ES2817325T3 - Procedimiento de preparación de células dendríticas con aumento de expresión génica específica, y composición para tratar o prevenir enfermedades autoinmunes, conteniendo células dendríticas preparadas utilizando el mismo - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de generación de células dendríticas semimaduras en las que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o un gen que codifica la proteína NR4A2 y/o UBASH3B al menos 2 veces en comparación con células dendríticas inmaduras, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) tratar células dendríticas inmaduras in vitro con un antígelno propio (autoantígeno), una citocina y prostaglandina E2 (PGE2); y (b) confirmar que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras al menos 2 veces en comparación con aquellas en las células dendríticas inmaduras, o confirmar que se aumenta adicionalmente la expresión de la proteína PTGS2 y/o IDO o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de preparación de células dendríticas con aumento de expresión génica específica, y composición para tratar o prevenir enfermedades autoinmunes, conteniendo células dendríticas preparadas utilizando el mismo Campo técnico
La presente invención se refiere a un procedimiento para generar células dendríticas semimaduras en las que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o un gen que codifica la proteína NR4A2 y/o UBASH3B al menos 2 veces en comparación con células dendríticas inmaduras, el procedimiento comprende las etapas de: (a) tratar células dendríticas inmaduras in vitro con un antígeno propio (autoantígeno), una citocina y prostaglandina E2 (PGE2); y
b) confirmar que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras al menos 2 veces en comparación con aquella en células dendríticas inmaduras, o confirmar que se aumenta adicionalmente la expresión de la proteína PTGS2 y/o IDO o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras.
Técnica antecedente
Las células dendríticas en la piel fueron encontradas por primera vez por Langerhans en 1868, y la función de las mismas como células potenciadoras de inmunidad fue reportada por Cohn and Steinmann en 1973. En la década de 1990, se encontró que las células dendríticas funcionan como células presentadoras de antígenos profesionales (APC), y se encontró que desempeñan una función importante en la activación y regulación inmunitaria. Las células dendríticas en el cuerpo humano representan solo alrededor del 0,3 % del total de leucocitos circulantes, pero consisten en una población heterogénea que tiene un fenotipo diferenciado del de los macrófagos. Las células dendríticas se diferencian en que son células presentadoras de antígenos profesionales, a diferencia de las células B o los macrófagos que muestran una capacidad de presentación de antígenos relativamente débil. Las células dendríticas tienen la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria primaria capaz de estimular las células T indiferenciadas que no han sido expuestas al antígeno, y estas células dendríticas son las únicas células que tienen la capacidad de inducir memoria inmunitaria. Se sabe que las células dendríticas pueden funcionar para inducir fuertes respuestas inmunitarias, porque estas células dendríticas son células presentadoras de antígeno (APC) que expresan, sobre la superficie celular, altos niveles tanto de moléculas MHC presentadoras de antígeno (I/II) como moléculas coestimuladoras, por ejemplo, CD-80 y CD-86, y moléculas de adhesión, por ejemplo, ICAM-1, y secretan diversas citocinas (IFN-alfa, IL-12, iL-18, etc.). Se sabe que, debido a que las células dendríticas expresan altos niveles de moléculas presentadoras de antígenos (moléculas de HMC y moléculas coestimuladoras) sobre la superficie celular, y secretan varias citocinas tales como IFN-alfa, IL-12 y similares, estas células dendríticas pueden inducir la generación de linfocitos T citolíticos específicos de antígenos y la proliferación y activación de células Th1. Como se describió anteriormente, las células dendríticas son las células presentadoras de antígenos más fuertes. Un número muy pequeño de células dendríticas está presente in vivo, pero estas células inducen fuertemente la inmunidad de las células T y, por lo tanto, se han estudiado como agentes terapéuticos contra cánceres o enfermedades infecciosas en estudios clínicos centrados en la inducción de inmunidad contra antígenos específicos. Se encontró que la inmunogenicidad del antígeno se desencadenaba por la transferencia adoptiva de células dendríticas que se aislaron de tejidos o sangre, pulsadas con antígeno y maduradas in vitro. Por tanto, estas células dendríticas son muy valiosas como vacunas celulares para inducir inmunidad específica de antígeno contra el cáncer o microbios patógenos (Inaba, K. et al., 3. Exp. Med., 178: 479, 1993; Inaba, K. et al., Int. Rev. Immunol., 6: 197, 1990; Hsu, F. et al., Nature Med., 2:52, 1996). Las técnicas para el aislamiento y la maduración de células dendríticas se describen en varios documentos, y existen varios procedimientos, que incluyen un procedimiento que comprende generar células dendríticas maduras a partir de células dendríticas inmaduras derivadas de células pluripotentes que tienen la capacidad de expresar una cualquiera de las características de macrófagos o células dendríticas, y poner las células dendríticas inmaduras en contacto con factores de maduración de células dendríticas que incluyen IFN-a (patente europea No. 922,758); un procedimiento que comprende cultivar células hematopoyéticas CD34+ humanas con (i) GM-CSF, (ii) TNF-a e IL-3 y/o (iii) GMCSF y TNF-a para inducir la formación de células hematopoyéticas CD1a+, y recuperar las células dendríticas humanas CD1a+ del cultivo (patente europea No. 663,930); y un procedimiento que comprende aislar células de sangre periférica, enriquecer las células progenitoras de la sangre que expresan el antígeno CD34 y cultivar las células con una combinación de factores de crecimiento hematopoyéticos y citocinas (documento WO 95/28479).
El documento de Boks et al., Clinical Immunology (2012), vol. 142, no. 3, páginas 332-342 divulga células dendríticas tolerogénicas (tDC) como una herramienta prometedora para la terapia celular específica para inducir tolerancia inmunitaria en trasplantes y autoinmunidad. Los autores describen adicionalmente las DC de IL-10 que mostraron las características tolerogénicas más poderosas con una alta producción de IL-10 y una baja activación de las células T, y que son elegibles para las terapias que inducen la tolerancia.
Sin embargo, los documentos y patentes de la técnica anterior están simplemente dirigidos a procedimientos de generación de células dendríticas sensibilizando células dendríticas inmaduras con antígeno no específico, y no
enseñan un procedimiento para generar células dendríticas semimaduras al sensibilizar células dendríticas inmaduras con un antígeno propio específico seleccionado (autoantígeno).
De acuerdo con lo anterior, en base a la función de las células dendríticas semimaduras específicas de antígeno en la tolerancia inmunitaria, los presentes inventores han encontrado que las células dendríticas semimaduras se pueden desarrollar a partir de células dendríticas inmaduras pulsadas con antígenos propios seleccionados entre los antígenos propios sobreexpresados en pacientes con artritis reumatoide. Estas células dendríticas semimaduras aumentan la expresión de un gen específico y median la tolerancia inmunitaria a los antígenos propios seleccionados (autoantígeno) y, por tanto, mejoran la eficacia terapéutica en la artritis reumatoide.
Divulgación de la invención
Problema Técnico
Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para generar células dendríticas semimaduras que tienen una expresión aumentada de un gen específico después de pulsar células dendríticas inmaduras con un antígeno propio específico (autoantígeno).
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico celular que contiene células dendríticas semimaduras generadas por el procedimiento descrito anteriormente, y aumentar la eficacia terapéutica sobre una enfermedad autoinmunitaria induciendo tolerancia inmunitaria al mismo antígeno propio (autoantígeno) utilizado para la generación de células dendríticas semimaduras, y un procedimiento para preparar el agente terapéutico celular. Todavía otro objeto más de la presente invención es proporcionar un procedimiento para medir un nivel de expresión de un gen o una proteína, que se incrementa específicamente mediante el tratamiento con un antígeno propio específico (autoantígeno).
Solución técnica
Para lograr los objetos anteriores, la presente invención proporciona un procedimiento para generar células dendríticas semimaduras en las que la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o un gen que codifica la proteína NR4A2 y/o UBASH3B aumenta al menos 2 veces en comparación con células dendríticas inmaduras, el procedimiento comprende las etapas de:
(a) tratar células dendríticas inmaduras in vitro con un antígeno propio (autoantígeno), una citocina y prostaglandina E2 (PGE2); y
(b) confirmar que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras al menos 2 veces en comparación con aquella en células dendríticas inmaduras, o confirmar que se aumenta adicionalmente la expresión de la proteína PTGS2 y/o IDO o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras.
La presente invención también proporciona un procedimiento para preparar un agente terapéutico celular que contiene células dendríticas semimaduras, el procedimiento comprende las etapas de:
(a) tratar células dendríticas inmaduras in vitro con un antígeno propio (autoantígeno), una citocina y prostaglandina E2 (PGE2) para producir células dendríticas semimaduras;
(b) confirmar que la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras aumenta al menos 2 veces en comparación con la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o el gen que codifica la proteína en células dendríticas inmaduras; y
(c) preparar un agente terapéutico celular que contiene las células dendríticas semimaduras en las que aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o el gen que codifica la proteína al menos 2 veces.
La presente invención también proporciona un procedimiento para medir un nivel de expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o un gen que codifica la proteína en células dendríticas semimaduras, el procedimiento comprende las etapas de:
(a) tratar células dendríticas inmaduras in vitro con un antígeno propio (autoantígeno), una citocina y PGE2 para producir células dendríticas semimaduras;
(b) medir el nivel de expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o el gen que codifica la proteína en las células dendríticas inmaduras;
(c) medir el nivel de expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o el gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras; y
(d) comparar los niveles de expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o el gen que codifica la proteína, medidos en la etapa (b) y etapa (c).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1a muestra los resultados de un experimento realizado para medir respuestas de células T (IFN-y) a antígenos propios (autoantígenos) utilizando la sangre de personas normales y pacientes con artritis reumatoide con el fin de seleccionar un antígeno propio específico (autoantígeno) que se va a utilizar para sensibilizar las células dendríticas semimaduras.
La Figura 1b muestra los resultados de un experimento realizado para medir respuestas de antígeno propio (autoantígeno) a antígenos propios (autoantígenos) utilizando la sangre de personas normales y pacientes con artritis reumatoide con el fin de seleccionar un antígeno propio específico (autoantígeno) que se va a utilizar para sensibilizar las células dendríticas semimaduras.
La Figura 2a muestra resultados experimentales que indican los niveles de expresión de genes específicos en función del tiempo de tratamiento con TNF-a PGE2.
La Figura 2b muestra resultados experimentales que indican los niveles de expresión de genes específicos como una función de la concentración de PGE2.
La Figura 3a muestra resultados experimentales que indican el nivel de secreción de IL-10 como una función del tiempo de tratamiento con TNF-a PGE2.
La Figura 3b muestra resultados experimentales que indican el nivel de secreción de IL-10 como una función de la concentración de PGE2.
La Figura 4 muestra resultados experimentales que indican la correlación entre la expresión génica específica y la secreción de IL-10.
La Figura 5a muestra resultados experimentales que indican que el gen NR4A2 expresado en células dendríticas semimaduras de acuerdo con un procedimiento de producción de la presente invención regula la secreción de IL-10.
La Figura 5b muestra resultados experimentales que indican que el gen UBASH3B expresado en células dendríticas semimaduras de acuerdo con un procedimiento de producción de la presente invención regula la secreción de IL-10.
La Figura 6a muestra resultados experimentales que indican que las células dendríticas semimaduras de acuerdo con un procedimiento de producción de la presente invención inducen la tolerancia inmunitaria de células T mediante secreción de IL-10, y resultados experimentales que indican niveles de secreción de IL-10 de células dendríticas semimaduras bajo diversas condiciones de estimulación.
La Figura 6b muestra resultados experimentales que indican la inhibición mediada por IL-10 de la secreción de T-IFNy mediante células dendríticas semimaduras.
La Figura 6c muestra resultados experimentales que indican la inducción mediada por IL-10 de células T reguladoras por células dendríticas semimaduras.
La Figura 7a muestra resultados experimentales que indican que la expresión génica en células dendríticas semimaduras, producidas por un procedimiento de la presente invención y que tienen expresión aumentada de un gen específico y aumento de secreción de IL -10, es efectiva para tratamiento de artritis reumatoide.
La Figura 7b resultados experimentales que indican expresión génica específica y secreción de IL-10 y que indica que las células dendríticas semimaduras, producidas por un procedimiento de la presente invención son efectivas para tratamiento de artritis reumatoide.
La Figura 8 muestra la eficacia clínica de células dendríticas semimaduras durante 14 semanas y 24 semanas en 12 pacientes administrados cinco veces con células dendríticas semimaduras en diferentes dosis (NA: paciente en el que el recuento de articulaciones inflamadas es 0 en el momento inicial, y por lo que la evaluación ACR es imposible).
La Figura 9a muestra los resultados de un ensayo ELISPOT realizado para medir cambios en respuestas de células T (IFN-y) de pacientes administrados con células dendríticas semimaduras.
La Figura 9b muestra los resultados de un ensayo de tinción intracelular de IFN-y realizado para medir cambios en respuestas de células T (IFN-y) de pacientes administrados con células dendríticas semimaduras.
La Figura 10 muestra resultados experimentales que indican la disminución de autoanticuerpos específicos (filagrina citrulinada, PAD4, RA33, y vimentina) en 12 pacientes a 14 semanas después de administración de células dendríticas semimaduras.
La Figura 11 muestra resultados experimentales que indican las disminuciones dependientes del tiempo en autoanticuerpos (filagrina citrulinada, PAD4, RA33, y vimentina), medidos 14 semanas después en células dendríticas semimaduras a 9 pacientes que tienen uno o más antígenos propios(autoantígenos).
Mejor modo de realizar la invención
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Generalmente, la nomenclatura utilizada en este documento y los procedimientos experimentales, que se describirán a continuación, son bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica.
En un aspecto, la presente invención se dirige a un procedimiento para generar células dendríticas semimaduras en las que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o un gen que codifica la proteína NR4A2 y/o UBASH3B al menos 2 veces en comparación con aquel en células dendríticas inmaduras, el procedimiento comprende las etapas de:
(a) tratar células dendríticas inmaduras in vitro con un antígeno propio (autoantígeno), una citocina y prostaglandina E2 (PGE2); y
(b) confirmar que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras al menos 2 veces en comparación con aquel en células dendríticas inmaduras, o confirmar que se aumenta adicionalmente la expresión de la proteína PTGS2 y/o IDO o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras.
En un ejemplo de la presente invención, se trataron células dendríticas inmaduras producidas por la diferenciación de monocitos de sangre periférica (PBMCs) de personas normales o pacientes con artritis reumatoide con un antígeno propio específico seleccionado(autoantígeno), una citocina y prostaglandina E2 (PGE2), generando de esta manera células dendríticas semimaduras.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “células dendríticas” pretende incluir una población de células dendríticas y se refiere a células presentadoras de antígenos profesionales que absorben y tratan un antígeno y presentan el antígeno tratado junto con un complejo MHC clase I (complejo principal de histocompatibilidad) o complejo MHC clase II. Las células dendríticas que se utilizan en la presente invención se refieren a células que tienen el fenotipo típico y las características de las células dendríticas divulgadas en Steinman et al., Annual Rev. Immunol. 9: 271 -296, 1991 y Banchereau and Steinman Nature 392: 245-252, 1998. Las células dendríticas incluyen células presentadoras de antígenos tanto inmunogénicas como tolerogénicas, y se clasifican en células dendríticas inmaduras (imDC), células dendríticas semimaduras (smDC) y células dendríticas maduras (mDC). Como se utiliza en la presente memoria, el término “células dendríticas inmaduras (imDC)” se refiere a células dendríticas que no expresan marcadores de superficie celular tales como CD14, como células dendríticas maduras, y que expresan CCR7 y proteína citoplásmica DC-LAMP a niveles bajos, expresan moléculas coestimuladoras (c D40, CD80 y CD86) a niveles bajos, y expresan CD1a, CCR1, CCR2, CCR5 y CXCR1 a niveles convencionales. Como se utiliza en la presente memoria, el término “células dendríticas maduras (mDC)” se refiere a células formadas por maduración de células dendríticas inmaduras. Las células dendríticas maduras muestran una mayor expresión no solo de DC-LAMP, sino también de MHC de clase II, CD40, CD80, CD83 y CD86, liberan citocinas proinflamatorias e inducen una mayor proliferación de células T alogénicas y células T singénicas en una reacción de linfocitos mezclada y/o aumento de la producción de citocinas de células dendríticas. Las células dendríticas maduras (mDC) expresan CCR7 y CXCR4 a altos niveles.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “células dendríticas semimaduras (smDC)” se refiere a células dendríticas que carecen de algunas de las características de las células dendríticas inmaduras, tienen algunos de los fenotipos de células dendríticas maduras y muestran caracteres morfológicos y fenotípicos parcial o incompletamente maduros. Las células dendríticas semimaduras generalmente tienen la capacidad de inducir una respuesta de tolerancia inmunitaria a un antígeno propio (autoantígeno).
Por ejemplo, los monocitos se pueden haber obtenido de personas normales o pacientes con artritis reumatoide. De acuerdo con una realización, las células se cultivan luego principalmente utilizando un medio (preferiblemente un medio complementado con GM-CSF) sobre un sustrato adecuado. Las sustancias que promueven la diferenciación de células pluripotentes o células multipotentes en células dendríticas inmaduras, particularmente GM-CSF, se divulgan en las Patentes de Estados Unidos No. 5,851,756 y 5,994,126. El sustrato es preferiblemente un sustrato al que se pueden adherir las células. Más preferiblemente, el sustrato es un sustrato de plástico que se utiliza en cultivo de tejidos.
Además de GM-CSF, se pueden agregar al medio de cultivo factores que previenen o inhiben la proliferación de células no dendríticas para mejorar el rendimiento de células dendríticas inmaduras. Los factores incluyen, por ejemplo, IL-4 y/o IL-13 que inhibe los macrófagos. Si bien los factores promueven la proliferación de células progenitoras dendríticas, inhiben el crecimiento de células no dendríticas para aumentar de esta manera el número de células dendríticas inmaduras en el medio.
El antígeno propio (autoantígeno) que se utiliza en la presente invención puede ser, por ejemplo, uno o más seleccionado del grupo que consiste en a-enolasa, filagrina, PAD4 (peptidil arginina deiminasa 4), RA33 (ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2), fibrinógeno-a, fibrinógeno-p, colágeno II, histona B, agrecano, fibrina, factor reumatoide, GPI (glucosa-6-fosfato isomerasa), y péptidos y proteínas de vimentina, y péptidos y proteínas citrulinados de los mismos, o en el que la citocina es TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa), preferentemente en el que la concentración del PEG2 utilizado para tratar las células es 0,05 - 5 pg/ml.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, los monocitos de sangre periférica que se han extraído de 9 pacientes con artritis reumatoide que muestran una respuesta ELISPOT efectiva o 2 personas normales, se sensibilizan con siete antígenos respectivos, que incluyen filagrina citrulinada (JW CreaGene), PAD4 (JW CreaGene), RA33 (JW CreaGene), vimentina (JW CreaGene), fibrinógeno (Sigma-Aldrich), fibrina (Sigma-Aldrich), IgGFc (Cell Science), y se cribó un cierto antígeno propio (autoantígeno) que muestra una capacidad de respuesta de células T autorreactivas del 50% o más. Adicionalmente, en 100 pacientes coreanos con artritis reumatoide, se cribaron 9 autoanticuerpos, que incluyen filagrina citrulinada o no citrulinada (JW CreaGene), PAD4 (JW CreaGene), RA33 (JW CreaGene), vimentina (JW CreaGene), fibrinógeno (Sigma-Aldrich), fibrina (Sigma-Aldrich), IgG Fc (Cell Science), GPI (JW CreaGene) y colágeno (Genway), y se cribó un antígeno propio específico( autoantígeno) al utilizar un procedimiento que mida la reactividad antígeno-anticuerpo en base a un caso que muestra un valor ID que es al menos 1,5 veces mayor que aquel de las personas normales consideradas positivas. Como resultado, se pudo observar que los antígenos propios (autoantígenos), que muestran una reactividad antígeno-anticuerpo del 30% o más (Figura 1a) y cuyos monocitos de sangre periférica que secretan IFN-y muestran una capacidad de respuesta de 50 % o más (Figura 1b), eran filagrina citrulinada, PAD4 (peptidil arginina deiminasa 4), RA33 (ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2) y vimentina.
Por lo tanto, en la presente invención, el antígeno propio específico (autoantígeno) que se utiliza para tratar células dendríticas inmaduras puede ser uno o más seleccionado del grupo que consiste en filagrina citrulinada, PAD4 (peptidil arginina deiminasa 4), RA33 (ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2) y vimentina.
Como se divulga en la presente memoria, las células dendríticas semimaduras específicas de antígeno propio (autoantígeno) se pueden producir al poner el antígeno específico y las células en “contacto” entre sí durante un tiempo suficiente y bajo condiciones suficientes para permitir que el antígeno específico antígeno sea presentado desde la superficie celular por las células dendríticas semimaduras. Preferentemente, el “contacto” es “cocultivo”. El cocultivo preferentemente se realiza durante 3-10 horas, más preferentemente 3 -8 horas, aún más preferentemente 3 -4 horas. La concentración del PEG2 utilizado para tratar las células es preferentemente 0,01 - 5 ug/ml, y aún más preferentemente 0.5 - 5 pg/ml. La citosina puede ser TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa), y se utiliza a una concentración de 1-20 ng/ml, preferentemente 5 - 15 ng/ml.
Se confirmó que las células dendríticas semimaduras de acuerdo con la presente invención aumentan la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o un gen que codifica la proteína. Alternativamente, se puede aumentar adicionalmente la expresión de la proteína PTGS2 y/o IDO o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras de acuerdo con la presente invención, y en este caso, la expresión se puede aumentar en al menos dos veces que en células dendríticas inmaduras.
La proteína NR4A2, un factor de transcripción, se puede unir al promotor y potenciador de Foxp3 para actuar junto con otros factores de transcripción, induciendo de esta manera la diferenciación Treg de CD4+ T y finalmente induciendo respuestas antiinflamatorias. Adicionalmente, se sabe que las neuronas dopaminérgicas son dañadas por ambientes inflamatorios para provocar la enfermedad de Parkinson, y la expresión regulada de NR4A2 en glias y astrocitos puede proporcionar efectos protectores neuronales, al inhibir la secreción de TNF-a, IL-1p, NO y ROS. La proteína UBASH3B tiene un dominio similar a PGM en la región de terminal C, es evolutivamente similar a la enzima PGM/AcP y tiene actividad fosforilasa. Esta proteína UBASH3B puede desfosforilar la tirosina quinasa Src activada (fosforilada) de las células T, lo que resulta en una regulación negativa de las células T.
Las MLN-DC que expresan la proteína PTGS2 interfieren con la diferenciación de Th2 y desempeñan una función importante en el desarrollo de Treg. Cuando las DC se tratan con IG IV, puede aumentar la secreción de PGE2 de las DC y puede aumentar la expresión de Cox2 en las DC, mientras que la expresión de Treg también puede aumentar para reducir las puntuaciones de EAE.
La proteína IDO es una enzima que funciona como indolamina 2,3-dioxigenasa y está implicada en la degradación del aminoácido esencial L-triptófano.
En la presente invención, gen NR4A2 (NM_006186: SEQ ID NO: 11), gen UBASH3B (NM_032873: SEQ ID NO: 12), gen PTGS2 (NM_000963: SEQ ID NO: 13) y gen IDO (NM_002164: SEQ ID NO: 14) significa genes que codifican la proteína NR4A2, la proteína UBASH3B, la proteína PTGS2 y la proteína IDO, respectivamente.
La expresión de la proteína se puede medir mediante un procedimiento de análisis, por ejemplo, como transferencia Western, ELISA, análisis de radioinmunoensayo, inmunodifusión radial, inmunohistoquímica de tejidos, ensayo de inmunoprecipitación, ensayo de fijación del complemento o FACS, y la expresión del gen se puede medir mediante PCR, PCR en tiempo real o RT pCr , pero no se limita a ello.
En un ejemplo de la presente invención, se mide la expresión de un gen específico en las células dendríticas semimaduras de la presente invención mediante PCR en tiempo real. Como resultado, se pudo confirmar que, cuando la concentración de PGE2 utilizada para el tratamiento de las células fue 0,01 - 5 pg/ml, la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras aumentó al menos 2 veces en comparación con aquella en las células dendríticas inmaduras. Adicionalmente, se pudo encontrar que aumentó la expresión del gen PTGS2 y/o IDO en las células dendríticas semimaduras, por ejemplo, al menos dos veces. Específicamente, se pudo encontrar que las células dendríticas semimaduras de la presente invención mostraron un aumento de al menos 2 veces en expresión del gen NR4A2, un aumento de al menos 5 veces en la expresión del gen UBASH3B, un aumento de al menos 4 veces en la expresión del gen PTGS2, y un aumento de al menos 2 veces en expresión del gen IDO, en comparación con células dendríticas maduras (Figura 2).
Mientras tanto, con el fin de confirmar las características de las células dendríticas semimaduras de la presente invención y encontrar la razón por la cual las células dendríticas semimaduras de la presente invención exhiben excelentes efectos terapéuticos en pacientes con artritis reumatoide en comparación con agentes terapéuticos convencionales, es importante medir el nivel de expresión aumentado de forma característica de un gen específico en las células dendríticas semimaduras de la presente invención.
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para medir un nivel de expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o un gen que codifica la proteína en células dendríticas semimaduras, el procedimiento que comprende las etapas de:
(a) tratar células dendríticas inmaduras in-vitro con un antígeno propio (autoantígeno), una citocina y PGE2 para producir células dendríticas semimaduras;
(b) medir el nivel de expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o el gen que codifica la proteína en las células dendríticas inmaduras;
(c) medir el nivel de expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o el gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras; y
(d) comparar los niveles de expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o el gen que codifica la proteína, medidas en la etapa (b) y etapa (c).
En la presente invención, la medición del nivel de expresión de la proteína o el gen se puede realizar utilizando un procedimiento convencional, y los ejemplos específicos de este procedimiento son los mencionados anteriormente. La medición del nivel de expresión de la proteína o el gen se puede realizar, por ejemplo, al amplificar genes específicos utilizando un par de cebadores seleccionado entre cebadores de SEQ ID NO: 1 a 10, medir los niveles de expresión de los genes específicos mediante PCR en tiempo real, normalizar los niveles de expresión con pactina y analizar los valores relativos, que resultan de dividir los niveles de expresión normalizados por los niveles de expresión medidos en células dendríticas inmaduras. La p-actina es el componente principal del citoesqueleto, se expresa de manera uniforme en la mayoría de las células, no se modifica fácilmente por condiciones externas en la naturaleza de la misma y muestra un cierto nivel de expresión alto. Dichos genes se denominan genes constitutivos y se utilizan como valores de referencia para comparar los niveles de expresión de genes específicos. En un ejemplo de la presente invención, utilizando el nivel de expresión de p-actina como valor de referencia, se midió el nivel de expresión del gen NR4A2 y/o UBASH3B en células dendríticas semimaduras y se dividió por el nivel de expresión del gen NR4A2 y/o UBASH3B en células dendríticas inmaduras utilizadas como grupo de control. Como resultado, se pudo ver que, cuando la concentración de PGE2 utilizada para el tratamiento de las células fue de 0,05 - 5 pg/ml, los niveles de expresión de los genes NR4A2 y UBASH3B aumentaron al menos 2 y 5 veces, respectivamente, en comparación con aquellos de las células dendríticas inmaduras.
Además, el procedimiento de la presente invención puede comprender adicionalmente medir el nivel de expresión del gen PTGS2 y/o IDO.
La concentración de PGE2 utilizada para el tratamiento de las células puede ser 0,05 - 5 pg/ml, y el tiempo requerido para tratar las células dendríticas inmaduras con PGE2, el antígeno propio (autoantígeno) y la citosina puede ser 3 -10 horas. El antígeno propio (autoantígeno) puede ser uno o más seleccionado del grupo que consiste en (filagrina citrulinada, PAD4 (peptidil arginina deiminasa 4), RA33 (ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2), y vimentina. La citocina es TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa).
En la presente memoria también se divulga una enfermedad o trastorno al que se aplica la composición de la presente invención, que puede ser artritis reumatoide, pero no necesariamente se limita a la misma. En otras palabras, una enfermedad autoinmunuaria que se puede tratar con la composición que comprende las células dendríticas semimaduras de la presente invención incluye cualquier enfermedad o trastorno provocado por una respuesta autoinmunuaria in vivo, como se divulga en la presente memoria. Ejemplos de enfermedades autoinmunuarias incluyen diabetes tipo 1, artritis reumatoide, enfermedad celíaca, deficiencia de IgA, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, esclerodermia, polimiositis, hepatitis crónica activa, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, cirrosis biliar primaria, anemia perniciosa, tiroiditis autoinmunuaria, enfermedad de Addison idiopática, vitíligo, enteropatía sensible al gluten, enfermedad de Grave, miastenia gravis, neutropenia autoinmunuaria, púrpura trombocitopénica idiopática, cirrosis, pénfigo vulgar, infertilidad autoinmunuaria, síndrome de Goodpastures, penfigoide vesicular, lupus eritematoso discoide, colitis ulcerosa, enfermedad de depósitos densos y similares.
En otro ejemplo de la presente invención, con el fin de confirmar el efecto clínico de las células dendríticas semimaduras de la presente invención, se administraron células dendríticas semimaduras sensibilizadas antígenos propios específicos (autoantígenos) a 12 pacientes activos con artritis reumatoide. Los pacientes se dividieron en dos grupos, cada uno de los cuales consistía de 6 personas, y luego las células se administraron por vía subcutánea a cada grupo a una concentración de 5 x 106 células/0,5 ml o 1,5 x 107 células/1,5 ml. Las células se administraron un total de tres veces a intervalos de 2 semanas hasta las primeras 4 semanas, y luego se administraron un total de dos veces a intervalos de 2 semanas después de un descanso del fármaco de 4 semanas. Por tanto, las células se administraron durante un total de 10 semanas. Antes y después de la administración y 8 y 14 semanas después de la administración, se tomaron muestras de sangre de los pacientes con artritis reumatoide y se midieron las reactividades de los autoanticuerpos y las células T en la sangre.
Como resultado, se pudo encontrar que se redujeron los autoanticuerpos contra los antígenos propios específicos (autoantígenos: filagrina citrulinada, PAD4, RA33, y vimentina) (Figuras 10 y 11).
También se divulga en la presente memoria un agente terapéutico celular para tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria que tiene capacidad de respuesta al mismo antígeno propio (autoantígeno) como un antígeno propio (autoantígeno) utilizado para el tratamiento de células dendríticas semimaduras producidas por el procedimiento de la presente invención, el agente terapéutico celular contiene, como un ingrediente activo, las células dendríticas semimaduras.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “agente terapéutico celular” se refiere a un fármaco utilizado para el tratamiento, diagnóstico y prevención de enfermedades a través de una serie de procedimientos que incluyen el procedimiento de cambiar la propiedad biológica de una célula al cultivar o seleccionar autógenos, alogénicos y células xenogénicas fuera del cuerpo o utilizando otros procedimientos. Estados Unidos y Corea han controlado el agente terapéutico celular como fármaco desde 1993 y 2002, respectivamente. Dicho agente terapéutico celular se puede clasificar en gran medida en dos tipos: “un agente terapéutico de células madre” para la regeneración de tejidos y la recuperación de las funciones de los órganos y “un agente terapéutico inmunocítico” para la regulación de la reacción inmunitaria, que incluye la inhibición de reacción inmunitaria in vivo o la acentuación de la reacción inmunitaria.
La composición de agente terapéutico celular puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico celular para el tratamiento de enfermedades. Como se utiliza en la presente memoria, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un ingrediente activo o una composición farmacéutica que induce una reacción biológica o médica en sistemas de tejidos, animales o humanos, y es considerada por investigadores, veterinarios, doctores, u otros médicos. La cantidad terapéuticamente eficaz comprende una cantidad para inducir el alivio de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se está tratando. Es obvio para aquellos expertos en la técnica que el agente terapéutico celular contenido en la composición cambiará de acuerdo con el efecto deseado. Por lo tanto, aquellos expertos en la técnica pueden determinar fácilmente el contenido óptimo del agente terapéutico celular en la composición, y lo pueden ajustar dependiendo de varios factores, que incluyen el tipo y la gravedad de una enfermedad, el contenido de otros componentes contenidos en la composición, el tipo de formulación, la edad del paciente, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta, el tiempo de administración, la ruta de administración, la tasa de secreción de la composición, la duración del tratamiento y los medicamentos utilizados simultáneamente.
En un ejemplo de la presente invención, las células dendríticas semimaduras de la presente invención se administraron a 12 pacientes con artritis reumatoide a una concentración de 5 x 106 células/0,5 ml o 1,5 x 107 células/1,5 ml. Como resultado, se pudo observar que, cuando se agregaron las células dendríticas semimaduras a los pacientes que mostraban capacidad de respuesta al antígeno específico, las células dendríticas semimaduras funcionaron para reducir un autoanticuerpo contra el antígeno específico, lo que indica que las células tienen efectos terapéuticos (Figuras 10 y 11). Por lo tanto, cuando se determina la cantidad de células dendríticas semimaduras, que pueden exhibir el mayor efecto en la menor cantidad al considerar todos los factores descritos anteriormente, el agente terapéutico celular de la presente invención contiene las células dendríticas semimaduras en una cantidad de 5 x 106 a 1,5 x 107 células/ml, más preferentemente 1,5 x 107 células/ml.
Para examinar la correlación entre el efecto terapéutico de las células dendríticas semimaduras de la presente invención y los genes específicos que se expresan en las células e identificar el mecanismo relacionado con ellos, se examinaron si o no las células dendríticas secretan IL-10 y las funciones de genes específicos. Se sabe que la IL-10, una citocina secretada por Th2, células T reguladoras, células dendríticas y similares, ataca el tejido propio para inducir tolerancia inmunitaria.
En un ejemplo de la presente invención, la IL-10 se cuantificó mediante un kit ELISA y, como resultado, se pudo ver que las células dendríticas semimaduras de la presente invención secretaban IL-10 de una manera dependiente del tiempo y la concentración de tratamiento con PGE2 (Figura 4). En otro ejemplo de la presente invención, en base a una comparación con un grupo control transfectado con ARNip para cada gen a una concentración de 10-100 pmol (10, 50 y 100 pmol), se pudo observar que la secreción de IL-10 de las células dendríticas semimaduras es atribuible a genes específicos, particularmente al gen NR4A2 y/o UBASH3B (Figura 5). Adicionalmente, se pudo ver que las células dendríticas semimaduras de la presente invención, que muestran una secreción de IL-10 incrementada por la expresión del gen NR4A2 y/o UBASH3B, fueron efectivas para el tratamiento de la artritis reumatoide (Figuras 7a, 7b y 8). En otro ejemplo, se encontró que las células dendríticas semimaduras de la presente invención inducían tolerancia inmunitaria de las células T por IL-10 (Figuras 6 y 9).
Por lo tanto, también se divulga un agente terapéutico celular para el tratamiento de enfermedades autoinmunutarias, que tiene los efectos de aumentar la secreción de IL-10, reducir la secreción de IFN-y de las células T y reducir la producción de autoanticuerpos.
Mientras tanto, es obvio para aquellos expertos en la técnica que las células dendríticas semimaduras de la presente invención se pueden formular en una forma adecuada con un vehículo farmacéuticamente aceptable que se utiliza generalmente en terapia celular.
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un agente terapéutico celular, el agente terapéutico celular que contiene células dendríticas semimaduras, el procedimiento comprende las etapas de:
(a) tratar células dendríticas inmaduras in vitro con un antígeno propio (autoantígeno), una citocina PGE2 para producir células dendríticas semimaduras;
(b) confirmar que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras al menos 2 veces en comparación con la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o el gen que codifica la proteína en células dendríticas inmaduras; y
(c) preparar un agente terapéutico celular que contiene las células dendríticas semimaduras en las que aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o el gen que codifica la proteína al menos 2 veces.
En la presente invención, puede aumentar adicionalmente la expresión de PTGS2 o proteína IDO o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras. En este caso, se puede aumentar la expresión de PTGS2 o proteína IDO o el gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras al menos 2 veces en comparación con aquella en células dendríticas inmaduras.
En la presente invención, la medición de los niveles de expresión de genes específicos se puede realizar al amplificar los genes específicos utilizando cada par de cebadores seleccionado entre cebadores de SEQ ID NO: 1 a 10, medir los niveles de expresión de los genes específicos mediante PCR en tiempo real, normalizar los niveles de expresión con p-actina y dividir los niveles de expresión normalizados por los niveles de expresión medidos en células dendríticas inmaduras, determinando de esta manera los valores relativos. Específicamente, el nivel de expresión del gen NR4A2 o UBASH3B en las células dendríticas semimaduras se mide utilizando como valor de referencia el nivel de expresión de p-actina, un tipo de gen constitutivo que, no se cambia fácilmente por condiciones externas y muestra un cierto alto nivel de expresión, y el nivel de expresión medido se divide por el nivel de expresión del gen NR4A2 o UBASH3B en células dendríticas inmaduras utilizadas como grupo de control. Como resultado, se pudo ver que, cuando la concentración de PGE2 utilizada para el tratamiento de las células fue 0,05 -5 |jg/ml, aumentaron los niveles de expresión del gen NR4A2 y UBASH3Bs en las células dendríticas semimaduras al menos 2 veces y al menos 5 veces, respectivamente, en comparación con aquellos en las células dendríticas inmaduras. Cuando los niveles de expresión se midieron mediante el procedimiento descrito anteriormente, se pudo ver que, cuando la concentración de PGE2 utilizada para el tratamiento de las células fue 0,05 - 5 jg/ml, aumentaron los niveles de expresión de los genes PTGS2 y IDO en las células dendríticas semimaduras al menos 4 veces y al menos 2 veces, respectivamente, en comparación con aquellos en las células dendríticas inmaduras.
Un vehículo farmacéuticamente aceptable necesario para la formulación del agente terapéutico celular de la presente invención se refiere a una composición que es fisiológicamente aceptable y no provoca trastornos gástricos, reacciones alérgicas tales como trastornos gastrointestinales o vértigo, o reacciones similares, cuando se administra a humanos. Ejemplos del vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen vehículos para administración parenteral, tales como agua, aceite adecuado, solución salina, glucosa acuosa y glicol. La composición de la presente invención puede comprender adicionalmente un estabilizador y un conservante. Los estabilizadores adecuados incluyen antioxidantes, tales como bisulfito de sodio, sulfito de sodio y ácido ascórbico. Los conservantes
adecuados incluyen cloruro de benzalconio, metil- o propil-parabeno y clorobutanol. Se pueden encontrar otros vehículos farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1995.
En el procedimiento para preparar el agente terapéutico celular divulgado para prevención o tratamiento de enfermedad autoinmunitaria de acuerdo con la presente invención, el tiempo requerido para tratar las células con el antígeno propio (autoantígeno), la citocina y PGE2 puede ser 3-10 horas. En la presente memoria, el antígeno propio (autoantígeno) puede ser, por ejemplo, uno o más seleccionado del grupo que consiste en a-enolasa, filagrina, PAD4 (peptidil arginina deiminasa 4), RA33 (ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2), fibrinógeno-a, fibrinógeno-p, colágeno II, histona B, agrecano, fibrina, factor reumatoide, GPI (glucosa-6-fosfato isomerasa), y péptidos y proteínas de vimentina, y péptidos y proteínas citrulinados de los mismos, y la citosina puede ser TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa).
Ejemplos
A continuación, se describirá la presente invención con más detalle con referencia a ejemplos. Será obvio para una persona con experiencia normal en la técnica que estos ejemplos son únicamente con fines ilustrativos y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la presente invención.
Ejemplo 1: Cribado de antígenos o monitorización de la respuesta inmunitaria mediante identificación de autoanticuerpos
Para identificar los autoanticuerpos plasmáticos presentes en pacientes con artritis reumatoide (RA) en niveles más altos que aquellos de personas normales o para monitorizar cambios en el autoplasma (monitorización de la respuesta inmunitaria) después de la administración de células dendríticas semimaduras a pacientes con RA, se realizó el siguiente ensayo. Específicamente, cada uno de un total de 9 antígenos, que incluyen filagrina citrulinada o no citrulinada (JW CreaGene), PAD4 (JW CreaGene), RA33 (JW CreaGene), vimentina (JW CreaGene), fibrinógeno (Sigma-Aldrich), fibrina (Sigma-Aldrich), IgG Fc (Cell Science), GPI (JW CreaGene) y colágeno (Genway), se suministraron en una placa de 96 pocillos a una concentración de 1 pg/ml, y luego después de 24 horas, la placa se lavó con PBS-T al 0,05 % y se bloqueó con PBS al 1 % que contenía BSA durante 1 hora. Después de 1 hora, 50 pl de una dilución 1:10 o 1:50 de plasma de cada uno de los 100 pacientes con artritis reumatoide y 14 personas normales se suministro en duplicado seguido por incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de 2 horas, la placa se lavó con PBST al 0,05 %, y se suministraron 50 pl de una dilución 1:2000 de un anticuerpo IgG antihumano conjugado con AP (Sigma-Aldrich) en PBS que contenía BSA al 1 % en cada pozo de la placa. Después de 1 hora, la placa se lavó con PBS-T al 0,05%, y se suministraron 100 pl de 1 pg/ml de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma-Aldrich) en cada pocillo de la placa. Después del desarrollo del color, se suministraron 50 pl de hidróxido de sodio 0,2 M en cada pocillo de la placa para detener la reacción, y se midió la absorbancia de cada pocillo a 405 nm mediante un lector ELISA.
Como resultado, se pudo observar que la reactividad antígeno-anticuerpo de cada filagrina citrulinada, PAD4, RA33 y vimentina fue del 30 % o superior (Figura 1b). En la presente memoria, la reactividad antígeno-anticuerpo significa el porcentaje (%) de pacientes que tienen un valor igual o superior a <absorbancia media de personas normales x 1,5> entre 100 pacientes con artritis reumatoide.
Ejemplo 2: Cribado de antígenos y monitorización de la respuesta inmunitaria mediante ensayo ELISPOT de IFNy
Con el fin de identificar antígenos propios (autoantígenos) que aumentan la capacidad de respuesta al IFN-y de las células T autorreactivas en la sangre de pacientes con artritis reumatoide (Ra ) en comparación con aquella de personas normales y para monitorizar la capacidad de respuesta al IFN-y de las células T autorreactivas a antígenos propios (autoantígenos) (monitorización de la respuesta inmunitaria) después de la administración de células dendríticas semimaduras a pacientes con artritis reumatoide (RA), se realizó el siguiente ensayo. Se realizó un ensayo de IFNy-ELISPOT (BD Bioscience) de acuerdo con las directrices del fabricante. Específicamente, se suministraron 100 pl de anticuerpo de captura en cada pocillo de una placa ELSISPOT de 96 pocillos y se incubaron a 4 °C durante 24 horas, y luego se bloqueó la placa con PBS que contenía FBS al 10 % durante 2 horas. Después del bloqueo, 10 pg/ml de cada uno de un total de 7 antígenos, que incluyen filagrina citrulinada (JW CreaGene), PAD4 (JW CreaGene), RA33 (JW CreaGene), vimentina (JW CreaGene), fibrinógeno (Sigma-Aldrich), fibrina (Sigma-Aldrich) e IgGFc (Cell Science), se agregó a 2 x 105 monocitos de sangre periférica (PBMC) extraídos de cada una de las 9 personas con artritis reumatoide y 2 personas normales, y luego las células se suspendieron en RPMI1640 que contenía suero AB humano al 10 % y se suministraron en cada pocillo por duplicado. Después de la incubación en una incubadora de CO2 a 37 °C durante 24 horas, la placa se lavó con PBS-T al 0,05 % y se suministraron 100 pl de anticuerpo de detección biotinilado en cada pocillo, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de 2 horas, la placa se lavó con PBS-T al 0,05 % y se suministraron 100 pl de una dilución 1:100 de avidina conjugada con HRP en cada pocillo, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de 1 hora, la placa se lavó con PBS y se suministraron 100 pl de un sustrato de AEC (BD Biosciences) en cada pocillo. Se midió el grado de desarrollo del color y se comparó con el grado de desarrollo del
color medido en un grupo de control no tratado con el antígeno propio (autoantígeno). La mancha en cada pocilio se analizó utilizando un lector ImmunoSPOT-ELISPOT (Cellular Technology).
Como resultado, se pudo ver que los antígenos para los que los monocitos de sangre periférica secretan IFN-y muestran una capacidad de respuesta del 50 % o más eran filagrina citrulinada, PAD4, RA33 y vimentina (Figura 1a). La capacidad de respuesta a IFN-y significa el porcentaje (%) de pacientes que tienen un valor igual o superior a <absorbancia media de personas normales x 1,5> entre 9 pacientes con RA.
Considerando los resultados de los Ejemplos 1 y 2 juntos, la filagrina citrulinada, PAD4, RA33 y vimentina, que muestran una reactividad antígeno-anticuerpo del 30 % o superior y a los que los monocitos de sangre periférica que secretan IFN-y muestran una respuesta del 50 % o superior, se seleccionaron como autoantígenos específicos (autoantígenos) para ser utilizados para sensibilizar células dendríticas semimaduras.
Ejemplo 3: Producción de células dendríticas semimaduras
Se suministró una cierta cantidad de monocitos de sangre periférica extraídos de personas normales o pacientes con artritis reumatoide en una placa de cultivo de plástico y se cultivaron durante 30 minutos a 1 hora, y luego se eliminaron las células flotantes. Los monocitos adheridos al fondo se cultivaron en un medio CellGro (CellGenix) que contenía 20 ng/ml de IL-4 (JW CreaGene) y 30 ng/ml de GM-CSF (JW CreaGene) a 37 °C durante 3 días, y luego se recolectaron las células dendríticas inmaduras suspendidas (entre estas células, algunas células dendríticas inmaduras se utilizaron como grupo de control para confirmar la expresión de genes específicos). Las células dendríticas inmaduras recolectadas se suspendieron en el medio CellGro y se suministraron en una placa nueva en una cierta cantidad, y luego las células se estimularon durante 3-10 horas mediante la adición de 5-10 |jg de antígenos propios (autoantígenos: JW CreaGene) seleccionados en los Ejemplos 1 y 2, 10 ng/ml de TNFa (Peprotech) y 0,05 - 5 jg/ml de PGE2 (Sigma-Aldrich). Las células dendríticas semimaduras estimuladas se congelaron con albúmina de plasma humano (JW Pharm.) que contenía DMSO al 5 % (Sigma-Aldrich) y glucosa al 5 % (Green Cross Corp.).
Ejemplo 4: Análisis de la expresión de genes específicos en células dendríticas semimaduras
Las células dendríticas semimaduras sensibilizadas con antígenos propios específicos (autoantígenos), obtenidas en el Ejemplo 3, se descongelaron y lavaron con RPMI1640 (Lonza), y luego se aisló el ARNm de las células utilizando un mini kit RNeasy (Qiagen) y se cuantificó. Luego, cada ADNc se sintetizó a partir del ARNm de acuerdo con el procedimiento del kit de ARN de alta capacidad a ADNc (AB). El ADNc sintetizado se mezcló con cada par de cebadores de SEQ ID NO: 1 a 10 utilizando Power SYBR Green (AB), seguido de PCR en tiempo real (etapa uno más). El nivel de expresión de cada gen, normalizado con p-actina, se dividió por el nivel de expresión de cada gen en las células dendríticas inmaduras, determinando de esta manera los valores relativos
Como resultado, se pudo ver que, cuando las células dendríticas semimaduras se trataron con PGE2 durante 0-48 horas (particularmente 3-10 horas), las células dendríticas semimaduras mostraron un aumento de al menos 2 veces en la expresión del gen NR4A2 (NM_006186), un aumento de al menos 5 veces en la expresión del gen UBASH3B (NM_032873) y un aumento de al menos 3 veces en la expresión del gen PTGS2 (NM_000963), en comparación con las células dendríticas inmaduras, y en que aumentó la expresión del gen IDO (NM_002164) aproximadamente al menos 60 veces en un tiempo de tratamiento de 10 - 48 horas (Figura 2a).
Adicionalmente, se pudo ver que las células dendríticas semimaduras tratadas con 0,01 - 5 jg/ml de PGE2 mostraron un aumento de al menos 2 veces en expresión del gen NR4A2 (NM_006186), un aumento de al menos 5 veces en la expresión del gen UBASH3B (NM_032873), un aumento de al menos 4 veces en la expresión del gen PTGS2 (NM_000963) y un aumento de al menos 2 veces en expresión del gen IDO (NM_002164), en comparación con las células dendríticas inmaduras (Figura 2b).
Tabla 1
(continuación)
Ejemplo 5: Análisis de la secreción de IL-10 a partir de células dendríticas semimaduras
De acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3, se descongelaron células dendríticas semimaduras estimuladas durante 3-48 horas mediante la adición de 5 pg/ml de PGE2 (Sigma-Aldrich), y células dendríticas semimaduras estimuladas mediante la adición de 0,05, 005 y 5 pg/ml de PGE2 (Sigma-Aldrich) y luego se lavaron utilizando RPMI1640 (Lonza). Se cultivaron 2 x 105 células de la población celular por duplicado con un suero AB humano al 10 % (Lonza) que contenía RPMI1640 que contenía 10 ng/ml de TNFa, IL-6, IL-1p (Peprotech) o 200 unidades/ml de IFNy (LG) o que contenía 0.1 pg/ml de LPS (Sigma-Aldrich), 200 unidades/ml de IFNy (LG) o 1 pg/ml de CD40L (Peprotech), en una placa de 96 pocillos bajo las condiciones de 37 °C y CO2 durante 24 horas. Después de 24 horas, se recuperó el cultivo y se cuantificaron IL-12 e IL-10 en el cultivo utilizando un kit ELISA (BD Biosciences) de acuerdo con las directrices del fabricante.
Como resultado, se pudo ver que, cuando las células dendríticas semimaduras sensibilizadas con PGE2 se trataron con PGE2 durante 3-10 horas, aumentó la secreción de IL-10 de las células (Figura 3a). Adicionalmente, se pudo observar que, cuando se utilizó el antígeno propio (autoantígeno) PGE2 a una concentración de 0,05 - 5 pg/ml (que corresponde a P (0,05), P (0,5) y P (5)), aumentó la secreción de IL-10 de las células (Figura 3b).
Ejemplo 6: Transfección de ARNip para confirmar funciones de genes específicos
Para examinar la correlación entre la IL-10 secretada por las células dendríticas semimaduras sensibilizadas con un antígeno propio específico (autoantígeno) como se confirma en el Ejemplo 5 y la expresión de genes específicos como se confirma en el Ejemplo 4, el gen fue inactivado por transfección con ARNip para el gen, y luego se analizaron los cambios en la secreción de IL-10 de las células dendríticas semimaduras y la secreción de IFN-y de las células T. La transfección de ARNip en las células dendríticas semimaduras se realizó de la siguiente manera. Se dispensó una cierta cantidad de monocitos de sangre periférica humana en una placa de cultivo de plástico y se dejó reposar durante 30 minutos a 1 hora para que se adhirieran. Luego, se eliminaron las células flotantes y se cultivaron los monocitos adheridos al fondo en un CellGro (CellGenix) que contenía 20 ng/ml de IL-4 (JW CreaGene) y 30 ng/ml de GM-CSF (JW CreaGene) para 2 días, después de los cuales se recolectaron las células inmaduras flotantes. Las células dendríticas inmaduras suspendidas en el medio CellGro se suministraron a una densidad de 5 x 105 - 10 x 105 células/pocillo (placa de 6 pocillos). Se agregaron 10-100 pmol de ARNip para cada uno de NR4A2 (Invitrogen), UBASH3B, Ga PDH (control positivo) y un control negativo (N.C.), y 5 pl del transportador RNAiMAX (Invitrogen) a 100 pl de las células cultivadas que luego se dejaron caer cuidadosamente en cada pocillo y se cultivaron durante 24 - 36 horas. Después de 24 horas, las células se estimularon durante 4 horas con 5 -10 pg/ml de un antígeno propio específico (autoantígeno) (JW CreaGene), 10 ng/ml de TNFa (Peprotech) y 5 pg/ml de PGE2 (Sigma-Aldrich), y luego se congelaron. Las células dendríticas semimaduras producidas se descongelaron y luego se cultivaron en un suero AB humano al 10% (Lonza) que contenía RPMI1640 que contenía 10 ng/ml de TNFa, IL-6, IL-1p (Peprotech) y 200 unidades/ml de IFNy (LG) o que contenía 0,1 pg/ml de LPS (Sigma-Aldrich) o 1 pg/ml de CD40L (Peprotech). Se recolectó el cultivo y se cuantificó la IL-10 en el cultivo utilizando un kit ELISA (BD Biosciences).
Como resultado, se pudo ver que los genes específicos expresados en las células dendríticas semimaduras de la presente invención y la secreción de IL-10 de las células tenían una alta correlación (Figura 4). Particularmente, se pudo ver que el gen NR4A2 regulaba la secreción de IL-10 (Figura 5a) y el gen UBASH3B secretaba la secreción de IL-10 (Figura 5b).
Ejemplo 7: Análisis de la regulación de las células T por células dendríticas semimaduras
Las células T CD3 positivas con una pureza del 90 % o más se separaron de los monocitos de sangre periférica humana mediante el uso de una columna de lana de nailon, y se suspendieron en un suero AB humano al 10 % (Lonza) que contenía RPMI1640 (Lonza) y se suministraron en cada pocillo de una placa de 48 pocillos a una densidad de 1 x 106 células. Las células dendríticas semimaduras, producidas y congeladas por el procedimiento del Ejemplo 3, se descongelaron, se lavaron con RPMI1640, se suspendieron en el mismo medio, se suministraron en cada pocillo a una densidad de 1 x 105 células y se cultivaron bajo las condiciones de 37 °C y CO2. Después de 2 días, las células se estimularon con 50 ng/ml de PMA (Sigma-Aldrich), 500 ng/ml de ionomicina (Sigam-Aldrich) y 1 pl/ml de brefeldina A (Ebioscience) durante 4 horas, y se recolectó la población de células y se sometió a tinción FACS con anticuerpo CD3 antihumano (BD Biosciences) y anticuerpo CD4 antihumano (Ebioscience). Las muestras de FACS teñidas en la superficie se permeabilizaron utilizando un kit de fijación/permeabilización (BD Biosciences) y
se sometieron a tinción FACS de citocinas intracelulares para anticuerpo IFN-y antihumano. Utilizando las muestras de FACS resultantes, se analizó la secreción de citocinas en las células T utilizando un FACScalibur (BD). Para inducir células T reguladoras, se aislaron las células T de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, y se suspendieron en RPMI1640 (Gibco) que contenía FBS (Gibco), y se cultivaron con cada grupo de prueba durante 7 días bajo las condiciones de 37 °C y CO2. Después de 7 días, se recolectaron las células T de cada grupo de prueba y se tiñeron principalmente con FACS con anticuerpo CD4 antihumano y anticuerpo CD25. Las muestras de FACS teñidas en la superficie se permeabilizaron utilizando un kit de fijación/permeabilización (Ebioscience). Cada muestra se sometió a tinción FACS intranuclear para el anticuerpo Foxp3 antihumano, y luego se analizó la inducción (%) de células reguladoras en cada muestra utilizando un FACScalibur (BD).
Como resultado, se pudo ver que la tolerancia inmunitaria de las células T se logró mediante la IL-10 secretada a partir de las células dendríticas semimaduras producidas por el procedimiento de la presente invención (Figura 6). Adicionalmente, las células dendríticas semimaduras se administraron a pacientes con artritis reumatoide bajo las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 2, y luego se realizó un ensayo para controlar los cambios en las reactividades de IFN-y de las células T autorreactivas frente a los antígenos propios (autoantígenos) (monitorización de la respuesta inmunitaria). Se utilizaron antígenos de filagrina citrulinada (JW CreaGene), PAD4 (JW CreaGene), RA33 (Jw CreaGene) y vimentina (JW CreaGene) (10 pg/ml), y se analizó la mancha en cada pocillo con un lector ImmunoSPOT-ELISPOT (Cellular Tecnología).
Como resultado, se pudo ver que el tratamiento con las células dendríticas semimaduras de la presente invención inhibió la secreción de IFN-y de las células T en proporción al tiempo de tratamiento para aumentar las propiedades de tolerancia inmunológica tales como inducción de células T reguladoras (Figura 9).
Ejemplo 8: Administración de células dendríticas semimaduras y muestreo de sangre para la monitorización de la respuesta inmunitaria
Para células dendríticas inmaduras extraídas de los monocitos de sangre periférica de pacientes con artritis reumatoide, se agregaron 7 pg/ml de cada uno de los antígenos propios específicos (autoantígenos: JW CreaGene) seleccionados en el Ejemplo 1 o 2, 10 ng/ml de TNFa (Peprotech) y 5 pg/ml de PGE2 (Sigma-Aldrich) y las células se estimularon en por cada uno de los antígenos durante 4 horas. Después de la estimulación, las células dendríticas semimaduras resultantes se mezclaron en una relación de 1:1:1:1 y se congelaron a una concentración de 0,5 x 107 células/0,5 ml o 1,5 x 107 células/1,5 ml. Los frascos que contenían las células dendríticas semimaduras congeladas se descongelaron y las células se inyectaron por vía subcutánea en ambas regiones femorales de 12 pacientes con artritis reumatoide (divididos en dos grupos (grupo de dosis alta y grupo de dosis baja), cada uno de los cuales constaba de 6 personas)) en una cantidad de 5 x 106 células/0,5 ml o 1,5 x 107 células/1,5 ml. A continuación, a las 2, 4, 8 y 10 semanas, se administraron las células dendríticas semimaduras en la misma cantidad y manera que se describió anteriormente. Antes de la administración y 8 y 14 semanas después de la administración, se tomaron muestras de sangre de los pacientes con artritis reumatoide y se realizaron la evaluación de la eficacia y la monitorización de la respuesta inmunitaria.
Los resultados de la evaluación de la eficacia indicaron que las células dendríticas semimaduras de la presente invención, en las que se aumentó la secreción de IL-10 mediante la expresión del gen NR4A2 y/o UBASH3B, fueron eficaces para el tratamiento de la artritis reumatoide (Figuras 7a, 7b y 8).
Adicionalmente, los resultados de la monitorización de la respuesta inmunitaria indicaron que los autoanticuerpos contra antígenos de filagrina citrulinada, PAD4 (peptidil arginina deiminasa 4), RA33 (ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2) y vimentina disminuyeron significativamente, lo que sugiere que las células dendríticas semimaduras de la presente invención, sensibilizadas con los antígenos específicos, son eficaces para el tratamiento de la artritis reumatoide (Figuras 10 y 11).
Aplicabilidad industrial
Como se describió anteriormente, de acuerdo con la presente invención, se pueden producir células dendríticas semimaduras al tratar células dendríticas inmaduras humanas in vitro con un antígeno propio específico seleccionado (autoantígeno), una citocina y PGE2. Las células dendríticas semimaduras producidas muestran un aumento de al menos 2 veces en expresión de NR4A2 o proteína UBASH3B o un gen que codifica la proteína, en comparación con células dendríticas inmaduras, y por lo tanto muestran aumento de secreción de lL-10, lo que indica que las células dendríticas semimaduras tienen mayores propiedades de tolerancia inmunitaria.
<110> JW CREGENE INC.
<120> Procedimiento para preparar células dendríticas que aumentarán la expresión de genes específicos y composición para prevenir o tratar enfermedades autoinmunitarias que comprenden células dendríticas preparadas por los mismos
<130> PP-B1588
<150> KR 10-2014-0076405 <151> 2014-06-23
<160> 14
<170> KopatentIn 2,0
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<212>ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Cebador
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Claims (11)
1. Un procedimiento de generación de células dendríticas semimaduras en las que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o un gen que codifica la proteína NR4A2 y/o UBASH3B al menos 2 veces en comparación con células dendríticas inmaduras, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) tratar células dendríticas inmaduras in vitro con un antígelno propio (autoantígeno), una citocina y prostaglandina E2 (PGE2); y
(b) confirmar que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras al menos 2 veces en comparación con aquellas en las células dendríticas inmaduras, o confirmar que se aumenta adicionalmente la expresión de la proteína PTGS2 y/o IDO o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células dendríticas inmaduras se tratan con el antígeno propio (autoantígeno), la citocina, y PGE2 durante 3-10 horas.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el antígeno propio (autoantígeno) es uno o más seleccionados del grupo que consiste en a-enolasa, filagrina, PAD4 (peptidil arginina deiminasa 4), RA33 (ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2), fibrinógeno-a, fibrinógeno-p, colágeno II, histona B, agrecano, fibrina, factor reumatoide, GPI (glucosa-6-fosfato isomerasa), y péptidos y proteínas de vimentina, y péptidos y proteínas citrulinados de los mismos, o
en el que la citocina es TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa), preferentemente
en el que la concentración del PEG2 utilizado para tratar las células es 0,05 - 5 pg/ml.
4. Un procedimiento de medición de un nivel de expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o un gen que codifica la proteína en células dendríticas semimaduras, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) tratar células dendríticas inmaduras in vitro con un antígeno propio (autoantígeno), una citocina y PGE2 para producir células dendríticas semimaduras;
(b) medir el nivel de expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o el gen que codifica la proteína en las células dendríticas inmaduras;
(c) medir el nivel de expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o el gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras; y
(d) comparar los niveles de expresión de la proteína NR4A2 y/o proteína UBASH3B o el gen que codifica la proteína, medidos en la etapa (b) y etapa (c).
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que se mide adicionalmente la expresión de la proteína PTGS2 y/o proteína IDO o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras.
6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que las células dendríticas inmaduras se tratan con el antígeno propio (autoantígeno), la citocina, y PGE2 durante 3-10 horas.
7. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el antígeno propio (autoantígeno) es uno o más seleccionados del grupo que consiste en a-enolasa, filagrina, PAD4 (peptidil arginina deiminasa 4), RA33 (ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2), fibrinógeno-a, fibrinógeno-p, colágeno II, histona B, agrecano, fibrina, factor reumatoide, GPI (glucosa-6-fosfato isomerasa), y péptidos y proteínas de vimentina, y péptidos y proteínas citrulinados de los mismos, o
en el que la citocina es TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa), preferentemente
en el que una concentración del PEG2 utilizado para tratar las células es 0,05 - 5 pg/ml.
8. Un procedimiento de preparación de un agente terapéutico celular, conteniendo el agente terapéutico celular células dendríticas semimaduras, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) tratar células dendríticas inmaduras in vitro con un antígeno propio (autoantígeno), una citocina y PGE2 para producir células dendríticas semimaduras;
(b) confirmar que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras al menos 2 veces en comparación con la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o el gen que codifica la proteína en células dendríticas inmaduras; y;
(c) preparar un agente terapéutico celular que contiene las células dendríticas semimaduras en las que se aumenta la expresión de la proteína NR4A2 y/o UBASH3B o el gen que codifica la proteína al menos 2 veces.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que se aumenta adicionalmente la expresión de la proteína PTGS2 y/o IDO o un gen que codifica la proteína en las células dendríticas semimaduras.
10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que las células dendríticas inmaduras se tratan con el antígeno propio (autoantígeno), la citocina, y PGE2 durante 3-10 horas.
11. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el antígeno propio (autoantígeno) es uno o más seleccionados del grupo que consiste en a-enolasa, filagrina, PAD4 (peptidil arginina deiminasa 4), RA33 (ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2), fibrinógeno-a, fibrinógeno-p, colágeno II, histona B, agrecano, fibrina, factor reumatoide, GPI (glucosa-6-fosfato isomerasa), y péptidos y proteínas de vimentina, y péptidos y proteínas citrulinados de los mismos, o
en el que la citocina es TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa), preferentemente
en el que la concentración del PEG2 utilizado para tratar las células es 0,05 - 5 pg/ml.
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