CN104630251A

CN104630251A - 一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法

Info

Publication number: CN104630251A
Application number: CN201510050370.0A
Authority: CN
Inventors: 李俊; 徐江; 陈永恒; 陈林; 闫宁宁; 陈主初
Original assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2015-05-20

Abstract

本发明公开了一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法。所述方法包括：1)优化MitTxα及MitTxβ基因序列；2)重组MitTxα及MitTxβ蛋白的表达与复性；3)MitTxα复性后溶液的阳离子交换纯化；4)MitTxβ复性后的阴离子交换纯化；5)将步骤3流穿产物的阳离子交换纯化；6)步骤2和4产物的结合实验。本发明可以得到MitTx蛋白纯品，可用于大规模生产和纯化，节约了纯化成本提高纯化效率。

Description

一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法。该方法通过对MitTx蛋白编码序列进行优化，利用大肠杆菌进行重组表达，表达的蛋白经过复性纯化得到具有生物学活性的重组蛋白。

背景技术

MitTx是Bohlen于2011年从德克萨斯州珊瑚蛇毒液中分离得到，由α和β亚基组成，这2个亚基可以以1:1的非共价方式相互作用(Kd＝12.2±3.1nM)。其中α亚基由61个氨基酸组成，包含3对二硫键，分子量为7.26kD；β亚基包含126个氨基酸，含有7对二硫键，分子量为14.50kD(见图3)。2个亚基本身不能激活感觉神经元，当二者结合后细胞内Ca²⁺浓度很快增加。研究发现，MitTx可以激活同源或异源型酸敏感离子通道蛋白(ASIC)1a(EC₅₀＝9.4±1.3)，1b(EC₅₀＝23±3.6nM)，对ASIC3有弱的作用(EC₅₀＝830nM)。

2014年Gouaux率先解析了小鸡ASIC1a全长与MitTx复合物的晶体结构。结构的解析阐述了一种新的痛觉产生机制，同时也表明MitTX在这种痛觉产生机制上的重要性，因此MitTx蛋白的提取与纯化工艺非常关键。从珊瑚蛇毒液中提取MitTx过程复杂、成本昂贵，加之蛋白产量低，成分复杂等，使科研和应用大大受限。而且，MitTx特别是β亚基分子内半胱氨酸数目多，且都形成了二硫键，这样一来合成折叠非常困难。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法包括如下步骤：

(1)优化MitTxα及MitTxβ的编码序列，优化后的MitTxα的编码序列如SEQ ID NO.1所示，优化后的MitTxβ的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)以优化后的MitTxα的编码序列为基础构建重组载体MitTxα-pET22b；以优化后的MitTxβ的编码序列为基础构建重组载体MitTxβ-pET22b；所述重组载体MitTx α-pET22b的序列如SEQ ID NO.3所示；所述重组载体MitTxβ-pET22b的序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)将重组载体MitTxα-pET22b和重组载体MitTxβ-pET22b转化大肠杆菌，并制备MitTxα包涵体和MitTxβ包涵体；

(4)分别对MitTxα包涵体和MitTxβ包涵体进行复性；将复性后的MitTxα包涵体和MitTxβ包涵体分离纯化，得到MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共价结合，得到重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx。

优选地，步骤(4)所述复性中，MitTxα包涵体的复性条件为：0.2M Arg-HCl(pH 8.8),32mM L-cys，1mM胱氨酸；MitTxβ包涵体的复性条件为：50mM NDSB-201，0.2M Arg-HCl(pH 8.8)；32mM L-cys，1mM胱氨酸。

优选地，步骤(4)所述MitTxα包涵体分离纯化包括透析去沉淀、阳离子交换、分子筛层析的步骤；其中，透析时pH值调为5.0-5.5；MitTxα在mono S 5/50洗脱电导为25ms/cm，在superdex75 10/300上洗脱体积为17.80-18.20mL。

优选地，步骤(4)所述MitTxβ包涵体分离纯化包括透析弃沉淀、阴离子交换、阳离子交换、分子筛层析的步骤；其中，透析时pH值调至8.5-9.0，透析后用Mono Q阴离子交换纯化收集流穿的MitTxβ；Mono Q的流穿MitTxβ再经pH 5.0-5.5的20mM NaAC透析后利用Mono S进一步纯化,洗脱电导为25ms/cm，在superdex7510/300上洗脱体积为13.80-13.90mL。

优选地，步骤(4)所述MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共价结合是将MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白等比例混合，放置10—20min后过Superdex75柱子，洗脱体积为13.46-13.55mL时，得到重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx。

优选地，其步骤(4)所述的所述MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白分别进行非变性凝胶电泳，其MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白以非共价1:1方式结合，且MitTx复合物蛋白比单独MitTxβ蛋白在50mM NaAC体系中迁移率稍快。

所述重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx优化编码序列包括如SEQ ID NO.1所示的MitTxα编码序列和如SEQ ID NO.2所示的MitTxβ编码序列；MitTxα编码序列编码的MitTxα蛋白的序列如SEQ ID NO.5所示，MitTxβ编码序列编码的MitTxβ蛋白的序列如SEQ ID NO.6所示，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白为重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的两个亚基，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共价连接。

下面对本发明作进一步说明：

1优化的基因序列

根据大肠杆菌密码子偏爱性，应用生物信息学软件对已公布的MitTxα及MitTxβ氨基酸序列的编码序列进行不断优化，优化后送至南京金斯瑞合成。其特征在于该基因序列可以高效表达蛋白合成后序列经NdeI和XhoI消化构建于pET22b载体中。所述的含有按照大肠杆菌偏爱密码子优化合成的编码MitTxα及MitTxβ成熟肽的基因序列的载体MitTxα-pUC57及MitTxβ-pUC57，以及由此为基础构建的MitTxα-pET22b及MitTxβ-pET22b重组载体，含有与上述MitTx编码DNA 90％以上的同源性的DNA序列的表达载体，但不限于pET、pBV220、pGEX、pQE等系列载体。

2MitTx包涵体的制备

将MitTx表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达分析。然后进行高密度发酵，当OD600达到16-18时添加终浓度为0.5mM IPTG，37℃诱导3h，收获菌体。对发酵后的细菌进行超声裂解，并反复用裂解buffer(1mg/mL溶菌酶，1％Triton X-100，500mMNaCl，10mM 2-ME)进行反复洗涤3次以上，离心即得到包涵体。

3包涵体的复性

对MitTxα包涵体和MitTxβ包涵体分别进行复性，其特征在于2种蛋白亚基的复性条件。经过复性条件的筛选与优化，最终得到MitTxα包涵体的复性条件最佳为：0.2M Arg-HCl(pH 8.8),32mM L-cys，1mM胱氨酸。MitTxβ复性条件：50mM NDSB-201，0.2M Arg-HCl(pH 8.8)；32mM L-cys，1mM胱氨酸。复性后的包涵体进行分离纯化。4MitTxα纯化

MitTxα纯化至少包括透析去沉淀，阳离子交换，分子筛层析。特征在于透析时pH调为5.0-5.5；该蛋白亚基在mono S 5/50洗脱电导为25ms/cm，superdex75 10/300上洗脱体积为17.80-18.20mL。

5MitTxβ纯化

MitTxβ纯化至少包括透析弃沉淀，阴离子交换，阳离子交换以及分子筛层析。其特征在于复性后先将pH调至8.5-9.0，样品经透析后用Mono Q阴离子交换纯化收集流穿样品；Mono Q的流穿样品再经pH5.0-5.5的20mM NaAC透析后利用Mono S进一步纯化,洗脱电导为25ms/cm左右，superdex75 10/300上洗脱体积为13.80-13.90mL。

6MitTxα和MitTxβ蛋白亚基结合

根据权利4和权利5的要求，进行实验。2种亚基进行等比例混合，放置10-20min后过Superdex75柱子。其特征在于复合物在13.46-13.55mL时洗脱。

7MitTxα和MitTxβ蛋白亚基结合的凝胶迁移实验

根据权利4和权利5的要求MitTxα和MitTxβ的结合实验，其特征在于电泳时选用50mM NaAC，pH 5.0-5.5以及凝胶的配方；另一特征在于电泳时操作方法，包括样品处理，混合样品比例，电泳时间以及电极连接方法。

本发明的目的在于提供一种重组MitTx的制备方法，为大量制备MitTx奠定基础。本发明利用基因工程技术，通过对MitTxα和β亚基的基因编码序列按照大肠杆菌密码子进行优化，实现目的基因在大肠杆菌中高效表达。然后利用蛋白质复性技术使蛋白进行很好地折叠，最后通过特有的纯化方式得到纯度较高且具有生物学活性的蛋白质。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明根据大肠杆菌mRNA密码子的偏爱性进行了序列优化，使蛋白表达量得到提高，之后，对折叠条件进行不断优化，纯化过程不断改进，最终得到了纯度较高具有一定生物学活性的蛋白纯品。这个发明为蛋白表达纯化特别是包涵体的折叠纯化提供了一种思路，具有很重要的理论价值，由于MitTx本身重要性也使得这项发明具有很大的潜在实用价值。本发明可以得到MitTx蛋白纯品，可用于大规模生产和纯化，节约了纯化成本提高纯化效率。

附图说明

图1是优化后MitTxα的基因序列及其编码的氨基酸序列；

图2是优化后MitTxβ的基因序列及其编码的氨基酸序列；

图3是MitTxα和MitTxβ蛋白的二硫键结合方式图；

图4MitTxα和MitTxβ蛋白预表达分析；

图5MitTxα和MitTxβ折叠条件筛选；

图6MitTxα蛋白纯化及电泳图；

图7MitTxβ纯化及电泳图；

图8是MitTxα和MitTxβ结合gel filtration图及其电泳图；

图9是MitTxα和β亚基结合凝胶迁移实验电泳图。

具体实施方式

1.MitTx编码基因的优化合成及重组表达质粒的构建。

根据MitTxα和β亚基的氨基酸序列(图1，图2)，由南京金斯瑞生物公司按照大肠杆菌偏爱密码子优化合成全序列。

利用酶切技术，将目的基因分别从pUC57中切下，并用NdeI和XhoI对pET22b进行双酶切，而后利用T4DNA连接酶及重组技术构建MitTxα-pET22b及MitTxβ-pET22b重组载体。

重组表达载体的预表达分析：挑取单个转化菌落以5mL含100μg/mL Ampicillin的2×YT培养液小量培养至OD₆₀₀≈0.6时，加入IPTG至1mM，继续培养3h诱导蛋白表达，SDS-PAGE分析，以此挑选高表达克隆(如图4所示)。

2、MitTx蛋白的复性及其条件的优化

(1)细菌培养

挑取重组质粒转化的BL21(DE3)菌落接种至50mL含100μg/mL Ampicillin的2×YT培养液中过夜培养，次日2500rpm离心弃去上清，之后用2×YT培养液重悬菌体将其接种至3L发酵液中，37℃培养至OD600至17-19左右(约4-6h)，其间每隔2h测发酵液pH值，当溶液偏酸时用氨水调节pH至7.0左右，并对发酵过程进行监控，根据生长曲线进行补料。当细菌生长至所需OD值时加入终浓度0.5mM的IPTG进行诱导，诱导3h左右离心收集菌体；收集后的菌体置于-20℃保存备用。

(2)包涵体的制备

解冻菌体，加入30mL含有50mM PBS，10mM 2-ME,1％Triton X-100，1mg/mL溶菌酶的裂菌液，吹打菌体混匀，冰上放置15min消化裂解菌体，然后以50％波幅，按照占3s/停12s/总3min的方案，于冰上超声裂解菌体并切断基因组DNA。10000rpm/4℃/10min离心收集沉淀，重复以上步骤1遍，弃上清。然后加入30mL含50mM PBS，10mM2-ME,1％Triton X-100的包涵体洗液，剧烈吹吸沉淀，10000rpm/4℃/5min离心，弃上清，重复上述步骤3次，即得到粗包涵体。

(3)MitTxα及MitTxβ复性条件优化

以30mL含50mM Tris-HCl(pH 8.6),6M盐酸胍，10mM 2-ME的缓冲液溶解包涵体，室温下震荡约2h，使包涵体溶解。配制以下缓冲液，分别含有①1M Tris-HCl(pH～8.8)；②1M胱氨酸；③2M NDSB201；④1M Arginine-Cl(pH9.0)。在以上缓冲液中加入不同浓度的L-半胱氨酸，以此作为折叠液。将溶解后的包涵体加入不同的折叠液中(包涵体和折叠液的体积比为1:50)，混匀后4℃静置24h左右，然后将各个样品离心，4500g超滤上清(截留分子量3kDa)浓缩，浓缩后样品进行电泳分析，观察折叠效果(图5)。最终得到MitTxα复性条件：0.2M Arg-HCl,32mM L-cys，1mM胱氨酸。MitTx β复性条件：50mM NDSB-201，0.2M Arg-HCl(pH8.8)；32mM L-cys，1mM胱氨酸。3MitTx蛋白的纯化

(1)MitTxα蛋白纯化

根据优化后的复性条件进行大量折叠，折叠后的蛋白样品4500g进行超滤浓缩(100 倍左右)，超滤后蛋白样品用pH 5.0NaAC进行透析，透析过夜1000g离心1h弃沉淀；将蛋白样品上清加载于以缓冲液A(20mM NaAC缓冲液，pH 5.0)平衡的Mono S 5/50柱(Pharmacia)，以缓冲液B(20mM NaAC缓冲液，pH 5.0，1M NaCl)经20倍柱体积洗脱至100％B，线性梯度洗脱结合在柱上的蛋白。根据A₂₈₀吸收值确定蛋白峰，收集蛋白峰(图6A)，以非还原SDS-PAGE分析每一步的可溶性蛋白(图6C)。合并Mono S 5/50的洗脱峰蛋白样品进行超滤浓缩，浓缩至250μL左右将蛋白样品用Superdex75 10/300进行分子筛层析(平衡及洗脱buffer为200mM NH₄AC，pH 7.0)，收集洗脱峰蛋白(图6B)；并浓缩成10mg/mL左右；电泳分析纯化效果(图6C)，从图中可以看出该蛋白纯度可达到95％以上。

(2)MitTxβ蛋白纯化

根据优化后的复性条件进行大量折叠，折叠后的蛋白样品4500g进行超滤浓缩(100倍左右)，超滤后蛋白样品先用Tris-Cl(pH9.0)透析过夜1000g离心1h弃沉淀；离心后上清先经Mono Q 5/50纯化，收集Mono Q后流穿样品(图7A)，之后将流穿样品先进行超滤，在用pH 5.0NaAC进行透析，透析后样品再利用Mono S纯化，收集洗脱峰样品(图7B)。合并Mono S洗脱峰样品，利用Superdex75进行进一步纯化(图7C)。纯化后样品分别进行PAGE-SDS电泳分析。

本发明的关键在于MitTxα和MitTxβ的复性，经优化后的复性液配方折叠效果非常好。此外，MitTx毒素的纯化也非常关键，经过摸索，最后才得一个最佳的纯化方案。特别是MitTxβ的纯化，采用常规方法很难达到好的纯化效果，经过不断优化最后终于确定一个好的纯化方案。

4Gel filtration结合实验

将纯化好的MitTxα和MitTxβ蛋白样品分别进行浓度测定，测定后分别按照1:1(图8C)和1:2(图8D)混合，4℃放置10min左右，上superdex75柱观看2个蛋白亚基结合情况；

5EMSA实验

(1)凝胶配制

各组分如表1：

表1

组分	体积
		超纯化水	5mL

30％丙烯酰胺/双叉丙烯酰胺(29:1)	4mL
		0.5M NaAC(pH5.0)	1mL
10％过硫酸铵	100μL
		TEMED	10μL

混匀后灌入玻璃室内，直至短玻璃板0.2mL出，将上样梳插入胶室内，室温放置30-50min后胶聚合，聚合后移去上样梳。

(2)样品制备

根据样品浓度确定上样量，本实验测得蛋白浓度为：MitTx a:(1)0.62mM；MitTxb:0.31mM；为确定蛋白保存buffer及离子强度对蛋白迁移率及结合率影响，本实验采用2种buffer分别为buffer 1：20mM NaAC,150mM NaCl,pH 5.0；buffer 2：20mM Hepes(pH 7.0)。(2)4℃放置2个月后电泳结合(图9，lane 9-12)；

按表2进行配置，混匀后室温放置10-20min后电泳。

表2

编号(6ul)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													Buffer	4.4	3.8	3.2	2.6	4.4	3.8	3.2	2.6	4.4	3.8	3.2	2.6
Buffer+50％glycerol	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
													MitTxα	0.6	0	0.6	1.2	0.6	0	0.6	1.2	0.6	0	0.6	1.2
MitTxβ	0	1.2	1.2	1.2	0	1.2	1.2	1.2	0	1.2	1.2	1.2

(3)电泳

电泳buffer：50mM NaAC，pH5.0

100V电泳3-4h，由于该蛋白在此电泳buffer中带正电，因此电泳时需将电源正负极接反蛋白才能够迁移。

电泳完毕后按常规凝胶染色方法进行染色和脱色(图9)。

Claims

1.一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(2)以优化后的MitTxα的编码序列为基础构建重组载体MitTxα-pET22b；以优化后的MitTxβ的编码序列为基础构建重组载体MitTxβ-pET22b；所述重组载体MitTxα-pET22b的序列如SEQ ID NO.3所示；所述重组载体MitTxβ-pET22b的序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)将重组载体MitTxα-pET22b和重组载体MitTxβ-pET22b转化大肠杆BL21表达菌株，并制备MitTxα包涵体和MitTxβ包涵体；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述复性中，MitTxα包涵体的复性条件为：0.2M Arg-HCl(pH 8.8),32mM L-cys，1mM胱氨酸；MitTxβ包涵体的复性条件为：50mM NDSB-201，0.2M Arg-HCl(pH 8.8)；32mM L-cys，1mM胱氨酸。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述MitTxα包涵体分离纯化包括透析去沉淀、阳离子交换、分子筛层析的步骤；其中，透析时pH值调为5.0-5.5；MitTxα在mono S 5/50洗脱电导为25ms/cm，在superdex7510/300上洗脱体积为17.80-18.2mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述MitTxβ包涵体分离纯化包括透析弃沉淀、阴离子交换、阳离子交换、分子筛层析的步骤；其中，透析时pH值调至8.5-9.0，透析后用Mono Q阴离子交换纯化收集流穿的MitTxβ；Mono Q的流穿MitTxβ再经pH5.0-5.5的NaAC透析后利用Mono S进一步纯化,洗脱电导为25ms/cm在superdex7510/300上洗脱体积为13.80-13.90mL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共价结合是将MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白等比例混合，放置10—20min后过Superdex75柱子，洗脱体积为13.46-13.55mL时，得到重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx。

6.一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx优化编码序列，其特征在于，所述重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx优化编码序列包括如SEQ ID NO.1所示的MitTxα编码序列和如SEQ ID NO.2所示的MitTxβ编码序列；MitTxα编码序列编码的MitTxα蛋白的序列如SEQ ID NO.5所示，MitTxβ编码序列编码的MitTxβ蛋白的序列如SEQ ID NO.6所示，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白为重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的两个亚基，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共价连接。