KR101289535B1

KR101289535B1 - 원심분리관

Info

Publication number: KR101289535B1
Application number: KR1020127012529A
Authority: KR
Inventors: 전민용
Original assignee: 전민용
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2013-07-24
Also published as: EP2511011A4; KR20120089723A; WO2011071353A2; EP2511011A2; WO2011071353A3; US20120251411A1

Abstract

본 발명은 생물학적 물질의 원심분리 시에 사용하는 원심분리관으로서, 원심분리관의 직경을 달리하여 좀 더 세밀한 분리가 이루어 질수 있게 하고, 강한 힘이 작용하는 원심분리관의 가늘고 약한, 직경이 좁은 부위에 별도의 지지편을 형성하여 원심분리관의 변형 없이 원심분리가 이루지도록 한다. 별도의 시약 등을 이용하지 않고도 원심분리로 물질의 비중차에 의한 분리가 쉬워지며, 마개를 니들이 관통할 수 있는 고무나 폴리에틸렌 폴리프로필렌 또한 실리콘 등의 재료를 사용하여, 세균의 오염으로부터 차단되는, 페쇄된 공간 속에서 생물학적 제재의 원심분리가 가능하게 한다.

Description

원심분리관{CENTRIFUGE TUBE}

본 발명은 원심분리관에 관한 것으로, 특히 특정한 성분의 분리를 용이하게 하는 원심분리관에 관한 것이다.

생물학적 물질의 분리는 모든 생물학 유전학이나 의학 등에 있어서 물질분석 뿐만 아니라 세포의 배양 및 DNA의 확인 및 증폭을 위한 가장 근본적인 작업이라고 할 수 있다. 현재 의학에서는 줄기세포를 이용한 재생의학에 전 세계가 경쟁적으로 연구하고 있다. 이러한 줄기세포를 얻기 위하여 발생초기의 배반포(Blstocyst)에서 얻어지는 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 발생과정이 끝난 성인 또는 태반에서 얻어지는 성체줄기세포(adult stem cell)가 있다.

이 가운데 성체줄기세포(adult stem cell)를 얻는 주된 3가지 방법이 있는데, 첫째로 골수(bone marrow)를 통해서 얻을 수 있으며, 둘째로는 제대혈(umbilical cord blood)을 통해서 얻을 수 있으며, 다음으로 말초혈액(mesenchymal blood)을 통하여 쉽게 얻을 수 있다. 이 모든 방법들은 우선 원심분리 과정을 거쳐 혈액내의 적혈구 백혈구 혈소판 혈장으로 크게 나누어지는 성분을 분리한 다음 단핵세포구인 줄기세포를 분리해 내야하는 작업이 따르게 된다. 이 과정에서 우리는 종래의 원심분리 방법들을 고찰해 보면 다음과 같다.

도1은 종래의 원심분리관의 일 예시도로서, 여러 가지 물질이 혼합되어 있는 용액에 있어서 특히 인간이나 동물의 혈액을 채취하여 원심분리하게 되면 혈액 속에 있는 적혈구 백혈구 혈소판 기타 혈장성분들은 각각의 고유한 비중차이에 의해서 원심분리관(10)의 아래쪽에서부터 위쪽으로 무거운 것 순으로 층층이 위치하게 된다.

먼저 주사바늘을 통하여 채취한 말초혈액을 원심분리관에 옮겨 담는 과정에서는, 원심분리관의 마개를 열고 시린지의 니들을 원심분리관 안쪽으로 위치한 다음 주사기에 있는 말초혈액을 원심분리관으로 이동시킨 후, 니들을 원심분리관으로부터 격리 시킨 후 열려있던 원심분리관의 마개를 봉한 다음, 원심분리기의 버킷에 원심분리관을 위치시키고 원하는 시간과 회전속도(rpm) 또는 중력가속도(g) 값을 셋팅하여 작동시킨다. 통상 적혈구의 경우 혈액 중에서 가장 무거운 비중을 차지하며 아래쪽에 형성되는데 남성의 경우 전체 혈액 중 47％를 차지하며 여성의 경우 42％를 차지한다. 그 위로는 백혈구와 혈소판이 차지하며 전체 혈액 가운데 약1％ 정도를 차지하며 여기에는 말초혈액 줄기세포인 단핵구(monocyte)들도 포함된다. 나머지는 그 상층에 혈장이라 불리는 세럼(serum)과 피브리노겐(fibrinogen)이 위치한다. 원심분리가 끝난 원심분리관을 꺼내어 다시 마개를 열어 피펫이나 모세관 또는 니들을 통하여 각 구성물질의 비중차에 의하여 분리된 물질 가운데 원하는 물질을 분리해낸 다음 나머지 성분들은 따로 보관 하던지 폐기하거나 재활용하게 된다.

이러한 조작 과정에서 마개가 열리고 닫히고 하는 과정과 혈액을 주입하는 과정 동안에 주변 공기 중에 떠다니던 바이러스나 기타 박테리아 등의 이물질이 원심분리관속으로 침투될 우려가 있으며 이를 배양하게 되면 당연히 오염된 배양물이 생겨나게 된다. 또한 이때 사용되는 원심분리관을 보면 직경이 대체적으로 아랫방향으로 갈수록 좁아지게 형성되어 있다. 이는 원하는 성분이 아래쪽에 있다면 분리가 쉽지만 만약 원하는 성분이 전체 용액가운데 아래 부분이 아니라 비중에 따라 중간위치나 그 보다 더 위쪽의 원심분리관 직경이 넓은 부위에 있을 경우 그 성분은 세밀하게 분리할 수 없는 불편함이 따르게 된다. 특히 분리하고자하는 줄기세포가 함유된 buffy coat 층은 전체 용액의 1％ 정도에 지나지 않아 실질적으로 넓은 직경의 원심분리관에서 분리하게 되면 종이장 처럼 얇게 적혈구 위에 깔려 있는 형상이므로 이를 분리 하기란 전문가로서도 매우 어려운 작업이 되고 있다.

도2는 통상 혈액백이라 불리우는 혈액채취백의 예시도로서, 채혈을 통해 수집한 혈액을 일시 보관하면서 원심분리하여 혈액을 각 성분별로 적혈구 백혈구 혈소판 그리고 혈장 성분으로 분리하게 된다. 상기의 두 용기에 있어서, 백혈구나 혈소판을 분리하고자 할 경우 전체 혈액에서 1％ 정도인 이들 성분은 1차 원심분리하게 되면 그 면이 얇은 백색을 띠는 Buffy coat층을 형성하는데 이러한 Buffy coat층을 분리해 내는 것은 실제 임상에서 매우 까다로운 문제를 일으킨다.

도3은 종래의 또 다른 원심분리관의 단면도로서, 원심분리관(10)의 직경에 있어서 중간챔버(40)의 직경은 다른 두 챔버(30)(50)의 그것에 비하여 현저하게 작게 형성되어 있다. 이렇게 가늘게 형성된 중간챔버(40)는 Buffy coat층이 이곳에 형성되었을 경우에는 다른 두 챔버(30)(50)에 형성되었을 경우와 비교하여 그 분리가 매우 쉽다. 그러나 상술한 전체 혈액에서 차지하는 적혈구의 비율이 남녀 간이나 개인마다 차이가 있기 때문에 Buffy coat층을 중간챔버(30)로 이동시키는 수단으로 별도의 플러그(60)를 형성하였으며, 또한 원심분리시 가해지는 높은 중력가속도(g)로 인하여 발생되는 직경이 가는 중간챔버(40)의 변형을 막기 위하여 원심분리관(10)을 에워싸는 별도의 블록(70)을 형성하고 있다.

US 특허 3,513,976에서는 말초혈액에서 백혈구를 얻기 위하여 원심분리관의 중간 부분을 목처럼 잘록하게 형성하고 아래쪽의 챔버에는 적혈구가 모이게 하되 아래쪽 챔버의 한 면에 홀과 또 다른 튜브를 형성하여 상기 목 부분에 백혈구가 위치할 수 있도록 하고 있다. 이 방식은 제작비용이 많이 들고 사용하기에 번거롭다.

또한 US특허 4,861,477에서는 이러한 단점을 보완하고자 원심분리관의 아래쪽에 플러그를 형성하여 적혈구가 분리되는 공간의 체적을 조절할 수 있게 하며, 잘록한 중간부분의 원심분리관이 높은 중력가속도에 변형되거나 하는 점을 보완하기 위하여 원심분리관 외부에 또 다른 블록 구성물을 형성하는 방식을 취하고 있는데 이는 원심분리관의 제조원가를 상승시키고 있다.

또한 US특허 5,422,018에서는 가운데가 오목한 내부 원심분리관과 이를 둘러싸는 외부 원심분리관 사이에 매질을 채워줌으로 인하여 내부 원심분리관의 직경이 좁은 중간챔버 부분을 보호하는 역할을 하는 방식을 취하고 있으나 이 방식 또한 조작이 번거롭고 원심분리관의 제조원가를 상승시키고 있다.

특허공개 10-2006-0059849 에서는 말초혈액에 수용성 고분자를 첨가하는 공정을 포함하는 혈소판 다혈장(platelet rich plasma)의 제조방법을 출원하고 있고, 이와 유사한 방법들로 실험실에서는 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하기 위하여 Ficoll(슈크로스 중합체)과 Hypaque(Sodium Ditrizote의 중합체)의 중합체인 Ficoll-Hypaque이 이용된다. 이 Ficoll-Hypaque은 비중이 1.0778g/ml로서 단핵구는 이보다 가벼우나 적혈구는 이보다 무겁기 때문에 비중차이를 이용하여 분리한다. 상기의 이러한 중합체를 이용하는 경우 세척용 aMEM(alpha minium essential Medium Jaeil Biotech Service Korea)에 넣어 10분간 200xg로 원심분리한 후 팔콘튜브 바닥에 가라앉은 세포를 제외한 aMEM을 버리는 세척과정을 거치게 된다.

말초혈액이나 여타 생물학적인 물질 및 모든 종류의 액체에 들어있는 고형성분들은 각각 그 비중에 있어 차이가 있으므로 이러한 비중의 차이를 이용하는 원심분리법이 가장 경제적인 것이다.

그런데 이러한 미세한 비중의 차이를 이용하여 미량의 성분이 위치할 부분의 원심분리관의 직경을 좁게 한 제품들이 있지만, 제작이 어렵고 오염의 위험이 있으며, 사용함에 번거롭고, 추가적인 장치나 비싼 재료가 사용됨에 따라 원가가 높아지는 문제점들이 있었으며, 요즈음 흔히 사용되는 15ml 및 50ml용의 코니칼튜브가 적용되는 원심분리기의 버킷에 사용하기에 적합하지 않다.

[특허문헌]

[문헌1] US 3,513,976호 (W.C.James) 1970.5.26

[문헌2] US 4,861,477호 (Shiro Kimura) 1989.8.29

[문헌3] US 5,422,018호 (Alexander M.Saunders 외2인) 1995.6.6

[문헌4] KR 10-0,409,028 (전홍재) 2003.11.27

[문헌5] KR 10-0,489,248 (메디포스트(주)) 2005.5.11

[문헌6] KR 10-2006-0,059,849 (스미다 에미) 2006.6.2

[문헌7] US 6,835,353 (Emery Smith 외 2인) 2004.12.28

본 발명은 원심분리 대상인 혈액 샘플에서 특정한 성분의 분리를 용이하게 하는 원심분리관을 제공하려는 것이다.

본 발명은 말초혈액을 비롯한 생물학적 화학적 성분들이 들어있는 용액에 있어서 그 속의 각 물질들의 비중차이에 의한 효율적인 성분 분리를 일으킬 수 있게 하는 원심분리관을 제공하려는 것이다.

특히 최근의 의학 생명공학계에서 연구되고 있는 세포의 분리, 배양 및 재생에 있어서 그 분리과정 중에 일어나는, 생물학적인 것들을 포함하는 오염 등으로부터 차단되는, 경제적이고 안전하며 효율적인 생물학적 물질 분리를 위한 기구를 제공하고자 한다.

본 발명은 내부 공간에 유동물질을 수용하는 외벽을 가지고, 내부에 수용한 유동물질을 비중에따라 성분을 분리하기 위한 원심분리관으로서, 상부에 입구가 열려 있고 일정한 내부 용적을 가진 상부챔버와, 상기 상부챔버의 하부에 연통되고 상부챔버보다 작은 직경을 가진 중간챔버와, 상기 중간챔버의 하부와 연통되고 중간챔버보다 큰 직경을 가진 하부챔버를 가진 원심분리관에서 원심분리 시에 원심력에 의한 중간챔버의 변형을 방지하기 위하여 중간챔버의 외벽에 하나 이상의 지지편을 일체로 형성하는 것이다.

본 발명은 내부 공간에 유동물질을 수용하는 외벽을 가지고, 내부에 수용한 유동물질을 비중에따라 성분을 분리하기 위한 원심분리관으로서, 상부에 입구가 열려 있고 일정한 내부 용적을 가진 상부챔버와, 상부챔버의 하부에 연통되고 상부챔버보다 작은 직경을 가진 중간챔버로 이루어지고, 15ml 및 50ml 코니칼 튜브가 삽입되는 원심분리기에 있어서, 일회의 원심분리로 버피코트층이 중간층에 형성되게 하부챔버 및 중간챔버, 상부챔버의 체적을 일정한 비율로 형성하며, 원심분리 시에 중간챔버의 변형을 방지하기 위하여 외벽에 하나 이상의 지지편을 일체로 부착된 원심분리관이다. 이 지지편은 그 하부가 원심분리기 버킷에까지 연장된다.

본 발명의 특징은 상부챔버에는 열린 입구를 막을 수 있는 마개를 가지는 것인데, 이 마개는 유연한 재질로 만들어 지는 것이고, 특히 고무, 실리콘, PVC, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 중합체 가운데 하나로 형성되는 것이다.

본 발명의 특징은 상부챔버의 상단을 막는 마개가 중앙부분이 외부로 볼록하게 하여 주사기 바늘을 삽입하기 전에 소독을 쉽게 할 수 있게 한다. 또 이 마개는, 상부챔버의 상단에 결착턱을 형성하고, 결착턱과 결합하는 결착홈을 가진 캡을 추가하여 마개가 상부챔버로부터 쉽게 분리되지 못하도록 한다.

본 발명의 특징은 하부챔버는 그의 바닥면의 두께가 측면의 뚜께보다 얇게 형성되어 유연한 것인데, 이는 미소한 성분을 중간챔버로 위치시키기 위하여 필요하면 하부챔버의 부피를 줄일 수 있도록 한 것이다.

본 발명은 내부 공간에 유동물질을 수용하는 외피을 가지고, 내부에 수용한 유동물질을 비중에따라 성분을 분리하기 위한 원심분리용 팩으로서, 상부에 입구가 열려 있고 일정한 내부 용적을 가진 상부챔버와, 상부챔버의 하부에 연통되고 상부챔버보다 작은 직경을 가진 중간챔버와, 중간챔버의 하부와 연통되고 중간챔버보다 큰 직경을 가진 하부챔버와, 상부챔버, 중간챔버, 및 하부챔버을 형성하는 외피에 걸이구멍이 형성되고, 이 걸이구멍이 고리를 가진 평판버킷에 걸리도록 한다. 또 원심분리팩의 하부에 하부입구를 형성한 것이 특징이다.

본 발명의 특징은 내부 공간에 유동물질을 수용하는 외벽을 가지고, 내부에 수용한 유동물질을 비중에따라 성분을 분리하기 위한 원심분리관의 중간챔버의 외벽을 상부챔버 및 하부챔버의 외벽보다 뚜껍게 하는 것이다.

본 발명의 특징은 트롬빈, 칼슘2가이온, 유리비드 등의 피브린 활성화 물질 또는 헤파린, ACDA, CPDA, EDTA 등의 항응고물질, 또는 특정물질을 침강시키는 수용성 고분자 화합물이나 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque) 등의 분리물질, 또는 트롬빈, 칼슘2가이온, 유리비드 등의 피브린 활성화 물질, 또는 항원항체 반응을 이용한 형광표적물질 분리시약, 또는 마그네틱 미세비드(magnetic microbead)를 원심분리관에 미리 일정량을 주입한 것이다.

본 발명의 특징은 원심분리할 대상의 량을 표시하는 표시부를 상부챔버의 외표면에 형성한 것이다.

본 발명은 상부챔버와 중간챔버 및 하부챔버를 가진 원심분리관으로서, 하부챔버의 체적을 원심분리관의 전체 체적의 약 36％ 되게 형성하고, 중간챔버의 체적을 10±2％ 되도록 형성하여, 추출하려는 성분이 중간챔버에 모이도록 한 것이다.

본 발명은 다음과 같은 효과들을 가진다.

분리하고자하는 생물학적 화학적 물질의 비중차이에 의한 원심분리를 할 때, 원심분리관의 측면에 지지편을 형성함으로 인하여 좁은 직경을 가진 원심분리관이 원심분리 시에 발생되는 높은 원심력과 중력가속도에 견디는 힘을 발생시킴으로써 직경이 좁은 원심분리관으로만 가능한 세밀한 비중차이에 의한 원심분리가 가능해지게 된다. 예로서 분리하고자하는 말초혈액의 비중 및 성분 비율 차이에 의한 원심분리관을 이용함으로 목적하는 줄기세포가 포함된 buffy coat층이 직경이 가는 중간챔버에 형성됨으로써 buffy coat층의 분리가 효율적으로 이루어지게 되었다.

간단히 형성된 지지편 으로 인하여 기존의 방법에 비하여 별도의 외부 블록을 형성한다든지 중간 매개물을 설치해야하는 불편을 없애므로 저렴한 가격으로 원심분리관을 제작할 수 있게 되고, 인공적인 중합체를 이용한 뒤 이를 제거하는 세척과정의 번거로움 없이도 미세한 원심분리가 가능하게 되어 실험실에서의 작업이 수월해 지는 효과가 있다.

원심분리관의 하부챔버의 바닥면의 두께를 약간 얇게 형성함으로써 별도의 스크류나 플러그를 형성하지 않더라도 하부챔버에 형성된 용액을 중간챔버로 밀어 올려줄 수 있도록 유연하게 함으로써, 분리하고자하는 물질을 직경이 좁은 중간챔버로 위치시킬 수가 있다.

원심분리용 용기가 팩 형태로 된 것에서 별도의 용기로 혈액을 이동시키지 않고도 혈액물질의 분리가 용이하며, 원하는 물질이 하부챔버에 있을 적에 간단히 하부챔버를 눌러서 중간챔버로 이동시킨 다음 물질을 분리할 수 있고, 1차 원심분리된 혈액팩에서 적혈구와 기타 성분들로 구분되는 중간챔버 층에서 집게나 융착기를 통하여 서로 분리시켜 놓을 수 있게 되므로 별도의 용기로 분리 보관하지 않아도 되며, 필요시 적혈구방향에도 혈액인출 마개를 형성하여 쉽게 분리할 수 있다.

생물학적 화학적 물질을 원심분리관내로 주입하거나 원심분리가 이루어진 물질을 분리 채취할 적에 니들이 관통되는 마개를 형성함으로써, 마개를 오픈할 경우에 유입될 수 있는 생물학적 오염으로부터 안전한 원심분리 조작 작업이 이루어 질 수 있는 장점이 있다.

직경이 좁은 원심분리관을 원심분리기에서 꺼내었을 때 지지편으로 인하여 원심분리관이 넘어지는 것을 방지하여 바닥에 세워놓은 상태에서도 원심분리물질의 분리작업을 할 수 있게 도와준다.

원심분리관의 표면에 남성 또는 여성의 경우에 주입되는 혈액의 양을 다르게 표시한 지시선, 또는 지시문자, 지시기호 등이 표시됨으로 인하여 조작자가 간편하게 지시선 까지만 주입하기만 하여도 원하는 줄기세포가 포함된 buffy coat층이 중간챔버에 분리될 수 있도록 도와준다.

현재 각종 의료기관이나 실험실 등에서 가장 많이 사용되는 15ml 코니칼 튜브가 사용되는 원심분리기에서 1회의 원심분리로 혈액에서 원하는 성분인 buffy coat를 쉽게 추출할 수 있게 한다.

본 발명 원심분리관, 즉 하부챔버의 체적을 원심분리관의 전체 체적의 약 36％ 되게 형성하고 중간챔버의 체적을 10±2％ 되도록 한 것을 사용하여, 혈액을 원심분리하면 추출하려는 buffy coat 층이 중간챔버에 모이게 되므로 추출하기가 매우 용이하게 된다.

도1은 종래의 원심분리관의 일 예시도
도2는 종래의 혈액채취백의 일 예시도
도3은 종래의 원심분리관의 일 예시 단면도
도4는 본 발명의 원심분리관의 하나의 실시예 사시도
도5는 본 발명의 원심분리관의 하나의 실시예 사시도
도6은 도4의 A-A선 단면도
도7은 도 5의 C-C선 단면도
도8은 도 4의 B-B선 단면도
도9는 도 5의 D-D선 단면도
도10은 본 발명의 원심분리관의 하나의 실시예 단면도
도11은 본 발명의 원심분리관의 하나의 실시예 단면도
도12는 본 발명의 혈액채취백의 하나의 실시예를 설명하기 위한 도면
도13는 본 발명의 혈액채취백의 하나의 실시예를 설명하기 위한 도면
도14는 본 발명의 혈액채취백의 하나의 실시예를 설명하기 위한 도면
도15는 본 발명의 혈액채취백의 하나의 실시예를 설명하기 위한 도면
도16은 본 발명의 평판 버킷의 사시도
도17는 본 발명의 원심분리관의 사시도
도18는 본 발명의 원심분리관의 하나의 실시예 사시도
도19은 도 17의 A-A선 단면도
도20은 도 18의 C-C선 단면도
도21은 도 17의 B-B선 단면도
도22는 도 17의 D-D선 단면도
도23은 본 발명의 원심분리관의 하나의 실시예의 사시도
도24는 본 발명의 원심분리관의 하나의 실시예의 분해사시도
도25는 본 발명의 원심분리관의 하나의 실시예의 정면도
도26은 도 25의 A-A'선 단면도

발명의 실시를 위한 최선의 형태

도 4 내지 16을 참조하면서 본 발명의 실시예들을 설명한다.

도4는 본 발명의 원심분리관의 일 실시예로서, 원심분리하겨 비중이 제일 무거운 물질이 모이는 하부챔버(50)와, 비중이 중간에 속하는 물질이 모이는 중간챔버(40)와, 비중이 제일 가벼운 물질이 모이는 상부챔버와, 중간챔버 옆에서 이를 지지하고 상부챔버와 하부챔버에 연결된 지지편(80)을 가진다. 이 지지편(80)에는 용액의 체적용량을 확인할 수 있는 눈금이 표기될 수 있다. 지지편(80)은 적어도 하나이상 형성되며, 바람직하게는 세 개가 형성되는 것이 적당하며, 이러한 지지편(80)은 원심분리관의 중간챔버(40) 측면뿐만 아니라 상부챔버(30) 또는 하부챔버(50) 측면에도 형성될 수 있다. 또한 이 지지편(80)에는 용액의 체적용량을 확인할 수 있는 눈금이 표기될 수 있다. 또한 원심분리관의 상부에는 고무나 실리콘, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌이나 PVC 등의 화학적 중합체 소재로서 니들이 관통될 수 있는 마개(90)가 형성되며, 마개(90)는 끼움식 또는 원심분리관(10)에 나사선을 형성하여 이에 대칭되게 나사를 형성하여 돌려서 끼우는 방식 가운데 선택되어질 수 있다.

본 발명의 원심분리관의 구제적인 실시예 중 하나는 다음과 같은 수치를 가진다. 원심분리관의 상부챔버(30)와 중간챔버(40) 하부챔버(50)의 직경과 길이를 일정한 비율로 형성함으로서 종래의 15ml 및 50ml 원심분리관이 삽입되는 모든 원심분리기에 적용하여도, 별도의 장치 등이 필요없이 혈액에서 원하는 성분인 Buffy coat를 손쉽게 중간챔버(40)에 형성하고, 이를 쉽게 추출할 수 있게 한다. 즉 원심분리관의 외경은 15ml용 원심분리 어뎁터에 적용되는 원심분리관의 경우 상부챔버(30)가 16mm±2mm를 유지하되, 하부챔버(50)의 외경 또한 16mm±2mm를 유지하며, 중간챔버(40)의 외경은 6mm±2mm를 유지하며, 하부챔버(50)의 체적은 전체 원심분리관의 체적의 36％를 넘지 않게 형성하되 중간챔버(40)의체적은 전체 원심분리관의 체적의 10％±2％가 되게 형성한다. 또한 50ml 원심분리 버킷에 적용되는 원심분리관의 경우 상부챔버(30)의 외경은 28mm±2mm를 유지하고, 하부챔버(50)의 외경 또한 28mm±5mm를 유지하고, 중간챔버(40)의 외경은 6mm±2mm를 유지하며, 하부챔버(50)의 체적은 전체 원심분리관의 체적의 36％를 넘지 않게 형성하되 중간챔버(40)의체적은 전체 원심분리관의 체적의 10％±2％가 되게 형성한다. 이는 원심분리관에 있어서 지지편(80)의 형성 유무와 상관없이 혈액을 원심분리시에 buffy coat를 항상 중간챔버(40)에 형성시켜 준다.

이러한 원심분리관을 사용하여 혈액 등을 채취하여 원심분리 하였을 경우, 비중이 무거운 적혈구층은 하부챔버(50)에 모이고 백혈구 및 혈소판 등의 Buffy coat층은 중간챔버(40)로 분리되며, 지지편(80)이 원심분리시 발생하는 높은 중력가속도(g)에도 중간챔버(40)가 변형되는 것을 막아준다. 또 마개(90)를 개봉하지 않고도 혈액 등의 생물학적인 액체를 원심분리관에 주입할 수 있게 함으로써 바이러스나 세균의 혼입을 방지할 수 있다. 이는 엄격한 멸균이 요구되는 의료기구나 생물학적 기기에 있어서 패쇄적인 조작을 할 수 있어 검체나 배양물 또는 원심분리물의 오염을 예방할 수 있다.

도 5는 본 발명의 원심분리관의 또 다른 실시예로서, 도 4의 하부챔버 없애고, 중간챔버(40)가 원심분리관의 하부까지 연장된 형태로서 생물학적 용액의 특성에 따라서 선택하여 사용할 수 있도록 한 것이다. 즉 전체적인 비중이 비슷한 소량의 용액을 원심분리하기에 적당하도록 만든 것이다. 이는 좀 더 세밀한 원심분리가 필요한 경우에 사용될 수 있는데, 예를 들어 1차적으로 분리된 혈액에서 적혈구와 혈소판 백혈구의 구성 비율이 비슷할 경우에 사용하게 되면 좀 더 세밀하면서도 쉽게 분리하여 낼 수 있게 된다.

이러한 형태의 원심분리관은 하부까지 연장된 중간챔버(40)의 측면에 형성된 지지편(80)으로 인하여, 원심분리 시 중간챔버(40)에 가해지는 높은 중력가속도(g)의 압력에도 중간챔버(40)가 틀어지거나 흔들리는 것을 방지해 수용되어있는 혈액이 각 성분들의 비중차이에 따라 가지런하게 배열되게끔 하여 좀 더 세밀한 원심분리가 가능해지는 것을 돕는다. 뿐만 아니라 지지편(80)에는 그 직경이 매우 가는 중간챔버(40)의 경우에 이 용액의 체적을 표시하기가 어려울 경우에도 여유 있게 그 용량을 눈금으로 표시해줄 수 있게 한다. 또한 지지편(80)의 말단이 원심분리기의 버킷과 밀착되게 길게 외측으로 연장되는 날개부분을 형성할 수 있으며, 원심분리기에서 꺼내어 평평한 바닥에 세워놓을 수 있어 분리작업을 편리하게 한다.

도6 및 도4의 A-A선 단면도 도7은 도5의 C-C선 단면도를 나타내며, 상부챔버(30) 및 하부챔버(50)의 단면모양이 5각형 형태를 하고 있으나 꼭 5각형일 필요는 없으며 필요에 따라 그 단면모양은 역삼각형 또는 삼각형이거나 사각형에 가까운 모양으로 할 수도 있다. 한편 하부챔버(50)의 바닥면의 두께에 있어서 벽면의 두께보다 얇게 약간 유연성 있게 형성함으로 하여, 만약 Buffy coat층이 상기 하부챔버(50)에 걸려있을시 하부챔버(50)의 바닥면의 유연한 부분을 밀어주어 Buffy coat층을 중간챔버(40) 쪽으로 이동시켜 분리를 쉽게 할 수 있다. 그리고 도5 및 도7에서 나타낸 바와 같이 중간챔버(40)의 측면에 형성된 지지편(80)의 아래 부분은 그 끝이 길게 연장되어 있어 원심분리기의 버킷 내부에 밀착될 수 있게 형성되어 있어 원심분리 시에 원심분리관의 흔들림을 방지하는 역할을 하고 있다.

도8 및 도9는 각각 B-B선 단면도 및 D-D선 단면도이다. 그 직경이 가는 중간챔버(40)의 표면에는 적어도 하나 이상의 지지편(80)이 형성된다.

도10은 좀 더 세밀하게 분리하고자하는 성분이 중간이상에 분포하고 있을 경우에 분리하기 쉽게 위쪽으로 직경이 좁은 중간챔버(40)를 구성한 것을 나타내며, 도13은 전체적으로 적은 량의 용액에서 분리하고자하는 물질을 찾아낼 적에 편리하게 사용할 수 있다. 위 각각의 경우에 있어서 지지편(80)은 원심분리관의 변형 뿐만 아니라 지지편(80)의 연장된 날개부분이 원심분리용 버킷에 밀착됨으로써 흔들림으로 인한 원심분리된 각 성분들의 경계층이 흐트러짐을 방지하게 된다.

도12, 도13, 도14는 본 발명의 혈액채취용 백의 일 예시 도를 나타낸 도면으로서, 혈액을 채취하고 보관할 적에 사용하는 혈액채취백(20)으로서 그 재질은 PVC가 많이 사용되고 있다. 혈액채취백(20)은 각각 상부챔버(31), 중간챔버(41), 하부챔버(51)로 구분되며, 원심분리되면 혈액내의 구성물은 각각의 비중에 따라서 나뉘어지게 된다. 이때 혈액채취백(20)의 중간부분에 형성된 지지편(81)은 원심분리시 발생하는 높은 중력가속도(g)에 의한 직경이 작고 길쭉한 형태의 중간챔버(41)의 찢어짐이나 변형을 막아주며, 각 성분의 분리 채취 작업 시에 중간챔버(41)의 형상을 고정시켜주는 역할도 하게 되므로 Buffy coat층의 출렁임이나 흐트러짐을 방지하여 준다.

도16은 원심분리기의 로터에 걸리는 평판버킷(120)의 사시도로서, 혈액채취백(20)은 상기 평판버킷(120)에 형성된 고리(140)에 걸려 지게 된다. 이때 혈액채취백(20)에 형성된 걸이구멍(100)은 평판버킷(120)의 고리(110)에 대응된다.

한편 원심분리된 혈액에서 혈소판이나 백혈구 층이 모여 있는 Buffy coat층이 만약 하부챔버(51)쪽에 형성되었을 경우에 하부챔버(51)의 아래쪽을 살며시 눌러 주면 상기 Buffy coat층은 살짝 위쪽으로 밀려올라가 중간챔버(41)쪽에서 형성되므로 수월하게 니들이나 모세관등을 이용하여 분리할 수 있으며, 또한 폭이 좁은 즉 직경이 작은 중간챔버(41)에 혈장과 적혈구 혈소판 층이 분리됨으로 인하여 그 경계면을 길쭉한 집게나 압착기, 융착기 등으로 집어서 분리해 둘 수 있으며, 융착기 등을 이용하여 융착하게 되면 상기 원심분리된 혈액성분등을 별도의 각각의 용기 등에 옮겨 담지 않더라도 저장할 수 있고, 또한 도15에서 나타낸 바와 같이 하부입구(92)를 통해서 적혈구를 따로 뽑아낼 수도 있게 된다.

원심분리관에, 특정물질을 침강시키는 수용성 고분자 화합물이나 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque) 등의 분리물질 등을 첨가하거나 헤파린, ACDA, CPDA, EDTA 등의 항 응고물질 또는 트롬빈, 칼슘2가이온, 유리비드 등의 피브린 활성화 물질 또는 항원항체 반응을 이용한 형광표적물질 분리시약 또는 마그네틱 미세비드(magnetic microbead) 등을 미리 첨가하여도 된다. 이상의 설명에서의 도면부호는 도 1 ∼ 16에서 기재된 것을 의미한다.

도17은 본 발명의 원심분리관의 또 다른 실시예로서 혈액 등을 채취하여 원심분리 하였을 경우, 비중이 무거운 적혈구층은 하부챔버(50)에 모이고 백혈구 및 혈소판 등의 Buffy coat층은 중간챔버(40)로 분리되며, 중간챔버(40)의 두께는 원심분리시 발생하는 높은 중력가속도(g)에도 중간챔버(40)가 변형되는 것을 막아주기 위하여 직경이 가는 중간챔버(40)의 두께를 직경이 넓은 다른 상부챔버(30)나 하부챔버(50) 보다 두껍게 형성하여, 높은 중력가속도에도 견딜 수 있게 한 것이다. 또한 상부챔버(30)의 입구 부위는 마개(20)가 결착될 수 있도록 두껍게 형성될 수도 있다. 원심분리관의 상부에는 고무나 실리콘, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌이나 PVC 등의 화학적 중합체 소재로서 니들이 관통될 수 있는 마개(20)가 형성되며, 마개(20)는 끼움식 또는 원심분리관에 나사선을 형성하여 이에 대칭되게 나사를 형성하여 돌려서 끼우는 방식 가운데 선택될 수 있다. 즉 혈액 등의 생물학적인 액체를 원심분리할 시에 마개(20)를 개폐하지 아니하여도 혈액 등의 액체를 원심분리관에 주입할 수 있게 함으로써, 바이러스나 세균의 혼입으로부터 자유롭게 원심분리 할 수 있어 엄격한 멸균이 요구되는 의료기구나 생물학적 기기에 있어서 패쇄적인 조작을 할 수 있어 검체나 배양물 또는 원심분리물의 오염을 예방할 수 있다.

도18는 본 발명 원심분리관의 또 다른 실시예로서 하부챔버를 없애고 중간챔버(40)를 원심분리관의 하부까지 연장된 형태로 만든 것이다. 이것은 생물학적 용액의 특성에 따라서 선택하여 사용할 수 있으며, 전체적인 비중이 비슷한 소량의 용액을 원심분리하기에 적당하다. 이는 좀 더 세밀한 분리를 하기 위하여 사용될 수 있는데 예를 들어 1차적으로 분리된 혈액에서 적혈구와 혈소판 백혈구의 구성 비율이 비슷할 경우에 사용하게 되면 좀 더 세밀하면서도 쉽게 분리하여 낼 수 있게 된다. 하부에 형성된 지지편(80)을 원심분리기의 버킷과 밀착되게 외측으로 길게 연장되게 형성하여 버킷과 밀착시켜 원심분리시 진동을 방지할 수 있으며, 원심분리기에서 꺼내어 평평한 바닥에 세워놓을 수 있게 함으로써, 각 성분의 분리작업을 도와준다.

도19 및 도20는 각각 A-A선 단면도 및 C-C선 단면도를 나타내며, 상부챔버(30) 및 하부챔버(50)의 단면모양이 반드시 5각형일 필요는 없으며 필요에 따라 그 단면모양은 역삼각형 또는 삼각형이거나 사각형에 가까운 모양으로 할 수도 있다. 한편 하부챔버(50)의 두께에 있어서 이를 얇게 약간 유연성 있게 형성함으로 하여, 만약 Buffy coat층이 상기 하부챔버(50)에 걸려있을시 하부챔버(50)를 누름으로써 Buffy coat층을 중간챔버(40) 쪽으로 이동시켜 분리를 쉽게 할 수 있다. 그리고 도18 및 도20에서 나타낸 바와 같이 중간챔버(40)의 아래쪽에 형성된 지지편(80)이 원심분리기의 버킷 내부에 밀착될 수 있게 형성되어 있어 원심분리 시에 원심분리관의 흔들림을 방지하는 역할을 하고 있다.

도21 및 도22는 각각 B-B선 단면도 및 D-D선 단면도이다. 중간챔버(40)의 두께가 상부챔버(30)의 그것과 비교하여 두껍게 형성되어 높은 중력가속도(g)가 가해지는 원심분리시에도 변형이 일어나지 않게 하였으며, 원심분리된 혈액에서 혈소판이나 백혈구 층이 모여 있는 Buffy coat층이 만약 하부챔버(50)쪽에 형성되었을 경우에 하부챔버(50)를 살며시 눌러 주면 상기 Buffy coat층은 살짝 위쪽으로 밀려올라가 중간챔버(40)쪽에서 형성되므로 수월하게 니들이나 모세관등을 이용하여 분리할 수 있게된다. 이상의 설명에서 사용된 도면부호는 도 17 ∼ 22에서 기재된 것을 의미한다.

발명의 실시를 위한 형태

도23은 본 발명의 원심분리관의 하나의 실시예로를 보인 사시도로서, 혈액 등을 채취하여 원심분리하였을 경우, 비중이 무거운 적혈구층은 하부챔버(50)에 모이고 백혈구 및 혈소판 등의 줄기세포가 포함된 Buffy coat층은 중간챔버(40)로 분리되며, 세럼 등의 혈장성분은 상부챔버(30)에 형성되도록 한 것이다.

상부챔버(30)의 어느 일정한 높이의 표면에는 원심분리관에 투입되는 혈액의 양을 지시하는 지시선(100.101) 또는 지시문자, 지시기호 등의 표시부를 가진다. 이때 지시선(100)은 여성의 경우에 투입되는 말초혈액량을 나타내고 지시선(101)은 남성일 경우에 투입되는 말초혈액량을 표시한다. 이는 이렇게 다르게 투입되게 함으로써 하부챔버(50)에 모이는 적혈구의 성분비가 비슷해지기 때문에 남녀에 따른 각각의 별도 원심분리관을 제작하지 않고 공동으로 사용할 수 있게 하기 위함이다.즉, 남여의 혈액 성분 차이에 따라 원심분리관의 적혈구가 분리되는 하부챔버(50)의 체적은 일정하게 형성할 수 있게 된다. 위의 지시선(100, 101)은 하나씩 만 표시하지 아니하고 계량 표시선으로 도 4 및 5에서 중간챔버에 보인 바와 같이, 분량표시선(표시눈금)을 형성하여도 된다. 이때는 각 성분의 부피를 계측하여 볼 수 있도록 하여 더욱 편리하게 사용할 수가 있다. 이 표시선은 중간챔버에 표시한 것으로 도시되어 있지만 상부챔버 및/또는 하부챔버에 표시하여도 된다. 이 표시선에 특별히 남 여 표시를 하여 지지선을 겸하여 사용하도록 하면 된다. 종래에는 도 3에서 보인 바와 같이, 하부챔버(50)에 별도의 플러그(60)를 형성하여 조이고 풀고 하는 방식으로 하부챔버(50)의 체적을 조절하는 방식을 사용하여, 제작비용의 상승을 초래하고, 또 일부에서는 비용 절감을 이유로 플러그(80)를 분리한 뒤 이를 세척하여 멸균 후 재사용하기도 하나, 좁은 나사에 끼어있는 타인의 혈액 등이 완전히 제거되지 아니한 것을 재사용 한다든지 하는 비위생적인 사용의 위험을 초래하기 때문에 본 실시예에서와 같이 하면 이러한 문제를 해결할 수가 있다.

남성과 여성의 적혈구 성분의 비율이 47％ 와 42％를 구성하고 있는 점과 말초혈액의 채취과정에 투입되는 항응고제의 양이 통상 헤파린의 경우 미미한 수준에 지나지 않지만 ACDA 등의 항응고제의 경우 혈액의 약 10-15％ 의 비율로 첨가됨을 감안하여 투입되는 말초혈액을 양을 지시하는 지시선(100,101)을 상부챔버(30)의 표면에 형성한다. 또한 이러한 지시선(100,101)은 남녀에 따라 또는 첨가되는 항응고제의 양에 따라 다르게 투입하게끔 두께 있는 선으로도 표시되며, 이러한 지시선(100,101)은 두께감 있게 표현되어 같은 지시선(100,101)이더라도 선의 높은 쪽은 적은양의 항응고제가 투입된 경우를 지시하고, 선의 아래쪽은 투입된 항응고제가 많을 경우에 적용됨을 지시할 수 도 있다. 또한 도면에는 표시되지 아니하였지만, 색깔이나 기호, 문자로 표시함으로서 분리작업 시 원하는 줄기세포가 포함된 버피코트층이 중간챔버(40)의 어느 한 부분에 위치할 수 있게 함으로써 효율적인 줄기세포의 분리작업이 이루어 질 수 있게 된다. 이러한 지시선(100,101)은 전체의 체적을 표시하는 눈금과 별도로 표기될 수 도 있으며, 전체의 체적을 표시하는 눈금과 같이 표기될 수 도 있다. 지시선(100,101)은 원심분리관에 투입되는 물질이 인간의 말초혈액이 아니라 여타 다른 분리물질에 따라서는 다르게 표시될 수 도 있음은 물론이다.

또 도 24에서 나타낸 바와 같이, 상기 원심분리관의 상부에는 고무나 실리콘, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌이나 PVC 등의 화학적 중합체 소재로서 니들이 관통될 수 있는 마개(20)가 형성되며, 마개(20)는 끼움식 또는 원심분리관에 나사선을 형성하여 이에 대칭되게 나사를 형성하여 돌려서 끼우는 방식 가운데 선택되어질 수 있으며, 마개(20)는 상부가 약간 융기한 형태로 되어있어 니들을 삽입하기 전에 알콜솜 등으로 닦을 적에 캡(90)을 열지 않아도 잘 닦이게 형성하였으며, 그 내부는 반대로 오목하게 형성하였다. 이는 원심분리관 내부의 특정 물질을 수집할 적에 오목한 부위에 모을 수 있게 된다.

또한 마개(20)와 별도로 상부가 열린 캡(90)이 형성되어 마개(20)에 삽입된 니들을 다시 빼낼 적에 마개(20)가 열리는 것을 방지할 수 있는, 상부가 열린 구조로 된 캡(90)이 형성될 수 있다. 캡(90)은 그 내면에 결착홈(81)을 형성하고 이에 대응되는 원심분리관에 있는 결착턱(80)과 맞물려 결합되게 된다. 이와 같이 형성됨으로 인하여 마개(20)나 캡(90)을 개폐하지 아니하여도 말초혈액을 원심분리관에 주입하거나 및 원하는 성분물질의 분리 추출을 할 수 있게 함으로써 바이러스나 세균의 혼입을 방지하게 되는 효과가 있어 엄격한 멸균이 요구되는 의료기구나 생물학적 기기에 있어서 패쇄적인 조작을 할 수 있어 검체나 배양물 또는 원심분리물의 오염을 예방할 수 있다. 여기에서 결착턱(80)과 결착홈(81)은 나사선등으로도 형성될 수 있음은 물론이다. 또한 하부챔버(50)의 두께에 있어서 다른 두 챔버의 두께보다 얇게 약간 유연성 있게 형성함으로 하여, 만약 Buffy coat층이 상기 하부챔버(50)에 걸려있을 시 하부챔버(50)의 바닥면의 유연한 부분을 눌러주어 Buffy coat층을 중간챔버(40) 쪽으로 이동시켜 분리를 쉽게 할 수 있다. 도면에는 나타내지 아니하였지만 직경이 가는 중간챔버(40)의 표면에 지지편을 형성할 수 도 있다.

주사기 니들을 삽입하여 Buffy coat층을 추출하여 내는 방법으로는, 주사시 니들 단부를 Buffy coat층에 도달하도록 삽입한 후 빨아내면 된다. Buffy coat층의 마지막 부분은 하부의 적혈구와 얇은 층으로 경계를 이루게 되는데 이때는 니들 끝으로 중간챔버 벽면 내로 동그라미를 그리듯 회전시키면 원심력에 의하여 무거운 적혈구가 중간챔버 벽면에 붙게 되게 상대적으로 가벼운 Buffy coat층은 중심에 모이게 되는데 이때 니들 단부로 중앙에 모인 Buffy coat층을 흡입하여 내는 방법을 사용하면 Buffy coat층의 나머지 미소량까지 채취할 수 있다.

도 25에서도 나타낸 바와같이, 원심분리관의 표면에는 검체자등의 성명이나 검사일 등이 기록될 수 있는 표시면(110)이 형성된다. 이러한 표시면(110)이 있음으로 인하여 동시에 많은 검사가 이루어 질 경우 검사자는 검체자의 혼돈으로 인한 오진 등을 방지 할 수 있다.

도 26은 도 25의 A-A'선 단면도로써, 원심분리관의 표면에는 결착턱(80)이 형성되고 이에 대응하는 위치의 캡(90)의 내측면에 결착홈(81)이 형성되어 서로 결착됨을 보여주고 있다. 이상의 설명에서 사용된 도면부호는 도 23 ∼ 26에서 기재된 것을 의미한다.

본 발명은 또한 원심분리관에, 특정물질을 침강시키는 수용성 고분자 화합물이나 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque) 등의 분리물질 등을 첨가하거나, 헤파린, ACDA, CPDA, EDTA 등의 항 응고물질 또는 트롬빈, 칼슘2가이온, 유리비드 등의 피브린 활성화 물질 또는 항원항체 반응을 이용한 형광표적물질 분리시약 또는 마그네틱 미세비드(magnetic microbead) 등을 미리 주입시켜서 필요한 용도에 편리하게 사용할 수 있도록 한 것이다.

이상 설명한 바와 같은 여러 가지 실시예를 설명하였는데, 이런 것 외에도 본 발명의 기술사상에 기초한 더욱 많은 다양한 실시예들을 제시할 수 있음은 용이한 일이고, 본 발명의 범위는 이러한 실시 예들도 당연히 포함한다.

산업상 이용가능성

본 발명은 혈액을 원심분리하여 특정한 성분을 분리하고, 그 분리된 성분을 이용하여 의학 생명공학에 이용된다. 본 발명의 기구들은 세포의 분리, 배양 및 재생에 있어서 그 분리과정 중에 일어나는, 생물학적인 것들을 포함하는 오염 등으로 부터 차단되는, 경제적이고 안전하며 효율적인 생물학적 물질 분리에 도움을 준다.

Claims

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내부 공간에 유동물질을 수용하는 외벽을 가지고, 내부에 수용한 유동물질을 비중에 따라 성분을 분리하기 위한 원심분리관으로서,
상부에 입구가 열려 있고 일정한 내부 용적을 가진 상부챔버와,
상기 상부챔버의 하부에 연통되고 상부챔버보다 작은 직경을 가진 중간챔버와,
상기 중간챔버의 외벽에 일체로 부착된 판 형상을 갖는 하나 이상의 지지편을 포함하는 원심분리관.
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청구항 2에 있어서,
상기 지지편은 그 하부가 원심분리기 버킷에까지 연장된 것을 특징으로 하는 원심분리관.
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