ES2559235T3 - TSP-1, TSP-2 e IL-17BR asociadas con la diferenciación de células madre - Google Patents

Abstract

Un método para identificar una capacidad de una célula madre para diferenciar una célula en un condrocito, comprendiendo el método: cultivar una célula madre en un medio; medir una concentración de al menos uno seleccionado entre el grupo que consiste en trombospondina 1 (TSP-1), TSP-2 y receptor de interleucina 17b (IL-17BR) a partir del cultivo; e identificar una capacidad de la célula madre cultivada para diferenciarse en un condrocito, en base a la concentración medida.

Description

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EJEMPLO 8: Inducción de la diferenciación condrogénica de UCB-MSC por TSP-2 (no entra en el alcance de la presente invención)

Una UCB-MSC se cultivó en presencia de TSP-2 para inducir la diferenciación condrogénica. El medio usado fue el medio de cultivo condrogénico anteriormente descrito. Se añadió una TSP-2 recombinante (R&D System, Minneapolis, MN, USA) al medio de cultivo en una cantidad de 10 ng/ml a 500 ng/ml y el producto resultante se cultivó en sedimento. Una concentración inicial de la UCB-MSC fue de 5x105 células/ml. Después del procedimiento de cultivo, se realizó una RT-PCR usando un RNA total aislado a partir de la célula como plantilla y usando cebadores específicos para un marcador de condrocitos (por ejemplo, colágeno de tipo II (Col IIA1), agrecano (Acan), Sox-9 y TSP-2), y condrocito hipertrófico y marcadores óseos (por ejemplo, Col IA1 y Col XA1) para medir una cantidad de expresión de mRNA de estos marcadores.

Las figuras 15 a 17 son gráficos que muestran una cantidad de expresión de una proteína marcadora de una UCB-MSC cultivada en presencia de TSP-2, según realizaciones de la presente invención. Haciendo referencia a las figuras 15 a 17, las expresiones de colágeno de tipo II (Col IIA1), agrecano (Acan) y Sox-9 aumentaron dependiendo de su concentración 1 semana después de la inducción de la diferenciación condrogénica, mientras que la expresiones de Col IA1 y Col XA1 disminuyeron o no fueron exhibidas con un tiempo de cultivo.

Por tanto, se confirma que la TSP-2 externamente añadida estimula la diferenciación condrogénica de la UCB-MSC.

EJEMPLO 9: Inducción de diferenciación condrogénica de UCB-MSC bajo condiciones de inhibición de expresión de TSP-2

Una UCB-MSC se cultivó en un medio de cultivo condrogénico bajo condiciones de inhibición de la expresión de TSP-2 para inducir la diferenciación condrogénica.

Se añadió RNA de interferencia pequeña (siRNA) (Bioneer, Daejeon, Korea, secuencia de sentido: SEQ ID NO:9, secuencia de anti-sentido: SEQ ID NO: 10) con una secuencia complementaria a la de mRNA de TSP-2 a un medio en una concentración de 33 nM para inhibir la expresión de TSP-2. El medio usado fue el medio de cultivo condrogénico anteriormente descrito y la UCB-MSC fue cultivada en sedimento. Una concentración inicial de la UCB-MSC fue de 5x105 células/ml y el procedimiento de cultivo se realizó durante 7 días. La cantidad de expresión de TSP-2 se midió usando RT-PCR que usó un RNA total extraído de la UCB-MSC y usando un cebador específico de TSP-2, o la cantidad de expresión de TSP-2 en la materia sobrenadante del cultivo obtenido se midió mediante ELISA. Las expresiones de Col IIA1 y agrecano se midieron usando RT-PCR.

La figura 18 ilustra gráficos que muestran el grado de diferenciación condrogénica de una UCB-MSC cultivada en un medio condrogénico bajo condiciones de inhibición de la expresión de TSP-2, según una realización de la presente invención. Haciendo referencia a la figura 18, en la UCB-MSC cultivada bajo condiciones de inhibición de la expresión de TSP-2, es decir, en presencia de siRNA de TSP-2, las expresiones de los marcadores de condrocitos, es decir, Col IIA1 y agrecano disminuyeron significativamente. Esto indica que la TSP-2 induce o estimula la diferenciación condrogénica de la UCB-MSC. En la figura 18, A muestra los resultados de medir la concentración de TSP-2 mediante RT-PCR, B muestra los resultados de medir la concentración de TSP-2 mediante ELISA y C y D muestran los resultados de RT-PCR de Col IIA1 y agrecano respectivamente.

EJEMPLO 10: Nivel de TSP-2 en plasma sanguíneo de paciente con osteoartritis

Se recogió sangre 15 personas normales y 28 pacientes con osteoartritis y el nivel de TSP-2 en cada plasma sanguíneo se midió mediante ELISA.

La figura 19 es un gráfico que muestra los niveles de TSP-2 en plasma sanguíneo de una persona normal y un paciente con osteoartritis, según una realización de la presente invención. Haciendo referencia a la figura 19, el nivel de TSP-2 era mayor en el plasma sanguíneo del paciente con osteoartritis que en el plasma sanguíneo de la persona normal. Esto indica que el nivel de TSP-2 en sangre puede actuar como un marcador para diagnosticar artritis. Esto indica también que el nivel de TSP-2 en sangre puede actuar como un marcador para diagnosticar enfermedades relacionadas con la diferenciación condrogénica, además de la artritis.

EJEMPLO 11: Expresión de TSP-1 en UCB-MSC por líquido articular de paciente con artritis (no entra en el alcance de la presente invención)

Se confirmó el efecto de un líquido articular de un paciente con artritis sobre la expresión de TSP-1 en una UCB-MSC.

Una UCB-MSC se cultivó en presencia de un líquido articular de un paciente con artritis. La UCB-MSC se cultivó en un medio que contenía MEM-α, 10 % (v/v) de FBS y 50 µg/ml de gentamicina durante 5 a 6 días. El líquido articular de la cavidad articular se añadió al medio cuando la UCB-MSC se cultivó hasta un nivel de 70-80% del área de un recipiente de cultivo. El líquido articular del paciente con artritis se añadió a una concentración de 20% (v/v) después

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Claims (1)

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