配制成悬液，以2×105个细胞/孔接种于6孔板，每孔2ml过夜。给药分为四组：(1)空白组：只加2ml培养液；(2)化合物对照组：加受试化合物18b 10μM；(3)脂多糖组：加脂多糖100ng/ml；(4)脂多糖组加化合物组：同时加入脂多糖100ng/ml和受试化合物18b2.5、5、10μM。
药物作用24小时后，细胞裂解液提取细胞总蛋白，定量后取40克样本进行SDS-PAGE电泳分离，然后将蛋白转移至PVDF膜上，将膜在封闭液中封闭2小时，然后用单抗(Abcam，cambrige，MA)在4℃下孵育过夜。洗膜后再与二抗(CellSignaling Technology，Beverly，MA或者Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)室温孵育1小时。
3.实验结果：如图4所示，为上述药物组18b与空白组的iNOS、TNF-α、COX-2、IL-6及PGE-2表达检测结果，可以看出化合物18b明显抑制脂多糖诱导BV-2相关细胞炎症因子的表达。
实施例7
检测高活性化合物对小鼠脑缺血模型的影响
1.受试化合物18b用DMSO溶解至10mM，然后用含10％FBS、1％青霉素的DMEM培养液(5％CO2)稀释至工作浓度。
2.实验方法：
(1)取对数增长期BV-2细胞以2×105个细胞/孔接种于6孔板，并以空白对照或化合物18b(给药分为4组详见下面的叙述)预处理30分钟。然后用LPS(0.1μg/ml)刺激细胞24小时后，分别收获各培养基，加入含有HT-22细胞(上海肿瘤细胞所，5×107/孔)的24孔板中，继续培养36小时。
给药分为四组：(1)空白组：只加2ml培养液；(2)化合物对照组：加受试化合物18b10μM；(3)脂多糖组：加脂多糖100ng/ml；(4)脂多糖组加化合物组：同时加入脂多糖100ng/ml和受试化合物18b 2.5、5、10μM。
给药36小时后弃上清，加入MTT(0.5μg/mL)继续培养4小时，用酶标仪检测570nM处吸光度值OD570，按下列公式计算细胞存活率(CV)：CV(％)＝(1-给药孔平均OD值/空白对照孔平均OD值)×100％，每组设三个复孔。
(2)大脑中动脉栓塞模型(MCAO)制作步骤：小鼠称重，腹腔注射4％水合氯醛麻醉，做颈部正中切口，暴露右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，在颈外动脉距其始端约1mm处做一小切口，制备好的线栓自切口处插入颈外动脉，再经颈内动脉至大脑中动脉始端，栓塞大脑中动脉，造成局灶性脑缺血。小鼠缺血1小时后，拨出栓子，恢复脑组织供血(血流再灌注24小时后，处死动物)；假手术组小鼠只进行手术操作，不进行线栓阻断脑血流。术后于安静清洁环境中分笼饲养。手术前一小时腹腔注射不同浓度18b(20-40mg/kg)。
(3)TTC染色法检测脑梗死体积：小鼠缺血后再灌注24小时后，麻醉迅速断头取脑，切成2mm脑片，置于1％TTC溶液中染色，37℃避光温浴，每隔15分钟翻面一次，共温浴30分钟。染色后用4％多聚甲醛溶液固定24小时，拍照后输入计算机，用图像分析软件(Image J)分析计算梗死面积(梗死组织呈白色，正常组织被染成红色)。
3.实验结果：如图5A所示，化合物18b有一定的神经保护作用。如图5B和5C所示，为上述药物组18b与空白组照片以及梗死体积图，[CTX(cortex)皮层CP(caudate-putamen)纹状体或尾壳核，HMSPH：(hemisphere)缺血面积占大脑半球的百分比，Corrected校正)，可以看出药物组可以剂量依赖性较少C57MCAO模型小鼠的脑缺血面积，且在有效剂量下未见明显的毒副反应。

Claims (10)

1.一种3β‐羟基‐雄甾‐5‐烯‐17‐类二肽化合物，其特征在于，其结构式为：
2.权利要求1所述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物的制备方法，其特征在于，包括：将式(II)所示的酸同式(III)所示的醛、式(IV)所示的胺及式(V)所示的异腈在路易斯酸的作用下发生四组分ugi反应，得到目标产物，即如式(I)所示的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物；
其中，所述的式(I)所示的3β‐羟基‐雄甾‐5‐烯‐17‐类二肽化合物的结构为：
3.如权利要求2所述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物的制备方法，其特征在于，所述的路易斯酸为镧系元素的三氟甲磺酸盐，氯化铝，氯化铁，三氟化硼，四氯化钛和四异丙基氧基钛中的至少一种。
4.如权利要求3所述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物的制备方法，其特征在于，所述的镧系元素的三氟甲磺酸盐为三氟甲磺酸钪。
5.如权利要求3所述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物的制备方法，其特征在于，当式(II)中的为单键，X为-H，Y为-H时，其所示的酸的具体结构如式(VII)所示，其制备方法包括：以式(VI)所示的孕烯醇酮为起始物，在强碱条件下与次溴酸盐作用，并酸化后，得到如式(VII)所示的酸；
当式(II)中的为双键时，所述的其所示的酸的具体结构如式(Ⅸ)所示，其制备方法包括：以式(VIII)所示的妊娠双烯醇酮为起始物，在强碱条件下与次溴酸盐作用，并酸化后，得到如式(Ⅸ)所示的酸；
所述的强碱为氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种。
6.如权利要求5所述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物的制备方法，其特征在于，所述的强碱为氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种，所述的次溴酸盐为次溴酸钠和次溴酸钾中的至少一种；所述的酸化采用盐酸，硫酸和柠檬酸中的至少一种。
7.权利要求1所述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用。
8.如权利要求7所述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用，其特征在于，所述的中枢神经系统疾病为外伤、中风、阿尔茨海默症、帕金森病和多发性硬化病中的至少一种。
9.一种治疗中枢神经系统疾病药物，其特征在于，由权利要求1所述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物组成或含有权利要求1所述的3β-羟基-雄甾-5-烯-17-类二肽化合物和至少一种载体。
10.如权利要求9所述的治疗中枢神经系统疾病药物，其特征在于，其剂型为溶剂、稀释剂、片剂、胶囊、可分散粉末或颗粒剂。
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