CN103409378A - 一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种酪氨酰tRNA合成酶突变体的制备方法及应用；具体涉及一种酪氨酰tRNA合成酶突变体的制备方法及其在放疗、化疗后辅助治疗的应用。本发明所述制备方法简单、快捷，适于产业化生产；此外，本发明的药效学研究，结果表明，所述酪氨酰tRNA合成酶突变体可用于治疗肿瘤放、化疗诱导的血小板减少症。

Description

一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法及应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法及应用；具体涉及一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法及其在放疗、化疗后辅助治疗的应用。

背景技术

目前已知，氨酰 tRNA 合成酶是生命进化过程中最早出现的一类蛋白质，广泛存在于动物、植物、细菌、病毒等各种生物体中；该类酶催化氨基酸转移到相应的 tRNA 上，使氨基酸活化，进而参与蛋白质的合成，保证生命体的严谨性和多样性。特异性氨酰 tRNA 的形成依赖于氨酰 tRNA 合成酶对氨基酸和 tRNA 的正确识别，蛋白质生物合成的特异性主要依赖 tRNA 的反密码子与 mRNA 的密码子正确配对；由于每一种的氨基酸与 tRNA的连接都需要专一性的氨酰 tRNA 合成酶来催化，因此，所述氨酰 tRNA 合成酶的种类与标准氨基酸的数量一样均为 20 种；其中，

所述的氨酰 tRNA 合成酶所催化反应的反应式如下：

氨基酸 + ATP → 氨酰-AMP + PPi

氨酰-AMP + tRNA → 氨酰-tRNA + AMP

总反应式：氨基酸 + tRNA + ATP → 氨酰-tRNA + AMP + PPi

氨基酸是通过其羧基 (-COOH) 与腺苷上的羟基 (-OH) 连接，因此，上述反应为一个酯化反应。

有研究显示，根据序列和活性位点的结构的不同，氨酰 tRNA 合成酶可被分为两大类： I 类含有两个高度保守的序列，该类酶所催化的氨酰化发生在 tRNA 上腺苷的 2'-羟基上，且酶分子通常的活性形式为单体或二聚体，包括 GluRS、GlnRS、ArgRS、CysRS、MetRS、ValRS、IleRS、LeuRS、TyrRS 和 TrpRS，其中 CysRS、MetRS、TyrRS 和 TrpRS 为同源二聚体，其余为单体；II 类含有三个高度保守的序列，该类酶所催化的氨酰化发生在 tRNA 上同一个腺苷的 3'-羟基上，且酶分子通常的活性形式为二聚体或四聚体；例外的是苯丙氨酰 tRNA 合成酶，虽被归类于 II 类，但其催化的氨酰化发生 2'-羟基上；包括 GlyRS、AlaRS、ProRS、SerRS、ThrRS、HisRS、AspRS、AsnRS、LysRS 和 PheRS，其中 AlaRS 为同源四聚体，GlyRS 和 PheRS 异源四聚体，其余为同源二聚体。

研究还指出，几乎所有物种中 20 中氨基酸是保守存在的，但氨酰 tRNA 合成酶及其对应的 tRNA 在进化过程中有较大的改变，酶与 tRNA 的变化是一个相互适应的共同进化的过程；该种结构上的进化使氨酰 tRNA 合成酶及其 tRNA 具有更高的种属特异性和更新的生物功能；随着后基因组时代的到来，氨酰 tRNA 合成酶的结构和功能成为新的研究热点。

美国 Scripps 研究所的 Wakasugi 和 Schimmel 通过研究证明，人酪氨酰 tRNA 合成酶 (TyrRs) 能被断裂成两种具有不同细胞因子活性的片段：C-末端片段和 N-末端片段 (mini TyrRs)；所述C-末端片段在结构功能上与内皮单核细胞激活肽 EMAP II 相类似，其不仅能诱导 MPs 和 PMNs 的迁移，并能刺激 MPs产生肿瘤坏死因子和 PMNs 释放髓过氧化物酶；但只有单独的 C-端结构域才具有细胞因子功能，而全长的 TyrRS 则不具有。所述N-末端片段具有氨基酰化的能力，行使类似 IL-8 的细胞因子功能，能促进血管生成，行使功能主要依靠一个由 3 个氨基酸组成的模体 Glu-Leu-Arg (ELR)，对 ELR 中的氨基酸进行点突变会导致 mini TyrRS 的细胞因子功能丧失，且全长的 TyrRS 不具有IL-8 样的趋化因子功能。有研究获得了mini TyrRS 晶体结构，并对晶体结构解析，发现 mini TyrRS 中关键的 ELR 模体位于催化结构域内部的 α5 螺旋上，位于 α14 螺旋上的 Y₃₄₁ 在氢键网络中起到关键的作用，破坏此氢键网络能使 α5 螺旋释放出来，从而将 ELR 暴露在外边，行使细胞因子活性 (Figure：Domains and Critical Motifs in TyrRS)。

但迄今为止，尚未见有关酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法及其在放疗、化疗后辅助治疗中应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法及应用；具体涉及一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法及其在放疗、化疗后辅助治疗的应用。

本发明的酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤包括：

（1）工程菌高密度发酵

工程菌复苏及摇瓶接种：取出原始祖种子菌，100 级洁净度条件下，在 LBK 平板上接种，37℃ 培养 2-3 天；从平板上挑取单菌落，100 级洁净度条件下接种于 20ml 含 50 μg/ml kanamycin LB培养液中，30℃ 振摇培养 8 小时，至 OD₆₀₀ 为 2，制得一级种子液；将上述一级种子液加入 300 ml LBK 培液中，30℃ 振摇培养 6 小时，至 OD₆₀₀ 为 2，制得二级种子液；

（2）发酵罐及 Sl 培养基高压灭菌

清洗发酵罐 (Bioflow 3000)，安装好各个管道，按校正程序进行 pH 校正，加入 3.2 L S1 培养基，121℃ 1.5kg/cm² 高压灭菌 20 min，冷却至室温；

溶氧 (DO) 电极校正和各种参数设定，发酵罐温度设定为 30℃；无菌条件下，向发酵罐中加入 S2 (32ml)、S3 (160ml)、S4 (320ml) 和 S5 (320ml) 培养基；通入纯氧，搅拌速度设定为 500 rpm，待 DO 稳定后，按 DO 校正程序将此时 DO 值设定为 100%；

设定参数：pH 6.5，DO 50%，搅拌速度设定为与 DO 联动控制，转速范围500-700 rpm；

（3）二级种子液接种培养及 IPTG 诱导酪氨酰 tRNA 合成酶突变体表达

在无菌条件下，将所述二级种子液接种入发酵罐内，通入空气，进行扩增培养；发酵条件设定为温度 30℃、pH 6.5、DO 45%、搅拌速度 500 rpm；

每隔 1 h 取样 5ml，测定 OD₆₀₀;控制 DO 50%±10%，观察 pH、温度、搅拌转速；pH 以氨水调节，随时流加适量消泡剂；至 OD₆₀₀ 30，加入 IPTG 诱导 6 小时，停止发酵，4000 rpm × 20 min 离心，收集菌体；

工程菌在发酵罐内生长至 OD₆₀₀ 30，加入 IPTG (终浓度为 0.5 Mol/L) 诱导目的蛋白表达，诱导 6 小时后，表达量占全菌总蛋白的 50%，每升培液收获湿菌 100g；

（4）纯化酪氨酰 tRNA 合成酶突变体

①高压破菌

菌体用醋酸缓冲液 (NaAc-HAc 0.02 Mol/L，pH5.6) 以 1:10 (w/v) 重悬，将混悬液倒入均质机，300 bar 压力下，完成均质，1000 bar 压力下，完成破菌；10,000 rpm × 30 min 离心，分离上清；

②阳离子交换层析 (洁净度 10000 级，4℃)

层析柱规格为 12.5 cm × 40 cm，填料为 SP-Sepharose Fast Flow，纯化使用 AKTA Explore 系统完成，用 NaAc-HAc (0.02 Mol/L，pH5.6) 平衡，将上述分离得到的上清上样，流速 15ml/min；用 NaAc-HAc (0.02 Mol/L，pH5.6) 冲洗至 OD₂₈₀ 达到基线，流速 15ml/min，用 NaAc-HAc-NaCl (1.0 Mol/L NaCl) 线性梯度洗脱，流速 15ml/min，监测 OD₂₈₀，收集活性组份；

③凝胶过滤层析 (洁净度 10000 级，4℃)

层析柱规格为 12.5 cm × 100 cm，填料为 SephadexG-50，纯化使用 AKTA Explore 系统完成，用 0.02Mol/L PB 平衡，将经过阳离子交换层析收集的样品自动进样，用 0.02 Mol/L PB 洗脱，流速 10ml/min，监测 OD280，收集活性组份；

④阴离子交换层析 (洁净度 10000 级，4℃)

层析柱规格为2.6 cm × 10 cm，填料为 Q-sepharose Fast Flow，纯化使用AKTA Explore 系统完成，用 0.02 Mol/L PB 平衡，经凝胶过滤层析收集的组份上样，流速 15 ml/min，收集上样峰组分；

一次发酵，纯化工艺如表1所示：1 次 5L 规模的发酵，收集菌体 100g，经 3 步纯化，获得纯度 ＞ 95% 的 酪氨酰 tRNA 合成酶突变体 蛋白 350 mg；

表1

	体积 (L)	蛋白浓度(mg/ml)	蛋白总量 (mg)	回收率 (%)
					发酵收集菌体	100 g (重悬1 L)	1.0 mg/ml	1000 mg	0
阳离子交换层析	0.2 L	2.0 mg/ml	400 mg	40%
					凝胶过滤层析	0.3 L	1.33 mg/ml	400 mg	40%
阴离子交换层析	0.15 L	2.33 mg/ml	350 mg	35%

本发明提供了一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法及应用；所述制备方法简单、快捷，适于产业化生产；此外，本发明的药效学研究，结果表明，所述酪氨酰 tRNA 合成酶突变体可用于治疗肿瘤放、化疗诱导的血小板减少症。

附图说明

图 1显示了本发明中所述工程菌经 10 h 扩增培养，OD₆₀₀ 达到 30，IPTG 诱导 6 h，OD₆₀₀ 达到 55。

图 2显示了本发明中所述目的蛋白表达水平约占全菌总蛋白的 50%；其中，

L 1 Marker (14.4-116 kD)，

L 2 诱导前，

L 3-8 0.5 mMol/L IPTG 诱导 1、2、3、4、5 和 6 h。

图 3显示了BCA 法蛋白质含量，其中，所得标准曲线相对系数为 R = 0.9987，计算酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品蛋白浓度为 1mg/ml。

图 4.显示了本发明中Western blot 检测结果，其中，

L 1 Marker (14.4-116 kD)

L 2 IPTG 诱导 6 h 后，收集菌体

L 3 高压均质破菌后的上清

L 4 阳离子交换层析后收集的活性组份

L 5 凝胶过滤层析后收集的活性组份

L 6 阴离子交换层析后的上样峰组份

L 7 Western blot 鉴定酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品

图 5显示了本发明这HPLC 测定结果，其中，

结果显示为一对称单峰，保留时间约为 17 min，纯度 > 95% 

图 6显示了本发明中质谱分析计算得分子量为 59.18 kD，与理论分子量相一致。

图 7显示了酪氨酰 tRNA 合成酶突变体在浓度范围为 10 nMol/L-320 nMol/L 具有氨酰化能力；与浓度、时间均成正比。

图 8显示了辐射后立即注射Tmax及一周后注射Tmax大鼠存活率。

图 9.显示了各组大鼠照射后 1d、7d、14d 和 21d 体重变化。

图10显示了本发明实施例中照射剂量 2Gy 组的结果，其中，

大鼠血小板计数显著下降，在照射后一周左右达到最低水平，大鼠未出现死亡情况，照射后立即给药组的大鼠，血小板下降程度显著减轻，至照射后 18d 外周血血小板计数接近正常水平。

图11显示了发明实施例中照射剂量 4Gy 组的结果，其中，

照射后存活大鼠外周血血小板数量在照射后 7 天达到最低水平。

图12显示了酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品对骨髓巨核细胞数量的影响，其中， 

A 腹腔注射 PBS 组大鼠骨髓内巨核细胞分布，

B 腹腔注射酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品组大鼠骨髓内巨核细胞分布。

图13为骨髓巨核细胞计数分析图。

图14显示了本发明实施例中血常规分析的结果。

图 15显示了本发明实施例中股骨作病理切片，HE 染色和免疫组化的结果，其中，D 11 骨髓切片 HE 染色：

A：TPO，

B：酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品高剂量，

C：阴性对照，

D：假手术组。

图 16显示了本发明实施例中对巨核细胞数目进行统计结果。

图 17显示了本发明实施例中对小鼠骨髓切片进行抗巨核细胞 CD₄₁的免疫组化检测的结果，其中，D 11 免疫组化：

A：TPO，

B：酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品高剂量，

C：阴性对照，

D：假手术组。

图 18显示了本发明实施例中对巨核细胞数目进行统计的结果。

具体实施方式

实施例1

材料和方法

主要设备

（1）超净工作台 (博讯实业有限责任公司)

（2）5L Bioflow3000 发酵罐 (美国 NBS) 

（3）C25KC 摇床 (美国 NBS)

（4）紫外分光光度仪 (BioRad)

（5）冷冻干燥机 (美国FTS)

（6）AKTA explore 纯化系统 (GE Amersham)

（7）高压均质机 (Panda Plus 2000 型，意大利 Niro Soavi)

（8）酶标仪 (perkin Elmer 1420，VICTOR3)。

材料

（1）菌种和质粒：Tmax 高表达菌株 BL21 (F-ompT hsdS (rB-mB-) gal dcm, Novagen)及抗 Tmax 单克隆抗体由美国 aTyr Pharma 提供；

（2）纯化填料：SP-Sepharose Fast Flow；Sephadax-G50；Q-Sepharose Fast Flow (Pharmaei)；

（3）蛋白栋、酵母提取物 (Oxoid)，酪蛋白水解物 (Sigma)；

（4）其余为国产分析纯。

培养基和常用溶液

（1）发酵培养液 M9CA (1.0 L)：S1，Na₂HPO₄ 6g、KH₂PO₄ 35g、NaCl 2.93g；S2，(10×) NH₄Cl 0.4g、Vitmin B 10.88mg；S3，MgSO₄ 1.2g；S4，CA 10g；S5，Glucose 10g、CaCl₂ 11.13mg。S1 121℃ 发酵罐在位消毒 20 分钟，S2 0.22um 微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，S3、S4、S5高压灭菌消毒；

（2）LB 细菌培养基 (1.0 L)：NaCl 10g、Trypton10g、Yeast extract 5g，调节 pH 至 7.0；

（3）LBA 平板 (100 ml)：NaCl1g、Trypton1g、Yeast extract 0.5g、Agar 1.5g、kanamycin 50 μg/ml；

（4）0.2Mol/L NaOH (1.0 L)：8g NaoH 溶于 1.0 L 蒸馏水中；

（5）醋酸缓冲液 (NaAc-HAc，0.02Mol/L，pH5.6，1L)：NaAc 1.483g、HAc 约 5.5ml调至 pH5.6；

（6）1.0Mol/L NaCI (1L)：NaC1 58.6g 溶于 1L 蒸馏水中；

（7）磷酸缓冲液 (0.02Mol/L PB, 1L): Na₂HPO₄ 2.2g，NaH₂PO₄ 0.684g 溶于 1.0 L 蒸馏水中，pH7.4。

制备步骤：

（1）工程菌高密度发酵

工程菌复苏及摇瓶接种：从 -80℃ 中取出原始祖种子菌，100 级洁净度条件下，在 LBK 平板上接种，37℃ 培养 2-3 天；从平板上挑取单菌落，100 级洁净度条件下接种于 20ml 含 50 μg/ml kanamycin LB培养液中，30℃ 振摇培养 8 小时，至 OD₆₀₀ 为 2，制得一级种子液；将上述一级种子液加入 300 ml LBK 培液中，30℃ 振摇培养 6 小时，至 OD₆₀₀ 为 2，制得二级种子液；

（2）发酵罐及 Sl 培养基高压灭菌

清洗发酵罐 (Bioflow 3000)，安装好各个管道，按校正程序进行 pH 校正，加入 3.2 L S1 培养基，121℃ 1.5kg/cm² 高压灭菌 20 min，冷却至室温；

溶氧 (DO) 电极校正和各种参数设定，发酵罐温度设定为 30℃；无菌条件下，向发酵罐中加入 S2 (32ml)、S3 (160ml)、S4 (320ml) 和 S5 (320ml) 培养基；通入纯氧，搅拌速度设定为 500 rpm，待 DO 稳定后，按 DO 校正程序将此时 DO 值设定为 100%；

设定参数：pH 6.5，DO 50%，搅拌速度设定为与 DO 联动控制，转速范围500-700 rpm；

（3）二级种子液接种培养及 IPTG 诱导酪氨酰 tRNA 合成酶突变体表达

在无菌条件下，将二级种子液接种入发酵罐内，通入空气，进行扩增培养；发酵条件设定为温度 30℃、pH 6.5、DO 45%、搅拌速度 500 rpm；

每隔 1 h 取样 5ml，测定 OD₆₀₀;控制 DO 50%±10%，观察 pH、温度、搅拌转速；pH 以氨水调节，随时流加适量消泡剂；至 OD₆₀₀ 30，加入 IPTG 诱导 6 小时，停止发酵，4000 rpm × 20 min 离心，收集菌体；

工程菌在发酵罐内生长至 OD₆₀₀ 30 (如图 1所示)，加入 IPTG (终浓度为 0.5 Mol/L) 诱导目的蛋白表达，诱导 6 小时后，表达量约占全菌总蛋白的 50% (如图 2所示)，每升培液可收获湿菌 100g；

（4）纯化酪氨酰 tRNA 合成酶突变体

①高压破菌

菌体用醋酸缓冲液 (NaAc-HAc 0.02 Mol/L，pH5.6) 以 1:10 (w/v) 重悬，将混悬液倒入均质机，300 bar 压力下，完成均质，1000 bar 压力下，完成破菌；10,000 rpm × 30 min 离心，分离上清；

②阳离子交换层析 (洁净度 10000 级，4℃)

层析柱规格为 12.5 cm × 40 cm，填料为 SP-Sepharose Fast Flow，纯化使用 AKTA Explore 系统完成，用 NaAc-HAc (0.02 Mol/L，pH5.6) 平衡，将上述分离得到的上清上样，流速 15ml/min；用 NaAc-HAc (0.02 Mol/L，pH5.6) 冲洗至 OD₂₈₀ 达到基线，流速 15ml/min，用 NaAc-HAc-NaCl (1.0 Mol/L NaCl) 线性梯度洗脱，流速 15ml/min，监测 OD₂₈₀，收集活性组份；

③凝胶过滤层析 (洁净度 10000 级，4℃)

层析柱规格为 12.5 cm × 100 cm，填料为 SephadexG-50，纯化使用 AKTA Explore 系统完成，用 0.02Mol/L PB 平衡，将经过阳离子交换层析收集的样品自动进样，用 0.02 Mol/L PB 洗脱，流速 10ml/min，监测 OD280，收集活性组份；

④阴离子交换层析 (洁净度 10000 级，4℃)

层析柱规格为2.6 cm × 10 cm，填料为 Q-sepharose Fast Flow，纯化使用AKTA Explore 系统完成，用 0.02 Mol/L PB 平衡，经凝胶过滤层析收集的组份上样，流速 15 ml/min，收集上样峰组分；

一次发酵，纯化工艺如表1所示：1 次 5L 规模的发酵，收集菌体 100g，经 3 步纯化，可获得纯度 ＞ 95% 的 酪氨酰 tRNA 合成酶突变体 蛋白 350 mg；

表1

	体积 (L)	蛋白浓度(mg/ml)	蛋白总量 (mg)	回收率 (%)
					发酵收集菌体	100 g (重悬1 L)	1.0 mg/ml	1000 mg	0
阳离子交换层析	0.2 L	2.0 mg/ml	400 mg	40%
					凝胶过滤层析	0.3 L	1.33 mg/ml	400 mg	40%
阴离子交换层析	0.15 L	2.33 mg/ml	350 mg	35%

；

（5）制备酪氨酰 tRNA 合成酶突变体的注射用粉针剂

在洁净度 100 级的条件下，将纯化后得到的酪氨酰 tRNA 合成酶突变体原液用无菌、无热源注射用水稀释到 1.0 mg/ml，加辅料甘露醇至终浓度为 5%，0.22 μm 微孔过滤；

l.0 ml/瓶分装入 2.0 ml 西林瓶中，经冷冻干燥，制成注射用粉针剂，-20℃保存。

（6）鉴定酪氨酰 tRNA 合成酶突变体

①测定蛋白质含量

采用蛋白标准品 BSA，l.0 mg/ml，利用 BCA 法测定蛋白质含量，具体步骤参照Thermo公司Pierce^?BCA 蛋白定量分析试剂盒进行；标准品浓度系列：100 μg/ml、80 μg/ml、60 μg/ml、40 μg/ml、20 μg/ml、0 μg/ml，分光光度计 (BIO-RAD smartspec TM 3000) 测定对应OD₅₁₂ (如图 3所示)；

②SDS-PAGE

根据《中华人民共和国药典(三部) 》中“SDS-PAGE”的具体方法进行。浓缩胶浓度为 5%，分离胶浓度为 12%，加样 20 μl；电泳条件为稳压，120V，考马斯亮蓝染色，脱色后图象分析系统进行光密度扫描分析 (Image Master VDS)；

③Western blot

12% SDS-PAGE 分离酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品；湿胶转移仪(BIO-RAD) 100 V 条件下转印 90min 至 PVDF 膜，5% 脱脂牛奶 PBS 溶液封闭，洗涤液 (PBS，l.0% Tween20) 洗膜 10 min × 3 次，加第一抗体，兔源抗酪氨酰 tRNA 合成酶突变体单克隆抗体 (l:5000 稀释)，37℃ 孵育 2h，HRP 标记的羊抗兔第二抗体，37℃ 反应 2h，ECL 发光试剂盒 (Amersham pharmaeia Biotech) 发光，ChemiDoc XRS (BIO-RAD) 进行化学发光检测 (如图 4所示)。

④测定N-末端氨基酸序列

与理论值一致，为 MGDAPSPEEKLHLIT。

⑤HPLC-MS 测定纯度及分子量 (结果如图 5、6所示)

样品稀释至 1mg/ml，进样量 20 μl，HPLC 色谱条件选用反相 C18 色谱柱  (3.9mm×15cm，Waters Delta PAK，色谱主机为 Waters2690，Waters2487)；

流动相：流动相 A 水 + 0.1% 三氟乙酸 (TFA)；流动相B：100% 乙腈 + 0.1% TFA，流速为 0.2ml/min，梯度为 100 分钟内流动相 B 从 0% 到 100%。检测波长为 280nm。

⑥测定酪氨酰 tRNA 合成酶突变体的氨基酰化活性

20μl 总体积含 150 μMol/L Tris-HCl (pH 7.8)，150 mMol/L KCl，10 mMol/L MgCl，10 mMol/L β-巯基乙醇，4.0 mMol/L ATP 和 10 μMol/L 酪氨酸 (含3 μMol/L ³H 标记酪氨酸)，5~25 μMol/L 酪氨酰 tRNA 合成酶突变体药品，37℃ 反应 7 min，转移到直径 1.5 cm 圆滤纸片上，放入预冷的 10% 三氯乙酸 50 ml中固定 15 min，再用预冷的 5% 三氯乙酸洗涤 3次，洗去未与 tRNA 结合的氨基酸，再依次用 50ml 无水乙醇，无水乙醚各洗涤一次，使之脱水，滤纸片干燥后分别装入含 5ml 闪烁液 (0.5% PPO，0.05% POPOP 的二甲苯溶液) 的闪烁杯内进行液闪计数；以反应体系中的底物浓度与对应的酶促反应速度为参数，Line weaver-Burk 作图法计算酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品的氨酰化能力 (如图 7所示)。

（7）酪氨酰 tRNA 合成酶突变体用于急性放射损伤中血小板减少症辅助治疗的药效学研究

SD 大鼠，雌雄各半，体重 180 ± 20g (上海斯莱克实验动物有限公司)；

动物给予一次性全身性⁶⁰Co γ射线照射 (剂量为2、4、6 Gy，剂量率 1Gy/min)；

照射后或照射后一周给予动物腹腔注射生理盐水溶解的酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品，注射剂量为 1.0 mg/kg，注射容量为 0.2ml/只；

分组如下：

第1组照射后立即给予酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品 (每照射剂量组各 5 只)，

第2组照射后一周给予酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品 (每照射剂量组各 5 只)，

第3组照射后给予生理盐水组 (每照射剂量组各 5 只)，

第4组不照射而给予酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品 (5只)，

第5组不照射而给予生理盐水组 (5只)；

分组及给药如表2所示，

表2

检测项目和结果：

酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品对照射大鼠存活率及体重的影响，结果如图 8所示，

照射剂量 2Gy 组的大鼠没有出现死亡情况，照射剂量 4Gy 组中，照射后立即注射酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品组的大鼠无死亡情况，照射后一周注射酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品组死亡率为 30%，照射剂量 6Gy 组大鼠陆续死亡。

酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品对照射大鼠体重的影响：照射后 1d、7d、14d 和 21d，大鼠称重，体重变化如图 9所示，

在照射 21d 时，照射剂量 2Gy 组的大鼠体重基本无差异，为 265 ± 10 g，照射剂量 4Gy组中，照射后立即注射酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品组的大鼠体重为 252 ± 14 g，照射后一周注射酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品组体重为 215 ± 20 g，照射剂量 6Gy 组大鼠 190 ± 15g。

酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品对照射大鼠外周血细胞的作用，

外周血血常规分析：照射后 1d、7d、14d 和 21d 尾静脉剪尾取血，血常规分析 (BC2800Vet，全自动动物血液细胞分析仪，迈瑞医疗公司)，

统计学分析：标本的组间差异运用 SPSS 软件进行多因素方差分析 (MANOVA)。

结果显示：

①照射剂量 2Gy 组，大鼠血小板计数显著下降，在照射后一周左右达到最低水平，大鼠未出现死亡情况，照射后立即给药组的大鼠，血小板下降程度显著减轻，至照射后 18d 外周血血小板计数接近正常水平 (如表3和图 10所示)；照射后一周给药组的大鼠，血小板数量下降幅度大，恢复较慢；照射后即使用酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品的大鼠，外周血血小板数量比照射后一周注射药物组得到明显改善，第 7 天，血小板计数分别为 (334.4 ± 75.3 ×10⁹/L) 和 (204.8 ± 67.5 ×10⁹/L)，第14 天，血小板计数为 (526.2 ± 98.2 ×10⁹/L) 显著高于照射后一周给药组(323 ± 87 ×10⁹/L) 及未使用酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品组 (296.6 ± 60.4 ×10⁹/L，p<0.01)；

表3

；

②照射剂量 4Gy 组，照射后存活大鼠外周血血小板数量在照射后 7 天达到最低水平 (如表4及图 11所示)，照射后立即注射及照射后一周注射酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品的大鼠，第 7 天时血小板计数分别为 (178.4 ± 21.5 ×10⁹/L) 和 (100.8 ± 39.1 ×10⁹/L)，第 14 天，血小板计数分别为 (435 ± 90.1 ×10⁹/L) 和 (166.7 ± 55.8 ×10⁹/L)，照射后立即给药组血小板数量恢复较快，差别均具有显著意义，P＜0.05；

表4

；

③照射剂量 6Gy 组，血小板水平维持在较低水平，陆续死亡。

（8）酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品动员骨髓巨核细胞的研究

SD 大鼠腹腔注射酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品 1mg/kg，注射容量为 0.2 ml/只，连续用药 16 d，以生理盐水为对照；

骨髓涂片，巨核细胞计数：大鼠经戊巴比妥那 (40mg/kg) 麻醉，取完整大鼠股骨，用骨剪从膝关节向髋关节处纵剖，使骨髓暴露，记录骨髓颜色及状态，用尖头镊子将骨髓左右混合均匀，用镊子尖部取出骨髓约 0.5 mm³ 进行涂片，将骨髓涂片标本浸泡于 Wright 原液的染缸中静置 2 min，再将骨髓标本移至 5% Giemsa染液中，上下轻振数次，静置 20 min，水洗3-4次，干燥。  

酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品对骨髓巨核细胞数量的影响结果如图 12所示；              

骨髓巨核细胞计数分析结果如图 13所示；

将瑞氏染色干燥后的骨髓涂片，用低倍镜计数巨核细胞，计数 10 个视野内的巨核细胞并取平均值，可观察到用药组大鼠骨髓内巨核细胞数目明显多于对照组 (P<0.05)；

结果表明，大鼠经放射治疗后，预处理给予酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品，经腹腔注射，可动员骨髓巨核细胞，使外周血血小板增殖，有效缓解放射治疗诱导的血小板减少。

（9）酪氨酰tRNA 合成酶用于肿瘤化疗诱导的血小板减少症的药效学研究

BALB/c 小鼠 72 只，雌雄各半，体重为 20±2 g，随机分成 6 组。

处理方式如表5所示，

表5

；

分别于第 1、4、7、11、13、17 天剪尾取血 (50 μL)，血常规分析 (BC2800Vet，全自动动物血液细胞分析仪，迈瑞医疗公司)，重点检测血小板数量变化，结果如图 14所示：

每组取 6 只分别于第 7、11、17 天取股骨作病理切片，HE 染色和免疫组化，结果如图 15所示；

对巨核细胞数目进行统计，结果如图 16所示；

对小鼠骨髓切片进行抗巨核细胞 CD₄₁ 的免疫组化检测，结果如图 17所示；

结果表明，小鼠皮下注射环磷酰胺150 mg/kg制备化疗模型，诱导血小板减少症，预处理给予酪氨酰 tRNA 合成酶突变体样品，经腹腔注射，可使外周血血小板增殖，有效缓解化疗诱导的血小板减少。

Claims (7)

1.一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤包括：

（1）工程菌高密度发酵

工程菌复苏及摇瓶接种：取出原始祖种子菌，100 级洁净度条件下，在 LBK 平板上接种，37℃ 培养 2-3 天；从平板上挑取单菌落，100 级洁净度条件下接种于 20ml 含 50 μg/ml kanamycin LB培养液中，30℃ 振摇培养 8 小时，至 OD₆₀₀ 为 2，制得一级种子液；将上述一级种子液加入 300 ml LBK 培液中，30℃ 振摇培养 6 小时，至 OD₆₀₀ 为 2，制得二级种子液；

（2）发酵罐及 Sl 培养基高压灭菌

清洗发酵罐，安装好各个管道，按校正程序进行 pH 校正，加入 3.2 L S1 培养基，121℃ 1.5kg/cm² 高压灭菌 20 min，冷却至室温；

溶氧DO 电极校正和设定各种参数，发酵罐温度设定为 30℃；无菌条件下，向发酵罐中加入 S2、S3、S4 和 S5培养基；通入纯氧，搅拌速度设定为 500 rpm，待 DO 稳定后，按 DO 校正程序将此时 DO 值设定为 100%；

（3）二级种子液接种培养及 IPTG 诱导酪氨酰 tRNA 合成酶突变体表达

在无菌条件下，将所述二级种子液接种入发酵罐内，通入空气，进行扩增培养；

每隔 1 h 取样 5ml，测定 OD₆₀₀;控制 DO 50%±10%，观察 pH、温度、搅拌转速；pH 以氨水调节，随时流加适量消泡剂；至 OD₆₀₀ 30，加入 IPTG 诱导 6 小时，停止发酵，4000 rpm × 20 min 离心，收集菌体；

工程菌在发酵罐内生长至 OD₆₀₀ 30，加入 IPTG ，终浓度为 0.5 Mol/L，诱导目的蛋白表达，诱导 6 小时后，表达量占全菌总蛋白的 50%，每升培液收获湿菌 100g；

（4）纯化酪氨酰 tRNA 合成酶突变体

①高压破菌

菌体用醋酸缓冲液以 1:10 w/v 重悬，将混悬液倒入均质机，300 bar 压力下，完成均质，1000 bar 压力下，完成破菌；10,000 rpm × 30 min 离心，分离上清；

②阳离子交换层析，洁净度 10000 级，4℃

层析柱规格为 12.5 cm × 40 cm，填料为 SP-Sepharose Fast Flow，纯化使用 AKTA Explore 系统完成，用NaAc-HAc平衡，将上述分离得到的上清上样，流速 15ml/min；用 NaAc-HAc 冲洗至 OD₂₈₀ 达到基线，流速 15ml/min，用 NaAc-HAc-NaCl线性梯度洗脱，流速 15ml/min，监测 OD₂₈₀，收集活性组份；

③凝胶过滤层析，洁净度 10000 级，4℃

层析柱规格为 12.5 cm × 100 cm，填料为 SephadexG-50，纯化使用 AKTA Explore 系统完成，用 0.02Mol/L PB 平衡，将经过阳离子交换层析收集的样品自动进样，用 0.02 Mol/L PB 洗脱，流速 10ml/min，监测 OD280，收集活性组份；

④阴离子交换层析，洁净度 10000 级，4℃

层析柱规格为2.6 cm × 10 cm，填料为 Q-sepharose Fast Flow，纯化使用AKTA Explore 系统完成，用 0.02 Mol/L PB 平衡，经凝胶过滤层析收集的组份上样，流速 15 ml/min，收集上样峰组分；

一次发酵，纯化工艺如下表所示：1 次 5L 规模的发酵，收集菌体 100g，经 3 步纯化，获得纯度 ＞ 95% 的 酪氨酰 tRNA 合成酶突变体 蛋白 350 mg；

  体积 (L) 蛋白浓度(mg/ml) 蛋白总量 (mg) 回收率 (%) 发酵收集菌体 100 g (重悬1 L) 1.0 mg/ml 1000 mg 0 阳离子交换层析 0.2 L 2.0 mg/ml 400 mg 40% 凝胶过滤层析 0.3 L 1.33 mg/ml 400 mg 40% 阴离子交换层析 0.15 L 2.33 mg/ml 350 mg 35%

。

2.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，发酵罐加入的培养基中：S2为32ml、S3为160ml、S4为320ml、S5为320ml。

3.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，设定的参数分别为：pH 6.5，DO 50%，搅拌速度设定为与 DO 联动控制，转速范围500-700 rpm。

4.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，发酵条件为：温度 30℃、pH 6.5、DO 45%、搅拌速度 500 rpm。

5.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）的①中，醋酸缓冲液为NaAc-HAc，0.02 Mol/L，pH5.6。

6.按权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）的②中，NaAc-HAc浓度为0.02 Mol/L，pH5.6；NaAc-HAc-NaCl 为1.0 Mol/L NaCl。

7.权利要求1所述制备方法制得的酪氨酰 tRNA 合成酶突变体在制备治疗肿瘤放、化疗诱导的血小板减少症药物中的用途。

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