CN106687583B

CN106687583B - 制备树突细胞的方法和包含所述树突细胞的组合物

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Publication number: CN106687583B
Application number: CN201580039910.3A
Authority: CN
Inventors: 裵容洙; 朴全义; 禹润珠; 张瑱我
Original assignee: JW CREAGENE Inc
Current assignee: JW CREAGENE Inc
Priority date: 2014-06-23
Filing date: 2015-06-23
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2035-06-23
Also published as: KR101807778B1; EP3159403A1; ES2817325T3; KR20150146465A; EP3159403B1; JP6434139B2; CN106687583A; US10350279B2; JP2017527302A; US20170209557A1; EP3159403A4; WO2015199402A1

Abstract

本发明涉及通过用自体抗原、细胞因子和PGE2处理未成熟的树突细胞生成半成熟的树突细胞的方法，其用于治疗自身免疫性疾病特别是类风湿性关节炎，所述半成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达与未成熟的树突细胞相比增加2倍或更多。另外，本发明涉及用于治疗或预防自身免疫性疾病的细胞治疗剂，其包含半成熟的树突细胞作为活性成分。本发明增加对类风湿性关节炎患者的疗效，保留对与在制备半成熟的树突细胞时所用相同的自身抗原的响应，由此能够进行细胞疗法。

Description

制备树突细胞的方法和包含所述树突细胞的组合物

技术领域

本发明涉及生成治疗自身免疫性疾病特别是类风湿性关节炎的半成熟的树突细胞的方法和包含使用所述方法产生的树突细胞作为活性成分的用于治疗或预防自身免疫性疾病的组合物。

背景技术

皮肤中的树突细胞首先由Langerhans在1868年发现且其作为免疫增强细胞的功能由Cohn和Steinmann在1973年报道。在20世纪90年代发现树突细胞作为专业的抗原呈递细胞(APC)且在免疫活化和调节中发挥重要作用。人体中的树突细胞仅占总循环白细胞的约0.3％，但是由表型与巨噬细胞不同的异质群落构成。树突细胞的特征在于其为专业的抗原呈递细胞，与显示出相对弱的抗原呈递能力的B细胞或巨噬细胞不同。树突细胞能够诱导初级免疫响应，而初级免疫响应能够刺激尚未暴露至抗原的没有受到刺激的T细胞且这些树突细胞是唯一能够诱导免疫记忆的细胞。已知树突细胞可发挥功能以诱导强免疫响应，这是因为这些树突细胞是抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面表达高水平的抗原呈递MHC分子(I/II)和共刺激分子(例如CD-80和CD-86)及粘附分子(例如ICAM-1)并分泌多种细胞因子(IFN-α、IL-12、IL-18等)。已知由于树突细胞在细胞表面表达高水平的抗原呈递分子(HMC分子和共刺激分子)并分泌多种细胞因子(例如IFN-α、IL-12等)，因此这些树突细胞可诱导抗原特异性杀伤T细胞的生成及Th1细胞的增殖和活化。

如上所述，树突细胞是最强的抗原呈递细胞。在体内存在数目非常少的树突细胞，但是这些细胞强烈地诱导T细胞免疫且由此已作为针对癌症或感染性疾病的治疗剂在关注于对针对特异性抗原的免疫进行诱导的临床研究中被研究。发现抗原免疫原性由分离自组织或血液、经抗原致敏且体外成熟的树突细胞的过继转移触发。因此，这些树突细胞作为细胞疫苗用于诱导针对癌症或病原微生物的抗原特异性免疫具有很高的价值(Inaba,K.等人,3.Exp.Med.,178:479,1993；Inaba,K.等人,Int.Rev.Immunol.,6:197,1990；Hsu,F.等人,Nature Med.,2:52,1996)。用于分离树突细胞和使树突细胞成熟的技术描述在很多文献中且存在多种方法，包括：包括由能够表达任何一种巨噬细胞或树突细胞的特征的多能细胞得到未成熟的树突细胞并使未成熟的树突细胞与树突细胞成熟因子(包括IFN-α)接触生成成熟的树突细胞的方法(欧洲专利号922,758)；包括用(i)GM-CSF、(ii)TNF-α和IL-3和/或(iii)GM-CSF和TNF-α培养人CD34+造血细胞以诱导CD1a+造血细胞的形成并由培养物回收CD1a+人树突细胞的方法(欧洲专利号663,930)；和包括分离外周血细胞、富集表达CD34抗原的血祖细胞并用造血生长因子和细胞因子的组合培养细胞的方法(WO95/28479)。

然而，现有技术文献和专利仅涉及通过用非特异性抗原致敏未成熟的树突细胞生成树突细胞的方法且没有教导通过用所选择的特异性自身抗原(自体抗原)致敏未成熟的树突细胞生成半成熟的树突细胞的方法。

因此，基于抗原特异性半成熟的树突细胞在免疫耐受中的功能，本发明的发明人已发现半成熟的树突细胞可开发自用从类风湿性关节炎患者中过表达的自身抗原中选择的自身抗原致敏的未成熟的树突细胞。这些半成熟的树突细胞增加特异性基因的表达并介导对所选自身抗原(自体抗原)的免疫耐受且由此改善对类风湿性关节炎的疗效。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供生成半成熟的树突细胞的方法，所述半成熟的树突细胞在用特异性自身抗原(自体抗原)致敏未成熟的树突细胞后具有增加的特异性基因的表达。

本发明的另一个目的是提供细胞治疗剂和制备所述细胞治疗剂的方法，所述细胞治疗剂包含通过上述方法生成的半成熟的树突细胞并通过诱导对与生成半成熟的树突细胞所用相同的自身抗原(自体抗原)的免疫耐受增加对自身免疫的疗效。

本发明的另一个目的是提供测量基因或蛋白的表达水平的方法，所述基因或蛋白的表达水平通过用特异性自身抗原(自体抗原)处理特异性地提高。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供生成半成熟的树突细胞的方法，其包括用自身抗原(自体抗原)、细胞因子和前列腺素E2(PGE2)处理未成熟的树突细胞的步骤，其中所述半成熟的树突细胞与未成熟的树突细胞相比具有就基因或蛋白水平而言增加至少2倍的NR4A2和/或UBASH3B的表达。

本发明还提供如上所述用于通过诱导对与生成半成熟的树突细胞所用相同的自身抗原(自体抗原)的耐受治疗自身免疫性疾病的细胞治疗剂，所述细胞治疗剂包含半成熟的树突细胞作为活性成分。

本发明还提供制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的细胞治疗剂的方法，所述细胞治疗剂包含半成熟的树突细胞，所述方法包括以下步骤：

(a)用自身抗原(自体抗原)、细胞因子和前列腺素E2(PGE2)处理未成熟的树突细胞以生成半成熟的树突细胞；

(b)确认半成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达与未成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达相比增加至少2倍；和

(c)制备包含半成熟的树突细胞的细胞治疗剂，所述半成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达增加至少2倍。

本发明还提供测量用于预防或治疗自身免疫性疾病的半成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平的方法，其包括以下步骤：

(b)测量未成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平；

(c)测量所产生的半成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平；和

(d)对在步骤(b)和步骤(c)中测量的NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平进行比较。

附图说明

图1a显示了为了测量对自身抗原(自体抗原)的T细胞响应(IFN-γ)而进行的实验的结果，使用正常人和类风湿性关节炎患者的血液从而选择用于致敏半成熟的树突细胞的特异性自身抗原(自体抗原)。

图1b显示了为了测量对自身抗原(自体抗原)的自身抗原(自体抗原)响应而进行的实验的结果，使用正常人和类风湿性关节炎患者的血液从而选择用于致敏半成熟的树突细胞的特异性自身抗原(自体抗原)。

图2a显示的实验结果表明了特异性基因的表达水平作为用TNF-α+PGE2进行处理的时间的函数。

图2b显示的实验结果表明了特异性基因的表达水平作为PGE2的浓度的函数。

图3a显示的实验结果表明了IL-10的分泌水平作为用TNF-α+PGE2进行处理的时间的函数。

图3b显示的实验结果表明了IL-10的分泌水平作为PGE2的浓度的函数。

图4显示的实验结果表明了特异性基因表达与IL-10分泌的关系。

图5a显示的实验结果表明在根据本发明的方法生成的半成熟的树突细胞中表达的NR4A2基因调节IL-10分泌。

图5b显示的实验结果表明在根据本发明的方法生成的半成熟的树突细胞中表达的UBASH3B基因调节IL-10分泌。

图6a显示的实验结果表明根据本发明的方法生成的半成熟的树突细胞通过IL-10分泌诱导T细胞免疫耐受且实验结果表明了半成熟的树突细胞在各种刺激条件下的IL-10分泌水平。

图6b显示的实验结果表明了通过半成熟的树突细胞的由IL-10介导的对T-IFNγ分泌的抑制。

图6c显示的实验结果表明了通过半成熟的树突细胞的由IL-10介导的对调节性T细胞的诱导。

图7a显示的实验结果表明通过本发明的方法产生且具有增加的特异性基因表达和增加的IL-10分泌的半成熟的树突细胞中的基因表达可有效治疗类风湿性关节炎。

图7b显示的实验结果表明了特异性基因表达和IL-10分泌且表明通过本发明的方法产生的半成熟的树突细胞可有效治疗类风湿性关节炎。

图8显示了半成熟的树突细胞历时14周和24周对用不同剂量的半成熟的树突细胞给药五次的12位患者的临床有效性(NA：肿胀关节计数在基线时间为0且由此不可能进行ACR评估的患者)。

图9a显示了为了测量用半成熟的树突细胞给药的患者的T-细胞响应(IFN-γ)的变化而进行的ELISPOT测定的结果。

图9b显示了为了测量用半成熟的树突细胞给药的患者的T-细胞响应(IFN-γ)的变化而进行的IFN-γ细胞内染色测定的结果。

图10显示的实验结果表明了在给药半成熟的树突细胞后14周12位患者中特异性自体抗体(瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4、RA33和波形蛋白)的减少。

图11显示的实验结果表明了在将半成熟的树突细胞给药至具有一种或多种自身抗原(自体抗原)的患者后14周测量的自体抗体(瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4、RA33和波形蛋白)的时间依赖性减少。

具体实施方式

除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所通常理解相同的含义。通常，本发明使用的命名法和下述实验方法为本领域已知和常用的那些。

在一个方面，本发明涉及生成半成熟的树突细胞的方法，所述半成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达与未成熟的树突细胞相比增加至少2倍，所述方法包括用自身抗原(自体抗原)、细胞因子和前列腺素E2(PGE2)处理未成熟的树突细胞的步骤。

在本发明的实施例中，通过使来自正常人或类风湿性关节炎患者的外周血单核细胞(PBMC)进行分化而产生的未成熟的树突细胞用所选择的特异性自身抗原(自体抗原)、细胞因子和前列腺素E2(PGE2)处理，由此生成半成熟的树突细胞。

本发明使用的术语“树突细胞”意在包括树突细胞的群落且是指吸收并处理抗原并将所处理的抗原与MHC(主要组织相容性复合物)I类复合物或MHC II类复合物一起呈递的专业的抗原呈递细胞。本发明使用的树突细胞是指具有在Steinman等人,AnnualRev.Immunol.9:271-296,1991和Banchereau and Steinman,Nature 392:245-252,1998中公开的树突细胞的典型表型和特征的细胞。树突细胞包括免疫原性和致耐受性抗原呈递细胞两者且分为未成熟的树突细胞(imDC)、半成熟的树突细胞(smDC)和成熟的树突细胞(mDC)。

本发明使用的术语“未成熟的树突细胞(imDC)”是指以下树突细胞，其如成熟的树突细胞那样不表达细胞表面标志物例如CD14且以低水平表达CCR7和细胞质蛋白DC-LAMP、以低水平表达共刺激分子(CD40、CD80和CD86)且以常规水平表达CD1a、CCR1、CCR2、CCR5和CXCR1。

本发明使用的术语“成熟的树突细胞(mDC)”是指通过未成熟的树突细胞的成熟所形成的细胞。成熟的树突细胞不但显示出增加的DC-LAMP的表达，而且显示出增加的MHC II类、CD40、CD80、CD83和CD86的表达，释放促炎细胞因子并在混合性淋巴细胞反应中诱导增加的同种异体T细胞和同系T细胞的分化和/或增加的树突细胞细胞因子的生成。成熟的树突细胞(mDC)以高水平表达CCR7和CXCR4。

本发明使用的术语“半成熟的树突细胞(smDC)”是指以下树突细胞，其缺失未成熟的树突细胞的一些特征，具有成熟的树突细胞的一些表型且部分或不完全地显示出熟化形态学和表型特征。半成熟的树突细胞通常能够诱导对自身抗原(自体抗原)的免疫耐受响应。

根据本发明的优选实施方案，由正常人或类风湿性关节炎患者得到单核细胞，然后使用培养基(优选为补充有GM-CSF的培养基)在适当的基质上对细胞进行原代培养。促进多能细胞分化为未成熟的树突细胞的物质特别是GM-CSF参见美国专利号5,851,756和5,994,126，其内容通过引用并入本发明。基质优选为细胞可附着的基质。更优选地，基质是用于组织培养的塑性基质。

除GM-CSF外，可将防止或抑制非树突细胞增殖的因子加到培养基中以改善未成熟的树突细胞的产率。所述因子包括例如抑制巨噬细胞的IL-4和/或IL-13。当所述因子促进树突前体细胞的分化时，其抑制非树突细胞的生长且由此增加培养基中未成熟的树突细胞的数目。

在本发明中使用的自身抗原(自体抗原)可为例如选自以下的一种或多种：α-烯醇化酶、丝聚蛋白、PAD4(肽基精氨酸脱亚氨酶4)、RA33(异质核核糖核蛋白A2)、纤维蛋白原-α、纤维蛋白原-β、胶原II、组蛋白B、聚集蛋白聚糖、纤维蛋白、类风湿因子、GPI(葡萄糖-6-磷酸异构酶)及波形蛋白肽和蛋白及其瓜氨酸化肽和蛋白。

根据本发明的优选实施方案，由显示出有效ELISPOT响应的9位类风湿性关节炎患者或2位正常人提取的外周血单核细胞分别用7种抗原(包括瓜氨酸化丝聚蛋白(JWCreaGene)、PAD4(JW CreaGene)、RA33(JW CreaGene)、波形蛋白(JW CreaGene)、纤维蛋白原(Sigma-Aldrich)、纤维蛋白(Sigma-Aldrich)、IgG Fc(Cell Science))致敏并筛选自体反应性T细胞响应性为50％或更大的某种自身抗原(自体抗原)。另外，在100位韩国类风湿性关节炎患者中筛选9种自体抗体(包括瓜氨酸化或非瓜氨酸化丝聚蛋白(JW CreaGene)、PAD4(JW CreaGene)、RA33(JW CreaGene)、波形蛋白(JW CreaGene)、纤维蛋白原(Sigma-Aldrich)、纤维蛋白(Sigma-Aldrich)、IgG Fc(Cell Science)、GPI(JW CreaGene)和胶原(Genway))并通过使用对以OD值比视为阳性的正常人高至少1.5倍的情形为基础的抗原-抗体反应性进行测量的方法来筛选特异性自身抗原(自体抗原)。

结果表明抗原-抗体反应性为30％或更高(图1a)且分泌IFN-γ的外周血单核细胞对其显示出50％或更高的响应性(图1b)的自身抗原(自体抗原)为瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4(肽基精氨酸脱亚氨酶4)、RA33(异质核核糖核蛋白A2)和波形蛋白。

因此，在本发明中，用于处理未成熟的树突细胞的特异性自身抗原(自体抗原)可为选自以下的一种或多种：瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4(肽基精氨酸脱亚氨酶4)、RA33(异质核核糖核蛋白A2)和波形蛋白。

在本发明中，对自身抗原(自体抗原)具有特异性的半成熟的树突细胞可如下生成：在足以使所述特异性抗原能够被半成熟的树突细胞由细胞表面呈递的条件下使所述特异性抗原与所述细胞彼此“接触”足够的时间。优选地，“接触”为“共培养”。

共培养优选进行3-10小时，更优选3-8小时，最优选3-4小时。用于处理细胞的PEG2的浓度优选为0.01-5μg/mL且最优选0.5-5μg/mL。细胞因子可为TNF-α(肿瘤坏死因子-α)且以1-20ng/ml优选5-15ng/ml的浓度使用。

所确认的是，根据本发明的半成熟的树突细胞增加NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达。可选择地，根据本发明的半成熟的树突细胞中PTGS2和/或IDO蛋白或编码所述蛋白的基因的表达可进一步增加且在该情况下，所述表达与未成熟的树突细胞相比可增加至少2倍。

NR4A2蛋白(一种转录因子)可与Foxp3的启动子和增强子结合以与其它转录因子一起发挥作用，由此诱导CD4+T细胞的Treg分化并最终诱导抗炎响应。另外，已知多巴胺能神经元被炎性环境损伤从而引起帕金森病且神经胶质和星形胶质细胞中NR4A2的受控表达可通过抑制TNF-α、IL-1β、NO和ROS的分泌来提供神经元保护作用。

UBASH3B蛋白在C末端区具有PGM样结构域，在进化上与PGM/AcP酶类似且具有磷酸化酶活性。该UBASH3B蛋白可使T细胞的活化的Src酪氨酸激酶(磷酸化的)去磷酸化，导致对T细胞的负性调节。

表达PTGS2蛋白的MLN-DC干扰Th2的分化并在Treg的发展中发挥重要作用。当用IVIG处理DC时，由DC分泌的PGE2可增加且DC中Cox2的表达可增加，同时Treg的表达也可增加从而降低EAE评分。

IDO蛋白是作为吲哚胺2,3-二加氧酶发挥功能的酶且参与必需氨基酸L-色氨酸的降解。

在本发明中，NR4A2基因(NM_006186:SEQ ID NO:11)、UBASH3B基因(NM_032873:SEQ ID NO:12)、PTGS2基因(NM_000963:SEQ ID NO:13)和IDO基因(NM_002164:SEQ ID NO:14)意为分别编码NR4A2蛋白、UBASH3B蛋白、PTGS2蛋白和IDO蛋白的基因。

蛋白的表达可通过Western印迹、ELISA、放射免疫测定分析、径向免疫扩散、组织免疫组化、免疫沉淀测定、补体结合测定或FACS等分析方法测量且基因的表达可通过PCR、实时PCR或RT PCR测量，但是不限于此。

在本发明的实施例中，本发明的半成熟的树突细胞中特异性基因的表达通过实时PCR测量。结果所确认的是，当用于处理细胞的PGE2的浓度为0.01-5μg/mL时，半成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达与未成熟的树突细胞相比增加至少2倍。还发现半成熟的树突细胞中PTGS2和/或IDO基因的表达增加例如至少2倍。具体地，发现与成熟的树突细胞相比，本发明的半成熟的树突细胞显示出NR4A2基因的表达增加至少2倍、UBASH3B基因的表达增加至少5倍、PTGS2基因的表达增加至少4倍和IDO基因的表达增加至少2倍(图2)。

同时，为了确认本发明的半成熟的树突细胞的特征并发现本发明的半成熟的树突细胞与常规治疗剂相比在类风湿性关节炎患者中显示出优秀疗效的原因，对本发明的半成熟的树突细胞中特异性基因的特征性增加的表达水平进行测量是重要的。

因此，在另一个方面，本发明提供测量用于预防或治疗自身免疫性疾病的半成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平的方法，其包括以下步骤：

(a)用自身抗原(自体抗原)、细胞因子和PGE2处理未成熟的树突细胞以产生半成熟的树突细胞；

(c)测量半成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平；和

在本发明中，对蛋白或基因的表达水平进行的测量可使用常规方法进行且该方法的具体实例如上所述。在本发明中，对蛋白或基因的表达水平进行的测量可例如如下进行：使用从SEQ ID NO:1-10的引物中选择的引物对对特异性基因进行扩增，通过实时PCR测量特异性基因的表达水平，用β-肌动蛋白对表达水平进行归一化并对通过将经归一化的表达水平除以在未成熟的树突细胞中测量的表达水平而得到的相对值进行分析。β-肌动蛋白是细胞骨架的主要组分，在大多数细胞中均匀表达，在性质上不容易被外部环境改变且显示出一定程度的高表达水平。上述基因被称为管家基因且用作参照值以比较特异性基因的表达水平。在本发明的实施例中，使用β-肌动蛋白的表达水平作为参照值，对半成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B基因的表达水平进行测量并除以用作对照组的未成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B基因的表达水平。结果表明当用于处理细胞的PGE2的浓度为0.05-5μg/mL时，NR4A2和UBASH3B基因的表达水平与未成熟的树突细胞相比分别增加至少2倍和5倍。

另外，本发明的方法可进一步包括测量PTGS2和/或IDO基因的表达水平。

用于处理细胞的PGE2的浓度可为0.05-5μg/ml且用PGE2、自身抗原(自体抗原)和细胞因子处理未成熟的树突细胞所需要的时间可为3-10小时。自身抗原(自体抗原)可为选自以下的一种或多种：瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4(肽基精氨酸脱亚氨酶4)、RA33(异质核核糖核蛋白A2)和波形蛋白。细胞因子为TNF-α(肿瘤坏死因子-α)。

另外，根据优选的实施方案，本发明的组合物所应用的疾病或病症可为类风湿性关节炎，但是不限于此。换言之，可用包含本发明的半成熟的树突细胞的组合物治疗的自身免疫性疾病包括由体内自身免疫性响应引起的任何疾病或病症。自身免疫性疾病的实例包括1型糖尿病、类风湿性关节炎、乳糜泻、IgA缺乏、克罗恩病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、斯耶格伦综合征、硬皮病、多发性肌炎、慢性活动性肝炎、混合性结缔组织疾病、原发性胆汁性肝硬化、恶性贫血、自身免疫性甲状腺炎、特发性阿狄森病、白癜风、麸质敏感性肠病、格雷夫病、重症肌无力、自身免疫性中性粒细胞减少、特发性血小板减少性紫癜、肝硬化、寻常型天疱疮、自身免疫性不孕、古德帕斯彻综合征、大疱性类天疱疮、盘状红斑狼疮、溃疡性结肠炎、致密物沉积病等。

在本发明的另一个实施例中，为了确认本发明的半成熟的树突细胞的临床作用，用特异性自身抗原(自体抗原)致敏的半成熟的树突细胞给药至12位活动性类风湿性关节炎患者。将患者分为4组，每组包括6人，然后将细胞以5×10⁶个细胞/0.5mL或1.5×10⁷个细胞/1.5mL的浓度皮下给药至每组。细胞以2周间隔给药总计三次直至最初4周，然后在4周休药期后以2周间隔给药总计2次。因此，给药细胞历时总计10周。在给药前后和给药后8和14周，由类风湿性关节炎患者得到血液样品并测量所述血液中自体抗体和T细胞的反应性。

结果发现针对特异性自身抗原(自体抗原)(瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4、RA33和波形蛋白)的自体抗体减少(图10和11)。

因此，在另一个方面，本发明提供治疗自身免疫性疾病的细胞治疗剂，其对与用于处理通过本发明的方法生成的半成熟的树突细胞的自身抗原(自体抗原)相同的自身抗原(自体抗原)具有响应性，所述细胞治疗剂包含半成熟的树突细胞作为活性成分。

本发明使用的术语“细胞治疗剂”是指用于通过一系列过程(包括通过在体外生长或选择自体、同种异体和异种细胞或使用其它方法改变细胞的生物学性质的过程)治疗、诊断和预防疾病的药物。美国和韩国已分别自1993和2002年控制作为药物的细胞治疗剂。上述细胞治疗剂可大致分两类：用于组织再生和器官功能恢复的“干细胞治疗剂”和用于免疫反应调节(包括体内抑制免疫反应或加强免疫反应)的“免疫细胞治疗剂”。

本发明的细胞治疗剂组合物可包含治疗有效量的用于治疗疾病的细胞治疗剂。本发明使用的术语“治疗有效量”是指活性成分或药物组合物在组织系统、动物或人类中引起生物学或医学反应的量并由研究人员、兽医、医生或其他临床人员考量。治疗有效量包括使所治疗的疾病或病症的症状得以缓解的量。对于本领域技术人员显而易见的是，包含在本发明的组合物中的细胞治疗剂将随所预期的作用而变化。因此，细胞治疗剂在本发明的组合物中的最佳含量可由本领域技术人员容易地确定且可随多种因素而调节，所述因素包括疾病的类型和严重性、包含在组合物中的其它组分的含量、制剂的类型、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径、组合物的分泌率、治疗的持续时间和同时使用的药物。

在本发明的实施例中，本发明的半成熟的树突细胞以5×10⁶个细胞/0.5mL或1.5×10⁷个细胞/1.5mL的浓度给药至12位类风湿性关节炎患者。结果显示当将半成熟的树突细胞给药至对特异性抗原显示出响应性的患者时，半成熟的树突细胞发挥功能以减少针对特异性抗原的自体抗体，这表明细胞具有治疗作用(图10和11)。因此，当通过考虑所有上述因素确定半成熟的树突细胞可在最小量时呈现最高作用的量时，本发明的细胞治疗剂包含量为5×10⁶至1.5×10⁷个细胞/mL更优选1.5×10⁷个细胞/ml的半成熟的树突细胞。

为了检查本发明的半成熟的树突细胞的治疗作用和在细胞中表达的特异性基因之间的关系并鉴定与其相关的机制，检查了树突细胞是否分泌IL-10和特异性基因的功能。已知IL-10(一种由Th2、调节性T细胞、树突细胞等分泌的细胞因子)攻击自身组织从而诱导免疫耐受。

在本发明的实施例中，IL-10通过ELISA试剂盒定量且结果表明本发明的半成熟的树突细胞以时间和PGE2处理浓度依赖性方式分泌IL-10(图4)。在本发明的另一个实施例中，基于与用针对每个基因的浓度为10-100pmol(10、50和100pmol)的siRNA转染的对照组进行的比较，发现IL-10由半成熟的树突细胞的分泌归因于特异性基因特别是NR4A2和/或UBASH3B基因(图5)。还发现本发明的半成熟的树突细胞显示出由于NR4A2和/或UBASH3B基因的表达而增加的IL-10分泌且可有效治疗类风湿性关节炎(图7a、7b和8)。在另一个实施例中，发现本发明的半成熟的树突细胞通过IL-10诱导T细胞的免疫耐受(图6和9)。

因此，本发明提供用于治疗自身免疫性疾病的细胞治疗剂，其具有增加IL-10分泌、减少IFN-γ由T细胞的分泌和减少自体抗体产生的作用。

同时，对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的半成熟的树突细胞可与在细胞疗法中通常使用的药用载体一起配制成适当的形式。

因此，在另一个方面，本发明提供制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的细胞治疗剂的方法，所述细胞治疗剂包含半成熟的树突细胞，所述方法包括以下步骤：

(a)用自身抗原(自体抗原)、细胞因子和前列腺素E2(PGE2)处理未成熟的树突细胞以产生半成熟的树突细胞；

在本发明中，半成熟的树突细胞中PTGS2或IDO蛋白或编码所述蛋白的基因的表达可进一步增加。在该情况下，半成熟的树突细胞中PTGS2或IDO蛋白或编码所述蛋白的基因的表达与未成熟的树突细胞相比可增加至少2倍。

在本发明中，对特异性基因的表达水平进行的测量可如下进行：使用从SEQ IDNO:1-10的引物中选择的引物对对特异性基因进行扩增，通过实时PCR测量特异性基因的表达水平，用β-肌动蛋白对表达水平进行归一化并将经归一化的表达水平除以在未成熟的树突细胞中测量的表达水平，由此确定相对值。具体地，半成熟的树突细胞中NR4A2或UBASH3B基因的表达水平使用β-肌动蛋白(一种不容易被外部条件改变且显示出一定程度的高表达水平的管家基因)的表达水平作为参照值来测量并将所测量的表达水平除以用作对照组的未成熟的树突细胞中NR4A2或UBASH3B基因的表达水平。结果表明当用于处理细胞的PGE2的浓度为0.05-5μg/mL时，半成熟的树突细胞中NR4A2和UBASH3B基因的表达水平与未成熟的树突细胞相比分别增加至少2倍和至少5倍。当表达水平通过上述方法测量时，发现当用于处理细胞的PGE2的浓度为0.05-5μg/mL时，半成熟的树突细胞中PTGS2和IDO基因的表达水平与未成熟的树突细胞相比分别增加至少4倍和至少2倍。

本发明的细胞治疗剂的制剂所需要的药用载体是指以下组分，其是生理学上可接受的且当给药至人类时不引起胃部不适、变态反应例如胃肠不适或眩晕或类似反应。药用载体的实例包括用于胃肠外给药的载体例如水、合适的油、盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油。本发明的组合物可进一步包含稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂包括抗氧化剂例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠和抗坏血酸。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和氯丁醇。其它药用载体可参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版,MackPublishing Company,Easton,Pa.,1995。

在制备根据本发明的用于预防或治疗自身免疫性疾病的细胞治疗剂的方法中，用自身抗原(自体抗原)、细胞因子和PGE2处理细胞所需要的时间可为3-10小时。在本发明中，自身抗原(自体抗原)可为例如选自以下的一种或多种：α-烯醇化酶、丝聚蛋白、PAD4(肽基精氨酸脱亚氨酶4)、RA33(异质核核糖核蛋白A2)、纤维蛋白原-α、纤维蛋白原-β、胶原II、组蛋白B、聚集蛋白聚糖、纤维蛋白、类风湿因子、GPI(葡萄糖-6-磷酸异构酶)及波形蛋白肽和蛋白及其瓜氨酸化肽和蛋白且细胞因子可为TNF-α(肿瘤坏死因子-α)。

实施例

在下文中，将参考实施例进一步详细地描述本发明。对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于说明性目的，而不应该被解释为限制本发明的范围。

实施例1：通过自体抗体鉴定进行的抗原筛选或免疫响应监测

为了在将半成熟的树突细胞给药至RA患者后鉴定类风湿性关节炎(RA)患者中与正常人相比以较高水平存在的血浆自体抗体或监测自体血浆的变化(免疫响应监测)，进行以下测定。具体地，将包括瓜氨酸化或非瓜氨酸化丝聚蛋白(JW CreaGene)、PAD4(JWCreaGene)、RA33(JW CreaGene)、波形蛋白(JW CreaGene)、纤维蛋白原(Sigma-Aldrich)、纤维蛋白(Sigma-Aldrich)、IgG Fc(Cell Science)、GPI(JW CreaGene)和胶原(Genway)在内的总计9种抗原各自以1μg/mL的浓度加到96孔板中，然后在24小时后，板用0.05％PBS-T洗涤并用包含1％BSA的PBS阻断1小时。1小时后，一式两份地加入50μL分别来自100位类风湿性关节炎患者和14位正常人的血浆的1:10或1:50稀释液，然后在室温温育2小时。2小时后，板用0.05％PBS-T洗涤并将50μL缀合有AP的抗人IgG抗体(Sigma-Aldrich)在包含1％BSA的PBS中的1:2000稀释液加到板的每个孔中。1小时后，板用0.05％PBS-T洗涤并将100μL1μg/mL磷酸对硝基苯基酯(Sigma-Aldrich)加到板的每个孔中。显色后，将50μL 0.2M氢氧化钠加到板的每个孔中以终止反应且通过ELISA读数器测量每个孔在405nm的吸收值。

结果表明瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4、RA33和波形蛋白各自的抗原-抗体反应性为30％或更高(图1b)。在本发明中，抗原-抗体反应性意为100位类风湿性关节炎患者中所具有的值等于或大于“正常人的平均吸收值×1.5”的患者的百分比(％)。

实施例2：通过IFNγELISPOT测定进行的抗原筛选和免疫响应监测

为了在将半成熟的树突细胞给药至类风湿性关节炎(RA)患者后鉴定使类风湿性关节炎(RA)患者的血液中自体反应性T细胞的IFN-γ响应性与正常人相比得以增加的自身抗原(自体抗原)并检测自体反应性T细胞对自身抗原(自体抗原)的IFN-γ响应性(免疫响应检测)，进行以下测定。根据制造商的说明进行IFNγ-ELISPOT(BD Bioscience)测定。具体地，将100μL捕获抗体加到ELSISPOT 96孔板的每个孔中并在4℃温育24小时，然后板用包含10％FBS的PBS阻断2小时。阻断后，将10μg/mL包括瓜氨酸化丝聚蛋白(JW CreaGene)、PAD4(JW CreaGene)、RA33(JW CreaGene)、波形蛋白(JW CreaGene)、纤维蛋白原(Sigma-Aldrich)、纤维蛋白(Sigma-Aldrich)和IgG Fc(Cell Science)在内的总计7种抗原各自加到分别提取自9位类风湿性关节炎和2位正常人的2×10⁵个外周血单核细胞(PBMC)中，然后将细胞混悬在包含10％人AB血清的RPMI1640中并一式两份地加到每个孔中。在CO₂培养箱中在37℃温育24小时后，板用0.05％PBS-T洗涤并将100μL生物素化检测抗体加到每个孔中，然后在室温温育2小时。2小时后，板用0.05％PBS-T洗涤并将100μL缀合有HRP的抗生物素蛋白的1:100稀释液加到每个孔中，然后在室温温育1小时。1小时后，板用PBS洗涤并将100μL AEC底物(BD Biosciences)加到每个孔中。测量显色程度并与在没有用自身抗原(自体抗原)处理的对照组中测量的显色程度进行比较。每个孔中的斑点使用ImmunoSPOT-ELISPOT读数器(Cellular Technology)分析。

结果表明分泌IFN-γ的外周血单核细胞对其显示出50％或更高的响应性的抗原为瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4、RA33和波形蛋白(图1a)。IFN-γ响应性意为9位RA患者中所具有的值等于或高于“正常人的平均吸收值×1.5”的患者的百分比(％)。

将实施例1和2的结果一起考虑，选择显示出30％或更高的抗原-抗体反应性且分泌IFN-γ的外周血单核细胞对其显示出50％或更高的响应性的瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4、RA33和波形蛋白作为用于致敏半成熟的树突细胞的特异性自身抗原(自体抗原)。

实施例3：半成熟的树突细胞的产生

将一定量的提取自正常人或类风湿性关节炎患者的外周血单核细胞加到塑料培养皿中并培养30分钟至1小时，然后去除漂浮的细胞。将附着于底部的单核细胞在包含20ng/mL IL-4(JW CreaGene)和30ng/mL GM-CSF(JW CreaGene)的CellGro(CellGenix)培养基中在37℃培养3天，然后收集悬浮的未成熟的树突细胞(在这些细胞中将一些未成熟的树突细胞用作对照组以确认特异性基因的表达)。将所收集的未成熟的树突细胞混悬在CellGro培养基中并以一定量加到新的板中，然后通过添加在实施例1和2中选择的5-10μg自身抗原(自体抗原)(JW CreaGene)、10ng/mL TNFα(Peprotech)和0.05-5μg/mL PGE2(Sigma-Aldrich)将细胞刺激3-10小时。经刺激的半成熟的树突细胞与包含5％DMSO(Sigma-Aldrich)和5％葡萄糖(Green Cross Corp.)的人血浆白蛋白(JW Pharm.)一起冷冻。

实施例4：对半成熟的树突细胞中特异性基因的表达进行的分析

使在实施例3中得到的用特异性自身抗原(自体抗原)致敏的半成熟的树突细胞融化并用RPMI1640(Lonza)洗涤，然后使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)从细胞中分离mRNA并定量。然后根据High Capacity RNA-to-cDNA试剂盒(AB)的方法由mRNA合成每种cDNA。使用Power SYBR Green(AB)将所合成的cDNA与SEQ ID NO:1-10的每种引物对混合，然后进行实时PCR(Step One Plus)。将每种基因的用β-肌动蛋白归一化的表达水平除以未成熟的树突细胞中每种基因的表达水平，由此确定相对值。

结果表明当半成熟的树突细胞用PGE2处理0-48小时(特别是3-10小时)时，半成熟的树突细胞显示出与未成熟的树突细胞相比NR4A2基因(NM_006186)的表达增加至少2倍，UBASH3B基因(NM_032873)的表达增加至少5倍且PTGS2基因(NM_000963)的表达增加至少3倍且显示出在处理时间为10-48小时时IDO基因(NM_002164)的表达增加约至少60倍(图2a)。

还发现用0.01-5μg/mL PGE2处理的半成熟的树突细胞显示出与未成熟的树突细胞相比NR4A2基因(NM_006186)的表达增加至少2倍，UBASH3B基因(NM_032873)的表达增加至少5倍、PTGS2基因(NM_000963)的表达增加至少4倍且IDO基因(NM_002164)的表达增加至少2倍(图2b)。

表1

实施例5：对IL-10由半成熟的树突细胞的分泌进行的分析

根据实施例3的方法，使通过添加5μg/mL PGE2(Sigma-Aldrich)刺激3-48小时的半成熟的树突细胞和通过添加0、0.05、0.5和5μg/mL PGE2(Sigma-Aldrich)刺激的半成熟的树突细胞融化，然后使用RPMI1640(Lonza)洗涤。将2×10⁵个细胞的细胞群落一式两份地在96孔板中在37℃和CO₂的条件下用包含10％人AB血清(Lonza)的RPMI1640(其包含10ng/mL TNFα、IL-6、IL-1β(Peprotech)或200单位/mL IFNγ(LG)或包含0.1μg/mL LPS(Sigma-Aldrich)、200单位/mL IFNγ(LG)或1μg/mL CD40L(Peprotech))培养24小时。24小时后，回收培养物并使用ELISA试剂盒(BD Biosciences)根据制造商的说明对培养物中的IL-12和IL-10进行定量。

结果表明当用PGE2致敏的半成熟的树突细胞用PGE2处理3-10小时时，IL-10由细胞的分泌是增加的(图3a)。还发现当以0.05-5μg/mL的浓度(对应于P(0.05)、P(0.5)和P(5))使用自身抗原(自体抗原)抗原PGE2时，IL-10由细胞的分泌是增加的(图3b)。

实施例6：siRNA转染以确认特异性基因的功能

为了检查如实施例5确认的由用特异性自身抗原(自体抗原)致敏的半成熟的树突细胞分泌的IL-10与如实施例4确认的特异性基因的表达的关系，特异性基因通过用针对所述基因的siRNA转染来敲除，然后对IL-10由半成熟的树突细胞的分泌的变化和IFN-γ由T细胞的分泌的变化进行分析。按以下方式将siRNA转染到半成熟的树突细胞中。将一定量的人外周血单核细胞加到塑料培养皿中并静置30分钟至1小时从而附着。然后去除漂浮的细胞并将附着于底部的单核细胞在包含20ng/mL IL-4(JW CreaGene)和30ng/mL GM-CSF(JWCreaGene)的CellGro(CellGenix)中培养2天，然后收集漂浮的未成熟的细胞。将悬浮在CellGro培养基中的未成熟的树突细胞以5×10⁵-10×10⁵个细胞/孔的密度分配(6孔板)。将10-100pmol针对NR4A2(Invitrogen)、UBASH3B、GAPDH(阳性对照)和阴性对照(N.C.)各自的siRNA和5μL转运剂RNAiMAX(Invitrogen)加到100μL所培养的细胞中，然后将其小心地滴到每个孔中并培养24-36小时。24小时后，通过5-10μg/mL特异性自身抗原(自体抗原)(JWCreaGene)、10ng/mL TNFα(Peprotech)和5μg/mL PGE2(Sigma-Aldrich)对细胞进行刺激，然后冷冻。使所产生的半成熟的树突细胞融化，然后在包含10％人AB血清(Lonza)的RPMI1640(其包含10ng/mL TNFα、IL-6、IL-1β(Peprotech)和200单位/mL IFNγ(LG)或包含0.1μg/mL LPS(Sigma-Aldrich)或1μg/mL CD40L(Peprotech))中培养。收集培养物并使用ELISA试剂盒(BD Biosciences)对培养物中的IL-10进行定量。

结果表明在本发明的半成熟的树突细胞中表达的特异性基因和IL-10由所述细胞的分泌具有高度相关性(图4)。具体地，发现NR4A2基因调节IL-10分泌(图5a)且UBASH3B基因分泌IL-10分泌(图5b)。

实施例7：分析半成熟的树突细胞对T细胞的调节

由人外周血单核细胞通过使用尼龙羊毛柱分离纯度为90％或更高的CD3阳性T细胞并混悬在包含10％人AB血清(Lonza)的RPMI1640中并以1×10⁶个细胞的密度加到48孔板的每个孔中。使通过实施例3的方法产生并冷冻的半成熟的树突细胞融化，用RPMI1640洗涤，混悬在相同的培养基中，以1×10⁵个细胞的密度加到每个孔中并在37℃和CO₂的条件下培养。2天后，细胞用50ng/mL PMA(Sigam-Aldrich)、500ng/mL伊屋诺霉素(Sigam-Aldrich)和1μL/mL布雷菲尔德菌素A(Ebioscience)刺激4小时并收集细胞群落且用抗人CD3抗体(BDBiosciences)和抗人CD4抗体(Ebioscience)进行FACS染色。使用固定/透化试剂盒(BDBiosciences)对经表面染色的FACS样品进行透化并进行针对抗人IFN-γ抗体的细胞内细胞因子FACS染色。使用所得到的FACS样品，使用FACScalibur(BD)对T细胞中的细胞因子分泌进行分析。为了诱导调节性T细胞，根据上述方法分离T细胞并混悬在包含FBS(Gibco)的RPMI1640(Gibco)中并在37℃和CO₂的条件下与每个测试组一起培养7天。7天后，收集每个测试组的T细胞并首先用抗人CD4抗体和CD25抗体进行FACS染色。使用固定/透化试剂盒(Ebioscience)对经表面染色的FACS样品进行透化。对每个样品进行针对抗人Foxp3抗体的核内FACS染色，然后使用FACScalibur(BD)分析每个样品中对调节性细胞的诱导(％)。

结果表明T细胞的免疫耐受通过由本发明的方法产生的半成熟的树突细胞所分泌的IL-10实现(图6)。

另外，在与实施例2所述相同的条件下将半成熟的树突细胞给药至类风湿性关节炎患者，然后进行测定以监测自体反应性T细胞针对自身抗原(自体抗原)的IFN-γ反应性的变化(免疫响应监测)。使用瓜氨酸化丝聚蛋白(JW CreaGene)、PAD4(JW CreaGene)、RA33(JW CreaGene)和波形蛋白(JW CreaGene)抗原(10μg/mL)且每个孔中的斑点使用ImmunoSPOT-ELISPOT读数器(Cellular Technology)分析。

结果表明用本发明的半成熟的树突细胞进行的处理与处理时间成比例地抑制IFN-γ由T细胞的分泌从而增加免疫耐受性质例如诱导调节性T细胞(图9)。

实施例8：半成熟的树突细胞的给药和用于免疫响应监测的血液采样

将7μg/mL在实施例1或2中选择的每种特异性自身抗原(自体抗原)(JWCreaGene)、10ng/mL TNFα(Peprotech)和5μg/mL PGE2(Sigma-Aldrich)加到由类风湿性关节炎患者的外周血单核细胞提取的未成熟的树突细胞中且细胞用每种所述抗原刺激4小时。刺激后，所得到的半成熟的树突细胞以1:1:1:1的比例混合并以0.5×10⁷个细胞/0.5mL或1.5×10⁷个细胞/1.5mL的浓度冷冻。使包含冷冻的半成熟的树突细胞的小瓶融化并以5×10⁶个细胞/0.5mL或1.5×10⁷个细胞/1.5mL的量将细胞皮下注射至12位类风湿性关节炎患者(分为两组(高剂量组和低剂量组)且每组6人))的两侧股区。然后在2、4、8和10周，以与上述相同的量和方式给药半成熟的树突细胞。给药前和给药后8和14周，由类风湿性关节炎患者得到血样并进行有效性评估和免疫响应监测。

有效性评估的结果表明其中IL-10的分泌由于NR4A2和/或UBASH3B基因的表达而增加的本发明的半成熟的树突细胞可有效治疗类风湿性关节炎(图7a、7b和8)。

另外，免疫响应监测的结果表明针对瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4(肽基精氨酸脱亚氨酶4)、RA33(异源核核糖核蛋白A2)和波形蛋白抗原的自体抗体是显著减少的，这表明用特异性抗原致敏的本发明的半成熟的树突细胞可有效治疗类风湿性关节炎(图10和11)。

虽然已参照具体特征而详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是，该描述仅针对优选的实施方案且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同形式所定义。

工业应用性

如上所述，根据本发明，半成熟的树突细胞可通过用所选择的特异性自身抗原(自体抗原)、细胞因子和PGE2对人未成熟的树突细胞进行处理来产生。所产生的半成熟的树突细胞显示出与未成熟的树突细胞相比NR4A2或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达增加至少2倍且由此显示出增加的IL-10分泌，这表明半成熟的树突细胞具有增加的免疫耐受性质。

当将用于预防或治疗自身免疫性疾病的包含本发明的半成熟的树突细胞的细胞治疗剂给药至对与生成半成熟的树突细胞所用相同的自身抗原(自体抗原)显示出响应性的患者时，其与常规的自身免疫性疾病治疗剂相比显示出优秀的作用。因此，所述细胞治疗剂使基于个体患者的特征来进行细胞疗法成为可能。

序列表

<110> JW可瑞基因株式会社

<120> 用于制备具有增加的特异性基因表达的树突细胞的方法和包含使用所述方法制备的树突细胞的用于治疗或预防自身免疫性疾病的组合物

<130> PF-B1801

<140> PCT/KR2015/006337

<141> 2015-06-23

<150> 10-2014-0076405

<151> 2014-06-23

<160> 14

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 引物

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aagcaagact agtgggtgaa gcct 24

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gctgacgcgc gctgacgcgc ggagacttta ggtgcatgtt ggcagcggca gcgcaagcca 60

cataaacaaa ggcacattgg cggccagggc cagtccgccc ggcggctcgc gcacggctcc 120

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accagcaaca cagccacctg cccccccagt ctgaggagat gatgccgcac tccgggtcgg 780

tttactacaa gccctcctcg cccccgacgc ccaccacccc gggcttccag gtgcagcaca 840

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cgcacatgat cgagcagagg aaaacgccag tctcccgcct ctccctcttc tcctttaagc 960

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aatcagcttt cttagaactg tttgtccttc gattagcata caggtccaac ccagtggagg 1800

gtaaactcat cttttgcaat ggggtggtct tgcacaggtt gcaatgcgtt cgtggctttg 1860

gggaatggat tgattccatt gttgaattct cctccaactt gcagaatatg aacatcgaca 1920

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aacccaagag agtggaagaa ctgcaaaaca agattgtaaa ttgtctcaaa gaccacgtga 2040

ctttcaacaa tggggggttg aaccgcccca attatttgtc caaactgttg gggaagctcc 2100

cagaacttcg taccctttgc acacaggggc tacagcgcat tttctacctg aaattggaag 2160

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taaccctcct agcccccttg atccctaaag aaaacaaaca aacaaacaaa aactgttgct 2400

atttcctaac ctgcaggcag aacctgaaag ggcattttgg ctccggggca tcctggattt 2460

agaacatgga ctacacacaa tacagtggta taaacttttt attctcagtt taaaaatcag 2520

tttgttgttc agaagaaaga ttgctataat gtataatggg aaatgtttgg ccatgcttgg 2580

ttgttgcagt tcagacaaat gtaacacaca cacacataca cacacacaca cacacacaga 2640

gacacatctt aaggggaccc acaagtattg ccctttaaca agacttcaaa gttttctgct 2700

gtaaagaaag ctgtaatata tagtaaaact aaatgttgcg tgggtggcat gagttgaaga 2760

aggcaaaggc ttgtaaattt acccaatgca gtttggcttt ttaaattatt ttgtgcctat 2820

ttatgaataa atattacaaa ttctaaaaga taagtgtgtt tgcaaaaaaa aagaaaataa 2880

atacataaaa aagggacaag catgttgatt ctaggttgaa aatgttatag gcacttgcta 2940

cttcagtaat gtctatatta tataaatagt atttcagaca ctatgtagtc tgttagattt 3000

tataaagatt ggtagttatc tgagcttaaa cattttctca attgtaaaat aggtgggcac 3060

aagtattaca catcagaaaa tcctgacaaa agggacacat agtgtttgta acaccgtcca 3120

acattccttg tttgtaagtg ttgtatgtac cgttgatgtt gataaaaaga aagtttatat 3180

cttgattatt ttgttgtcta aagctaaaca aaacttgcat gcagcagctt ttgactgttt 3240

ccagagtgct tataatatac ataactccct ggaaataact gagcactttg aatttttttt 3300

atgtctaaaa ttgtcagtta atttattatt ttgtttgagt aagaatttta atattgccat 3360

attctgtagt atttttcttt gtatatttct agtatggcac atgatatgag tcactgcctt 3420

tttttctatg gtgtatgaca gttagagatg ctgatttttt ttctgataaa ttctttcttt 3480

gagaaagaca attttaatgt ttacaacaat aaaccatgta aatgaacaga aaaaaaaaaa 3540

aaaaaa 3546

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cttttccttt ttgatccatt caaaaattac tcattgcaaa ttcccggact gctaggcgag 60

gagagggaag ggggcggagg agacagggct actgcaggcg cagagctggg ggcagccggg 120

ggcccgagtg gctgaggctg gtcccgcagc ggccgcttgc cggcgttctg gctcctgtgg 180

cctcaccagg aagcgtcaga gtcccgacac tggggaagct cggagcgccg cctccgctgc 240

cgccgcctcc tgcctggctc tgggtccccg agccccctcc cctggcccag cccgactccc 300

tcctccttcc cgaaccatcc ggctcgggct ccttccctgg cgatggctgg ccgctgagcc 360

atggctcagt acggccaccc cagtccgctc ggcatggctg cgagagagga gctgtacagc 420

aaagtcaccc cccggaggaa ccgccaacag cgccccggca ccatcaagca tggatcggcg 480

ctggacgtgc tcctctccat ggggttcccc agagcccgcg cacaaaaagc cttggcatcc 540

acgggaggaa gaagtgttca ggcagcatgt gactggttat tctcccatgt cggtgacccc 600

ttcctggatg accccctgcc ccgggagtac gtcctctacc tccgtcccac cggcccctta 660

gcacagaagc tttccgactt ttggcagcag tcgaagcaga tctgcgggaa gaacaaggca 720

cacaacatct tcccccacat cacactctgc cagttcttta tgtgcgagga cagcaaggtg 780

gatgccctgg gggaagccct gcagaccacg gtcagtcgct ggaaatgtaa gttctcggcc 840

ccgctgcccc tggagctcta tacgtcgtcc aacttcatcg gcctctttgt aaaggaagac 900

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gccagccacc tacccaccct agagaaactg gcccagaaca ttgacgtcaa gctagggtgt 1080

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atcttcatgt ctccaatgga gcagaccagc accagcgagg gttggatcta tggcacgtcc 1260

ttaaccaccg gctgctctgg actcctgcct gagaattaca ttaccaaggc tgatgaatgc 1320

agcacctgga tatttcatgg ttcttattca atcttaaata catcgtcatc caactctctc 1380

acgtttgggg atggagtatt ggagaggcgg ccttatgagg accaggggct cggggagacg 1440

actcctctta ctatcatctg ccagcccatg cagccgctga gggtcaacag ccagcccggc 1500

ccccagaagc gatgcctttt tgtgtgtcgg catggtgaga ggatggatgt tgtgtttggg 1560

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atcactgtgt ttggatgcat gcaagcaaga ctagtgggtg aagccttatt agagagcaat 1740

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actctagact atgttaacta gttaaggatg ttacattttg aaaggatgta tgttagatat 3240

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ggtcaggttg ttgtacactt acagtacgtg tcaaccataa tggaacatcc acaaatgcat 3360

caattatacc agggatgtat agtaagtcag ggaactaata taaatgatga cagtcatggc 3420

tgcactgcta cttgtgctgt cgttttgttt gtttttctat gataatttaa aatacatagg 3480

tagggctact gaggaaattt ggagagccac attctgtggt ttctcattat acttacttcc 3540

tgcatttaga gggagtttat ttaaaagaaa taaatgacaa tcaaaccaaa tcatcagtta 3600

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atggtatagt tcactctgta gaagatgtat gcaaagtgaa atgccagccc tttaaagaga 3720

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cttgataacc cctagaaaga agaggacatg aaaggatgct ggctatatat gttaatgagc 3900

aaaaggatta tagttgtttt gttttgtttt tagagacagg gtctcactat aatgcttaga 3960

ctggtcttga actcctgggc tcaagcgatc ctcctgcccc tgtctcccaa agtgctagga 4020

ttacaggtgt gagccaccac acctggccca tagttgtatt ttttttaggt cacttagaaa 4080

aatatgtcat gtattttaca ttttgagaaa caaatcaatc atggtttctt ctagcgttgc 4140

gcaaacactg acccagcttc tgggtatgga aataaccctg tgatgatgtg ttaatataaa 4200

atgttgggag ggaatattcc caataaaggt cttaagagaa aagtcacatt acaagtaatg 4260

taatggctct accattcatt cttctggtat ttgtaatgaa gtgaatccac tgtttaatca 4320

gatccataat ctttaacaga ttcaccacaa attttcatgg gcgttgagtg ctcagaataa 4380

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gaaatagagt ctggaatagg ttatccactc catcttctag gttatcttag ttgtatgacg 4500

aactgataaa tctgtctgac tgggctacaa tccattgttc ttagtccaat atggacactg 4560

ccttaggcaa tggtctatat aagcaaaagg agatagagat ctgaaataat tttccgaata 4620

attcaggtgg aaaacaagaa agattgtatt tctctgcttt catttcaatt tcattatttc 4680

aaattgcttg tcaaaatggc ccaaaagatc tgaattcaca ttaagttccc cttgcacact 4740

tacctattta aaaaactaaa cttgcactgc aactgagaaa ttatttgtaa atcatgtggc 4800

atctatgtat aataaaagaa agagacaact atattactca atttcatata catccaaaaa 4860

gtataggcta atatatataa cctgaagttg cagctggttc tttttgatct gaagctgatg 4920

cttattaaaa caaatgatgt atggggagag gagaaggaag ggcaaggaag gaattgacag 4980

ataagaagca aatggtttct tgtacagagg aattttgttt taatgtagaa agttatttga 5040

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catttcctgc ttctacaagt gtgccacatc aatccggtaa tgccccagtg ttattcacag 5160

acagaacttt gtttcctgtg attttaaaat accgcgtctg ttcctccatg gaccagagta 5220

attggcacat tttaatgcat aagctggggg tttcattttc ccaggctctc ttcaccatca 5280

ctgcattggt agctaggagc ttattgcttc accccagtat ggagttcaga ttacagtgtt 5340

ttccattaca tttagattca tagaatctga atggctgatt aaatggccat ctgatggctg 5400

aaagaggggc gtatttttca ctctgtagtg aaaggcttgg aggagtttct actttttatt 5460

ttaattatac tttaaccaaa gaattatttt aaagtaacct tatatttaaa agatgatttt 5520

gcaaaaaata aaaaataaaa aatatgcctt ctggagtgat gtctgtttgg taaatcattg 5580

ttgataattt ccttgttagt ggtatttgga atgcatatag attgtcttgt cattgtgctt 5640

aacattacca taagtgtgtc ttttccactc aactagctgt attcgtatta aaatgaagtc 5700

tcttatttca attacctagt gttgttggga actaattgaa cagctacagt aaaagaagtt 5760

cctatctcat tgcctttgtg gaaaggcttc cctatgtggt aaaagaaagg cattcctccg 5820

taacctaggc actctgcaag tccagtgttt aatttcaaag cagtgatgaa ttgctctttt 5880

gaaattactc taagtaatcc atgtgttaga atacagatga acctccgttt gatttcacag 5940

ccttcagcac aggcaactgt tactgagtct gcacgaactt agataatgag gtgcagggtt 6000

atttgcattt aaattgcaat ccagcacacg tgtgagaaag aagaggcact agtctaaaag 6060

gctgcattgc ggggagagat gagacaggca gaggagggtg gggtaaagag cgatttaaca 6120

tctatttagg ttaatgttca ctttacaaag gtgatggggg atattttgtt aggtgatagc 6180

agaagctttt catttttaaa catagaatta aaattggatt tgcttctctt taatacttca 6240

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aaagattgta aatgcagatg aaataacttc atttttaagt acaaataata gtaggattgg 6360

tgtatgtagg tttaaaatta tagtgatgac tagtcgaact taatatacaa tcagttcttg 6420

caaatacttt acacttagct gccattacac aacaaattgg aattttccag ctgttcaact 6480

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gagagctctc ccctgttgat acagctatgg caccattgta attacagatg cacctttcag 6840

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gaccaattgt catacgactt gcagtgagcg tcaggagcac gtccaggaac tcctcagcag 60

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ccctgcccgc cgctgcgatg ctcgcccgcg ccctgctgct gtgcgcggtc ctggcgctca 180

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gaaatgcaat tatgagttat gtgttgacat ccagatcaca tttgattgac agtccaccaa 480

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acttaaatca tatttacggt gaaactctgg ctagacagcg taaactgcgc cttttcaagg 840

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gaagtaacta atgtttgaaa ttttaaagta cttttggtta tttttctgtc atcaaacaaa 2400

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aaccaaatga tatctaagta gttctcagca ataataataa tgacgataat acttcttttc 3660

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tttttttttg ttatgtcaca atcagtatat tttctttggg gttacctctc tgaatattat 3840

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ctgacttatg agaacatgga cgttttgttc tcatttcgtg atggagactg cagtaaagga 600

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tgtgtaatta tactagaagt tttgtaatct gtatcttatc attggaataa aatgacattc 1560

aataaataaa aa 1572

Claims

1.生成半成熟的树突细胞的方法，其包括用一种或多种自身抗原(自体抗原)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)和前列腺素E2(PGE2)处理未成熟的树突细胞的步骤，所述自身抗原(自体抗原)选自丝聚蛋白、瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4(肽基精氨酸脱亚氨酶4)、RA33(异质核糖核蛋白A2)、波形蛋白肽和瓜氨酸化波形蛋白肽；和确认NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码NR4A2和/或UBASH3B蛋白的基因的表达与未成熟的树突细胞相比增加至少2倍，以选择半成熟的树突细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述半成熟的树突细胞中PTGS2和/或IDO蛋白或编码所述蛋白的基因的表达进一步增加。

3.权利要求1的方法，其中所述未成熟的树突细胞用自身抗原(自体抗原)、TNF-α和PGE2处理3-10小时。

4.权利要求1的方法，其中用于处理所述细胞的PEG2的浓度为0.05-5μg/mL。

5.用于治疗类风湿性关节炎的细胞治疗剂，其包含通过权利要求1的方法生成的半成熟的树突细胞作为活性成分，其中所述类风湿性关节炎对与生成所述半成熟的树突细胞所用相同的自身抗原(自体抗原)具有响应性，所述自身抗原(自体抗原)选自丝聚蛋白、瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4(肽基精氨酸脱亚氨酶4)、RA33(异质核糖核蛋白A2)、波形蛋白肽和瓜氨酸化波形蛋白肽。

6.权利要求5的用于治疗类风湿性关节炎的细胞治疗剂，其中所述半成熟的树突细胞中NR4A2和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达与未成熟的树突细胞相比增加至少2倍。

7.权利要求6的用于治疗类风湿性关节炎的细胞治疗剂，其中所述半成熟的树突细胞中PTGS2蛋白和/或IDO蛋白或编码PTGS2蛋白和/或IDO蛋白的基因的表达进一步增加。

8.测量用于预防或治疗类风湿性关节炎的半成熟的树突细胞中NR4A2蛋白和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平的方法，其包括以下步骤：

(a)用一种或多种自身抗原(自体抗原)、TNF-α和PGE2处理未成熟的树突细胞以产生半成熟的树突细胞，所述自身抗原(自体抗原)选自丝聚蛋白、瓜氨酸化丝聚蛋白、PAD4(肽基精氨酸脱亚氨酶4)、RA33(异质核糖核蛋白A2)、波形蛋白肽和瓜氨酸化波形蛋白肽；

(b)测量所述未成熟的树突细胞中NR4A2蛋白和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平；

(c)测量所述半成熟的树突细胞中NR4A2蛋白和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平；和

(d)对在步骤(b)和步骤(c)中测量的NR4A2蛋白和/或UBASH3B蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平进行比较。

9.权利要求8的方法，其中还测量所述半成熟的树突细胞中PTGS2蛋白和/或IDO蛋白或编码所述蛋白的基因的表达。

10.权利要求8的方法，其中所述未成熟的树突细胞用自身抗原(自体抗原)、TNF-α和PGE2处理3-10小时。

11.权利要求8的方法，其中用于处理所述细胞的PEG2的浓度为0.05-5μg/mL。