CN1222851A

CN1222851A - 7α－取代的类固醇用于治疗神经精神病、免疫或内分泌疾病的用途

Info

Publication number: CN1222851A
Application number: CN 97195384
Authority: CN
Inventors: R·拉特; K·A·罗瑟; J·R·瑟克尔; R·贝斯特; J·K·W·尧; C·M·勒基
Original assignee: British Technology Group Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1996-04-09
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 1999-07-14

Abstract

本发明提供了具有胆固醇、雄酮、孕烯醇酮或雌二醇的碳骨架的7α－羟基或7－氧取代的3β－羟基－类固醇或其以酯或醚基分别在7－和3－位的一个位置或两个位置上取代的类似物在制备用于治疗神经精神病、免疫和/或内分泌疾病或者用于诱导认知增强的药物组合物中的用途。本发明还提供了Cyp7b酶在生产上述类固醇中的用途以及用于诊断上述疾病的多种新的类固醇、测试试剂盒与方法。

Description

7α-取代的类固醇用于治疗神经精神病、免疫或内分泌疾病的用途

本发明涉及7α-羟基-取代的类固醇的新用途、用于制备上述类固醇的方法以及如此生产的新的类固醇。

具体地讲，本发明涉及命名为Cyp7b的细胞色素P450家族的细胞色素用于影响某些3β-OH类固醇的7α-羟基化作用从而生产出7α-羟基-取代的类固醇的用途。某些如此生产的7α-羟基-取代的类固醇以及相应的7-氧代衍生物是新的并且构成了本发明的另一方面。本发明还涉及这些类固醇的用途，Cyp7b酶的用途以及在生物学上与Cyp7b酶有关的新的大分子物质、例如抗体和DNA的用途。

细胞色素P450为一组各异的催化多种氧化转化的含有血红素的单加氧酶(命名为CYP’s；参见Nelson等人，《DNA细胞生物学》(1993)12,1-51)，其中尤其是催化类固醇以及脂肪酸和异生素的氧化。当CYP’s在睾丸、卵巢、胎盘、肾上腺和肝脏中最大量地表达的同时，日益显见大脑为CYP表达的另一个场所。已经报道了在神经系统中的几种CYP活性或mRNA’s，但它们以代谢脂肪酸和异生素的类型为主(亚类CYP2C,2D,2E和4)。但是，来自大鼠大脑的原代神经胶质细胞具有在体外合成孕烯醇酮和孕酮的能力。Mellon和Deschepper在《大脑研究》(1993),629,283-292(9)中为主要的类固醇生成酶CYP11A1(scc)和CYP11B1(11β)在大脑中的存在提供了分子证据，但却没有检测到CYP17(c17)或CYP11B2(AS)。尽管报道了在大脑中存在CYP21A1(c21)的活性，但在该组织中却没有检测出真正的CYP21A1的转录物。

通过发现来自肾上腺和大脑的类固醇(神经类固醇)可以调节认知功能和突触可塑性，人们已对类固醇在大脑中的代谢越发地感兴趣。例如，据报道来自大脑中的孕烯醇酮和类固醇对小鼠具有增强记忆的效果。但是尚未确立在大脑中代谢CYP’s的类固醇的全谱及其体内代谢物的生物学作用。

大脑功能的许多方面都受到类固醇的调节。糖皮质激素(皮质醇，皮质酮)的胞内受体在海马(1)中尤其进行了大量的表达，其中所说的海马为在特异的记忆形成方面起到关键作用的大脑区域并且为在阿尔茨海默氏病(AD)中针对功能异常和损伤的早期和突出的目标。在糖皮质激素调节学习和记忆、情绪和神经内分泌控制的同时，慢性糖皮质激素过剩(尤其是海马中)会损害神经元的活性、突触可塑性并且最终将危及其生存。这些发现提示出糖皮质激素介导的神经毒性可以巩固包括AD在内的一些与年龄有关的大脑疾病，其中血浆皮质醇的含量显著升高(2)。

相反地，已经提出脱氢表雄酮(DHEA)、即人肾上腺皮质的最丰富的类固醇产物可以预防老化的大脑的疾病(3)。DHEA的血浆含量通常显示出明显的与年龄有关的降低，而这与认知功能的丧失有关(4)。在啮齿类动物中，向边缘结构中注射DHEA或其硫酸盐提高了训练后的记忆并且增强了突触的可塑性(5)。因而，DHEA和糖皮质激素似乎对记忆功能和突触可塑性起到了相反的作用，并且已经把DHEA推崇为内源的“抗-糖皮质激素”。但是，尽管有大量详尽的证据来支持这一论点，但仍没有在神经元中的DHEA和糖皮质激素的信号途径之间直接发生相互作用的证据。

已经报道了在分离出的大鼠视网膜(8)和大脑(9)中神经类固醇的生成作用。除了从胆固醇生成孕烯醇酮和DHEA之外，在大脑的提取物或培养的大脑细胞中还制得了多种新的类固醇，其中包括20α-脱氢孕烯醇酮、孕烯醇酮和DHEA的7α-羟基衍生物、孕酮以及3α-和3β-羟基-5α-孕烷(pregnan)-20-酮(在参考文献7中进行了评述)。雄激素也得以修饰，特别是通过aromatase和5α-还原酶的作用进行的修饰(在参考文献10中进行了评述)。但是，仍然没有很好地描述引起上述以及在中枢神经系统中的其它转化的具体酶的特性。

就以上而论，在中枢神经系统中存在几种Cyps(11-22)。除Cyp19(aromatase)之外，还检测出对应于主要的类固醇生成酶的活性或mRNAs(23-25)。而且已经报道了在中枢神经系统中编码非-Cyp羟基类固醇脱氢酶(HSD)3α-HSD、3β-HSD和11β-HSD的mRNAs(25,27-29)。

为了研究大脑功能的调节作用，在共同未决的申请号为PCT/GB95/02465、公开号为WO96/12810的国际专利申请以及Stapleton等人(《生物化学杂志》270,29739-1995,1995年12月15日)中报道的研究集中于海马、即在学习和记忆中重要的大脑区域。国际专利申请PCT/GB95/02465的说明书的副本已经随提交的本说明书的优先权文本提交。

该共同未决的申请PCT/GB95/02465描述并要求保护了命名为Hct-1的新的细胞色素P450蛋白。这些Hct-1蛋白现已由标准化细胞色素P450命名法委员会命名为Cyp7b，并且在本申请中将使用名称Cyp7b。

Cyp7b酶与肝的胆固醇7α-羟化酶(Cyp7a)之间存在39％的序列同一性，但却与其它的类固醇生成的Cyps之间存在较小然而明显的同源性。在这些酶的许多酶中发现的假定的类固醇生成域(30,31)既存在于Cyp7a中，又存在于Cyp7b中。Cyp7b mRNA主要在啮齿类动物的大脑中表达，特别是在海马中表达，这与对肝脏具有特异性的Cyp7a有所不同(31-33与EP0648840A2)。

本发明人现已研究了Cyp7b的底物特异性并且发现Cyp7b催化在类固醇底物、特别是3β-羟基类固醇中7α位置上羟基的引入。因此，细胞色素Cyp7b为具有7α-特异性的类固醇羟化酶。生产7α-羟基化类固醇的能力主要在商业上很重要，这是因为这些类固醇在生产药物(或者本身用作药物或者作为中间体)、在生产测试试剂盒以及用于与存在异常水平的内源酶、底物或产物有关的病理状况的测定中特别有用。

在本文中使用缩写词“DHEA”来表示脱氢表雄酮，因而7α-羟基-DHEA表示7α-羟基脱氢表雄酮。

本发明人已经鉴定了与Cyp7b有关的底物/产物对，其中特别是DHEA/7α-羟基-DHEA(7-HD)、孕烯醇酮/7α-羟基-孕烯醇酮(7-HP)与β-雌二醇/7α-羟基-β-雌二醇(7-HE)。他们也已经测定出DHEA在大脑组织中的浓度随年龄下降，而其它的大脑类固醇的浓度却没有下降，并且测定出老化过程可能与某些类固醇的不足有关并且也与Cyp7b自身浓度的不足有关。还可以确信的是由Cyp7b介导的反应所生产的一种产物、即7α-羟基脱氢表雄酮在免疫系统的操作中起到了重要的作用。因为人们认为7α-羟基-DHEA基本上仅在大脑中产生，所以本发明人假设衰老可能是由于大脑产生的7α-羟基-DHEA以及在大脑中发现的其它类固醇(如DHEA、孕烯醇酮和7α-羟基-孕烯醇酮)的不足造成的。

目前，本发明人还进一步测定出由本发明提供的7α-羟基-取代的类固醇及其潜在的7-氧取代的类固醇衍生物的一种特殊的性质，即在受体水平或其他水平上上述物质对糖皮质激素和/或盐皮质激素的拮抗作用。这种性质尤其通过以下涉及7α-羟基-DHEA的实施例5来说明，但可以更普遍地得以应用。因此，这种活性不仅给本发明新的类固醇提供了更多的用途，而且为可以通过本方法制得的已知的7α-羟基或7-氧类固醇提供第一和第二医药用途，这些类固醇可以作为糖皮质激素和/或盐皮质激素的拮抗剂并且优选用于对诸如在CNS中的神经元组织具有特异性的拮抗作用中。

因此，考虑到上述活性及其与内源的代谢途径有关、尤其是在大脑中，通过利用Cyp7b酶的活性生成的7α-羟基取代的3β-羟基-类固醇(包括由本发明生成的新的化合物)及其7-氧衍生物在治疗神经精神病、免疫和内分泌疾病、特别是治疗不排除与类固醇有关的疾病方面具有实用性。

在本发明的第一方面提供了这些7α-羟基或7-氧取代的3β-羟基-类固醇在治疗上述疾病以及用于制备用于上述治疗的药物中的用途，其中优选具有胆固醇、雄酮、孕烯醇酮或雌二醇的碳骨架的上述类固醇或其以酯或醚基分别在7-和3-位的一个位置或两个位置上取代的衍生物。特别优选的衍生物为那些其中的酯和/或醚基的一个或两个基团在体内可以代谢以生产出相应的羟基化合物的衍生物。

优选的衍生物包括那些在所说的类固醇中具有3β-取代基-OR₁和/或7α-取代基-OR₂，其中-OR₁与-OR₂各自分别表示游离的羟基、酯基或醚基，其中R₁和R₂各自分别选自由氢、取代的或者未取代的C_1-6烷基、基团R₅CO-组成的组中，其中R₅可以选自取代的或者未取代的C_1-6烷基和通式-OP(OH)₃的基团，其中任意的取代基选自OH、卤代(F,Cl,Br,I)氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6二烷基氨基、COOH或COOR₄，其中R₄表示C_1-6烷基；并且其中所说的化合物可以呈游离的形式或者呈含有药理学可接受的阴离子的酸式加成盐的形式。

本发明提供的针对上述实用性的具体的疾病包括：

(a)衰老过程中认知的缺损

(b)阿尔茨海默氏病

(c)衰老过程中免疫系统的缺损

(d)在HIV感染中免疫功能的缺损

(e)糖皮质激素或者盐皮质激素过剩

(f)糖尿病

(g)抑郁症

(h)骨质疏松症与高钙血症

(i)高血糖症与高脂血症

(j)肌肉萎缩

(k)动脉硬化

(l)类固醇糖尿病

此外，这些7α-羟基类固醇、其酯、醚以及7-氧衍生物可以用来诱导在正常个体中认知的增强。

针对上述用途的优选的类固醇具有雄酮、孕烯醇酮或雌二醇的碳骨架，并且特别优选的实例为7α-羟基-DHEA和7α-羟基孕烯醇酮。因此，本发明进一步提供了以下所示的通式Ⅰa和Ⅰb的新化合物在上述应用中的用途。

对这些7-取代的类固醇的拮抗特性来说，特别优选的用途包括治疗属于以上类别之列的疾病或者无论上述类皮质激素是否过剩都需要有对这些类皮质激素的作用产生相反作用的治疗。

本发明的第二方面提供了实现上述用途的药物组合物。对本领域的普通技术人员来说易于想到其中将会使用本发明的新的类固醇以及已知的类固醇的组合物，其中通常包括与药物可接受的载体或稀释剂结合的活性的类固醇，该组合物的制剂例如适于吸入或者适于肠胃的(例如口服)、肠胃外的、局部的、经皮肤的或者经粘膜的给药。

作为把本发明的化合物自身进行给药的可供选择的方法，本发明的第三方面提供了在基因治疗中使用Cyp7b基因的基因序列以便弥补Cyp7b酶不足的可能性。在这种治疗中，把含有Cyp7b编码序列的构建体包装在常规的送递系统(如腺病毒、痘苗病毒、疱疹病毒和脂质体)中，并且通过能造成优先地靶向所选择的组织(尤其是大脑)的途径进行给药。本发明进一步提供了在基因治疗中使用Cyp7b基因的基因序列以便为了其它目的(例如为了促进免疫原性的过程)来实现Cyp7b序列内源表达的可能性。因此，例如可以把载体、诸如一种经过适当的修饰的痘苗病毒(或其变体)与疫苗制剂共同给药以便使所表达的Cyp7b序列增强上述疫苗的免疫原性的特性。

应当了解的是，在除了那些涉及Cyp7b耗竭之外的与Cyp7b有关的疾病的情况下，人们仍然可以寄希望于使用含有Cyp7b有效的反义序列的载体以抑制Cyp7b的表达。

在免疫方面与Cyp7b酶有关的大分子构成本发明的第四和第五方面，并且就抗体而论，特别是能够选择性地结合Cyp7b的单克隆抗体在诊断上述(a)至(l)的疾病中具有实用性。抗-Cyp7b的抗体(包括单克隆抗体)以及含有抗体片段的结合分子可以通过已知的方法生产并且可以用于对Cyp7b酶进行测定的测试试剂盒中。

根据本发明的第六方面，本发明提供了一种生产7α-羟基-取代的类固醇的方法，该方法包括在有Cyp7b类固醇羟化酶存在的情况下使在7-位上没有羟基取代基的相应的类固醇底物进行羟基化。

在本发明的方法中使用的Cyp7b类固醇羟化酶优选为在上述提到的国际专利申请PCT/GB95/02465中描述并要求保护的Cyp7b酶(在该文中称为Hct-1)。所说的酶包括(a)具有对小鼠、大鼠和人的Cyp7b所述的精确的氨基酸序列的酶，(b)来自其它物种的同源酶，以及(c)具有不同于在(a)和(b)的定义中所包括的酶的序列的氨基酸序列、但却没有消除催化引入7α-羟基的能力的酶。

根据在国际专利申请PCT/GB95/02465中公开的DNA编码序列可以确定出合适的Cyp7b类固醇羟化酶的氨基酸序列。因此，Cyp7b类固醇羟化酶可以具有由选自下列序列的Cyp7b酶的DNA编码序列所编码的序列：

(a)包含在SEQ Id No:1中所示的大鼠Cyp7b的编码序列的DNA分子的编码序列，

(b)包含在SEQ Id No:2中所示的小鼠Cyp7b的编码序列的DNA分子的编码序列，

(c)在如2×SSC、65℃所定义的标准的杂交条件下，能够与在(a)或(b)中定义的DNA分子杂交的编码Cyp7b类固醇羟化酶的DNA分子，

(d)在如6×SSC、55℃所定义的降低了严紧性的杂交条件下，能够与在(a)、(b)或(c)中定义的DNA分子杂交的编码Cyp7b类固醇羟化酶的DNA分子。

以上的序列(a)和(b)表示大鼠和小鼠的Hct-1基因序列。来自其它脊椎动物物种、特别是来自哺乳动物物种(包括人)的同源序列属于由(c)或(d)表示的DNA分子的类别之列。

因此对人的Cyp7b而言，类固醇羟化酶可以包括由下列序列编码的序列

(e)选自下列序列的DNA编码序列：

(ⅰ)在SEQ Id No 3中命名为“外显子3”的序列，

(ⅱ)在SEQ Id No 3中命名为“外显子4”的序列，以及

(f)在如2×SSC、65℃所定义的标准的杂交条件下，能够与在(e)中定义的DNA分子杂交的编码Cyp7b类固醇羟化酶的DNA分子，

(g)在如6×SSC、55℃所定义的降低了严紧性的杂交条件下，能够与在(e)或(f)中定义的DNA分子杂交的编码Cyp7b类固醇羟化酶的DNA分子，

(h)包括选自下列序列的序列连续碱基对的编码Cyp7b类固醇羟化酶的DNA分子，

(ⅰ)在SEQ Id No 3中命名为“外显子3”的序列，

(ⅱ)在SEQ Id No 3中命名为“外显子4”的序列，以及

(i)在如2×SSC、65℃所定义的标准的杂交条件下，能够与在(h)中定义的DNA分子杂交的编码Cyp7b类固醇羟化酶的DNA分子，

(j)在如6×SSC、55℃所定义的降低了严紧性的杂交条件下，能够与在(h)或(i)中定义的DNA分子杂交的编码Cyp7b类固醇羟化酶的DNA分子，

(k)包括由SEQ Id No 3中的序列“外显子3”和“外显子4”组成的连续编码序列的DNA分子的编码序列，以及

(l)在如2×SSC、65℃所定义的标准的杂交条件下，能够与在(k)中定义的DNA分子杂交的编码Cyp7b类固醇羟化酶的DNA分子，

(m)在如6×SSC、55℃所定义的降低了严紧性的杂交条件下，能够与在(k)或(l)中定义的DNA分子杂交的编码Cyp7b类固醇羟化酶的DNA分子。

应当理解的是所说的DNA序列可以由基因组DNA组成或者来源于基因组DNA，但它们通常是由cDNA组成或者来源于cDNA的。这些序列可以在根据国际专利申请PCT/GB95/02465的发明所提供的序列的基础上使用杂交探针探查合适的文库(cDNA或基因组)来获得，或者可以通过化学合成或者通过连接子序列来制备。

在上述定义中，已经根据DNA序列信息定义了Cyp7b类固醇羟化酶。参照氨基酸序列信息(例如在SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6中所含的氨基酸序列)可以用另一种方法或者额外地定义在本发明的方法中使用的Cyp7b类固醇羟化酶。

因此，在本发明的方法中使用的Cyp7b类固醇羟化酶可以具有与所说的序列之一精确匹配的序列，或者在另一方面，所用的酶可以具有不同于前述序列的序列，但只要该序列没有消除催化引入7α-羟基的能力即可。

因此，例如可以通过已知的方法生产出突变的酶，比如定向位点的诱变或者其它以PCR为基础的方法，并且根据本文所述的方法测试表达产物在所选择的底物中催化引入7α-羟基的能力。

考虑到在大鼠、小鼠和人的酶之间同源性的程度以及与羟化酶的物种分散(divergence)有关的已知的数据，通过与SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3的DNA序列相比，所说的突变酶优选应当由在50个连续的核苷酸长度的范围内与所说的序列之间具有至少50％的同源性的序列，其中更优选至少有60％的同源性并且最优选至少有70％的同源性编码。

突变酶优选由与完整的编码序列之间至少具有60％的同源性，更优选至少有70％的同源性的序列编码。

另一方面，通过与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的氨基酸序列相比，所说的突变酶优选应当在30个连续的氨基酸长度的范围内与所说的序列之间具有至少50％的同源性，其中更优选至少有60％的同源性并且最优选至少有70％的同源性。在所有情况下，突变酶优选与完整的氨基酸序列之间具有至少60％的同源性，并且更优选具有70％或者更高的同源性。

但是，上述突变酶优选与前述序列的差别不太明显，并且就氨基酸被取代的这一点而言，被取代的氨基酸优选为所谓的“同义的”或者“保守的”取代，即亲水的、疏水的、碱性的和酸性的氨基酸应当优选由同一类别中的氨基酸来取代(参见US5380712)。

更具体地讲，所说的突变酶优选与本文中所述的那些酶的精确序列的不同之处在于不超过20个、优选不超过10个并且最优选不超过5个氨基酸的取代、插入或者缺失。

本文所述的Cyp7b酶可以用于毒性和药物评价的研究中并且这种用途构成了本发明的另一方面。在本发明的这一方面的一个特别优选的实例中，能够表达Cyp7b酶的细胞系用作测定一种或多种Cyp7b底物的基准。这些细胞系在毒性和药物评价的研究中具有实用性。最优选的细胞系包括已经进行了人工转化以表达Cyp7b酶的原核或者真核的细胞系。实例包括细菌、酵母和哺乳动物的细胞。此外还包括转基因动物，其中至少有一个组织(尤其是一个非脑的组织)表达Cyp7b酶。这些转基因动物可以通过已知的方法把外源编码序列引入体细胞系或者生殖细胞系来生产。

在本发明的方法中所用的底物的特征在于具有3β-羟基基团并且更优选具有胆固醇、雄酮、孕烯醇酮或者雌二醇的碳骨架，但条件是当底物具有胆固醇的碳骨架时，该底物在25、26或27-位上有一个羟基基团，其中优选在25-位上有一个羟基。

这些底物的实例包括25-羟基胆固醇、脱氢表雄酮、孕烯醇酮和雌二醇，在这种情况下生成的类固醇分别为7α-羟基-25-羟基胆固醇、7α-羟基脱氢表雄酮、7α-羟基孕烯醇酮与7α-羟基雌二醇(即雌1,3,5(10)-三烯-3,7α,17β-三醇)。

可以通过已知的酶的或者非酶的方法来氧化根据本发明生产的7α-羟基化的类固醇以生产出7-氧代取代的类固醇，并且这种进一步的方法步骤构成了本发明的另一方面。

某些根据本发明生产的7α-羟基-取代的类固醇以及某些相应的7-氧代衍生物是新的并且提供了本发明的另一方面。因此，本发明进一步提供了特征在于具有7α-羟基或者7-氧代取代基的新的3β-羟基类固醇。优选的新的类固醇具有胆固醇、雄酮、孕烯醇酮或者雌二醇的碳骨架，但条件是当所说的骨架为胆固醇的骨架时，25、26或者27位进行了羟基化，最优选是在25位进行了羟基化。

具体的新的类固醇的通式为

其中OR₁,OR₂和OR₃各自分别表示游离的羟基、醚基或酯化的羟基。

在当OR₁,OR₂和OR₃各自分别表示醚基的情况下，每个R₁,R₂和R₃可以选自取代的或者未取代的C_1-6烷基，任意的上述取代基选自OH、卤代(F,Cl,Br,I)氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6二烷基氨基、COOH或COOR₄，其中R₄表示不被上述的取代基之一取代的或者被所说的取代基取代的C_1-6烷基。

在当OR₁,OR₂和OR₃各自分别表示酯化的羟基的情况下，每个R₁,R₂和R₃可以具有通式R₅CO-，其中R₅可以选自取代的或者未取代的C_1-6烷基，任意的上述取代基选自OH、卤代(F,Cl,Br,I)氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6二烷基氨基、COOH或COOR₄，其中R₄表示C_1-6烷基；以及通式-OP(OH)₃的基团。当通式Ⅰa或Ⅰb的化合物包括如羧基、phospate基团等的取代基或者取代的或未取代的氨基时，该化合物可以呈游离的形式或者呈含有药理学可接受的阴离子(例如磷酸盐或卤化物的离子)或阳离子(例如碱金属阳离子)的酸式加成盐的形式。因此，当OR₁,OR₂或OR₃表示血红素琥珀酸根HOOC(CH₂)₂CO时，得到的琥珀酸盐例如可以是Na或K盐的形式。

应当了解的是本发明提供了如上所述的7α-羟基化的和7-氧代的类固醇，但是它们可以在类固醇的骨架上的其它位置处进一步直接被取代。

7α-羟基雌二醇和7-氧代雌二醇为通式Ⅰa和Ⅰb的化合物的具体的实例。

现在具体地参照以下的附图和实施例更为详细地描述本发明。

附图的描述

图1说明了在评价不同的细胞提取物对DHEA进行羟基化的能力的实验中所用的TLC板的放射自显影图。

图2描述了不同的组织从7-³H-孕烯醇酮中释放放射性的能力。

图3说明了由Cyp7b介导的基本的类固醇的相互转换。

图4为描绘出如实施例5所述的萤光素酶表达的诱导倍数与不同的类固醇浓度之间的直方图。

图5说明了如实施例5所述的在阿尔茨海默氏病中Cyp7b基因表达的减少。

图6显示出由本发明的方法生产的7α-羟基-DHEA及其参照样品的质谱图。

实施例1-鉴定Mu Cyp7b的底物特异性

A．制备痘苗表达构建体

为了鉴定由Cyp7b催化的反应，修饰由Lathe,Rose和Stapleton(PCT/GB95/02465)以及由Stapleton等人(《生物化学杂志》270,29739-1995,1995年12月15日)报道的编码小鼠的酶的cDNA，从而在如上述文献中所述的Cyp7b开放读框的5’末端引入翻译起始的共有序列。如Lathe等人所述，根据标准的方法(例如参见Gonzalez等人，Meth.Enzymol.206,85-92,1991以及该文献中的参考文献)通过重组交换把经过修饰的cDNA引入痘苗病毒的基因组中。

B．生产Cyp7b酶的提取物

把Hela细胞培育至半汇合(每5cm的平皿有10⁶个细胞；5ml培养基)并用重组的(VV-Cyp7b)和对照的(VV哥本哈根菌株)痘苗病毒以0.1pfu/细胞来侵染该细胞；16小时后，洗涤被侵染的细胞并将其溶入W(Waxman)缓冲溶液(0.1M KPO₄,1mM EDTA,20％甘油pH7.5；500μl/平板)中并且再次离心(5分钟，1000rpm)。

为了制备完整的细胞提取物，将细胞重新悬浮于1/100体积(50μl/平板)的W缓冲溶液中并且在-70℃下冷冻储藏。为了制备微粒体(Waxman，《生物化学杂志》260,81-85,1989)，把细胞重新悬浮于1/10的最初体积的W缓冲溶液(500μl/平板)中；在冰上以6×5秒进行超声处理，并且通过离心(10分钟，4℃,3000rpm)除去没有破碎的细胞。

通过离心(100,000g,45分钟，4℃,Beckman SW50.1转子)从上清液中制备微粒体部分，并且在-70℃下储藏之前使用Potter匀浆器将该部分重新悬浮在1/50的最初体积的W缓冲溶液(100μl/平板)中。

通过在W缓冲溶液(2.5ml/g)中对新鲜的组织进行匀浆并且通过离心(4000rpm,5分钟，4℃)进行简单的净化从雄性大鼠的肝脏和大脑中制备出对照提取物；在-70℃下储存上清液。

C．通过薄层层析鉴定底物

从DuPont-NEN购买¹⁴C或³H-标记的类固醇(¹⁴C-标记的分子：比活性为45-60mCi/mmol；³H：比活性为70-100mCi/mmol)。把标记底物的1nMol的等分试样彻底干燥，加入微粒体或者细胞和组织的提取物(25至50μl)并用W缓冲溶液将其稀释至体积为175μl。

通过加入25μl的8mM NADPH来起始反应。在37℃下培养15分钟后，用500μl的乙酸乙酯(BDH)来振荡反应物。分离出有机相，将其彻底干燥并且悬浮到10μl的乙酸乙酯中。把等分试样(5×2μl)加到薄层层析(TLC)板(Merck)上并且在乙酸乙酯/正己烷/乙酸16∶8∶1(Waxman的溶剂系统N,Meth.Enzymol.206,462-476,1991)中展开。在干燥后，通过在X-射线胶片上曝光可以看到¹⁴C的层析谱。在曝光前用EN³ HANCETM(DuPont-NEN)喷洒来处理³H-标记的层析谱。

D．结果

图1为在溶剂系统N中展开的TLC板的放射自显影图；底物为³H-DHEA，并且在把样品加入到TLC板(位于图底部的起点处)之前用乙酸乙酯提取样品并进行了干燥。提取物为：1，来自由对照的痘苗病毒侵染的Hela细胞的微粒体(负对照)；2，来自由VVCyp7b侵染的Hela细胞的微粒体；3，来自由VVCyp7b侵染的Hela细胞的微粒体的复制的配制品；4，大鼠大脑的匀浆物。

正如可以从图1中看到的那样，来自由表达Cyp7b的重组痘苗侵染的细胞的微粒将¹⁴C-脱氢表雄酮(DHEA)转化至较低的迁移率，这与羟基化作用极其相符。大脑的提取物生成了在迁移率方面无法区分的产物，运与我们在早些时候说明的Cyp7b在大脑中表达是一致的。从上述产物的相对迁移率，我们推测出Cyp7b可以在7位使DHEA进行羟基化。不管以任何方式，孕酮、皮质酮、皮质醇和睾酮都是最不能有效地代谢的。但是，孕烯醇酮和雌二醇都能象25-羟基胆固醇那样由酶来转化。所有这些底物的区别在于3β羟基。

实施例2-通过³H-释放鉴定修饰的位置

为了鉴定修饰的位置使用³H-孕烯醇酮(NEN)，其中³H的取代主要位于类固醇主链的7位上。在与以前采用的相同的条件下用³H-孕烯醇酮培养微粒体的提取物。在反应过后，用乙酸乙酯(2×1ml)提取标记的类固醇，并且弃去；通过液体闪烁计数来检测释放到水相中的³H。

参照图2，用提取物培养7-³H-孕烯醇酮并且在用乙酸乙酯提取后测定释放到水相中的放射性。提取物为：1，来自由对照的痘苗病毒侵染的Hela细胞的微粒体(阴性对照)；2，来自由VVCyp7b侵染的Hela细胞的微粒体；3，来自由VVCyp7b侵染的Hela细胞的微粒体的一式两份的制品；4，大鼠大脑的匀浆物；5，大鼠肝脏的匀浆物。

正如可以从图2中看到的那样，来自由表达Cyp7b的重组痘苗侵染的细胞的微粒体有效地把³H释放到水相中。大脑也进行了这种反应，但肝脏却没有进行该反应。从孕烯醇酮的7位释放³H说明了Cyp7b在7-位上使孕烯醇酮进行羟基化以生成7-羟基孕烯醇酮(7HP)；可以得到的结论是Cyp7b也使DHEA进行羟基化(以生成7-羟基DHEA[7HD])并使雌二醇生成7-羟基雌二醇[7HE]。

实施例3-Cyp7b羟基化作用的立体化学

在不同的位置上(例如2,6,7,15,16)发生羟基化的类固醇其TLC迁移率不同，而这取决于所说的修饰是在α-位上还是在β-位上(Waxman,Meth.Enzymol.206,462-476,1991)。获得了纯化的7α-羟基DHEA(由威斯康星大学酶学院的H.A.Lardy博士友好相赠的礼物)，将其与Cyp7b作用于DHEA的产物混合并且进行TLC。该产物与7α-羟基-DHEA一同迁移，这说明Cyp7b为7α羟化酶。

实施例4-在孕烯醇酮和DHEA的7α-羟基化作用中酶的活性

为了测定Cyp7b酶的催化活性，在哺乳动物的细胞系中表达cDNAs。细胞提取物显示出DHEA(Km 13.3μM；V_max288pmol/min/mg)和孕烯醇酮(Km3.6μM；V_max34pmol/min/mg)转化为在薄层层析上较慢的迁移形式，其中的转化基本上是NADPH依赖的。由大鼠大脑的提取物生成了具有相同的迁移率的产物。所表达的酶对25-羟基胆固醇、17β-雌二醇和5α-雄烷-3β,17β-二醇的活性较差，而对孕酮、皮质酮和睾酮的活性低到难于检测。当用Cyp7b提取物培养[³H-7α]孕烯醇酮时，释放到培养基中的放射性的程度暗示着羟基化作用优先在7α-位上发生。在由以Cyp7b提取物培养DHEA产生的修饰的类固醇的气相层析和质谱中，所说的类固醇的保留时间和断裂型式与由标准的7α-羟基DHEA(7HD)得到的结果相同；在TLC上，其反应产物也与7HD一同迁移。

质谱：使用95％的未标记的DHEA(Sigma)和5％的[14C]-DHEA(最终的比活性为2.25-3mCi/mmol)进行按比例增加了10倍的反应，并且将反应时间延长至1小时。通过TLC纯化产物，切去该产物并在彻底干燥前用乙酸乙酯进行提取。把干燥后的残余物和标准的7HD(50mg)转化为其甲肟-三甲基甲硅烷基(MO-TMS)的衍生物。在下列条件下，使用在电子碰撞(EI)模式下运转的Trio 100质谱仪进行上述产物的分析，其中的质谱仪连接到配备有HP-1交联的甲基硅氧烷柱(25m，内径0.25mm,0.17mm的膜)的HP5890气相层析仪上：电子能量为70eV，电源温度为200℃，界面温度为280℃，烘箱温度为50℃并以每分钟30℃的速度增长到200℃、然后以每分钟10℃的速度长至300℃，注射温度为280℃。

实施例5-顺式-反式共转染的分析；拮抗作用的说明

在补充有15％的胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和200mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)(均由英国Paisley的Gibco BRL购买)中维持并转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

在转染前24小时，以3×10⁵/60mm平皿(Costar英国)的密度来涂布CHO细胞。通过磷酸钙的方法来转染细胞。简单地说，把作为用于测定转染效率的对照物的5μg的MMTV-LUC和1μg的pRShGR或5μg的pSV2与pGEM3相混合，所用的总量为10μg DNA/平板，并与用无菌水把30μl 2.5M的CaCl₂稀释10倍并把300μl的稀释液加入上述DNA中。接下来用回荡(swirling)的方式向DNA/CaCl₂的混合物中缓慢地加入300μl以2×Hepes缓冲的盐水(280 mM NaCl,10mM KCl,1.5mMNa₂HPO₄·2H₂O)(50mM Hepes,12mM葡萄糖，pH7.05)。为了生成良好的沉淀保持该溶液30分钟并且向每个平板中逐滴地加入600μl的溶液。在24小时后除去培养基，在不含血清的培养基中洗涤细胞并且在含有10％的用活性炭提取的血清(charcoal-stripped serum)的培养基中与浓度适宜的DHEA/7α-羟基-DHEA一起再培养细胞24小时。

在加入DHEA/7α-羟基DHEA后六小时，向每个平板中加入B或Dex。在随后的一天在PBS中洗涤细胞，用0.3ml的裂解缓冲溶液(25mM Tris-磷酸盐pH7.8,2mM DTT,1％TritonX-100与10％的甘油)裂解细胞，刮取上述细胞、离心，并且用Berthold发光计在总体积为250μl的溶液中重复测定上清液两次，其中所说的溶液包括40μl的细胞提取物、5μl30mM的ATP、100μl的测定缓冲溶液(20mM tricine,1.07nM(MgCO₃)₄·Mg(OH)₂·％H₂O,2.67mM MgSO₄,0.1mM EDTA,33.3mM DTT,0.2mg/ml辅酶A)注入105μl的萤光素(Promega英国)以便起始反应。在10秒钟后测量光的发射并且计算出相对的光的单位/微克蛋白。

在图4中显示出了结果，其中通过对照物、单独加入DHEA、7α-羟基-DHEA(7HD)的直方图说明了萤光素酶的诱导倍数，并且上述物质都是在有皮质酮的GR活化浓度存在的情况下加入的。该结果表明在活化GR-介导的转录的过程中，7HD起到了皮质酮的拮抗剂的作用，但DHEA却没有起到这一作用。

实施例6-Cyp7b在阿尔茨海默氏病人的神经元中的表达

把来自对照的和阿尔茨海默氏病人的海马进行恒冷大脑切片(10μm)、融化并装载到涂覆了底层为明胶、其上为聚-L-赖氨酸的载玻片上并且在-80℃下储存。

为了进行原地的杂交研究，把大脑切片在经过乙酰化(溶于0.1M三乙醇胺的0.25％的乙酸酐，pH8.0)的4％的多聚甲醛中后固定(post-fixed)10分钟，在磷酸盐缓冲盐水中漂洗上述切片，通过分级醇(graded alcohol)进行脱水并进行空气干燥。使用200μl[³⁵S]-UTP-标记的cRNA反义探针(在杂交缓冲溶液中为10×10⁶dpm/ml)进行杂交，其中该反义探针是在体外由人的Cyp7b pMMCtⅠ克隆的500bp的XbaⅠ/PstⅠ片段合成的，而所说的片段用XbaⅠ进行了线性化并且用T3 RNA(用作有义探针)转录。在50℃下，在每个载玻片上使上述切片与20μl的预杂交缓冲溶液(与杂交缓冲溶液相同，但却省了硫酸葡聚糖)预杂交3小时。

在50℃下与探针杂交过夜后，用RNase A(30μg/ml，在37℃下处理45分钟)处理切片并且洗涤切片至最终的严紧性为在60℃下0.1×SSC。脱去载玻片上的水分，把载玻片浸入照相乳剂(NTB-2,Kodak)中，在冲洗之前在4℃下曝光5周，并用1％的焦宁复染色。通过计算机辅助的颗粒计数使用图象分析系统(Seescan plc，剑桥，英国)并且进行盲法(blind)分析(切下切片并通过单独的个体来编号)在单个的海马的神经元中评定银粒的密度。对每个载玻片而言，一个海马的切片表示一个受试者。评定每个分区中的6-10个神经元，并且减去在白色物质的区域内计量到的背景。通过ANOVA、随后通过Scheffe post hoc检验来评价数据。显著性设在p＜0.05的情况下。值为平均值±S.E.M.。

图5为显示出与年龄相当的对照大脑相比，阿尔茨海默氏病样品的齿状脑回、CA1和CA3分区中的每个神经元中通过颗粒计数所示的Cyp7b表达的直方图。

结论

可以得出的结论为Cyp7b以及来自大鼠、人和其它哺乳动物物种的相关酶为对具有3β羟基基团的类国醇底物有特异性的7α-羟化酶。当以前已经记载了在多种粗的组织匀浆物中使DHEA、孕烯醇酮和胆固醇在7-位进行羟基化的活性的时候(例如Akwa等人，《生物化学杂志》288,959-964,1992)，但却没有确定起作用的酶的特征并且记载了上述物质对雌二醇不具备活性。因此，表达Cyp7b的重组的生物体提供了大规模制备7HP、7HD和7HE的途径，但基本上不排除提供了治疗用途或者生产出更多的类固醇衍生物、如7-氧代分子。

序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：(A)名称：英国技术集团有限公司(B)街道：101 Newington Causeway(C)城市：伦敦(E)国家：英国(F)邮政编码(ZIP):SE1 6BU(A)姓名：Richard Frank LATHE(B)街道：爱丁堡大学基因组研究中心(C)城市：爱丁堡(E)国家：英国(F)邮政编码(ZIP):EH9 3JQ(A)姓名：Ken A ROSE(B)街道：爱丁堡大学基因组研究中心(C)城市：爱丁堡(E)国家：英国(F)邮政编码(ZIP):EH9 3JQ(A)姓名：Jonathan Robert SECKL(B)街道：爱丁堡大学分子医学中心(C)城市：爱丁堡(E)国家：英国(F)邮政编码(ZIP):EH4 2XU(A)姓名：Ruth BEST(B)街道：爱丁堡大学分子医学中心(C)城市：爱丁堡(E)国家：英国(F)邮政编码(ZIP):EH4 2XU(A)姓名：Joyce Lai Wah YAU(B)街道：爱丁堡大学分子医学中心(C)城市：爱丁堡(E)国家：英国(F)邮政编码(ZIP):EH4 2XU(A)姓名：Caroline McKenzie LECKIE(B)街道：爱丁堡大学分子医学中心(C)城市：爱丁堡(E)国家：英国(F)邮政编码(ZIP):EH4 2XU(ⅱ)发明名称：神经类固醇(ⅲ)序列数：6(ⅳ)计算机可读形式：(A)存储媒体类型：软磁盘(B)计算机：IBM PC兼容机(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release#1.0,#1.30版(EPO)(ⅴ)目前申请信息：申请号：*****(2)SEQ ID NO:1信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：1763个碱基对 (B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特征：(A)名称/关键词(key):CDS(B)位置：1..1245(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:GCC TTG GAG TAC CAG TAT GTA ATG AAA AAC CCA AAA CAA TTA AGC TTT48Ala Leu Glu Tyr Gln Tyr val Met Lys Asn Pro Lys Gln Leu Ser Phe1 5 10 15GAG AAG TTC AGC CGA AGA TTA TCA GCG AAA GCC TTC TCT GTC AAG AAG96Glu Lys Phe Ser Arg Arg Leu Ser Ala Lys Ala Phe Ser Val Lys Lys

20 25 30CTG CTA ACT AAT GAC GAC CTT AGC AAT GAC ATT CAC AGA GGC TAT CTT 144Leu Leu Thr Asn Asp Asp Leu Ser Asn Asp Ile His Arg Gly Tyr Leu

35 40 45CTT TTA CAA GGC AAA TCT CTG GAT GGT CTT CTG GAA ACC ATG ATC CAA 192Leu Leu Gln Gly Lys Ser Leu Asp Gly Leu Leu Glu Thr Met Ile Gln

50 55 60GAA GTA AAA GAA ATA TTT GAG TCC AGA CTG CTA AAA CTC ACA GAT TGG 240Glu Val Lys Glu Ile Phe Glu Ser Arg Leu Leu Lys Leu Thr Asp Trp65 70 75 80AAT ACA GCA AGA GTA TTT GAT TTC TGT AGT TCA CTG GTA TTT GAA ATC 288Asn Thr Ala Arg Val Phe Asp Phe Cys Ser Ser Leu Val Phe Glu Ile

85 90 95ACA TTT ACA ACT ATA TAT GGA AAA ATT CTT GCT GCT AAC AAA AAA CAA 336Thr Phe Thr Thr Ile Tyr Gly Lys Ile Leu Ala Ala Asn Lys Lys Gln

100 105 110ATT ATC AGT GAG CTG AGG GAT GAT TTT TTA AAA TTT GAT GAC CAT TTC 384Ile Ile Ser Glu Leu Arg Asp Asp Phe Leu Lys Phe Asp Asp His Phe

115 120 125CCA TAC TTA GTA TCT GAC ATA CCT ATT CAG CTT CTA AGA AAT GCA GAA 432Pro Tyr Leu Val Ser Asp Ile Pro Ile Gln Leu Leu Arg Asn Ala Glu

130 135 140TTT ATG CAG AAG AAA ATT ATA AAA TGT CTC ACA CCA GAA AAA GTA GCT 480Phe Met Gln Lys Lys Ile Ile Lys Cys Leu Thr Pro Glu Lys Val Ala145 150 155 160CAG ATG CAA AGA CGG TCA GAA ATT GTT CAG GAG AGG CAG GAG ATG CTG 528Gln Met Gln Arg Arg Ser Glu Ile Val Gln Glu Arg Gln Glu Met Leu

165 170 175AAA AAA TAC TAC GGG CAT GAA GAG TTT GAA ATA GGA GCA CAT CAT CTT 576Lys Lys Tyr Tyr Gly His Glu Glu Phe Glu Ile Gly Ala His His Leu

180 185 190GGC TTG CTC TGG GCC TCT CTA GCA AAC ACC ATT CCA GCT ATG TTC TGG 624Gly Leu Leu Trp Ala Ser Leu Ala Asn Thr Ile Pro Ala Met Phe Trp

195 200 205GCA ATG TAT TAT CTT CTT CAG CAT CCA GAA GCT ATG GAA GTC CTG CGT 672Ala Met Tyr Tyr Leu Leu Gln His Pro Glu Ala Met Glu Val Leu Arg

210 215 220GAC GAA ATT GAC AGC TTC CTG CAG TCA ACA GGT CAA AAG AAA GGA CCT 720Asp Glu Ile Asp Ser Phe Leu Gln Ser Thr Gly Gln Lys Lys Gly Pro225 230 235 240GGA ATT TCT GTC CAC TTC ACC AGA GAA CAA TTG GAC AGC TTG GTC TGC 768Gly Ile Ser Val His Phe Thr Arg Glu Gln Leu Asp Ser Leu Val Cys

245 250 255CTG GAA AGC GCT ATT CTT GAG GTT CTG AGG TTG TGC TCC TAC TCC AGC 816Leu Glu Ser Ala Ile Leu Glu Val Leu Arg Leu Cys Ser Tyr Ser Ser

260 265 270ATC ATC CGT GAA GTG CAA GAG GAT ATG GAT TTC AGC TCA GAG AGT AGG 864Ile Ile Arg Glu Val Gln Glu Asp Met Asp Phe Ser Ser Glu Ser Arg

275 280 285AGC TAC CGT CTG CGG AAA GGA GAC TTT GTA GCT GTC TTT CCT CCA ATG 912Ser Tyr Arg Leu Arg Lys Gly Asp Phe Val Ala Val Phe Pro Pro Met

290 295 300ATA CAC AAT GAC CCA GAA GTC TTC GAT GCT CCA AAG GAC TTT AGG TTT 960Ile His Asn Asp Pro Glu Val Phe Asp Ala Pro Lys Asp Phe Arg Phe305 310 315 320GAT CGC TTC GTA GAA GAT GGT AAG AAG AAA ACA ACG TTT TTC AAA GGA 1008Asp Arg Phe Val Glu Asp Gly Lys Lys Lys Thr Thr Phe Phe Lys Gly -

325 330 335GGA AAA AAG CTG AAG AGT TAC ATT ATA CCA TTT GGA CTT GGA ACA AGC 1056Gly Lys Lys Leu Lys Ser Tyr Ile Ile Pro Phe Gly Leu Gly Thr Ser

340 345 350AAA TGT CCA GGC AGA TAC TTT GCA ATT AAT GAA ATG AAG CTA CTA GTG 1104Lys Cys Pro Gly Arg Tyr Phe Ala Ile Asn Glu Met Lys Leu Leu Val

355 360 365ATT ATA CTT TTA ACT TAT TTT GAT TTA GAA GTC ATT GAC ACT AAG CCT 1152Ile Ile Leu Leu Thr Tyr Phe Asp Leu Glu Val Ile Asp Thr Lys Pro

370 375 380ATA GGA CTA AAC CAC AGT CGC ATG TTT CTG GGC ATT CAG CAT CCA GAC 1200Ile Gly Leu ASn His Ser Arg Met Phe Leu Gly Ile Gln His Pro Asp385 390 395 400TCT GAC ATC TCA TTT AGG TAC AAG GCA AAA TCT TGG AGA TCC TGA 1245Ser Asp Ile Ser Phe Arg Tyr Lys Ala Lys Ser Trp Arg Ser *

405 410 415AAGGGTGGCA GAGAAGCTTA GCGGAATAAG GCTGCACATG CTGAGCTCTG TGATTTGCTG 1305TACTCCCCAA ATGCAGCCAC TATTCTTGTT TGTTAGAAAA TGGCAAATTT TTATTTGATT 1365GCGATCCATC CAGTTTGTTT TGGGTCACAA AACCTGTCAT AAAATAAAGC GCTGTCATGG 1425TGTAAAAAAA TGTCATGGCA ATCATTTCAG GATAAGGTAA AATAACGTTT TCAAGTTTGT 1485ACTTACTATG ATTTTTATCA TTTGTAGTGA ATGTGCTTTT CCAGTAATAA ATTTGCGCCA 1545GGGTGATTTT TTTTAATTAC TGAAATCCTC TAATATCGGT TTTATGTGCT GCCAGAAAAG 1605TGTGCCATCA ATGGACAGTA TAACAATTTC CAGTTTTCCA GAGAAGGGAG AAATTAAGCC 1665CCATGAGTTA CGCTGTATAA AATTGTTCTC TTCAACTATA ATATCAATAA TGTCTATATC 1725ACCAGGTTAC CTTTGCATTA AATCGAGTTT TGCAAAAG 1763(2)SEQ ID NO:2信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：1880个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：CDS(B)位置：81..1604(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:GGCAGGCACA GCCTCTGGTC TAAGAAGAGA GGGCACTGTG CAGAAGCCAT CGCTCCCTAC60AGAGCCGCCA GCTCGTCGGG ATG CAG GGA GCC ACG ACC CTA GAT GCC GCC 110

Met Gln Gly Ala Thr Thr Leu Asp Ala Ala

420 425TCG CCA GGG CCT CTC GCC CTC CTA GGC CTT CTC TTT GCC GCC ACC TTA 158Ser Pro Gly Pro Leu Ala Leu Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ala Thr Leu

430 435 440CTG CTC TCG GCC CTG TTC CTC CTC ACC CGG CGC ACC AGG CGC CCT CGT 206Leu Leu Ser Ala Leu Phe Leu Leu Thr Arg Arg Thr Arg Arg Pro Arg

445 450 455GAA CCA CCC TTG ATA AAA GGT TGG CTT CCT TAT CTT GGC ATG GCC CTG 254Glu Pro Pro Leu Ile Lys Gly Trp Leu Pro Tyr Leu Gly Met Ala Leu

460 465 470AAA TTC TTT AAG GAT CCG TTA ACT TTC TTG AAA ACT CTT CAA AGG CAA 302Lys Phe Phe Lys Asp Pro Leu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Arg Gln

475 480 485CAT GGT GAC ACT TTC ACT GTC TTC CTT GTG GGG AAG TAT ATA ACA TTT 350His Gly Asp Thr Phe Thr Val Phe Leu Val Gly Lys Tyr Ile Thr Phe490 495 500 505GTT CTG AAC CCT TTC CAG TAC CAG TAT GTA ACG AAA AAC CCA AAA CAA 398Val Leu Asn Pro Phe Gln Tyr Gln Tyr Val Thr Lys Asn Pro Lys Gln

510 515 520TTA AGC TTT CAG AAG TTC AGC AGC CGA TTA TCA GCG AAA GCC TTC TCT 446Leu Ser Phe Gln Lys Phe Ser Ser Arg Leu Ser Ala Lys Ala Phe Ser

525 530 535GTA AAG AAG CTG CTT ACT GAT GAC GAC CTT AAT GAA GAC GTT CAC AGA 494Val Lys Lys Leu Leu Thr Asp Asp Asp Leu Asn Glu Asp Val His Arg

540 545 550GCC TAT CTA CTT CTA CAA GGC AAA CCT TTG GAT GCT CTT CTG GAA ACT 542Ala Tyr Leu Leu Leu Gln Gly Lys Pro Leu Asp Ala Leu Leu Glu Thr

555 560 565ATG ATC CAA GAA GTA AAA GAA TTA TTT GAG TCC CAA CTG CTA AAA ATC 590Met Ile Gln Glu Val Lys Glu Leu Phe Glu Ser Gln Leu Leu Lys Ile570 575 580 585ACA GAT TGG AAC ACA GAA AGA ATA TTT GCA TTC TGT GGC TCA CTG GTA 638Thr Asp Trp Asn Thr Glu Arg Ile Phe Ala Phe Cys Gly Ser Leu Val

590 595 600TTT GAG ATC ACA TTT GCG ACT CTA TAT GGA AAA ATT CTT GCT GGT AAC 686Phe Glu Ile Thr Phe Ala Thr Leu Tyr Gly Lys Ile Leu Ala Gly Asn

605 610 615AAG AAA CAA ATT ATC AGT GAG CTA AGG GAT GAT TTT TTT AAA TTT GAT 734Lys Lys Gln Ile Ile Ser Glu Leu Arg Asp Asp Phe Phe Lys Phe Asp

620 625 630GAC ATG TTC CCA TAC TTA GTA TCT GAC ATA CCT ATT CAG CTT CTA AGA 782Asp Met Phe Pro Tyr Leu Val Ser Asp Ile Pro Ile Gln Leu Leu Arg

635 640 645AAT GAA GAA TCT ATG CAG AAG AAA ATT ATA AAA TGC CTC ACA TCA GAA 830Asn Glu Glu Ser Met Gln Lys Lys Ile Ile Lys Cys Leu Thr Ser Glu650 655 660 665AAA GTA GCT CAG ATG CAA GGA CAG TCA AAA ATT GTT CAG GAA AGC CAA 878Lys Val Ala Gln Met Gln Gly Gln Ser Lys Ile Val Gln Glu Ser Gln

670 675 680GAT CTG CTG AAA AGA TAC TAT AGG CAT GAC GAT TCT GAA ATA GGA GCA 926Asp Leu Leu Lys Arg Tyr Tyr Arg His Asp Asp Ser Glu Ile Gly Ala

685 690 695CAT CAT CTT GGC TTT CTC TGG GCC TCT CTA GCA AAC ACC ATT CCA GCT 974His His Leu Gly Phe Leu Trp Ala Ser Leu Ala Asn Thr Ile Pro Ala

700 705 710ATG TTC TGG GCA ATG TAT TAT ATT CTT CGG CAT CCT GAA GCT ATG GAA 1022Met Phe Trp Ala Met Tyr Tyr Ile Leu Arg His Pro Glu Ala Met Glu

715 720 725GCC CTG CGT GAC GAA ATT GAC AGT TTC CTG CAG TCA ACA GGT CAA AAG 1070Ala Leu Arg Asp Glu Ile Asp Ser Phe Leu Gln Ser Thr Gly Gln Lys730 735 740 745AAA GGG CCT GGA ATT TCA GTC CAC TTC ACC AGA GAA CAA TTG GAC AGC 1118Lys Gly Pro Gly Ile Ser Val His Phe Thr Arg Glu Gln Leu Asp Ser

750 755 760TTG GTC TGC CTG GAA AGC ACT ATT CTT GAG GTT CTG AGG CTG TGC TCA 1166Leu Val Cys Leu Glu Ser Thr Ile Leu Glu Val Leu Arg Leu Cys Ser

765 770 775TAC TCC AGC ATC ATC CGA GAA GTG CAG GAG GAT ATG AAT CTC AGC TTA 1214Tyr Ser Ser Ile Ile Arg Glu Val Gln Glu Asp Met Asn Leu Ser Leu

780 785 790GAG AGT AAG AGT TTC TCT CTG CGG AAA GGA GAT TTT GTA GCC CTC TTT 1262Glu Ser Lys Ser Phe Ser Leu Arg Lys Gly Asp Phe Val Ala Leu Phe

795 800 805CCT CCA CTC ATA CAC AAT GAC CCG GAA ATC TTC GAT GCT CCA AAG GAA 1310Pro Pro Leu Ile His Asn Asp Pro Glu Ile Phe Asp Ala Pro Lys Glu810 815 820 825TTT AGG TTC GAT CGG TTC ATA GAA GAT GGT AAG AAG AAA AGC ACG TTT 1358Phe Arg Phe Asp Arg Phe Ile Glu Asp Gly Lys Lys Lys Ser Thr Phe

830 835 840TTC AAA GGA GGG AAG AGG CTG AAG ACT TAC GTT ATG CCT TTT GGA CTC 1406Phe Lys Gly Gly Lys Arg Leu Lys Thr Tyr Val Met Pro Phe Gly Leu

845 850 855GGA ACA AGC AAA TGT CCA GGG AGA TAT TTT GCA GTG AAC GAA ATG AAG 1454Gly Thr Ser Lys Cys Pro Gly Arg Tyr Phe Ala Val Asn Glu Met Lys

860 865 870CTA CTG CTG ATT GAG CTT TTA ACT TAT TTT GAT TTA GAA ATT ATC GAC 1502Leu Leu Leu Ile Glu Leu Leu Thr Tyr Phe Asp Leu Glu Ile Ile Asp

875 880 885AGG AAG CCT ATA GGG CTA AAT CAC AGT CGG ATG TTT TTA GGT ATT CAG 1550Arg Lys Pro Ile Gly Leu Asn His Ser Arg Met Phe Leu Gly Ile Gln890 895 900 905CAC CCC GAT TCT GCC GTC TCC TTT AGG TAC AAA GCA AAA TCT TGG AGA 1598His Pro Asp Ser Ala Val Ser Phe Arg Tyr Lys Ala Lys Ser Trp Arg

910 915 920AGC TGA AAGTGTGGCA GAGAAGCTTT GCAGAGTAAG GCTGCATGTG CTGAGCTCCG 1654Ser *TGATTTGGTG CACTCCCCCA AATGCAACCG CTACTCTTGT TTGAAAATGG CAAATTTATA 1714TTTGGTTGAG ATCAATCCAG TTGGTTTTGG GTCACAAAAC CTGTCATAAA ATAAAGCAGT 1774GTGATGGTTT AAAAAATGTC ATGGCAATCA TTTCAGGATA AGGTAAAATA ACATTTTCAA 1834GTTTGTACTT ACTATGATTT TTATCATTTG TAGTGAATGT GCTTTT 1880(2)SEQ ID NO:3信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：3846个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：CDS(B)位置：831..2078(ⅸ)特征： (A)名称/关键词：外显子(3)(B)位置：831..1422(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：内含子(B)位置：1423..1872(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：外显子(4)(B)位置：1873..2078(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:GGATCCAACC AAGTTTCCAG ATCTTATAAA TGTGGTGAAT GGTGAATGAC TTCCTGAAGA60ATGGATGAAT GGATGTGTTC TAGTTTGGAA TCCTGTGTCA GTCACAAGTC AATATGTGAC 120CTTGAACATG TTATTAAATC TCCCACATCC ATAAAAGTGA AAATGCTGGC ATTAGTGGAT 180TTTTGCCAGT GTTGAATTAG ACATTTATTT GTGAGTACCT GCTCCATACA GTATGGTCAT 240TTATTTGAGT TAAAATTGTT GTATTTGAAC AAAACTCAGA TGACACCTAA GCATGAAAAA 300GCTCTTTATG AAGTATAAAT ACTCAGAAAT GGAATGGCAT GTTGCCAATT TGTTTTCTGC 360TTTATTGAGG GAAATATATG AGAAGTATTT AAGTCAGGGG ATTATGAGGA ATATTTAAAG 420GATANNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 480NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 540NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 600NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNTCTAGA GTGTTTTCCA CCATCTTTCA 660AAGGAAACAT GTAGTGTACC TTCGAATGAA ATGGATTTGT ATTAAACTTT TTGCCTTAGT 720TATTAGGGTC TTTCTAATTT TTGATTAACA TATTTTTTTA ATTTGTGGTG TTTATTTCTG 780TTTTTATTAA CAAACGAACT CATATGCTCC TCTCTCTTTT TTTTTTTTCT GGAAAGTACA 840TAACATTTAT ACCTGGACCC TTCCAGTACC AGCTAGTGAT AAAAAATCAT AAACAATTAA 900GCTTTCGAGT ATCTTCTAAT AAATTATCAG AGAAAGCATT TAGCATCAGT CAGTTGCAAA 960AAAATCATGA CATGAATGAT GAGCTTCACC TCTGCTATCA ATTTTTGCAA GGCAAATCTT 1020TGGACATACT CTTGGAAAGC ATGATGCAGA ATCTAAAACA AGTTTTTGAA CCCCAGCTGT 1080TAAAAACCAC AAGTTGGGAC ACGGCAGAAC TGTATCCATT CTGCAGCTCA ATAATATTTG 1140AGATCACATT TACAACTATA TATGGAAAAG TTATTGTTTG TGACAACAAC AAATTTATTA 1200GTGAGCTAAG AGATGATTTT TTAAAATTTG ATGACAAGTT TGCATATTTA GTATCCAACA 1260TACCCATTGA GCTTCTAGGA AATGTCAAGT CTATTAGAGA GAAAATTATA AAATGCTTCT 1320CATCAGAAAA GTTAGCCAAG ATGCAAGGAT GGTCAGAAGT TTTTCAAAGC AGGCAAGATG 1380ACCTGGAGAA ATATTATGTG CACGAGGACC TTGAAATAGG AGGTAAGAAC TTCTGAATGA 1440GCACTTGCCT AAATAAAAAT CATTTACATA GACCTCTGAA ATAAAAAAAG ACAAAATGGC 15007GACCTTGAAA ATTTTTTTAT GCTCTTTCTA ATTGGCTAAT GATAAATGTT TACTCTGATA 1560TAACCTCTAT AATTGATATT TTTTTTTTTG CTGAGGTGGT AAACAGATAC TTAATGGTGA 1620TAATGAGAAA GCGTATAACT AAGCTGCATT TATCCCTCTT ATCTCATCCC CGACCACACC 1680GCCCCCCCCA TACACATTAC ATTTTAAACT ATTCTCATTA AGCAGAAAAT TAGACTTCAG 1740AAGCCTATTG GTTCTCATTA GCATGCAGTG ATCCTTGGCT GGTCTGTGTC CTAACATCTT 1800TTAATTAGCA CACTGCAAAT CTAATCAGTG TAATAAACGC TATTAATCTT CCTTTACACT 1860TATTTTCTCC CACACATCAT TTAGGCTTTC TCTGGGCCTC TGTGGCAAAC ACTATTCCAA 1920CTATGTTCTG GGCAACGTAT TATCTTCTGC GGCACCCAGA AGCTATGGCA GCAGTGCGTG 1980ACGAAATTGA CCGTTTGCTG CAGTCAACAG GTCAAAAGGA AGGGTCTGGA TTTCCCATCC 2040ACCTCACCAG AGAACAATTG GACAGCCTAA TCTGCCTAGG TAATTATTTT ATCTGTTATG 2100AAGAAAGAAG GTACCTCTCT GCAAACTCGG TTTATCACTC ATAGCTGTTT ACAAGAGGTA 2160GAGGACACAG CTGCTAATTG ACATAATAAC TCCCATTTAC ATCAATTATA AATTATGTAG 2220TTTATAGCCG TAGATCATCT CATTGCATGT AAACATAAGG CCTATGTAAT TAACTGTGTA 2280ATGTATGTAA AATTCTAACC AAAGCTTNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2340NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2400NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2460NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2520NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2580NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2640NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2700NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2760NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2820NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNCCT GACTGAACTT CTTACTGCCA 2880AAGTTAAATT CCATACCAAT GAGTTATTCT CTATTCTCTC TGTATTGACA TTTCATCTGC 2940GGTATCCTTT AGGGTACAAT GAGTTATTCT CTATTCTCTC TGTATTGACA TTTCATCTGC 3000GGTATCCTTT AGGGTACAAT ATTCCAAGTT TCTTTAGACA AACGCAGGAA CAAATGTTCA 3060CATATTTCTG TTTCTTTATT CCTTTGACAA GTAGGCGAGC ATTTTAGCCT ATGTTGGTCT 3120CAAAAAAAAT CTTTTAAATA TGTTCCAGGT TCTTTAATGG GACCTTTCAG GAGCAAAAGT 3180CCTCCCAGGT TTGGTCAATG TTCACCCTCN GTGGCCATTG AGGAAAATGC CCNNNNNGTT 3240CTAGAGATTG TTCTCACTTC TCAGGCTAAG GCCCATTGAG CAATGCCAGA AAGCATGCCT 3300TATACTAGCA GTCAATTTGG AAGTTTGTAG TTTGTGTCTT TAGCATAGGT TATCAAATAA 3360ATTTTATATT TNCTTTTAAA AAAATCTCAA CATTACTAAA ATACAAATAT CCTTTTATTT 3420TTCTTTGCAG AATTATCGGG GAACAAATCC AGAAAATTTG TGTAAATTTC GGGTAGTTGC 3480TCCACTTGAT ACACAGTATT TCTGCATATT GTAATTTCTA TGAAGATCTA GGTTGCATTT 3540CCCATACATT CAAGCAGTTT CCATTGCATT TTTATGAATA AGATGACGCA TACTGGGAAG 3600TAAGGCAAAT ACACTAAAAG GAATATGTGT TTGTATTCTG TATAGTTATT ACTCTTAAAA 3660AAAGTAGTTG TAATTCATCC ACTCTTTTTA CTTTCAACTT TTTGCTATTA AAAAATCATT 3720TTTAAATTTC AGTATTAAAG CAGAAACATT TAAATTTATT AGACCAGAAA AATAACAGAT 3780TCTAGAACTA TAATTTGAAT CCATTTAAGC CCATAGCTAG AGCTAGAGAT TTTCACTATT 3840GGATCC 3846(2)SEQ ID NO:4信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：415个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Ala Leu Glu Tyr Gln Tyr Val Met Lys Asn Pro Lys Gln Leu Ser Phe1 5 10 15Glu Lys Phe Ser Arg Arg Leu Ser Ala Lys Ala Phe Ser Val Lys Lys

20 25 30Leu Leu Thr Asn Asp Asp Leu Ser Asn Asp Ile His Arg Gly Tyr Leu

35 40 45Leu Leu Gln Gly Lys Ser Leu Asp Gly Leu Leu Glu Thr Met Ile Gln

50 55 60Glu Val Lys Glu Ile Phe Glu Ser Arg Leu Leu Lys Leu Thr Asp Trp65 70 75 80Asn Thr Ala Arg Val Phe Asp Phe Cys Ser Ser Leu Val Phe Glu Ile

85 90 95Thr Phe Thr Thr Ile Tyr Gly Lys Ile Leu Ala Ala Asn Lys Lys Gln

100 105 110Ile Ile Ser Glu Leu Arg Asp Asp Phe Leu Lys Phe Asp Asp His Phe

115 120 125Pro Tyr Leu Val Ser Asp Ile Pro Ile Gln Leu Leu Arg Asn Ala Glu

130 135 140Phe Met Gln Lys Lys Ile Ile Lys Cys Leu Thr Pro Glu Lys Val Ala145 150 155 160Gln Met Gln Arg Arg Ser Glu Ile Val Gln Glu Arg Gln Glu Met Leu

165 170 175Lys Lys Tyr Tyr Gly His Glu Glu Phe Glu Ile Gly Ala His His Leu

180 185 190Gly Leu Leu Trp Ala Ser Leu Ala Asn Thr Ile Pro Ala Met Phe Trp

195 200 205Ala Met Tyr Tyr Leu Leu Gln His Pro Glu Ala Met Glu Val Leu Arg

210 215 220Asp Glu Ile Asp Ser Phe Leu Gln Ser Thr Gly Gln Lys Lys Gly Pro225 230 235 240Gly Ile Ser Val His Phe Thr Arg Glu Gln Leu Asp Ser Leu Val Cys

245 250 255Leu Glu Ser Ala Ile Leu Glu Val Leu Arg Leu Cys Ser Tyr Ser Ser

260 265 270Ile Ile Arg Glu Val Gln Glu Asp Met Asp Phe Ser Ser Glu Ser Arg

275 280 285Ser Tyr Arg Leu Arg Lys Gly Asp Phe Val Ala Val Phe Pro Pro Met

290 295 300Ile His Asn Asp Pro Glu Val Phe Asp Ala Pro Lys Asp Phe Arg Phe305 310 315 320Asp Arg Phe Val Glu Asp Gly Lys Lys Lys Thr Thr Phe Phe Lys Gly

325 330 335Gly Lys Lys Leu Lys Ser Tyr Ile Ile Pro Phe Gly Leu Gly Thr Ser

340 345 350Lys Cys Pro Gly Arg Tyr Phe Ala Ile Asn Glu Met Lys Leu Leu Val

355 360 365Ile Ile Leu Leu Thr Tyr Phe Asp Leu Glu Val Ile Asp Thr Lys Pro

370 375 380Ile Gly Leu Asn His Ser Arg Met Phe Leu Gly Ile Gln His Pro Asp385 390 395 400Ser Asp Ile Ser Phe Arg Tyr Lys Ala Lys Ser Trp Arg Ser *

405 410 415(2)SEQ ID NO:5信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：508个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:Met Gln Gly Ala Thr Thr Leu Asp Ala Ala Ser Pro Gly Pro Leu Ala1 5 10 15Leu Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ser Ala Leu Phe

20 25 30Leu Leu Thr Arg Arg Thr Arg Arg Pro Arg Glu Pro Pro Leu Ile Lys

35 40 45Gly Trp Leu Pro Tyr Leu Gly Met Ala Leu Lys Phe Phe Lys Asp Pro

50 55 60Leu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Arg Gln His Gly Asp Thr Phe Thr65 70 75 80Val Phe Leu Val Gly Lys Tyr Ile Thr Phe Val Leu Asn Pro Phe Gln

85 90 95Tyr Gln Tyr Val Thr Lys Asn Pro Lys Gln Leu Ser Phe Gln Lys Phe

100 105 110Ser Ser Arg Leu Ser Ala Lys Ala Phe Ser Val Lys Lys Leu Leu Thr

115 120 125Asp Asp Asp Leu Asn Glu Asp Val His Arg Ala Tyr Leu Leu Leu Gln

130 135 140Gly Lys Pro Leu Asp Ala Leu Leu Glu Thr Met Ile Gln Glu Val Lys145 150 155 160Glu Leu Phe Glu Ser Gln Leu Leu Lys Ile Thr Asp Trp Asn Thr Glu

165 170 175Arg Ile Phe Ala Phe Cys Gly Ser Leu Val Phe Glu Ile Thr Phe Ala

180 185 190Thr Leu Tyr Gly Lys Ile Leu Ala Gly Asn Lys Lys Gln Ile Ile Ser

195 200 205Glu Leu Arg Asp Asp Phe Phe Lys Phe Asp Asp Met Phe Pro Tyr Leu

210 215 220Val Ser Asp Ile Pro Ile Gln Leu Leu Arg Asn Glu Glu Ser Met Gln225 230 235 240Lys Lys Ile Ile Lys Cys Leu Thr Ser Glu Lys Val Ala Gln Met Gln

245 250 255Gly Gln Ser Lys Ile Val Gln Glu Ser Gln Asp Leu Leu Lys Arg Tyr

260 265 270Tyr Arg His Asp Asp Ser Glu Ile Gly Ala His His Leu Gly Phe Leu

275 280 285Trp Ala Ser Leu Ala Asn Thr Ile Pro Ala Met Phe Trp Ala Met Tyr

290 295 300Tyr Ile Leu Arg His Pro Glu Ala Met Glu Ala Leu Arg Asp Glu Ile305 310 315 320Asp Ser Phe Leu Gln Ser Thr Gly Gln Lys Lys Gly Pro Gly Ile Ser

325 330 335Val His Phe Thr Arg Glu Gln Leu Asp Ser Leu Val Cys Leu Glu Ser

340 345 350Thr Ile Leu Glu Val Leu Arg Leu Cys Ser Tyr Ser Ser Ile Ile Arg

355 360 365Glu Val Gln Glu Asp Met Asn Leu Ser Leu Glu Ser Lys Ser Phe Ser

370 375 380Leu Arg Lys Gly Asp Phe Val Ala Leu Phe Pro Pro Leu Ile His Asn385 390 395 400Asp Pro Glu Ile Phe Asp Ala Pro Lys Glu Phe Arg Phe Asp Arg Phe

405 410 415Ile Glu Asp Gly Lys Lys Lys Ser Thr Phe Phe Lys Gly Gly Lys Arg

420 425 430Leu Lys Thr Tyr Val Met Pro Phe Gly Leu Gly Thr Ser Lys Cys Pro

435 440 445Gly Arg Tyr Phe Ala Val Asn Glu Met Lys Leu Leu Leu Ile Glu Leu

450 455 460Leu Thr Tyr Phe Asp Leu Glu Ile Ile Asp Arg Lys Pro Ile Gly Leu465 470 475 480Asn His Ser Arg Met Phe Leu Gly Ile Gln His Pro Asp Ser Ala Val

485 490 495Ser Phe Arg Tyr Lys Ala Lys Ser Trp Arg Ser *

500 505(2)SEQ ID NO:6信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：266个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:Gly Lys Tyr Ile Thr Phe Ile Pro Gly Pro Phe Gln Tyr Gln Leu Val1 5 10 15Ile Lys Asn His Lys Asn Leu Ser Phe Arg Val Ser Ser Asn Lys Leu

20 25 30Ser Glu Lys Ala Phe Ser Ile Ser Gln Leu Gln Lys Asn His Asp Met

35 40 45Asn Asp Glu Leu His Leu Cys Tyr Gln Phe Leu Gln Gly Lys Ser Leu

50 55 60Asp Ile Leu Leu Glu Ser Met Met Gln Ash Leu Lys Gln Val Phe Glu65 70 75 80Pro Gln Leu Leu Lys Thr Thr Ser Trp Asp Thr Ala Glu Leu Tyr Pro

85 90 95Phe Cys Ser Ser Ile Ile Phe Glu Ile Thr Phe Thr Thr Ile Tyr Gly

100 105 110Lys Val Ile Val Cys Asp Asn Asn Lys Phe Ile Ser Glu Leu Arg Asp

115 120 125Asp Phe Leu Lys Phe Asp Asp Lys Phe Ala Tyr Leu Val Ser Asn Ile

130 135 140Pro Ile Glu Leu Leu Gly Asn Val Lys Ser Ile Arg Glu Lys Ile Ile145 150 155 160Lys Cys Phe Ser Ser Glu Lys Leu Ala Lys Met Gln Gly Trp Ser Glu

165 170 175Val Phe Gln Ser Arg Gln Asp Asp Leu Glu Lys Tyr Tyr Val His Glu

180 185 190Asp Leu Glu Ile Gly Ala His His Phe Gly Phe Leu Trp Val Ser Val

195 200 205Ala Ser Thr Ile Pro Thr Met Phe Trp Ala Thr Tyr Tyr Leu Leu Arg

210 215 220His Pro Glu Ala Met Ala Ala Val Arg Asp Glu Ile Asp Arg Leu Leu225 230 235 240Gln Ser Thr Gly Gln Lys Glu Gly Ser Gly Phe Pro Ile His Leu Thr

245 250 255Arg Glu Gln Leu Asp Ser Leu Ile Cys Leu

260 265

参考文献1．Joels.M.与De Kloet,E.R.(1994)大脑中的盐皮质激素和糖皮质激素的受体，离子渗透性和递质系统的关系，神经生物学进展43,1-36。2．Sapolsky,R.M.,Krey,L.C.与McEwen,B.S(1986)紧张与老化的神经内分泌学：糖皮质激素的连锁假说内分泌回顾7,284-301；Landfield,P.W.(1994)在大脑老化和阿尔茨海默氏病中糖皮质激素的作用：综合的生理学假说，Gerontol 29,3-11；Seckl,J.R与Olsson,T(1995)糖皮质激素分泌过多与随年龄损伤的海马：原因或效果?内分泌学杂志145,201-211。3．Morales,A.J.,Nolan,J.J.,Nelson,J.C.与Yen,S.S.(1994),J.Clin.Endocrinol.Metab,78,1360-1367:Bellino F.L.,Daynes,R.Y.,Mornsby,P.J.,Mornsby,P.J.,Lavrin,D.H.与Nestler,J.E.(1995)，脱氢表雄酮与老化。Ann NY Acad Sci774,1-35.1。4．Meusy-Dessolle,N.与Dang,D.C.(1985)在从出生到成年的食Crab猴(Maeaca fascicularis)中睾酮、二氢睾酮、δ4-雄烯二酮、脱氢表雄酮和雌二醇-17β的血浆浓度。Repord.Fert.74-347-359,Orentreich,N.,Brind,J.L.,Vogelman,J.H.,Andres,R.与Baidwin,H.(1992)长期纵向测量正常人血浆中的脱氢表雄酮硫酸盐。Clin.Endocrinol,Metab.75,1002-1004；Sapol sky,R.M.,Vogelman,J.H.,Orentreich,N.,与Allmann.J.(1993).在野生狒狒的群体中血清中的脱氢表雄酮硫酸盐浓度随衰老而下降。J.Gerontol,48 B196-200；Belanger,A.,Candas,B.,Dupont,A.,Cusan,L.,Diamond.P.,Gomez,J.L.,与Labrie,F.(1994)在40至80岁的人当中血清中结合的与未结合的类固醇浓度的变化J.Clin.Endocrinol.Metab,79,1086-1090；Birkenhager-Gillesse,E.G.,Derksen,J.,与Lagaay,A.M.(1994)在最老的、年龄为85年以上的老人中的脱氢表雄酮硫酸盐(DHEAS)Ann.NY Acad.Sci,719,543-552；Shealy.C.N.(1995)脱氢表雄酮(DHEA) C.N.(1995)脱氢表雄酮(DHEA)的回顾。Integ.Physiol.Behav.Sci 30,308-313。5．Flood,J.F.,Smith,G.E.,与Roberts,E.(1988)脱氢表雄酮及其硫酸盐增强小鼠的记忆的保留大脑研究447,269-278；Flood,J.F.与Roberts，E.(1988)在老化的小鼠中，脱氢表雄酮硫酸盐改善记忆，大脑研究448,178-181；Flood,J.F.,Morley,J.E.,与Roberts,E(1992)孕烯醇酮及由该物质经代谢得到的类固醇对雄性小鼠起到的增强记忆的作用美国科学院学报89,1567-1571；Flood,J.F.,Morley,J.E.，与Roberts.E.(1995)当以非常低的剂量把孕烯醇酮的硫酸盐注射到边缘系统的结构中时孕烯醇酮硫酸盐增强训练后的记忆的过程；扁桃体是敏感的美国科学院学报92,10806-10810；Yoo.A.,Harris,J.，与Dubrovsky,B.(1996)，脱氢表雄酮硫酸盐对齿状脑回长期增强的剂量-应答的研究神经学实验137,151-156；Robel,P.与Baulieu.E.E.(1995)脱氢表雄酮(DHEA)为具有神经活性的神经类固醇Ann.NY Acad.Sci.774,82-110；Mayo.W.,Dellu,F.,Robel,P.,Cherkaoui,J.,Le Moal,M.，与Baulieu,E.E.(1993)。向基底神经节大细胞注入神经类固醇影响了大鼠的认知过程大脑研究607,324-328；Mathis,C.,Paul.S.M.,与Crawley,J.N.(1994)神经类固醇孕烯醇硫酸盐阻碍在消极地回避记忆任务中诱导NMDA拮抗剂的不足精神药理学Psychopharmacology 116,201-206；Isaacson,R.L.,Varner,J.A.,Baars,J.M.,与De Wied,D.(1995)。孕烯醇酮硫酸盐与乙雌烯醇对消极回避任务的保留的影响大脑研究689,79-84.6．Staplcton.G.,Steel,M.,Richardson,M.,Mason.J.O.,Rose,K.A.,Morris,R.G.M.，与Lathe,R.(1995)。主要在大脑中表达的新的细胞色素P450生物化学杂志270,29739-29745。7．Robel,P.＆ Baulieu,E.E.(1995).In:P.E.Micevych＆ R.P.Hammer，编辑性类固醇激素的神经生物学作用(剑桥：剑桥大学出版社)pp.281-296。8．Guarneri,P.Guarneri,R.,Cascio,C.,Pavasant,P.,Piecoli,F.＆ Papadopoulos,V.(1994)神经化学杂志63,86-96。9．Jung-Testas,I.,Hu,Z.Y.Baulieu,E.E.,＆ Robel,P.(1996)类固醇生物化学杂志34,511-519。10．Martini,L.＆ Meleangi,R.C.(1991)类固醇生物化学，分子生物学杂志39,819-82811．Walther,B.,Ghersi-Egea,J.F.,Minn,A.＆ Siest,G.(1986)大脑研究375,338-34412．Kapitulnik,J.,Gelboin,H.V.,Guengerich.F.P.＆Jacobowitz,D.M.(1987).神经科学20,829-833。13．Warner.M.,Kohler,C.,Hansson,T.＆ Gustafsson,J.A.(1988)神经化学杂志50,1057-1065。14．Warner,M.,Stromstedt,M.,Moller,L,＆ Gustafsson,J.A.(1989)，内分泌学124,2699-2706.15．Warner,M.,Wyss,A.,Yoshida,S.＆ Gustafsson.J.A(1994)，神经科学方法22 51-66。16．Warner,M.＆ Gustafsson,J.A(1995)神经内分泌学前沿16,224-236.17．Akwa,Y.,Morlin,R.F.＆ Baulieu.E.E.(1992)生物化学杂志288,959-96418．Bhamre,S.,Anandatheerathavarada,H.K.,Shankar,S.K.＆ Ravindranath,V(1992)生化药理学44,1223-122519．Bhamre,S.,Anandatheerathavarada,H.K.,Shankar,S.K.,Boyd,M.R.＆ Ravindranath.V.(1993).Arch,Biochem.Biophys,301,251-25520．Komori,M.(1993)生物化学、生物物理研究通讯196,721072821．Stromstedt.M.Wamer,M.＆ Gustafsson J.A(1994)神经化学杂志63,671-67622．Kawashima,H.＆ Strobel,H.W.(1995)生物化学生物物理研究通讯209,535-54023．Le Goascogne,C.,Robel,P.,Gouezou,M.,Sananes,N.,Baulieu.E.E.,＆ Waterman,M.(1987)科学237,1212-121524．Mellon,S.H.＆ Deschepper,C.F.(1993)大脑研究629,283-29325．Sanne,J.L.＆ Krueger,K.E.(1995)神经化学杂志65,528-536。26．Lauber,M.E.＆ Lichtensteiger,W.(1994)内分泌学135,1661-166827．Khanna,M.,Qin,K.N.,Wang,D.P.＆ Cheng,K.C.(1995),生物化学杂志270,20162-2016828．Guennoun,R.,Fiddes,R.J.,Gouezou,M.,Lombes,M.＆Baulieu,E.E.(1995)分子大脑研究30,287-30029．Rajan,V.,Edwards,C.R.W.＆ Seckl,J.R.(1996)，神经科学杂志16,65-7030．Chung,B.C.,Picado-Leonard J.,Haniu,M.,Bienkowski,M.,Hall.P.F.,Shively,J.E.＆Miller,W.I.,(1987)美国科学院学报84 407-41131．Noshiro,M.＆ Okuda,K.(1990).FEBS Lett.268,137-14032．Noshiro.M.,Nishimoto,M.,Morohashi,K.＆ Okuda,K.(1989),FEBS Lett.257,97-10033．Jelinek,D.F.,Andersson.S.,Slaughter,C.A.＆Russel,D.W.(1990)，生物化学杂志265,8190-8197

Claims

1．7α-羟基或7-氧代取代的3β-羟基-类固醇或其以酯或醚基分别在7-和3-位的一个位置或两个位置上取代的衍生物在制备用于治疗神经精神病、免疫和/或内分泌疾病或者用于诱导认知增强的药物组合物中的用途。

2．根据权利要求1的用途，其中所说的疾病选自

(a)衰老过程中认知的缺损

(b)阿尔茨海默氏病

(c)衰老过程中免疫系统的缺损

(d)在HIV感染中免疫功能的缺损

(e)糖皮质激素或者盐皮质激素过剩

(f)糖尿病

(g)抑郁症

(h)骨质疏松症与高钙血症

(i)高血糖症与高脂血症

(j)肌肉萎缩

(k)动脉硬化

(l)类固醇糖尿病。

3．如权利要求1或权利要求2所要求保护的用途，其中所说的类固醇具有3β-取代基-OR₁和/或7α-取代基-OR₂，其中-OR₁与-OR₂各自分别表示游离的羟基、酯基或醚基，其中R₁和R₂各自分别选自由氢、取代的或者未取代的C_1-6烷基、基团R₅CO-组成的组中，其中R₅可以选自取代的或者未取代的C_1-6烷基和通式-OP(OH)₃的基团，其中任意的取代基选自OH、卤代(F,Cl,Br,I)氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6二烷基氨基、COOH或COOR₄，其中R₄表示C_1-6烷基；并且其中所说的化合物可以呈游离的形式或者呈含有药理学可接受的阴离子的酸式加成盐的形式。

4．根据权利要求1至3之任一所要求保护的用途，其特征在于所说的类固醇为具有胆固醇、雄酮、孕烯醇酮或雌二醇的碳骨架的类固醇。

5．Cyp7b类固醇羟化酶在制备用于诊断神经精神病、免疫和内分泌疾病的测试试剂盒中的用途。

6．根据权利要求5的用途，其中所说的疾病选自

(a)衰老过程中认知的缺损

(b)阿尔茨海默氏病

(c)衰老过程中免疫系统的缺损

(d)在HIV感染中免疫功能的缺损

(e)糖皮质激素或者盐皮质激素过剩

(f)糖尿病

(g)抑郁症

(h)骨质疏松症与高钙血症

(i)高血糖症与高脂血症

(j)肌肉萎缩

(k)动脉硬化

(l)类固醇糖尿病。

7．一种抗体、尤其是一种单克隆抗体，其特征在于所说的抗体特异性地结合Cyp7b酶。

8．如权利要求5中要求保护的抗体在用于分析Cyp7b酶存在的测试试剂盒中的用途。

9．Cyp7b编码序列或反义序列在制备用于Cyp不足或过剩的基因治疗或者用于促进免疫原性的过程的定向药物中的用途。

10．权利要求9要求保护的用途，其中把载体与疫苗制剂共同给药，从而在给药的过程中表达Cyp7b序列并且所生成的表达产物增强了该疫苗的免疫原性的特性。

11．一种生产7α-羟基-取代的类固醇的方法，该方法包括在有Cyp7b类固醇羟化酶存在的情况下使在7-位上没有取代基的相应的类固醇底物进行羟基化。

12．根据权利要求11的方法，其中所说的酶为小鼠、大鼠或者人的Cyp7b类固醇羟化酶。

13．根据权利要求11的方法，其中所说的Cyp7b类固醇羟化酶具有由选自下列序列的Cyp7b酶的DNA编码序列所编码的序列

14．根据权利要求11的方法，其中所说的Cyp7b类固醇羟化酶具有由选自下列序列的Cyp7b酶的DNA编码序列所编码的序列

(e)选自下列序列的DNA编码序列：

(ⅰ)在SEQ Id No 3中命名为“外显子3”的序列，

(ⅱ)在SEQ Id No 3中命名为“外显子4”的序列，以及

(h)包括选自下列序列的连续的碱基对的编码Cyp7b类固醇羟化酶的DNA分子，

(ⅰ)在SEQ Id No 3中命名为“外显子3”的序列，

(ⅱ)在SEQ Id No 3中命名为“外显子4”的序列，以及

(k)包括由SEQ Id No 3中的序列“外显子3”和“外显子4”组成的连续的编码序列的DNA分子的编码序列，以及

15．根据权利要求11的方法，其中所说的Cyp7b类固醇羟化酶具有由Cyp7b酶的DNA编码序列所编码的序列，所说的序列选自在SEQ IDNO.4,SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中所含的氨基酸序列或者与上述的一个或者多个序列之间至少具有50％的同源性的序列，前提是该序列没有消除催化引入7α-羟基的能力。

16．根据权利要求15的方法，其中所说的Cyp7b类固醇羟化酶具有由DNA编码序列所编码的序列，所说的序列与上述的一个或者多个序列之间至少具有60％的同源性、并且更优选至少具有70％的同源性，前提是该序列没有消除催化引入7α-羟基的能力。

17．根据权利要求15的方法，其中所说的Cyp7b类固醇羟化酶具有与在SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中所含的氨基酸序列的不同之处在于有不超过20个、优选不超过10个并且最优选不超过5个氨基酸的取代、插入或者缺失的序列。

18．根据前述之任一权利要求的方法，其中所说的底物为具有3β-羟基的类固醇。

19．根据前述权利要求之任一的方法，其中所说的底物为具有胆固醇、雄酮、孕烯醇酮或雌二醇的碳骨架的类固醇，但条件是当所说的底物具有胆固醇的碳骨架时，该底物在25,26或27-位上有一个羟基基团。

20．根据权利要求19的方法，其中所说的底物为25-羟基胆固醇、脱氢表雄酮、孕烯醇酮或雌二醇。

21．根据前述权利要求之任一的方法，其中所生成的7α-羟基-取代的类固醇为7α-羟基雌二醇、7α-羟基孕烯醇酮或7α-羟基脱氢表雄酮。

22．根据前述权利要求之任一的方法，其中使所生成的类固醇经过了氧化步骤，从而把H.OH转化为氧代基团。

23．一种具有下列通式的类固醇

24．一种根据权利要求23的类固醇，其中

每个R₁,R₂和R₃可以选自取代的或者未取代的C_1-6烷基，任意的上述取代基选自OH、卤代(F,C1,Br,I)氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6二烷基氨基、COOH或COOR₄，其中R₄表示不被上述的取代基之一取代的或者被所说的取代基取代的C_1-6烷基；或者

OR₁,OR₂和OR₃各自分别表示酯化的羟基，其通式为R₅COO-，其中R₅可以选自取代的或者未取代的C_1-6烷基，任意的上述取代基选自OH、卤代(F,Cl,Br,I)氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6二烷基氨基、COOH或COOR₄，其中R₄表示C_1-6烷基；或者

OR₁,OR₂和OR₃各自分别表示通式为-OP(OH)₃的酯化的羟基，

或者为该化合物的药理学可接受的盐。

25．7α-羟基雌二醇或7-氧代雌二醇。

26．如权利要求23中要求保护的类固醇，其特征在于所说的类固醇为3β-羟基类固醇。

27．一种生产氧代-取代的类固醇的方法，该方法包括使7α-羟基雌二醇、7α-羟基孕烯醇酮或者7α-羟基脱氢表雄酮进行氧化。

28．一种用于治疗需要对神经精神病、免疫和内分泌疾病进行治疗的人或动物的方法或者用于诱导认知增强的方法，该方法包括把有效量的7α-羟基或7-氧代取代的3β-羟基-类固醇或其以酯或醚基分别在7-和3-位的一个位置或两个位置上取代的衍生物进行给药。

29．根据权利要求28的方法，其中所说的疾病选自

(a)衰老过程中认知的缺损

(b)阿尔茨海默氏病

(c)衰老过程中免疫系统的缺损

(d)在HIV感染中免疫功能的缺损

(e)糖皮质激素或者盐皮质激素过剩

(f)糖尿病

(g)抑郁症

(h)骨质疏松症与高钙血症

(i)高血糖症与高脂血症

(j)肌肉萎缩

(k)动脉硬化

(l)类固醇糖尿病。

30．一种如权利要求28中要求保护的方法，其中所说的类固醇具有胆固醇、雄酮、孕烯醇酮或雌二醇的碳骨架并且具有3β-取代基-OR₁和/或7α-取代基-OR₂，其中-OR₁与-OR₂各自分别表示游离的羟基、酯基或醚基，

其中R₁和R₂各自分别选自由氢、取代的或者未取代的C_1-6烷基、基团R₅CO-组成的组中，其中R₅可以选自取代的或者未取代的C_1-6烷基和通式为-OP(OH)₃的基团，其中任意的取代基选自OH、卤代(F,Cl,Br,I)氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6二烷基氨基、COOH或COOR₄，其中R₄表示C_1-6烷基；并且其中所说的化合物可以呈游离的形式或者呈含有药理学可接受的阴离子的酸式加成盐的形式。

31．一种用于治疗当中的具有胆固醇、雄酮、孕烯醇酮或雌二醇的碳骨架的7α-羟基或7-氧代取代的3β-羟基-类固醇或其以酯或醚基分别在7-和3-位的一个位置或两个位置上取代的衍生物。

32．一种如权利要求31中要求保护的类固醇，所说的类固醇选自7α-羟基脱氢表雄酮、7α-羟基孕烯醇酮以及7α-羟基雌二醇。

33．一种药物组合物，其特征在于所说的组合物包括具有胆固醇、雄酮、孕烯醇酮或雌二醇的碳骨架的7α-羟基或7-氧取代的3β-羟基-类固醇或其以酯或醚基分别在7-和3-位的一个位置或两个位置上取代的衍生物，以及与之结合的呈无菌和不含热原形式的药物可接受的载体或稀释剂。