ES2710288T3 - Medicamentos y usos - Google Patents

Abstract

Compuesto para usar en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o afeccion metabolica, una afeccion de perdida osea o dolor, en el que el compuesto es 17α-etinilandrost-5-en-3β, 7β, 17β-triol, o un analogo de monoester C2-4 o diester C2-4 de este compuesto, opcionalmente en el que el monoester es acetato en la posicion 3 o 17 o el diester es acetato en las posiciones 3 y 17.

Description

DESCRIPCION

Medicamentos y usos

Campo de la invencion

La invencion se refiere a compuestos especificos para usar en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o afeccion metabolica, una afeccion de perdida osea o dolor.

Antecedentes de la invencion

Una serie de factores contribuyen al establecimiento y mantenimiento de muchos trastornos autoinmunitarios e inflamatorios cronicos. A menudo, la etiologia de dichos trastornos no se entiende bien. El factor de necrosis tumoral a (TNFa) es una citoquina que es liberada principalmente por fagocitos mononucleares en respuesta a una serie de inmunoestimuladores. Cuando se administra a animales o seres humanos, produce inflamacion, fiebre, efectos cardiovasculares, hemorragia, coagulacion y respuestas de fase aguda similares a las observadas durante infecciones agudas y estados de choque. La produccion excesiva o no regulada del TNFa esta implicada por lo tanto en una serie de estados patologicos. Estos incluyen la endotoxemia y/o sindrome de choque toxico Tracey et al., Nature 330:662-664 (1987) y Hinshaw et al., Circ. Shock 30:279-292 (1990), la caquexia p. ej., Dezube et al., Lancet, 335(8690):662 (1990) y el ARDS (sindrome de dificultad respiratoria aguda) en el que se han detectado concentraciones altas de TNFa en aspirados pulmonares procedentes de pacientes de ARDS, p. ej. Millar et al., Lancet 2(8665):712-714 (1989).

Parece que el TNFa tambien esta implicado en enfermedades de resorcion osea, incluyendo la artritis. Cuando se activan, los leucocitos pueden producir resorcion osea, una actividad a la que puede contribuir el TNFa, p. ej., Bertolini et al., Nature 319:516-518 (1986) y Johnson et al., Endocrinology 124(3): 1424 -1427 (1989). Tambien se ha mostrado que el TNFa estimula la resorcion osea e inhibe la formacion osea in vitro e in vivo mediante la estimulacion de la formacion de osteoclastos y la activacion combinada con inhibicion de la funcion de osteoblastos. Se ha mostrado que el bloqueo del TNFa con anticuerpos monoclonales anti-TNFa es beneficioso en la artritis reumatoide (Elliot et al., Int. J. Pharmac. 17(2): 141 - 145 1995) y en la enfermedad de Crohn (von Dullemen et al., Gastroenterology, 109(1):129 - 135, 2005).

La molecula factor nuclear kappaB (NF-kB) es un mediador de la inflamacion en una serie de estados clinicos. Algunos agentes terapeuticos que se usan para tratar la inflamacion, tales como la dexametasona, prednisona o hidrocortisol, son agonistas del receptor de glucocorticoides (GR) e inhiben indirectamente el NF-kB al aumentar la actividad del GR, p. ej., H. Harkonarson et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 25:761-771, 2001. Sin embargo, los niveles elevados de agonistas de GR naturales y niveles farmacologicos de agonistas de GR sinteticos, normalmente ejercen toxicidades no deseadas que incluyen una supresion inmunitaria importante y la perdida de masa osea u osteopenia, p. ej., T.L. Popper et al., Anti-inflammatory agents: Anti-inflammatory steroids, RA. Scherer & M.W. Whitehouse, editors, Academic Press, New York, capitulo 9, volumen 1, paginas 245-294,1974. Muchas de las toxicidades no deseadas asociadas con los glucocorticoides son causadas por la activacion del GR. Por lo tanto, la identification de compuestos que puedan inhibir la actividad del NF-^kB, sin producir estas toxicidades mediante la activacion del GR, representa una clase de agentes que se podrian usar para tratar la inflamacion y los sintomas asociados tales como el dolor, fiebre o fatiga.

La inflamacion no deseada o perjudicial se produce en una serie de afecciones cronicas o agudas, p. ej., ARDS, COPD y septicemia. Los monocitos y neutrofilos activados tienen una funcion en la mediation de la inflamacion asociada a la patologla. Son particularmente importantes los neutrofilos activados, que presentan una mayor acumulacion en el nucleo del factor regulador de la transcription NF-kB y una mayor produccion de citoquinas proinflamatorias. Los neutrofilos tambien son una fuente de especies de oxigeno toxicas, cuya generation media, al menos en parte, la secretion del factor de necrosis tumoral (TNF-a) por macrofagos activados, lo cual puede ser necesario para la lesion e insuficiencia organica vistos en la septicemia.

La serialization asociada con la inflamacion se puede producir a traves de diferentes rutas, y esto puede aumentar la actividad del NF-^kB en las celulas afectadas. La activacion del NF-^kB por el factor-a de necrosis tumoral (TNF-a) empieza con la union del TNF-a al receptor del TNF-a en la membrana celular, seguido de la activacion de una serie de transductores de senales, incluyendo las MAP quinasas. La activacion del NF-^kB en el citoplasma conduce a su traslocacion en el nucleo y activacion de genes que contienen el elemento de respuesta del NF-^kB en sus promotores. La activacion del NF-kB citoplasmatico por el lipopolisacarido bacteriano (LPS) empieza con la union del LPS al receptor de tipo Toll 4 en la superficie celular y la posterior activacion de los transductores de senales intracelulares, incluyendo la fosfatidilinositol-3-quinasa. Se sabe que tanto el TNF-a como el LPS inducen respuestas inflamatorias intensas in vivo y en las celulas in vitro. Las celulas que responden a dichas senales proinflamatorias incluyen macrofagos, monocitos y otros tipos de celulas inmunitarias.

Parece que varios subgrupos de linfocitos T tienen una funcion en el desarrollo de determinados estados patologicos. Se ha sugerido una funcion importante para una poblacion diferente de linfocitos T incluyendo linfocitos T reguladores y/o supresores, en la mediation de diferentes aspectos de la inmunidad, p. ej., E. Suri-Payer et al., J. Immunol., 160(3): 1212-1218, 1998; J. Shimizu et al., J. Immunol., 163(10):5211-5218, 1999; M. Itoh et al., J. Immunol., 162(9):5317-5326, 1999; A.M. Miller et al., J. Immunol., 177: 7398-7405, 2006. Los linfocitos T CD4+ CD25+ pueden tener una funcion en la supresion de algunas respuestas inmunitarias.

Se ha descrito el estudio de algunos de estos subgrupos de linfocitos T en modelos animales, p. ej. patente de EE.UU. 6.593.511. Por ejemplo, se ha examinado una funcion para el estudio de afecciones autoinmunitarias humanas en el modelo de CD4+ CD45Rbhi scid/scid. Este modelo animal se ha usado para estudiar las respuestas inmunitarias desreguladas tales como estados de inflamacion y para evaluar farmacos experimentales y protocolos de tratamiento, p. ej., K. Hong et al., J. Immunol., 162:7480-7491, 1999; Powrie et al., J. Exp. Med., 183(6):2669-2674, 1996.

El gen Foxpro3, que es inducido por el epitelio del timo, puede tener una funcion en la induction de linfocitos T para desarrollar el fenotipo CD4+CD25+ o CD4+CD25high (linfocito T regulador o Treg). El antigeno de superficie CD25 es la cadena a del receptor de la IL-2. En algunos modelos animales de enfermedades autoinmunitarias, la deficiencia del gen Foxpro3 esta asociada con la aparicion de enfermedades autoinmunitarias, p. ej., solicitud de patente de EE.UU. n° 2006/0111316. El restablecimiento de este gen parece que reduce las anomalias autoinmunitarias. Se han descrito diferentes reactivos o protocolos de ensayo para celulas CD4+CD25+, p. ej., H. Yagi et al., International Immunol., 16(11): 1643-1656, 2004; W.R. Godfrey et al., Blood, 105(2)750-758, 2005.

La resistencia a la insulina en sujetos con intolerancia a la glucosa se ha reconocido desde hace tiempo. Reaven et al. (American Journal of Medicine, 60(1 ):80-88, 1976) usaron una infusion continua de glucosa e insulina (tecnica de pinzamiento de insulina/glucosa) y ensayos de tolerancia a la glucosa oral para demostrar que existia la resistencia a la insulina en un grupo diverso de sujetos no obesos, no cetosicos. Estos sujetos iban desde intolerancia a la glucosa a hiperglucemia en ayunas manifiesta. Los grupos diabeticos en estos estudios incluian tanto sujetos dependiente de insulina (DMDI) como no dependientes de insulina (DMNDI).

Coincidente con la resistencia a la insulina sostenida es la hiperinsulinemia mas facilmente determinada, que se puede medir mediante una determination precisa de la concentration de insulina plasmatica en la circulation en el plasma de los sujetos. La hiperinsulinemia puede estar presente como resultado de la resistencia a la insulina, como es el caso en sujetos obesos y/o diabeticos (DMNDI) y/o sujetos con intolerancia a la glucosa, o en sujetos con DMDI, como consecuencia del exceso de inyeccion de insulina comparado con la liberation fisiologica normal de la hormona por el pancreas endocrino.

La asociacion de la hiperinsulinemia con la obesidad y con enfermedades isquemicas de los grandes vasos sanguineos (p. ej., aterosclerosis) se ha descrito mediante estudios experimentales, clinicos y epidemiologicos (Stout, Metabolism, 34:7, 1985; Pyorala et al, Diabetes/Metabolism Reviews, 3:463, 1987). Los aumentos de la insulina plasmatica estadisticamente significativos 1 y 2 horas despues de la carga de glucosa oral se correlacionan con un mayor riesgo de enfermedad cardiaca coronaria.

Un modelo de diabetes humana es el raton db/db. Se ha descrito el modelo de raton db/db, por ejemplo, en D. Koya et al., The FASEB Journal, 14:439-447, 2000; K. Kobayashi et al., Metabolism, 49(1): 22-31,2000; J. Berger et al., J. Biol. Chem., 274(10):6718-6725, 1999. El raton db/db Neva una mutation en el gen que codifica el receptor de leptina, lo que le confiere un fenotipo caracterizado por hiperfagia, obesidad, resistencia a la insulina y diabetes al deteriorarse con el tiempo su masa de celulas D pancreaticas funcionales, en particular para animales en el contexto genetico C57BL/Ks. Los ratones db/db tipicamente se convierten en obesos identificables alrededor de las 3 a 4 semanas de edad y los aumentos de la insulina plasmatica empiezan a los 10 a 14 dias. Los aumentos de azucar en la sangre se observan a las 4 a 8 semanas de edad con un aumento incontrolado de azucar en la sangre, reduction grave de celulas p productoras de insulina de los islotes pancreaticos, y la muerte aproximadamente a los 10 meses de edad. Este modelo se ha usado para caracterizar la capacidad de los candidates a farmacos para afectar a la aparicion o a la velocidad de avance de parametros, p. ej., la hiperglucemia y ganancia de peso, relacionado con el desarrollo y mantenimiento de la diabetes.

El tratamiento de la diabetes con agonistas del PPAR-y se ha asociado con la hipertrofia cardiaca, o un aumento del peso del corazon. El tratamiento con maleato de rosiglitazona, un agonista del PPAR-y, indica que los pacientes pueden experimentar acumulacion de liquidos y sucesos relacionados con el volumen, tales como edema o insuficiencia cardiaca congestiva. La hipertrofia cardiaca relacionada con el tratamiento con agonista del PPAR-y tipicamente se trata por interruption del tratamiento.

Un efecto fisiologico del cortisol es su antagonismo a la insulina. Las concentraciones altas de cortisol en el higado pueden reducir la sensibilidad a la insulina en este organo, lo cual tiende a aumentar la gluconeogenesis y aumentar los niveles de azucar en la sangre (M.F. Dallman et al. Front Neuroendocrinol., 14:303-347, 1993). Este efecto agrava la intolerancia a la glucosa o la diabetes mellitus. En el sindrome de Cushing, que es producido por concentraciones excesivas de cortisol en la circulacion, el antagonismo de la insulina puede provocar diabetes mellitus en individuos que son susceptibles (E.J. Ross et al., Lancet, 2:646-649,1982).

El cortisol se puede convertir en cortisona en el cuerpo por la actividad de 11b-deshidrogenasa de enzimas 11bhidroxiesteroide deshidrogenasa. La reaccion inversa, conversion de la cortisona inactiva en cortisol, la Neva a cabo en determinados organos la actividad de 11 b-reductasa de estas enzimas. Esta actividad tambien se conoce como actividad de corticoesteroide 11 b-reductasa. Hay al menos dos isozimas diferentes de la 11b-hidroxiesteroide deshidrogenasa. La expresion de la 11P-HSD de tipo 1 en una variedad de lineas celulares, genera una enzima bidireccional o una 1 ip-reductasa predominante, que puede regenerar la 1 ip-hidroxiesteroide a partir de la 11-cetoesteroide pariente inerte.

La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa mitocondrial (tambien conocida como PEPCK mitocondrial, PEPCK-M, PCK2 y mtPEPCK) es expresada en una variedad de tejidos humanos, principalmente en el higado, rinon, pancreas, intestino y fibroblastos (Modaressi et al., Biochem. J., 333:359-366, 1998). La deficiencia de PEPCK mitocondrial, aunque no esta bien documentada, se ha asociado con retraso en el desarrollo, hipoglucemia y anomalias hepaticas. A diferencia de la forma citosolica (PEPCK-C), la forma mitocondrial (PEPCK-mitocondrial) es expresada constitutivamente y no es regulada por estimulos hormonales (Hanson and Patel, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 69:203-281, 1994). Las dos formas se encuentran en cromosomas separados que se localizan en el cromosoma 14q11 y PEPCK-C reside en el cromosoma 20q11 (Stoffel et al., Hum. Mol. Genet., 2:1-4, 1993).

La esclerosis multiple (EM) es una enfermedad autoinmunitaria que es una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central (Bar-Or, A., J. Neuroimmunol. 100:252-259, 1999). Aunque recientemente se ha mejorado la evolucion natural de la enfermedad mediante el tratamiento con compuestos inmunomoduladores-inmunosupresores tales como el interferon (IFN)-beta, copolimero, ciclofosfamida y mitoxantrona (Hafler, D.A. and Weiner, H.L., Immunological Reviews 144:75, 1995; Goodkin, D.E., Lancet 352: 1486, 1998), ninguno de estos farmacos puede bloquear el desarrollo de la enfermedad y algunos de ellos tienen efectos secundarios graves que limitan su uso prolongado. Ademas, un numero sustancial de pacientes tanto con EM de recaida-remision como con EM progresiva secundaria presentan una respuesta pobre al IFN-p. Por lo tanto, son necesarios nuevos compuestos que solos o en terapia de combinacion mejoren la evolucion de la EM, p. ej., ralentizando su avance.

El documento EP 1422 234 da a conocer un compuesto usado para la preparacion de un medicamento para la potenciacion de los numeros o la actividad de neutrofilos o celulas dendriticas en un ser humano o un primate que tiene o es propenso a desarrollar una afeccion de supresion inmunitaria innata.

El documento WO 95/10527 describe di y tri-metil andros-5-eno-3,17 dioles, que tienen desde 1 hasta 2 sustituyentes de metilo y opcionalmente un grupo hidroxilo en la position 7, que pueden usarse profilactica y terapeuticamente para actividades asociadas con dehidroepiandrosterona.

El documento WO 2004/019953 se refiere al uso de compuestos para mejorar o tratar una afeccion tal como fibrosis quistica, neutropenia u otras afecciones a modo de ejemplo.

El documento US 4.898.694 se refiere a esteroides y mas particularmente a derivados de androsterona utiles como agentes anti-cancerosos, anti-obesidad, anti-diabeticos e hipolipidemicos y utiles para combatir la enfermedad coronaria.

Los documentos WO 02/06977 y US 2003/083231 se refieren al uso de compuestos para tratar varias afecciones, tales como trombocitopenia, neutropenia o efectos retardados de la radioterapia.

El documento US 2004/116359 proporciona composiciones que comprenden esteroides, por ejemplo, hemihidrato de 16-alfa-bromo-3-beta-hidroxi-5-alfa-androstan-17-ona y uno o mas excipientes, normalmente en las que la composition comprende menos de aproximadamente el 3% de agua.

El documento US 2004/097475 se refiere a procedimientos para la preparacion de compuestos esteroideos 7-carboxi-sustituidos. Los documentos WO 01/23405 y CA 2 670 236 y CA 2669 753 proporcionan metodos para tratar afecciones tales como cancer de prostata, o para mejorar uno o mas sintomas asociados con el cancer de prostata, o para identificar agentes que modulan la actividad biologica del receptor de androgenos.

Loira R. M. et al., Ann. New York Acad. Sci. 917:860-867 (2000) muestran que el androstenotriol (AET) y el androstenodiol (AED) inducen una recuperation mas rapida de todos los precursores hematopoyeticos a partir del pequeno numero de celulas madres supervivientes tras irradiation.

Pelissier M. A. et al., Steroids. Steroids 71:240-248. (2006) investigaron el efecto antioxidante de la DHEAy la 7-alfahidroxi-DHEA contra el estres oxidativo inducido por colitis in vivo en ratas, mostrando que tanto DHEA como 7-alfahidroxi-DHEA pueden demostrar ser utiles en la prevention o el tratamiento de la colitis.

Liu S. et al., Cancer Res. 65:2269-2276 (2005) revelan que el sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S) y la DHEA tienen un efecto directo sobre celulas estromales de medula osea y mieloma para inhibir su proliferation y la produccion de IL-6, respectivamente.

Auci D. L. et al., Mod. Asp. Immunobiol. 3:64-70 (2003) proporcionan una vision general de hormonas de regulacion inmunitaria.

Ho E. et al., Faseb J. 13:1845-1854 (1999) demuestran que la activacion de NF-^kB por ROS puede iniciar una secuencia de acontecimientos que conduce a diabetes mellitus dependiente de insulina.

Hattori Y. et al., Cardiovasc. Res. 46:188-197 (2000) sugieren que la glucosa alta de manera aguda produce alteraciones en la osmolaridad que conducen a la activacion de NF-kB, pero que la exposicion a alta glucosa durante tiempos mas prolongados produce cambios en las defensas antioxidantes y la activacion de la proteina quinasa C, que potencia la activacion por citocinas de NF-^kB.

Eldor R. et al., Proc Natl Acad Sci U SA . 103:5072-5077 (2006) muestran que la activacion especifica de celulas beta de NF-kB es un acontecimiento clave en la perdida progresiva de celulas beta en la diabetes.

Zhang H. et al., Nature Med. 11:1238-1243 (2005) sugieren que la IL-2 y la linfopenia son moduladores primarios de la homeostasis de celulas Treg CD4+CD25+.

Coles et al., Eur. J. Immunol. 35:3694-3703 (2005) encontraron que la sustitucion de DHEA oral en la enfermedad de Addison tiene propiedades inmunomoduladoras significativas.

Pashko L. L. et al., Diabetes, 42:1105-1108 (1993) muestran que la administracion de 16-alfa-fluoro-5-androsten-17-ona en la dieta (el 0,2 y el 0,3%) redujeron notablemente los niveles de glucosa en plasma en ratones, mientras que el tratamiento con 16-alfa-fluoro-5-androsten-17-ona no tuvo efecto aparente sobre el peso de las glandulas vesiculares seminales.

Schwartz A. G. et al., Mil. Med. 167:60-63 (2000) desarrollaron un congenere sintetico de DHEA denominado fluasterona que, en pruebas animales, carece de los efectos de androgenicidad, estrogenicidad y proliferacion de peroxisoma de la DHEA, pero conserva la eficacia antiinflamatoria, antidiabetica y de prevencion del cancer.

Actualmente son necesarios agentes farmaceuticos o metodos de tratamientos baratos que sean mas eficaces en el tratamiento de las afecciones descritas antes. La presente divulgacion proporciona agentes terapeuticos y metodos de tratamiento para tratar una o mas de estas afecciones. Por lo tanto, los agentes y los metodos son utiles para reducir uno o mas sintomas asociados con las afecciones descritas en la presente memoria. Ademas, el uso de los agentes y metodos dados a conocer se puede combinar con uno o mas tratamientos convencionales para estos trastornos.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Resumen de las realizaciones preferidas

La invencion se define mediante el contenido de las reivindicaciones. En particular, la invencion proporciona un compuesto para usar en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o afeccion metabolica, una afeccion de perdida osea o dolor, en el que el compuesto es 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol o un analogo de monoester C ^{2-4 0} diester C ^2-4 de este compuesto, opcionalmente en el que el monoester es acetato en la posicion 36 17⁰ el diester es acetato en las posiciones 3 y 17.

La divulgacion proporciona ademas compuestos ⁰ composiciones para tratar, prevenir, ralentizar el avance de, ⁰ mejorar una afeccion de inflamacion no deseada, una enfermedad autoinmunitaria ⁰ un trastorno metabolico, ⁰ un sintoma de los mismos, en un mamifero que los necesita, opcionalmente en los que el mamifero es un ser humano ⁰ un primate no humano, en los que la composicion comprende un compuesto de formula 1 (“F1C”)

en la que un R1 es -H o alquilo opcionalmente sustituido y el otro R1 es -H, -OH, un ester o un eter, o ambos R1 son juntos =0 o una oxima tal como =NOH o =NOCH3; un ester o un eter; un R2 es -H o alquilo opcionalmente sustituido y el otro R2 es -H, -OH, un ester o un eter o ambos R2son juntos =0 o una oxima tal como =NOH o =NOCH3; un R3 es -H o alquilo opcionalmente sustituido y el otro R3 es -H, -OH, un ester o un eter o alquilo opcionalmente sustituido o ambos R3 son juntos =0 o una oxima tal como =NOH o =NOCH3; un R4es -H o alquilo opcionalmente sustituido y el otro R4es -OH, un ester o un eter o ambos R4 son juntos o ambos R4 son juntos =0 o una oxima tal como =NOH o =N0CH3; R5es alquilo opcionalmente sustituido, seleccionado opcionalmente de -CH³, -C²H⁵ y -CH²OH; R6 es -H ⁰ alquilo opcionalmente sustituido, seleccionado opcionalmente de -CH³, -C²H⁵ y -CH²OH; un R7 es -H ⁰ alquilo opcionalmente sustituido y el otro R7 es -H, - OH, un ester ⁰ un eter ⁰ , cuando no esta presente ningun doble enlace en la posicion 4, ambos R7 son juntos =0 ⁰ una oxima tal como =NOH ⁰ =N0CH3; R9 es -O- ⁰ -C(R12)(R12)- donde un R12 es -H, -F, -Br ⁰ alquilo opcionalmente sustituido y el otro R12 es -H, -OH, un ester ⁰ un eter ⁰ alquilo opcionalmente sustituido ⁰ ambos R12 son juntos =0 ⁰ una oxima tal como =NOH ⁰ =N0CH3; R10 es -H ⁰ un halogeno tal como -F ⁰ -Cl; y un R11 es -H ⁰ alquilo opcionalmente sustituido y el otro R11 es -H, -OH, un ester ⁰ un eter ⁰ alquilo opcionalmente sustituido ⁰ ambos R11 son juntos =0 ⁰ una oxima tal como =NOH ⁰ =N0CH3. Realizaciones de estos compuestos incluyen compuestos en los que (i) uno, dos ⁰ tres de R2, R7, R11 y R12 son independientemente -OH, un ester C ² - ⁸ , un eter C ^{1-8 0} =0, (ii) uno ⁰ dos de R1, R7, R11 y R12 son -OH, un ester C^{2-8 0} un eter C ^1-8 y (Hi) uno ⁰ dos de R1, R2, R7, R11 y R12 son =0 ⁰ =NOH y uno, dos ⁰ tres de los otros son independientemente -OH, un ester C^{2-8 0} un eter C ¹ - ⁸ . El atomo de hidrogeno en la posicion 5, cuando esta presente, puede estar en la configuration a- ⁰ p. Cuando esta presente un doble enlace en la posicion 4, esta ausente un resto R7.

La divulgation tambien proporciona un metodo para identificar ⁰ caracterizar una actividad biologica de un compuesto con potencial para tratar ⁰ mejorar un trastorno metabolico en un mamifero, que comprende seleccionar un compuesto que (i) no activa uno, dos ⁰ tres de PPAR-a, PPAR-y y PPAR-8 en celulas humanas ⁰ de mamifero in vitro en mas de aproximadamente el 30% cuando se compara con celulas humanas ⁰ de mamifero de referenda negativas adecuadas in vitro; (ii) inhibe ⁰ disminuye la actividad transcripcional ⁰ el nivel de NF-^kB en aproximadamente el 20-80% en celulas humanas ⁰ de mamifero in vitro cuando se compara con celulas humanas ⁰ de mamifero de referenda negativas adecuadas in vitro; (iii) cuando se compara con una referenda normal ⁰ referenda negativa adecuada, disminuye la hiperglucemia, ralentiza el avance ⁰ retrasa el inicio de la hiperglucemia, aumenta la sensibilidad a la insulina, disminuye la intolerancia a la glucosa, ralentiza el avance ⁰ la velocidad de perdida de numeros de celulas de islotes p pancreaticos ⁰ su capacidad para secretar insulina, aumenta los numeros de celulas de islotes p pancreaticos ⁰ su capacidad para secretar insulina, ralentiza la velocidad de aumento de peso en ratones db/db ⁰ en sujetos con obesidad inducida por la dieta ⁰ relacionada con la dieta, disminuye los niveles elevados de trigliceridos, disminuye los niveles elevados de colesterol total en sangre ⁰ suero, disminuye los niveles normales ⁰ elevados de LDL, VLDL, apoB-100 ⁰ apoB-48 en sangre ⁰ suero ⁰ aumenta los niveles normales ⁰ bajos de HDL ⁰ apoA1 en sangre ⁰ suero ⁰ disminuye un nivel elevado de fibrinogeno en sangre ⁰ suero; y (iv) opcionalmente, no activa uno ⁰ mas de un receptor de glucocorticoides, un receptor de mineralcorticoides, un receptor de progesterona, un receptor de androgenos, un receptor de estrogenos-a, receptor de estrogenos-p ⁰ una variante biologicamente activa de cualquiera de estas biomoleculas en celulas humanas ⁰ de mamifero in vitro en mas de aproximadamente el 30% cuando se compara con celulas humanas ⁰ de mamifero de referenda negativas adecuadas in vitro. El metodo permite la identification ⁰ caracterizacion del compuesto como con potencial para tratar ⁰ mejorar el trastorno metabolico en un ser humano u otro mamifero.

Las realizaciones tambien incluyen composiciones que comprenden un compuesto de formula 1 para la profilaxis ⁰ el tratamiento de una afeccion autoinmunitaria, una afeccion inflamatoria no deseada ⁰ un trastorno metabolico ⁰ un sintoma de cualquiera de estas afecciones.

Otras realizaciones son las descritas en el resto de la memoria descriptiva incluyendo las realizaciones descritas en la presente memoria.

Definiciones. Como se usa en la presente memoria y salvo que se exponga otra cosa o este implicito en el contexto, los terminos que se usan en la presente memoria tienen los significados que se definen aqui. Las descripciones de realizaciones y ejemplos que se describen ilustran la invencion y no se pretende que sean limitantes de ninguna forma. Salvo indicacion contraria o que este implicito, por ejemplo, cuando se incluyen elementos que se excluyen mutuamente u opciones, en estas definiciones y a lo largo de la memoria descriptiva, los terminos “un” y “una” significan uno o mas, y el termino “o” significa y/o.

Una “formulacion” o similar significa una composicion que se puede administrar a un sujeto, por ejemplo, un ser humano o animal. Las formulaciones son adecuadas para aplicaciones humanas o veterinarias y tipicamente tendran las caracteristicas esperadas para la formulacion, p. ej., las formulaciones parenteral es para uso humano normalmente seran disoluciones o suspensiones esteriles.

Un “excipiente”, “vehiculo”, “vehiculo farmaceuticamente aceptable” o expresiones similares significan uno o mas componentes o ingredientes que son aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de las composiciones o formulaciones dadas a conocer y no son excesivamente perjudiciales para el paciente, animal, tejidos o celulas a los que se va a administrar la formulacion.

Un “sujeto” significa un ser humano o animal. Normalmente el animal es un mamifero tal como un primate no humano, roedor, lagomorfo, animal domestico o animal de caza. Los primates incluyen chimpances, macacos cangrejeros, monos arana y macacos, p. ej., Rhesus o Pan. Los roedores y lagomorfos incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hamsteres.

“Alquilo” como se usa aqui, significa atomos de carbono normales, secundarios, terciarios o ciclicos unidos, es decir, lineales, ramificados, ciclicos o cualquier combinacion de los mismos. Restos alquilo, como se usa en la presente memoria, pueden ser saturados o insaturados, es decir, el resto puede comprender uno, dos o mas dobles enlaces o triples enlaces seleccionados independientemente. Los restos alquilo insaturados incluyen restos como se describe para restos alquenilo y alquinilo descritos a continuacion. El numero de atomos de carbono en un resto o grupo alquilo es de 1 a aproximadamente 50, por ejemplo, aproximadamente 1-30 o aproximadamente 1-20, a menos que se especifique de otro modo, por ejemplo, alquilo C^1-8 significa un resto alquilo que contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 atomos de carbono. Cuando se especifica un grupo alquilo, las especies pueden incluir metilo, etilo, 1 -propilo (npropilo), 2-propilo (/-propilo, -CH(CH³)²), 1-butilo (n-butilo), 2-metil-1 -propilo (/-butilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo (sbutilo, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propilo (f-butilo, -C(CH3)3), 1-pentilo (n-pentilo), 2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3- pentilo (-CH(CH2CH3)²), 2-metil-2-butilo (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butilo (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1 -butilo (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1 -butilo (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo, 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4- metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentilo (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butilo (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CH3)3), ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, -(CH2)n-(CHCH3)m-(CH2)o-CH3 y -(CH2)n-(CHC2H5)m-(CH2)^o-CH3 donde n, m y o son independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.

“Alquenilo” como se usa aqui, significa un resto que comprende atomos de carbono normales, secundarios, terciarios o ciclicos unidos, es decir, lineales, ramificados, ciclicos o cualquier combinacion de los mismos, que comprende uno o mas dobles enlaces (por ejemplo, -CH=CH-), por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas, normalmente 16 2. El numero de atomos de carbono en un resto o grupo alquenilo es de 2 a aproximadamente 50, por ejemplo, aproximadamente 2-30 o aproximadamente 2-20, a menos que se especifique de otro modo, por ejemplo, alquenilo C2-8 o alquenilo C2-8 significa un resto alquenilo que contiene 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 atomos de carbono. Cuando se especifica un grupo alquenilo, las especies pueden incluir vinilo, alilo, -(CH2)n-(CH=CH)-(CH2)m-CH3, -(CH2)n-(CCH3=CH)-(CH2)m-CH3,-(CH2)n-(CH=CCH3)-(CH2)m-CH3 y -(CH2)n-(CH=CH)o-i-(CH2)m-CH2CH=CH2, donde n y m son independientemente 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.

“Alquinilo” como se usa aqui, significa un resto que comprende atomos de carbono normales, secundarios, terciarios o ciclicos unidos, es decir, lineales, ramificados, ciclicos o cualquier combinacion de los mismos, que comprende uno o mas tripes enlaces (-C=C-), por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas, normalmente 16 2 triples enlaces, que comprende opcionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas dobles enlaces, siendo los enlaces restantes enlaces sencillos. El numero de atomos de carbono en un resto o grupo alquenilo es de 2 a aproximadamente 50, por ejemplo, aproximadamente 2-30 o aproximadamente 2-20, a menos que se especifique de otro modo, por ejemplo, alquinilo C2-8 o alquinilo C2-8 significa un resto alquinilo que contiene 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 atomos de carbono. Cuando se especifica un grupo alquilo, los grupos y las especies pueden incluir -CCH, -CCCH3, -CCCH2CH3, -CCC ³ H ⁷ ,-CCChhCsHy, -(CH2)n-(CEC)-(CH2)m-CH3, y -(CH2)n-(CE-C)o-i-(CH2)m-CH2CECH, donde n y m son independientemente 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.

“Alquilo sustituido”, “alquenilo sustituido” “alquinilo sustituido” y similares significa un alquilo, alquenilo, alquinilo u otro resto ⁰ grupo como se define aqui que tiene un/unos sustituyente(s) ⁰ que comprende un/unos sustituyente(s) que reemplaza(n) a un/unos atomo(s) de hidrogeno y esta(n) unido(s) a un/unos atomo(s) de carbono o un/unos sustituyente(s) que interrumpe(n) una cadena de atomos de carbono. Los sustituyentes incluyen 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -ORPR, -SH, -SCHs, -0-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(0)0RPR, -CHO, -CH2SH, -C=N-, -C(0)0RPR, -C(0)CH3 seleccionados independientemente, donde RPR es independientemente hidrogeno, un grupo protector o ambos RPR son hidrogeno o juntos son un grupo protector.

“Halogeno” significa fluor, cloro, bromo o yodo.

“Ester” significa un resto que comprende una estructura -C(0)-0-. Normalmente, los esteres, como se usan aqui, comprenden un resto organico que contiene aproximadamente 1-50 atomos de carbono (por ejemplo, aproximadamente 2-20 atomos de carbono) y de 0 a aproximadamente 10 heteroatomos seleccionados independientemente (por ejemplo, O, S, N, P, Si), donde el resto organico esta unido a un nucleo esteroide de formula 1 en, por ejemplo, R1 o R2a traves de la estructura -C(0)-0-, por ejemplo, resto organico-C(0)-0-esteroide o resto organico-0-C(0)-esteroide. El resto organico habitualmente comprende uno o mas de cualquiera de los grupos organicos descritos anteriormente, por ejemplo, restos alquilo C ¹ - ²⁰ , restos alquenilo C ² - ²⁰ , restos alquinilo C ² - ²⁰ , restos arilo, heterociclos C ^{2-9 0} derivados sustituidos de cualquiera de estos, por ejemplo, que comprenden 1, 2, 3, 4 ⁰ mas sustituyentes, donde cada sustituyente se escoge independientemente. Los esteres incluyen esteres de acido succinico, acidos dicarboxilicos y aminoacidos tales como -0-C(0)-(CH2)n-C(0)-0RPR, -0-C(0)-(CH2)n-NHRPR y -NH-(CH2)n-C(0)-ORPR, donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 y RPR es -H ⁰ un grupo protector tal como alquilo C1-4. Los esteres tambien incluyen estructuras tales como -0-C(0)-0-(CH2)n-H y -0-C(0)-NH-(CH2)n-H.

Las sustituciones a modo de ejemplo para atomos de hidrogeno ⁰ carbono en estos grupos organicos son como se describio anteriormente para restos alquilo sustituidos e incluyen 1, 2, 3, 4, 5, 6⁰ mas, habitualmente 1,2 63 -0-, -S-, -NRPR- (incluyendo -NH-), -C(O)-, -CHO, -CHS,-C=NH, -C(S), =0, =S, -N(Rpr)2 (incluyendo -NH2), -C(0)ORPR (incluyendo -C (0)0H),-0C(0)RPR (incluyendo -O-C(O)-H), -ORPR (incluyendo -OH), -SRPR (incluyendo -SH), -NO ² , -CN, -SON, -CeHs, -CH2C6H5, -NHC(O)-, -C(0)NH-, -OC(O)-, -C(0)0-, -0-A8, -S-A8, -C(0)-A8, -OC(0)-A8, -C(0)0-A8, =N-, -N=, =N-OH, -0P03(Rpr)2, -OSO ³ H ^{2 0} atomos ⁰ restos de halogeno, donde cada RPR es -H, un grupo protector seleccionado independientemente ⁰ ambos RPR comprenden juntos un grupo protector, y A8 es alquilo C ¹ - ⁸ , alquenilo C ² - ⁸ , alquinilo C ² - ⁸ , alquil Ci-4-arilo (por ejemplo, bencilo), arilo (por ejemplo fenilo) ⁰ alquil Co-4-heterociclo C ² - ⁹ . Las sustituciones se escogen independientemente. El resto organico incluye compuestos definidos por la variable R4. Los restos organicos excluyen obviamente los restos inestables, por ejemplo, -O-O-, excepto cuando tales restos inestables son especies transitorias que pueden usarse para obtener un compuesto con estabilidad quimica suficiente para uno ⁰ mas de los usos descritos en la presente memoria, incluyendo para la sintesis de los compuestos de formula 1 u otros. Las sustituciones enumeradas anteriormente normalmente son sustituyentes que pueden usarse para reemplazar a uno ⁰ mas atomos de carbono, por ejemplo, -O- ⁰ - C(O)-, ⁰ uno ⁰ mas atomos de hidrogeno, por ejemplo, halogeno, -NH ² u -OH. Los esteres a modo de ejemplo incluyen uno ⁰ mas de acetato, enantato, propionato, isopropionato, ciclopropionato, isobutirato, n-butirato, valerato, caproato, isocaproato, hexanoato, heptanoato, octanoato, nonanoato, decanoato, undecanoato, acetato de fenilo ⁰ benzoato seleccionados independientemente, que son normalmente esteres de hidroxilo. Los esteres tambien incluyen aminoacidos, carbonatos y carbamatos incluyendo -0-C(0)-CH2-NHRpr, -0-C(0)-CH2CH2-NHRpr, -O-C(O)-CH(CH3)-NHRpr, -0-C(0)-CH2CH(CH3)-NHRpr,-0-C(0)-CH(NHRpr)-CH(0Rpr)-CH3, -0-C(0)-0-(CH2)m-H y -O-C(0)-NH-(CH2)m-H donde RPR es -H ⁰ un grupo protector tal como alquilo C ^1-4 (-CH ³ , -C ² H ⁵ , -C ³ H ⁷ , etc.) ⁰ -C(0)-CH3 ⁰ -CH ² CH ² -O-CH ³ y m es 0, 1, 2, 3, 4, 566. Los esteres tambien incluyen -0-C(0)-(CF2)n-CF3, -0-C(0)-(CH2)n-CH3, -0-C(0)-CH(CH3)-(CH2)n-CH3 y -0-C(0)-C(CH3)2-(CH2)n-CH3 donde n es 0, 1,2, 3, 4, 566.

“Eter” significa un resto organico como se describe para ester que comprende 1, 2, 3, 4 ⁰ mas restos -0-, habitualmente 162. En algunas realizaciones, el grupo -O- esta unido al nucleo esteroide en un grupo variable tal como R1, R2, R3, R4⁰ R11, por ejemplo, resto organico-O-esteroide. El resto organico es como se describio anteriormente para los esteres. Los eteres incluyen -0-(CH2)n-CH3, -0-CH2(CH2)n-0-CH3, -0-CH2(CH2)n-S-CH3 y -O-CH(CH3)-(CH2)n-CH3 donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 566.

Compuestos de formula 1. Los compuestos de formula 1 tienen 3, 465 grupos hidroxilo, opcionalmente en los que uno, dos ⁰ mas estan esterificados con grupos ester que son iguales ⁰ diferentes. En algunas de estas realizaciones los grupos hidroxilo ⁰ esteres estan en las posiciones 3, 4, 16-y 17 en los que los grupos hidroxilo ⁰ esteres en las posiciones 3, 4 y 16, respectivamente, estan en las configuraciones (3,(3,a, p,p,p, a,p,a, a,p,p, p,a,a, p,a,p, a,a,a ⁰ a,a,p. El hidroxilo ⁰ ester en la posicion 17 normalmente esta en la configuracion p, pero puede estar en la configuracion a. R10 en estos compuestos normalmente es -H ⁰ un halogeno tal como -F y R5es opcionalmente -CH ^{3 0} -C ² H ⁵ y R6 es opcionalmente -H ⁰ -CH ³ . Para algunos de estos compuestos, puede estar presente un hidroxilo ⁰ ester adicional en la posicion 7⁰ en la posicion 11 en la configuracion p ⁰ en la configuracion a.

Para los compuestos de formula 1, los restos alquilo C ^1-8 sustituidos incluyen -CH²F, -CF3.-CH20H y -C²F⁵. Los restos alquinilo C^2-8 opcionalmente sustituidos incluyen-CCH, -CCCH³, -CCCH²OH, -CCCH²CI y -CCCH²Br.

Los compuestos de formula 1 a modo de ejemplo incluyen androst-5-en-3p,4p,7p,16a,17p-pentol y epimeros de este compuesto, donde uno ⁰ dos grupos hidroxilo estan epimerizados, por ejemplo, androst-5-en-3a,4p,7p,16a,17ppentol, androst-5-en-3p,4a,7a,16a,17p-pentol y androst-5-en-3p,4p,7a,16p,17|3-pentol. Otros compuestos de formula 1 incluyen unos donde estan presentes 5 restos -OH, ester o eter seleccionados independientemente, por ejemplo, androst-5-en-3p,4p,1 ip,16a,17p-pentol y epimeros de este compuesto donde uno o dos grupos hidroxilo estan epimerizados, por ejemplo, androst-5-en-3a,4p,1 ip,16a,17p-pentol, androst-5-en-3p,4p,1 ip,16a,17a-pentol, androst-5-en-3p,4p,11a,16a,17p-pentol y androst-5-en-3p,4a,11 p, 16p, 17p-pentol. Para tales compuestos, pueden derivatizarse uno, dos o mas de los 5 grupos hidroxilo, por ejemplo, para dar esteres o eteres tales como derivaos de metoxilo, etoxilo, acetoxilo, propionoxilo, -0-C(0)-(CH2)3-H, -0-C(0)-(CH2)4-H o -0-C(0)-(CH2)s-H. Otros esteres incluyen -0-C(0)-CH2-C(0)0H, -0-C(0)-(CH2)2-C(0)0H, -0-C(0)-(CH2)3-C(0)0H, -0-C(0)-(CH2)4-C(0)0H, -O-C(0)-(CH2)5-C(0)0H y -0-C(0)-(CH2)6-C(0)0H.

En algunos de estos ejemplos, estan presentes cuatro hidroxilo, esteres o eteres seleccionados independientemente en un compuesto de formula 1 en cuatro de las posiciones 2, 3, 4, 7, 11, 16 y 17. Tales sustituyentes pueden unirse a, por ejemplo, las posiciones 2, 3, 16 y 17, las posiciones 2, 3, 7 y 17, las posiciones 2, 3, 11 y 17, las posiciones 3, 4, 7 y 17, las posiciones 3, 4, 11 y 17, las posiciones 3, 7, 16 y 17, las posiciones 3, 4, 16 y 17 o las posiciones 3, 11, 16 y 17. Los hidroxilo, esteres o eteres, respectivamente, pueden estar en las configuraciones 2 y/o 3-p,(3,(3,(3-17, 2-y/o 3-p,p,p,a-17, 2- y/o 3-p,p,a,p-17, 2- y/o 3-p,a,p,p-17, 2- y/o 3-a,p,p,p-17, 2- y/o 3-p,p,a,a-17, 2- y/o 3-p,a,p,a-17, o en las configuraciones 2- y/o 3-a,p,p,a-17 cuando no esta presente ningun doble enlace en la posicion 4. El termino “2- y/o 3-p,p,p,p-17” significa que la posicion 2 esta opcionalmente sustituida y que las posiciones 3 y 17 estan sustituidas con hidroxilo, ester o eter. Los hidroxilo, esteres o eteres respectivamente pueden estar en las configuraciones 2- y/o 3-p,a,a,p-17, 2- y/o 3-a,p,a,p-17, 2- y/o 3-a,a,p,p-17, 2- y/o 3-p,a,a,a-17, 2- y/o 3-a,p,a,a-17, 2- y/o 3-a,a,p,a-17, 2- y/o 3-a,a,a,p-17, 2- y/o 3-p,a,a,a-17, cuando no esta presente ningun doble en lace en la posicion 4. R10 en estos compuestos normalmente es -H o -F y R5 es opcionalmente -CH ^{3 0} -C ² H ⁵ y R6 es opcionalmente -H, -CH ³ , -CH ² OH, -CCH ⁰ -CCCH ³ . Para estos compuestos, la uno, dos ⁰ mas de las posiciones 2, 3, 4, 7, 11, 16 y 17 estan sustituidas con -H ⁰ alquilo opcionalmente sustituido tal como -CH ³ , -C ² H ⁵ , -CH ² =CH ² , -CCH, -CFs ⁰ -C ² F ⁵ .

En algunos ejemplos de los compuestos de formula 1, pueden estar presentes cinco restos hidroxilo, ester y/o eter seleccionados independientemente. Para estos compuestos, los restos hidroxilo, ester y/o eter habitualmente estan presentes en las posiciones 3 y 17 y en otras 3 posiciones. Estos sustituyentes pueden estar en las posiciones 2, 3, 7 11 y 17, las posiciones 2, 3, 716 y 17⁰ las posiciones 2, 3, 11 16 y 17. Pueden estar presentes restos hidroxilo, ester y/o eter seleccionados independientemente en las posiciones 3, 4, 7 11 y 17, las posiciones 3, 4, 11,16 y 17, las posiciones 3, 4, 7, 16 y 17⁰ las posiciones 3, 7, 11, 16, 17. Para estos compuestos, cada resto puede estar en la configuracion ao la configuracion p cuando no esta presente ningun doble enlace en la posicion 4. Por tanto, los sustituyentes en estos compuestos pueden estar respectivamente en las configuraciones 2- y/o 3-p,p,p,p,p-17, 2- y/o 3- p,p,p,p,a-17, 2- y/o 3-p,p,p,a,p-17, 2- y/o 3-p,p,a,p,p-17, 2- y/o 3-p,a,p,p,p-17, 2- y/o 3-a,p,p,p,p-17, 2- y/o 3-P,P,P,a,a-17, 2- y/o 3-p,p,a,p,a-17, 2- y/o 3-p,a,p,p,a-17, 2- y/o 3-a,p,p,p,a-17, 2- y/o 3-p,p,a,a,p-17, 2- y/o 3-p,a,p,a,p-17, 2- y/o 3-a,p,p,a,p-17, 2- y/o 3-p,a,a,p,p-17, 2- y/o 3-a,p,a,p,p-17,2- y/o 3-a,a,p,p,p-17 ⁰ en las configuraciones 2- y/o 3-p,p,a,a,a-17 respectivamente. Los sustituyentes en estos compuestos tambien pueden estar respectivamente en las configuraciones 2- y/o 3-p,a,p,a,a-17, 2- y/o 3-p,a,a,p,a-17, 2- y/o 3-p,a,a,a,p-17, 2-y/o 3-a,p,p,a,a-17, 2- y/o 3-a,p,a,p,a-17, 2- y/o 3-a,p,a,a,p-17, 2- y/o 3-a,a,p,p,a-17, 2- y/o 3-a,a,p,a,p-17, 2- y/o 3-a,a,a,p,p-17, 2- y/o 3-p,a,a,a,a-17, 2- y/o 3-a,p,a,a,a-17, 2- y/o 3-a,a,p,a,a-17, 2- y/o 3-a,a,a,p,a-17, 2- y/o 3-a,a,a,a,p-17⁰ en las configuraciones 2- y/o 3-a,a,a,a,a-17 respectivamente.

Para los compuestos de formula 1 descritos en la presente memoria, la posicion 16 puede estar no sustituida, es decir, uno ⁰ ambos R3 son -H, y puede estar presente un segundo R4 en la posicion 17 en la configuracion a ⁰ en la configuracion p cuando no esta presente ningun doble enlace en la posicion 17. Tales segundos restos R4 incluyen alquilo C ^1-8 opcionalmente sustituido tal como -CH ³ , -C ² H ⁵ , -CF ³ , -C ² F ⁵ , -C=CH ² , -CCH, -CCCH ³⁰ -CCCH ² OH.

Para cualquiera de estos compuestos, la posicion 2 puede estar no sustituida, es decir, R9 es - CH²-. En algunas realizaciones, R9 esta sustituido, por ejemplo, -0-, -CH(OH)-, -CH(ester)- o-CH(eter)- donde el resto hidroxilo, ester ⁰ eter esta en la configuracion a ⁰ p. Restos R9 a modo de ejemplo son -CH(a-OH)-, -CH(P-OH)-, -C(P-CH3)(a-OH)-, -C(a-CH3)(P-OH)-, -CH(a-OCH3)-, -CH(P-OCH3)-, -CH(a-OC(0)CH3)- y -CH(P-OC(0)CH3)-. Otros restos R9 son -CH(a-0C(0)CH2CH3)-, -CH(P-0C(0)CH2CH3)-, -CH(a-OCH2CH3)-, -CH(P-OCH2CH3)-, -C(P-CH3)(a-0C(0)CH3)- y -C(a-CH3)(P-0C(0)CH3)-.

Compuestos biodinamicos. El metodo para identificar ⁰ caracterizar un compuesto biodinamico puede llevarse a cabo como se describio anteriormente. El metodo comprende ademas opcionalmente llevar a cabo un protocolo para determinarsi el compuesto de ensayo modula la actividad ⁰ el nivel del mediador de la respuesta biologica aguda en aproximadamente 20% ⁰ aproximadamente 25% a aproximadamente 70% ⁰ aproximadamente 75% en un ensayo in vitro, en el que opcionalmente el compuesto de ensayo no activa ⁰ antagonista un receptor de glucocorticoides en mas de aproximadamente 10%, aproximadamente 20% ⁰ aproximadamente 30%, cuando se compara con un activador ⁰ antagonista del receptor de glucocorticoides de referencia adecuado, p. ej., dexametasona ⁰ cortisol. Los estimulos agudos ⁰ las agresiones biologicas pueden ser la exposicion del sujeto a una cantidad suficiente de radiacion ionizante ⁰ una serial, compuesto ⁰ composicion proinflamatorios, en las que la serial, compuesto ⁰ composition proinflamatorios son LPS bacteriano o TNFa y/o en las que opcionalmente el mediador de la respuesta biologica aguda es NF-kB o IkB.

Los estimulos agudos o la agresion biologica pueden ser la administration de suficiente LPS bacteriano a un numero suficiente de ratones tratados con farmaco y un numero suficiente de ratones de control tratados con vehiculo y la medicion del efecto del compuesto de ensayo sobre el mediador de la respuesta biologica aguda en el momento en el que (i) la respuesta aguda es maxima o cercana al maximo, opcionalmente aproximadamente a las 1,5 h, p. ej., aproximadamente 70-110 minutos o 75-105 minutos despues de la administration del LPS bacteriano por inyeccion intraperitoneal, y (ii) en uno o dos tiempos de medicion mas antes y/o o despues de la administration de suficiente LPS bacteriano, opcionalmente en un tiempo de medicion antes de la administration de suficiente LPS bacteriano y en un tiempo de medicion posterior despues de que la respuesta aguda sea maxima o proxima al maximo, opcionalmente aproximadamente 2,0 6 2,5 h despues de la administration del LPS bacteriano por inyeccion intraperitoneal, y opcionalmente en el que el mediador de la respuesta biologica aguda es NF-kB o IkB.

La administration de suficiente LPS bacteriano opcionalmente se puede llevar a cabo esencialmente de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria o una variation adecuada de los mismos y en los que opcionalmente, la capacidad del compuesto para modular parcialmente el nivel o la actividad del mediador de la respuesta biologica aguda se Neva a cabo esencialmente de acuerdo con un metodo descrito en la presente memoria o una variation adecuada del mismo.

Otros estimulos o agresiones biologicas que se pueden analizar incluyen la isquemia y reperfusion de uno o mas tejidos isquemicos, quemaduras termicas o quimicas de gravedad relativamente leve, moderada o alta, o la exposition a otras toxinas o venenos. El efecto de la agresion biologica se puede evaluar en diferentes tejidos u organos, por ejemplo, el bazo, sangre, medula osea, pulmon, cerebro, higado, intestino, colon o corazon.

Las variables que se pueden evaluar normalmente incluiran el tiempo o periodo de tiempo en el que el sujeto tiene la respuesta maxima a una agresion biologica dada. En general, las agresiones biologicas produciran una respuesta biologica maxima en los primeros 30 minutos a 48 horas despues de la exposition del sujeto a la agresion. La respuesta maxima por una biomolecula dada a una agresion biologica aguda en general durara de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 2 horas, aunque algunas respuestas empezaran en un periodo de tiempo dado y despues aumentaran a lo largo de un periodo de dias o mas tiempo. El periodo de tiempo de la respuesta biologica maxima es un periodo de tiempo conveniente en el que evaluar la eficacia o mecanismo de action de un candidato a farmaco.

La capacidad del 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol para ejercer un efecto transitorio pero muy potente, que se desvanece y vuelve la funcion normal, se denomina en la presente memoria una respuesta biodinamica (vease el ejemplo 9). Una respuesta biodinamica producida por un “agente biodinamico” tal como el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol contrasta con una “respuesta biostatica” que produce un compuesto como la dexametasona hacia sus biomoleculas efectoras tales como el receptor de glucocorticoides o NF-^kB, al que inhibe indirectamente a traves de la activation del receptor de glucocorticoides. La respuesta biostatica es esencialmente una respuesta de “toda, todo el tiempo” con la potencia biologica de un “agente biostatico” tal como la dexametasona que tiene una variation relativamente pequena en una concentration dada en las celulas o tejidos diana.

Por lo tanto, el efecto farmacodinamico de un agente biostatico varia principalmente con su concentration o propiedades farmacocineticas. A diferencia de esto, los agentes biodinamicos tales como el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol se caracterizan por un efecto farmacodinamico al que le afecta una combination de su concentration en las celulas o tejidos diana y la naturaleza y la intensidad del estimulo biologico subyacente. Por lo tanto, un estimulo biologico producido, por ejemplo, por la exposition a una cantidad potencialmente letal de radiation ionizante tal como rayos y o rayos X o exposition a LPS bacteriano, TNFa u otro agente puede activar o inhibir mediadores de la inflamacion tales como NF-^kB, I^kB, IL-6, proteina C reactiva. En relation con esto, los farmacos biodinamicos pueden presentar una correlation estadistica debil, o no presentar correlation significativa, entre los efectos farmacocineticos y farmacodinamicos comparado con lo que se observa en general para los farmacos biostaticos.

Un aspecto de los farmacos biodinamicos es su capacidad potential para reducir la toxicidad sistemica asociada con los farmacos biostaticos que pueden actuar, al menos en parte, por la modulation de la misma o de similares biomoleculas diana. Los farmacos biostaticos tales como la dexametasona se pueden usar clinicamente para tratar una amplia variedad de afecciones de inflamacion, pero la bioactividad de “toda, todo el tiempo” puede conducir a toxicidad. En el caso de inhibition del NF-kB, la inhibition constante y relativamente completa de su actividad, por ejemplo, inhibition en aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o esencialmente 100% en la mayoria o en todos los tejidos, durante un periodo de tiempo prolongado, p. ej., durante mas de 1, 264 horas a aproximadamente 1, 2, 3 dias o mas, puede dar como resultado efectos secundarios indeseados observables, puesto que es necesario algun nivel base de actividad del NF-^kB para la funcion biologica normal en la mayoria de los tejidos. Es probable que las toxicidades asociadas con el uso de glucocorticoides tales como la dexametasona surjan, al menos en parte, de la detention relativamente completa de las biomoleculas afectadas tales como el NF-kB. A diferencia de estos, los farmacos biodinamicos pueden ejercer una respuesta mas transitoria que puede conducir a una mejora o disminucion de los efectos secundarios toxicos observables.

Otro aspecto de los farmacos biodinamicos es su capacidad para ejercer potencialmente un efecto terapeutico de una forma especifica del tejido. Por lo tanto, la respuesta de un animal a un estimulo tal como la exposicion a una agresion biologica tal como una cantidad potencialmente mortal de LPS bacteriano o la reperfusion de los tejidos afectados despues de isquemia transitoria, se puede poner de manifiesto mediante diferentes grados de activacion del NF-kB en diferentes tejidos. Un farmaco biodinamico podria actuar en tejidos en los que la respuesta del animal es relativamente grande, p. ej., el bazo o tejido cardiaco de raton, mientras que deja la funcion del NF-kB relativamente sin afectar en otros tejidos, p. ej., el cerebro, en el que la respuesta a la agresion biologica es relativamente menor para la biomolecula diana que media al menos parcialmente la respuesta a la agresion biologica.

Los farmacos biodinamicos pueden actuar en parte por su capacidad para inhibir parcialmente biomoleculas diana. Como se describe en el ejemplo 7, el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol y algunos otros compuestos descritos alii, inhiben parcialmente la activacion del NF-^kB en las celulas in vitro, pero la inhibicion completa no se observo nunca en ninguna concentracion. Esto contrastaba con la actividad del farmaco biostatico dexametasona, que con una concentracion suficientemente alta inhibia completamente la actividad del NF-^kB. Esta inhibicion parcial del NF-kB in vitro parece estar parcialmente reflejada por su actividad descrita en este ejemplo. Por lo tanto, en al menos algunos casos, los farmacos biodinamicos se caracterizan por tener una capacidad para inhibir o activar parcialmente una biomolecula diana en un sistema tal como el ensayo in vitro descrito en el ejemplo 7. Parece que la inhibicion del NF-^kB es indirecta, puesto que en este momento no se cree que el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17ptriol y los otros compuestos descritos aqui se unan directamente al NF-kB en el citoplasma o el nucleo.

El protocolo descrito en este ejemplo, o variaciones adecuadas del mismo, se puede usar para caracterizar otros compuestos por su capacidad para actuar como agentes biodinamicos o biostaticos modulando (activando de forma detectable o antagonizando o inhibiendo de forma detectable) moleculas tales como el NF-kB in vivo. Los compuestos tambien se pueden analizar en ensayos in vitro, tal como el ensayo descrito en el ejemplo 7, para caracterizar mejor su mecanismo de accion. Las variaciones adecuadas del protocolo in vivo descrito en este ejemplo, incluyen usar diferentes dosificaciones de los compuestos de ensayo y diferentes vias de administracion, p. ej., un intervalo de dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 350 mg/kg administrada por via oral, bucal, sublingual o parenteral tal como por inyeccion intradermica, subcutanea, intravenosa o intramuscular o por via intranasal o inhalacion en los conductos nasales, organo vomeronasal o alveolos pulmonares o vias respiratorias que conducen a los alveolos, p. ej., bronquios o bronquiolos. Las dosificaciones de ensayo adecuadas tipicamente seran de aproximadamente 1-150 mg/kg. Las biomoleculas que se pueden medir in vivo son biomoleculas tales como IkB, quinasas tales como src quinasa, una map quinasa u otros mediadores de senales descritos en la presente memoria. Dichos metodos de caracterizacion se pueden llevar a cabo en una o mas variedades de sujetos tales como roedores, p. ej., ratas, perros, primates no humanos tales como monos rhesus o macacos cangrejeros. Los grupos de animales que consisten en aproximadamente 3-12 animales por grupo, p. ej., 4-8 animales por grupo, se pueden usar con vehiculos adecuados o controles con placebo, compuestos de ensayo que son farmacos potencialmente biodinamicos, controles de farmacos biodinamicos positivos cono el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17|3-triol, controles de farmacos biostaticos positivos como la dexametasona, y grupos en los que la respuesta del compuesto de ensayo en poblaciones de celulas o tejidos diferentes se comparan frente a uno o mas grupos de referencia, p. ej., referencias con vehiculo o referencias de farmaco biodinamico positivo o negativo o referencias de farmaco biostatico positivo o negativo.

Cuando dichos analisis se aplican a seres humanos, la seleccion de opciones experimentales se reducira de forma natural comparada con otros animales. Los tejidos o muestras humanas tales como sangre, medula osea o liquido de lavado pulmonar son mas facilmente accesibles para el analisis que otros tipos de tejidos tales como el bazo o higado, que hay que obtenerlos mediante tecnicas invasivas. Por lo tanto, en general, los estudios con animales se llevaran a cabo antes o simultaneamente con la evaluacion de la respuesta humana.

Tratamientos para la inflamacion. Un aspecto de la actividad de los compuestos de formula 1 es que pueden reducir la inflamacion afectando a los mediadores de la inflamacion tales como NK-^kB, IL-6 ^o TNFa. La molecula de NK-^kB a menudo es un mediador importante de la inflamacion. La mayor activacion del NK-^kB esta asociada con una variedad de enfermedades inflamatorias y afecciones autoinmunitarias.

Los compuestos de formula 1 se pueden usar para tratar o mejorar sintomas asociados con la inflamacion tales como el dolor, fiebre o fatiga; endometriosis; fiebre; fibromialgia; glomerulonefritis; enfermedad de injerto contra huesped, rechazo de trasplante de organo o tejido, p. ej., trasplante de rinon, pulmon, medula osea o higado; choque hemorragico; fibromialgia; hiperalgesia; enfermedad inflamatoria del intestino; gastritis; sindrome del intestino irritable; colitis ulcerativa; una ulcera peptica; una ulcera por estres; una ulcera sangrante; hiperacidez gastrica; dispepsia; gastroparesis; enfermera de reflujo gastroesofagico; afecciones inflamatorias de una articulacion, incluyendo osteoartritis, artritis psoriasica y artritis reumatoide; enfermedad ocular inflamatoria, que puede estar asociada con, p. ej., trasplante de cornea; isquemia, incluyendo isquemia cerebral (p. ej., lesion cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia o accidente cerebrovascular, cada uno de los cuales puede conducir a neurodegeneracion); enfermedad de Kawasaki; deterioro del aprendizaje; enfermedades pulmonares (p. ej., ARDS); esclerosis multiple; miopatias (p. ej., metabolismo proteico muscular, en especial en la septicemia); neurotoxicidad (p. ej., Inducida por VIH); osteoporosis; dolor, incluyendo dolor relacionado con el cancer; enfermedad de Parkinson; enfermedad de Alzheimer; enfermedad periodontal; parto prematuro; psoriasis; lesion por reperfusion; choque septico; efectos secundarios de la terapia con radiacion; enfermedad de la articulacion temporomandibular; lesion hepatica inducida por el alcohol incluyendo cirrosis alcoholica; fiebre reumatica; sarcoidosis; escleroderma; sindrome de fatiga cronica; afecciones e indicaciones coronarias, incluyendo insuficiencia cardiaca congestiva, reestenosis coronaria, infarto de miocardio, disfuncion miocardica (p. ej., relacionada con la septicemia) y revascularizacion coronaria; alteraciones del sueno; uveitis; poliartritis seronegativa; espondilitis anquilosante; sindrome de Reiter y artritis reactiva; enfermedad de Still; artritis psoriasica; polimiositis; dermatomiositis; escleroderma; esclerosis sistemica; vasculitis (p. ej. enfermedad de Kawasaki); inflamacion resultante de, p. ej., torcedura, esguince o dano del cartilago; curacion de heridas; piel fina o fragil; petequias o equimosis; eritema; y traumatismo. El traumatismo incluye heridas, quemaduras quimicas, quemaduras termicas, quemaduras por radiacion y dano de tejidos u organos asociado con una cirugia tal como una cirugia ortopedica o una cirugia abdominal.

Las afecciones de inflamacion pueden incluir inflamacion asociada con lesion por reperfusion, reestenosis despues de angioplastia, infarto de miocardio o cerebral. Las afecciones o sintomas de inflamacion no deseados incluyen afecciones de inflamacion pulmonar, p. ej., fibrosis quistica, asma agudo, asma cronico, asma resistente a esteroides, bronquitis aguda, bronquitis cronica, enfisema, psoriasis, eczema, sindrome de dificultad respiratoria agudo (ARDS) o enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD).

Afecciones autoinmunitarias. Los compuestos de formula 1 (F1C) y las composiciones descritos en la presente memoria, se pueden usar para tratar, prevenir o ralentizar el avance de las afecciones autoinmunitarias tales como la diabetes de tipo 1, enfermedad de Crohn, artritis, dermatitis de contacto, afecciones de lupus y esclerosis multiple (EM). Las afecciones de EM incluyen la EM de recaida-remision y EM progresiva secundaria. Las afecciones de lupus incluyen lupus eritematoso sistemico, artritis relacionada con lupus eritematoso, cambios en la piel relacionados con lupus eritematoso, anomalias hematologicas relacionadas como lupus eritematoso, insuficiencia renal relacionada con lupus eritematoso, enfermedad cardiaca o pulmonar relacionada con lupus eritematoso, cambios neuropsiquiatricos relacionados con lupus eritematoso, inflamacion de tejidos relacionada con lupus eritematoso, lupus eritematoso discoide, lupus eritematoso cutaneo subagudo y lupus eritematoso inducido por farmacos. La artritis y las afecciones relacionadas incluyen la artritis reumatoide, osteoartritis, fibromialgia, osteoartritis primaria, osteoartritis secundaria, artritis psoriasica, artritis relacionada con lupus eritematoso, artritis asociada con enfermedad inflamatoria del intestino aguda o cronica o colitis, artritis asociada con espondilitis anquilosante, inflamacion de tejidos relacionada con artritis, dolor de las articulaciones, rigidez de las articulaciones, movimiento deteriorado de las articulaciones, hinchamiento de las articulaciones, inflamacion de las articulaciones e inflamacion sinovial.

Los F1C o las composiciones que contienen un F1C y uno o mas excipientes, se pueden usar para tratar, prevenir, retrasar el inicio o ralentizar el avance de afecciones tales como la espondilitis anquilosante, psoriasis, eczema, colitis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino aguda o cronica, lesion renal autoinmunitaria y lesion hepatica. Los F1C se pueden usar para tratar afecciones pulmonares y de las vias respiratorias incluyendo afecciones de asma tales como asma independiente de esteroides, asma grave, asma atopico, asma agudo o asma cronico, rinitis alergica, bronquitis cronica, bronquitis aguda, fibrosis quistica, enfisema, fibrosis pulmonar, hiperreactividad de las vias respiratorias pulmonares, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, edema pulmonary sindrome de dificultad respiratoria agudo.

La encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) es una afeccion experimental en animales que tiene caracteristicas clinicas, histopatologicas e inmunologicas similares a la EM humana, y como la EM humana presenta infiltration en el SNC de linfocitos T y monocitos. La EAE se puede inducir en ratones susceptibles mediante inmunizacion con lipoproteina proteolipidica (PLP) en adyuvantes adecuados. El modelo animal de EAE es un modelo in vivo de EM humana usado para estudiar los mecanismos patogenos de la EM y para caracterizar nuevos agentes para tratar la EM.

Tratamiento de trastornos metabolicos. Los compuestos de formula 1 se pueden usar para tratar, prevenir o ralentizar el avance de trastornos metabolicos tales como la diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, sindrome X, hipercolesterolemia, hiperglucemia, resistencia a la insulina (p. ej., asociada con la obesidad), intolerancia a la glucosa, hipertrigliceridemia, hiperlipoproteinemia, una afeccion de lipodistrofia, sindrome X, arteriosclerosis, aterosclerosis y obesidad. El sindrome X (incluyendo el sindrome metabolico) se define como un conjunto de dos o mas anomalias incluyendo hiperinsulinemia, obesidad, niveles elevados de trigliceridos, acido urico, fibrinogeno, particulas LDL densas pequenas e inhibidor del activador del plasminogeno 1 (PAI-1) y niveles reducidos de HDL-c. Muchos pacientes que tienen resistencia a la insulina pero todavia no han desarrollado la diabetes de tipo 2, tienen tambien el riesgo de desarrollar el sindrome metabolico, denominado tambien sindrome X, sindrome de resistencia a la insulina o sindrome plurimetabolico. El sindrome X tipicamente aparece cuando un paciente tiene dos o mas de hiperlipidemia, hiperinsulinemia, obesidad, resistencia a la insulina, resistencia a la insulina que conduce a la diabetes de tipo 2 y complicaciones diabeticas de la misma, es decir enfermedades en las que la resistencia a la insulina es parte de la fisiopatologia.

Los factores de riesgo independientes que se han asociado con la enfermedad cardiovascular asociada con trastornos metabolicos se pueden tratar con los F1C. Estos factores de riesgo incluyen hipertension, niveles de fibrinogeno aumentados, niveles altos de trigliceridos, colesterol LDL elevado, colesterol total elevado y niveles bajos de colesterol HDL. El tratamiento puede dar como resultado la estimulacion de las celulas p pancreaticas para segregar mas insulina y/o una menor velocidad de perdida de celulas p pancreaticas que se puede producir a lo largo del tiempo en pacientes que tienen diabetes o que son obesos.

El tratamiento de los trastornos metabolicos con un compuesto de formula 1 se pueden combinar con otros tratamientos. La diabetes se puede tratar con un compuesto de formula 1 y uno o mas de una variedad de agentes terapeuticos incluyendo sensibilizadores de insulina, tales como agonistas de PPAR-y tales como glitazonas; biguanidas; inhibidores de la proteina tirosina fosfatasa 1B; inhibidores de la dipeptidil peptidasa IV; insulina; mimeticos de insulina; sulfonilureas; meglitinidas; inhibidores de la a-glucosido hidrolasa; e inhibidores de la aamilasa. La metformina, fenformina, acarbosa y rosiglitazona son agentes que se han usado para tratar algunos tipos de diabetes.

Como se ha indicado antes, las composiciones que contienen un F1C se pueden usar para tratar, prevenir o ralentizar el avance de la resistencia a la insulina o sus sintomas. La resistencia a la insulina es la menor capacidad de la insulina para ejercer su accion biologica a lo largo de un amplio intervalo de concentraciones que producen menos efecto biologico del esperado. Las personas con resistencia a la insulina tienen una menor capacidad para metabolizar de forma adecuada la glucosa y responden mal, si lo hacen, a la terapia con insulina. Los sintomas de la resistencia a la insulina incluyen la insuficiente activacion por la insulina de la captacion de glucosa, oxidacion y almacenamiento en los musculos e inadecuada represion por la insulina de la lipolisis en el tejido adiposo y de la produccion y secrecion de glucosa en las celulas. La resistencia a la insulina puede producir o contribuir al sindrome del ovario poliquistico, intolerancia a la glucosa, diabetes gestacional, hipertension, obesidad y aterosclerosis. Las composiciones de F1C se pueden usar para reducir los niveles de trigliceridos en pacientes que son resistentes a la insulina.

Como se describio anteriormente, la divulgacion incluye un metodo para identificar un compuesto (o “compuesto de prueba”) con potencial para tratar, ralentizar el avance de, ralentizar el inicio de o mejorar un trastorno metabolico o un sintoma del mismo en un ser humano u otro animal. Los compuestos identificados por los metodos se describen generalmente como no activadores de PPAR in vitro e inhibidores de NF-kB incompletos in vitro que tienen una o mas de las actividades escritas, que se obtienen normalmente de observaciones in vivo, por ejemplo, inicio retardado de hiperglucemia o avance ralentizado de una afeccion de diabetes existente. Los compuestos con estas caracteristicas son una nueva clase de compuestos que pueden evaluarse como agentes para tratar estos trastornos .

El metodo comprende seleccionar un compuesto de prueba que (i) no activa uno, dos o tres de PPAR-a, PPAR-y y PPAR-8 en celulas humanas o de mamifero in vitro en mas de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30% o aproximadamente el 40% cuando se compara con celulas humanas o de mamifero de referencia negativas adecuadas in vitro; (ii) inhibe o disminuye la actividad transcripcional o el nivel de NF-^kB en aproximadamente el 20-80% o aproximadamente el 25-75% o aproximadamente el 30-70% o aproximadamente el 35-65% en celulas humanas o de mamifero in vitro cuando se compara con celulas humanas o de mamifero de referencia negativas adecuadas in vitro;{iii) cuando se compara con una referencia normal o referencia negativa adecuada, disminuye la hiperglucemia, ralentiza el avance o retrasa el inicio de la hiperglucemia, aumenta la sensibilidad a la insulina, disminuye la intolerancia a la glucosa, ralentiza el avance o la velocidad de perdida de numeros de celulas de islotes p pancreaticos o su capacidad para secretar insulina, aumenta los numeros de celulas de islotes p pancreaticos o su capacidad para secretar insulina, ralentiza la velocidad de aumento de peso en ratones db/db o ratones con obesidad inducida por la dieta, disminuye los niveles elevados de trigliceridos, disminuye los niveles elevados de colesterol total en sangre o suero, disminuye los niveles normales o elevados de LDL, VLDL, apoB-100 o apoB-48 en sangre o suero o aumenta los niveles normales o bajos de HDL o apoA1 en sangre o suero o disminuye un nivel elevado de fibrinogeno en sangre o suero; y (iv) opcionalmente, no activa uno o mas de un receptor de glucocorticoides, un receptor de androgenos un receptor de estrogenos-a, un receptor de estrogenos-p, un receptor de mineralcorticoides, un receptor de progesterona o una variante biologicamente activa o isoforma de cualquiera de estas biomoleculas en celulas humanas o de mamifero in vitro en mas de aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20% o aproximadamente el 30% cuando se compara con celulas humanas o de mamifero de referencia negativas adecuadas in vitro. Esto permite la identificacion o al menos la caracterizacion parcial de compuestos con potencial para tratar o mejorar el trastorno metabolico en el mamifero.

La actividad del compuesto de prueba puede compararse con un compuesto de referencia adecuado tal como un compuesto de formula 1. El compuesto de formula 1 puede usarse en el metodo como una referencia positiva o un patron de referencia positiva que se adapta a las caracteristicas que proporciona el metodo. Tales compuestos incluyen 17a-etinilandrost-5-en-3p,7p,17p-triol y androst-5-en-3p,7p,16a,17p-tetrol. Otros compuestos de formula 1 pueden usarse como referencias negativas o patrones de referenda que pueden mostrar ninguna, una o dos de las tres caracteristicas requeridas. Tales compuestos incluyen 16a-bromoepiandrosterona, 16a-bromo-3p,17pdihidroxiandrost-5-eno y 16a-hidroxiepiandrosterona.

La divulgation incluye la determination del efecto de un compuesto de prueba sobre una o mas afecciones o sintomas asociados con una enfermedad o trastorno metabolico. Normalmente, tales determinaciones se comparan con una referenda negativa o referenda normal adecuada o con una referenda positiva adecuada y la determinacion se realiza en un ser humano o un animal in vivo, aunque la determinacion puede realizarse en ocasiones in vitro en celulas completas o lisados celulares.

Las disminuciones en la hiperglucemia puede observarse como una disminucion en el nivel de glucosa en sangre o suero hasta un intervalo en ayuno normal, que para seres humanos de al menos 2 anos de edad es de aproximadamente 70 mg/dl a 105 mg/dl o 115 mg/dl, estando presente hiperglucemia a niveles de glucosa en ayuno de aproximadamente 135 mg/dl o aproximadamente de 140 mg/dl a 200 mg/dl, 300 mg/dl o 350 mg/dl. Niveles de glucosa por encima de aproximadamente 400 mg/dl son potencialmente mortales. La glucosa posprandial en sangre o suero normalmente se mide a las 2 horas tras la ingestion de hidratos de carbono, al menos 75 g para seres humanos, seguido por una extraction de sangre para medir la glucosa. Niveles de glucosa en seres humanos de 140 mg/dl a 200 mg/dl en sangre o suero posprandial indican una afeccion de hiperglucemia y un nivel de glucosa por encima de 200 mg/dl identifica diabetes mellitus humana. Para los seres humanos, normalmente en pacientes que tienen un nivel de glucosa en ayunas normal de 70-115 mg/dl, puede realizarse una prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) usando sangre. En la OGTT para seres humanos, si el nivel de glucosa pico (normalmente a los 30 min o 1 hora despues de la alimentation) y 2 horas despues de que los valores tras los hidratos de carbono esten por encima de 200 mg/dl en dos o mas ocasiones, indica que el paciente tiene diabetes mellitus.

Un sustituto para la glucosa en sangre en seres humanos es la medicion de la hemoglobina glicosilada o Hb A1c, que se usa, por ejemplo, para monitorizar un tratamiento de diabetes. La medicion de la Hb A1c permite la evaluation de los niveles de azucar o glucosa en sangre a lo largo de 100 a 120 dias antes de la prueba y es insensible a variaciones a corto plazo tales como una comida reciente o un estado de ayuno. Niveles de Hb A1c del 2,2-48% son normales en adultos, mientras que niveles del 2,5-5,9% indican un buen control de la diabetes, niveles del 6-8% indican un control razonable de la diabetes y niveles por encima del 8% e Hb A1c indican un control deficiente de una afeccion de diabetes. Procedimientos para realizar e interpretar estos y otros protocolos relacionados se han descrito, por ejemplo, por K.D. Pagana y T.J. Pagana, Mosby's Diagnostic and Laboratory Test Reference, 5a edition, 2001, Mosby Inc., paginas 441-448, 451-458, 507-509. Se usan tratamientos con un compuesto de formula 1 para disminuir Hb A1c, lo que se correlaciona con tratamiento o control mejorado de la diabetes.

El uso de los metodos descritos aqui puede dar como resultado normalization, por ejemplo, volver a niveles dentro de limites o intervalos normales o limites o intervalos casi normales de glucosa, sustituto de glucosa u otros valores tales como niveles de proteinas de fase reactiva o componentes lipidicos tales como el colesterol total. Normalmente se observa normalizacion de los valores de glucosa o un sustituto como un nivel elevado de glucosa o sustituto que disminuye hasta dentro de aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 3% o aproximadamente el 5% de un nivel de glucosa normal o dentro de aproximadamente el 5% o aproximadamente el 8% de un valor de sustituto de glucosa normal. Se han descrito valores de glucosa para otras especies y pueden usarse mediciones o ensayos similares en los metodos dados a conocer para esas especies. Normalmente se observa normalizacion de otros valores como una vuelta a un nivel alto o bajo de manera anomala hasta dentro de aproximadamente el 2% o de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 6%, aproximadamente el 10% o aproximadamente el 12% del extremo superior o inferior del intervalo normal de valores para la especie de sujetos.

Los compuestos identificados por los metodos descritos en la presente memoria se pueden usar para ralentizar el avance o retrasar el inicio de hiperglucemia o para aumentar la sensibilidad a la insulina en la resistencia a la insulina cuando existen o cuando se espera razonablemente que se desarrollen. Otros efectos de los compuestos incluyen una disminucion de la intolerancia a la glucosa, ralentizacion del avance o de la velocidad de perdida del numero de celulas b de los islotes pancreaticos o de su capacidad para secretar insulina o mayor numero de celulas b de islotes pancreaticos o de la capacidad para secretar insulina.

Los metodos pueden llevarse a cabo en sujetos obesos. La obesidad o “sobrepeso” para seres humanos, como se usa en la presente memoria, se refiere en general a (1) hombres adultos que tienen un indice de masa corporal de aproximadamente 26 kg/m2, 27 kg/m2, 28 kg/m2, 29 kg/m2, 30 kg/m2, 31 kg/m2, 32 kg/m2 o mayor y mujeres adultas que tienen un indice de masa corporal de al menos aproximadamente 26 kg/m2, 27 kg/m2, 28 kg/m2, 29 kg/m2, 30 kg/m2, 31 kg/m2, 32 kg/m2 o mayor o (2) una afeccion de obesidad o sobrepeso, tal como se evalua por un profesional sanitario tal como un medico o enfermero. La determinacion de la obesidad para, por ejemplo, un ser humano, puede tener en cuenta el contenido y la distribucion de la grasa corporal, puesto que algunas personas con un indice de masa corporal alto pueden no ser tecnicamente obesas debido a una alta cantidad de tejido muscular en lugar de tejido adiposo o debido a cantidades significativas de grasa corporal o tejido adiposo en zonas del cuerpo distintas del abdomen, por ejemplo, las caderas o la pelvis. La obesidad y el indice de masa corporal se han descrito, por ejemplo, por G.A. Colditz, Med. Sci. Sports Exerc., 31(11), Supl., pags. S663-S667, 1999, F.J. Nieto-Garcia et al., Epidemiology, 1 (2): 146-152, 1990, R.H. Eckel, Circulation, 96:3248-3250, 1999.

Los compuestos identificados por los metodos descritos en la presente memoria no activan significativamente uno o mas de un receptor de mineralcorticoides, un receptor de progesterona, un receptor de glucocorticoides, un receptor de androgenos un receptor de estrogenos-a, receptor de estrogenos-p o una variante biologicamente activa de cualquiera de estas biomoleculas en celulas humanas o de mamifero in vitro en mas de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20% o aproximadamente el 30% cuando se compara con celulas humanas o de mamifero de referencia negativas adecuadas, normalmente tal como se determina en un ensayo in vitro. Se han descrito metodos para medir estas actividades, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.298.429. En un metodo a modo de ejemplo, un ensayo para evaluar si un compuesto de prueba es un ligando funcional para una proteina receptora de hormonas, o una forma modificada u obtenida por ingenieria genetica funcional de la misma, comprende: (a) cultivar celulas que contienen: ADN no endogeno que expresa la proteina receptora de hormonas, o la forma modificada u obtenida por ingenieria genetica funcional de la misma, y ADN que codifica para un elemento de respuesta a la hormona operativo unido a un gen indicador, en el que el cultivo se realiza en presencia de al menos un compuesto de prueba cuya capacidad para funcionar como ligando o modulador para la proteina receptora de hormonas, o forma modificada u obtenida por ingenieria genetica funcional de la misma, se busca determinar, y (b) someter a ensayo para demostrar la transcripcion de dicho gen indicador en dichas celulas. Este ensayo se realizara normalmente usando celulas de mamifero, por ejemplo, celulas CV-1 o COS. El gen indicador puede estar contenido en un plasmido indicador donde el ADN no endogeno, que expresa la proteina receptora de hormonas o forma modificada funcional de la misma, esta contenido en un plasmido de expresion, en el que dicho indicador y plasmidos de expresion tambien contienen el origen de replicacion de SV-40. Ademas, el gen indicador puede estar contenido en un plasmido indicador, en el que el ADN no endogeno, que expresa la proteina receptora de hormonas o forma modificada funcional de la misma, esta contenido en un plasmido de expresion, donde el indicador y los plasmidos de expresion tambien contienen un marcador seleccionable. Ensayos relacionados pueden usar celulas transfectadas de manera estable con genes indicadores detectables, por ejemplo, como se describe para el receptor de estrogenos-p (ensayo basado en celulas, EPp-UAS-bla GripTite™, numero de catalogo K1091, Invitrogen Corp.), el receptor de estrogenos-a (ensayo basado en celulas 293, ERa-UAS-bla GripTite™, numero de catalogo K1090, Invitrogen Corp.), el receptor de androgenos (ensayo basado en celulas 293 MSR, AR-UAS-bla GripTite™, numero de catalogo K1082, Invitrogen Corp.) o el receptor de progesterona (ensayo de receptor de progesterona-UAS-bla HEK293T, numero de catalogo K1103, Invitrogen Corp.).

En la presente memoria se da a conocer un metodo para identificar o caracterizar una actividad biologica de un compuesto con potencial para tratar o mejorar un trastorno metabolico en un mamifero, que comprende seleccionar un compuesto que (i) no activa uno, dos o tres de PPAR-a, PPAR-y y PPAR-8 en celulas humanas o de mamifero in vitro en mas de aproximadamente el 30% cuando se compara con celulas humanas o de mamifero de referencia negativas adecuadas in vitro; (ii) inhibe o disminuye la actividad transcripcional o el nivel de NF-kB en aproximadamente el 20-80% en celulas humanas o de mamifero in vitro cuando se compara con celulas humanas o de mamifero de referencia negativas adecuadas in vitro; (iii) cuando se compara con una referencia normal o referencia negativa adecuada, disminuye la hiperglucemia, ralentiza el avance o retrasa el inicio de la hiperglucemia, aumenta la sensibilidad a la insulina, disminuye la intolerancia a la glucosa, ralentiza el avance o la velocidad de perdida de numeros de celulas de islotes p pancreaticos o su capacidad para secretar insulina, aumenta los numeros de celulas de islotes p pancreaticos o su capacidad para secretar insulina, ralentiza la velocidad de aumento de peso en ratones db/db o en sujetos con obesidad inducida por la dieta o relacionada con la dieta, disminuye los niveles elevados de trigliceridos, disminuye los niveles elevados de colesterol total en sangre o suero, disminuye los niveles normales o elevados de LDL, VLDL, apoB-100 o apoB-48 en sangre o suero o aumenta los niveles normales o bajos de HDL o apoA1 en sangre o suero o disminuye un nivel elevado de fibrinogeno en sangre o suero; (iv) opcionalmente, no activa uno o mas de un receptor de glucocorticoides, un receptor de mineralcorticoides, un receptor de progesterona, un receptor de androgenos un receptor de estrogenos-a, receptor de estrogenos-p o una variante biologicamente activa de cualquiera de estas biomoleculas en celulas humanas o de mamifero in vitro en mas de aproximadamente el 30% cuando se compara con celulas humanas o de mamifero de referencia negativas adecuadas in vitro; y (v) opcionalmente inhibe el nivel o la actividad de una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) o una 1 ip-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11 p-HSD), opcionalmente 11P-HSD de tipo 1 o 11P-HSD de tipo 2 o el nivel de un ARNm que codifica para PEPCK o 11P-HSD, en hepatocitos o celulas derivadas del higado in vitro o en celulas o tejido hepatico obtenido de celulas o tejido hepatico in vivo. El metodo permite la identification o caracterizacion del compuesto con potencial para tratar o mejorar el trastorno metabolico en un ser humano u otro mamifero. La enzima PEPCK puede ser de origen citosolico o mitocondrial.

Afecciones de perdida osea. Las composiciones que contienen un F1C y uno o mas excipientes, se pueden usar para tratar, prevenir, retrasar el inicio o ralentizar el avance de la perdida osea o trastornos de osteopenia descritos en la presente memoria, p. ej., una afeccion de osteoporosis tal como osteoporosis primaria, osteoporosis postmenopausica o de tipo 1, osteoporosis involutiva o de tipo 2, osteoporosis idiopatica, una osteoporosis secundaria tal como una afeccion de perdida osea asociada a glucocorticoides y perdida osea asociada con un traumatismo tal como una quemadura termica, quimica o por radiation de primer, segundo o tercer grado. Los tratamientos con F1C pueden mejorar la masa osea, densidad osea y/o resistencia osea.

Productos farm ace uti cos. La divulgacion proporciona un producto farmaceutico para el tratamiento de una afeccion inflamatoria. El producto farmaceutico tipicamente comprende (a) el farmaco en una forma farmaceutica tal como una formulacion solida o Ifquida adecuada para, por ejemplo, la administracion oral o parenteral. El envase del farmaco y/o un inserto o etiqueta en el envase tendran informacion sobre la eficacia del farmaco, mecanismo de accion, poblacion de pacientes a la que va dirigido, dosificacion, regimen de dosis, via de administracion, toxicidad de la agresion biologica o la gravedad de la agresion que se puede tratar usando el farmaco, si se conoce. Cuando la agresion biologica es exposicion a radiacion, el inserto o etiqueta del envase puede contener informacion sobre la dosis de radiacion o el intervalo de dosis para el que el medicamento se puede usar o esta aprobado. El producto farmaceutico puede contener opcionalmente una agenda o instrucciones de uso para que el paciente recuerde cuando o como usar el farmaco, o que sintomas o efectos del farmaco experimenta el usuario del farmaco durante o despues del uso del farmaco. Este se puede usar para ayudar en los analisis de fase IV o de postcomercializacion sobre la eficacia del farmaco o los efectos secundarios. Otros ejemplos de productos farmaceuticos se describen en otros ejemplos descritos en la presente memoria.

Un producto farmaceutico como se usa en la presente memoria, significa un producto que ha sido revisado y aprobado para la comercializacion o venta, por una agenda o entidad reguladora con autoridad para revisar o aprobar solicitudes de venta o uso medico, por ejemplo, la Agenda de alimentos y medicamentos de EE.UU. o la Agenda de evaluacion de medicamentos europea. Los usos de productos farmaceuticos incluyen su comercializacion o ventas y ofertas para vender o comprarlo para su estudio. Estas actividades tipicamente se adhieren a los terminos de aprobacion de la normativa que pueden afectar o controlar la comercializacion, ventas, compras o manipulaciones del producto. El farmaco en un producto farmaceutico puede ser un nuevo farmaco, un farmaco generico, un producto biologico, un dispositivo medico o un protocolo para usar cualquiera de estos. El producto farmaceutico normalmente resulta de la aprobacion de comercializacion por la Agenda de alimentos y medicamentos de EE.UU. o la Agenda de evaluacion de medicamentos europea, de una nueva solicitud de farmaco de EE.UU. o no EE.UU., una solicitud de nuevo farmaco abreviada, una solicitud de licencia biologica o una solicitud para comercializar un dispositivo medico. Los usos para el producto farmaceutico incluyen su venta al publico o compradores privados tales como el Departamento de Defensa de EE.UU., el Departamento de Energia de EE.UU., el Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU. o un comprador de farmacos privado o entidad distribuidora. Otros usos incluyen el uso del farmaco para tratar afecciones medicas indicadas o aprobadas y usos aprobados por el medico o usos fuera de lo indicado en la etiqueta. La aprobacion previa de los productos farmaceuticos son otro aspecto de la divulgacion, que pueden ser esencialmente los mismos que los productos farmaceuticos descritos en la presente memoria, pero se pueden usar para preparar un farmaco para la comercializacion o la revision reguladora antes de la aprobacion de comercializacion.

La poblacion de pacientes a la que va dirigido identificada por el producto farmaceutico tambien puede especificar poblaciones excluidas, si las hay, lo que se puede aplicar por ejemplo a pacientes pediatricos o pacientes ancianos. La informacion sobre la dosificacion tipicamente especificara la dosis diaria del farmaco, mientras que el regimen de dosis describira con que frecuencia y durante cuanto tiempo se va a administrar o tomar el farmaco. La via de administracion identificara una o mas vias que son adecuadas para usar el farmaco, aunque normalmente una formulacion dada estara aprobada para una sola via de administracion. Las dosificaciones, regimenes de dosis y vias de administracion que el envase o etiqueta pueden identificar se describen en otra parte en la presente memoria.

El producto farmaceutico puede ser para el tratamiento, prevencion o mejora de una afeccion inflamatoria u otra afeccion descrita en la presente memoria y comprende o incluye una formulacion que contiene un compuesto, tal como un compuesto de formula 1, formulado con 1, 2, 3, 4 o mas excipientes para la administracion oral o parenteral, p. ej. inyeccion intramuscular, subcutanea o subdermica, con un inserto o etiqueta en el envase que describe la administracion de una dosis diaria de, p. ej., 0,5 mg, 1 mg, 4 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg o 500 mg de un compuesto de formula 1 de acuerdo con la invencion durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas dias consecutivos empezando despues de haber diagnosticado u observado de otra forma la enfermedad o afeccion. La informacion que el inserto o etiqueta del envase pueden contener incluye informacion sobre las respuestas biologicas al farmaco o al regimen de tratamiento. La informacion puede incluir una descripcion de uno o mas de (a) una o mas efectos secundarios o toxicidades asociadas con el uso del farmaco en seres humanos o mamiferos tales como primates no humanos, (b) su efecto en la inflamacion u otra afeccion, (c) protocolos o instrucciones para el uso de agentes terapeuticos adicionales tales como dexametasona u otros glucocorticoides con el farmaco, y (d) el tiempo o el periodo de tiempo en el que debe iniciarse la administracion del farmaco para el efecto terapeutico mejor o conocido.

Ademas, se describe un metodo en la presente memoria para identificar un compuesto con potencial para modular de manera detectable los numeros o la actividad de celulas T reguladoras CD4+CD25+, celulas T reguladoras CD4+CD25+CD103+, celulas T reguladoras CD4+CD25alt°CD103+ o celulas T reguladoras CD4+CD25alt° en un mamifero, que comprende seleccionar un compuesto que (i) no activa o inhibe uno o mas de un receptor de glucocorticoides, un receptor de androgenos un receptor de estrogenos-a, receptor de estrogenos-p o una variante biologicamente activa de cualquiera de estas biomoleculas en celulas humanas o de mamifero in vitro en mas de aproximadamente el 30% cuando se compara con celulas humanas o de mamifero de referencia adecuadas in vitro; (ii) tiene un peso molecular de aproximadamente 100-1000 Daltons, opcionalmente un peso molecular de aproximadamente 250-850 Daltons; (iii) cuando se compara con una referenda negativa o referenda normal adecuada, aumenta o disminuye los numeros o la actividad de celulas T reguladoras CD4+CD25+, celulas T reguladoras CD4+CD25+CD103+, celulas T reguladoras CD4+CD25alt°CD103+o celulas T reguladoras CD4+CD25alt° en mas del 20% en un ensayo adecuado; y (iv) opcionalmente inhibe o disminuye la actividad transcripcional o el nivel de NF-kB en aproximadamente el 20-80% en celulas humanas o de mamifero in vitro cuando se compara con celulas humanas o de mamifero de referenda negativas adecuadas in vitro. Los compuestos de formula 1 y otros compuestos pueden usarse en estas realizaciones esencialmente como se describe en los ejemplos 20 o 21 a continuacion.

Los compuestos in vitro o in vivo que aumentan o disminuyen la actividad o los numeros de determinados subconjuntos de celulas T tales como celulas T CD4+CD25+ y celulas T CD4+CD25alt° son candidates para tratar o ralentizar el inicio o el avance de afecciones autoinmunitarias, cancer, traumatismo neurologico o trastornos tales como perdida neuronal tras un traumatismo tal como isquemia y enfermedades metabolicas tales como diabetes tipo I, aterosclerosis, rechazo de celulas, organos o tejidos en trasplantes autologos y enfermedad de injerto contra huesped en situaciones en las que estas afecciones existen o pueden producirse. Los tratamientos pueden usarse para mejorar la cicatrizacion de heridas, tratar la lesion por reperfusion, estenosis, reestenosis tras angioplastia, infarto de miocardio o cerebral. Las realizaciones incluyen compuestos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 2.000 Daltons, menos de aproximadamente 1.000 Daltons o menos de aproximadamente 500 Daltons. Un grupo de compuestos tiene un peso molecular de aproximadamente 285 o 290 a aproximadamente 500 6 650 Daltons. Las respuestas de las celulas Treg pueden observarse como un aumento o disminucion de aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 100%, aproximadamente el 200%, aproximadamente el 400%, aproximadamente el 600%, aproximadamente el 1000%, aproximadamente el 2000%, aproximadamente el 5000%, aproximadamente el 10000% o mas en los numeros de celulas Treg, normalmente celulas T CD4+CD25+ o celulas T CD4+CD25alt°, en sujetos o en ensayos in vitro tratados con el compuesto, en comparacion con referencias negativas adecuadas. Estos cambios pueden observarse como aumentos o disminuciones en los numeros de celulas Treg o en su actividad en la sangre circulante o en celulas in vitro o in vivo.

Los metodos para analizar perfiles de subconjuntos de celulas tales como los perfiles de linfocitos T, se pueden obtener de cualquiera de una variedad de metodos, incluyendo la citometria de flujo (FACS), por ejemplo, Levy et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 35:328, 1985. En el analisis por FACS, los anticuerpos monoclonales contra una variedad de subconjuntos de celulas se unen e identifican antigenos de superficie fenotipicos que estan presentes en las celulas. Existen anticuerpos disponibles en el comercio que pueden detectar la presencia de estos marcadores, de modo que en general no es necesaria la preparation de los anticuerpos. Se espera que los anticuerpos que identifican el mismo o un marcador antigenico estrechamente vinculado den resultados de diagnostico similares. Por lo tanto, cuando se designa un marcador antigenico en la memoria descriptiva o las reivindicaciones por referenda a un anticuerpo monoclonal particular con el que se une, p. ej., CD4 o CD25, dicha designation incluye este marcador incluso si se usan anticuerpos monoclonales diferentes en la identification. Los marcadores fenotipicos de interes incluyen marcadores generates para diferentes tipos de subconjuntos de celulas, incluyendo CD3 para linfocitos T totales, CD4 para linfocitos T auxiliares/inductores, CD8 para linfocitos T supresores/citotexicos, y CD16/56 para celulas NK; subconjunto de marcadores que expresan CD8 tales como CD11b para linfocitos T supresores, CD38 para linfocitos T supresores/citotexicos activados, HLA-DR para linfocitos T supresores/citotexicos activados y CD57; y marcadores que expresan CD4 tales como CD25 y HLA-DR para linfocitos T auxiliares/inductores activados, incluyendo celulas Treg.

Protocolos o metodos de dosificacion. Cuando se trata cualquiera de las afecciones o smtomas descritos en la presente memoria, se puede administrar de forma continua (diaria) o de forma intermitente el/los compuesto(s) de formula 1, a un sujeto que padece o es susceptible de padecer la afeccion o sintoma. Cuando se trata una afeccion tal como una afeccion inflamatoria u otra afeccion descrita en la presente memoria con un compuesto de formula 1, la dosificacion intermitente podria evitar o mejorar algunos de los aspectos indeseados que normalmente estan asociados con la suspension de la dosificacion. Dichos aspectos indeseados incluyen el fracaso del paciente o sujeto para adherirse a un regimen de dosificacion diaria o la reduction de las dosificaciones de otros agentes terapeuticos tales como glucocorticoides y/o de sus efectos secundarios o toxicidades indeseados asociados tales como la perdida osea o la resorcion.

La dosificacion diaria puede continuar mientras la enfermedad o los smtomas sean evidentes, tipicamente para afecciones cronicas. La dosificacion diaria puede continuar durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9610 dias consecutivos y despues le seguira un periodo sin dosificacion hasta que sea necesaria de nuevo, o si es necesaria. Estos ejemplos tipicamente implican el tratamiento de afecciones agudas que pueden o no reaparecer de vez en cuando. El tratamiento de afecciones cronicas tipicamente implicate la dosificacion diaria continua durante periodos de tiempo prolongados.

En cualquiera de los regimenes de dosificacion continuo (diario) o intermitente, o en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades, afecciones o sintomas descritos en la presente memoria, el/los compuesto(s) de formula 1 se puede(n) administrar por una o mas vias adecuadas, por ejemplo, por via oral, bucal, sublingual, topica, intramuscular, subcutanea, subdermica, intravenosa, intradermica o mediante un aerosol.

La dosis diaria normalmente es de aproximadamente 0,05 mg/kg/dia a aproximadamente 200 mg/kg/dia. Los intervalos de dosis tipicos son de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/kg/dia, incluyendo aproximadamente 0,2 mg/kg/dia, 0,5 mg/kg/dia, aproximadamente 1 mg/kg/dia, aproximadamente 2 mg/kg/dia, aproximadamente 4 mg/kg/dia, aproximadamente 5 mg/kg/dia, aproximadamente 6 mg/kg/dia, aproximadamente 8 mg/kg/dia, aproximadamente 10 mg/kg/dia, aproximadamente 20 mg/kg/dia, aproximadamente 40 mg/kg/dia o aproximadamente 100 mg/kg/dia. Tambien se pueden usar dosificaciones mayores, p. ej. aproximadamente 250 mg/kg/dia, aproximadamente 300 mg/kg/dia o aproximadamente 350 mg/kg/dia, por ejemplo en aplicaciones veterinarias. El/los compuesto(s) de formula 1 se puede(n) administrar por via oral o parenteral usando de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg/dia o aproximadamente 2-40 mg/kg/dia. Dicha dosificacion dara tipicamente un nivel en el suero del compuesto de formula 1 de aproximadamente 4 ng/ml o aproximadamente 8 ng/ml a aproximadamente 125 ng/ml o aproximadamente 250 ng/ml, p. ej., de aproximadamente 15 ng/ml a aproximadamente 120 ng/ml o de aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. Dicho nivel en el suero puede ser transitorio, p. ej., que dure de aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 60 minutes a aproximadamente 2 horas o aproximadamente 8 horas, lo cual puede ocurrir durante los dias en que se administra el compuesto o durante un tiempo posterior para las formulaciones de deposito.

La dosificacion diaria continua normalmente se usa para tratar las afecciones cronicas descritas en la presente memoria. Las dosis diarias normalmente se dan como una sola dosis, pero las dosis diarias se pueden dividir en 26 3 subdosis. Los protocolos de dosificacion intermitente incluyen la administracion de un compuesto de formula 1 en dias alternos o cada tercer dia durante un periodo de tiempo adecuado. Cuando se tratan deficiencias de globulos rojos la dosificacion normalmente empezara el mismo dia que el sujeto experimenta un suceso mieloablativo de corta duracion tal como la exposicion a una radiacion. Para sucesos de duracion mas prolongada, por ejemplo quimioterapia del cancer, la dosificacion con el compuesto de formula 1 puede empezar aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 dia, aproximadamente 2 dias o aproximadamente 3 dias despues de haber administrado un agente de quimioterapia al sujeto. La dosificacion diaria puede continuar durante periodos definidos seguidos de un periodo de tiempo fijo o variable sin dosificacion. En estas realizaciones, una exacerbacion de una enfermedad tal como una exacerbacion de esclerosis multiple, artritis, asma, colitis o enfermedad de Crohn, se pueden tratar con una dosificacion diaria durante 3-14 dias consecutivos o 5-10 dias consecutivos, seguido de un periodo sin tratamiento hasta que se produzca o empiece otra exacerbacion.

Afecciones v sintomas clinicos. Los compuestos y metodos descritos en la presente memoria son utiles para tratar, mejorar, prevenir o ralentizar el avance de afecciones descritas en la presente memoria y/o uno o mas de sus sintomas. Dichos usos incluyen inhibir la resorcion osea, reducir los efectos secundarios indeseados asociados o causados por una quimioterapia, por ejemplo, glucocorticoides antiinflamatorios, tratar, prevenir o ralentizar la osteoporosis y las fracturas oseas, inhibir la reestenosis vascular y tratar la retinopatia diabetica, degeneracion macular, inflamacion. Las afecciones o sintomas inflamatorios indeseados, tales como afecciones inflamatorias pulmonares, p. ej., fibrosis quistica, asma agudo o cronico, asma bronquial, asma atopico, ARDS o COPD o trastornos autoinmunitarios tales como la osteoartritis, artritis reumatoide, una pancreatitis tal como pancreatitis autoinmunitaria, lupus eritematoso sistemico, inflamacion de tejidos relacionada con lupus eritematoso, artritis relacionada con lupus eritematoso, cambios de la piel relacionados con lupus eritematoso, anomalias hematologicas relacionadas con lupus eritematoso, insuficiencia renal relacionada con lupus eritematoso, enfermedad cardiaca o pulmonar relacionada con lupus eritematoso y cambios neuropsiquiatricos o neurologicos relacionados con lupus eritematoso.

Los sintomas de las afecciones que se pueden tratar incluyen fiebre, dolor en articulaciones (artralgias), artritis, y serositis (peluritis o pericarditis). Tambien se puede usar la administracion de otros agentes en los presentes tratamientos. Por lo tanto, el dolor se puede tratar usando farmacos antiinflamatorios no esteroideos, tales como aspirina, salicilatos, ibuprofeno, naproxeno, clinoril, oxaprozina y tolmetina. Las caracteristicas cutaneas del lupus sistemico se pueden tratar con farmacos antimalaria, tales como hidroxicloroquina, cloroquina y quinacrina. Los retinoides tales como isotretinoina y etretinato tambien se pueden usar para tratar los sintomas de la piel en combinacion con los compuestos descritos en la presente memoria. El dano de organos se puede tratar con corticosteroides, normalmente administrados por via oral o intravenosa. Los corticosteriodes que se pueden usar incluyen hidrocortisona (cortisol), corticosterona, aldosterona, ACTH, triamcinolona y derivados tales como diacetato de triamcinolona, hexacetonido de triamcinolona, y acetonido de triamcinolona, betametasona y derivados tales como dipropionato de betametasona, benzoato de betametasona, fosfato de sodio y betametasona, acetato de betametasona, y valerato de betametasona, flunisolida, prednisona y sus derivados, fluocinolona y derivados tales como acetonido de fluocinolona, diflorasona y derivados tales como diacetato de diflorasona, halcinonida, dexametasona y derivados tales como dipropionato de dexametasona y valerato de dexametasona, desoximetasona, diflucortolona y derivados tales como valerato de diflucortolona), acetonido de fluclorolona, fluocinonida, fluocortolona, fluprednideno, flurandrenolida, clobetasol, clobetasona y derivados tales como butirato de clobetasona, alclometasona, flumetasona, y fluocortolona.

Cuando la administracion oral de corticosteroides es insuficiente, se puede usar la terapia con pulsos de metilprednisolona intravenosa (dosis alta) para tratar la nefritis lupica y otras manifestaciones no renales graves, tales como la anemia hemolitica, inflamacion del sistema nervioso central (cerebritis), recuento bajo de plaquetas y pleuropericarditis grave.

Los compuestos de formula 1 se pueden usar para tratar, prevenir o ralentizar el avance de la osteoporosis o fracturas oseas. El tratamiento de los sujetos puede conducir al fortalecimiento de los huesos y/o a la menor perdida de masa osea o minerales, dando como resultado una mayor resistencia a las fracturas. Como se usan la presente memoria, “ tratar” afecciones tales como las descritas en la presente memoria, significa que el tratamiento puede dar como resultado la mejora, prevencion o el avance ralentizado de las afecciones, y/o la mejora, prevencion o avance ralentizado de uno o mas sintomas de dichas afecciones.

Los compuestos de formula 1 se pueden usar para tratar, prevenir o ralentizar el avance o un retrasar el inicio de enfermedades metabolicas tales como la diabetes tipo 1, la diabetes de tipo 2, hiperglucemia, el resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipoproteinemia, lipodistrofia, sindrome X y aterosclerosis.

Formulaciones v composiciones para preparar formulaciones. La divulgacion incluye formulaciones descritas aqui y en otras partes en esta descripcion. Aunque se puede(n) administrar el/los compuesto(s) de formula 1 solo(s), es habitual presentarlo(s) como formulaciones. Las formulaciones, tanto para uso veterinario como para uso humano, comprenden al menos un compuesto de formula 1, junto con uno o mas excipientes y opcionalmente uno o mas ingredientes terapeuticos adicionales.

Las formulaciones incluyen composiciones que comprenden 1, 2, 3, 4 o mas excipientes o vehiculos farmaceuticamente aceptables. Las composiciones se usan para preparar formulaciones adecuadas para uso humano o animal. Las vias de administracion adecuadas para las formulaciones incluyen la via oral, rectal, nasal, topica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal, rectal y parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa, intradermica, intratecal, intraocular y epidural). En general, se suministran formulaciones liquidas acuosas o no acuosas o cremas por una via parenteral, oral o topica. El/los compuesto(s) de formula 1 puede(n) estar presente en forma de una formulacion liquida acuosa o no acuoso o una formulacion solida adecuadas para la administracion por cualquiera de las vias descritas en la presente memoria, por ejemplo, por via oral, topica, bucal, sublingual, parenteral, aerosol inhalado o un deposito tal como un deposito subcutaneo o un deposito intraperitoneal o intramuscular. Se observara que la via preferida puede variar, por ejemplo, con la afeccion patologica del sujeto o el peso o la respuesta del sujeto a la terapia con un compuesto de formula 1 u otra terapia que se usa o que es adecuada a las circunstancias.

Las formulaciones incluyen las adecuadas para las vias de administracion anteriores. Las formulaciones se pueden presentar de forma conveniente en una forma farmaceutica unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica de la farmacia. Las tecnicas, excipiente y formulaciones en general se encuentran, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 1985, 17a edicion, Nema et al., PDA J. Pharm. Sci. Tech. 199751:166-171, G. Cole, et al., editors, Pharmaceutical Coating Technology, 1995, Taylor & Francis, ISBN 0 136628915, H.A. Lieberman, et al., editors, Pharmaceutical Dosage Forms, 1992, 2a edicion revisada, volumenes 1 y 2, Marcel Dekker, ISBN 0824793870, J.T. Carstensen. Pharmaceutical Preformulation, 1998, paginas 1-306, Technomic Publishing Co. ISBN 1566766907. Los excipientes de ejemplo para las formulaciones incluyen cera emulsionante, galato de propilo, acido citrico, acido lactico, polisorbato 80, cloruro sodico, palmitato de isopropilo, glicerina, vaselina blanca y otros excipientes descritos en la presente memoria.

Las formulaciones o composiciones descritas en la presente memoria para usar para hacer formulaciones adecuadas para la administracion por las vias descritas en la presente memoria, comprenden opcionalmente un tamano medio de particulas en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 500 micrometros, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 micrometros o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 75 micrometros. Los tamahos medios de particulas incluyen un intervalo entre 0,01 y 500 micrometros en incrementos de 0,05 micrometros o de 0,1 micrometros u otros incrementos, por ejemplo, un tamano medio de particulas de aproximadamente 0,05, 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 85, 100, 120, etc. micrometros). Cuando los compuestos de formula 1 o las composiciones que comprenden un compuesto de formula 1 se usan como productos intermedios para hacer una formulacion, pueden comprender 1, 2, 3 o mas de estos tamahos medios de particulas o intervalos de tamahos. Cuando se prepara alguna de las composiciones o formulaciones que se describen en la presente memoria y que comprenden un compuesto de formula 1 (y opcionalmente uno o mas excipientes), opcionalmente se puede moler, tamizar o granular de otra forma el compuesto o la composition para obtener un tamano de particulas deseado.

Los compuestos de formula 1 pueden caracterizarse porque carecen de androgenicidad apreciable. Por ejemplo, los compuestos de formula 1 pueden caracterizarse por tener aproximadamente 30% o menos, aproximadamente 20% o menos, aproximadamente 10% o menos o aproximadamente 5% o menos de la androgenicidad de un androgeno tal como la testosterona, propionato de testosterona, dihidrotestosterona o propionato de dihidrotestosterona, medido en un ensayo adecuado usando referencias positivas y/o negativas adecuadas. Se han descrito ensayos adecuados para la androgenicidad de diferentes compuestos, p. ej., en J.R. Brooks, et al., Prostate 1991, 18:215-227, M. Gerrity et al., Int. J. Androl. 1981 4:494-504, S.S. Rao et al., Indian J. Exp. Biol. 19697:20-22, O. Sunami et al., J. Toxicol. Sci. 2000 25:403-415, G.H. Deckers et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2000 74:83-92. La androgenicidad de los compuestos de formula 1 se determina opcionalmente como se describe o esencialmente como se describe en uno o mas de estos ensayos o en cualquier otro ensayo.

Por lo tanto, un metodo para tratar una afeccion descrita en la presente memoria puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto de formula 1 o suministrar a los tejidos del sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de formula 1, en el que el compuesto de formula 1 tiene aproximadamente 30% o menos, aproximadamente 20% o menos, aproximadamente 10% o menos o aproximadamente 5% o menos de la androgenicidad de un androgeno tal como la testosterona, propionato de testosterona, dihidrotestosterona o propionato de dihidrotestosterona, medido en un ensayo adecuado, por ejemplo, como se describe en las citas anteriores. Cuando se llevan a cabo dichos metodos, opcionalmente se hace el seguimiento en los sujetos o mamiferos, p. ej. roedores, seres humanos o primates, de la mejora, prevencion o una menor gravedad de la enfermedad, afeccion o sintoma. Dicho seguimiento puede incluir opcionalmente la medicion de una o mas citoquinas (p. ej., TNFa, IL-13, IL-1P), WBC, plaquetas, granulocitos, neutrofilos, RBC, celulas NK, macrofagos u otros tipos de celulas inmunitarias, p. ej., como se describe en la presente memoria o en las referencias citadas, en la circulacion en tiempos adecuados, p. ej., en el valor base antes de iniciar el tratamiento y en diferentes tiempos despues del tratamiento con un compuesto de formula 1, tal como aproximadamente 2-45 dias despues de finalizar el tratamiento con un compuesto de formula 1.

Como se ha indicado antes, puede combinarse un tratamiento con un compuesto de formula 1 con un corticosteroide o glucocorticoide. Los corticosteroides se usan en una serie de situaciones clinicas, por ejemplo para disminuir la intensidad o la frecuencia de exacerbaciones o episodios de inflamacion o reacciones autoinmunes en afecciones tales como la artritis reumatoide aguda o cronica, osteoartritis aguda o cronica, una afeccion de colitis tal como colitis ulcerativa, asma agudo o cronico, asma bronquial, psoriasis, lupus eritematoso sistemico, hepatitis, fibrosis pulmonar, diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 o caquexia. Sin embargo, muchos corticosteroides tienen efectos secundarios o toxicidades significativos que pueden limitar su uso o eficacia. Los compuestos de formula 1 son utiles para contrarrestar dichos efectos secundarios o toxicidades sin anular toda la capacidad terapeutica deseada del corticosteroide. Esto permite el uso continuado o una dosificacion modificada del corticosteroide, p. ej., una dosificacion mayor, sin una intensificacion de los efectos secundarios o toxicidades o una disminucion de la dosificacion de corticosteroide. Los efectos secundarios o toxicidades que se pueden tratar, prevenir, mejorar o reducir incluyen uno o mas de la perdida osea, menor crecimiento oseo, resorcion osea potenciada, osteoporosis, inmunosupresion, mayor susceptibilidad a la infeccion, cambios de personalidad o estado de animo, depresion, cefalea, vertigo, presion sanguinea alta o hipertension, debilidad muscular, fatiga, nauseas, malestar, ulceras pepticas, pancreatitis, piel fina o fragil, supresion del crecimiento en ninos o sujetos preadultos, tromboembolia, cataratas y edema. Las dosificaciones, vias de administracion y los protocolos de dosificacion para el compuesto de formula 1 serian esencialmente como se describen en la presente memoria. Una dosis de ejemplo del compuesto de formula 1 de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 mg/kg/dia, se administra durante el periodo durante el cual se administra un corticosteroide y opcionalmente a lo largo de un periodo de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 6 meses o mas despues de finalizar la dosificacion del corticosteroide. Los corticosteroides se administran esencialmente usando dosificaciones, vias de administracion y protocolos de dosificacion conocidos, vease, p. ej., Physicians Desk Reference 54a edicion, 2000, paginas 323-2781, ISBN 1-56363-330-2, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ. Sin embargo, la dosificacion del corticosteroide se puede ajustar opcionalmente, por ejemplo, aumentada aproximadamente 10% a aproximadamente 300% por encima de la dosificacion normal, sin un aumento correspondiente de todos los efectos secundarios o toxicidades asociados con el corticosteroide. Dichos aumentos se harian de forma gradual a lo largo de un periodo de tiempo suficiente y segun sea adecuado para el estado clinico del sujeto, p. ej., la dosis de corticosteroide diaria aumenta de aproximadamente 10% a aproximadamente 20% a un maximo de aproximadamente 300% a lo largo de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 1 ano.

El metodo de tratamiento se puede usar para tratar, prevenir o mejorar un traumatismo agudo tal como un infarto de miocardio, una hemorragia tal como una hemorragia cerebral o accidente cerebrovascular o una fractura osea, osteoporosis o resorcion o perdida osea en exceso o no deseada. Los tratamientos se pueden usar para facilitar la reparacion del dano o lesion en la piel, mucosa, cartilago, higado, tejido cardiaco, hueso o SNC o tejido neural, en situaciones en las que hay dano, p. ej. quemaduras quimicas o por calor, osteoartritis, artritis reumatoide, cirrosis hepatica, osteoartritis, fractura osea, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular o traumatismo craneal. Los tratamientos tambien se pueden usar para reducir la perdida osea debida a una terapia, p. ej., una terapia con glucocorticoides en una afeccion de lupus o en pacientes que tienen una enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis aguda o cronica o un trastorno renal tal como insuficiencia renal aguda o cronica o lesion renal autoinmunitaria.

Eiemolos.

Ejemplo 1. Tratamiento de inflamacion pulmonar. Se usaron tres compuestos, 3|3,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano, 3a16p,17|3-trihidroxiandrostano y 3a,16a,17a-trihidroxiandrostano para tratar la inflamacion en ratones, esencialmente como se ha descrito (D. Auci et al., Ann. New York Acad. Sci. 1051:730-7422005, cita nueva). Para el estudio se usaron ratones macho CD1 de 5 a 8 semanas de edad (Charles River, Calco, Italia). Los animales se alojaron en un entorno controlado y se les proporciono alimento para roedores convencional y agua. El cuidado de los animales estaba conforme con la normativa aplicable en proteccion de animales. Los ratones se asignaron a uno de los siguientes grupos: (1) ratones tratados con 7-carragenano al 2% en disolucion salina (grupo de referenda tratado con 7-carragenano), (2) ratones tratados con 0,1 mg, 0,01 mg o 0,001 mg de 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano por inyeccion subcutanea (s.c.) 24 h y 1 h antes de la administracion de 7-carragenano, (3) ratones tratados con 0,1 mg, 0,01 mg o 0,001 mg de 3a,16a,17a-trihidroxiandrostano por inyeccion s.c. 24 y 1 h antes del carragenano; (4) ratones tratados con 0,1 mg, 0,01 mg o 0,001 mg de 3a,16p,17p-trihidroxiandrostano por inyeccion s.c. 24 h y 1 h antes de la administracion de 7-carragenano; (5) ratones tratados con vehiculo (carboximetilcelulosa al 0,1%, disolucion salina al 0,9%, tween 80 al 2%, fenol al 0,05%) por via s.c. 24 h y 1 h antes de la administracion de 7-carragenano; (6) ratones tratados con anticuerpo policlonal de conejo anti-TNFa anti-raton (200 pg) administrado como un bolo intraperitoneal 24 h y 1 h antes de la administracion de 7-carragenano (grupo de referenda positivo); y (7) ratones con operacion simulada que no se trataron con 7-carragenano. Cada grupo consistia en 10 ratones. Todos los tratamientos se dieron en un volumen final de 100 pi. La inflamacion pulmonar (cavidad pleural) se indujo como sigue. Los ratones se anestesiaron con isoflurano y se hizo una incision en la piel al nivel del sexto espacio intercostal izquierdo. El musculo subyacente se disecciono y se inyecto en la cavidad pleural 0,1 ml de disolucion salina (referenda) o 0,1 ml de disolucion salina que contenia 7-carragenano al 2%. El X-carragenano es un potente inductor de inflamacion, que en este protocolo se pone de manifiesto por la acumulacion de liquido y neutrofilos en la cavidad pleural. La incision se cerro con una sutura y se dejo que los animales se recuperaran.

A las 4 h despues de la inyeccion de 7-carragenano, los animales se sacrificaron por exposicion a CO². Se abrio con cuidado el pecho y la cavidad pleural se lavo con 1 ml de disolucion salina que contenia heparina (5 U/ml) e indometacina (10 pg/ml). El exudado y la disolucion de lavado se retiraron por aspiracion y se midio el volumen total. Se descarto cualquier exudado contaminado con sangre. La cantidad de exudado se calculo restando el volumen de 1 ml inyectado al volumen total que se recupero de la cavidad pleural. Los neutrofilos en el exudado se suspendieron en disolucion salina tamponada con fosfato y se contaron con un microscopio optico en una camara Burker despues de tincion con azul de trypan. Los resultados se analizaron por ANOVA de un factor seguido de un ensayo posterior por el metodo de Bonferroni para comparaciones multiples. Un valor p menor de 0,05 se considero significativo. Para el analisis estadistico, cada grupo se compare con el grupo de ratones de referenda que fueron estimulados con X-carragenano y no recibieron otro tratamiento.

Todos los ratones que se estimularon con 7-carragenano y se dejaron sin tratar, desarrollaron una pleuritis aguda, produciendo un exudado turbio y numero mayor de neutrofilos pleurales. El aumento del volumen de los exudados y del numero de leucocitos en la pleura de los ratones tratados con el vehiculo era similar al observado en los ratones de referenda que se estimularon con 7-carragenano y no recibieron tratamiento. Con respecto a estos dos grupos de ratones de referenda, los animales tratados con 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano, presentaron una reduccion significativa del numero de neutrofilos en la pleura, el volumen de los exudados pleurales, con dosis de 0,1 mg y 0,01 mg, mientras que la dosis inferior de 0,001 mg era inactiva. El volumen del exudado pleural se redujo significativamente con la dosis de 0,1 mg en los animales tratados con 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano, pero no con las dosis inferiores de 0,01 mg y 0,001 mg. Los animales tratados con el 3a,16a,17a-trihidroxiandrostano mostraron una reduccion significativa del numero de neutrofilos en la pleura con las dosis de 0,1 mg y 0,01 mg. El tratamiento con 3a,16p,17p-trihidroxiandrostano tambien mostro una reduccion significativa del numero de neutrofilos en la pleura con dosis de 0,1 mg y 0,01 mg. Las potencias del 3a,16a,17a-trihidroxiandrostano y del 3a,16p,17a-trihidroxiandrostano eran similares a las observadas con el anticuerpo policlonal anti-TNFa de referenda, mientras que el 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano era menos potente.

La siguiente tabla describe el numero de neutrofilos de los grupos de animales tratados con respecto a los animales de referenda no tratados que fueron expuestos al 7-carragenano pero no se trataron con nada mas (grupo de referenda negativo). El numero de neutrofilos para el grupo de referenda negativo se establecio en 100% y los otros grupos se compararon con este. El grupo de animales que se trato con el anticuerpo anti-TNFa (grupo de referenda positivo) tenia el 29% del numero de neutrofilos que tenia el grupo de referenda negativo, lo que indicaba que el anticuerpo tenia un efecto antiinflamatorio contra la exposicion al 7-carragenano. El grupo de referenda con vehiculo no tuvo un numero significativamente reducido de neutrofilos (91%) comparado con el grupo de referenda negativo, que no presento efecto antiinflamatorio significativo debido al vehiculo solo.

Otros compuestos que tenian actividad antiinflamatoria estadisticamente significativa en este modelo eran el 17aetinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol (1 mg y 0,1 mg administrado por alimentacion oral por sonda) y el 17paminoandrost-5-en-3p-ol (40 mg/kg administrado por alimentacion oral por sonda, aproximadamente 0,5 mg/raton). Estos compuestos eran activos comparados con los grupos de ratones que se usaron como referencias de vehiculo.

Otros compuestos de formula 1 descritos en la presente memoria se pueden usar de esta manera para caracterizar su capacidad relativa para tratar o mejorar la inflamacion. Estos compuestos incluyen 3(3,16(3,17(3-trihidroxiandrostano, 3p,16a,17a-trihidroxiandrostano, 3p,16p,17a-trihidroxiandrostano, 3|3,16|3-dihidroxiandrost-5-en-17-oxima, 3p,16a-dihidroxiandrost-5-en-17-oxima, 3a,16a-dihidroxiandrost-5-en-17-oxima, 3(3,16adihidroxiandrostan-17-oxima y analogos de estos compuestos que (1) contienen un grupo hidroxilo en la posicion 7 en la configuracion a o la configuracion Py/o (2) un doble enlace en la posicion 5 o la posicion 4, y/o (3) un ester, eter, aminoacido, carbamato u oxima (=NOH), derivado, conjugado o analogo de cualquiera estos.

Ejemplo 2. Analisis de la respuesta inmunitaria. Se encontro que el compuesto 3a,16a17a-trihidroxiandrostano tenia propiedades biologicas que hacen al compuesto superior como un agente para tratar una afeccion inflamatoria tal como el asma. Especificamente, al uso del compuesto de referenda no le acompano un efecto de rebote en la IL-13, que es un efecto secundario conocido de los compuestos antiinflamatorios glucocorticoides tales como la dexametasona. El efecto de rebote de la IL-13 despues del glucocorticoide hace que un paciente con asma sea mas propenso a tener una posterior exacerbacion aguda, por lo tanto un agente antiinflamatorio que no produjera esto seria ventajoso. Esta falta de efecto de rebote de la IL-13 fue inesperada.

La capacidad del 3a,16a17a-trihidroxiandrostano para limitar la carga de eosinofilos y reducir los mediadores inflamatorios clave (IL-5, IL-3, cisteinil leucotrienos) se observo en el modelo de asma de raton sensibilizado con ovoalbumina (OVA). Se sensibilizaron ratones BALB/c por inyeccion intraperitoneal con OVA (en adyuvante de alumbre) los dias 1 y 12. Las vias respiratorias se estimularon con OVA los dias 28 y 30 por suministro de OVA al pulmon o con disolucion salina. El dia 31, se sacrificaron 6 ratones del grupo de disolucion salina y 6 ratones estimulados con OVA, y se analizo el tejido pulmonar. El resto de los animales se dividio en 6 grupos (6 ratones por grupo). Los grupos de ratones se trataron una vez al dia por inyeccion subcutanea como sigue. Grupo 1, referenda con vehiculo (carboximetilcelulosa al 0,1%, disolucion salina al 0,9%, tween 80 al 2%, fenol al 0,05%). Grupo 2, dexametasona (5 mg/kg). Grupo 3, 3a,16a17a-trihidroxiandrostano (1 mg/raton). Se sacrificaron 3 animales en los grupos 1-3 el dia 35, 1 h despues del tratamiento final, y los 3 animales restantes de los grupos 1-3 se sacrificaron el dia 38.

Como se muestra en la siguiente tabla, el 3a,16a17a-trihidroxiandrostano no genero un aumento de IL-13, que se observo con animales que se habian tratado con dexametasona.

Ademas de una reduccion el dia 38 del efecto rebote de la IL-13 despues de estimulacion, los animales tratados con 3a,16a17a-trihidroxiandrostano tenian un nivel reducido de IL-5 en el tejido pulmonar (90 pg/ml) comparado con el grupo tratado con dexametasona (145 pg/ml). El nivel de IL-5 en el grupo de referenda con vehiculo era 75 pg/ml el dia 38. Se usaron de esta manera otros compuestos de formula 1 descritos en la presente memoria para identificar su capacidad para tratar o mejorar la inflamacion sin un efecto rebote de la IL-13 y/o IL-5, incluyendo el 3(3,16(317(3-trihidroxiandrostano, 3(3,16a17a-trihidroxiandrostano, 3(3,16(317a-trihidroxiandrostano, androst-5-eno-2a,3(3,16a, 17(3-tetrol, androst-5-eno-3(3,7(3,16a,17(3-tetrol y 17a-etinilandrost-5-eno-3(3,7(3,17(3-triol. Estos resultados muestran que los F1C se pueden usar para tatar la inflamacion pulmonar o el asma in vivo.

En otro protocolo, se cultivo una poblacion de mastocitos de medula osea murina, como sigue. Brevemente, las medulas oseas de ratones Balb/C se lavaron del femur usando PBS y una aguja 27 g. Las celulas se cultivaron en una mezcla de RPMI-1640 con FBS al 19% 2/3, y celulas que secretaban IL-3. Se dejo que las celulas de la medula osea se diferenciaran durante 18-25 dias en la mezcla que contenia IL-3 antes de usarlas para experimentos. Las celulas de la medula osea cultivadas de esta manera tienen un fenotipo similar a los mastocitos de mucosa y se denominan mastocitos derivados de medula osea (BMMC).

Se comprobo la homogeneidad de los mastocitos multiplicados in vitro mediante tecnicas convencionales de citometria de flujo y se tineron los marcadores especificos de celula. Entre los dias 14 y 21 de la multiplicacion, los mastocitos maduros se recogieron y se prepararon para los cultivos de ensayo. El objetivo era evaluar el efecto de compuestos tales como la deshidroepiandrosterona en la desgranulacion de mastocitos acoplada a estimulo. Los mastocitos preparados se dispensaron en pocillos de cultivo de ensayo con una densidad de 1 x 107 celulas/ml. En los cultivos de referencia, los mastocitos se indujeron para la desgranulacion despues de reaccion entrecruzada de receptores de IgE con complejos de antigeno-anticuerpo IgE. En grupos paralelos de cultivo, los mastocitos se preincubaron con deshidroepiandrosterona con diferentes dosis seguido de activacion usando un anticuerpo anti-IgE. No hubo desgranulacion detectable de los mastocitos, medida por la liberacion de p-glucuronidasa de los granulos de almacenamiento citosolicos de las celulas en ausencia de estimulo. La introduccion de anticuerpo anti­ receptor de IgE en los cultivos produjo una liberacion significativa de p-glucuronidasa. Cuando los mastocitos se expusieron a la deshidroepiandrosterona sola, no hubo desgranulacion medible. Sin embargo, los mastocitos previamente expuestos a dosis de deshidroepiandrosterona 100 pM durante 5 a 10 minutos antes de la activacion con complejos de antigeno-anticuerpo anti-lgE, presentaron aproximadamente 70% de inhibicion de la desgranulacion. Niveles inferiores de deshidroepiandrosterona mostraron proporcionalmente una menor capacidad para inhibir la desgranulacion. En protocolos similares, los F1C tales como el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol, androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol o androst-5-eno-3a,7p,16a,17p-tetrol eran 10-1000 veces mas potentes que la deshidroepiandrosterona.

Ejemplo 3. Tratamiento de inflamacion/choque mortal. Se usaron dos compuestos, la 16a-bromoepiandrosterona (3p-hidroxi-16a-bromoandrostan-17-ona) y 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano, en un protocolo de choque mortal. En un protocolo, se administraron 3 mg de 16a-bromoepiandrosterona a un grupo de animales por alimentacion oral por sonda, mientras que otro grupo recibio 3 mg de 16a-bromoepiandrosterona por inyeccion subcutanea. Un grupo de animales de referencia recibio una referencia de placebo. En este protocolo, la 16a-bromoepiandrosterona se administro a ratones 24 h antes y 1 h despues de la administracion de una cantidad mortal de lipopolisacarido bacteriano (LPS). Al final del periodo de observacion, 72 h despues de la administracion de LPS, ninguno de los animales de referencia de placebo tratados con vehiculo habia sobrevivido, mientras que 65% de los animales que habian recibido la 16a-bromoepiandrosterona por administracion oral sobrevivieron. 50% de los animales que recibieron 16a-bromoepiandrosterona por inyeccion subcutanea sobrevivieron. Los animales que sobrevivieron durante 72 h se recuperaron todos de la exposicion al LPS.

En un segundo ensayo, se administro por alimentacion oral por sonda 16a-bromoepiandrosterona o 3)3,16adihidroxi-17-oxoandrostano a ratones, 24 h antes y 1 h despues de la administracion de una cantidad mortal de LPS. Se uso un grupo de animales tratados con vehiculo como referencia de placebo. A las 72 h, sobrevivia el 25% de los ratones de referencia de placebo, sobrevivia el 50% de los ratones tratados con 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano y sobrevivia el 80% de los ratones tratados con 16a-bromoepiandrosterona.

En otro ensayo, se mostro la capacidad de la 16a-bromoepiandrosterona y el 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano de proteger frente a la lesion pulmonar inducida por exposicion a una cantidad inferior a la mortal de LPS, en ratones. En este ensayo, los compuestos, la disolucion salina esteril (referencia negativa) o el vehiculo (referencia de vehiculo) se administraron a grupos de 5 ratones por alimentacion oral por sonda 24 h antes y 1 h despues de la administracion de 100 pg de LPS en la traquea y pulmones de animales con anestesia ligera. A las 48 h los animales se sacrificaron y se obtuvieron muestras de los pulmones de los animales por lavado broncoalveolar (LBA). Se conto el numero de celulas en el liquido del LBA, mostrando los numeros altos de celulas inflamacion y dano pulmonar. En este ensayo, las celulas que median la inflamacion y el dano pulmonar se infiltran en los pulmones en respuesta a la presencia del LPS. En los grupos de referencia negativa y referencia de vehiculo, el liquido del LBA contenia aproximadamente 6 x 107 celulas/ml. El numero de celulas en los grupos de animales que se trataron con 16abromoepiandrosterona (p = 0,02) o 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano (p = 0,04) tenian recuentos de celulas significativamente reducidos en el liquido de LBA (aproximadamente 4,4 x 107 celulas/ml). Este resultado muestra que los compuestos tienen actividad en afecciones clinicas tales como el asma o la COPD en las que la lesion o dano pulmonar estan asociados con la inflamacion en exceso o no controlada. Otros compuestos, p. ej., el 17aetinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol o el 17p-aminoandrost-5-en-3p-ol, se pueden caracterizar de una forma similar.

Ejemplo 4. Eliminacion bacteriana del tejido pulmonar. La capacidad de la 16a-bromoepiandrosterona para eliminar una infeccion por Pseudomonas aeruginosa del tejido pulmonar se mostro usando un protocolo publicado previamente, A. van Heeckeren et al., J. Clin. Invest., 100(11):2810-2815 1977; A. van Heeckeren et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 161: 271-2792000. El protocolo se llevo a cabo en ratones CFTR, que se usan como un modelo animal para la fibrosis quistica humana, S.D. Freedman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(24):13995-14000 1999; W. Zeng et al., Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 273:C442-C455 1997. El establecimiento de infeccion cronica por P. aeruginosa usando perlas de agarosa que contienen bacterias (50 pi contienen aproximadamente 6,1 x 104 UFC/animal) se ha publicado previamente, J.R. Starke et al., Pediatr. Res., 22:698-702 1987. Se trataron dos grupos de ratones (n=9 para cada grupo) con 40 mg/kg de 16a-bromoepiandrosterona o vehiculo (referencia) y se determino la carga bacteriana en los pulmones de los animales 10 dias despues de introducir perlas de agarosa en el pulmon. El dia 10, la carga bacteriana en los pulmones de los animales de referencia con vehiculo era aproximadamente 6 x10s UFC/animal, mientras que los animales tratados con 16a-bromoepiandrosterona tenian una caga bacteriana menor (p =< 0,04). Este resultado muestra que la 16a-bromoepiandrosterona no solo es antiinflamatoria, sino que tambien se puede usar para tratar o reducir la infeccion pulmonar, lo cual es una propiedad deseable para los agentes que se usan para tratar afecciones tales como la fibrosis quistica, en la que pueden coexistir la inflamacion y la infeccion.

Ejemplo 5. Actividad antiinflamatoria en celulas humanas in vitro. La capacidad de la 16a-bromoepiandrosterona y el 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano para reducir la inflamacion en celulas humanas in vitro, se demostro usando sangre entera humana que se habia expuesto a LPS. Se observo una menor produccion de interferon y por las celulas en presencia de 16a-bromoepiandrosterona (100 ng/ml) y de 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano comparado con celulas expuestas solo a LPS (referenda positiva) o vehiculo (dimetilsulfoxido) sin compuesto (referenda de vehiculo). Se midio la cantidad de interferon y en el medio de crecimiento cuando las celulas se habian incubado en presencia de LPS durante 24 horas.

Ejemplo 6. Tratamiento de la degeneracion autoinmunitaria. Se caracterizaron 3 compuestos, el 17p-aminoandrost-5-en-3p-ol, 17p-dimetilaminoandrost-5-en-3p-ol y 17p-metilaminoandrost-5-en-3p-ol porsu capacidad para mejorarla encefalomielitis alergica experimental (EAE) en ratones. Esta afeccion desmielinizante se usa ampliamente como modelo para la esclerosis multiple en seres humanos y para ensayar nuevas terapias para tratar la esclerosis multiple, p. ej., B.F. Bebo Jr. et al., J. Neurosci. Res. 52:420-426 1998; R.R. Voskuhl et al., Neuroscientist, 7:258-2702001; H. Offner et al., J. Neuroimmunol., 130:128-1392002. La actividad en este modelo muestra la capacidad de los compuestos de prueba de prevenir o ralentizar la velocidad de muerte neuronal que esta asociada con el avance de la enfermedad de EAE.

En este protocolo, los compuestos se administraron a ratones SJL/J hembra por alimentacion oral por sonda al empezar los sintomas de la enfermedad. Se uso un antigeno para iniciar la afeccion de EAE en los ratones. El antigeno que se uso para la inmunizacion activa era proteolipido proteina (PLP) de raton 139-151 (HCLGKWLGHPDKF). La inmunizacion con este antigeno peptidico inicia una enfermedad autoinmunitaria desmielinizante del sistema nervioso central mediada por Th1. El antigeno se prepare por sintesis en fase solida y se purified por cromatografia liquida de alto rendimiento. La afeccion de EAE se inicio en los ratones SJL/J hembra por inmunizacidn con 150 pg del peptido PLP 139-151 en adyuvante completo de Freund que contenia 200 pg de Mycobacterium tuberculosis. El protocolo de inmunizacidn era inyeccidn subcutanea en 4 sitios en el flanco trasero el dia 0. Despues de inmunizacidn, se evaluo diariamente en los ratones los signos clinicos de EAE usando la siguiente escala: 0 = no hay signos clinicos o sintomas; 1 = cola floja; 2 = leve debilidad del limbo posterior y cola floja; 3 = debilidad moderada del limbo posterior y cola floja o ataxia leve; 4 = debilidad grave del limbo posterior y leve debilidad de extremidades anteriores con ataxia moderada; 5 = paraplejia con debilidad de limbo posterior no mas que moderada; 6 = paraplejia con debilidad de limbo posterior grave o ataxia grave o estado moribundo.

Los ratones en el grupo de referenda con vehiculo empezaron a mostrar sintomas observables de EAE aproximadamente 10-11 dias despues de inmunizacion con el antigeno PLP, que es tipico para el modelo de enfermedad de EAE. Se administro diariamente a los animales 17p-aminoandrost-5-en-3p-ol, 17pdimetilaminoandrost-5-en-3p-ol y 17p-metilaminoandrost-5-en-3p-ol por alimentacion oral por sonda empezando el dia 1, que era 1 dia despues de inmunizacion. Los 3 compuestos eran activos con una dosis de 5 mg/kg y redujeron la gravedad clinica de los sintomas que se observaron hasta el dia 26 cuando termino el periodo de observation. La actividad terapeutica de los compuestos se observo en los niveles en la sangre de aproximadamente 10 ng/ml en los ratones. Estos resultados mostraban que los compuestos eran biologicamente activos en el tratamiento de esta enfermedad de neurodegeneration cronica autoinmunitaria.

Ejemplo 7. Inhibition de NK-^kB in vitro. Se uso una serie de compuestos para inhibir la activation de NF-^kB por el TNFa o LPS en celulas humanas in vitro. La activacion de NF-kB aumenta la expresion de una serie de genes que median la inflamacion. Este protocolo usaba celulas THP-1 humanas, que son celulas sanguineas mononucleares humanas con un fenotipo de monocito. La linea celular denominada NF-KB-bla THP-1, contenia un gen indicador de P-lactamasa bajo el control del elemento de respuesta de NF-^kB (Invitrogen, CellSensor™, producto N° K1176). En esta linea celular, el gen indicador de p-lactamasa se integra establemente en las celulas THP-1. Esta linea celular se uso para detectar agonistas o antagonistas de la ruta de serialization de NF-^kB. Estas celulas NF-KB-bla THP-1 responden a la presencia del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) o lipopolisacarido bacteriano (LPS) mediante la expresion aumentada del gen indicador de p-lactamasa. El nivel de actividad de la enzima p-lactamasa se midio por detection radiometrica de transferencia de energia por resonancia de fluorescencia. Tanto el TNFa como el LPS son potentes agentes inductores de la inflamacion que activan el NF-^kB en las celulas THP-1. En este ensayo, los compuestos que disminuyen la actividad de NF-kB, y por lo tanto la p-lactamasa, en presencia de TNFa o LPS estan ejerciendo una actividad antiinflamatoria.

Las celulas NF-KB-bla THP-1 se mantuvieron mediante pases o con alimentacion segun fuera necesario. Las celulas, que se desarrollan en suspension, se mantuvieron con una densidad entre 2 x 105 celulas por ml y 2 x 10s celulas/ml. Las celulas se cultivaron en placa con 20.000 celulas/pocillo en placas de ensayo de fondo transparente, paredes negras, de 384 pocillos (Costar n° 3712-TC placas de baja fluorescencia de fondo) aproximadamente 24 h antes de anadir 10 ng/ml de TNFa o 0,2 ng/ml de LPS para activar el NF-kB. En los ensayos de referenda positiva para la activacion de NF-^kB, la concentration CEso para el TNFa era 0,20 ng/ml despues de 1 h de incubation del sustrato con p-lactamasa. La dosis de CEso para el LPS era 0,15 ng/ml. La concentracion CEso para el TNFa o LPS en este ensayo se refiere a 50% de la concentracion de TNFa o LPS que produce una activacion maxima del NF-kB. El glucocorticoide sintetico dexametasona (un potente farmaco antiinflamatorio) disminuyo el efecto del TNFa con una CE⁵⁰ de 0,47 nM (media de 5 ensayos) en este ensayo. Se ha descrito una actividad biologica similar para la dexametasona en otros ensayos celulares in vitro con inhibicion completa de la activacion de NF-kB observada con una CI⁵⁰ de aproximadamente 1 nM (M.K.A. Bauer et al., Eur. J. Biochem. 243:726-731, 1977).

Usando este ensayo, la CI⁵⁰ de los compuestos para inhibir la activacion de NF-^kB en celulas NF-KB-bla THP-1 despues de estimulacion con LPS se muestra a continuacion. La concentracion CI⁵⁰ para los compuestos usados en este ensayo se refiere a la concentracion de compuesto que produce un 50% de la inhibicion maxima de la activacion de NF-kB que puede inducir el compuesto. Los ensayos se llevaron a cabo normalmente 2-4 veces para cada compuesto y los valores mostrados a continuacion son las medias de cada compuesto. Los datos de la siguiente tabla 1 muestran que niveles muy bajos de muchos de estos compuestos pueden inhibir el NF-^kB en esta celulas macrofagos humanos.

TABLA 1

Clso* Compuesto

0,47 nM 0,11 dexametasona (referencia positiva de antiinflamacion)

> 10 pM estradiol (referencia negativa de antiinflamacion)

8.2 fM 7,4 3p,7p,16a,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno

84.5 fM 65 3a,7p, 16a, 17p-tetrahidroxiandrost-5-eno

> 10 pM 3p,7a, 16a, 17p-tetrahidroxiandrost-5-eno

> 10 pM 16a-acetoxi-3p,7p,17p-trihidroxiandrost-5-eno

0,4 fM 3p,4p,16a,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno

0,01 fM 4p-acetoxi-3p,16a,17p-trihidroxiandrost-5-eno

2.0 fM 3p-acetoxi-7p,11 p,17p-trihidroxiandrost-5-eno

> 10 pM 3p,7 p, 11 p,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno

10 fM 3p,7p, 17p-tri hidroxi-11-oxoandrost-5-eno

0,1 pM 17a-metil-3p,11a,17p-trihidroxiandrost-5-eno

> 10 pM 3p, 11 a-di hidroxi-17-oxoandrost-5-eno

2.0 fM 2a,3p,17p-trihidroxiandrostano

14 pM 12 3p,17p-dihidroxiandrost-5-eno

1.2 fM 0,28 3p,7p,17p-trihidroxiandrost-5-eno

> 10 pM 3p,7a,17p-trihidroxiandrost-5-eno

19 f M ±11 3p,7p,17p-tri hidroxi-17a-etinilandrost-5-eno

> 10 pM 3p,7p,17p-tri hidroxi-17a-trifluorometilandrost-5-eno

6.8 fM 5,6 3p,7p,17p-tri hidroxi-17a-etinilandrost-5-eno

12 fM 9,8 3p,7p,17p-tri hidroxi-17a-vinilandrost-5-eno

50,3 fM 13,9 3p,7p,17p-tri hidroxi-17a-metilandrost-5-eno

64 fM 36 3p,7a,17p-trihidroxi-17a-metilandrost-5-eno

30 pM 29 16a-fluoroandrost-5-en-17-ona

1.9 nM 0,8 16a-yodoepiandrosterona

8,8 pM 1,3 16a-bromoepiandrosterona

0,6 pM 0,2 16p-bromoepiandrosterona

> 10 pM 16a-hidroxiepiandrosterona

7.2 fM 4,7 3p,17p-dihidroxi-17a-metilandrost-5-eno

11.5 fM ± 3,5 3p,17p-dihidroxi-7-oxo-17a-etinilandrost-5-eno

> 10 pM 3p,17P-dihidroxi-7-oxo-17a-metilandrost-5-eno______

*pM = 10-® M; nM = 10'9 M; pM = 10'12 M; fM = 10'15 M

Otros compuestos que presentaron actividad antiinflamatoria en este protocolo fueron el 3a-pentafluoroetilandrost-4-eno-3p,17p-diol (CI ⁵⁰3,1 nM), 3a-pentafluoroetilandrost-5-eno-3p,17p-diol (CI ⁵⁰ 17 nM; la inhibicion maxima de NF- ^kB era 50%), 3a/p,17a-etinilandrostano-3a/p,17p-diol (CI ⁵⁰200 pM), 17a-trifluorometilandrostano-3a,17p-diol (CI ⁵⁰ 190 nM), 17p-glicilandrostan-3p-ol (CI ⁵⁰ 0,42 pM), 3p-glicilandrostan-17p-ol (CI ⁵⁰ 1 nM), 17-oxima de androstano-3p,16p-diol (CI ⁵⁰ 1,9 fM), 17a-etinilandrost-4-en-3-on-17p-ol (CI ⁵⁰2,9 fM; la inhibicion maxima de NF-^kB era 80%), 16a-fluoroandrost-5-en-17-ona (CI ⁵⁰ 30 pM), 16p-fluoroandrost-5-en-7p-ol-17-ona (CI ⁵⁰ 1,5 nM), androstano-3a,16a,17p-triol (CI ⁵⁰6,9 fM), androstano-3a,16p,17p-triol (CI ⁵⁰ 19 fM), ester 17p-succinilico del androst-5-en-3p-ol (CI ⁵⁰0,2 nM), 3p-acetoxi-7p,17p-dihidroxi-11-oxoandrost-5-eno (CI ⁵⁰1 fM; la inhibicion maxima de NF-^kB era 65%). La inhibicion maxima de NF-^kB de estos compuestos era aproximadamente de 25% a 80%, que difiere de la inhibicion de 100% de la activacion de NF-^kB por el glucocorticoide sintetico dexametasona de este protocolo.

Dos compuestos aumentaron la actividad del NF-kB en este protocolo, el androst-5-eno-3p,7a,16a-triol-17-ona (CI ⁵⁰ 1,3 nM; actividad de NF-^kB 140% comparado con las celulas de control) y el 3p,17a-dimetilandrostano-3a,17p-diol (Clso 40 nM).

Los compuestos que no presentaron actividad antiinflamatoria en este protocolo fueron el 3a,17a-metilandrostano-3p,17p-diol, 3p-acetoxiandrost-5-eno-3p,17p-diol, 17a-metilandrost-5-eno-3p,17p-diol-7-ona, 16a-fluoroandrost-5-eno-7p-ol-17-ona, 16a-fluoroandrost-5-en-7a-ol-17-ona, 17a-metilandrostano-3p,7a,17p-triol, androst-5-eno-3p,11 p, 17p-triol, 16a-fluoroandrostan-17-ona, androst-5-eno-3a,17p-diol, androstano-2p,3a,16a,17p-tetrol y androstano-3a,16a,17a-triol, los cuales tenian todos una CI⁵⁰ > 10 pM.

La capacidad de los compuestos para disminuir la actividad del NF-kB a niveles bajos indica que se pueden usar para tratar la inflamacion, en particular en afecciones en las que los niveles en exceso de actividad de transcripcion nuclear mediada por el NF-kB tienen una funcion importante en la patologia de la enfermedad ⁰ afeccion.

En el ensayo descrito antes, la inhibicion maxima del NF-kB por la dexametasona, 16a-bromoepiandrosterona y 16p-bromoepiandrosterona era 100% y no habia activacion detectable del NF-kB en concentraciones de estos compuestos por encima de la CI⁵⁰ para estos compuestos. A diferencia de esto, la inhibicion maxima del NF-^kB por los otros compuestos, p. ej., 3p,7p,16a,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno, 3a,7p,16a,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno ⁰ 3p,7p,17p-trihidroxi-17a-metilandrost-5-eno era menor de aproximadamente 80%, y las cantidades mayores de los compuestos por encima de sus niveles de CI⁵⁰ no proporcionaban actividad inhibidora adicional significativa frente a la activacion del NF-kB. Para la mayoria de estos compuestos, el grado maximo de inhibicion del NF-kB en este ensayo era aproximadamente 25-80%, principalmente aproximadamente 30-65% ⁰ aproximadamente 30-70%. Estos resultados indicaban que los compuestos tales como el 3p,7p,16a,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno inhibian la activacion de NF-kB por un mecanismo que no podia prevenir completamente su actividad biologica.

Algunos compuestos de la tabla 1 tenian una capacidad no detectable para ejercer una actividad antiinflamatoria en el ensayo celular in vitro. Otros compuestos que se ensayaron y que no tenian actividad en el ensayo (CI⁵⁰ > 10 pM) incluian el 3p,17a-dihidroxiandrost-5-eno, deshidroepiandrosterona (3p-hidroxiandrost-5-en-17-ona), 3phidroxiandrostano-7,17-diona, 16a-bromo-3p,17p-dihidroxiandrost-5-eno y 16p-bromo-3p-hidroxiandrost-5-en-17-ona. No obstante, algunos de los compuestos que eran inactivos en este ensayo celular in vitro, por ejemplo, la 16ahidroxiepiandrosterona, se encontro que sin embargo eran antiinflamatorios en animales in vivo. Este resultado muestra que los compuestos pueden actuar por diferentes mecanismos ⁰ que su actividad requiere mas que celulas de una sola linea celular. La actividad antiinflamatoria de dichos compuestos in vivo puede proceder, por ejemplo, de inducir la sintesis de prostaglandinas y otra actividad en el higado, conduciendo a una respuesta antiinflamatoria sistemica. Alternativamente, la actividad antiinflamatoria para dichos compuestos puede proceder de la capacidad de los compuestos para inhibir la estimulacion de la actividad del NF-kB que procede de fuentes distintas del LPS. Una serie de materiales diferentes pueden activar la actividad del NF-^kB, incluyendo el LPS, TNF-a, IL-1, la presencia de determinados productos genicos videos ⁰ bacterianos, la activacion de linfocitos B ⁰ linfocitos T, ⁰ la exposicion de las celulas a la radiacion ultravioleta. No todos los tipos de celulas pueden responder a cada uno de estos estimulos, puesto que no todas las celulas expresan la maquinaria de senalizacion que es necesaria para responder a cada uno de estos estimulos. La mayoria de los tipos de celulas pueden responder a uno ⁰ a unas pocas de estas senales, pero raramente un tipo de celula dada puede responder a todos. En el ensayo usado aqui, la activacion del NF-kB procede de la estimulacion inducida por el LPS bacteriano y por lo tanto, se esperaria que los compuestos que tengan una capacidad limitada para inhibir la ruta de senalizacion del LPS, tuvieran una capacidad limitada para reducir la actividad del NF-kB en este ensayo.

Los metodos para modular el NF-^kB que se han descrito y que se pueden incorporar ⁰ usar en la practica de la presente divulgacion, incluyen los descritos en las siguientes publicaciones. Patentes de EE.UU. n° 5.989.835, 6.410.516, 6.545.027, 6.831.065 y 6.998.383. Otros aspectos de la actividad del NF-kB se han descrito, y tambien se pueden incorporar en los metodos divulgados, por ejemplo, en A.S. Baldwin, Annual Rev. Immunol. 14:649-683 1996; M. Muller et al., Mol. Cell. Biol. 22((4)1060-10722002; P.A. Baeuerle, Cell 95:729-731 1998.

Ejemplo 8. La capacidad de compuestos seleccionados para tratar el choque/inflamacion inducidos por LPS en ratones se examino mediante un protocolo similar al protocolo descrito antes. Se trato cada uno de 5 grupos de 3 ratones ICR que pesaban aproximadamente 30 g, por inyeccion intraperitoneal con 120 pi de vehiculo (eter sulfobutilico-ciclodextrina al 30% en agua), androst-5-eno-3a,7p,16a,17|3-tetrol en vehiculo, androst-5-eno-3p,4p,16a,17p-tetrol en vehiculo ⁰4p-acetoxiandrost-5-eno-3p,16a,17p-triol en vehiculo. Todas las formulaciones de farmaco y vehiculo eran disoluciones, no suspensiones. El eter sulfobutilico-ciclodextrina se obtuvo en el comercio (Captisol™, www.cydexinc.com). Habia dos grupos de referenda con vehiculo, un grupo recibio solo vehiculo y el otro recibio vehiculo mas LPS. El vehiculo ⁰ farmaco se administro 24 h antes y 1 h antes del LPS (aproximadamente una dosis DL ⁵⁰ / ²⁴ , es decir letal para 50% 24 h despues de la administracion de LPS) a los ratones mediante inyeccion intraperitoneal. Se administraron aproximadamente 40 mg/kg de farmaco (1,2 mg de farmaco/animal para cada administracion de los farmacos). Se recogieron los bazos de los animales 1,5 h despues de la inyeccion de LPS y las celulas de bazo se lisaron y se ensayo el NF-^kB activado mediante aislamiento de los nucleos de las celulas de bazo y midiendo el NF-kB de los nucleos lisados. Los resultados indicaban que los tres compuestos disminuian el nivel de activacion del NF-kB comparado con el grupo de referenda de LPS vehiculo, en aproximadamente 50%. El nivel de NF-kB activado en celulas de bazo de los animales que se trataron con vehiculo y sin LPS era esencialmente el mismo que el NF-^kB activado en celulas de bazo de animales tratados con farmaco. Estos resultados indicaban un potente efecto antiinflamatorio en los animales, mostrado por una disminucion del NF-kB activado en los animales tratados con farmaco comparados con los animales de referenda.

Otros compuestos que se usaron en un protocolo similar con analisis del NF-kB ^o del TNF-a 1,5 horas despues de la estimulacion con LPS, eran el androstano-3a,16a,17p-triol, androstano-3a,17p-diol-16-ona, 17atrifluorometilandrost-5-eno-3p,17p-diol, androst-5-eno-3a,17p-diol, androst-5-eno-3a,16a,17p-triol, 3atrifluorometilandrost-5-eno-3p,17p- diol, 16-oxima del androstano-3a,17p-diol y androst-5-eno-3p,17p-diol-7-ona. Todos estos compuestos se administraron en forma de una disolucion (no una suspension) del compuesto con eter sulfobutilico-ciclodextrina en agua. Estos compuestos se administraron a los animales 24 h antes de la estimulacion con LPS y al mismo tiempo que la estimulacion con LPS (en lugar de 1 h despues de la estimulacion con LPS como se ha descrito antes), y despues se hizo el analisis del NF-^kB en los bazos o del TNFa en la sangre 1,5 h despues de la estimulacion con LPS. Se administraron 40 mg/kg de los compuestos y para el 3a-trifluorometilandrost-5-eno-3p,17p-diol tambien 4 mg/kg, 0,1 mg/kg y 0,05 mg/kg. Se observo la inhibicion del NF-kB y del TNFa para todos estos compuestos comparados con las referencias con vehiculo. Para el 3a-trifluorometilandrost-5-eno- 3p,17p-diol, la inhibicion maxima del NF-kB y del TNFa se observo en animales que se habian tratado con un nivel de dosis de 0,1 mg/kg.

Ejemplo 9. Analisis cinetico de la inhibicion del NF-^kB in vivo. Se examino la cinetica de la inhibicion del NF-^kB despues de inyeccion de LPS bacteriano en ratones para probar mejor el mecanismo de accion de compuestos tales como el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol, que inhibian solo parcialmente la activacion del NF-kB que es inducida por el LPS o TNFa en celulas inmunitarias (macrofagos o monocitos) in vitro, como se describe en el ejemplo 7. En este estudio, los ratones se trataron con 17a-etinilandrost- 5-eno-3p,7p,17p-triol (aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1,2 mg/animal) por inyeccion intraperitoneal de una disolucion (no una suspension) del compuesto en el vehiculo descrito en el ejemplo 8. El farmaco se inyecto 24 h antes de la inyeccion intraperitoneal del LPS bacteriano (aproximadamente una DL ⁵⁰ / ²⁴ ). El estudio uso dos grupos de 12 animales, referenda con vehiculo ⁰ farmaco administrados 24 h antes de la estimulacion con LPS. Se recogieron los bazos de 3 animales de ambos grupos justo antes de la estimulacion con LPS y 1,5, 2,0 y 2,5 h despues de administracion del LPS. Se recogieron las celulas de bazo y se midio el nivel de NF-^kB activado mediante el ensayo del NF-^kB en nucleos esencialmente como se ha descrito en el ejemplo 8.

La activacion maxima de NF-^kB despues de administracion de LPS se produjo a las 1,5 h en los grupos de referenda con vehiculo, que era un aumento de 4 veces frente al nivel de NF-^kB activado previo al LPS. Los resultados se muestran a continuacion. Los valores para los animales de referenda con vehiculo y tratados con farmaco son las unidades de densidad optica relativa de las mediciones por ELISA del NF-kB en los nucleos de las celulas de bazo.

Tiempo Referenda con Tratado con farmaco

vehiculo

(horas)

0 18 22

1,5 72 2

2,0 10 7

2,5 10 9

La profunda inhibicion del NF-kB en el tiempo de medicion de 1,5 h y los niveles relativamente normales de actividad del NF-^kB en los otros tiempos de medicion, indicaba que el compuesto ejercia una inhibicion transitoria pero potente del traumatismo inducido por el LPS en un periodo critico despues de la exposicion a LPS. Ensayos similares en otros estudios mostraron que el nivel de NF-kB activado a los 30 min y 60 min despues de inyeccion de LPS en ratones de referenda con vehiculo, era similar al tiempo de medicion previo al LPS en este estudio. Este resultado indica que en este modelo el efecto del LPS en la activacion del NF-^kB en celulas de bazo es maximo aproximadamente 1,5 h despues de estimulacion con LPS. Este tiempo de medicion pone de manifiesto un tiempo ⁰ ventana de tiempo convenientes en los que se puede evaluar la actividad de los candidatos a farmacos antiinflamatorios in vivo, es decir, de aproximadamente 75 min a aproximadamente 105 min despues de estimulacion con LPS. La ventana puede variar dependiendo de la via de administracion de la agresion biologica, por ejemplo, el LPS ⁰ TNFa administrados por inyeccion intraperitoneal frente al LPS ⁰ TNFa administrados por inyeccion subcutanea ⁰ intramuscular. Igualmente, la agresion biologica puede ser otra cosa, por ejemplo, la exposicion de los sujetos a radiacion ionizante de aproximadamente 50-60 cGy/min frente a la exposicion de sujetos a radiacion ionizante de aproximadamente 500-1000 cGy/min ⁰ aproximadamente 5-10 cGy/min.

El analisis de la expresion de TNFa inducida por el LPS en ratones mostro que los niveles de TNFa eran maximos 1,5 h despues de la estimulacion con LPS (500 pg de LPS administrados por inyeccion intraperitoneal) con los niveles mas altos de TNFa observados 1-2 h despues de estimulacion con LPS. Los niveles de TNFa 30 min despues del LPS y a las 2,5 h eran inferiores.

Otros compuestos en los que se puede analizar su capacidad para actuar como farmacos biodinamicos incluyen el androst-5-eno-3p,7p, 16a, 17p-tetrol, androst-5-eno-3a,7p, 16a, 17p-tetrol, androst-5-eno-3p,7a, 16a, 17p-tetrol, androst-5-eno-3p,4p,16a,17p-tetrol, androst-5-eno-3p,4a,16a,17p-tetrol, androst-5-eno-3a,4b,16a,17p-tetrol, 17aetinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol, 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7a,17p-triol, 17a-etinilandrost-5-eno-3p,17p-triol-7-ona y analogos farmaceuticamente aceptables de cualquiera de estos compuestos, por ejemplo, analogos que son esteres de hidroxilo o derivados de eter en 1, 2 o mas grupos hidroxilo. Los esteres y eteres adecuados incluyen acetato, n-propionato, i-propionato, succinato, -0-C(0)-(CH2)n-CH2R, -0-C(0)-(CH2)n-CH2R, -0-C(0)-NH-(CH2)n-CH ² R, aminoacidos tales como glicina y alanina (-0-C(0)-CHCH3-C00H), hidroxiesteres y eteres de metilo, etilo, npropilo, i-propilo, -0-(CH2)n-CH2R, -0-(CH2)n-0CH2R (p. ej., -O-CH ² CH ² -O-CH ³ ), en los que n es 1, 2, 3, 4, 566 y R es -H, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -C(0)OH ⁽⁰ una sal aceptable, p. ej., sal de sodio ⁰ potasio), -C(0)OCH3, -C(0)OC2Hs.

Ejemplo 10. La capacidad de los compuesto de formula 1 para afectar a la evolucion de la artritis en un modelo de artritis pasiva inducida por colageno, se examino esencialmente como se ha descrito previamente (E. Simelyte et al., Arthritis & Rheumatism, 52(6): 1876-1884, 2005; Z. Han et al., Arthritis & Rheumatism 46(3):818-823, 2002; H. Miyahara et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 69(1):69-76, 1993). En este protocolo, la artritis pasiva inducida por colageno se indujo en ratones DBA/1 por administracion de anticuerpos anti-colageno de tipo II, que inducian una respuesta inmunitaria contra los tejidos de articulaciones en los animales. La eficacia en este modelo de artritis muestra eficacia principalmente contra la inflamacion, que se evalua de forma aislada de los efectos celulares que operan en la artritis. La gravedad de la artritis se evaluo usando un sistema de puntuacion clinico semicuantitativo. Se trataron grupos de 8 animales por grupo con 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol con 40 mg/kg/dia durante 14 dias ⁰ vehiculo durante 14 dias por alimentacion oral por sonda. El vehiculo era ciclodextrina-eter sulfobutilico al 30% en agua y la disolucion de farmaco era vehiculo con farmaco de concentracion 20 mg/ml.

Los animales se examinaron mediante la medicion del grosor del tobillo y la puntuacion de la artritis (4 puntos/pata), indicando la puntuacion mayor una artritis mas grave. El experimento termino despues de aproximadamente 14 dias, y se llevaron a cabo mediciones de expresion de genes y analisis histologico. Para el analisis histologico, se recogio la pata posterior izquierda, se fijo en formalina al 10% durante 24 h, se descalcifico y se sumergio en parafina. Las secciones de tejido se tineron con hematoxilina y eosina para safranina O-verde rapido para determinar el contenido de proteoglicanos. Se uso un sistema de puntuacion semicuantitativo para obtener la inflamacion sinovial, inflamacion extraarticular, erosion y perdida de proteoglicanos.

El tratamiento con el compuesto empieza despues de la administracion de los anticuerpos. El protocolo permite observar los efectos del tratamiento en el avance de la artritis. Los resultados mostraron que la artritis inducida por colageno en el grupo 1 se redujo en los animales del grupo 1 comparados con los animales del grupo 4 y los dias 7-14. La puntuacion clinica maxima en los animales tratados con vehiculo era 10,2 el dia 8 comparado con una puntuacion clinica maxima de 5,1 en los animales del grupo 1 el dia 7. Al final del protocolo el dia 14, la puntuacion clinica del grupo tratado con vehiculo era 7,8 comparado con la puntuacion del grupo de referenda que era 4,1. Las diferencias en la puntuacion clinica los dias 7-14 eran evidentes en los animales tratados, mostrando un nivel reducido de inflamacion presente en los animales tratados comparados con el grupo de animales de referenda con vehiculo. El efecto del tratamiento con el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol era similar al tratamiento con dexametasona, que tambien inhibe la inflamacion y reduce la gravedad de la artritis en esto modelo animal. La capacidad del 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol para reducir la gravedad de la artritis contrasta con supresores de la inmunidad mediada por celulas tales como el metotrexato ⁰ agentes anti-TNFa, que tienen poca eficacia en este modelo de artritis.

Ejemplo 11. Se investigo la capacidad de los compuestos de formula 1 para afectar a la lesion pulmonar inducida por LPS en ratones. Los modelos de lesion pulmonar inducida por LPS se han usado previamente para evaluar los tratamiento para la lesion pulmonar aguda (ALI), sindrome de dificultad respiratoria agudo (ARDS) y septicemia ⁰ choque por endotoxinas (Metz et al., C., Chest 100(4): 1110-9, 1991; Windsor, A.C. et al., Ann. J. Med. Sci. 306(2): 111-6, 1993; Brigham K.L. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 133(5): 913-27, 1986).

El protocolo llevado a cabo era esencialmente como se describe en Su, X. et al., Intenstive Care Med. 30:133-140, 2004. Ratones C57/BL6 hembra de 6-8 semanas de edad (peso corporal medio de 25 g) obtenidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) se distribuyeron aleatoriamente en grupos de 7 animales y se mantuvieron en alojamiento y con alimentacion estandar. Los grupos eran (1) ratones tratados con disolucion salina y LPS, (2) ratones tratados con vehiculo y LPS, (3) ratones tratados con 125 pg de dexametasona, (4) ratones tratados con androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol 40 mg/kg y LPS, (5) ratones tratados con 5a-androstano-3p,16a-diol-17-ona 40 mg/kg y LPS, (6) ratones tratados con 5a-androstano-3p,17p-dihidroxi-16-oxima 40 mg/kg y (7) ratones tratados con androst-5-eno-3a,7p,16a,17p-tetrol 40 mg/kg.

El dia -1 los ratones se trataron previamente con el compuesto o vehiculo. El dia 0 los ratones se trataron con una segunda dosis de compuesto o vehiculo. El dia 0 60 min los ratones se estimularon con 100 pg de LPS de E. coli (Sigma) con visualizacion directa de la traquea con anestesia ligera. El dia 2 (es decir, punto de medicion de 48 h despues de estimulacion con LPS) los ratones se sacrificaron y se obtuvieron los LBA (en los que se contaron las celulas y se midieron los niveles de TNFa/IL6). Se recogieron los pulmones, se picaron y se usaron para estudios de mieloperoxidasa (MPO). La inflamacion pulmonar aguda inducida por LPS se llevo a cabo mediante instilacion de 50 mg de LPS (£. Coli 0111:B4, Sigma-Aldrich) en 100 ml de PBS en las traqueas con anestesia ligera (isoflurano) con visualizacion directa. En el tiempo de medicion de 48 h los ratones se sacrificaron. Despues de esto, se establece una traqueotomia despues de exposicion de la traquea en la parte inferior del cuello. Se inserta una aguja de calibre 20 con extremo romo en la traquea expuesta, que despues se une y se usa para obtener el lavado broncoalveolar (LBA). Para minimizar la hemorragia y traumatismo de las vias respiratorias, el LBA se realiza usando 0,5 ml de PBS esteril x 3. Tipicamente se recuperan un total de 1300 ml de este procedimiento. Los recuentos celulares diferenciales de leucocitos se determinan en el liquido del LBA (LLBA) usando un hemacitometro. Los recuentos diferenciales se realizan en 80-100 celulas. Despues de obtener el LBA, la cavidad del pecho se abre y el corazon/pulmones se perfunden con 3 ml de disolucion salina esteril a traves de una puncion ventricular R. Despues se recoge todo el tejido pulmonar y se prepara para el ensayo de MPO. Para este ensayo, los pulmones se homogeneizan individualmente en tampon de fosfato de potasio (pH 6,0 que contiene bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 0,5%). Despues de centrifugacion (14.000 X g, 10 min 4°C) se anadieron 50 pi de liquido sobrenadante a 950 pi de tampon de fosfato de potasio que contiene dihidrocloruro de o-dianisidina 0,2 mg/ml (Sigma-Aldrich) y peroxido de hidrogeno al 0,00002%. Los cambios en la absorbancia se miden a 460 pm. Los niveles de citoquinas se determinan en el liquido sobrenadante exento de celulas del LLBA (200 X g, 10 min, 4°C) por analisis de ELISA para el TNFa, IL-6 (R&D Systems) usando analisis de ELISA disponibles en el comercio. Son particularmente llamativos los resultados para el androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol, para el que se encontro que los animales tratados por via oral con este compuesto tenian niveles reducidos de MPO, TNFa e IL-6 en el LBA comparado con los animales tratados con vehiculo. El efecto en la MPO, que es una medida de la carga de neutrofilos en el pulmon, y la citoquina proinflamatoria TNFa, era particularmente profundo. Esto sugiere la capacidad del compuesto para bloquear la migracion de celulas proinflamatorias a tejido inflamado, asi como para reducir la senalizacion de citoquinas proinflamatorias. En este modelo, la inflamacion aguda probablemente es dirigida por la estimulacion con LPS de elementos de la inmunidad innata. Muchos de estos mismos mediadores estan en un nivel mas elevado y se cree que estan implicados en la inflamacion pulmonar asociada con diferentes trastornos, incluyendo la fibrosis quistica, enfermedades pulmonares obstructivas cronicas, bronquitis aguda y cronica, e incluso algunas enfermedades infecciosas como la tuberculosis. La observacion de que el tratamiento con el androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol reduce notablemente los niveles de MPO y de citoquinas proinflamatorias en el LLBA a las 48 h, esta en consonancia con las actividades antiinflamatorias descritas en la presente memoria para el androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol en modelos especificos de enfermedad de inflamacion cronica, incluyendo la EAE.

Ejemplo 12. Reaccion mixta de linfocitos (MLR) humanos. La capacidad del 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano, 3p,17p-dihidroxi-16-oxoandrostano, 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol, y 17p-aminoandrost-5-eno-3p-ol para afectar a la estimulacion especifica de antigenos en la que los linfocitos T humanos responden a un antigeno extrano especifico (complejo de histocompatibilidad principal). La MLR se usa como un modelo in vitro de respuestas de hipersensibilidad de tipo retrasado y muestra el efecto que puede tener un compuesto en las respuestas de linfocitos T especificos de antigeno humano in vivo. La inhibicion de la MLR por un compuesto muestra un efecto de supresion inmunitaria del compuesto en los linfocitos. Los compuestos que no inhiben la MLR no son supresores inmunitarios para la activacion especifica de antigeno de los linfocitos que responden.

Se obtuvieron muestras de sangre de 3 (2 hombres, 1 mujer) voluntaries humanos sanos, en ayunas, de 23-31 anos de edad. Los sujetos no usaron farmacos antialergicos inmunomoduladores o antibioticos los tres meses antes del estudio. Se extrajo sangre de los sujetos a las 9 y 10 am para limitar las posibles fluctuaciones en los niveles en la circulacion de hormonas o citoquinas que podrian haber influido en las respuestas in vitro de sus linfocitos. Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) se aislaron por centrifugacion en gradientes de Ficoll-Hypaque (densidad 1,077, Biochrom AG, Berlin, Alemania) y se volvieron a suspender en medio de cultivo (RPMI 1640 complementado con L-glutamina 2 mM, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg/ml) (Invitrogen s.rl., Milan, Italia). Se uso plasma inactivado autologo (respondedor) al 10%. Se mezclaron 500.000 PBMC respondedoras (PBMCr) y 500.000 PBMC estimuladoras (PBMCs) alogenicas irradiadas (30 Gy) en una relacion 1:1 en 200 pi de medio y se cultivaron durante 6 dias en placas de fondo piano de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en una concentracion de 300 nM o 30 nM para cada uno de los 4 compuestos. Los compuestos se disolvieron en etanol y despues se diluyeron a la concentracion deseada con medio de cultivo, dando una disolucion final que contenia etanol al 0,01%. Este vehiculo se uso como referenda. Los controles tambien incluian PBMCr y PBMCs cultivadas por separado. Durante las ultimas 8 horas del periodo de cultivo las PBMC se pulsaron con [3H]-timidina 1 pCi/pocillo (Amersham, Milan, Italia). Despues las celulas se recogieron y se midio la incorporacion de radiactividad con un contador de celulas beta. Se calcularon las cpm medios de los pocillos por cuadruplicado. La proliferacion de linfocitos T se expreso como un indice de estimulacion: Sl=cpm (PMBCs xPBMCr)/ cpm (PBMCr) cpm (PBMCs). Se llevaron a cabo analisis estadisticos usando el ensayo t de Student. Las cpm obtenidas por cuadruplicado de cada compuesto de ensayo, se compararon con las respuestas proliferativas obtenidas en PBMCr y PBMCs de referencia cultivadas en presencia del vehiculo. Las diferencias se consideraron significativas con p<0,05.

Los resultados no mostraban inhibicion de la MLR por ninguno de los 4 compuestos excepto el 17p-aminoandrost-5-en-3p-ol 300 nM. Esto indicaba que el 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano, 3p,17p-dihidroxi-16-oxoandrostano y 17aetinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol, no eran inmunosupresores apreciables en este ensayo en concentraciones de 300 nM o 30 nM (p>0,05), mientras que el 17p-aminoandrost-5-en-3p-ol 300 nM era moderadamente inmunosupresor (p<0,05) comparado con las reacciones de referencia. Estos resultados muestran que el 3p,16adihidroxi-17-oxoandrostano, 3p,17p-dihidroxi-16-oxoandrostano y 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol no serian inmunosupresores para los linfocitos en seres humanos in vivo. Estos resultados estan de acuerdo con la capacidad de los compuestos de ser agentes antiinflamatorios (vease, p. ej. el ejemplo 7) sin ser inmunosupresores.

Ejemplo 13. Analisis de la inmunosupresion. Los esteroides glucocorticoides tales como la dexametasona o hidrocortisona tipicamente son inmunosupresores y tienen toxicidades significativas asociadas con su uso. Se examino la inmunosupresion en un ensayo de ganglios linfaticos popliteos de antigeno indicador en ratones, esencialmente como se ha descrito previamente (C. Goebel et al., Inflamm. Res., 45(Suppl. 2):S85-S90, 1996; R. Pieters et al., Environmental Health Perspectives 107(Suppl. 5): 673-677, 1999). Este protocolo se uso para analizar la actividad del 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol en el ensayo de ganglios linfaticos popliteos (PLN) para mostrar que el compuesto no tiene una actividad inmunosupresora apreciable in vivo. En este protocolo, el vehiculo era carboximetilcelulosa al 0,1%, disolucion salina al 0,9%, tween 80 al 2% y fenol al 0,05%, que contenia 17aetinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol en suspension, en los animales tratados con farmaco. La evaluacion de la actividad incluia (1) medir la supresion del numero de linfocitos totales, celulas secretoras de anticuerpos IgM, lgG1 e lgG2a (ASC) especificos de antigeno (ensayo ELISPOT) en celulas de ganglios linfaticos popliteos; (2) analisis de la expresion de marcadores de superficie celular (CD4, CD8, CD19, F480, CD80, CD86) por citometria de flujo de celulas vivas en suspension; y (3) produccion de IL-4, TNFa e IFNyDpor linfocitos in vitro (ELISA).

Se usaron grupos (n = 5 por grupo) de ratones BALB/C exentos de patogenos especificos. El grupo de referencia positiva se trato con vehiculo (alimentacion oral por sonda) y 5 pg/dia de dexametasona por inyeccion subcutanea para inducir inmunosupresion. Los animales de referencia con vehiculo (referencia negativa) se trataron solo con vehiculo (alimentacion oral por sonda). Un grupo de animales se trato con 0,1 mg/dia de 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol por alimentacion oral por sonda. Otro grupo se trato con 1 mg/dia de 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol administrado a los animales por alimentacion oral por sonda. Los resultados se analizaron por el ensayo t de Student de dos colas con varianzas iguales. Se inyecto a los animales en la almohadilla de la pata posterior derecha 50 pi de dosis de sensibilizacion recien preparada de TNP-OVA. Se administro dexametasona (inyeccion de fosfato de decadron; fosfato sodico de dexametasona) por inyeccion subcutanea en la nuca diariamente, inmediatamente despues de la sensibilizacion con TNP-OVA. El 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol se administro inmediatamente despues por alimentacion oral por sonda. Cinco dias despues de inyeccion de TNP-OVA, se extrajo sangre por puncion orbital, y los ratones se sacrificaron por dislocation cervical y se extirparon los ganglios linfaticos popliteos y se separaron del tejido graso adherente. Se prepararon suspensiones de celulas solas, se volvieron a suspender en 1 ml de PBS-BSA (1%) y se contaron. Se contaron las celulas y se midieron la IL-4, IL-5 e IFNy.

El numero medio de linfocitos en los PLN del grupo de referencia con vehiculo era 7,8 x 10s por ganglio linfatico comparado con 2,9 x 10s por ganglio linfatico en el grupo de animales tratado con dexametasona. Este menor recuento de linfocitos mostraba claramente la notable inmunosupresion que se observa tipicamente con el uso de dexametasona y otros compuestos glucocorticoides. A diferencia de esto, el grupo tratado con 1 mg/dia de 17aetinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol tenia 8,2 x 10s linfocitos por ganglio linfatico y el grupo tratado con 0,1 mg/dia de 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol tenia 11,1 x 10s linfocitos por ganglio linfatico. Los resultados mostraban que el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol no era inmunosupresor, sino que era potenciador inmunitario. El tratamiento con 1,0 mg/dia y 0,1 mg/dia de 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol aumento los niveles de IFNy, IL-4 e IL-5 comparado con el grupo de referencia con vehiculo, indicando tambien la potentiation inmunitaria. El efecto del 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol con 0,1 mg/dia en los niveles de IFNy, IL-4 e IL-5 era mayor que en el grupo que se trato con 1,0 mg/dia. A diferencia de esto, los niveles de IFNy, IL-4 e IL-5 eran menores en el grupo tratado con dexametasona comparado con el grupo de referencia con vehiculo o con cualquiera de los grupos tratados con farmaco.

Ejemplo 14. Analisis de la inmunosupresion. Se caracterizaron varios compuestos por su capacidad para afectar a las respuestas inmunitarias. Este protocolo examinada los efectos inmunitarios de los compuestos en un ensayo inmunitario convencional. El ensayo de respuesta inmunitaria especifica a la ovoalbumina (OVA) es un sistema bien establecido para medir las respuestas inmunitarias anamnesicas (tanto mediadas por celula como mediadas por anticuerpo). Se inmunizaron ratones BALB/c por inyeccion intraperitoneal (volumen total 200 pi) los dias 0 y 7 con 100 pg de OVA precipitada con alumbre (25 mg/ml) en disolucion salina. Los ratones (n = 5 por grupo) se trataron diariamente (alimentacion oral por sonda de 40 mg/kg, aproximadamente 1 mg/animal) durante 20 dias con compuesto. El dia 20, se extrajo sangre y se ensayaron por ELISA los titulos de anticuerpos contra la OVA. Los compuestos que se ensayaron fueron el 3p,16a-dihidroxi-17-oxoandrostano, 16a-bromoepiandrosterona, 17aetinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol, 17-oxima de 3p,16a-dihidroxiandrostano, 17p-aminoandrost-5-eno-3p-ol y 3a,16a,17p-trihidroxiandrostano. Ninguno de estos compuestos era profundamente inmunosupresor, con titulos de anticuerpo contra OVA similares a los del grupo de referenda con vehiculo.

Ejemplo 15. Disminucion de glucosa y mejora de la resistencia a la insulina. Se evaluaron los efectos de disminucion de la glucosa y la mejora de la resistencia a la insulina en el modelo de raton diabetico db/db de diabetes humana y resistencia a la insulina. En estos estudios, ratones C57BL/Ks db/db de aproximadamente 8 a 10 semanas de edad se dividieron en grupos de 10 cada uno y despues se trataron con una referenda con vehiculo (sin farmaco) o con 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol por alimentacion oral por sonda. El compuesto se administro dos veces al dia con 20 mg/kg/dia (dosis de 10 mg/kg administrada dos veces al dia), 40 mg/kg/dia (dosis de 20 mg/kg administrada dos veces al dia) u 80 mg/kg/dia (dosis de 40 mg/kg administrada dos veces al dia) durante hasta 28 dias. Se hizo el seguimiento de los niveles de glucosa en la sangre dos veces por semana durante el periodo de administracion, usando una cantidad minima de sangre (sangrados de muesca de la cola) para medir la concentracion de glucosa mediante tiras de glucometro. En momentos de tiempo especificos durante el periodo de administracion (dia 14 y dia 28), tambien se realizo una prueba de tolerancia oral a la glucosa (PTOG) por administracion de una dosis oral convencional de 1 g/kg de glucosa (aproximadamente 40 mg en un raton de 40 mg) y despues se hizo el seguimiento de la fluctuacion de los niveles de glucosa en la sangre rapidamente despues de 15, 30, 60 y 120 minutos despues de la dosis de glucosa. En el grupo tratado con farmaco, se observo una disminucion de los niveles hiperglucemicos de glucosa en la sangre de aproximadamente 40% en ratones db/db. La glucosa en la sangre alcanzo 380 mg/dl en el grupo de referenda con vehiculo y era <230 mg/ml despues de al menos 10 dias de administracion en el grupo tratado con farmaco. El tratamiento con dos dosis diarias de 80 mg/kg de farmaco dos veces al dia durante 28 dias redujo notablemente la variacion maxima de la glucemia de aproximadamente 400 mg/dl 30 min despues de administracion de glucosa oral observado en los animales tratados con vehiculo a <200 mg/dl en el grupo tratado con farmaco.

Ejemplo 16. Tratamiento de la hiperglucemia en ratones con obesidad inducida por la dieta (OID). El efecto de un farmaco para potenciar la sensibilidad periferica a la insulina se puede estudiar en un modelo de raton en el que se alcanza un estado de resistencia a la insulina mediante alimentacion de los animales con una dieta enriquecida en grasas (60% de la ingestion calorica total) durante al menos 6 semanas. Este modelo se ha descrito, por ejemplo, en J. N. Thupari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(14):9498-9502, 2002, H. Xu et al., J. Clin. Invest., 112:1821-1830, 2003, H. Takahashi et al., J. Biol. Chem., 278(47):46654-46660, 2003. En estas condiciones de dieta, los ratones presentaron un peso corporal aumentado (+35 g) y un estado de intolerancia a la glucosa, que se pone de manifiesto como un retraso significativo en el tiempo de depuracion de la glucosa administrada por via oral durante una PTOG (prueba de tolerancia oral a la glucosa) convencional.

Para estos estudios, animales de aproximadamente 4 semanas de edad se dividieron en grupos de 10 animales cada uno y despues se trataron con una referenda con vehiculo (sin farmaco) o con 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol por alimentacion oral por sonda. Se administraron 20 mg/kg, 40 mg/kg u 80 mg/kg de 17aetinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol dos veces al dia durante hasta 28 dias. El dia 14 y el dia 28 durante el periodo de administracion, se llevo a cabo una PTOG. En este modelo de OID de resistencia a la insulina, el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol redujo notablemente la intolerancia a la glucosa comparado con los animales de referenda con vehiculo, indicado por una mejora significativa de la variacion glucemica en la PTOG. Estos descubrimientos mostraron que el tratamiento con el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol potenciaba la sensibilidad o captacion de insulina periferica, lo cual mejoraba la intolerancia a la glucosa en estos animales.

Ejemplo 17. Se llevo a cabo un protocolo de tratamiento similar al descrito en el ejemplo 15 con ratones db/db que eran mas jovenes que los animales descritos en el ejemplo 15. Los animales (n = 8 a 10 por grupo) se trataron con 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol o vehiculo por alimentacion oral por sonda dos veces al dia con 40 mg/kg/dia (dosis de 20 mg/kg administrada dos veces al dia) y 80 mg/kg/dia (dosis de 40 mg/kg administrada dos veces al dia). Al inicio de la administracion, los animales tenian 6 semanas de edad, antes del inicio de los niveles elevados de glucosa o hiperglucemia. La administracion de vehiculo o de farmaco se mantuvo durante 32 dias para determinar el efecto de los tratamientos en el inicio y la velocidad de avance de la hiperglucemia en los animales. En el grupo de referenda, el inicio de la hiperglucemia se observo despues de 25 dias de administracion y continuo empeorando, es decir los niveles de glucosa en la sangre subieron de normales a hiperglucemia manifiesta al final del periodo de administracion de 32 dias. A diferencia de esto, los niveles de glucosa en ambos grupos de tratamiento no subieron por encima de niveles normales al final del periodo de administracion de 32 dias, mostrando que el tratamiento con el farmaco retrasaba el inicio de la hiperglucemia a lo largo del transcurso del protocolo.

La administracion de 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol a ratones macho diabeticos db/db de 8 semanas de edad suprimio notablemente los niveles hiperglucemicos de glucosa basal en la sangre, un efecto que era evidente despues de 10 dias de administracion y que se mantuvo durante 18 dias adicionales de tratamiento continuo de dos veces al dia en el grupo de dosis de 40 mg/kg. En ratones macho db/db mas jovenes, de 6 semanas de edad, el tratamiento con 40 mg/kg de 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol bloqueo completamente el avance de los animales al estado hiperglucemico que se observo en el grupo tratado con vehiculo despues de 25 dias de administracion. Los animales tratados mantuvieron niveles de glucosa en la sangre que eran comparables a los de las crias de la misma camada db/+ delgadas. Ademas, los resultados de las PTOG realizadas en el modelo de animales tratados mostro una mejora significativa de la intolerancia a la glucosa comparado con los animales de referenda con vehiculo.

Ejemplo 18. Disminucion de la glucosa en ratones diabeticos db/db de 8 semanas de edad. Se llevo a cabo el protocolo de pinzamiento hiperinsulinemico-normoglucemico para medir la sensibilidad a la insulina in vivo. En este procedimiento, se administro insulina para elevar la concentracion de insulina mientras que se infundia glucosa para mantener la normoglucemia o un nivel de glucosa en sangre normal, fijo (aproximadamente 180 mg/dl). La velocidad de infusion de la glucosa (VIG) necesaria para mantener la normoglucemia mostraba la accion de la insulina en estos animales. El objetivo de este protocolo era investigar la capacidad del 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol y el androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol para mejorar la resistencia a la insulina sistemica y mejorar la eliminacion de glucosa de todo el cuerpo en el modelo de pinzamiento hiperinsulinemico-normoglucemico. Tambien se evaluaron el grado de sensibilidad de la insulina del musculo esqueletico y hepatica y la captacion de glucosa especifica de tejido. La administracion a los animales fue diaria por alimentacion oral por sonda durante 14 dias. El dia 10 de tratamiento, se implantaron cateteres en la arteria carotida y en la vena yugular. El dia del pinzamiento (dia 14) se administro el compuesto a las 7:30 am.

Se evaluaron el peso corporal y la concentracion de glucosa el dia 0, 7 y el dia 14 de tratamiento. El dia 14 se realizo un pinzamiento normoglucemico-hiperinsulinemico. Se retiro el alimento a las 7:30 am y a las 10:30 una infusion continua cebada de [3-3H]-glucosa (0,05 pCi/min). Se tomo una muestra de sangre base a las 12:50 (-10 min) y a la 1:00 (0 min) se inicio un pinzamiento normoglucemico-hiperinsulinemico por administracion de 10 mU/kg/min de insulina. La glucosa se infundio a una velocidad variable para pinzar la concentracion de glucosa en -180 mg/dl. Se administro un bolo de [14C]-2-desoxiglucosa al final del estudio para evaluar la captacion de glucosa especifica de tejido. Se evaluo la [14C]-2-desoxiglucosa en el plasma a los 122, 125, 130, 135, 145 min. Despues los animales se anestesiaron con una infusion intravenosa de pentobarbital sodico y se extirparon tejidos seleccionados, se congelaron inmediatamente en nitrogeno liquido y se conservaron a -70°C hasta el analisis.

El analisis se llevo a cabo como sigue. Se desproteinizaron muestras de plasma con Ba(OH)2 (0,3 N) y ZnS04 (0,3 N), se secaron y se evaluo la radiactividad en un contador de centelleo (Packard TRICARB 2900 TR, Meriden, CT). Las muestras de tejido congeladas se homogeneizaron en acido perclorico al 0,5%, se centrifugaron y se neutralizaron. Se hizo el recuento directamente en un liquido sobrenadante para determinar la radiactividad tanto de [14C]-DG como de [14C]-DGP. Una segunda parte alicuota se trato con Ba(OH)2 y ZnS⁰⁴ para separar el 14C-DGP y cualquier trazador incorporado en el glucogeno y despues se hizo el recuento para determinar la radiactividad del [14C]DG(2) libre. Se calculo el [14C]DGP como la diferencia entre las dos partes alicuotas. La acumulacion de [14C]DGP se normalizo respecto al peso de tejido y el bolo de trazador. Se calculo Rg, un indice de captacion de glucosa especifico de tejido, como se ha descrito previamente (E.W. Kraegen et al., Am. J. Physiol., 248:E353-E362, 1985). El recambio de glucosa de todo el cuerpo se calculo como la relacion de la velocidad de infusion de 3H-glucosa (dpm/kg/min) y la actividad especifica de la glucosa plasmatica arterial (dpm/mg). La produccion endogena de glucosa se calculo como la diferencia entre el recambio de glucosa de todo el cuerpo y la velocidad de infusion de glucosa exogena (R.N. Bergman et al., Endocr. Rev., 6:45-86, 1985). Los grupos de tratamiento se resumen en la tabla mostrada a continuacion.

*vehiculo: eter sulfobutilico al 30% en agua (20 mg/ml de farmaco en disolucion para los grupos B-D)

**compuesto 1: 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol

compuesto 2: andros-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol

***maleato de rosiglitazona (31493r, AApin Chemicals Limited (Reino Unido)),

CMC - Carboximetilcelulosa (calidad media, C4888, Sigma)

La dosis de insulina era 10 mU/kg/min. En un animal normal, esta dosis de insulina requeriria una infusion de ~90 mg/kg/min de glucosa para mantener el nivel de glucosa pinzado en -150 mg/dl. El requisite medio de glucosa en todos los grupos de tratamiento era -50% el normal. Los resultados mostraban que tanto el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol como el andros-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol aumentaron la velocidad de infusion de glucosa comparado con la referencia con vehiculo, lo que significa que mejoro la accion de la insulina en los grupos B, C, D y E.

Usando el trazador 3-3H-glucosa, se calculo la velocidad de produccion de glucosa del higado durante el periodo basal y la capacidad de la insulina para suprimir la produccion de glucosa en el higado durante el pinzamiento. En animates resistentes a la insulina graves, la produccion de glucosa endogena se reduciria en aproximadamente 50% con la dosis de insulina que se uso. En los grupos C, D y E la insulina suprimio completamente la produccion de glucosa endogena (p<0,05), lo cual mostro una mejora en la accion de la insulina hepatica.

Para evaluar la accion de la insulina periferica, se evaluo la captacion de glucosa especifica de tejido durante el pinzamiento normoglucemico-hiperinsulinemico usando 14C-2-desoxiglcuosa. Se administro un bote de 14C-2-desoxiglcuosa a los 120 min. Los tejidos se recogieron 25 min despues. Se analizo en los tejidos la acumulacion total de fosfato de 14C-2-desoxiglcuosa. En este protocolo, la captacion de glucosa del cerebro no es afectada por la mayoria de los regimenes de tratamiento y por lo tanto sirve como un control interno. Los resultados mostraron que la captacion de glucosa del cerebro era comparable entre todos los grupos. En el corazon y el diafragma, la captacion de glucosa era mayor en los grupos tratados comparado con el grupo de referencia con vehiculo. Tanto el andros-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol como la rosiglitazona eran mas eficaces (p<0,05) en el aumento de la captacion de glucosa muscular en el musculo gastrocnemio. En el musculo vasto lateral, que es un grupo muscular no oxidativo, no se detectaron diferencias excepto entre el androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol y la rosiglitazona.

Ejemplo 19. Las ratas se alimentaron a voluntad con una comida de laboratorio convencional que contenia androst-5-eno-3p,7pi7p-triol al 0,45% en p/p durante 6 dias, seguido de analisis del tejido hepatico el dia 6 de los niveles de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (“PEPCK”) y 1 ip-hidroxiesteroide deshidrogenasa (“11P-HSD”) en el higado. Los animates de referencia se alimentaron con comida normal y se examinaron los niveles de PEPCK y 11P-HSD en los higados el dia 6, mediante medicion del ARN mensajero (ARNm) por RT-PCR. Tanto los animates de referencia como los tratados tenian acceso a agua. Se encontro que la administracion del compuesto en la comida durante 6 dias disminuia los niveles de 11P-HSD de tipo 1 (“ 11P-HSD1 ”) y PEPCK en el tejido hepatico como se muestra a continuacion. Los niveles de ARNm de PPARa en estos animates no se vieron afectados por la alimentacion con androst-5-eno-3p,7pi7p-triol.

_____________________________ ARNm 11P-HSD1________ ARNm PEPCK_______ ARNm PPARa________ referencia (sin compuesto) 100% 100% 100%

androst-5-eno-3P,7pi7P-triol_____45%___________________ 30%________________ 105%________________

En otro estudio, se encontro que la administracion a los ratones del compuesto 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17ptriol disminuia la expresion de la 11P-HSD1 en osteoblastos en aproximadamente 50%, lo cual esta de acuerdo con la observacion de que el compuesto tiene efectos de ahorro de hueso en ratones tratados con dexametasona, un glucocorticoide que induce perdida osea in vivo.

En otro estudio, el ARN total de tejido graso perigonadal de ratones db/+ delgados o db/db diabeticos, tratado con 20 mg/kg de 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol se aislo y se proceso para la RT/PCR cuantitativa usando cebadores especificos para la proteina-1 quimioatractora de monocitos (MCP-1) usando un sistema de deteccion en tiempo real multicolor iCycler iQ (Bio-Rad). Los niveles de expresion del ARN se normalizaron con respecto a la referencia con vehiculo. Se encontro que el compuesto disminuia los niveles de proteina-1 quimioatractora de monocitos (MCP-1) en aproximadamente 50%. Para este estudio, tambien se administro vehiculo a un grupo de referencia de ratones db/+ heterozigotos delgados de edades correspondientes (n = 7).

En otros compuestos tales como el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol, androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol, androst-5-eno-3p,7a, 16a, 17p-tetrol, androst-5-eno-3a,7p, 16a, 17p-tetrol, androst-5-eno-3p,4p, 16a, 17a-tetrol, androst-5-eno-3a,4p,16a,17p-tetrol o monoesteres o diesteres de estos compuestos, p. ej. compuestos que contienen uno o dos esteres acetate o propionato en las posiciones 36 17, se examino de una forma similar su capacidad para disminuir el nivel o la actividad de PEPCK o una 11P-HSD tal como la 11P-HSD de tipo 1 o la 11)3-HSD de tipo 2, en hepatocitos o celulas derivadas del higado o en otros tejidos o celulas tales como el rinon, musculo, tejido o celulas oseas, tejido o celulas adiposas o tejido o celulas del SNC, p. ej. neuronas o gliales.

Ejemplo 20. Inhibicion de la generacion de linfocitos T reguladores CD4+CD25+ T o su actividad in vivo. Linfocitos T CD4+CD25‘ purificados (5 x 10s celulas) de ratones congenicos B6.SJL (CD45.1) se transfirieron por adopcion a cada uno de cinco ratones B6 (CD45.2). Los linfocitos T CD4+CD25_ purificados se obtuvieron por separacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) de las celulas donantes al menos dos veces. Se inyecto vehiculo (carboximetilcelulosa al 0,1%, disolucion salina al 0,9%, tween 80 al 2%, fenol al 0,05%) o 16D-bromoepiandrosterona en vehiculo (1 mg/animal/dia en 100 pi de vehiculo) por via subcutanea antes de la transferencia de las celulas de los animales donantes CD45.1, y las inyecciones se continuaron diariamente durante 14 dias. Se recogieron el timo, los ganglios linfaticos y el bazo de los animales el dia 15. Se obtuvieron muestras de timo, ganglios linfaticos y bazo de los individuos, y las celulas se marcaron con anticuerpo de fluorescencia que se unia a CD4, CD25, CD103 o Foxp3. Despues, las celulas se analizaron por citometria de flujo para el recuento de los diferentes tipos de celulas. El resto de las celulas de los ganglios linfaticos y los bazos de cada grupo de tratamiento se mezclaron, se enriquecieron previamente para las celulas CD4+CD25+ y despues se analizaron los CD4+CD25+ que provenian de las celulas huesped (celulas CD45.2 endogenas) y de las celulas donantes (celulas CD45.1 que se convertian del fenotipo donante CD4+CD25_ al fenotipo CD4+CD25+ despues de residir in vivo durante 15 dias). Las celulas se analizaron por separacion celular. Para ensayar la funcion reguladora, se cocultivaron diferentes numeros de celulas CD45.1 convertidas o CD45.2 CD4+CD25+ endogenas purificadas con 2000 celulas respondedoras CD4+CD25_, 1 x 105 celulas de bazo irradiadas como celulas presentadoras de antigeno, y 0,5 mg/ml de anticuerpo anti-CD3. Se usaron celulas CD4+CD25+ recientes como referenda. La proliferacion se determine por medicion de la captacion de 3H-timidina 4 dias despues de inicio del cultivo.

Los resultados mostraban que el numero de linfocitos Treg CD45.1 CD4+CD25+ donantes en los bazos de los animales tratados con farmaco, es menor que el numero de linfocitos Treg CD45.1 CD4+CD25+ en bazos de animales tratados con referenda con vehiculo. El numero medio de celulas CD45.1 CD4+CD25+ en la referenda con vehiculo era 1,97 x 105 celulas comparado con una media de 0,62 x 105 celulas CD45.1 CD4+CD25+ en los animales tratados con farmaco.

El numero de linfocitos Treg CD45.2 CD4+CD25+ endogenos en los bazos de los animales tratados con farmaco tambien era menor que el numero de linfocitos Treg CD45.1 CD4+CD25+en los bazos de los animales de referenda con vehiculo. El numero medio de celulas CD45.2 CD4+CD25+ de la referenda con vehiculo era 9,54 x 105 celulas comparado con un numero medio de celulas CD45.2 CD4+CD25+ de 5,49 x 10s de los tratados con farmaco.

El numero medio de celulas CD45.2 CD4+CD25+ endogenas en el timo de los animales de referenda con vehiculo era 3,10 x 105 comparado con 1,59 x 105 en los animales tratados con farmaco.

El porcentaje de celulas CD45.1 CD4+CD25+CD103+ donantes comparado con las celulas CD4+CD25+ donantes totales en los bazos de animales tratados con farmaco era menor que el numero de linfocitos Treg CD45.1 CD4+CD25+CD103+ comparado con las celulas CD4+CD25+ donantes totales en los bazos de los animales de referenda con vehiculo. La proporcion de linfocitos Treg CD45.2 CD4+CD25+CD103+ endogenos era aproximadamente la misma en los bazos de los animales de referenda con vehiculo (13,85%) comparado con los animales tratados con farmaco (13,40%). La media de celulas CD45.1 CD4+CD25+CD103+ donantes para las referencias con vehiculo era 29,06% comparado con una media de 9,63% en los animales tratados con farmaco. El antigeno de superficie CD103 es expresado por linfocitos Treg activados. Estos indica que la proporcion relativa de celulas CD45.1 CD4+CD25+ activadas era menor en los animales tratados con farmaco que en las referencias con vehiculo, lo cual esta de acuerdo con la inhibicion de la actividad de los linfocitos Treg para las celulas donantes in vivo.

Las variaciones adecuadas de este protocolo incluyen (1) el uso de un numero mayor de linfocitos T CD4+CD25_ donantes por animal, p. ej., 1 x 106/animal, 1,5 x 106/animal o 2 x 106/animal, (2) diferentes dosificaciones diarias del farmaco, (3) una via diferente de administracion del farmaco, (4) un compuesto diferente como farmaco, y (5) inclusion de grupos adicionales de animales, p. ej., un grupo que recibe otro agente terapeutico tal como un glucocorticoide antiinflamatorio o supresor inmunitario tal como dexametasona o cortisol. Algunas de estas variaciones se pueden aplicar a los protocolos del ejemplo 3 o algunas de las referencias citadas.

Ejemplo 21. Aumento de linfocitos T reguladores CD4+CD25+ o de su actividad in vivo. El compuesto 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol se administro a ratones esencialmente como se ha descrito en un modelo animal de artritis inducida con colageno H. Offner et al., Clin. Immunol., 110:181-190, 2006.

Se usaron ratones DBA/1Lac/J para el estudio. Los ratones se obtuvieron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Harbor, MA) y se alojaron de acuerdo con las recomendaciones institucionales aplicables. Se uso colageno bovino de tipo II (bCII) para inducir la artritis inducida por colageno (CIA) inmunizando ratones de 8 semanas de edad con 200 pg de bCII emulsionado 1:1 con CFA que contenia 200 pg de Mycobacterium tuberculosis (100 pi; Difco, Detroit, Ml). El antigeno se inyecto por via intradermica en la base de la cola. Se hizo el seguimiento de los animales durante 4-7 semanas para observar el inicio y el avance de la enfermedad despues de inmunizacion. La gravedad artritica se evaluo con un sistema de calificacion para cada pata de acuerdo con la siguiente escala: 0 = no hay enrojecimiento ni hinchamiento; 1 = ligero hinchamiento en el tobillo o enrojecimiento en la pata; 2 = hinchamiento e inflamacion avanzados y enrojecimiento desde el tobillo a la mitad de la pata; 3 = hinchamiento e inflamacion de toda la pata; 4 = hinchamiento e inflamacion de toda la pata incluyendo la punta de los dedos.

Despues de inmunizacion, los ratones se trataron con el farmaco con 40 mg/kg/dia en vehiculo por alimentation oral por sonda empezando al inicio de la enfermedad clinica observable (inicio aproximadamente 26-27 dias despues de inmunizacion). El vehiculo que se usd para el protocolo era ciclodextrina-eter sulfobutilico al 30% en agua. La ciclodextrina-eter sulfobutilico se obtuvo en el comercio (Captisol™ disponible en cydexinc.com). La formulacidn del farmaco era 20 mg de farmaco/ml en el vehiculo.

Los resultados obtenidos de los animales tratados con farmaco indicaban que la administracion del 17aetinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol aumentaba la frecuencia de celulas que expresan Fox3+ y CD4+Foxp3+ en esplenocitos enteros como se muestra a continuacion.

El analisis en el separador celular mostro un aumento de las celulas Foxp3+ CD4+ en animales tratados con farmaco (1,4%) con respecto a los animales de control (1,0%). La proteina Foxp3 esta asociada con la diferenciacidn o conversion de linfocitos T CD4+CD25_ en linfocitos Treg CD4+CD25+ y un aumento del numero de celulas que expresan Foxp3 indicaba mayor desarrollo de linfocitos Treg a partir de sus celulas precursoras. Despues de inmunizacion, los ratones se trataron con 40 mg/kg/dia de farmaco en vehiculo por alimentacidn oral por sonda empezando al inicio de la enfermedad clinica observable (inicio aproximadamente 26-27 dias despues de inmunizacion). Los resultados obtenidos de los animales tratados con farmaco indicaban que la administracion del 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol aumentaba la frecuencia de celulas que expresan Foxp3+ y CD4+Foxp3+ en esplenocitos enteros como se muestra a continuacion. Estaba de acuerdo con esto la puntuacion clinica estadisticamente mejorada en los animales tratados con farmaco comparado con las referencias con vehiculo, los dias 44-49 despues de inmunizacion. Entre los dias 34-49 los animales de referenda con vehiculo tenian una puntuacion clinica media de aproximadamente 6,8-8, mientras que los animales tratados con farmaco tenian una puntuacion clinica media maxima de aproximadamente 5 el dia 34, con un lento retroceso a una puntuacion media de aproximadamente 3 el dia 49. Estos resultados indicaban que el compuesto ralentizaba el avance de la artritis y reducia su gravedad maxima comparado con los animales de referenda con vehiculo.

Ejemplo 22. A continuacion se describe la sintesis de los compuestos

Androst-5-eno-3B.7B.16a.17B-tetrol (7).

Diacetato de 5-androsteno-3p,16a-diol-17-ona (3). La 16a-bromodeshidroepiandrosterona 2 se prepare mediante calentamiento a reflujo de DHEA (1) en metanol con bromuro de cobre (II). A 15,0 g del compuesto 2 (40,8 mmol) en piridina (129 ml) y agua (309 ml) se anadieron 120 ml de hidroxido sodico acuoso 1 N y la mezcla se agito en aire durante 15 minutos. La mezcla de reaccion se vertio en hielo/agua saturada con cloruro sodico y que contenia exceso de acido clorhidrico. El producto bruto se filtro, se lavo con agua hasta neutralidad y se seco a vacio sobre cloruro de calcio anhidro a 55-60°C. La recristalizacidn en metanol proporciono 8,21 g de 16a-hidroxi-DHEA (P.f.

194,4-195,1°C). Despues, este producto se convirtio en el diacetato 3 por tratamiento con exceso de acido acetico en piridina y se purified por cromatografia ultrarrapida.

5-Androsteno-3p,16a-diol-7,17-diona (5). A una disolucion del compuesto 3 (20,1 g, 51,7 mmol) en benceno que contenia celite (60 g) y dicromato de piridinio (75 g) se anadieron 22 ml de hidroperoxido de terc-butilo al 70%. Despues de 2 dias de agitacion a temperatura ambiente, se anadio eter dietilico (600 ml) y el precipitado se filtro y se lavo con eter dietilico (2 x 100 ml). El residuo se purified por cromatografia ultrarrapida (acetato de etilo en hexanos al 60%) y se recristalizo para dar 16,0 g (39,8 mmol, 77%) del compuesto 5 en forma de prismas. P.f.

205,6-206,2°C.

5-Androsteno-3p,7p,16a,17p-tetrol (7). A una disolucion del compuesto 5 (10,0 g, 24,8 mmol) en diclorometano (75 ml) y metanol (255 ml) a 0°C se anadieron 1,5 g de borohidruro de sodio y la mezcla se agito a 0°C durante 1 h. Despues de inactivacidn con acido acetico (3,5 ml) la mezcla de reaccion se repartio entre diclorometano y agua. La capa organica se concentro hasta una mezcla de diacetato de tetroles 7a y 7p. La mezcla se purified por cromatografia ultrarrapida y HPLC para dar 2,90 g del epimero 7p (9,5 mmol, 38%). P.f. 216,8-220,8°C. La saponificacion en metanol (100 ml) con hidroxido de sodio 1 N (60 ml) durante 2 dias a temperatura ambiente y purificacion por HPLC dio el compuesto 7 (1,41 g, 4,4 mmol, 46%) en forma de agujas finas del acetonitrilo acuoso. P.f. 202,1-206,4°C; [a]D 1,35 (metanol, c=1). Picos de RMN 1H seleccionados (CDsOD): d 0,77 (s, 3H), 1,01 (s, 3H), 3,39 (d, 1H), 3,46 (m, 1H), 3,74 (t, 1H), 4,04 (m, 1H), 5,55 (dd, 1H).

3a,7a,17p-Triacetoxiandrost-5-eno-16a-ol (8), androst-5-eno-3a,7a,16a,7p-tetrol (9).

16a-Bromo-5-androsten-3a-ol-17-ona (2). Una disolucion de 5-deshidroandrosterona (1) (17,8 g, 61,7 mmol) en metanol (1,35 litros) se calento a reflujo con bromuro de cobre (II) (36,4 g, 163 mmol) con agitacion durante 19 h. A la mezcla de reaction enfriada se anadio agua (1,35 litros) y diclorometano (1,5 litros). La capa organica se filtro a traves de sulfato de sodio anhidro y el producto cristalizo en metanol en forma de agujas finas (16,7 g, 45,5 mmol, 74%). P.f. 195-207°C.

3a,16a-Diacetoxi-5-androsten-17-ona (4). A una disolucion del compuesto 2 (12,0 g, 32,7 mmol) en piridina (1,032 litros) y agua (0,247 litros) en aire se anadio hidroxido sodico acuoso 1 N (90 ml) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 15 min. La mezcla de reaccion se anadio a una mezcla de hielo/agua que contenia 1,2 litros de acido clorhidrico 1 N. Despues de saturation de la disolucion con cloruro sodico, se extrajo con acetato de etilo (2 x 1 litros). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera (250 ml), se filtraron a traves de sulfato sodico anhidro y se concentraron. El 5-androsteno-3a,16a-diol-17-ona (3) se trato con exceso de anhidrido acetico en piridina a temperatura ambiente durante la noche y se purified por columna para dar el compuesto 4 (7,46 g, 19,2 mmol, 59%) en forma de prismas en metanol. P.f. 172,7-173,7°C.

3,16-Diacetato de 5-androsteno-3a,16a,17p-triol (5). A una disolucion de diacetato de la enodiolona 4 (7,46 g, 19,2 mmol) en diclorometano (45 ml) y metanol (120 ml) a 0°C se anadio borohidruro sodico (950 mg). La disolucion se agito a 0°C durante 1 h. Despues de adicion de exceso de acido acetico, la mezcla de reaccion se repartio entre diclorometano y agua. La capa organica se filtro a traves de sulfato de sodio anhidro y se concentro para dar una mezcla de los epimeros 17a (minoritario) y 17p (mayoritario). Esta mezcla se purified por cromatografia ultrarrapida (acetato de etilo en hexanos al 25%) para dar 6,1 g (15,6 mmol, 81%) del epimero 17p 5. P.f. 126,9-128,6°C. El triacetato 6 se hizo a partir del compuesto 5 tratado con exceso de anhidrido acetico en piridina a temperatura ambiente durante la noche, y se purified por columna para dar 6,0 g (13,9 mmol, 89%).

Triacetato de 5-androsteno-3a,16a,17p-triol-7-ona (7). Una disolucion del triacetato 6 (6,0 g, 13,9 mmol) en benceno (255 ml) se trato con celite (25,5 g), dicromato de piridinio (31,5 g) e hidroperoxido de ferc-butilo al 70% (9,0 ml) y se agito a temperatura ambiente durante 19 h. Se anadio eter dietilico anhidro (255 ml) y la mezcla de reaccion se enfrio en un bano de hielo durante 1 h. El solido resultante se separo por filtracion y se lavo con eter dietilico (2 x 50 ml). Las porciones organicas combinadas se concentraron y se purificaron por cromatografia ultrarrapida (acetato de etilo en hexanos al 29%) para dar 3,45 g del compuesto 7 (7,7 mmol, 55%).

5-Androsteno-3a,7a,16a,17p-tetrol (9). A una disolucion del compuesto 7 (3,45 g, 7,7 mmol) en diclorometano (15 ml) y metanol (30 ml) a 0°C se anadio borohidruro sodico (1,0 g) y la disolucion se agito a 0°C durante 2 h. Despues de anadir acido acetico en exceso (1,5 ml), la mezcla de reaccion se repartio entre diclorometano y agua. La capa organica se filtro a traves de sulfato sodico anhidro y se concentro para dar una mezcla de los epimeros 17a (minoritario) y 17p (mayoritario). Esta mezcla se saponified en metanol (100 ml) con hidroxido sodico 1 N (60 ml) durante la noche a temperatura ambiente. Los tetroles brutos se recuperaron por reparto de la mezcla de saponificacion entre acetato de etilo y salmuera. Los epimeros se separaron por HPLC para dar 220 mg del compuesto 9 (0,68 mmol, 9%). P.f. 243-248,3°C. Picos de RMN 1H seleccionados (CD³OD): 80,77 (s, 3H), 1,02 (s, 3H), 2,11 (m, 1H), 2,57 (m, 1H), 3,34 (s, 1H), 3,44 (d, 1H), 3,70 (t ancho, 1H), 4,04 (m, 2H), 5,55 (dd, 1H). Los epimeros de 8 se separan por HPLC para obtener el compuesto 8 purificado y su epimero 7p-acetato.

3B-Acetato de androst-5-eno-3B.7B.11B.17B-tetrol (8L androst-5-eno-3B.7B.11B.17B-tetrol (9L 3B-acetato-11-oxima de androst-5-eno- 3B.7BDl7B-tetrol (101.

I: A una disolucion del compuesto 1 (4 g) en 150 ml de AC²O, se anadieron 2,8 g de p-TsOH a temperatura ambiente, durante la noche, despues se trato por adicion de 700 ml de agua helada, agitando durante 1 h hasta que se formo un solido, y se filtro para dar el producto solido bianco 2, 4,55 g.

II: A una disolucion de 1,5 g de NaBH4 en 35 ml de EtOH y 5 ml de MeOH, se anadio lentamente una disolucion del compuesto 2 (1,2 g) en 30 ml de EtOH y 10 ml de cloroformo a 0°C. La disolucion se continuo agitando durante 2 h a 0°C, y despues a temperatura ambiente 2 h. Despues de este tiempo se anadieron 4 ml de acido acetico para inactivar el NaBhU, y despues 50 ml de agua. El producto se aislo por extraccion con EtOAc 50 ml x 3, y separacion del disolvente a vacio para dar el producto bruto. La purificacion se llevo a cabo por cromatografia en columna para dar el compuesto 3, 250 mg.

Ill: A una disolucion del compuesto 3 (200 mg) en 8 ml de MeOH, se anadio una disolucion de 0,36 g deHsICte en 2 ml de agua, agitando durante 1 h a temperatura ambiente, se separo el disolvente a vacio, se anadio agua y se extrajo con diclorometano. La purificacion usando cromatografia en columna dio el producto 4, 60 mg.

IV: A una disolucion del compuesto 4 (0,4 g) en 5 ml de piridina, se anadieron 0,5 ml de cloruro de acetilo, lentamente a 0°C, y se continuo agitando durante 15 min a 0°C, y despues a temperatura ambiente durante 30 min. La reaccion se inactivo por adicion de 20 ml de agua, se extrajo con EtOAc 15 ml x 3, se lavo con HCI 1 N, disolucion saturada de NaHC03, salmuera, y despues se seco sobre Na2S04. La concentracion a vacio dio el compuesto 5, 520 mg.

V: A una disolucion del compuesto 5 (0,5 g) y 0,13 g de Cul en 15 ml de acetonitrilo, se anadieron lentamente 3 ml de t-BuOOH al 70%, agitando durante 1 h y despues a 50°C durante 2 h. Se anadieron 12 ml de disolucion de Na2S205 al 10%, se extrajo con EtOAc, se seco sobre Na2S04, se separo el disolvente, y se llevo a cabo una columna para dar el compuesto 6 ^, 80 mg.

VI: A una disolucion del compuesto 6 (50 mg) en 1,5 ml de THF y 3 ml de MeOH, se anadieron 260 mg de CeCl3.7H20, despues se anadieron lentamente 75 mg de NaBH4 a 0°C, agitando durante 30 min, se anadieron 0,5 ml de HCI 1 N y 5 ml de agua, se extrajo con EtOAc 5 ml x 3, se seco sobre Na2SC>4, y se separo el disolvente para dar el compuesto 7, 49 mg.

VII: A una disolucion de 300 mg de NaBH4 en 4 ml de EtOH y 1 ml de MeOH, se anadio una disolucion del compuesto 7 (40 mg) en 0,5 ml de EtOH y 0,5 ml de cloroformo agitando durante 8 h a 0°C, y despues en un refrigerador durante la noche. Se anadio acido acetico para inactivar la reaccion, se anadio agua y se extrajo con EtOAc para dar el compuesto 8 ^, 30 mg. P.f. >250°C; RMN 1H (CDsOD) 80,86 (s, 3H), 1,35 (s, 3H), 1,95 (s, 3H), 3,55 (t, 1H, J = 7,5 Hz), 3,71 (dd, 1H, J =7 Hz, J = 2,5 Hz), 4,32 (d, 1H, J = 2,7 Hz), 4,55 (m, 1H), 5,21 (s, 1H)

VIII: A una disolucion del compuesto 8 (30 mg) en 1 ml de MeOH, se anadio una disolucion de 50 mg de NaOH en 0,25 ml de agua. Se agito durante 15 min a 50°C, despues se anadio 1 ml de HCI 1 N, 5 ml de agua, se extrajo con EtOAc 5 ml x 3, y se separo el disolvente para dar el compuesto 9, 20 mg. P.f. 170-172°C; RMN 1H (CD ³ OD) 80,95 (s, 3H), 1,32 (s, 3H), 3,41 (m, 1H), 3,51 (t, 1H, J = 8,0 Hz), 3,78 (dd, 1H, J =7,1 Hz, J = 2,5 Hz), 4,31 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 5,15 (s, 1H) .

IX: A una disolucion de 29 mg de NH²OH.HCI y 17 mg de NaOH en 1 ml de EtOH caliente, se anadio una disolucion del compuesto 9 (50 mg) en 1 ml de EtOH caliente, calentando a reflujo durante 2 h a 100°C, se separo la sal por filtracion, y se recristalizo en EtOH/H20 para dar el compuesto 10, 40 mg. P.f. > 250°C; RMN 1H (CD ³ OD) 80,72 (s, 3H), 1,02 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 3,86 (t, 1H, J = 8,5 Hz), 4,08 (dd, 1H, J =8,0 Hz, J = 2,6 Hz), 4,60 (m, 1H), 5,19 (s, 1 H ) .

17a-Metilandrost-5-eno-3B.17B-diol-3B-acetato-7.11-diona (71. 17a-metilandrost-5-eno-3B.7B.17B-triol-3B-acetato-11-ona (81. metilandrost-5-eno-3B.7B.17B-triol-11-ona (91.

I: A una disolucion del compuesto 1 (4 g) en 150 ml de AC²O, se anadieron 2,8 g de p-TsOH, T.a., durante una noche, se trato por adicion de 700 ml de hielo-agua, agitando durante 1 h, y se filtro el solido para dar un producto bianco 2, 4,55 g.

II: A una disolucion de 1,5 g de NaBhU en 35 ml de EtOH y 5 ml de MeOH, se anadio una disolucion del compuesto 2 (1,2 g) en 30 ml de EtOH y 10 ml de cloroformo a 0°C, lentamente, y se continuo agitando durante 2 h a 0°C, y a t.a. 2 h, se anadieron 4 ml de acido acetico para inactivar el NaBH4, se anadieron 50 ml de agua, se extrajo con EtOAc 50 ml x 3, y despues se separo el disolvente para dar el producto bruto. La columna dio el compuesto 3, 250 mg.

Ill: A una disolucion del compuesto 3 (200 mg) en 8 ml de MeOH, se anadio una disolucion de 0,36 g de H⁵IO⁶ en 2 ml de agua, se agito durante 1 h a t.a., se separo el disolvente, se anadio agua y se extrajo con DCM, y despues se trato en una columna para dar el producto 4, 60 mg.

IV: A una disolucion del compuesto 4 (250 mg) en 1,5 ml de THF y 3,5 ml de eter dietilico a -78°C en atmosfera de N², se anadio lentamente 1 ml de MeMgCI al 22% en THF, agitando durante 1,5 h a -78°C, despues a t.a. durante 1 h, y despues calentando a reflujo durante 1 h a 75°C. Se anadieron 4 ml de HCI 1 N y 10 ml de agua a 0°C. La extraccion con EtOAc, y separacion del disolvente dio el producto bruto, 249 mg. La separacion en columna dio el compuesto 5, 46 mg.

V: A una disolucion del compuesto 5 (1,0 g) en 15 ml de piridina, se anadieron lentamente 1,1 ml de cloruro de acetilo a 0°C, agitando durante 15 min a 0°C, despues a T.a. durante 30 min. Se anadieron 50 ml de agua, se extrajo con EtOAc 50 ml x 3, se lavo con HCI 1 N, disolucion saturada de NaHC03, salmuera y se seco sobre Na2S04. La separacion del disolvente dio el compuesto 6 ^, 1,02 g.

VI: A una disolucion del compuesto 6 (1,0 g) y 0,3 g de Cul en 40 ml de acetonitrilo, se anadieron lentamente 6 ml de t-BuOOH al 70%, agitando durante 1 h a t.a. y despues a 50°C durante 2 h. Se anadieron 24 ml de disolucion de Na²S²⁰⁵ al 10%, se extrajo con EtOAc, se seco sobre Na2SC>4, se separo el disolvente y se separo por columna para dar el compuesto 7, 285 mg. P.f > 250°C; RMN 1H (CD ³ CI) 80,82 (s, 3H), 1,29 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 4,70 (m, 1H,), 5,75 (s, 1H).

VII: A una disolucion del compuesto 7 (45 mg) en 1,5 ml de THF y 3 ml de MeOH, se anadieron 150 mg de CeCl3.7H20, despues se anadieron lentamente 30 mg de NaBH4 a 0°C, agitando durante 10 min, se anadieron 0,5 ml de HCI 1 N y 5 ml de agua, se extrajo con EtOAc 5 ml x 3, se seco sobre Na2S04, y se separo el disolvente para dar el compuesto 8 ^, 41 mg. P.f. 108-110°C; RMN 1H (CD³OD) 80,725 (s, 3H), 1,25 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 4,02 (dd, 1H, J =8,2 Hz, J = 2,4 Hz), 4,53 (m, 1H, ), 5,29 (s, 1H).

VIII: A una disolucion del compuesto 8 (22 mg) en 1 ml de MeOH, se anadio una disolucion de 23 mg de NaOH en 0,1 ml de agua. Se agito durante 10 min a 50°C, y despues se anadieron 1 ml de HCI 1 N, 5 ml de agua, y EtOAc 5 ml x 3 para la extraccion. La separacion del disolvente dio el compuesto 9, 10 mg. P.f. > 250°C; RMN 1H (CD ³ OD) 8 0,75 (s, 3H), 1,24 (s, 3H), 3,41 (m, 1H), 3,99 (dd, 1H, J =8,2 Hz, J = 2,5 Hz), 5,23 (s, 1H).

17a-Etinilandrost-5-eno-3B.7B.16a,17B-tetrol (8), 17B-etinilandrost-5-eno-3B.7B.16a,17a-tetrol (9),

I: A una disolucion del compuesto 1 (1,0 g) y 0,56 g de imidazol en 15 ml de DMF, se anadieron 1,24 g de TBDMS-Cl, t.a., durante una noche, se trato por adicion de 50 ml de agua, se formo un solido, y se separo por filtracion para dar un producto solido bianco 2, 1,75 g.

II: A una disolucion del compuesto 2 (1,64 g) en 50 ml de THF enfriada a -78°C, se anadieron 2,3 ml de LDA, 30 min despues se anadieron lentamente 0,62 ml de TMSCI, agitando durante 30 min a -78°C, despues se calento a t.a. agitando durante 1 h, el analisis por TLC mostro que la reaccion se habia completado, y la extraccion con eter dietilico 150 ml x 2, lavado con agua y salmuera, y secado sobre IX^SCUdieron el producto amarillo 3, 1,87 g.

Ill y IV: A una disolucion del compuesto 3 (10 g) en 250 ml de THF enfriada a -20°C, se anadieron 4,2 g de m-CPBA, agitando durante 3 h para formar el compuesto 4, despues se anadieron lentamente 250 ml de MeOH, agitando durante 30 min a -20°C, despues se anadieron lentamente 200 ml de disolucion de Na2SC>3 a -20°C, agitando durante 1 h. Se calento a t.a., se extrajo con eter 150 ml x 3, se lavo con disolucion saturada de NaHCC>3, salmuera, y despues se seco sobre Na2SC>4 para dar 11 g de producto bruto. Con el fin de separar algo de mCPBA extra en el producto, se paso por una columna corta, hexano al 100% 50 ml x 5, y despues Hex/EtOAC al 50% 100 ml x 5, para recoger el producto bruto 5, 8,5 g.

V: A una disolucion de 10 g de complejo de acetiluro de litio y etilendiamina al 90% en 250 ml de THF seco, se anadio una disolucion del compuesto 5 (5 g) en 50 ml de THF seco mediante una bomba con jeringa, tardandose aproximadamente 8 h. Se dejo agitar durante una noche a t.a. Se anadieron 500 ml de agua a 0°C, se extrajo con EtOAc 150 ml x 3, se lavo con 200 ml de HCI 0,1 N, 150 ml de disolucion saturada de NaHCC>3, 100 ml de salmuera, se seco sobre Na2SC>4, y se separo el disolvente para dar 5,5 g de producto bruto, y se separo en columna para recoger dos isomeros, 17-p-OH, 6 (1,5 g) y 17-a-OH, 7 (1,2 g).

VI: A una disolucion del compuesto 6 (265 mg) en 4 ml de MeOH y 3 ml de THF, se anadieron 4 ml de HCI 1 N a t.a., 1,5 h. Se anadieron 10 ml de disolucion saturada de NaHC03, se separo el disolvente organico a t.a., se anadieron 10 ml de agua, se almaceno en el refrigerador durante la noche para separar el agua, se anadio THF al solido, se filtro, se separo el THF para dar un producto solido bianco 8 ^, 130 mg. P.f. 214-216°C; RMN 1H (CD ³ OD) 80,92 (s, 3H), 1,06 (s, 3H), 2,99 (s, 1H), 3,42 (m, 1H), 3,72 (dt, 1H, J =7,2 Hz, J = 2,5 Hz), 4,17 (dd, 1H, J =8,2 Hz, J = 2,7 Hz), 5,24 (d, 1H, J = 1,0 Hz).

VII: A una disolucion del compuesto 7 (500 mg) en 8 ml de MeOH y 6 ml de THF, se anadieron 8 ml de HCI 1 N a t.a. durante 1,5 h. Se anadio disolucion saturada de NaHCC>3 para neutralizar la disolucion a pH = 8. Se anadieron 50 ml de agua para obtener un solido bianco, se filtro, se lavo con agua, se seco a vacio para dar el producto solido bianco 9, 225 mg. P.f. >250 °C; RMN 1H (CDsOD) 50,90 (s, 3H), 1,06 (s, 3H), 2,75 (s, 1H), 3,42 (m, 1H), 3,72 (dt, 1H, J =7,0 Hz, J = 2,0 Hz), 4,37 (dd, 1H, J =8,1 Hz, J = 2,6 Hz), 5,24 (t, 1H, J = 2,0, J = 1,0 Hz).

4β-Acetilandrost-5-eno-3β,16α,17β,triol (7), androst-5-eno-3β,4β,16α,17β-tetrol (compuesto 8).

Etapa 1: Una mezcla del compuesto 1 (24,0 g, 0,0832 mol) y bromuro de cobre (56,0 g, 0,20 mol) en metanol anhidro (800 ml) se calento a reflujo durante 16 h. La mayor parte del disolvente se separo a vacio y se anadio agua (500 ml). El precipitado resultante se recogio por filtracion y se lavo con agua. El solido se recristalizo en metanol dos veces para dar el compuesto 2 en forma de un solido amarillo palido (19,7 g).

Etapa 2: A una disolucion en agitacion del compuesto 2 (22,0 g, 0,060 mol) en 200 ml de N,N-dimetilformamida se anadio una disolucion acuosa de hidroxido sodico 1 N (66 ml, 0,066 mol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 h. Se anadieron acido clorhidrico acuoso 1 N (8 ml) y 400 ml de agua. El precipitado resultante se recogio por filtracion y se lavo con agua. La purificacion de este producto bruto por recristalizacion en metanol dio el compuesto 3 en forma de un solido bianco.

Etapa 3: A una disolucion del compuesto 3 (11,8 g, 0,0387 mol) en piridina (50 ml) se anadio cloruro de acetilo (11,8 g, 0,128 mol) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 1 h. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito durante 1 h mas. Se anadio agua. El precipitado se recogio por filtracion y se lavo con agua. El solido se seco a vacio para dar el compuesto 4 (12,6 g) con el que se continuo sin mas purificacion. Etapa 4: Se anadio hidruro de litio y aluminio (1,13 g, 0,030 mol) a una disolucion fria (0°C) del compuesto 2 (3,10 g, 0,00916 mol) en 80 ml de eter anhidro en atmosfera de nitrogeno. Se retiro el bano de hielo y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 0,5 h y despues se calento a reflujo durante 1 h. La reaccion se inactivo por la adicion de acido clorhidrico acuoso 6 N. Se separo el eter dietilico a presion reducida. El solido resultante se filtro y se lavo con agua. El producto bruto se recristalizo en metanol para dar el compuesto 5 (1,1 g) en forma de un solido bianco.

Etapa 5: A la disolucion del compuesto 5 (914 mg, 2,98 mmol) en 20 ml de cloroformo se anadio bromo (303 mg, 3,16 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 20 min. Se separo el disolvente a presion reducida para dar el compuesto 6 con el que se continuo sin mas purificacion.

Etapa 6: Preparacion del 4p-acetilandrost-5-eno-3p,16a,17p-triol (7).

El compuesto 6 se disolvio en 30 ml de eter dietilico anhidro y 10 ml de piridina anhidra. Se anadio una disolucion de acetato de plata (1,03 g, 1(914 mg, 2,98 mmol) en 5 ml de piridina anhidra. La mezcla de reaction se agito en la oscuridad durante 0,5 h. Se deposito un precipitado verdoso pesado. Se anadio eter (50 ml) y el precipitado se separo por filtration. El filtrado se llevd a sequedad a vacio. El residuo se purified por cromatografia en gel de silice eluida con acetato de etilo:hexanos 50:50 para dar el compuesto del titulo 7 (124 mg) en forma de un solido bianco. Datos seleccionados de RMN 1H: (CDsOD, 300 MHz): 85,78 (d, 1 H, J = 2,2 Hz), 5,34 (ancho, 1 H), 4,02 (t, 1 H, J = 4,5 Hz), 3,52 (dt, 1 H, J = 7,7 Hz, 3,0 Hz), 3,37 (d, 1H, J = 4,9 Hz), 2,03 (s, 3 H), (1,12 (s, 3H), 0,75 (s, 3H). Punto de fusion: 152-153°C.

Etapa 7: Preparacion del androst-5-eno-3p,4p,16a,17p-tetrol (8). El compuesto 7 (50 mg, 0,137 mmol) se disolvio en hidroxido sodico acuoso 1 N (1 ml) y metanol (5 ml) y la disolucion resultante se calento a reflujo durante 1 h. El metanol se separo a vacio y el residuo se extrajo con acetato de etilo (3 x 30 ml). Los extractos combinados se secaron sobre sulfato magnesico, se filtraron y se concentraron a vacio para dar un solido. El producto bruto se purified por recristalizacidn en metanol para dar el compuesto del titulo 8 (23 mg) en forma de un solido bianco. Datos seleccionados de RMN 1H: (CDsOD, 300 MHz): 85,62 (d, 1 H, J = 3,2 Hz), 4,05 (d, 1 H, J = 2,4 Hz), 4,02 (m, 1 H), 3,43 (dt, ancho, 1 H, J = 11,7 Hz, 3,6 Hz), 3,36 (d, 1H, J = 4,2 Hz), 1,197 (s, 3H), 0,76 (s, 3H). Punto de fusion: 238-241 °C.

Androst-5-eno-3B.4B.7B.17B-tetrol (121 (metodo 2L androst-5-eno-3B.7B.17B-triacetoxi-4B-ol (111.

Etapa 1: A una disolucion del compuesto 9 (5,0 g, 0,0138 mol) en piridina (20 ml) se anadio cloruro de acetilo (11,8 g, 0,128 mol) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 5 h y despues se separo a vacio la mayor parte del disolvente. El sedimento residual se repartio entre acetato de etilo (80 ml) y agua (20 ml). La capa organica se lavo con acido clorhidrico acuoso 1 N, disolucion acuosa saturada de bicarbonato sodico, despues se seed sobre sulfato magnesico, se filtro y se evaporo hasta un solido. El producto bruto se recristalizo en acetato de etilo y hexano para dar el compuesto 10 (4,8 g) en forma de un solido bianco.

Etapa 2: A una disolucion del compuesto 10 (720 mg, 1,66 mmol) en dioxano (15 ml) y acido acetico (10 ml) se anadio dioxido de selenio (185 mg, 1,66 mmol) en agua (1,5 ml) y dioxano (5 ml). La mezcla de reaccion se calento a 95°C durante 36 h. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente, se diluyo con acetato de etilo, y se lavo secuencialmente con agua, disolucion saturada de bicarbonato sodico y salmuera, y despues se seed sobre sulfato magnesico, se filtro y se concentro a vacio hasta sequedad. El producto bruto se purified por cromatografia ultrarrapida en gel de silice eluida con hexano:acetato de etilo 3:2 para dar el compuesto 11 (174 mg) en forma de un solido bianco.

Etapa 3: El compuesto 11 (148 mg, 0,33 mmol) se disolvio en hidroxido sodico acuoso 1 N (3 ml) y metanol (10 ml) y la disolucion resultante se calento a reflujo durante 1 h. La mayor parte del metanol se separo a vacio. Se anadio agua y la mezcla se trato con ultrasonidos y se filtro. El solido recogido se seed a vacio para dar el compuesto 12 (82 mg) en forma de un solido bianco. Datos seleccionados de RMN 1H: (CD³OD, 500 MHz) 85,48 (d, 1 H, J = 2,8 Hz), 4,04 (d, 1 H, J = 2,7 Hz), 3,74 (dd, J = 8,3 Hz, J = 2,5 Hz), 3,56 (t, 1 H, J = 8,5 Hz), 3,43 (dt, 1 H, J =7,6 Hz, J =4,2 Hz), 1,25 (s, 3H), 0,75 (s, 3H). Punto de fusion: 144-147°C.

(VII. 16a-Bromoandrost-5-en-3B-ol-11B-acetoxi-17-ona (VIII. (Villi. androst-5-eno-3B.11B.16a-triacetoxi-17-ona (IXL androst-5-eno-3B.11B.16a-triacetoxi-17B-ol (X), androst-5-eno-3B.11B.16a,17B-tetrol (XI).

II. El compuesto I (4,0 g, 11,4 mmol) se disolvio en 100 ml de 1,4-dioxano anhidro. Se anadio metoxido sodico (3,0 g, 55,2 mmol) y la mezcla se calento a reflujo en condiciones anhidras durante 3 horas con seguimiento por HPLC. Se separo el disolvente hasta 1/3 del volumen y la mezcla se acidified con HCI en agua 2 N hasta pH = 5-6. La mezcla se extrajo con DCM 3 x 50 ml. Las capas organicas se volvieron a combinar y se lavaron con 50 ml de disolucion saturada de bicarbonato sodico y 50 ml de salmuera. Despues de secado sobre sulfato sodico y evaporacion del disolvente, se aislaron 3,56 g de producto 95% puro.

III. El compuesto II (13,5 g) y acido p-toluenosulfonico (2,45 g) se agitaron durante 18 h en 175 ml de anhidrido acetico anhidro. Despues, la mezcla se vertio en 800 g de hielo y se agito durante 1 h. La filtracion a traves de un tapon corto de gel de silice dio 3,14 g de compuesto III.

IV. El compuesto III (100 mg) se disolvio en 1,55 ml de etilenglicol, seguido de la adicion de ortoformiato de trietilo (3,77 ml) y acido p-toluenosulfonico (50 mg). Despues la mezcla se calento a reflujo durante 1,5 h y despues se vertio en una mezcla caliente de 6 ml de metanol y 0,08 ml de piridina. La mezcla se enfrio y se anadieron 15 ml de agua. La mezcla se extrajo con 3 x 30 ml de acetato de etilo y se lavo con disolucion saturada de bicarbonato sodico (20 ml) y salmuera (20 ml). El secado sobre sulfato sodico y la evaporacion del disolvente dieron 50 mg de compuesto V 97% puro.

V. A una disolucion de 50 mg del compuesto IV en 2 ml de DMF se anadio una disolucion de 27 mg de borohidruro sodico disuelto en 0,5 ml de agua a temperatura ambiente. La disolucion se calento a 100°C con agitacion vigorosa durante 15 min, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente. La reaccion se vertio en 18 ml de agua seguido de 0,2 ml de acido acetico. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (2 x 10 ml) y se lavo con disolucion saturada de bicarbonato sodico (10 ml) y salmuera (10 ml). El secado sobre sulfato sodico y la evaporacion del disolvente dieron 39 mg del compuesto V.

VI. El compuesto V (50 mg) y acido p-toluenosulfonico (2 mg) se suspendieron en una mezcla de 2 ml de acetona y 0,21 ml de agua y se calentaron a reflujo durante 1,5 h. Despues de evaporacion de la acetona, se anadieron 10 ml de agua y el producto precipito en la disolucion. La filtracion dio 42 mg del producto deseado 95% puro.

VII. Se anadieron el compuesto VI (315 mg) y CuBr² (611 mg) a 7 ml de metanol anhidro y se calentaron a reflujo durante 24 h. La mezcla de reaccion despues se enfrio y se vertio en 15 ml de agua caliente y el producto bruto se filtro. Despues el producto bruto se disolvio en 25 ml de metanol/THF (1:1) y despues se anadieron 200 mg de carbon activado. La disolucion se hirvio durante 10 min y el carbon se separo por filtracion. El producto bruto se recristalizo en metanol para dar 426 mg de producto de 75% de pureza.

VIII. El compuesto VII (420 mg) se disolvio en una mezcla de 18 ml de DMF y 7 ml de agua. Se anadio hidroxido sodico acuoso mientras se agitaba (1 N, 1,31 ml). Despues de 10 min, la disolucion se vertio en una mezcla de hielo/agua que contenia 1,5 ml de HCI 1 M. La disolucion se saturo con NaCI y se extrajo con acetato de etilo 2 x 5 ml. Despues de secado sobre sulfato sodico y evaporacion del disolvente, el producto bruto se purified por cromatografia en columna para dar 300 mg del compuesto VIII 95% puro.

IX. El compuesto VIII (300 mg) se disolvio en 6 ml de piridina, seguido de la adicion de 0,34 ml de cloruro de acetilo. La reaccion se agito durante 18 h y despues se vertio en 30 ml de hielo-agua. El producto bruto se separo por filtracion, y despues se purified por columna para dar 180 mg de producto bruto.

X. El compuesto IX (120 mg) se disolvio en 5 ml de metanol y se enfrio en un bano de hielo. Se anadio borohidruro sodico (11,5 mg) a lo largo de 5 min y se retiro el bano de hielo. Despues de 1 h la reaccion se inactivo con 0,2 ml de acido acetico y se anadieron 15 ml de agua. La mezcla se extrajo con 3 x 20 ml de acetato de etilo y se lavo con disolucion saturada de bicarbonato sodico (20 ml) y salmuera (20 ml). El secado sobre sulfato sodico seguido de cromatografia en columna dio 86 mg del producto deseado.

XI. El compuesto X (180 mg) se disolvio en 5 ml de eter etilico seco y se enfrio a -78°C. Se anadio gota a gota bromuro de metilmagnesio (1,2 ml, 1 M en eter dietilico). La reaccion se calento a temperatura ambiente, y despues se calento a reflujo durante 3 h. Despues la reaccion se enfrio y neutralize con HCI 1 M. El producto precipitado se separo por filtracion y se recristalizo 3 veces en metanol/agua para dar 36 mg del compuesto XI puro. Punto de fusion = 220,3-221,6°C. Desplazamientos seleccionados de RMN: RMN 1H (CD ³ OD): 5,20 ppm (s ancho, 1H). 4,26 ppm (dd, J=3Hz, 5Hz, 1H), 3,88 ppm (m, 1H), 3,32 ppm (m, 1H), 3,19 ppm (d, J=8Hz, 1H), 1,24 ppm (s, 3H), 0,92 ppm (s, 3H).

Androst-5-eno-3B.16a-diacetoxi-7.17-diona (4V androst-5-eno-3B.16a-diacetoxi-7B.17B-diol (HE3467L

Sintesis del compuesto 2. A una disolucion del compuesto 1 (3,44 g, 10 mmol) y TMS-CI (2,15 ml, 16,5 mmol) en THF (100 ml) enfriada a -78°C se anadio gota a gota LDA 2,0 M (7,5 ml, 15 mmol). La disolucion se agito durante 30 min y se calento a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se repartio entre 100 ml de hexano/eter 1:1 y 100 ml de agua. La capa organica se lavo con salmuera (3 x 30 ml) y se seco sobre Na2SC>4. Se obtuvo un aceite amarillo despues de separar el disolvente. El producto bruto se cromatografio en gel de silice con EtOAc/hexano al 5-20% para recuperar 1,9 g del compuesto 1 y 2 en forma de un solido bianco (600 mg, 1,54 mmol), 31% de rendimiento.

Sintesis del compuesto 3. A una disolucion del compuesto 2 (100 mg, 0,26 mmol) en THF (3 ml) enfriada a 0°C, se anadio mCPBA (77%, 62,2 mg, 0,27 mmol) y se calento a temperatura ambiente. Se anadio HCI 0,5 N (3 ml), se agito durante 20 min, y se extrajo con eter. Los extractos se lavaron con disolucion saturada de bicarbonato sodico, salmuera, y se secaron sobre Na2S04. El producto 3 se obtuvo despues de separar el disolvente (90 mg, 0,26 mmol), 100% de rendimiento.

Sintesis del compuesto 4. A una disolucion del compuesto 3 (721 mg, 2,0 mmol) en piridina (10 ml) enfriada a 0°C se anadio gota a gota cloruro de acetilo y se agito a 0°C durante 2 h. La reaccion se inactivo con agua (300 ml) y se agito durante 15 min. Se formo un solido y se recogio por filtracion. El solido se lavo con agua, HCI 1 N y agua y se seco a vacio para dar un solido blanquecino del compuesto 4 (737 mg), 90% de rendimiento.

Sintesis del compuesto HE3467. A una disolucion del compuesto 4 (300 mg, 0,75 mmol) en MeOH/THF 1:1 (15 ml) enfriada a -15°C se anadio NaBhU (42,5 mg, 1,12 mmol) a lo largo de 15 min. Se anadio una disolucion de cloruro de cerio (300 mg, 0,81 mmol) en MeOH enfriada a -15 °C y se agito durante 2 min. La reaccion se inactivo con HCI 1 N y despues se vertio en 90 ml de agua. Se formo un solido y se recogio por filtracion. El solido se lavo con HCI 1 N y agua, y se seco a vacio para dar el compuesto HE3467 (183 mg, 0,45 mmol), 60% de rendimiento. RMN 1H (CD3OD): 55,29 (s, 1H), 4,89 (m, 1H), 4,55 (m, 1H), 3,74 (d, 1H, J=6,52), 3,60 (d, 1H, J=4,76), 2,36 (d, 2H, J=1,27), 2,15-2,18 (m, 2H), 2,05 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 1,9-1,1 (m, 11H), 1,11 (s, 3H), 0,82 (s, 3H).

5a-Androstano-2B.3a.16a.17B-tetrol (22).

Etapa 1: A una disolucion del compuesto 13 (50,0 g, 0,172 mol) en piridina (150 ml) se anadio cloruro de ptoluenosulfonilo (47,0 g, 0,24 mol) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 2 h y despues se agito a temperatura ambiente durante la noche. Se anadio agua. El precipitado resultante se recogio por filtracion y se lavo con agua. El producto bruto se purified por recristalizacion en metanol para proporcionar el compuesto 14 (75,2 g) en forma de un solido bianco.

Etapa 2: Una mezcla del compuesto 14 (75 g, 0,169 mol) en 2,4,6-colidina (200 ml) se calento a reflujo durante 5 h. Despues de enfriar, se anadio agua (500 ml) y el precipitado resultante se recogio por filtracion y se lavo con agua. El solido se recristalizo en metanol para dar un producto bruto (42,5 g). El producto bruto (20,0 g) se disolvio en cloroformo (113 ml) y anhidrido del acido acetico (37 ml). A esta disolucion se anadio una disolucion de acido sulfurico concentrado (3 ml) en cloroformo (37 ml) y 13 ml de anhidrido de acido acetico a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 0,5 h, despues se anadieron 700 ml de agua y se agito a temperatura ambiente durante 6 h. El precipitado resultante se recogio por filtracion y se lavo con agua, y se seco a vacio para dar el compuesto 15 (17,2 g) en forma de un solido bianco.

Etapa 3: La mezcla del compuesto 15 (8,17 g, 0,030 mol) y bromuro de cobre (10,8 g, 0,046 mol) en metanol anhidro (220 ml) se calento a reflujo durante 18 h. Despues de enfriar, se separo la mayor parte del disolvente a vacio y se anadio agua (150 ml). El precipitado resultante se recogio por filtracion y se lavo con agua. El solido se recristalizo en metanol para dar el compuesto 16 en forma de un solido bianco (6,76 g).

Etapa 4: A la disolucion con agitacion del compuesto 16 (6,69 g, 0,019 mol) en N,N-dimetilformamida (180 ml) se anadio disolucion acuosa de hidroxido sodico 1 N (22 ml, 0,022 mol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 0,5 h. Se anadieron acido clorhidrico acuoso 1 N (3 ml) y 100 ml de agua. La disolucion resultante se extrajo con acetato de etilo (3 X 250 ml). Los extractos combinados se secaron sobre sulfato magnesico, se filtraron y se concentraron a vacio para dar el compuesto 17 (4,37 g) en forma de un solido cereo.

Etapa 5: A una disolucion del compuesto 17 (3,74 g, 0,013 mol) en piridina (20 ml) se anadio cloruro de acetilo (2,18, 0,028 mol) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 1 h. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito 1 h mas. Se anadio agua. El precipitado se recogio por filtracion y se lavo con agua. El solido se seco a vacio para dar el compuesto 18 (4,25 g) en forma de un solido bianco.

Etapa 6: A una disolucion del compuesto 18 (2,4 g, 0,0072 mol) en metanol (80 ml) se anadio borohidruro sodico (1,2 g, 0,031 mol) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 1 h. La reaccion se inactivo por la adicion de acido acetico (6 ml) y agua (15 ml). Se separo la mayor parte del metanol a presion reducida. El sedimento residual se repartio entre acetato de etilo (80 ml) y agua (20 ml). La capa organica se lavo con acido clorhidrico acuoso 1 N, se neutralize con disolucion acuosa saturada de bicarbonato sodico y despues se seco sobre sulfato magnesico, se filtro y se evaporo para dar el producto bruto 19(1,92 g) en forma de un solido bianco.

Etapa 7: A una disolucion del compuesto 19 (1,9 g, 0,0057 mol) en piridina (20 ml) se anadio cloruro de acetilo (1 ml, 0,014 mol) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 1 h. La mezcla resultante se calento a temperatura ambiente y se agito 1 h mas y despues se separo a vacio la mayor parte del disolvente. El sedimento residual se repartio entre acetato de etilo (80 ml) y agua (20 ml). La capa organica se lavo con acido clorhidrico acuoso 1 N, disolucion acuosa saturada de bicarbonato sodico, despues se seco sobre sulfato magnesico, se filtro y se evaporo para dar un producto bruto. El producto bruto se purified por cromatografia ultrarrapida en gel de silice y se eluyo con acetato de etilo:hexano 1:10 para dar el compuesto 20 (1,4 g) en forma de un solido bianco.

Etapa 8: A una disolucion del compuesto 20 (980 mg, 2,61 mmol) en cloroformo (25 ml) se anadio acido m-cloroperoxibenzoico (3,6 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 h. La capa organica se lavo con disolucion acuosa saturada de bicarbonato sodico, se lavo con agua y despues se seco sobre sulfato magnesico, se filtro y se evaporo para dar un producto bruto. El producto bruto se purified por cromatografia ultrarrapida en gel de silice eluida con acetato de etilo:hexano 1:10 para dar el compuesto 21 (780 mg) en forma de un solido cereo bianco.

Etapa 9: La disolucion del compuesto 21 (625 mg, 1,61 mmol) en acido acetico (8 ml) se calento a reflujo durante 5 h. Despues de enfriar, el disolvente se separo a vacio para dar un aceite, que se seed mas a vacio durante la noche. El solido cereo resultante se disolvio en hidroxido sodico acuoso 2 N (8 ml) y metanol (15 ml) y la reaccion se calento a reflujo durante 1 h. Se separo el metanol a vacio y se anadio agua. El precipitado resultante se recogio por filtracion y se lavo con agua y acetona caliente. El solido recogido se seed a vacio para dar el androstano-2p,3a,16a,17|3-tetrol o compuesto 22 (295 mg) en forma de un solido bianco. Datos seleccionados de RMN 1H: (CDsOD, 500 MHz) 83,98(d, 1 H, J = 4,8 Hz), 3,79 (ancho, 1 H), 3,74 (ancho, 1 H), 3,35 (d, 1 H, 3,6 Hz), 0,99 (s, 3H), 0,77 (s, 3H). P.f.: 260-263°C.

Como sera evidente, los compuestos descritos antes se pueden usar para preparar otros compuestos de formula 1, p. ej., otros esteres o eteres de estos compuestos.Los productos intermedios en la preparacion de los compuestos del titulo tambien pueden usarse en los metodos descritos en la presente memoria.

Ejemplo 23. Se evaluo la capacidad de los compuestos de formula 1 para tratar la esclerosis multiple (EM) en la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) esencialmente como se ha descrito en el ejemplo 6 anterior. El protocolo para llevar a cabo el modelo animal de EAE se ha descrito en (D. Auci et. al., Ann. NY. Acad. Sci. USA, 1051:730-42, 2005). Ratones hembra SJL (6-8 semanas de edad, peso corporal medio de 25 g) obtenidos de Charles-River se mantuvieron en condiciones de laboratorio convencionales (exentos de germenes patogenos no especificos) con alimento y agua a voluntad y se dejo que se adaptaran una semana a su entorno antes de empezar el estudio. Los animales se distribuyeron aleatoriamente en 6 grupos de 7 animales cada uno: (1) ratones tratados con vehiculo, (2) ratones tratados con SU5416 (Z-3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilidenil]-2-indolinona), (3) ratones tratados con 17p-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17a-triol, (4) ratones tratados con androst-5-eno-3a,7p,16a,17p-tetrol, (5) ratones tratados con androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol, (6) ratones tratados con 3a-trifluorometilandrost-5-eno-3p,17p-diol, (7) ratones tratados con 17a-trifluorometil-androst-5-eno-3p,17p-diol y (8) ratones tratados con 16-oxima de 5a-androstano-3p,17p-diol. La EAE se indujo con 200 pi de una emulsion 1:1 de 75 pg de proteina proteolipidica (PLP) y 6 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis H37RA en adyuvante completo de Freund (CFA). La inyeccion de 200 pi se dividio entre cuatro sitios que drenaban en los ganglios linfaticos axilares e inguinales. Se uso la toxina Pertussis como coadyuvante y se administraron 200 ng/raton por via i.p. el dia cero y el dia 2 despues de inmunizacion. Los grupos se trataron con 0,1 mg de compuesto en 100 pi de vehiculo, o con vehiculo solo, una vez al dia p.o. (alimentacion oral por sonda), empezando en el inicio clinico de la enfermedad y continuando hasta el dia 30 despues de inmunizacion. El inicio clinico se define como el momento en el que los sintomas clinicos de la enfermedad alcanzan una clasificacion entre 2-3 en 25% de los ratones. La clasificacion clinica la llevo a cabo un observador que desconocia el tratamiento: 0 = no hay enfermedad, 1 = cola flacida, 2 = paraparesia moderada, 3 = paraparesia grave, 4 = estado moribundo, 5 = muerte. El analisis estadistico de las diferencias significativas en las puntuaciones clinicas se llevo a cabo por ANOVA para datos no pareados y el ensayo de Mann-Whitney no parametrico. Un valor P < 0,05 se considero que era estadisticamente significativo. Para el analisis estadistico, a los ratones que sucumbieron a la EAE se les asigno 5 solo el dia de la muerte y despues se suprimieron del grupo experimental.

Como se esperaba, se desarrollaron los signos clinicos de la EAE en 8/8 (100%) de los ratones tratados con vehiculo en los siguientes 19 dias despues de inmunizacion. El dia medio de inicio era 15,5 3,9 (ET). En este grupo de animales la duracion de la enfermedad era 12,3 4,3 dias. La puntuacion media acumulada desde el dia 1 al 30 era 24,8 7,8, y desde el dia 31 al dia 54 (despues de tratamiento) era 22,7 15,8. Se observo una evolucion de la EAE muy similar a la observada en los ratones tratados con vehiculo, en los animales tratados con SU5416, androst-5-eno-3a,7p,16a,17p-tetrol y 16-oxima de 5D-androstano-3p,17p-diol, los ratones asi tratados presentaron una incidencia acumulada de la enfermedad, duracion de la enfermedad e inicio acumulado medio comparable a los de los ratones de referenda. A diferencia de esto, los ratones tratados con androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol, 3atrifluorometilandrost-5-eno-3p,17p-diol o 17a-trifluorometilandrost-5-eno-3p,17p-diol presentaron una evolucion de la EAE significativamente mejorada comparado con los ratones tratados con vehiculo que implicaba una reduccion significativa de una o ambas de la puntuacion media acumulada y la duracion. Y otro contraste mas, es que ninguno de estos 3 compuestos influyo significativamente en la incidencia acumulada de la EAE o la letalidad. Finalmente, aunque el 17p-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17a-triol solo presentaba una tendencia hacia una menor puntuacion acumulada y duracion frente a los ratones tratados con vehiculo, los efectos parecian ser biologicamente importantes (14,9 17,6 y 7 7,9 frente a 24,8 7,8 y 12,3 4,3). La falta de significancia estadistica con este compuesto se debe probablemente al gran numero de ratones a los que se asigno la puntuacion 0 a lo largo del periodo de observation, que por lo tanto produjo una desviacion tipica importante.

Al final del tratamiento el dia 30, se hizo el seguimiento de los ratones durante hasta 24 dias adicionales. Se pudo observar la enfermedad convirtiendose en cronica en los ratones tratados con vehiculo con puntuaciones cumuladas comparables a las del periodo de tratamiento. Se observo un aumento sustancial de la puntuacion acumulada durante el periodo de seguimiento comparado con el periodo de tratamiento con SU5416, que paso de una puntuacion media acumulada de 25,5 8,9 a 35,5 13,2 y de forma mas modesta con el 17p-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17a-triol que paso de una puntuacion media acumulada de 14,9 17,6 a 18,4 20,6. En los ratones tratados con el 17p-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17a-triol tambien se pudo observar un aumento de la incidencia de la EAE de 57,1% al final del periodo de tratamiento a 85,6% al final del periodo de seguimiento. Por otra parte, los otros compuestos parecia que mantenian una puntuacion acumulada similar en el periodo de seguimiento y en el periodo de tratamiento. Esto era particularmente notable para el 3a-trifluorometilandrost-5-eno-3p,17p-diol que paso de una puntuacion media acumulada de 11,2 4,8 durante el periodo de tratamiento a 10,8 10,3 al final del periodo de seguimiento.

Estos resultados muestran que el 17p-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17a-triol, androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol, 3atrifluorometilandrost-5-eno-3p,17p-diol, y 17a-trifluorometil-androst-5-eno-3p,17p-diol, ejercian propiedades antiinflamatorias potentes en el modelo de EAE inducido por PLP en ratones SJL. Tienen un interes particular para la traduction de estos descubrimientos al marco clinico, las observaciones de que los compuestos son activos en este modelo de EAE incluso cuando se administran en un protocolo que empieza el dia 12 despues de inmunizacion, cuando 24% de los ratones ya habian desarrollado signos clinicos de la EAE. De particular interes es el descubrimiento de que SU5416 es ineficaz en este marco. Se habia descrito previamente que SU5416 era eficaz en la EAE (L. Bouerat et al., J. Med. Chem. 48: 5412-5414, 2005). Sin embargo, para obtener este resultado, el compuesto SU5416 se administro al mismo tiempo al que eran inmunizados los animales. A diferencia de esto, en este protocolo, los compuestos tales como el 17p-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17a-triol no se administraron a los animales hasta despues de que los sintomas de la enfermedad fueran evidentes, lo que muestra que los compuestos se pueden usar para tratar de forma eficaz la enfermedad existente y para prevenir o retrasar el inicio de la enfermedad.

Ejemplo 25. Tratamiento de la exposition a radiation ionizante. Se compare el efecto de los F1C seleccionados en la supervivencia de ratones hembra B6D2F1 mortalmente irradiadas con animales de referenda tratados solo con vehiculo. Los animales se expusieron a 10 Gy de irradiation corporal total a 2,5 Gy/min usando una fuente de 137Cs. Se usaron grupos de 12 animales en un total de 5 grupos. Para los grupos 1, 2, 3 y 5 se administro el articulo de ensayo en un volumen de 100 pi, por inyeccion subcutanea, durante 3 dias consecutivos, administrandose la primera dosis 2 a 4 horas despues de la exposicion a la radiacion. Para el grupo 4, el articulo de ensayo se administro en un volumen de 50 ^jj.1, por inyeccion intramuscular, durante 3 dias consecutivos. La formulacion era una suspension que contenia carboximetilcelulosa al 0,1% en p/v, cloruro sodico al 0,9% en p/v y fenol al 0,05% en v/v. Las formulaciones se agitaron para volver a suspender de forma uniforme los F1C antes de aplicarlos a la jeringa e inyectarlos a los animales en los minutos siguientes de aplicar a la jeringa para prevenir la sedimentacion en la jeringa.

Los grupos de animales se trataron como sigue. El grupo 1 recibio solo vehiculo por inyeccion subcutanea diaria durante 3 dias consecutivos. El grupo 2 recibio 0,6 mg en 100 pi de una suspension de 3p,17|3-dihidroxiandrost-5-eno por inyeccion subcutanea diaria durante 3 dias consecutivos. El grupo 3 recibio 3,0 mg en 100 pi de una suspension de 3p,17p-dihidroxiandrost-5-eno por inyeccion subcutanea diaria durante 3 dias consecutivos. El grupo 4 recibio 0,6 mg en 50 pi de una suspension de 3p,17p-dihidroxiandrost-5-eno por inyeccion intramuscular diaria durante 3 dias consecutivos. El grupo 5 recibio 0,6 mg en 100 pi de una suspension de 3|3-hidroxi-17paminoandrost-5-eno por inyeccion subcutanea diaria durante 3 dias consecutivos. Se hizo el seguimiento de la supervivencia de los animales durante 21 dias despues de irradiacion y se obtuvieron los siguientes resultados. Se muestra el numero de animales que sobreviven el dia 6, 7, 12 y 21.

Dia

Grupo______________________6_______ 7_______ 12______ 21______

1 referencia con vehiculo 12 11 4 1

2 0,6 mg s.c. 12 11 10 7

3 3,0 mg s.c. 12 12 9 7

4 0,6 mg i.m. 12 12 11 9

5 0,6 mg s.c. 12 12 12 11

Ejemplo 25bis Tratamiento de la inflamacion gastrointestinal. La capacidad de los compuesto de formula 1 para limitar o inhibir la inflamacion o los sintomas de inflamacion, se mostro usando un modelo animal para la enfermedad inflamatoria del intestino. Se usaron grupos de 3 ratas macho Wistar (180 20 gramos) en ayunas durante 24 h antes de la estimulacion con acido 2,4-dinitrobencenosulfonico (DNBS) o disolucion salina. Se indujo colitis distal por instilacion intracolonica de 0,5 ml de una disolucion de DNBS en etanol (30 mg en 0,5 ml de una disolucion de etanol al 30% en disolucion salina) despues de lo cual se inyectaron 2 ml de aire a traves de la canula para asegurar que la disolucion permanecia en el colon. El volumen usado fueron 0,1 ml por inyeccion de 2 y 20 mg/ml de compuesto tal como el androst-5-eno-3p,7p,17a-triol en una formulacion liquida, que se administro por inyeccion subcutanea una vez al dia durante 6 dias (0,2 mg/animal/dia o 2,0 mg/animal/dia). La formulacion contenia 100 mg/ml de compuesto en una suspension no acuosa, p. ej., alcohol bencilico al 2% en p/v, Brij 96 al 0,1% en p/v y volumenes iguales de PEG 300 y propilenglicol. Se obtuvieron concentraciones de 2 mg/ml y 20 mg/ml diluyendo la formulacion de 20 mg/ml con vehiculo que carecia de compuesto.

La primera dosis se administro 30 min despues de la estimulacion con DNBS. Se administro por via oral (p.o.) sulfasalazina (30 mg/ml en Tween 80 al 2% en agua destilada) una vez al dia (10 ml/kg/dia) durante 7 dias, empezando las dos primeras dosis 24 h y 2 h antes de la estimulacion con DNBS. Se registro diariamente la presencia de diarrea examinando el area anal. Los animales se dejaron en ayunas 24 h antes del sacrificio. Los animales se sacrificaron el dia 7 o el dia 8 y se saco y peso el colon. Antes de extirpar el colon, se registran los signos de adherencia entre el colon y los otros organos. Tambien se anoto la presencia de ulceraciones despues de pesar cada colon. El cambio “neto” de la relacion de peso de colon a peso corporal (PC) se normaliza con respecto al grupo base estimulado con disolucion salina. Se considero significativa una disminucion de 25-30% en la relacion “neta” de peso de colon a peso corporal. Los resultados mostraron que el androst-5-eno-3p,7p,17|3-triol tenia un efecto moderado en la evolucion de la enfermedad (aproximadamente 15-20% de disminucion en la relacion neta de peso de colon a peso corporal), mientras que los tratamientos con 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol o androst-5-eno-3p,7p,16a,17a-tetrol eran eficaces (aproximadamente 25-35% de disminucion en la relacion neta de peso de colon a peso corporal).

Las variaciones de este protocolo incluyen la administration de compuestos en una disolucion acuosa de eter sulfobutilico-ciclodextrina al 30% en agua, usando niveles de dosis descritos antes y/o uno o mas de 0,05 mg/animal/dia, 0,1 mg/animal/dia, 0,5 mg/animal/dia y 1,0 mg/animal/dia.

Ejemplo 26. Tratamiento de la perdida neuronal asociada con traumatismo y osteoporosis o afecciones de perdida osea. La competencia inmunitaria es una funcion compleja que puede estar extremadamente deteriorada despues de elevaciones de los niveles de glucocorticoides (GC) endogeno inducidas por traumatismo. Se uso el compuesto 5-androsteno-3p,7p,17p-triol para preservar esta funcion inmunitaria ejerciendo una actividad trofica o anabolica. En un modelo animal de accidente cerebral isquemico agudo consecutivo a una oclusion carotidea bilateral en jerbos, el tratamiento con 5-androsteno-3p,7p,17p-triol mejoro significativamente las capacidades cognitivas cuando se comparo con el accidente cerebrovascular solo (p = 0,03). As! pues, el periodo de latencia de busqueda de comida medido en cada grupo era 6,9 0,9 segundos (s) para el caso simulado, 46,9 13,6 s para el accidente cerebrovascular solo y 14,8 4,8 s para el accidente cerebrovascular tratado con el 5-androsteno-3p,7p,17p-triol. Al mismo tiempo, la perdida en el recuento de neuronas de la zona CA1 del hipocampo inducida por el accidente cerebrovascular se anulo significativamente con el 5-androsteno-3p,7p,17p-triol (caso simulado = 362,247 6,839; accidente cerebrovascular = 152,354 11,575; y accidente cerebrovascular 5- androsteno-3D,7D,17D-triol = 207,854+47,334).

En las afecciones de perdida osea, el 5-androsteno-3p,7p,17p-triol afectaba a las estructuras oseas principales, es decir, las capas cortical y trabecular y la placa epifisaria. En los ratones lesionados termicamente (20% de la superficie corporal total) tratados con 5-androsteno-3p,7p,17p-triol, la perdida cortical (femur) y la masa osea trabecular/esponjosa (tibia), asi como la supresion de la proliferacion de condrocitos en la placa epifisaria de la tibia proximal se previnieron todos significativamente (p<0,01) por el tratamiento con 5-androsteno-3p,7p,17p-triol. La histomorfometria del hueso cortical en el femur sugeria un aumento de la tasa de formacion de hueso. Se observo proteccion parcial frente a la perdida de contenido de hueso mineral medido por absorciometria dual de rayos X. El peso de las cenizas del femur era significativamente mayor (p<0,01) que el de los ratones quemados tratados con vehiculo, mostrando que el 5-androsteno-3p,7p,17p-triol preservaba el contenido de mineral oseo. Los efectos proinflamatorios de los niveles de GC cronicamente altos en el cerebro, sugiere que los niveles elevados de GC empeoran el resultado de las agresiones neurologicas. El esteroide suprarrenal DHEA (5-androsten-3p-hidroxi-17-ona), un precursor metabolico corriente arriba del 5-androsteno-3p,7p,17p-triol, ha demostrado que previene la involucion timica inducida por dexametasona en ratones (K.L. Blauer et al., Endocrinology, 129:3174, 1991). Considerados juntos, estos descubrimientos mostraban que el 5-androsteno-3p,7p,17p-triol suprimia la perdida del tejido nervioso funcional inducida por los GC y conservaba la estructura osea despues de lesion termica.

La capacidad de compuestos que incluyen el 5-androsteno-3p,7p,17p-triol, 17aDetinil-5-androsteno-3p7p,17p-triol y 4-estreno-3a,17p-diol para invertir los efectos adversos de los glucocorticoides en el crecimiento oseo, tambien se mostro en la linea celular humana de osteosarcoma MG-63. Las celulas MG-63 son osteoblastos, que son celulas que median el crecimiento oseo. Esta linea celular se ha usado ampliamente para estudiar la biologia del hueso y caracterizar la actividad biologica de compuestos para el tratamiento de las afecciones de perdida osea (p. ej., B.D. Boyan et al., J. Biol. Chem., 264(20): 11879-11886, 1989; L.C. Hofbauer et al., Endocrinology, 140(10):4382-4389, 1999). Las toxicidades adversas asociadas con los niveles elevados de glucocorticoides incluyen una disminucion en la produccion de IL-6 e IL-8 por los osteoblastos, incluyendo la linea celular MG-63, y un aumento de la expresion de la enzima 1 ip-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 1 (11P-HSD). El aumento de la enzima 1 ip-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 1 produce niveles aumentados de la actividad de glucocorticoides endogenos, convirtiendo la cortisona endogena en cortisol activo, que inhibe el crecimiento oseo. La enzima 11P-HSD es expresada en el higado, tejido adiposo, cerebro y tejidos oseos. El cortisol generado por la 11P-HSD-1 contribuye a la osteoporosis, resistencia a la insulina, diabetes de tipo 2, dislipidemia, obesidad, trastornos del sistema nervioso central tales como el accidente cerebrovascular, muerte neuronal, depresion y enfermedad de Parkinson. Las disminuciones de IL-6, IL-8 y osteoprotegerina estan asociadas con el menor crecimiento oseo por los osteoblastos. Estudios piloto mostraron que la Clso para la inhibicion de la IL-6 de celulas MG-63 por dexametasona era 10 nM y la Clso para la inhibicion del crecimiento de celulas MG-63 por la dexametasona era 15,3 nM.

En este protocolo, las celulas MG-63 se desarrollaron en presencia o ausencia del glucocorticoide sintetico dexametasona en una concentracion 30 mM y en presencia o ausencia del compuesto de formula 1 10 nM. El compuesto 1 en la siguiente tabla era el 5-androsteno-3p,7p,17p-triol, el compuesto 2 era el 17a-etinil-5-androsteno-3p,7p,17p-triol y el compuesto 3 era el 4-estreno-3a,17p-diol. Los resultados para estos compuestos se muestran a continuacion.

condiciones de crecimiento IL-6 IL-8 ARNm de 11P-HSD osteoprotegerina unidades

de MG-63 pg/ml unidades pmol/l

referenda con vehiculo 6,2 0,90 0,25 445

dexametasona 1,3 0,12 1,0 280

compuesto 1 4,0 0,53 0,73 -compuesto 2 2,8 0,50 0,54 -compuesto 2 (1 nM) - - - 455

compuesto 3 4,1 0,55 0,75 -

Estos resultados mostraban que los compuestos en concentracion 10 nM invertian parcialmente los efectos adversos de la dexametasona 30 nM, lo cual muestra que los compuestos pueden invertir las multiples toxicidades asociadas con niveles elevados de glucocorticoides en osteoblastos, que son las celulas que median el crecimiento oseo. En un protocolo relacionado, el compuesto 17a-etinil-5-androsteno-3p,7p,17p-triol 1 nM tambien invirtio completamente la disminucion de la sintesis de osteoprotegerina por las celulas MG-63 despues de crecimiento de las celulas durante 7 h en presencia de dexametasona 30 nM como se muestra en la tabla anterior. La osteoprotegerina es un factor asociado con el crecimiento oseo y la sintesis reducida de osteoprotegerina esta asociada con la perdida osea. Otros compuestos que invertian completa o parcialmente la sintesis de osteoprotegerina por las celulas MG-63 en presencia de dexametasona 30 nM eran el 17a-trifluorometil-5-androsteno-3p,7p,17p-triol (niveles de osteoprotegerina normales o basales con el compuesto 1 pM comparado con la referenda con vehiculo sin compuesto ni dexametasona), 5-androsteno-3p,7p,16a,17p-triol (niveles de osteoprotegerina normales con 0,1 pM), 3p,7a,16a,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno (niveles de osteoprotegerina casi normales con 10 nM), 3a,7p,16a,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno (niveles de osteoprotegerina normales con 10 nM), 17a-metilandrost-5-eno-3p,17p-diol-7-ona (niveles de osteoprotegerina aumentados con 100 nM), 17a-metilandrost-5-eno-3p,7p,17p-diol (niveles de osteoprotegerina normales con 10 nM). Otros compuestos que invertian parcialmente la disminucion de la osteoprotegerina en presencia de dexametasona 30 nM incluian la 7-oxima del androst-5-eno-3p, 17p-diol.

En protocolos similares, el compuesto 3a,17p-dihidroxiandrost-4-eno mostro inversion estadisticamente significativa de la supresion de IL-6 e IL-8 por las celulas MG-63 inducida por dexametasona y una disminucion del ARNm de 11P-HSD inducida por la dexametasona.

Para mostrar que se podian obtener efectos importantes in vivo, el compuesto 17a-etinil-5-androsteno-3p,7p,17ptriol se administro a ratones que tambien se habian tratado tambien diariamente con dexametasona durante 23 dias, para reducir los niveles de osteoprotegerina en los animales. Los niveles de osteoprotegerina en los ratones que se trataron con vehiculo y dexametasona, con 10 pg/dia (grupo de referenda positivo) eran de 3,3 pmol/l de osteoprotegerina, mientras que en los animales tratados con vehiculo, dexametasona y 17a-etinil-5-androsteno-3p,7p,17p-triol con 4 mg/kg/dia eran de 6,4 pmol/l de osteoprotegerina (p<0,05).

Se examino el grado de apoptosis de los osteoblastos y osteocitos en el hueso vertebral murino como funcion de la deficiencia de estrogenos. Se realizo una ovariectomia a ratones swiss-webster (4 meses de edad). 28 dias mas tarde, los animales se sacrificaron, se aislaron las vertebras, se fijaron y se sumergieron y despues se descalcificaron en metacrilato. La prevalencia de la apoptosis de osteoblastos y osteocitos se determino por el metodo TUNEL con potenciacion con CuS04 y se encontro que habia aumentado despues de la perdida de estrogenos. Se encontro que el tratamiento con un compuesto de referenda tal como el 17p-estradiol y con 4-estreno-3a,17p-diol y/o 17a-etinil-5-androsteno-3p,7p,17p-triol reducia la apoptosis, lo cual esta de acuerdo con la menor perdida osea.

De forma conjunta, los resultados descritos en este ejemplo son la prueba de que los compuestos tales como el 17aetinil-5-androsteno-3p,7p,17p-triol, afectan al tejido oseo tanto aumentando el crecimiento oseo como inhibiendo la perdida osea. Los compuestos tales como el 17a-etinil-5-androsteno-3p,7p,17p-triol y el 5-androsteno-3p,7p,16a,17p-tetrol no interaccionan con el receptor de androgenos, receptor a de estrogenos o receptor p de estrogenos, lo cual esta de acuerdo con su capacidad para tratar las afecciones de perdida osea sin ejercer una actividad de las hormonas sexuales indeseada.

Ejemplo 27. Se uso un modelo de lesion termica usando tejido de oreja de raton para caracterizar los compuestos por su capacidad para tratar la inflamacion asociada con el traumatismo termico. Las afecciones eran la minima lesion por quemadura que evoluciona a necrosis tisular en la oreja expuesta de los ratones sin tratar a las 24-72 h despues de la quemadura. Se dio a los grupos de ratones Balb/c, de aproximadamente 9 semanas de edad, una marca identificadora y despues se dividieron en los subgrupos de referenda y tratado. Se registro el grosor de la oreja que se iba a sumergir en agua caliente, y despues la oreja entera del raton anestesiado se sumergio en agua a 52°C durante 24 s. Se devolvio cada raton a su jaula despues de una inyeccion del vehiculo propilenglicol (referenda) o 100 mg de compuesto en propilenglicol. Se hizo el seguimiento de los cambios en el hinchamiento de la oreja en los ratones individuales antes de la quemadura, y en diferentes tiempos despues de la lesion termica. Se hizo el seguimiento de los cambios en el hinchamiento de la oreja en ratones individuales antes de la lesion y 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 y 48 h despues de la lesion termica. Los animales se trataron con 100 mg de deshidroepiandrosterona (DHEA) disuelta en propilenglicol. El analisis de la formacion de edema y la resolucion en los ratones de referenda y los tratados con DHEA mostro un hinchamiento maximo de la oreja, como una medida del edema, en los ratones quemados tanto tratados con DHEA como en los no tratados, 6 h despues de la lesion.

En el grupo de referenda no tratado, la extension del hinchamiento empezo a disminuir en las siguientes 12 h, y continuo disminuyendo rapidamente a lo largo del siguiente periodo de 12 h. Entre las 24 y 48 h despues de quemadura, el tejido de la oreja mostro perdida y oclusion microvascular de la zona original de estasis. Los compuestos androst-5-eno-3p,17p-diol y 16a- bromodeshidroepiandrosterona, protegieron a los animales tratados frente a la mayor parte de las consecuencias isquemicas de la lesion termica de la oreja. El compuesto 16ahidroxideshidroepiandrosterona era menos protector, es decir, redujo la extension, pero no previno totalmente la evolucion de la isquemia, y la 16a-clorodeshidroepiandrosterona era solo ligeramente protectora frente a la isquemia progresiva.

Se examino el efecto de los compuestos en el choque hemorragico y la isquemia en otro protocolo. Los ratones CF-1 con una edad de 6-8 meses se anestesiaron usando metoxifluorotano y se prepararon para la cirugia abdominal. Se ensayo en cada raton el nivel de respiracion, la respuesta de parpadeo y la respuesta a un pellizco en la piel, para asegurar un nivel de anestesia adecuado para la cirugia. La duracion de la cirugia abdominal era aproximadamente 2 h, y durante este tiempo se extrajo 35-40% del volumen sanguineo de los animales a lo largo de un periodo de 30 minutos. La extraccion de sangre de una forma controlada Simula el efecto del choque hemorragico. Se hizo una infusion intravenosa lenta de la sangre extraida y un volumen 2X de liquido de reanimacion (disolucion de Ringer lactato) en una vena central. El liquido de reanimacion se complemento con 2 mg de deshidroepiandrosterona-3p-sulfato o el excipiente como placebo. Se suturaron por separado el peritoneo y la piel de recubrimiento. Los animales se mantuvieron a 38°C-39°C hasta la recuperacion completa. En estas condiciones, la mayoria de los animales tratados con placebo murieron en las siguientes 24-48 h. Cuatro horas despues de cirugia, se realizo un ensayo de unidades formadoras de colonia (UFC) para bacterias y se ensayo el malondialdehido en el higado usando tecnicas convencionales. Se extirparon los ganglios linfaticos mesentericos (MLN) y se cultivaron en placas de agar sangre y se conto el numero de UFC despues de cultivo. Se extrajo el higado y se midio la cantidad de malonaldehido. El tratamiento de deshidroepiandrosterona-3p-sulfato dio como resultado la supervivencia de 15/15 ratones mientras que con la referenda con vehiculo sobrevivieron 1/15 animales.

Se examino el efecto del tratamiento en un modelo de rata de traumatismo hemorragico. Se sometieron 24 ratas a una perdida de 40% del volumen de sangre total, que consistia en la cateterizacion y laparatomia (lesion del tejido blando) para simular el traumatismo y la hemorragia. Una hora despues del inicio de la hemorragia, los animales se resucitaron con liquido cristaloide y globulos rojos empaquetados (PRBC). 12 animales recibieron una inyeccion subcutanea de androst-5-eno-3D,7p,17D-triol en una suspension de metilcelulosa con una concentracion de 40 mg/kg de peso corporal en 100 pl/kg de peso corporal, 1 h despues de inicio de la hemorragia, pero antes del liquido de reanimacion. 12 animales recibieron 100 pl/kg de peso corporal de inyeccion subcutanea de referenda de metilcelulosa. Tres dias despues de induccion de la hemorragia, los 12 animales que habian recibido androst-5-eno-3D,7p,17D-triol tenian una tasa de supervivencia de 100%; mientras que la tasa de mortalidad era de 25% en el grupo no tratado (P<0,04, prueba para superioridad de Barnard sin condiciones usando la diferencia de dos proporciones binomiales).

Tambien se llevo a cabo un protocolo de traumatismo hemorragico de presion sanguinea reducida como un segundo modelo del traumatismo hemorragico. En este protocolo, se produjo hemorragia en 15 ratas como se ha descrito antes a una presion arterial media de aproximadamente 35-40 mm de Hg y se reanimaron 1 h desde el inicio de la hemorragia con cristaloide y PRBC. 7 animales recibieron inyeccion subcutanea de androst-5-eno-3D,7p,17D-triol en una suspension de metilcelulosa en una concentracion de 40 mg/kg de peso corporal en 100 pl/kg de peso corporal, 1 h despues del inicio de la hemorragia, pero antes del liquido de reanimacion. 8 animales recibieron inyeccion subcutanea de 100 pl/kg de peso corporal de referenda con metilcelulsoa. Dos dias despues de inducir la hemorragia, la mortalidad en el grupo no tratado (n = 8) era 75%. La tasa de mortalidad en los animales tratados con androst-5-eno-3D,7p,17D-triol era 43%, demostrando que el compuesto era protector en casos de traumatismo hemorragico con presion sanguinea reducida.

Ejemplo 28. Estabilidad metabolica. Se examino la estabilidad metabolica de los compuestos seleccionados in vitro usando microsomas obtenidos de tejido hepatico, de acuerdo con el siguiente protocolo. Los microsomas en este protocolo son capaces de dar reacciones de hidroxilacion y reacciones redox que interconvierten hidroxilos y cetonas en las moleculas de esteroides. Los microsomas no median reacciones de conjugacion, p. ej., sulfatacion de grupos 3p-hidroxilo o glucuronidacion de grupos 3a-hidroxilo.

El protocolo se llevo a cabo como sigue. (1) Se preparo el compuesto en concentracion 0,5 mM en acetonitrilo/agua 35:65. Para el androst-5-eno-3D,17D-diol se preparo una concentracion de 0,145 mg/ml o 29,0 pi de una disolucion madre de 1 mg/ml mas 171 pi de disolvente. Para las diluciones para la curva patron se uso una disolucion madre 0,5 mM para obtener concentraciones finales del androst-5-eno-3p,17p-diol de 10 pM, 5 pM y 1 pM. (2) Se prepararon las muestras como sigue. Cada ensayo consistia en una referenda de androst-5-eno-3p,17|3diol y 1-8 compuestos desconocidos. Los tubos para cada compuesto eran los siguientes: 1-0’ 2-0’ 3-0’ 4-0’* 5-0’* 6-5 pM 7-1 pM 8-30’ 9-30’ 10-30’, en los que el * designa los tubos de reaccion de referenda negativa de microsomas desnaturalizados. Para los compuestos adicionales la numeracion se inicio en 11, 21, 31, etc. (3) Se anadieron 315 pi de PBS (pH 7,3-7,5) a cada tubo. Se anadieron 10 pi de la disolucion del articulo de ensayo adecuado a cada tubo. (4) La disolucion de referenda interna/acetonitrilo. (5) El sistema de regeneracion de NADPH (NRS) era 125 pi por tubo. Se anadieron al PBS NADP 1,7 mg/ml, glucosa-6-fosfato 7,8 mg/ml, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 6 unidades/ml. El NRS reciente para cada experimento se mantuvo en hielo hasta su uso. (6) Cada reaccion usaba 125 pi de NRS en cada tubo. (7) Se saco la preparacion de microsomas hepaticos del refrigerador a -80°C, y se descongelo en un bano de agua a temperatura ambiente. La preparacion de microsomas tenia una concentracion de 20 mg/ml. Cada reaccion usaba 0,25 mg/tubo y se diluyo a una concentracion de 5 mg/ml en PBS (es decir, dilucion de 4 veces) y se mantuvo en hielo. (8) Para los tubos de referenda con microsomas desnaturalizados y de tiempo cero, se anadieron 500 pi de acetonitrilo a -20°C. Los tubos de tiempo cero se transfirieron a hielo y los de referenda con microsomas desnaturalizados se preincubaron a 37°C durante 5 min. (9) Los tubos de ensayo que contenian la preparacion de microsomas tambien se preincubaron durante 5 min a 37°C. (10) Para cada tubo de incubacion, la reaccion se inicio por adicion de 50 pi de la preparacion de microsomas y se mezclo con mezcla vortical. (11) Cada reaccion se termino por adicion de 500 pi de acetonitrilo a -20°C y mezcla vortical. (12) Tras terminarse la reaccion, se transfirieron 100 pi de cada tubo de reaccion a un nuevo tubo y se anadieron a cada tubo 200 pi de agua y 1400 pi de eter de f-butilo y metilo. Los tubos se mezclaron con mezcla vortical y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 min en una microcentrifuga. Los tubos despues se pusieron en un bano de hielo seco-metanol hasta que la capa acuosa se habia congelado formando un solido. (13) Se transfirio el eter de f-butilo y metilo de cada tubo a un nuevo tubo y el disolvente se evaporo en atmosfera de nitrogeno y despues el precipitado se volvio a suspender en 100 pi de acetonitrilo/agua 35:65 y se analizo por LCMS. Los resultados se muestran en la siguiente tabla para los tiempos de incubation mostrados a continuation.

Compuesto microsomas humanos restantes microsomas de raton restantes oriqinales oriqinales

androst-5-eno-3p,17(3-diol 39% (10 min) 25% (10 min)

androst-5-eno-3p,17(3-diol 30% (90 min) -androst-5-eno-3p,7|3,17(3-triol 86% (90 min) 89% (10 min)

17a-etinilandrost-5- eno-3p,7p, 17p-triol - 86%* (30 min)

androst-5-eno-3p,7p, 16a, 17p-tetrol 100% (10 min) 100% (10 min)

androst-5-eno-3a,7p, 16a, 17p-tetrol 100% (10 min) 100% (10 min)

androst-5-eno-3a,7a, 16a, 17p-tetrol 100% (10 min) 100% (10 min)

androst-5-eno-3 P,7a, 16a, 17P-tetrol 100% (10 min) 100% (10 min) *microsomas de rata en lugar de preparation de raton

Los resultados muestran que el compuesto tetrol era resistente a las reacciones redox, lo cual esta de acuerdo con un grado muy reducido de metabolismo comparado con el compuesto de referenda androst-5-eno-3p,17p-diol. Esta observation era bastante inesperada porque cada uno de los 4 grupos hidroxilo podria ser potencialmente reducido a una cetona, pero de hecho ninguno era afectado. Otros compuestos que se examinaron incluian el androst-5-eno-3p,16a,17p-triol, androstano-3p,16a-diol-17-ona y androstano-3a,16a,17a-triol, los cuales eran todos metabolizados por los microsomas a una velocidad similar al compuesto de referenda androst-5-eno-3p,17p-diol.

Ejemplo 29. Medicion de la absorcion de farmaco con celulas CaCo-2. Este protocolo se uso para medir el influjo de los compuestos a traves de una monocapa de celulas CaCo-2. Las celulas CaCo-2 son celulas humanas de una linea celular muy diferenciada, polarizada, lo que demuestra un fenotipo celular de absorcion intestinal (J. Hunter et al., J. Biol. Chem., 268 (20):14991-14997, 1993). Esta linea celular se usa para estudiar la velocidad a la que diferentes compuestos cruzan la monocapa celular. Tipicamente, se usan monocapas confluentes de celulas Caco-2 como modelo de epitelio intestinal y para obtener coeficientes de permeabilidad del flujo en estado de equilibrio de los compuestos de ensayo. Esto puede proporcionar information sobre el potencial de un compuesto para ser biodisponible por via oral.

En este protocolo, las celulas se mantuvieron en medio a 37°C usando 100 pi por pocillo de medio caliente en un tubo esteril de 50 ml. Las celulas se cultivaron en placas esteriles de 24 pocillos con 600 pi de medio de diferenciacion por pocillo. Los pocillos contenian un inserto Transwell para permitir dos compartimentos por pocillo. Se anadieron con cuidado 100 pi de medio de diferenciacion en cada pocillo, tocando con la punta de la pipeta el lateral del pocillo. Las celulas se incubaron a 37°C, CO² al 5%, humedad de saturation durante 48 h para formar una monocapa. Para cada placa, se numeraron tubos como tubos 1-24 para el tampon basolateral para que sirvieran como tiempo de medicion cero basolateral (To). Los tubos 26 a 49 eran tampon apical que contiene el articulo de ensayo para que sirvieran como T0 apical. Los tubos 51-74 eran el punto de medicion T²⁰ (20 min), 76-99 eran el punto de medicion T⁴⁰, 101-124 eran el punto de medicion Tso, 126-149 eran el punto de medicion T¹²⁰, y 151-174 eran las muestras apicales T¹²⁰ para la determination del equilibrio de masas. Los tubos 175-179 eran la curva patron de 5 puntos para el compuesto 1, los tubos 180-184 eran la curva patron para el compuesto 2 etc. hasta los tubos 230-234 para el compuesto 12. Los tubos 1-49 se pusieron en 4 filas en la rejilla 1, 51-99 en la rejilla 2, 101-149 en la rejilla 3, 151-174 en la rejilla 4, y 175-234 en las rejillas 5 y 6.

Los tampones se prepararon separando 150 ml de tampon de transporte de una nueva botella de 1000 ml (a pH 7,4 con HCI 1 N). Este tampon es “basolateral”. El pH de los 850 ml restantes se ajusto a 6,5 con HCI 1 N para el tampon “apical”. Se pusieron 150 ml de tampon apical en un recipiente separado, y los 700 ml restantes se usaron para el lavado. Los tampones se almacenaron a 4°C pero se usaron a temperatura ambiente para el protocolo.

Despues de que el medio de diferenciacion alcanzara la temperatura ambiente, se vertieron aproximadamente 20 ml en un vaso de precipitados pequeno. La sonda se equilibro en este medio durante 15 min. Se sacaron las placas de 24 pocillos del incubador y se dejo que alcanzaran la temperatura ambiente. Se hizo la medicion en cada pocillo mediante la sonda, insertando la sonda en el pocillo sin tocar la monocapa celular, se presiono el boton TEST cuando la sonda estaba cerca de la superficie del medio y las lecturas iban de 0000 a un numero cuando la sonda toca la superficie; una lectura de >1000 Q era aceptable. Despues, se decanto el tampon apical del inserto Transwell y la placa entera se lavo en un vaso de precipitados de 1000 ml que contenia tampon de lavado para separar todo el tampon de diferenciacion. Los Transwell se pusieron en placas T20. Se anadieron el compuesto de ensayo y las referencias 10 pM (carabamazapina PM 236; hidroclorotiazida PM 351) en tapon apical, anadiendo 0,1 pmol (p. ej.

29 pi de una disolucion de referenda de 1 mg/ml de androst-5-eno-3p,17p-diol) a 10 ml de tampon apical. Despues se anadieron 0,6 ml de tampon basolateral a todos los pocillos.

Se hizo una disolucion de 50 pg/ml de 3a,7p,16a,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno como una referencia interna por adicion de 150 pi del compuesto (1 mg/ml en etanol) a 10 ml de acetonitrilo/agua (25:75). Las curvas de referencia se hicieron en tampon basolateral para cada compuesto. El tampon apical 10 pM se diluyo 6 veces cuando pasaba al compartimento basolateral, de modo que la curva patron se prepare con una concentracion 6 veces inferior.

Concentracion TA apical (10 pM) Tampon Baso.

2pM 120 480

1 pM 60 540

0,5 pM 30 570

0,2 pM 12 588

0,05 3 597

Se pusieron 600 pi de tampon basolateral en los tubos 1-24 para las referencias de T0. Se anadieron 100 pi de tampon apical mas articulo de ensayo mas 500 pi de tampon apical (de modo que la concentracion estuviera en el intervalo de la curva patron) a los tubos 26-49 para que sirvieran de T0 apical. Se pusieron 100 pi de tampon apical mas compuesto en el lado apical. El tempo en el que el Transwell se puso en la placa se tomo como tiempo cero (To). En T = 20 los Transwell se movieron a la placa T40 y se anadieron 600 pi de muestra desde la placa T20 al tubo adecuado. En T = 40, el Transwell se movio a la placa T80 y se recogieron 600 pi de muestra de la placa T40 y se anadieron al tubo adecuado. En T = 80, se movio el Transwell a la placa T120. Se anadieron mediante pipeta 600 pi de muestra de la placa T80 en el tubo adecuado y de la misma forma para el resto de los puntos de medicion. Se anadieron 100 pi de tampon apical al tubo adecuado para el equilibrio de masas. Las muestras se extrajeron inmediatamente y se pusieron inmediatamente en un refrigerador.

Se transfirieron 300 pi de cada muestra desde el tubo de ensayo a un tubo de 2 ml etiquetado, excepto para los tubos 151-174 (que contenian solo 100 pi); se transfirieron 50 pi de estas muestras y se anadieron a 250 pi de tampon basolateral (dando como resultado una dilucion de 6 veces). Se anadieron 20 pi de la referencia interna 3a,7p,16a,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno a cada tubo y se anadieron 1500 pi de eter de t-butilo y metilo a cada tubo. Los tubos se mezclaron con mezcla vortical, se centrifugaron en una microcentrifuga durante 10 min y se pusieron en un bano de metanol/hielo seco hasta congelacion. Se marcaron nuevos tubos y se decanto el eter de f-butilo y metilo de cada tubo congelado en el tubo nuevo. Despues se evaporo el eter de f-butilo y metilo en atmosfera de nitrogeno y se reconstituyo en 120 pi de acetonitrilo/agua (35:65) y se analizo por LCMS. En la siguiente tabla, el compuesto 1 era el 3p,7p,16a,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno, el compuesto 2 era el 17a-etinilandrost-5-eno-3p,7p,17p-triol, el compuesto 3 era el 3a,17p-dihidroxi-17a-etinilandrostano, el compuesto 4 era el 3a,7p,16a,17ptetrahidroxiandrost-5-eno, el compuesto 5 era el 2p,3a,16a,17p-tetrahidroxiandrostano, el compuesto 6 era el 3p,16a-diacetoxi-7p,17p-dihidroxiandrost-5-eno, el compuesto 7 era el 3p-acetoxi-17a-etinilandrost-5-7p,17p-diol, el compuesto 8 era el 3p-acetoxiandrost-5-7p,16a,17p-triol y el compuesto 9 era el 17a- etinilandrost-5-3a,7p,17p-triol.

Compuesto Cone. (pM) apical a To Cone. basolateral % apical transportada en% total transportado acumulada (pM) en 8080 min

min

1 2,195 0,017 0,008 0,8%

2 1,911 0,470 0,246 24,6%

3 2,727 0,411 0,151 15,1%

4 1,664 0,019 0,012 1,2%

5 1,817 0,162 0,089 8,9%

6 1,776 0,185 0,104 17,8%

7 1,710 0,195 0,114 31,4%

8 1,724 0,123 0,071 15,9%

9 1,773 0,531 0,299 29,9%

Los estudios con la linea celular CaCo-2 indicaban que los compuestos tetrol tales como el androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol no eran muy permeables y por lo tanto nose esperaria quefueran biodisponibles por via oral. A pesar de esto, el compuesto androst-5-eno-3p,7p,16a,17p-tetrol era activo como se ha descrito antes, cuando se administro por via oral a ratones en un modelo de tratamiento de la diabetes. Otros protocolos mostraron que el grado de sulfatacion y el grado de glucuronidacion de los compuestos tetrol tales como el 3p,7p,16a,17ptetrahidroxiandrost-5-eno y el 3a,7p,16a,17p-tetrahidroxiandrost-5-eno, era bajo para los compuestos tetrol comparado con los diol. Esta actividad puede surgir al menos parcialmente del bajo metabolismo de los compuestos tetrol in vivo.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Compuesto para usar en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o afeccion metabolica, una afeccion de perdida osea o dolor, en el que el compuesto es 17a-etinilandrost-5-en-3p, 7p, 17p-triol, o un analogo de monoester C^{2-4 0} diester C^2-4 de este compuesto, opcionalmente en el que el monoester es acetato en la posicion 3617⁰ el diester es acetato en las posiciones 3 y 17.

2. Compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, para la profilaxis ⁰ el tratamiento de una enfermedad ⁰ afeccion metabolica.

3. Compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que el compuesto es 17a-etinilandrost-5-en-3p, 7p, 17p-triol.

4. Compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la enfermedad ⁰ afeccion metabolica es diabetes tipo 2.

5. Compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la enfermedad ⁰ afeccion metabolica es hiperglucemia.

6^. Compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la enfermedad ⁰ afeccion metabolica es diabetes tipo 1.

7. Compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la enfermedad ⁰ afeccion metabolica es resistencia a la insulina, obesidad, arteriosclerosis, hipertension, sindrome metabolico ⁰ una afeccion hiperlipidemica.

8. Compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, para la profilaxis ⁰ el tratamiento del dolor.

9. Compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el compuesto es 17a-etinilandrost-5-en-3p, 7p, 17p-triol.

10. Compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el dolor es dolor de las articulaciones ⁰ es dolor asociado con cancer.

11. Compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, para la profilaxis ⁰ el tratamiento de una afeccion de perdida osea, en el que la afeccion de perdida osea es osteoporosis ⁰ una fractura osea, ⁰ es perdida osea asociada con una quemadura termica, por radiacion ⁰ quimica, la presencia de niveles elevados de glucocorticoides naturales ⁰ la presencia de un glucocorticoide sintetico.

12. Compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que el compuesto es 17a-etinilandrost-5-en-3p, 7p, 17p-triol.