CN115895911A - 一种用于驯化野生松桑黄的培养基组合和野生松桑黄的分离驯化培养方法 - Google Patents
一种用于驯化野生松桑黄的培养基组合和野生松桑黄的分离驯化培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于驯化野生松桑黄的培养基组合，包括子实体分离培养基、驯化固体培养基和驯化液体培养基；所述子实体分离培养基包括水、麸皮，马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁；所述驯化固体培养基为包括松木屑、麸皮、玉米面、石膏粉和白糖；所述驯化液体培养基包括马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁。本发明采用上述培养基组合驯化野生松桑黄的效果好，出菇率和转化率高。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌栽培技术领域，尤其是涉及一种用于驯化野生松桑黄的培养基组合和野生松桑黄的分离驯化培养方法。
背景技术
由于野生松桑黄产量低，并随着市场对松桑黄的需求量不断提高，为了满足原料供应，进行人工驯化松桑黄是势在必行的研究课题。食健客研发中心课题组，几年间对松桑黄做了多次分离驯化等工作，取得了可靠成果，填补了人工栽培松桑黄的一项空白。
真正的松桑黄菌是着生在松树干上，子实体药用价值比较大。味甘、辛、微苦，松树桑黄抑瘤率是很高，能达到96.7％～100％，所以松桑黄是当今国际公认的抗肿瘤效果最好的大型真菌之一。
松桑黄的药用价值在国内外引起人们关注，在国际医药市场价格昂贵，由于天然的桑黄数量越来越少，难以形成稳定的原料来源，所以研究开发是十分重要的。
松桑黄功效：用于各种癌症，食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌等，可改善患者的症状，化疗时减轻疼痛，有时可见肿瘤缩小。可明显提高患者的细胞免疫力功能，延长患者的生存期。子实体含齿孔酸等活性物质，是所有真菌中治疗癌症效果最好的品种。松桑黄补肺益肾、散结消肿。治疗肺肾两虚的咳嗽、喘憋，活动后加剧的症状，治疗肺结核的咳嗽.
中国松桑黄集中分布在长白山林区，内蒙古北部。由于北方天气四季分明，土壤营养丰富，所以北方的松桑黄营养价值高，但产量极少，由此看来,松桑黄难以形成商品，满足国内外市场需求。故选用长白山林区优质松桑黄进行分离驯化。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于驯化野生松桑黄的培养基组合，本发明采用上述培养基进行驯化野生松桑黄出菇率和转化率高。
本发明提供了一种用于驯化野生松桑黄的培养基组合，包括子实体分离培养基、驯化固体培养基和驯化液体培养基；
所述子实体分离培养基包括水、麸皮，马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁；
所述驯化固体培养基为包括松木屑、麸皮、玉米面、石膏粉和白糖；
所述驯化液体培养基包括马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁。
优选的，所述子实体分离培养基中水、麸皮，马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁的质量比为：1000：50：100：20：5：2：1；
所述液体培养基中马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁的质量比为：200：20：2：1。
优选的，所述松木屑、麸皮、玉米面、石膏粉和白糖的质量比为73:20:5:1:1。
本发明提供了一种野生松桑黄的分离驯化培养方法，包括如下步骤：
A)将野生松桑黄子实体采用基内菌丝分离法，采用上述技术方案任意一项所述的子实体分离培养基进行培养，分离得到培养的菌丝；
B)将所述菌丝接种至上述技术方案任意一项所述的驯化固体培养基或驯化液体培养基，培养，即得。
优选的，所述步骤A)具体为：
取野生松桑黄子实体，用无菌水冲洗后干制，扒开松桑黄，取断面部位松桑黄子实体，接入到子实体分离培养基中，取试管前后两端菌丝接入到PDA平板培养基上，在恒温培养，当菌丝扩展到6cm，划4～6条对角线，接每个角生长快且壮的菌丝继续转接到PDA试管培养基中继续培养，得到纯菌丝；从分离到纯化，所述菌丝传代培养五代；所述菌丝传代培养至生长速度为5.0～6.0mm/d。
优选的，所述子实体分离培养基的培养具体为25～26℃培养5～7d；所述恒温培养的温度为25～26℃。
优选的，步骤B)将所述菌丝接种至驯化固体培养基培养具体为：
将菌丝置于装有固体培养基的拌料袋中，灭菌，培养，即得；
所述培养的时间为26℃暗光条件下，培养35～45天；
所述灭菌的参数为120℃，压力1.00kg/㎡。
优选的，所述培养后还包括：困菌、低温培养、开口出菇；
所述困菌的天数为20～30天；所述低温培养为5℃培养7～10天；所述开口方式为划横线。
优选的，步骤B)将所述菌丝接种至驯化液体培养基培养具体为：
将菌丝置于液体培养基中，摇床培养，即得；
所述摇床培养为25～26℃、150～170转/min的摇床中培养7～15天。
本发明提供了一种驯化的松桑黄，由上述技术方案任意一项所述的驯化方法驯化得到。
与现有技术相比，本发明提供了一种用于驯化野生松桑黄的培养基组合，包括子实体分离培养基、驯化固体培养基和驯化液体培养基；所述子实体分离培养基包括水、麸皮，马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁；所述驯化固体培养基为包括松木屑、麸皮、玉米面、石膏粉和白糖；所述驯化液体培养基包括马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁。本发明采用上述培养基组合驯化野生松桑黄的效果好，出菇率和转化率高。
附图说明
图1为本发明人在2018年秋季在内蒙古大兴安岭林区的一个落叶松树干上生长的野生松桑黄，即此次分离驯化试验的菌株来源；
图2为配方③菌丝生长阶段图；
图3为无棉盖体拔盖出菇；
图4为划“—”线出菇。
具体实施方式
本发明提供了种用于驯化野生松桑黄的培养基组合和野生松桑黄的分离驯化培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
松桑黄，学名：松针层孔菌，别名：松木层孔菌。菌盖木质，马蹄形，扁平或贝壳型，有同心环棱，初期深咖啡色并有容貌，逐渐变黑色无毛，表面开裂。
驯化：指引入种或移入种在新的环境中经过一定时期的生存适应，在某种程度上改变了固有的一些生物学特性或发展了某些适应性性状，能在新环境中生活、生长，而且能繁殖后代，形成相当规模的种群的过程。
本发明提供了一种用于驯化野生松桑黄的培养基组合，包括子实体分离培养基、驯化固体培养基和驯化液体培养基；
所述子实体分离培养基包括水、麸皮，马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁；
所述驯化固体培养基为包括松木屑、麸皮、玉米面、石膏粉和白糖；
所述驯化液体培养基包括马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁。
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述子实体分离培养基中水、麸皮，马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁的质量比为：1000：50：100：20：5：2：1；
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述液体培养基中马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁的质量比为：200：20：2：1。
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述松木屑、麸皮、玉米面、石膏粉和白糖的质量比为73:20:5:1:1。
本发明提供了一种野生松桑黄的分离驯化培养方法，包括如下步骤：
A)将野生松桑黄子实体采用基内菌丝分离法，采用上述技术方案任意一项所述的子实体分离培养基进行培养，分离得到培养的菌丝；
B)将所述菌丝接种至上述技术方案任意一项所述的驯化固体培养基或驯化液体培养基，培养，即得。
本发明提供的野生松桑黄的分离驯化培养方法首先将野生松桑黄子实体采用基内菌丝分离法，采用上述技术方案任意一项所述的子实体分离培养基进行培养，分离得到培养的菌丝。
按照本发明，所述步骤A)具体为：
取野生松桑黄子实体，用无菌水冲洗后干制，优选可以为用无菌滤纸吸干水分；扒开松桑黄，取断面部位松桑黄子实体(黄豆大小)，接入到子实体分离培养基中，所述子实体分离培养基的培养具体为25～26℃培养5～7d；取试管前后两端菌丝接入到PDA平板培养基上，在恒温培养，所述恒温培养的温度为25～26℃。当菌丝扩展到6cm，划4～6条对角线，接每个角生长快且壮的菌丝继续转接到PDA试管培养基中继续培养，得到纯菌丝；从分离到纯化，所述菌丝传代培养五代；所述菌丝传代培养至生长速度为5.0～6.0mm/d。得到的松桑黄纯菌株可保存待用，也可直接扩大使用。
本发明可以将所述菌丝接种至上述技术方案任意一项所述的驯化固体培养基。
本发明将所述菌丝接种至驯化固体培养基培养具体为：
将菌丝置于装有固体培养基的拌料袋中，灭菌，培养，即得。
本发明所述拌料袋可以选择丙烯袋。本发明对于上述规格不进行限定。
将菌丝置于装有固体培养基的拌料袋中，用无棉盖体封口。用手提高压锅灭菌，温度120℃，压力1.00kg/㎡。灭菌结束后，把菌袋接入无菌净化室，待菌袋温度降至28℃以下时，放入超净工作台内，按要求消毒、接菌结束。每袋可接液体菌20ml-55ml，接好的菌袋移入培养室，在26℃暗光条件下，培养35-45天，菌丝长满袋。
本发明所述培养后还包括：困菌、低温培养、开口出菇。
菌丝长满袋后，使营养积累和出菇前转换，继续困菌20～30天，然后移至零上5℃的低温库进行低温刺激7～10天，再移到出菇室。在空气湿度85％的条件下进行出菇，6月10日到7月10日困菌，8月上旬开始开口，进行催芽出菇管理。所述开口方式优选为划横线。
本发明发现，上述划横线的开口方式可以使得出菇方式取得了好的效果。
本发明将所述菌丝接种至驯化液体培养基培养具体为：
将菌丝置于液体培养基中，摇床培养，即得；
所述摇床培养为25～26℃、150～170转/min的摇床中培养7～15天。
取驯化5代后的松桑黄菌接入到的装置中，可以选择锥形瓶，在25℃，170转/min摇床中培养8天后，再把培养液转接至另外装置中。在26℃，170转/min的摇床中继续培养5天，培养结束，经检测合格，转入出菇代接种培养。
本发明提供了一种驯化的松桑黄，由上述技术方案任意一项所述的驯化方法驯化得到。
本发明提供了一种用于驯化野生松桑黄的培养基组合，包括子实体分离培养基、驯化固体培养基和驯化液体培养基；所述子实体分离培养基包括水、麸皮，马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁；所述驯化固体培养基为包括松木屑、麸皮、玉米面、石膏粉和白糖；所述驯化液体培养基包括马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁。本发明采用上述培养基组合驯化野生松桑黄的效果好，出菇率和转化率高。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的种用于驯化野生松桑黄的培养基组合和野生松桑黄的分离驯化培养方法进行详细描述。
实施例1和对比例1
1.1材料及方法
1.1.1菌株来源
所提供菌株为2018年秋季在内蒙古大兴安岭林区的一个落叶松树干上采集。
1.1.2主要仪器设备与试剂
酸碱度测试仪、20*200试管、Φ70培养皿、量杯、量筒、锥形瓶、紫外线灯管、臭氧发生器、无菌超净工作台、手提高压锅、脱脂棉、酒精灯、酒精、琼脂、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁，均为国产分析纯。
1.1.3培养基配方
①麸皮、马铃薯培养基
水1000ml、麸皮50g，马铃薯100g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，pH自然。
②液体培养基
马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g，pH自然。
③松木屑培养
松木屑73％、麸皮20％、玉米面5％、石膏粉1％、白糖1％。
④阔叶树木屑培养(对比例1培养基)
阔叶木屑53％、松木屑25％、麸皮20％、石膏粉1％、白糖1％。
1.1.4试验方法
野生松桑黄的分离：取野生松桑黄子实体，用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干水分，扒开松桑黄，取断面部位黄豆大小松桑黄子实体，接入到麸皮、马铃薯料面培养基中，26℃培养一星期后，取试管前后两端菌丝接入到PDA平板培养基上，也叫纯化脱毒培养。同样在26℃恒温下培养，当菌丝扩展到6cm左右，划6条对角线，接每个角生长快且壮的菌丝继续转接到PDA试管培养基中继续培养，得到纯菌丝。从分离到纯化，一级种需5次倒转，这时得到的松桑黄纯菌株可保存待用，也可直接扩大使用。
1.1.5野生松桑黄菌丝培养及出菇试验
首先培养液体菌(培养基配方②)，取驯化5代后的松桑黄菌接入到500ml的锥形瓶，装液量300ml，在25℃，170转/min摇床中培养8天后，再把培养液转接至装有2500ml培养液的3000ml规格的锥形瓶中。在26℃，170转/min的摇床中继续培养5天，培养结束，经检测合格，转入出菇代接种培养。
选用配方③、配方④，按要求拌料装袋(袋的规格17cm*35cm)丙烯带，pH值自然，用无棉盖体封口。用手提高压锅灭菌，温度120℃，压力1.00kg/㎡。灭菌结束后，把菌袋接入无菌净化室，待菌袋温度降至28℃以下时，放入超净工作台内，按要求消毒、接菌结束。每袋可接液体菌20ml-55ml，接好的菌袋移入培养室，在26℃暗光条件下，培养35-45天，菌丝长满袋。
松桑黄配方③、配方④菌丝生长情况对比数据(2019.04.18)
备注：两种配方各50袋进行对比。
通过菌丝发育情况对比，配方④菌丝吃料快于配方③，但后期逐渐变慢，而且松桑黄分泌色素少而淡；配方③虽然前期萌发慢，但后期生长浓白、粗壮，松桑黄色素分泌多，为出菇创造了基础，证明了松桑黄长在松树即针叶树上的特点，而不同于其他真菌，只长在阔叶树上。
菌丝长满袋后，使营养积累和出菇前转换，继续困菌20-30天，然后移至零上5℃的低温库进行低温刺激7-10天，再移到出菇室。在空气湿度85％的条件下进行出菇，6月10日到7月10日困菌，8月上旬开始开口，进行催芽出菇管理。
松桑黄开口方式实验(开口时间：8月10日)
结果分析：从此表可以看出，配方③、配方④开口方式两组配方相同，以横线—型方法较准，参照桑黄出菇方式取得了比较好的效果。由于出菇时已进入7月末，温度偏低，就停止出菇，进入休眠阶段。
第二年的6月中旬，又进行出菇管理实验。
松桑黄出菇情况(6月15日)
从出菇情况看，配方③能够及时现芽并继续生产，虽然生长较慢，但大部分能达到成品松桑黄标准，并具有商品价值，实现了从分离驯化到出菇的证明了野生松桑黄可转人工栽培。
而配方④虽然产生新芽，但发生率低，生长速度慢，最终停止生长，菌袋发软，并感染杂菌，最后废掉。
两组配方对比，可以看出松木屑起至关重要作用。
对比例2不同培养基对比试验
新加配方5：
玉米芯51％，棉籽壳30％，麸皮15％，豆粉2％，石膏粉1％，白糖1％。
此配方与松木屑配方相比不同特点的地方是菌丝生长较快，菌丝浓白，转色快，但菌棒不硬实、发软，难以形成菇芽，时间久了即从开口处感染杂菌。
对比例3相同培养基不同比例试验
对照配方3：松木屑73％，麸皮20％，玉米面5％，石膏粉1％，白糖1％
(1)松木屑53％，麸皮40％，玉米面5％，石膏粉1％，白糖1％。
(2)松木屑93％，麸皮5％，石膏粉1％，白糖1％。
配方(1)：降低松木屑，提高氮素麸皮20％。
通过试验，菌丝生长速度慢于对照组，出菇推迟20天，污染率高，达到20％以上，生产上不可取。
配方(2)：降低麸皮比例，取消玉米粉，即提高碳素，降低氮素。
通过试验，生长速度同对照组相同，菌丝生长较弱，出菇时间与对照组相同，但子实体生长与对照组相比，子实体片薄，转化率低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于驯化野生松桑黄的培养基组合，其特征在于，包括子实体分离培养基、驯化固体培养基和驯化液体培养基；
所述子实体分离培养基包括水、麸皮，马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁；
所述驯化固体培养基为包括松木屑、麸皮、玉米面、石膏粉和白糖；
所述驯化液体培养基包括马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁。
2.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述子实体分离培养基中水、麸皮，马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁的质量比为：1000：50：100：20：5：2：1；
所述液体培养基中马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁的质量比为：200：20：2：1。
3.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述松木屑、麸皮、玉米面、石膏粉和白糖的质量比为73:20:5:1:1。
4.一种野生松桑黄的分离驯化培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
A)将野生松桑黄子实体采用基内菌丝分离法，采用权利要求1～3任意一项所述的子实体分离培养基进行培养，分离得到培养的菌丝；
B)将所述菌丝接种至权利要求1～3任意一项所述的驯化固体培养基或驯化液体培养基，培养，即得。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A)具体为：
取野生松桑黄子实体，用无菌水冲洗后干制，扒开松桑黄，取断面部位松桑黄子实体，接入到子实体分离培养基中，取试管前后两端菌丝接入到PDA平板培养基上，在恒温培养，当菌丝扩展到6cm，划4～6条对角线，接每个角生长快且壮的菌丝继续转接到PDA试管培养基中继续培养，得到纯菌丝；从分离到纯化，所述菌丝传代培养五代；所述菌丝传代培养至生长速度为5.0～6.0mm/d。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述子实体分离培养基的培养具体为25～26℃培养5～7d；所述恒温培养的温度为25～26℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B)将所述菌丝接种至驯化固体培养基培养具体为：
将菌丝置于装有固体培养基的拌料袋中，灭菌，培养，即得；
所述培养的时间为26℃暗光条件下，培养35～45天；
所述灭菌的参数为120℃，压力1.00kg/㎡。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养后还包括：困菌、低温培养、开口出菇；
所述困菌的天数为20～30天；所述低温培养为5℃培养7～10天；所述开口方式为划横线。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B)将所述菌丝接种至驯化液体培养基培养具体为：
将菌丝置于液体培养基中，摇床培养，即得；
所述摇床培养为25～26℃、150～170转/min的摇床中培养7～15天。
10.一种驯化的松桑黄，其特征在于，由权利要求4～9任意一项所述的驯化方法驯化得到。
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