KR20150146465A - 특정 유전자 발현이 증가된 수지상세포의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 수지상세포를 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

특정 유전자 발현이 증가된 수지상세포의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 수지상세포를 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자가면역질환, 특히 류마티스 관절염 치료를 위해 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell)를 자가항원(auto antigen)과 사이토카인 및 PGE2로 처리하여 미성숙 수지상세포에 비하여 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 2배 이상 증가된 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cell)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 상기 준성숙 수지상세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 세포치료제에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 준성숙 수지상세포 제조시 처리된 자가항원과 동일한 자가항원에 대한 반응성을 보유하는 류마티스 관절염 환자의 치료 효능을 높여 세포치료를 가능하게 한다.

Description

특정 유전자 발현이 증가된 수지상세포의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 수지상세포를 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 조성물 {Method for Preparing Dendritic Cell With Increased Expression of Specific Genes And Composition For Preventing Or Treating Autoimmune Diseases Comprising Semi-Mature Dendritic Cell Prepared By The Same}
본 발명은 자가면역질환, 특히 류마티스 관절염 치료를 위한 준성숙 수지상세포의 제조방법 및 상기 방법을 이용하여 제조된 수지상세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 치료 또는 예방용 조성물에 대한 것이다.
수지상세포는 1868년 랑겔한스(Langerhans)에 의해 피부에서 처음 발견되었으며 1973년 칸(Cohn)과 스테인만(Steinmann)에 의해 면역보조 세포로 기능이 알려지게 되었다. 그리고 1990년대에는 강력한 항원제시세포(professional antigen presenting cells; APC)로 기능이 밝혀지면서 면역유도 및 면역조절에서의 중요한 역할을 담당한다는 것을 알게 되었다. 인체 내의 수지상세포는 전체 순환 백혈구의 단지 약 0.3%를 차지할 뿐이지만 대식세포와는 구별되는 표현형을 지닌 이질적인 집단으로 구성되어 있다. 수지상세포는 비교적 약한 항원제시능력을 지닌 B세포나 대식세포와는 달리 강력한 항원제시세포라는 점에서 차별화된다. 수지상세포는 항원과 접한 적이 없는 원시 T세포(naive T cell)를 자극시킬 수 있는 일차면역반응(primary immune response) 유도 능력을 지니며, 또한 면역기억을 유도할 수 있는 특성을 갖는 유일한 면역세포이다. 수지상세포가 강력한 면역반응 활성화 기능을 할 수 있는 것은 항원제시세포(APC, Antigen Presenting Cell)로서 세포 표면에 MHC 분자(I/II)뿐만 아니라, 보조자극분자(co-stimulatory molecules) 예컨대, CD-80 및 CD-86와 부착 분자(adhesion molecule) 예컨대, ICAM-1들을 고농도로 발현하고 있으며, 여러 가지의 사이토카인(cytokine, IFN-alpha, IL-12, IL-18 등)을 분비하기 때문인 것으로 알려져 있다. 수지상세포는 세포 표면에 항원제시분자들(MHC 분자와 보조자극 분자들)을 많이 발현하고 있고, IFN-알파, IL-12 등 여러 가지 사이토카인을 분비하기 때문에 항원 특이 세포살해 T 세포의 생성, Th1 세포의 증식 및 활성화를 유도할 수 있다고 알려져 있다.
이와 같이, 수지상세포(dendritic cell)는 가장 강력한 항원 전달 세포(Antigen presenting cells)로서, 생체 내 극히 적은 수로 존재하지만 T세포 면역을 조절하는 기능이 매우 뛰어나기 때문에 특이 항원에 대한 면역을 유도하기 위한 임상 연구에서 암 또는 감염 질환의 치료제로서 연구되고 있다. 조직 또는 혈액으로부터 분리된 수지상세포를 in vitro에서 항원으로 자극시킨 후 성숙한 수지상세포 형태로 in vivo에 다시 주입하는 경우, 면역원성을 나타내는 것으로 확인되어, 암 또는 병원균의 특이 항원에 대한 면역을 유도하기 위한 세포 백신으로서 그 응용 가치가 매우 크다(Inaba, K. et al., 3. Exp. Med., 178:479, 1993; Inaba, K. et al., Int. Rev.Immunol., 6:197, 1990; Hsu, F. et al., Nature Med., 2:52, 1996). 수지상세포를 수득하고, 성숙화시키는 기술은 여러 문헌에 기재되어 있으며, 마이크로파아지 또는 수지상세포 특성 중 어느 하나를 발현할 능력을 가진 전분화능 세포로부터 유래한 미성숙 수지상세포로부터 성숙한 수지상세포를 생산하며, 미성숙 수지상세포를 IFN-α를 포함한 수지상세포 성숙화 인자와 접촉시키는 방법(유럽특허 제922,758호), 인간 CD34+ 조혈 세포를 (i)GM-CSF와 (ⅱ)TNF-α 및 IL-3와 또는 (ⅲ)GM-CSF 및TNF-α와 배양하여, CD1a+ 조혈 세포의 형성을 유도하고, 상기 배양물로부터 상기 CD1a+ 인간 수지상세포를 회수하는 방법(유럽특허 제663,930호), 말단 혈액세포를 분리하여, CD34 항원을 발현하는 혈액전구세포를 부유화시키고 상기 세포를 조혈 성장 인자 및 사이토카인의 조합물로 확장하는 방법(WO 95/28479) 등이 있다.
하지만 기존의 문헌 및 특허는 미성숙 수지상세포에 비특이적 항원을 감작시킨 성숙 수지상세포를 생산하는 방법에 관한 것일 뿐, 미성숙 수지상세포에 선별 과정을 거친 특정 자가항원을 감작시킨 준성숙 수지상세포의 생산 방법에 관해서는 언급하고 있지 않다.
이에, 본 발명자들은 항원 특이적 준성숙(semi-mature) 수지상세포가 면역관용적 반응을 유도한다는 사실에 기초하여, 류마티스 관절염 환자에게서 발현율이 높은 특정 자가항원을 선별한 다음, 이를 미성숙 수지상세포에 감작시키는 과정을 통해 제조된 준성숙 수지상세포가 특정 유전자의 발현을 높임으로써 준성숙 세포집단 제조시 처리된 자가항원과 동일한 자가항원에 대한 반응성을 보유한 류마티스 관절염 환자의 치료 효능을 높일 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 미성숙 수지상세포에 특정 자가항원을 처리하여 특정 유전자의 발현이 증가된 준성숙 수지상세포의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 준성숙 수지상세포를 포함하는 세포치료제를 제공하여 상기 자가항원과 동일한 자가항원에 대한 반응성을 보유하고 있는 자가면역질환의 치료율을 높인, 세포치료제 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 특정 자가항원 처리에 의해 발현이 특이적으로 증가하는 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미성숙 수지상세포를 자가항원(auto antigen)과 사이토카인 및 PGE2(Prostaglandin E2)로 처리하는 단계를 포함하는, 미성숙 수지상세포에 비해 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 2배 이상 증가된 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cell)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 준성숙 수지상세포를 유효성분으로 포함하는, 상기 준성숙 수지상세포 제조시 처리된 자가항원과 동일한 자가항원에 대한 반응성을 보유하는 자가면역질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell)를 자가항원(auto antigen)과 사이토카인 및 PGE2(Prostaglandin E2)로 처리하여 준성숙 수지상세포를 제조하는 단계;
(b) 상기 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 미성숙 수지상세포의 NR4A2 또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 비해 2배 이상 증가된 것을 확인하는 단계; 및
(c) 상기 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 2배 이상 증가된 준성숙 수지상세포를 함유하는 세포치료제를 제형화하는 단계;를 포함하는 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cell)를 함유한 자가면역질환 치료 또는 예방용 세포치료제의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 미성숙 수지상세포를 자가항원과 싸이토카인 및 PGE2로 처리하여 준성숙 수지상세포를 제조하는 단계;
(b) 미성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계;
(c) 상기 제조된 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 (b)단계 및 (c)단계에서 측정된 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 비교하는 단계;를 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B의 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 인간에게서 유래한 미성숙 수지상세포를 선별된 특정 자가항원과 사이토카인 및 PGE2로 처리하여, 미성숙 수지상세포에 비해 NR4A2 또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 2배 이상 증가되어 IL-10 분비가 증가되고, 이로 인하여 면역관용성질이 증가된 준성숙 수지상세포를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 준성숙 수지상세포를 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 세포치료제는 준성숙 수지상세포를 제조하는 과정에서 처리된 특정 자가항원과 동일한 자가항원에 대한 반응성을 보이는 환자에게 투여시, 기존의 자가면역질환 치료법에 비해 뛰어난 효과를 나타내기 때문에, 환자 개개인의 특성을 고려한 세포치료를 가능하게 하는 효과가 있다.
도 1a는 준성숙 수지상세포에 감작시키기 위한 특정 자가항원을 선별하기 위해 정상인과 류마티스 관절염 환자의 혈액을 이용하여 자가항원에 대한 T cell 반응성 (IFN-γ)을 확인한 실험결과이다.
도 1b는 준성숙 수지상세포에 감작시키기 위한 특정 자가항원을 선별하기 위해 정상인과 류마티스 관절염 환자의 혈액을 이용하여 자가항원에 대한 자가항체 반응성을 확인한 실험결과이다.
도 2a는 TNF-α + PGE2 처리시간에 따른 특정 유전자의 발현률을 보여주는 실험결과이다.
도 2b는 PGE2 처리 농도별 특정 유전자의 발현률을 보여주는 실험결과이다.
도 3a는 TNF-α + PGE2 처리시간에 따른 IL-10 분비량을 보여주는 실험결과이다.
도 3b는 PGE2 처리 농도에 따른 IL-10 분비량을 보여주는 실험결과이다.
도 4는 특정 유전자 발현과 IL-10 분비와의 상관관계를 보여주는 실험결과이다.
도 5a는 본 발명의 제조과정에 의한 준성숙 수지상세포가 발현하는 NR4A2 유전자가 IL-10 분비를 조절하는 것을 보여주는 실험결과이다.
도 5b는 본 발명의 제조과정에 의한 준성숙 수지상세포가 발현하는 UBASH3B 유전자가 IL-10 분비를 조절하는 것을 보여주는 실험결과이다.
도 6a는 본 발명의 제조과정에 의한 준성숙 수지상세포가 IL-10 분비를 매개로 T cell의 면역관용을 유도하는 것을 보여주는 실험결과로, 여러 가지 자극 조건에 따른 준성숙 수지상세포의 IL-10 분비량을 보여주는 실험결과이다.
도 6b는 IL-10을 매개로 한 준성숙 수지상세포의 T-IFNγ 분비억제를 보여주는 실험 결과이다.
도 6c는 IL-10을 매개로 한 준성숙 수지상세포의 regulatory T cell 유도를 보여주는 실험 결과이다.
도 7a 는 본 발명의 제조과정에 의해 생산되어 특정 유전자의 발현과 IL-10 분비가 높아진 준성숙 수지상세포의 유전자 발현에 따른 류마티스 관절염 치료의 유효성 결과를 보여주는 실험결과이다.
도 7b 는 본 발현의 제조과정에 의해 생산된 준성숙 수지상세포에 의한 류마티스 관절염 치료의 유효성 결과에 따른 특정 유전자의 발현과 IL-10의 분비 결과를 보여주는 실험결과이다.
도 8은 준성숙 수지상세포를 12명의 환자에게 용량별 5회씩 투여한 환자들에 대한 14주와 24주 기간 동안의 임상적 유효성을 보여주는 결과이다 (NA: 부종관 점수가 baseline 시점 0개로 ACR 평가가 불가능한 환자를 나타냄).
도 9a는 준성숙 수지상세포를 투여한 환자의 T cell 반응성(IFN-γ) 변화를 ELISPOT assay로 측정하여 보여주는 실험결과이다.
도 9b는 준성숙 수지상세포를 투여한 환자의 T cell 반응성(IFN-γ) 변화를 IFN-γ Intracellular staining assay로 측정하여 보여주는 실험결과이다.
도 10은 12명의 환자에게 준성숙 수지상세포를 투약한 후 14주가 경과한 후 특정 자가항체의 감소 변화(시투룰린화 필라그린, PAD4, RA33, 비멘틴)를 보여주는 실험결과이다.도 11은 특정 자가항원을 1종 이상 보유한 9명의 환자에게 준성숙 수지상세포을 투약한 다음, 14주가 경과한 시점에서 측정한 시간에 따른 자가 항체(시투룰린화 필라그린, PAD4, RA33, 비멘틴)의 감소를 나타내는 실험결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell )를 자가항원(auto antigen)과 사이토카인 및 PGE2(Prostaglandin E2)로 처리하는 단계를 포함하는, 미성숙 수지상세포에 비해 NR4A2 또는 UBASH3B 유전자 발현이 2배 이상 증가된 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cell)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 정상인 또는 류마티스 관절염 환자의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood monocyte, PBMC)를 분화시켜 제조한 미성숙 수지상세포에, 선별된 특정 자가항원(auto antigen)과 사이토카인 및 PGE2(Prostaglandin E2)를 처리하는 단계를 포함하는 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cell)를 제조하였다.
본 명세서에서 용어 "수지상세포(dendritic cell)"는 수지상세포 집단(population)을 포함하는 의미로, 항원을 세포내부로 흡수하고 이를 처리하여 항원 또는 항원으로부터 유래된 펩타이드를 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 I 복합체 또는 MHC클래스 Ⅱ 복합체와 함께 제시하는 전문적 항원 제시 세포(professional antigen presenting cell)를 의미한다. 본 발명에서의 수지상세포는 Steinman et al., Annual Rev. Immunol. 9:271-296, 1991 및 Banchereau and Steinman Nature 392:245-252, 1998.에 개시된 수지상세포의 전형적인 표현형과 특성을 갖는 세포를 의미한다. 수지상세포는 면역성(immunogenic) 및 면역관용성(tolerogenic) 항원 제시 세포를 모두 포함하며, 성숙도에 따라 미성숙 수지상세포(immature dendritic cells; "imDC"), 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cells; "smDC") 및 성숙 수지상세포(mature dendritic cells; "mDC")로 분류한다.
본 명세서에서 용어 "미성숙 수지상세포"는 성숙 수지상세포와 마찬가지로 CD14와 같은 세포 표면 마커를 발현하지 않으며, CCR7 및 세포질 단백질 DC-LAMP을 낮은 수준으로 발현하고, 공동 자극 분자 CD40, CD80및 CD86을 낮은 수준으로 발현하며, CD1a 및 CCR1, CCR2, CCR5 및 CXCR1을 통상적 수준으로 발현하는 수지상세포를 말한다.
본 명세서에서 용어 "성숙 수지상세포"는 미성숙 수지상세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미한다. 성숙 수지상세포는 DC-LAMP 뿐만 아니라 MHC 클래스 II, CD40, CD80, CD83 및 CD86의 증가된 발현을 나타내며, 친염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 방출하며, 혼합림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)에서 원시 동종이계 T 세포(allogeneic T cells) 및 동종동계 T 세포(syngeneic T cells)의 증식의 증가 및/또는 수지상세포 사이토카인의 증가된 생성을 발생시키는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 성숙 수지상세포는 전형적으로 CCR7 및 CXCR4을 높은 수준으로 발현한다.
본 명세서에서 용어 "준성숙 수지상세포"는 미성숙 수지상세포의 특성의 일부를 상실하고, 성숙 수지상세포의 표현형의 일부 특성을 갖는 수지상세포로서, 부분적으로(partially) 또는 불완전하게(incompletely) 성숙된 형태 및 표현형적 특성을 나타내는 수지상세포를 의미한다. 준성숙 수지상세포는 일반적으로 자가-항원(self-antigen)에 대응하여 면역관용 반응을 유도하는 능력을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 정상인 또는 류마티스 관절염 환자로부터 단핵구 세포를 얻은 다음, 이 세포를 적합한 지지체(substrate)에서 배지(바람직하게는, GM-CSF로 보충된 배지)를 이용하여 일차 배양(primary culture)한다. 전능성 세포 또는 다능성 세포로부터 미성숙 수지상세포로의 분화를 촉진하는 물질, 특히 GM-CSF는 미국특허 제5,851,756호 및 제5,994,126호에 개시되어 있으며, 이들 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상기 기판은 바람직하게는 세포가 부착할 수 있는 기판을 포함하며, 바람직하게는 조직 배양에 사용되는 플라스틱이다.
미성숙 수지상세포의 수율을 증가시키기 위해, GM-CSF 이외에, 비-수지상세포 타입의 세포 증식을 막거나 억제하는 인자들을 배양배지에 첨가할 수 있다. 상기 인자들은, 예를 들어 대식세포를 억제하는 IL-4 및/또는 IL-13을 포함한다. 상기 인자들은 수지상세포 전구세포들의 증식을 촉진하는 반면 비-수지상세포 타입의 세포의 성장을 억제함으로써 배지에서 미성숙 수지상세포의 수를 증가시킨다.
본 발명에서 자가항원은 예를 들어, α-에놀라제(α-enolase), 필라그린(filaggrin), PAD4(peptidyl arginine deiminase 4), RA33(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2), 피브리노겐 α, 피브리노겐 β, 콜라겐 II, 히스톤 B, 아그레칸, 피브린, 류마토이드 팩터(rheumatoid factor), GPI(glucose-6-phosphate isomerase), 및 비멘틴(Vimentin) 펩타이드　및 단백질, 및 이의 시투룰린화 펩타이드　및 단백질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 ELISPOT 반응이 유효한 류마티스 관절염 환자(9명) 또는 정상인(2명)에게서 추출한 말초혈액단핵구에 시트룰린된 필라그린(JW크레아젠), PAD4(JW크레아젠), RA33(JW크레아젠), 비멘틴(JW크레아젠), 피브리노젠(Sigma-Aldrich), 피브린(Sigma-Aldrich), IgGFc(Cell science)의 7항원을 감작시켜 autoreactive T cell 반응율이 50%이상인 것을 선별하는 방법으로 특정 자가항원을 스크리닝하였다. 또한 류마티스 관절염 한국인 환자 100명을 대상으로 시트룰린되거나 되지 않은 필라그린(JW크레아젠), PAD4(JW크레아젠), RA33(JW크레아젠), 비멘틴(JW크레아젠), 피브리노젠(Sigma-Aldrich), 피브린(Sigma-Aldrich), IgG Fc(Cell science), GPI(JW크레아젠), 콜라겐(Genway)의 9종의 자가항체를 스크리닝하여 정상인의 OD값의 1.5배 이상을 보이는 경우를 양성으로 하여 항원-항체 반응률을 측정하는 방법으로 특정 자가항원을 스크리닝하였다.
그 결과, 항원-항체반응률이 30% 이상이고(도 1a), IFN-γ를 분비하는 말초혈액단핵세포의 반응률이 50% 이상인(도 1b) 자가항원은 시투룰린화 필라그린(citrullinated filaggrin), PAD4(peptidyl arginine deiminase 4), RA33(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2) 및 비멘틴(Vimentin)인 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명에서 있어서, 미성숙 수지상세포에 처리되는 특정 자가항원은 시투룰린화 필라그린(citrullinated filaggrin), PAD4(peptidyl arginine deiminase 4), RA33(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2) 및 비멘틴(Vimentin)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법일 수 있다.
본 발명의 자가항원 특이적 준성숙 수지상세포는 상기 특정 항원이 준성숙 수지상세포에 의해 세포 표면으로부터 제시(presenting)되기에 충분한 시간 및 조건 하에서 서로 "접촉"시킴으로써 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 "접촉"은 "공동 배양(co-culture)" 이다.
상기 공동배양시간은 바람직하게는 3 내지 10 시간이며 더욱 바람직하게는 3 내지 8시간이며 가장 바람직하게는 3 내지 4시간이다. 상기 PGE2의 처리농도는 바람직하게는 0.01~5μg/mL이고 가장 바람직하게는 0.5μg/mL~5μg/mL이다. 상기 사이토카인은 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)인 것을 특징으로 하며 처리 농도는 1~20 ng/ml, 바람직하게는 5~15 ng/ml이다.
본 발명의 준성숙 수지상세포는 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 증가됨을 확인하였다. 경우에 따라서, 본 발명의 준성숙 수지상세포에서 PTGS2 및/또는 IDO 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 추가로 증가될 수 있으며, 증가되는 경우 미성숙 수지상세포에 비해 2배 이상 증가될 수 있다.
NR4A2 단백질은 전사인자(transcription factor)로서 Foxp3의 프로모터와 인헨서에 결합하여 다른 전사인자들과 함께 작용하고, 이를 통해 CD4+ T의 Treg 분화를 유도하며, 항염증 반응까지 유도할 수 있다. 또한, 도파민신경세포(dopaminergic neuron)가 염증 환경에 의해 손상되어 파킨슨병이 유발되는데, glia와 astocyte의 NR4A2발현 조절에 의해 TNF-α, IL-1β, NO, ROS의 분비가 억제되면서 신경세포 보호 효과가 유발될 수 있다.
UBASH3B 단백질은 C-terminal에 PGM-like domain을 가지는데, 이는 PGM/AcP 효소와 진화적으로 유사하며, 기능적으로도 인산화효소 활성을 가진다. 이러한 UBASH3B 단백질은 T cell의 활성화된 Src tyrosine kinase(phosphorylation됨)를 탈인산화시키고 결국 T cell을 negative regulation 할 수 있다.
PTGS2 단백질을 발현하는 MLN-DC는 Th2 분화를 방해하고, Treg 의 발달에 중요한 역할을 하며, DC에 IV IG를 처리했을 때 DC의 PGE2 분비가 증가하고, Cox2 발현이 증가하면서 Treg도 함께 증가, EAE score를 감소시킬 수 있다.
IDO 단백질은 Indoleamine 2,3-dioxygenase의 기능을 수행하는 효소로서, 필수 아미노산인 L-트립토판의 분해에 관여한다.
본 발명에 있어서, NR4A2 유전자 (NM_006186: 서열번호 11), UBASH3B 유전자 (NM_032873: 서열번호 12), PTGS2 유전자 (NM_000963: 서열번호 13) 및 IDO 유전자 (NM_002164: 서열번호 14)는 각각 NR4A2 단백질, UBASH3B 단백질, PTGS2 단백질 및 IDO 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다.
상기 단백질의 발현은 예를 들어, 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법 또는 FACS 등을 통해 측정될 수 있으며, 상기 유전자 발현은 PCR, Real-time PCR 또는 RT PCR 등을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 준성숙 수지상세포에서 발현되는 특정 유전자를 real time PCR로 측정한 결과, PGE2의 처리농도가 0.01~5μg/mL일 경우, NR4A2 및/또는 UBASH3B 유전자의 발현이 미성숙 수지상세포에 비해 2배 이상 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 준성숙 수지상세포는 PTGS2 및/또는 IDO 유전자 발현이 추가로 증가, 예를 들어 2배 이상 증가함을 확인할 수 있었다. 구체적으로 살펴보면, 본 발명의 준성숙 수지상세포는 미성숙 수지상세포에 비해, NR4A2 유전자의 발현은 2배 이상, UBASH3B 유전자의 발현은 5배 이상, PTGS2 유전자의 발현은 4배 이상, IDO 유전자의 발현은 2배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 2).
한편, 본 발명의 준성숙 수지상세포의 특징을 확인하고, 기존 치료제에 비해 본 발명이 류마티스 관절염 환자에게 뛰어난 치료 효능을 갖는 원인을 규명하기 위해서는 본 발명에 특징적으로 증가되어 있는 특정 유전자의 발현량을 측정하는 것이 중요하다고 할 것이다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 미성숙 수지상세포를 자가항원과 싸이토카인 및 PGE2로 처리하여 준성숙 수지상세포를 제조하는 단계; (b) 미성숙 수지상세포 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계; (c) 상기 제조된 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 (b)단계 및 (c)단계에서 측정된 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 비교하는 단계;를 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B의 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 단백질 및 유전자의 발현 정도를 측정하는 방법은 통상의 방법을 사용할 수 있으며, 이의 구체적인 예는 앞서 언급한 바와 같다. 본 발명에서 단백질 및 유전자의 발현 정도를 측정하는 방법은 예를 들어, 특정 유전자는 서열번호 1~10으로 표시되는 primer를 사용하여 증폭한 다음, real time PCR로 측정할 수 있으며 β-actin으로 normalization된 상기 특정 유전자들의 발현을 미성숙 수지상세포의 발현기준으로 나눈 상대적 값으로 분석하는 과정을 통해 수행된다. β-actin은 세포의 골격을 이루는 cytoskeleton의 주된 구성요소로서 대부분의 세포에서 고르게 발현하고 그 성격상 외부조건에 잘 변하지 않고 일정 정도의 높은 발현값을 보인다. 이러한 유전자들을 house keeping gene이라고 하는데 특정 유전자의 발현의 차이를 비교하고자 할 때 기준값으로 사용된다. β-actin 발현 정도를 기준값으로 하여 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 유전자의 발현 정도를 측정하고 이를 대조군인 미성숙 수지상세포 전체의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 유전자의 발현량으로 나눈값을 측정한 결과, PGE2의 처리농도가 0.05~5μg/mL인 경우에 미성숙 수지상세포에 비해, NR4A2 및/또는 UBASH3B 유전자의 발현이 각각 2배 이상 및 5배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명은 PTGS2 및/또는 IDO 유전자의 발현을 추가로 측정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 처리되는 PGE2의 농도는 0.05~5μg/ml이고 미성숙 수지상세포에 처리되는 상기 PGE2 및 자가항원과 사이토카인의 처리시간은 3~10시간인 것을 특징으로 하며, 상기 자가 항원은 시투룰린화 필라그린(citrullinated filaggrin), PAD4(peptidyl arginine deiminase 4), RA33(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2) 및 비멘틴(Vimentin)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 사이토카인은 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 질병 또는 질환은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 즉 본 발명의 준성숙 수지상세포를 포함하는 조성물에 의해 치료가 가능한 자가면역질환은 생체 내에서의 자가면역 반응에 의해 유발되는 모든 질병 또는 질환을 포함한다. 예를 들어, 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 셀리악 병(Celiac disease-sprue), IgA 결핍(IgA deficiency), 크론병(Crohn's disease), 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 다발성 근염, 만성 활동성간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 및 고밀도 침착병 등이 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 임상적 효과를 확인하기 위하여 특정 자가항원에 감작된 준성숙 수지상세포를 활동성 류마티스 관절염 환자 12명에게 투여하였다. 6명씩 두 그룹으로 나눈 다음, 각각 5 x106 cells/0.5 mL, 1.5x107 cells/1.5 mL의 농도로 각각 피하 주사하였다. 처음 4주까지는 2주 간격으로 총 3회를 투여하고 4주의 휴약기를 갖은 다음, 2주 간격으로 총 2회를 투여하여 총 10주간 투약하였다. 투여 전과 투여 후 8주, 14주과 경과한 시점에서 상기 류마티스 관절염 환자의 혈액을 채혈하여 자가 항체와 T cell 반응성을 측정하였다.
그 결과, 특정 자가항원(시투룰린화 필라그린, PAD4, RA33, 비멘틴)에 대한 자가 항체가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 10, 도 11).
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 준성숙 수지상세포를 유효성분으로 포함하는, 상기 준성숙 수지상세포 제조시 처리된 자가항원과 동일한 자가항원에 대한 반응성을 보유하고 있는 자가면역질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명에서 상기 '세포치료제'란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 "줄기세포 치료제"이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 "면역세포 치료제"이다.
본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. '치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)'은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 류마티스 관절염 환자 12명에게 본 발명의 준성숙 수지상세포를 각각 5 x106 cells/ 0.5 mL, 1.5X07 cell/1.5 mL 씩 투여한 결과, 특정 항원에 대한 반응성을 가진 환자에게 투여시 자가항체를 감소시키는 작용을 하여 치료효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 10, 도 11). 따라서 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 설정해보면 본 발명의 세포치료제에는 5 x106 ~ 1.5x107 cell/mL의 세포가 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1.5x107 cells/ml의 세포가 포함될 수 있다.
본 발명의 준성숙 수지상세포의 치료효과와 발현되는 특정 유전자 간의 상관관계를 확인하고, 관련 기전을 규명하기 위해 상기 수지상세포의 IL-10 분비 여부 및 특정 유전자의 기능을 확인해보았다. IL-10은 Th2, 조절 T세포, 수지상세포 등에서 분비되는 사이토카인으로 자기 조직을 공격하는 면역 세포를 억제시켜 면역관용을 유도하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라 IL-10을 ELISA kit로 정량한 결과, 본 발명의 준성숙 수지상세포가 PGE2 처리 시간 및 농도에 따라 IL-10을 분비하는 것을 확인할 수 있었다(도 4). 본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 IL-10의 분비가 특정 유전자, 특히 NR4A2 및/또는 UBASH3B 유전자에 의한 것임을 각각의 유전자에 대한 siRNA를 10~100 pmol (10, 50 100 pmol)의 농도로 transfection한 대조군과 비교를 통해 확인할 수 있었다(도 5). 또한, NR4A2 및/또는 UBASH3B 유전자의 발현에 의해 IL-10의 분비가 높아진 본 발명에 따른 준성숙 수지상세포가 유효하게 류마티스 관절염 치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 7a, 7b 및 8). 더욱이, 본 발명의 준성숙 수지상세포가 IL-10를 매개로 하여 T cell의 면역관용을 유도한다는 것을 또 다른 실시예를 통해 확인하였다(도 6, 도 9).
따라서 본 발명은, IL-10 분비를 증가시키고 T cell로부터 IFN -γ의 분비를 감소시키며, 자가항체 생성을 감소시키는 작용을 하는 것을 특징으로 하는 자가면역질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다.
한편, 본 발명의 준성숙 수지상세포는 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있음은 당업자에게 있어 자명한 사실이다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 (a) 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell)를 자가항원(auto antigen)과 사이토카인 및 PGE2(Prostaglandin E2)로 처리하여 준성숙 수지상세포를 제조하는 단계; (b) 상기 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 미성숙 수지상세포의 NR4A2 또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 비해 2배 이상 증가된 것을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 2배 이상 증가된 준성숙 수지상세포를 함유하는 세포치료제를 제형화하는 단계;를 포함하는 준성숙 수지상세포를 함유한 자가면역질환 치료 또는 예방용 세포치료제의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 수지상세포는 PTGS2 또는 IDO 유전자 발현이 추가로 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 증가되는 경우 미성숙 수지상세포에 비해 2배 이상 증가될 수 있다.
본 발명에서 발현되는 특정 유전자는 서열번호 1~10으로 표시되는 primer를 사용하여 증폭한 다음, real time PCR로 측정할 수 있으며 β-actin으로 normalization된 상기 특정 유전자들의 발현을 미성숙 수지상세포의 발현기준으로 나눈 상대적 값으로 분석하는 과정을 통해 수행된다. 구체적으로 설명하자면, 외부조건에 잘 변하지 않고 일정 정도의 높은 발현값을 보이는 house keeping gene 중의 한 종류인 β-actin 발현 정도를 기준값으로 하여 준성숙 수지상세포의 NR4A2 또는 UBASH3B 유전자의 발현 정도를 측정하고 이를 대조군인 미성숙 수지상세포 전체의 NR4A2 또는 UBASH3B 유전자의 발현량으로 나눈값을 측정한다. 그 결과, PGE2의 처리농도가 0.05~5μg/mL인 경우에 미성숙 수지상세포에 비해, NR4A2 및 UBASH3B 유전자의 발현이 각각 2배 이상 및 5배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 방법으로 측정시, PGE2의 처리농도가 0.05~5μg/mL인 경우, 미성숙 수지상세포에 비해, PTGS2 및 IDO 유전자의 발현은 각각 4배 이상 및 2배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 세포치료제를 제형하기 위해 필요로 하는 약학적으로 허용되는 약제학적 담체란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 자가면역질환 치료 또는 예방용 세포치료제를 제조하는 과정에서 자가 항원과 사이토카인 및 PGE2의 처리시간은 3~10 시간인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 자가 항원은 예를 들어, α-에놀라제(α-enolase), 필라그린(filaggrin), PAD4(peptidyl arginine deiminase 4), RA33(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2), 피브리노겐 α, 피브리노겐 β, 콜라겐 II, 히스톤 B, 아그레칸, 피브린, 류마토이드 팩터(rheumatoid factor), GPI(glucose-6-phosphate isomerase), 및 비멘틴(Vimentin) 펩타이드　및 단백질, 및 이의 시투룰린화 펩타이드　및 단백질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 사이토카인은 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1: 자가항체 확인을 통한 항원스크리닝 또는 면역반응모니터링
정상인과 비교하여 RA 환자에서 높게 존재하는 혈장 내 자가항체를 탐색하거나 준성숙 수지상세포를 RA 환자에 투여한 후 자가혈장의 변화를 확인(면역반응모니터링)하기 위해 다음과 같은 assay를 수행하였다. 준성숙 수지상세포를 류마티스 관절염 환자에 투여한 후 자가혈장의 변화를 확인(면역반응모니터링)하기 위해 다음과 같은 assay를 수행하였다. 시트룰린되거나 되지 않은 필라그린(JW크레아젠), PAD4(JW크레아젠), RA33(JW크레아젠), 비멘틴(JW크레아젠), 피브리노겐(Sigma-Aldrich), 피브린(Sigma-Aldrich), IgG Fc(Cell science), GPI(JW크레아젠), 콜라겐(Genway) 등 총 9종류의 항원을 각각 1 μg/mL씩 96 웰 플레이트에 분주한 다음, 24시간이 경과하면 0.05% PBS-T로 세척 후 1% BSA가 포함된 PBS로 해당 플레이트를 1시간 동안 blocking하였다. 1시간 후, 류마티스 관절염 환자 100명과 정상인 14명의 혈장을 각각 1:10 또는 1:50으로 희석하고 50μL씩 duplicate로 분주하여 2시간동안 상온에 반응시켰다. 2시간 후 플레이트를 0.05% PBS-T로 세척하고 1:2000비율로 AP-conjμgation된 항human IgG 항체(Sigma-Aldrich)를 1% BSA가 포함된 PBS에 첨가하여 이를 50μL씩 각 플레이트 웰에 분주하였다. 1시간 후 플레이트를 0.05% PBS-T로 세척하고 1μg/mL-p-Nitrophenyl phosphate(Sigma-Aldrich)를 100μL씩 플레이트 웰에 분주하였다. 발색이 진행되면 50μL씩 0.2M 수산화나트륨을 각 플레이트 웰에 분주하여 반응을 종료하였고 각 웰의 405nm에 대한 흡광도를 ELISA reader를 통해 확인하였다.
그 결과, 시트룰린화 필라그린, PAD4, RA33, 비멘틴의 항원-항체 반응률이 30% 이상임을 확인할 수 있었다(도 1b). 항원-항체반응률이란 100명의 류마티스 관절염 환자 중 <정상인 평균흡광도 x 1.5> 이상의 값을 갖는 환자의 %를 의미한다.
실시예 2: IFNγ ELISPOT을 통한 항원스크리닝 또는 면역반응모니터링
자가항원 중 정상인에 비하여 RA 환자의 혈액 내 autoreactive T cell 의 IFNγ 반응을 높이는 항원을 탐색하거나, 준성숙 수지상세포를 류마티스 관절염 환자에 투여한 후 자가항원에 대한 autoreactive T cell의 IFN-γ 반응성 변화(면역반응모니터링)를 확인하기 위한 assay를 수행하였다. IFNγ-ELISPOT(BD bioscience) assay는 실험방법 가이드라인에 따라 수행하였다. 100μL capture 항체를 각 ELSISPOT 96 웰 플레이트에 분주하고 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 플레이트를 10% FBS가 포함된 PBS로 2시간 동안 blocking 하였다. blocking이 끝난 다음, 류마티스 관절염 환자(9명) 또는 정상인(2명)에게서 추출한 말초혈액단핵구(peripheral blood monocyte, PBMC) 2x105 cell에 시트룰린된 필라그린(JW크레아젠), PAD4(JW크레아젠), RA33(JW크레아젠), 비멘틴(JW크레아젠), 피브리노겐(Sigma-Aldrich), 피브린(Sigma-Aldrich), IgGFc(Cell science) 총 7종류의 항원을 각각 10 μg/mL 첨가한 다음, 10% 인간 AB serum을 포함한 RPMI1640으로 현탁하여 웰에 duplicate로 분주하였다. 37℃ CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 다음, 0.05% PBS-T로 세척하고 biotinylation된 detection 항체를 각 웰에 100μL씩 분주하여 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 2시간 후 0.05% PBS-T로 세척하고 1:100으로 희석된 HRP-conjugation된 avidin을 100μL씩 각 웰에 분주하고 1시간 동안 상온에 반응시켰다. 1시간 후 PBS로 세척하고 AEC substrate(BD Biosciences)를 100μL씩 각 웰에 분주하여 발색을 확인하고 상기 자가항원을 처리하지 않은 대조군의 발색 정도와 비교하였다. 각 웰의 spot은 ImmunoSPOT-ELISPOT reader(Cellular Technology)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, IFN-γ를 분비하는 말초혈액단핵세포의 반응률이 50% 이상인 항원은 시트룰린화 필라그린, PAD4, RA33, 비멘틴임을 확인할 수 있었다(도 1a). IFN-γ 반응은 9명의 RA 환자 중 <정상인 평균흡광도 x 1.5> 이상의 값을 갖는 환자의 %를 의미한다.
실시예 1과 실시예 2의 결과를 종합적으로 고려하여 항원-항체반응률이 30% 이상이고, IFN-γ를 분비하는 말초혈액단핵세포의 반응률이 50% 이상인 항원인 시트룰린화 필라그린, PAD4, RA33, 비멘틴을 준성숙 수지상세포에 감작시킬 특정 자가항원으로 선별하였다.
실시예 3: 준성숙 수지상세포의 제조
정상인 또는 류마티스 관절염 환자에게 추출한 말초혈액단핵세포를 플라스틱 배양용기에 일정량 분주하고 30분 ~ 1시간 배양한 다음, 부유세포는 제거하고 바닥에 붙은 단핵구를 20ng/mL의 IL-4(JW크레아젠)와 30ng/mL의 GM-CSF(JW크레아젠)가 포함된 CellGro(CellGenix) 배지에서 3일 동안 37℃, CO2 배양 후, 부유하는 미성숙 수지상세포를 수거하였다(이 중 일부 미성숙 수지상세포는 특이유전자 발현 확인시험을 위한 대조군으로 사용). 수거된 미성숙 수지상세포는 상기 CellGro 배지로 현탁하고 새로운 플레이트에 일정량 재분주한 후 실시예 1 및 2에서 선별된 자가항원(JW크레아젠)을 각각 5~10μg, TNFα(Peprotech)를 10ng/mL, PGE2(Sigma-Aldrich)를 0.05~5μg/mL 첨가하여 3~10시간동안 자극하였다. 자극이 끝난 준성숙 수지상세포는 동결액, 5% DMSO(Sigma -Aldrich)와 5% 포도당(녹십자)이 포함된 인간혈장알부민(JW pharm.)으로 동결하였다.
실시예 4: 준성숙 수지상세포의 특정 유전자 발현확인
실시예 3에서 얻어진 특정 자가항원으로 감작된 준성숙 수지상세포를 해동하여 RPMI1640(Lonza)으로 세척한 다음, RNeasy mini kit(Qiagen)를 이용하여 mRNA를 분리하고 정량한 후 high capacity RNA to cDNA kit(AB)의 방법에 따라 각각의 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 power SYBR green(AB)을 이용하여 서열번호 1~10의 primer와 혼합한 다음, real time PCR(step one plus)을 수행하였고, β-actin으로 normalization된 각 유전자들의 발현을 미성숙 수지상세포의 발현기준으로 나눈 상대적 값으로 분석하였다.
그 결과, PGE2를 0~48h 처리하였는데, 특히 3~10h 처리시 준성숙 수지상세포는 미성숙 수지상세포에 비해 NR4A2 유전자(NM_006186)의 발현이 2배 이상, UBASH3B 유전자(NM_032873)의 발현이 5배 이상, PTGS2 유전자(NM_000963)의 발현이 3배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었으며, IDO 유전자(NM_002164)는 10~48h 처리 시간에서 발현이 약 60배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 2a).
또한, PGE2를 0.01~5μg/mL 처리한 준성숙 수지상세포는 미성숙 수지상세포에 비해 NR4A2 유전자(NM_006186)의 발현이 2배 이상, UBASH3B 유전자(NM_032873)의 발현이 5배 이상, PTGS2 유전자(NM_000963)의 발현이 4배 이상, IDO 유전자(NM_002164)의 발현이 2배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 2b).
서열번호 유전자 염기 서열
1 NR4A2 forward:GCC ATG CTT GGT TGT TGC AGT TCA
2 NR4A2 reverse:TCA TGC CAC CCA CGC AAC ATT TAG
3 UBASH3B forward:AAG CAA GAC TAG TGG GTG AAG CCT
4 UBASH3B reverse:AAA TAA GCC GGG CTC TAC ACG GAT
5 PTGS2 forward:GCC TAT GTG CTA GCC CAC AAA GAA
6 PTGS2 reverse:ACG AAG CAT CCA CAG ATC CCT CAA
7 IDO forward: GAT GAA GAA GTG GGG TTT GC
8 IDO reverse: CGC TGT GAC TTG TGG TCT GT
9 β-actin forward:GGC ACC CAG CAC AAT GAA GAT CAA
10 β-actin reverse:ACT CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA
실시예 5: 준성숙 수지상세포의 IL-10 분비 확인
실시예 3의 방법에 따라 PGE2(Sigma-Aldrich)를 5μg/mL 첨가하여 3~48 시간 동안 자극한 준성숙 수지상세포 및 0, 0.05, 0.5 및 5μg/mL의 PGE2(Sigma-Aldrich)를 첨가하여 자극한 준성숙 수지상세포를 해동한 후, RPMI1640(Lonza)을 이용하여 세척하였다. 상기 세포집단 2x105 cell를 10ng/mL의 TNFα, IL-6, IL-1β(peprotech), 200unit/mL의 IFNγ(LG)가 포함되거나 0.1μg/mL의 LPS(Sigma-Aldrich), 200unit/mL의 IFNγ(LG) 또는 1μg/mL의 CD40L(peprotech)가 포함된 10% human AB serum(Lonza)이 들어간 RPMI1640으로 96 웰 플레이트에서 duplicate로 24시간 동안 37℃, CO2 배양하였다. 24시간 후 배양액을 수거하여 IL-12와 IL-10에 대한 ELISA kit(BD Biosciences) 사용법에 따라 배양액 내 IL-12와 IL-10을 정량하였다.
실험 결과, PGE2로 감작된 준성숙 수지상세포에서 PGE2를 3~10h으로 처리하는 경우 IL-10 분비가 증가됨을 확인할 수 있었다(도 3a). 또한, 자가항원 PGE2 처리 농도 0.05~5μg/mL(P(0.05), P(0.5) 및 P(5)에 해당)에서 IL-10 분비 증가됨을 확인할 수 있었다(도 3b).
실시예 6: 특이유전자의 기능 확인을 위한 siRNA transfection
실시예 5의 실험 결과로 확인된 특정 자가항원으로 감작된 준성숙 수지상세포가 분비하는 IL-10와 실시예 4에서 확인된 특정 유전자 발현간의 상관관계를 확인하기 위하여 특정 유전자에 대한 siRNA를 transfection하여 knock down 시킨 다음, 준성숙 수지상세포의 IL-10 분비와 T세포의 IFN-γ 분비변화를 확인하였다. 준성숙 수지상세포에 대한 siRNA를 transfection 시키는 방법은 다음과 같다. 인간유래 말초혈액단핵세포를 플라스틱 배양용기에 일정량 분주하고 30분 ~ 1시간 부착시킨 후 부유세포는 제거하고 바닥에 붙은 단핵구를 20ng/mL의 IL-4(JW크레아젠)와 30ng/mL의 GM-CSF(JW크레아젠)가 포함된 CellGro(CellGenix) 배지에서 2일 동안 배양하여 부유하는 미성숙 수지상세포를 수거하였다. 상기 CellGro배지로 현탁한 미성숙 수지상세포는 5 x105~10x105/웰(6웰 플레이트)로 분주하였다. invitrogen에서 제작한 NR4A2, UBASH3B, GAPDH(양성대조군), N.C.(음성대조군)에 대한 siRNA 10~100 pmol과 transporter인 RNAiMAX(Invitrogen)-5μL를 배양액 100μL에 혼합하여 해당 웰에 조심스럽게 dropping한 후 24~36시간동안 배양하였다. 24시간 경과 후, 5~10μg/mL의 특정 자가항원(JW크레아젠)과 10ng/mL의 TNFα(Peprotech), 5μg/mL의 PGE2(Sigma-Aldrich)를 첨가하여 4시간 동안 자극 후 동결하였다. 제조된 준성숙 수지상세포를 해동한 후, 10ng/mL의 TNFα, IL-6, IL-1β(peprotech), 200unit/mL의 IFNγ(LG)가 포함되거나, 0.1μg/mL의 LPS(Sigma-Aldrich), 또는 1μg/mL의 CD40L(peprotech)가 포함된 10% human AB serum(Lonza)이 들어간 RPMI1640으로 배양하였다. 배양액을 수거하여 IL-10에 대한 ELISA kit(BD Biosciences) 사용법에 따라 배양액 내 IL-10을 정량하였다.
실험 결과, 본 발명의 준성숙 수지상세포가 발현하는 특정 유전자와 IL-10의 분비가 상관관계가 높다는 것을 확인하였으며(도 4), 특히 NR4A2 유전자가 IL-10 분비를 조절하고 (도 5a), UBASH3B 유전자가 IL-10 분비를 조절함을 확인할 수 있었다(도 5b).
실시예 7: 준성숙 수지상세포의 T 세포 조절 확인
Nylon wool column을 이용하여 인간 말초혈액 단핵세포로부터 순도 90% 이상의 CD3 positive T cell을 분리하였고 10% human AB serum(Lonza)이 첨가된 RPMI1640(Lonza)으로 현탁하여 48 웰 플레이트에 1x106씩 분주하였다. 실시예 3의 방법으로 제조되어 동결된, 준성숙 수지상세포를 해동한 다음, RPMI1640을 이용하여 세척하였고 같은 배양액으로 현탁하여 웰에 1x105 cell 씩 분주하여 37℃, CO2 배양하였다. 2일 후 50ng/mL의 PMA(Sigam-Aldrich), 500ng/mL의 ionomycin(Sigam- Aldrich) 및 1μL/mL의 brefeldinA(ebioscience)로 4시간 동안 자극하였고, 세포집단을 수거하여 항 인간 CD3 항체(BD Biosciences)와 항 인간 CD4항체(ebioscience)로 FACS 염색하였다. 표면염색이 끝난 FACS 샘플들은 Fixation/Permeabilization kit(BD Biosciences)의 사용법에 따라 permeablization하였고, 항 인간 IFN-γ 항체에 대해 세포내 사이토카인 FACS 염색을 수행하였다. 완료된 FACS 샘플들은 FACS calibur(BD)를 이용하여 T 세포 내 사이토카인 분비를 분석하였다. 조절 T세포를 유도하기 위해 상기와 같은 방법으로 T세포를 분리하여 FBS(Gibco)가 포함된 RPMI1640(Gibco)로 현탁하여 7일 동안 각 실험군들과 함께 37℃, CO2 배양하였다. 7일 후 각 실험군의 T세포를 수거하여 항 인간 CD4 항체와 CD25 항체로 1차 FACS 염색하였고 표면염색이 끝난 FACS 샘플들은 Fixation/Permeabilization kit(ebioscience)의 사용법에 따라 permeablization하였다. 항 인간 Foxp3 항체에 대해 핵 내 FACS 염색을 수행한 후 각 샘플들은 FACS calibur(BD)를 이용하여 조절 T세포의 유도 %를 확인하였다.
실험 결과, T cell의 면역관용은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 준성숙 수지상세포가 분비하는 IL-10를 매개로 하여 이루어짐을 알 수 있었다(도 6).
또한, 실시예 2에 기재된 방법과 동일한 조건으로 준성숙 수지상세포를 류마티스 관절염 환자에 투여한 후 자가항원에 대한 autoreactive T cell의 IFN-γ 반응성 변화(면역반응모니터링)를 확인하기 위한 assay를 수행하였다. 시트룰린된 필라그린(JW크레아젠), PAD4(JW크레아젠), RA33(JW크레아젠), 비멘틴(JW크레아젠) 항원(10 μg/mL) 을 이용하였으며, 각 웰의 spot은 ImmunoSPOT-ELISPOT reader(Cellular Technology)를 사용하여 분석하였다.
실험결과, 본 발명의 준성숙 수지상세포를 처리한 경우, 처리 시간에 비례하여 T세포의 IFN-γ 분비가 억제되어 조절 T 세포 유도와 같은 면역관용성질이 증가함을 확인할 수 있었다(도 9).
실시예 8: 준성숙 수지상세포의 투여방법 및 면역반응모니터링을 위한 채혈
류마티스 관절염 환자의 말초혈액 단핵세포로부터 추출한 미성숙 수지상세포에 실시예 1 또는 2에서 선별된 특정 자가항원(JW크레아젠)을 각각 7 μg/mL, TNFα(Peprotech)를 10ng/mL, PGE2(Sigma-Aldrich)를 5μg/mL 첨가하여 4시간동안 각 항원으로 자극한 준성숙 수지상세포를 1:1:1:1 의 비율로 혼합하여 0.5 x107/0.5 mL 또는 1.5 x107/1.5 mL 로 동결하였다. 상기 동결된 준성숙 수지상세포를 포함한 바이알을 해동하여 저용량 또는 고용량 투여군에 해당하는 류마티스 관절염 환자 12명에게 6명씩 두 그룹으로 각각 5X106 cell/0.5 mL, 1.5X107 cell/1.5 mL씩 대퇴부 양쪽에 피하주사하였다. 이후 2주와 4주, 8주, 10주차에 동량, 동법으로 상기의 준성숙 수지상세포를 투여하였고 투여 전 0주와 투여 후 8주, 14주차에 상기 류마티스 관절염 환자의 혈액을 채혈하여 유효성 평가 및 면역 반응 모니터링을 하였다.
유효성 평가 결과, NR4A2 및/또는 UBASH3B 유전자의 발현에 의해 IL-10의 분비가 높아진 본 발명에 따른 준성숙 수지상세포가 유효하게 류마티스 관절염 치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 7a, 7b 및 8).
또한, 면역 반응 모니터링 결과 시투룰린화 필라그린(citrullinated filaggrin), PAD4(peptidyl arginine deiminase 4), RA33(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2) 및 비멘틴(Vimentin) 항원에 대한 자가 항체가 유의미하게 감소하여 본 발명의 특정 자가항원에 감작된 준성숙 수지상세포가 류마티스 관절염 치료에 효과적임을 확인할 수 있었다(도 10, 도 11).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> JW CREAGENE INC. <120> Method for Preparing Dendritic Cell With Increased Expression of Specific Genes And Composition For Preventing Or Treating Autoimmune Diseases Comprising Dendritic Cell Prepared By The Same <130> P14-B135 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gccatgcttg gttgttgcag ttca 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 tcatgccacc cacgcaacat ttag 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 aagcaagact agtgggtgaa gcct 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 aaataagccg ggctctacac ggat 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gcctatgtgc tagcccacaa agaa 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 acgaagcatc cacagatccc tcaa 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gatgaagaag tggggtttgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 cgctgtgact tgtggtctgt 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ggcacccagc acaatgaaga tcaa 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 actcgtcata ctcctgcttg ctga 24 <210> 11 <211> 3546 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 gctgacgcgc gctgacgcgc ggagacttta ggtgcatgtt ggcagcggca gcgcaagcca 60 cataaacaaa ggcacattgg cggccagggc cagtccgccc ggcggctcgc gcacggctcc 120 gcggtccctt ttgcctgtcc agccggccgc ctgtccctgc tccctccctc cgtgaggtgt 180 ccgggttccc ttcgcccagc tctcccaccc ctacccgacc ccggcgcccg ggctcccaga 240 gggaactgca cttcggcaga gttgaatgaa tgaagagaga cgcggagaac tcctaaggag 300 gagattggac aggctggact ccccattgct tttctaaaaa tcttggaaac tttgtccttc 360 attgaattac gacactgtcc acctttaatt tcctcgaaaa cgcctgtaac tcggctgaag 420 ccatgccttg tgttcaggcg cagtatgggt cctcgcctca aggagccagc cccgcttctc 480 agagctacag ttaccactct 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cttttggtgg agaagtgggt tttcaaatca tcaacactgc ctcaattcag tctctcatct 1800 gcaataacgt gaagggctgt ccctttactt cattcagtgt tccagatcca gagctcatta 1860 aaacagtcac catcaatgca agttcttccc gctccggact agatgatatc aatcccacag 1920 tactactaaa agaacgttcg actgaactgt agaagtctaa tgatcatatt tatttattta 1980 tatgaaccat gtctattaat ttaattattt aataatattt atattaaact ccttatgtta 2040 cttaacatct tctgtaacag aagtcagtac tcctgttgcg gagaaaggag tcatacttgt 2100 gaagactttt atgtcactac tctaaagatt ttgctgttgc tgttaagttt ggaaaacagt 2160 ttttattctg ttttataaac cagagagaaa tgagttttga cgtcttttta cttgaatttc 2220 aacttatatt ataagaacga aagtaaagat gtttgaatac ttaaacactg tcacaagatg 2280 gcaaaatgct gaaagttttt acactgtcga tgtttccaat gcatcttcca tgatgcatta 2340 gaagtaacta atgtttgaaa ttttaaagta cttttggtta tttttctgtc atcaaacaaa 2400 aacaggtatc agtgcattat taaatgaata tttaaattag acattaccag taatttcatg 2460 tctacttttt aaaatcagca atgaaacaat aatttgaaat ttctaaattc atagggtaga 2520 atcacctgta aaagcttgtt tgatttctta aagttattaa acttgtacat ataccaaaaa 2580 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Claims (25)

  1. 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell)를 자가항원(auto antigen)과 사이토카인 및 PGE2(Prostaglandin E2)로 처리하는 단계를 포함하는,
    미성숙 수지상세포에 비해 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 2배 이상 증가된 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cell)의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 미성숙 수지상세포에 비해 2배 이상 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는 준성숙 수지상세포의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 준성숙 수지상세포는 PTGS2 및/또는 IDO 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 추가로 증가된 것을 특징으로 하는 준성숙 수지상세포의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 자가항원(auto antigen)과 사이토카인 및 PGE2(Prostaglandin E2) 처리 시간은 3시간 내지 10 시간인 것을 특징으로 하는 준성숙 수지상세포의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 자가 항원은 α-에놀라제(α-enolase), 필라그린(filaggrin), PAD4(peptidyl arginine deiminase 4), RA33(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2), 피브리노겐 α, 피브리노겐 β, 콜라겐 II, 히스톤 B, 아그레칸, 피브린, 류마토이드 팩터(rheumatoid factor), GPI(glucose-6-phosphate isomerase), 및 비멘틴(Vimentin) 펩타이드 및 단백질, 및 이의 시투룰린화 펩타이드　및 단백질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 준성숙 수지상세포의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 사이토카인은 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)인 것을 특징으로 하는 수지상세포의 준성숙 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 PGE2의 처리농도는 0.05~5μg/mL인 것을 특징으로 하는 준성숙 수지상세포의 제조방법.
  8. 제1항의 방법에 의해 제조된 수지상세포를 유효성분으로 포함하는, 상기 준성숙 수지상세포 제조시 처리된 자가항원과 동일한 자가항원에 대한 반응성을 보유하고 있는 자가면역질환 치료용 세포치료제.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 셀리악 병(Celiac disease-sprue), IgA 결핍(IgA deficiency), 크론병(Crohn's disease), 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 다발성 근염, 만성 활동성간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 또는 고밀도 침착병인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 치료용 세포치료제.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 미성숙 수지상세포에 비해 2배 이상 증가된 것임을 특징으로 하는 자가면역질환 치료용 세포치료제.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 준성숙 수지상세포는 PTGS2 및/또는 IDO 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 추가로 증가된 것을 특징으로 하는 자가면역질환 치료용 세포치료제.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 자가 항원은 α-에놀라제(α-enolase), 필라그린(filaggrin), PAD4(peptidyl arginine deiminase 4), RA33(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2), 피브리노겐 α, 피브리노겐 β, 콜라겐 II, 히스톤 B, 아그레칸, 피브린, 류마토이드 팩터(rheumatoid factor), GPI(glucose-6-phosphate isomerase), 및 비멘틴(Vimentin) 펩타이드　및 단백질, 및 이의 시투룰린화 펩타이드　및 단백질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 치료용 세포치료제.
  13. 다음 단계를 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B의 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 방법:
    (a) 미성숙 수지상세포를 자가항원과 싸이토카인 및 PGE2로 처리하여 준성숙 수지상세포를 제조하는 단계;
    (b) 미성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계;
    (c) 상기 제조된 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 (b)단계 및 (c)단계에서 측정된 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 정도를 비교하는 단계.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 셀리악 병(Celiac disease-sprue), IgA 결핍(IgA deficiency), 크론병(Crohn's disease), 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 다발성 근염, 만성 활동성간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 또는 고밀도 침착병인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    PTGS2 및/또는 IDO 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 추가로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 자가항원(auto antigen)과 사이토카인 및 PGE2(Prostaglandin E2) 처리 시간은 3시간 내지 10 시간인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 자가 항원은 α-에놀라제(α-enolase), 필라그린(filaggrin), PAD4(peptidyl arginine deiminase 4), RA33(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2), 피브리노겐 α, 피브리노겐 β, 콜라겐 II, 히스톤 B, 아그레칸, 피브린, 류마토이드 팩터(rheumatoid factor), GPI(glucose-6-phosphate isomerase), 및 비멘틴(Vimentin) 펩타이드　및 단백질, 및 이의 시투룰린화 펩타이드　및 단백질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 사이토카인은 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 PGE2의 처리농도는 0.05~5μg/mL인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 다음 단계를 포함하는 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cell)를 함유한 자가면역질환 치료 또는 예방용 세포치료제의 제조방법:
    (a) 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell)를 자가항원(auto antigen)과 사이토카인 및 PGE2(Prostaglandin E2)로 처리하여 준성숙 수지상세포를 제조하는 단계;
    (b) 상기 준성숙 수지상세포의 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 미성숙 수지상세포의 NR4A2 또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 비해 2배 이상 증가된 것을 확인하는 단계; 및
    (c) 상기 NR4A2 및/또는 UBASH3B 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 2배 이상 증가된 준성숙 수지상세포를 함유하는 세포치료제를 제형화하는 단계.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 준성숙 수지상세포는 PTGS2 및/또는 IDO 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 발현이 추가로 증가된 것을 특징으로 하는 제조방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 자가항원(auto antigen)과 사이토카인 및 PGE2(Prostaglandin E2) 처리 시간은 3 내지 10시간인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 자가 항원은 α-에놀라제(α-enolase), 필라그린(filaggrin), PAD4(peptidyl arginine deiminase 4), RA33(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2), 피브리노겐 α, 피브리노겐 β, 콜라겐 II, 히스톤 B, 아그레칸, 피브린, 류마토이드 팩터(rheumatoid factor), GPI(glucose-6-phosphate isomerase）및 비멘틴(Vimentin) 펩타이드　및 단백질, 및 이의 시투룰린화 펩타이드　및 단백질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  24. 제20항에 있어서,
    상기 사이토카인은 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  25. 제20항에 있어서,
    상기 PGE2의 처리농도는 0.05~5μg/mL인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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