KR20240005868A - 살균을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 기술은 크로마토그래피 매질 및 지지 장비의 신규한 살균 방법으로서, 아세트산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균/멸균 용액으로 처리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 5월 7일자로 출원된 미국 가출원 63/185,786에 따른 우선권을 주장한다. 상기 가출원의 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
생물제제에 대한 높은 상업적 수요로 인해 제약회사들은 제조 관련 비용을 통제하면서 생산성과 제품 품질을 극대화하는 데 중점을 두게 되었다. 효율성 증진을 위한 이러한 노력으로 친화성 크로마토그래피는 매우 특이적인 결합을 제공하고 미정제 혼합물로부터 관심 분석물을 정제하는 데 필요한 전체 단계 수를 줄임으로써 선두로 부상할 수 있었다. 친화성 크로마토그래피 수지는 기존 정제 기술에 비해 향상된 수율과 순도 표준을 제공한다.
친화성 크로마토그래피를 비롯한 모든 바이오프로세스 크로마토그래피 응용 분야는 오염물 및 불순물 제거에 대한 높은 수준의 제어를 필요로 한다. 이러한 오염물에는 단백질, 탄수화물, 지질, 지질다당류(예를 들어, 내독소), 지질단백질, 핵산, 및/또는 미생물 종이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 거대분자 불순물(예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산 등)은 크로마토그래피 작업의 세척 및 용리 단계에서 다양한 분자간 힘을 활용하고 불순물로부터 표적 분석물을 분리함으로써 해결되는 경우가 많다. 그러나 미생물 오염은 현대식 제조와 관련하여 연장된 수지 수명 동안 증식할 수 있기 때문에 모든 크로마토그래피 작업에 대단한 위협이 된다. 실제로, 미생물 오염은 연속 포획을 위해 크로마토그래피 단계가 생물반응기에 통합되는 처리과정에서 훨씬 더 높은 위험을 초래한다.
일반적으로 크로마토그래피 수지 오염 제거 방법에는 수산화나트륨 및/또는 감마선 조사 처리가 포함된다. 그러나 친화성 수지(예를 들어, 펩티드 기반 리간드에 접합된 수지)는 수산화나트륨 또는 감마선 조사에 노출되면 안정성이 떨어진다.
일 양태에서, 본 개시내용은 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법으로서, 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 카복실산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액과 접촉시키는 단계를 포함하고, 카복실산의 농도는 약 40 mM 내지 약 200 mM인, 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 크로마토그래피 매질에 결합된 표적 분석물을 용리하는 방법으로서, 크로마토그래피 매질을 카복실산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용리 버퍼 용액과 접촉시키는 단계를 포함하고, 카복실산의 농도는 약 40 mM 내지 약 200 mM인, 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법으로서, 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 카복실산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액과 접촉시켜 이 용액의 pH가 3.5 이하가 되도록 하는 단계를 포함하고, 1시간의 용액 처리 이내에 높은 수준의 박테리아, 포자, 및/또는 곰팡이 불활성화 또는 사멸을 제공하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 크로마토그래피 매질에 결합된 표적 분석물을 용리하는 방법으로서, 크로마토그래피 매질을 카복실산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 용리 버퍼 용액과 접촉시켜 이 용액의 pH가 3.5 이하가 되도록 하는 단계를 포함하고, 개선된 생성물 수율 및 피크 첨예도를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 크로마토그래피 매질의 수명을 늘리는 방법으로서, 크로마토그래피 매질을 약 65 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용액으로 살균 또는 멸균하는 단계를 포함하고, (i) 감마선 조사 또는 (ii) 수산화나트륨을 포함하는 버퍼 중 적어도 하나로 크로마토그래피 매질을 살균 또는 멸균하는 것과 비교하여, 크로마토그래피 매질의 수명을 적어도 약 10% 증가시킬 수 있는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 65 mM 아세트산 및 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용액을 제공한다.
일부 구현예에서, 카복실산은 화학식 R1-C(=O)-OH(식에서, R1은 치환 또는 비치환 C1-C12 알킬, 알케닐, 또는 알키닐임)를 갖는다. 일부 구현예에서, 카복실산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 아세트산의 농도는 40~200 mM이다. 일부 구현예에서, 아세트산의 농도는 65 mM이다. 일부 구현예에서, 헥실렌 글리콜의 농도는 8~80%이다. 일부 구현예에서, 헥실렌 글리콜의 농도는 20%이다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피이다.
일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 친화성 리간드는 천연 단백질 A를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 친화성 리간드는 재조합 단백질 A를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 친화성 리간드는 유전자 조작된 단백질 A를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 친화성 리간드는 인공 단백질 A를 기반으로 한다.
일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 G 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A/G 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 L 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 한다.
일부 구현예에서, 살균 용액의 pH는 약 3.0 내지 약 3.5이다. 일부 구현예에서, 살균 용액의 pH는 3.1이다.
일부 구현예에서, 박테리아, 포자, 및/또는 곰팡이 불활성화는 살균 또는 멸균 용액으로의 40분의 처리 이내에 달성된다.
일부 구현예에서, 살균 방법은 폴리펩티드의 정제에 대해 사용된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 재조합 효소이다. 일부 구현예에서, 재조합 효소는 인간 재조합 효소이다. 일부 구현예에서, 재조합 효소는 리소좀 글리코겐 특이적 효소이다. 일부 구현예에서, 재조합 효소는 인간 효소 산 α-글루코시다제(GAA)이다. 일부 구현예에서, 재조합 효소는 미오자임®이다.
도 1은 친화성 크로마토그래피 수지의 결합능에 대한 다양한 살균 방법의 영향을 나타낸 플롯이다.
도 2는 수지 수명에 대한 다양한 살균 방법의 영향을 나타낸 플롯이다.
도 3a 및 도 3b는 수지 수명에 대한 65 mM 아세트산 및 20% 헥실렌 글리콜(AAH 살균 용액)을 포함하는 용액의 영향을 나타낸 플롯이다.
도 4는 실시예 4에 기재된 미생물 사멸 연구의 결과를 나타낸 표이다.
도 5는 용리 버퍼(글리콜 불포함, 20% 에틸렌 글리콜 포함, 또는 20% 헥실렌 글리콜 포함) 중 미오자임®의 용리 프로파일을 나타낸 플롯이다.
도 2는 수지 수명에 대한 다양한 살균 방법의 영향을 나타낸 플롯이다.
도 3a 및 도 3b는 수지 수명에 대한 65 mM 아세트산 및 20% 헥실렌 글리콜(AAH 살균 용액)을 포함하는 용액의 영향을 나타낸 플롯이다.
도 4는 실시예 4에 기재된 미생물 사멸 연구의 결과를 나타낸 표이다.
도 5는 용리 버퍼(글리콜 불포함, 20% 에틸렌 글리콜 포함, 또는 20% 헥실렌 글리콜 포함) 중 미오자임®의 용리 프로파일을 나타낸 플롯이다.
본 기술의 특징, 목적, 및 이점은 하기의 상세한 설명에 명백히 나타나 있다. 그러나, 상세한 설명이 본 기술의 구현예 및 양태를 나타내더라도, 이는 제한하는 것은 아니며 단지 예시로서 제공됨을 인지해야 한다. 본 기술의 범주 내에서의 다양한 변경 및 변형은 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에 사용된 특정 용어의 정의는 하기에 제공된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 일반적으로 본 기술이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
정의
하기에 기재된 모이어티는 치환되거나 비치환될 수 있다. "치환된"은 1개 이상의 추가 R-기, 예컨대 중수소, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 알콕시, 알콕시알킬, 알킬티오, 트리플루오로메틸, 아실옥시, 하이드록시, 하이드록시알킬, 머캅토, 카복시, 시아노, 아실, 아릴옥시, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 아미노, 아미노알킬, 알킬아미노, 디알킬아미노, 모르폴리노, 피페리디노, 피롤리딘-1-일, 피페라진-1-일, 니트로, 포스핀, 포스피네이트, 포스포네이트, 설페이트, =O, =S, 또는 다른 R-기를 사용한 분자 또는 R-기의 수소 원자의 치환을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 경우, 임의로 치환된 기는 기의 각각의 치환가능한 위치에 치환체를 가질 수 있다. 본원에서 고려되는 치환체의 조합은 바람직하게는 안정적이거나(예를 들어, 수분 또는 다른 화학적 반응 조건의 부재 하에서 40℃ 이하의 온도에서 유지될 때 1주 이상 실질적으로 변경되지 않거나), 화학적으로 실현가능한 화합물의 형성을 야기하는 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "카복실산"은 화학식 R1-C(=O)-OH의 화합물을 지칭하며, R1은 수소, 중수소, 할로, 아미노, 하이드록시, 시아노, 포르밀, 푸릴, 니트로, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 알키닐, 할로알키닐, 아실옥시, 알콕시, 할로알콕시, 티오알콕시, 할로티오알콕시, 알카노일, 할로알카노일, 티오알카노일, 할로티오알카노일, 카복시, 카보닐옥시, 할로카보닐옥시, 카보닐티오, 할로카보닐티오, 티오카보닐옥시, 할로티오카보닐옥시, 티오카보닐티오, 할로티오카보닐티오, 및 ―S(O)nR11(n은 0 내지 2이고, R11은 S에 직접 연결됨)이고, R11은 수소, 중수소, 할로, 아미노, 하이드록시, 티올, 시아노, 포르밀, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 알키닐, 할로알키닐, 아실옥시, 알콕시, 할로알콕시, 티오알콕시, 할로티오알콕시, 알카노일, 할로알카노일, 티오알카노일, 할로티오알카노일, 카복시, 카보닐옥시, 할로카보닐옥시, 카보닐티오, 할로카보닐티오, 티오카보닐옥시, 할로티오카보닐옥시, 티오카보닐티오, 및 할로티오카보닐티오로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 카복실산은 아세트산, 시트르산, 석신산, 및 포름산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "글리콜"은 화학식 (R2)(R3)-C(OH)-C(OH)-(R4)(R5)의 화합물을 지칭하며, R2, R3, R4, 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 할로, 아미노, 하이드록시, 시아노, 포르밀, 푸릴, 니트로, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 알키닐, 할로알키닐, 아실옥시, 알콕시, 할로알콕시, 티오알콕시, 할로티오알콕시, 알카노일, 할로알카노일, 티오알카노일, 할로티오알카노일, 카복시, 카보닐옥시, 할로카보닐옥시, 카보닐티오, 할로카보닐티오, 티오카보닐옥시, 할로티오카보닐옥시, 티오카보닐티오, 할로티오카보닐티오, 및 ―S(O)nR11(n은 0 내지 2이고, R11은 S에 직접 연결됨)이고, R11은 수소, 중수소, 할로, 아미노, 하이드록시, 티올, 시아노, 포르밀, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 알키닐, 할로알키닐, 아실옥시, 알콕시, 할로알콕시, 티오알콕시, 할로티오알콕시, 알카노일, 할로알카노일, 티오알카노일, 할로티오알카노일, 카복시, 카보닐옥시, 할로카보닐옥시, 카보닐티오, 할로카보닐티오, 티오카보닐옥시, 할로티오카보닐옥시, 티오카보닐티오, 및 할로티오카보닐티오로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "살균"은 주어진 환경에서 미생물 오염을 감소시키고/시키거나 비활성화하는 처리과정을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 살균은 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 오염시킬 수 있는 미생물의 불활성화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 미생물 증식저지(microbiostatic) 로 간주된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "멸균"은 주어진 환경에서 모든 미생물을 사멸시키거나 제거하는 처리과정을 지칭한다. 일부 구현예에서, 멸균은 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 오염시킬 수 있는 미생물을 완전히 제거하는 것이다. 일부 구현예에서, 멸균은 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 오염시킬 수 있는 미생물을 6 로그를 초과하여 감소시키는 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 살미생물로 간주된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "불활성화"는 미생물 복제를 감소시키거나 억제하는 모든 처리과정을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "사멸"은 세포가 더 이상 생존하거나 번식할 수 없도록 중요한 세포 과정을 영구적으로 종식시키는 임의의 방법을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "완전 사멸"은 배양물을 멸균 용액에 접종하여 인큐베이션한 후(사멸이 발생함), 미생물 성장에 유리한 환경에 플레이팅하면 아무것도 자라지 않아 원래 스파이크의 어떠한 유기체도 멸균 용액에 노출되어 살아남지 못했음을 나타내는 상태를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "변이체"는 숙주 세포 또는 비-천연 숙주 세포에서 재조합적으로 발현되는 특정 단백질의 임의의 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "변이체"는 천연 DNA 서열로부터 재조합적으로 발현된 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "변이체"는 코돈 최적화된 DNA 서열로부터 재조합적으로 발현된 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "변이체"는 재조합적으로 발현된 전장 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "변이체"는 재조합적으로 발현된 절단된 형태의 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "변이체"는 재조합적으로 발현된 돌연변이체 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 단백질은 아미노산 서열 내 하나 이상의 위치에 점 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 용어 "변이체"는 재조합적으로 발현된 조작된 단백질, 예를 들어 유전적으로 조작된 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "변이체"는 재조합적으로 발현된 인공 단백질을 지칭한다.
살균/멸균 용액
일부 구현예에서, 본 기술은 카복실산 및 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 기술은 아세트산을 포함하는 살균 또는 멸균 용액에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 용액은 약 40~200 mM 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 40~200 mM, 약 50~190 mM, 약 60~180 mM, 약 70~170 mM, 약 80~160 mM, 약 90~150 mM, 약 100~140 mM, 또는 약 110~130 mM 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150(또는 이전 값 중 임의의 두 값 사이의 임의의 수) mM 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 65 mM 아세트산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술은 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 용액은 약 8~80% 헥실렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 10~70%, 약 12~60%, 약 14~50%, 약 16~40%, 약 18~30%, 또는 약 20~25% 헥실렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80% 헥실렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술은 아세트산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 기술은 약 40~200 mM 아세트산 및 약 8~80% 헥실렌 글리콜, 약 50~190 mM 아세트산 및 약 10~70% 헥실렌 글리콜, 약 60~180 mM 아세트산 및 약 12~60% 헥실렌 글리콜, 약 70~170 mM 아세트산 및 약 14~50% 헥실렌 글리콜, 약 80~160 mM 아세트산 및 약 16~40% 헥실렌 글리콜, 약 90~150 mM 아세트산 및 약 18~30% 헥실렌 글리콜, 약 100~140 mM 아세트산 및 약 20~25% 헥실렌 글리콜, 또는 약 110~130 mM 아세트산 및 약 20~25% 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 기술은 약 40 mM 아세트산 및 약 8% 헥실렌 글리콜, 약 50 mM 아세트산 및 약 10% 헥실렌 글리콜, 약 60 mM 아세트산 및 약 12% 헥실렌 글리콜, 약 70 mM 아세트산 및 약 14% 헥실렌 글리콜, 약 80 mM 아세트산 및 약 16% 헥실렌 글리콜, 약 90 mM 아세트산 및 약 18% 헥실렌 글리콜, 약 100 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜, 약 110 mM 아세트산 및 약 25% 헥실렌 글리콜, 약 120 mM 아세트산 및 약 30% 헥실렌 글리콜, 약 130 mM 아세트산 및 약 40% 헥실렌 글리콜, 약 140 mM 아세트산 및 약 50% 헥실렌 글리콜, 약 150 mM 아세트산 및 약 60% 헥실렌 글리콜, 약 160 mM 아세트산 및 약 70% 헥실렌 글리콜, 약 170 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜, 약 180 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜, 약 190 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜, 또는 약 200 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 기술은 약 65 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 기술은 pH가 약 3.5인 살균 또는 멸균 용액에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 용액은 pH가 약 3.4, 약 3.3, 약 3.2, 약 3.1, 약 3.0, 또는 약 2.9이다. 일부 구현예에서, 용액은 pH가 약 3.0이다.
일부 구현예에서, 용액은 약 65 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하며, pH는 약 3.0이다.
살균/멸균 방법
일부 구현예에서, 본 개시내용은 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 위한 살균 또는 멸균 방법으로서, 카복실산 및 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액으로 처리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 기술에 의해 해결되는 잠재적 미생물 오염물에는 바이러스, 박테리아, 진균, 및 기생충이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 방법은 높은 수준의 박테리아, 포자, 및/또는 곰팡이 불활성화 또는 사멸을 제공한다.
일부 구현예에서, 미생물 오염물은 바이러스, 예를 들어 DNA 바이러스, RNA 바이러스, 외피 바이러스, 또는 비외피 바이러스이다. 바이러스 오염물의 비제한적인 예에는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 간염 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스, 거대세포 바이러스, 엡스타인바(Epstein-Barr) 바이러스, 및 웨스트 나일(West Nile) 바이러스가 포함된다. 일부 구현예에서, 미생물 오염물은 박테리아, 예를 들어 그람 음성 박테리아, 그람 양성 박테리아, 및/또는 생물막 형성 박테리아이다. 박테리아 오염물의 비제한적 예에는 트레포네마 팔리듐, 네이세리아 고노르호에애, 클라미디아 트라코마티스, 스트렙토코커스 피오게네스, 마이코박테리움 투버쿨로시스, 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 멜리텐시스, 에를리히아, 스타필로코싸이, 스트렙토코싸이, 및 슈도모나스 아에루기노사가 포함된다. 일부 구현예에서, 미생물 오염물은 진균이다. 진균 오염물의 비제한적인 예로는 아스퍼길러스, 페니실륨, 푸사리움, 및 알테르나리아가 있다. 일부 구현예에서, 미생물 오염물은 기생충이다. 기생충 오염물의 비제한적인 예로는 아메바, 플라스모듐, 트리파노소마 크루지, 및 바베시아 마이크로티가 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은, 본 개시내용에 기재된 살균 또는 멸균 용액을 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비와 접촉시킴으로써 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 살균 또는 멸균 용액은 카복실산과 글리콜을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술은 아세트산을 포함하는 살균 또는 멸균 용액을 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비와 접촉시킴으로써 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 용액은 약 40~200 mM 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 40~200 mM, 약 50~190 mM, 약 60~180 mM, 약 70~170 mM, 약 80~160 mM, 약 90~150 mM, 약 100~140 mM, 또는 약 110~130 mM 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150(또는 이전 값 중 임의의 두 값 사이의 임의의 수) mM 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 65 mM 아세트산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술은 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액을 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비와 접촉시킴으로써 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 용액은 약 8~80% 헥실렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 10~70%, 약 12~60%, 약 14~50%, 약 16~40%, 약 18~30%, 또는 약 20~25% 헥실렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80% 헥실렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술은 아세트산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액을 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비와 접촉시킴으로써 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 용액은 약 40~200 mM 아세트산 및 약 8~80% 헥실렌 글리콜, 약 50~190 mM 아세트산 및 약 10~70% 헥실렌 글리콜, 약 60~180 mM 아세트산 및 약 12~60% 헥실렌 글리콜, 약 70~170 mM 아세트산 및 약 14~50% 헥실렌 글리콜, 약 80~160 mM 아세트산 및 약 16~40% 헥실렌 글리콜, 약 90~150 mM 아세트산 및 약 18~30% 헥실렌 글리콜, 약 100~140 mM 아세트산 및 약 20~25% 헥실렌 글리콜, 또는 약 110~130 mM 아세트산 및 약 20~25% 헥실렌 글리콜을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술은 약 40 mM 아세트산 및 약 8% 헥실렌 글리콜, 약 50 mM 아세트산 및 약 10% 헥실렌 글리콜, 약 60 mM 아세트산 및 약 12% 헥실렌 글리콜, 약 70 mM 아세트산 및 약 14% 헥실렌 글리콜, 약 80 mM 아세트산 및 약 16% 헥실렌 글리콜, 약 90 mM 아세트산 및 약 18% 헥실렌 글리콜, 약 100 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜, 약 110 mM 아세트산 및 약 25% 헥실렌 글리콜, 약 120 mM 아세트산 및 약 30% 헥실렌 글리콜, 약 130 mM 아세트산 및 약 40% 헥실렌 글리콜, 약 140 mM 아세트산 및 약 50% 헥실렌 글리콜, 약 150 mM 아세트산 및 약 60% 헥실렌 글리콜, 약 160 mM 아세트산 및 약 70% 헥실렌 글리콜, 약 170 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜, 약 180 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜, 약 190 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜, 또는 약 200 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액을 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비와 접촉시킴으로써 매질 및/또는 장비를 살균 또는 멸균하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 용액은 약 65 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술은 pH가 약 3.5인 살균 또는 멸균 용액을 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비와 접촉시킴으로써 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 용액은 pH가 약 3.4, 약 3.3, 약 3.2, 또는 약 3.1, 약 3.0, 또는 약 2.9이다. 일부 구현예에서, 용액은 pH가 약 3.0이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 살균 용액은 이 용액으로의 약 10시간의 처리 이내에 모든 식물, 생물막 형성, 포자 형성, 및/또는 곰팡이 형성 미생물(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 등)을 비활성화한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 살균 용액은 이 용액으로의 약 0~10시간, 약 0~9시간, 약 0~8시간, 약 0~7시간, 약 0~6시간, 약 0~5시간, 약 0~4시간, 약 0~3시간, 약 0~2시간, 또는 약 0~1시간의 처리 이내에 모든 식물, 생물막 형성, 포자 형성, 및/또는 곰팡이 형성 미생물을 비활성화한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 살균 용액은 이 용액으로의 약 10시간, 약 9시간, 약 8시간, 약 7시간, 약 6시간, 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 또는 약 1시간의 처리 이내에 모든 식물, 생물막 형성, 포자 형성, 및/또는 곰팡이 형성 미생물을 비활성화한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 살균 용액은 이 용액으로의 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 60분, 약 70분, 약 80분, 약 90분의 처리 이내에 모든 식물, 생물막 형성, 포자 형성, 및/또는 곰팡이 형성 미생물을 비활성화한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 살균 용액은 이 용액으로의 약 40분의 처리 이내에 모든 식물, 생물막 형성, 포자 형성, 및/또는 곰팡이 형성 미생물을 비활성화한다. 일부 구현예에서, 본 살균 방법은 살균된 매질 및/또는 장비가 후속적으로 치료 투여용 물질의 검출, 정제, 및/또는 조제에 활용될 수 있도록 하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 멸균 용액은 이 용액으로의 약 10시간의 처리 이내에 모든 식물, 생물막 형성, 포자 형성, 및/또는 곰팡이 형성 미생물(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 등)을 사멸한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 멸균 용액은 이 용액으로의 약 0~10시간, 약 0~9시간, 약 0~8시간, 약 0~7시간, 약 0~6시간, 약 0~5시간, 약 0~4시간, 약 0~3시간, 약 0~2시간, 또는 약 0~1시간의 처리 이내에 모든 식물, 생물막 형성, 포자 형성, 및/또는 곰팡이 형성 미생물을 사멸한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 멸균 용액은 이 용액으로의 약 10시간, 약 9시간, 약 8시간, 약 7시간, 약 6시간, 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 또는 약 1시간의 처리 이내에 모든 식물, 생물막 형성, 포자 형성, 및/또는 곰팡이 형성 미생물을 사멸한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 멸균 용액은 이 용액으로의 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 60분, 약 70분, 약 80분, 약 90분의 처리 이내에 모든 식물, 생물막 형성, 포자 형성, 및/또는 곰팡이 형성 미생물을 사멸한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 멸균 용액은 이 용액으로의 약 40분의 처리 이내에 모든 식물, 생물막 형성, 포자 형성, 및/또는 곰팡이 형성 미생물을 사멸한다. 일부 구현예에서, 본 멸균 방법은 멸균된 매질 및/또는 장비가 후속적으로 치료 투여용 물질의 검출, 정제, 및/또는 조제에 활용될 수 있도록 하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비는 약 0℃ ~ 약 40℃의 온도에서 본 개시내용의 살균 또는 멸균 용액에 노출된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비는 약 0℃ ~ 약 25℃의 온도에서 용액에 노출된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비는 약 0℃ ~ 약 15℃의 온도에서 용액에 노출된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비는 약 0℃ ~ 약 10℃의 온도에서 용액에 노출된다. 일부 구현예에서, 온도는 약 0℃, 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 또는 약 40℃이다. 일부 구현예에서, 온도는 약 20℃이다. 일부 구현예에서, 온도는 약 4℃이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 약 65 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용액(약 pH 3)과 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 약 20℃에서 적어도 약 1시간 동안 접촉시킴으로써 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 약 65 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용액(약 pH 3)과 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 약 20℃에서 적어도 약 40분 동안 접촉시킴으로써 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 일부 구현예에서 크로마토그래피 매질은 컬럼에 충전된 임의의 물질을 의미하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 물질은 수지 또는 입자이다. 일부 구현예에서, 수지는 중합체 지지체 또는 베이스 매트릭스이다. 일부 구현예에서, 중합체 지지체 또는 베이스 매트릭스는 친화성 리간드에 커플링된다. 일부 구현예에서, 중합체 지지체 또는 베이스 매트릭스는 아가로스, 셀룰로스, 세파로스, 폴리메타크릴레이트, 또는 폴리비닐에테르를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 매질은 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 또는 음이온 교환 크로마토그래피(AEX), 겔 여과 크로마토그래피(크기 배제 크로마토그래피(SEC)라고도 알려짐), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 초임계 유체 크로마토그래피(SFC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC), 고난류 액체 크로마토그래피(HTLC), 순상 크로마토그래피(NPC), 역상 크로마토그래피(RPC), 모세관 액체 크로마토그래피, 전기 크로마토그래피, 멤브레인 크로마토그래피, 모노리스(monolith) 크로마토그래피, 나노 또는 모세관 액체 크로마토그래피에 사용하도록 만들어진 것이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 지지 장비는 크로마토그래피 컬럼, 펌프, 주입기, 상호연결 튜브, 검출기, 샘플 수집기, 믹서, 유량 제한기, 인라인 필터, 밸브, 버블 트랩, 및 기타 모든 액체 접촉 표면으로부터 하나 이상 선택되지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 기술은 크로마토그래피 수지의 기능을 손상시키지 않거나 수지의 수명 성능을 약화시키지 않는다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 살균 또는 멸균 용액은 독성이 낮고, 불연성이며, 단백질 응집을 유발하지 않고/않거나 펩티드 친화성 리간드에 적당하다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 살균 또는 멸균 용액은 생물막을 관통한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 살균 또는 멸균 용액은 습윤성이 높고, 높은 습윤성은 크로마토그래피 매질 자체, 즉 크로마토그래피 비드 및 비드 기공 전반에 걸쳐 효율적인 분포를 가능하게 한다.
샘플 제조
일부 구현예에서, 본 기술은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플과 같은 임의의 소스 샘플로부터 하나 이상의 관심 분석물의 정제 및/또는 검출에 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 인간, 동물, 식물, 미생물, 또는 임의의 살아 있는 세포기관으로부터의 샘플, 예컨대 세포 및 조직 배양물, 조직 생체검사, 전혈, 건조 혈액 반점, 혈장, 탈단백질 혈장, 혈청, 탈단백질 혈청, 복수액, 정액, 객담, 뇨, 대변, 땀, 타액, 담즙, 눈물, 뇌척수액, 신체 부위로부터의 스왑(swab), 피부, 및 모발일 수 있다. 일부 구현예에서, 환경적 샘플은 공기 샘플, 토양 샘플, 물 샘플, 식품 샘플, 및 임의의 물질 샘플일 수 있다. 일부 구현예에서, 소스 샘플은 세포 배양물로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 소스 샘플은 세포 배양 상청액으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 소스 샘플은 세포 용해물로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 관심 분석물은, 예를 들어 소 분자, 예컨대 약물 물질 및 마크로분자, 예컨대 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 지질 또는 지방산, 탄수화물, 지질단백질, 지질다당류(예를 들어, 내독소), 호르몬, 비타민, 스테로이드, 및 대사산물일 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 분석물은 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 효소 또는 재조합 효소이다. 일부 구현예에서, 재조합 효소는 인간 재조합 효소이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 재조합 효소는 리소좀 글리코겐 특이적 효소, 인간 효소 산 α-글루코시다제(GAA), 알글루코시다제 알파, 아발글루코시다제 알파(neoGAA), 미오자임®, 루미자임®, 파브라자임®, 세레자임®, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 인자 VIII(FVIII), 인자 IX(FIX), 또는 산성 스핑고미엘리나제(ASM)이나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 비효소 단백질, 예를 들어 구조 단백질(예를 들어, 콜라겐), 수송 단백질(예를 들어, 헤모글로빈), 조절 단백질(예를 들어, 펩티드 호르몬), 운동 단백질(예를 들어, 미오신), 또는 면역 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 항체, 예를 들어 단일클론 항체(mAb), 다클론 항체(pAb), 이중특이적 항체(BsAb), 삼중특이적 항체(TsAb), 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 항체는 재조합 단일클론 항체이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 단편"은 당해 부위가 유래된 전체 항체와 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. "항원 결합 단편"의 예로는 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, dAb 단편, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), scFv, 및 디아바디를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 방법을 소스 샘플에 적용하기 전에 대부분의 오염물 및 간섭 물질이 제거된다. 일부 구현예에서, 관심 분석물은 여과, 침전, 원심분리, 추출, 희석, 또는 이들의 조합으로 농축되고 단리된다. 일부 구현예에서, 관심 분석물은 고상 추출(SPE)에 의해 소스 샘플로부터 농축된다. SPE는 샘플 제조 카트리지를 사용하여 관심 분석물을 농축한다. 분석물을 함유하는 SPE 추출물은 건조되어 크로마토그래피 시스템과 호환되는 용매 시스템에서 재구성될 수 있다.
일부 구현예에서 관심 분석물은 액체-액체 추출(LLE)에 의해 소스 샘플로부터 추출된다. LLE는 2개의 비혼화성 또는 부분 혼화성 액체, 일반적으로 물과 같은 극성 용매 및 비극성 유기 용매에서 상대적 용해도를 기준으로 분석물을 분리하는 데 사용된다. 먼저 표적 분석물을 용매로 분배한 후 추출하고, 농축하고, 희석한다.
일부 구현예에서, 관심 분석물은 고체 지지 액체-액체 추출(SLE)에 의해 소스 샘플로부터 추출된다. SLE에서, 소스 샘플의 수용액을 규조토를 포함하는 지지체 상으로 로딩한다. 샘플을 지지체에 흡수시킨 후 메틸 tert-부틸 에테르와 같은 유기 추출 용매로 여러 번 세척한다. 관심 분석물을 유기 상으로 분배한 후 건조하여 농축한 후 크로마토그래피 시스템에 적합한 용매에 재구성한다.
일부 구현예에서, 관심 분석물이 단백질인 경우, 이는 단백질 침전 추출(PPE)에 의해 소스 샘플로부터 농축된다. 단백질 침전법에는 탈염, 등전점 침전, 및 유기 용매 추출이 포함될 수 있다. 예를 들어, 소스 샘플은 탈염을 통해 크로마토그래피 시스템에 로딩하기 위해 제조된다. 이러한 단백질 침전 기술은 황산암모늄과 같은 중성 염의 농도 증가에 반응하여 용액에서 "염석(salted out)”되는 단백질에 의존한다. 일부 구현예에서, 소스 샘플은 등전점 침전에 의해 제조되고; 이 방법은 표적 단백질이 아닌 오염물 단백질을 침전하는 데 사용될 수 있다. 등전점(pI)은 단백질의 순(net) 1차 전하가 0이 되는 pH이다. 대부분의 단백질의 경우, pI는 4 내지 6의 pH 범위에 있다. 일부 구현예에서, 염산 및 황산과 같은 무기산이 침전제로서 사용된다. 등전점 침전의 잠재적인 단점은 무기산에 의해 유발되는 비가역적 변성이다.
크로마토그래피
일부 구현예에서, 소스 샘플이 예를 들어 원심분리 및/또는 여과에 의해 처리되면, 정화된 샘플은 크로마토그래피 시스템, 예를 들어 액체 크로마토그래피 시스템에 로딩된다.
액체 크로마토그래피(LC)는 유체 용액(이동상)이 펌핑 작용, 압력, 및/또는 중력에 의해 미분된 물질(정지상)의 컬럼을 통해 투과하여 크로마토그래피 매질의 기공 내 및 이를 통해 확산됨에 따라 유체 용액의 하나 이상의 성분을 선택적으로 보유하는 공정이다. 정지상에 의한 유체 용액 중의 선택적 성분의 보유는 이동상보다 정지상에 대한 성분들의 친화성이 더 높아서 발생한다. 일부 구현예에서, 사용되는 액체 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피(AC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 초임계 유체 크로마토그래피(SFC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC), 고난류 액체 크로마토그래피(HTLC), 순상 크로마토그래피(NPC), 역상 크로마토그래피(RPC), 모세관 액체 크로마토그래피, 전기 크로마토그래피, 막 크로마토그래피, 모노리스 크로마토그래피, 나노 또는 모세관 액체 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 이 기술에 사용되는 액체 크로마토그래피 시스템은 친화성 크로마토그래피(AC)이다.
일부 구현예에서, 관심 분석물은 정지상에 보유되고 후속적으로 용리된다. 일부 구현예에서, 관심 분석물은 보유되지 않고 정지상을 통해 흐른다. 일부 구현예에서, 용리액 또는 용출액 중의 분석물은 보유 시간, 피크 강도, 및 피크 면적을 기준으로 다양한 수단(예를 들어, UV, 형광, 굴절률, 광 산란, 및 전기 전도도)으로 모니터링할 수 있다. 일부 구현예에서, 분석물에 대한 보다 상세한 분석은 질량 분석법과 같은 기술을 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, LC 용매는 비제한적으로, 물, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 에테르, 헥산, 헥실렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 및 유기 용매, 예컨대 탄화수소 용매(예를 들어, 지방족 및 방향족 용매), 유산소 용매(예를 들어, 알코올, 글리콜, 케톤, 알데히드, 글리콜 에테르, 에스테르, 및 글리콜 에테르 에스테르), 및 할로겐화 용매(예를 들어, 염소화 및 브롬화 탄화수소)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, LC 용매는 완충되고, 당업계에서 일상적으로 사용되는 다양한 염 및 완충제, 예를 들어 아세트산나트륨, 아세트산암모늄, 포름산암모늄, 중탄산암모늄, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 포름산, 트리메틸아민, 트리에틸아민 등을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, LC 용매는 또한 Tween, SDS 등과 같은 세제를 포함한다.
친화성 크로마토그래피(AC)
일부 구현예에서, 사용되는 액체 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피이다. 친화성 크로마토그래피는 분자 간의 특정 생물학적 상호작용을 활용한다. 친화성 크로마토그래피에서 통상적으로 활용되는 생물학적 상호작용의 유형에는 항원-항체 상호작용, 단백질-면역글로불린 상호작용, 효소-기질/보조인자/억제제 상호작용, 핵산-핵산 결합 단백질 상호작용, 렉틴-다당류/당단백질 상호작용, 아비딘-비오틴 상호작용, 칼모듈린-칼모듈린 결합 파트너 상호작용, 글루타티온-GST 융합 단백질 상호작용, 금속 이온-폴리-히스티딘 융합 단백질 상호작용, 및 수용체-호르몬 상호작용이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 생물특이적 리간드(친화성 리간드)는 컬럼 내의 고체 지지체(예를 들어, 셀룰로스, 아가로스, 또는 폴리아크릴아미드) 상에 화학적으로 고정되어 미정제 추출물이 컬럼을 통과할 때 리간드(표적 분석물)에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 분자가 흡착된다. 다른 오염물을 씻어낸 후, 결합된 분석물이 지지체로부터 용리되어 원래 샘플로부터 정제된다. 일부 구현예에서, 사용되는 친화성 크로마토그래피는 면역친화성 크로마토그래피(IAC), 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 친화성 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 염료-리간드 친화성 크로마토그래피, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC), 또는 보로네이트 친화성 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 사용되는 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다.
친화성 크로마토그래피 수지는 화학적으로 커플링된 친화성 리간드를 갖는 중합체 지지체를 포함한다. 친화성 리간드는 생물학적 리간드 및 합성 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 리간드는 생물학적 리간드, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드(단백질), 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드(핵산), 조효소, 비타민, 렉틴, 및 항체이다. 일부 구현예에서, 친화성 리간드는 합성 리간드이다. 합성 리간드는 기존 분자 구조(예를 들어, 트리아즈닐 뉴클레오티드 모방체, 퓨린 및 피리미딘 유도체, 비천연 펩티드, 트리아지닐 염료, 기타 트리아진 기반 리간드, 올리고당, 및 보론산 유사체)의 새로운(de novo) 합성 또는 변형에 의해 생성된다.
일부 구현예에서, 친화성 리간드는 펩티드, 소분자, 단백질, 또는 효소에 결합한다. 일부 구현예에서, 효소는 재조합 효소이다. 일부 구현예에서, 재조합 효소는 인간 재조합 효소이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 재조합 효소는 리소좀 글리코겐 특이적 효소, 인간 효소 산 α-글루코시다제(GAA), 알글루코시다제 알파, 아발글루코시다제 알파(neoGAA), 미오자임®, 루미자임®, 파브라자임®, 세레자임®, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 인자 VIII(FVIII), 인자 IX(FIX), 또는 산성 스핑고미엘리나제(ASM)이나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 친화성 리간드는 단백질 A 또는 이의 변이체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 친화성 리간드는 단백질 G 또는 이의 변이체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 친화성 리간드는 단백질 A/G 또는 이의 변이체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 친화성 리간드는 단백질 L 또는 이의 변이체를 기반으로 한다.
단백질 A 친화성 크로마토그래피
단백질 A 친화성 크로마토그래피는 단일클론 항체(mAbs), 다클론 항체(pAbs), 이의 항원 결합 단편, 및 항체 융합 단백질의 정제에 널리 사용된다. 이는 정지상으로서 베이스 매트릭스에 가교된 단백질 A 리간드를 포함하는 단백질 A 친화성 수지를 사용하여 이동상으로부터 하나 이상의 관심 항체를 포획한다. 용어 "단백질 A 리간드"는 천연 단백질 A 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 하는 친화성 리간드를 지칭한다. 42 kDa 세포 표면 단백질인 포도상구균 단백질 A(SpA)는 5개의 상동 면역글로불린 결합 도메인(E, D, A, B, 및 C)을 사용하여 면역글로불린(예를 들어, 면역글로불린 G 또는 IgG)의 Fc 부분에 결합한다.
단백질 G 친화성 크로마토그래피
단백질 G 친화성 크로마토그래피는 단일클론 항체(mAb), 다클론 항체(pAb), 이의 항원 결합 단편, 및 항체 융합 단백질의 정제에 널리 사용된다. 이는 정지상으로서 베이스 매트릭스에 가교된 단백질 G 리간드를 포함하는 단백질 G 친화성 수지를 사용하여 이동상으로부터 하나 이상의 관심 항체를 포획한다. 용어 "단백질 G 리간드"는 천연 단백질 G 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 하는 친화성 리간드를 지칭한다. 2개(또는 3개)의 GA 도메인 및 2개(또는 3개)의 B 도메인을 포함하는 세포벽 단백질인 연쇄상구균 단백질 G는 면역글로불린(예를 들어, 면역글로불린 G 또는 IgG)의 Fc뿐만 아니라 Fab 부분에도 결합한다. 그러나 단백질 G와 Fab 사이의 상호작용은 Fc와의 상호작용보다 훨씬 약하다.
단백질 A/G 친화성 크로마토그래피
단백질 A/G 친화성 크로마토그래피는 단일클론 항체(mAbs), 다클론 항체(pAbs), 이의 항원 결합 단편, 및 항체 융합 단백질의 정제에 널리 사용된다. 이는 정지상으로서 베이스 매트릭스에 가교된 단백질 A/G 리간드를 포함하는 단백질 A/G 친화성 수지를 사용하여 이동상으로부터 하나 이상의 관심 항체를 포획한다. 용어 "단백질 A/G 리간드"는 재조합 단백질 A/G 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 하는 친화성 리간드를 지칭한다. 단백질 A/G는 포도상구균 단백질 A와 연쇄상구균 단백질 G의 항체 결합 도메인을 결합한 약 51 kDa 재조합 융합 단백질이다. 단백질 A/G는 단백질 A의 4개 Fc 결합 도메인 및 단백질 G의 2개의 Fc 결합 도메인을 함유한다. 단백질 A/G는 다양한 종의 다클론 또는 단일클론 항체를 정제하는 데 사용된다.
단백질 L 친화성 크로마토그래피
단백질 L 친화성 크로마토그래피는 단일클론 항체(mAbs), 다클론 항체(pAbs), 이의 항원 결합 단편, 및 항체 융합 단백질의 정제에 널리 사용된다. 이는 정지상으로서 베이스 매트릭스에 가교된 단백질 L 리간드를 포함하는 단백질 L 친화성 수지를 사용하여 이동상으로부터 하나 이상의 관심 항체를 포획한다. 단백질 L은 원래 펩토코커스 마그누스로부터 단리된 약 95 kDa 세포 표면 면역글로불린 결합 단백질이다. 용어 "단백질 L 리간드"는 대장균(Escherichia coli) 또는 임의의 다른 비천연 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 재조합 단백질 L 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 하는 친화성 리간드를 지칭한다.
표적 분석물 정제 방법
일부 구현예에서, 본 개시내용은 세포 배양물로부터 거대분자 분석물(예를 들어, 항체, 효소, 호르몬, 성장 인자, DNA/RNA, 렉틴, 치료성 비외피 바이러스 등)의 정제에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 항체이고, 정제 처리과정은 다음과 같은 단계를 포함한다:
(i) 살균 - 모든 크로마토그래피 매질 및 지지 장비를 AAH 살균 용액으로 사전 살균하며, 살균 방법은 매질 및 장비를 0~40℃, 바람직하게는 15~25℃에서 적어도 1시간 동안 AAH 살균 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
(ii) 채취 - 원심분리, 심층 여과, 미세여과, 및/또는 대체 접선 유동을 수행하여 세포, 세포 파편, 및 기타 불순물을 세포 배양 상청액으로부터 분리한다.
(ii) 친화성 크로마토그래피 - 사전 살균되고 평형화된 친화성 크로마토그래피 수지 상의 중성 pH에서 세포 배양 상층액으로부터 표적 항체를 포획하고, 세척하고, 산성 pH에서 용리한다.
(iii) 바이러스 불활성화 - 표적 항체가 테스트 pH에서 안정적인 경우, 일반적으로 낮은 pH(3.3~3.6)에서 60분 이상의 유지 시간 동안 낮은 pH 레트로바이러스 불활성화를 수행한다.
(iv) 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) - 숙주 세포 단백질(HCP), 항체 응집체, 및 항체 단편을 사전 살균된 양이온 교환 컬럼을 통해 샘플을 통과시켜 제거한다.
(v) 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) - DNA, 침출된 모든 단백질 A, 및 기타 미량 오염물은 사전 살균된 음이온 교환 컬럼을 통해 샘플을 통과시켜 제거한다.
(vi) 소형 바이러스 보유 여과 - 샘플에 대해 바이러스 제거 단계를 수행하여 임의의 오염된 바이러스를 제거한다.
(vii) 한외여과 - 표적 항체를 목적하는 농도로 농축하고 버퍼를 목적하는 제형 버퍼로 교환한다.
일부 구현예에서, 표적 항체는 중합체 지지체, 비드, 또는 막에 화학적으로 접합된 단백질 A 리간드를 포함하는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지 상의 세포 배양 상청액으로부터 포획된다. 일부 구현예에서, 단백질 A 리간드는 천연 단백질 A를 기반으로 한다. 일부 다른 구현예에서, 단백질 A 리간드는 인공 단백질 A를 기반으로 한다. 예를 들어, 인공 단백질 A는 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 A 리간드는 스타필로코커스 아우레우스로부터 추출된 천연 단백질 A를 기반으로 한다. 일부 다른 구현예에서, 단백질 A 리간드는 대장균(Escherichia coli) 또는 브레비바실러스 조시넨시스에서 재조합적으로 발현되는 단백질 A 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 A 리간드는 유전자 조작된 단백질 A(예를 들어, 알칼리성 저항성 단백질 A, 또는 B 또는 C 도메인으로부터 유도된 반복 단위를 함유하는 단백질 A 변이체)를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 A 리간드는 돌연변이체 단백질 A(예를 들어, B 및 C 도메인에 점 돌연변이를 함유하는 단백질 A 변이체)를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 A 리간드는 절단된 단백질 A를 기반으로 한다.
일부 구현예에서, 표적 항체는 중합체 지지체에 화학적으로 접합된 단백질 G 리간드를 포함하는 단백질 G 친화성 크로마토그래피 수지 상의 세포 배양 상청액으로부터 포획된다. 일부 구현예에서, 단백질 G 리간드는 천연 단백질 G를 기반으로 한다. 일부 다른 구현예에서, 단백질 G 리간드는 인공 단백질 G를 기반으로 한다. 예를 들어, 인공 단백질 G는 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 단백질 G 리간드는 C군 또는 G군 스트렙토코싸이로부터 단리된 천연 단백질 G를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 G 리간드는 대장균(Escherichia coli)에서 재조합적으로 발현되는 단백질 G 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 G 리간드는 유전자 조작된 단백질 G(예를 들어, 단백질 G의 비알부민 결합 형태)를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 G 리간드는 돌연변이체 단백질 G를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 G 리간드는 절단된 단백질 G를 기반으로 한다.
일부 구현예에서, 표적 항체는 중합체 지지체에 화학적으로 접합된 단백질 A/G 리간드를 포함하는 단백질 A/G 친화성 크로마토그래피 수지 상의 세포 배양 상청액으로부터 포획된다. 일부 구현예에서, 단백질 A/G 리간드는 대장균(Escherichia coli)에서 재조합적으로 발현되는 단백질 A/G 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 A/G 리간드는 유전자 조작된 단백질 A/G를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 A/G 리간드는 돌연변이체 단백질 A/G를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 A/G 리간드는 절단된 단백질 A/G를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 A/G 리간드는 인공 단백질 A/G를 기반으로 한다.
일부 구현예에서, 표적 항체는 중합체 지지체에 화학적으로 접합된 단백질 L 리간드를 포함하는 단백질 L 친화성 크로마토그래피 수지 상의 세포 배양 상청액으로부터 포획된다. 일부 구현예에서, 단백질 L 리간드는 천연 단백질 L을 기반으로 한다. 일부 다른 구현예에서, 단백질 L 리간드는 인공 단백질 L을 기반으로 한다. 예를 들어, 인공 단백질 L은 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 단백질 L 리간드는 펩토코커스 마그누스로부터 단리된 천연 단백질 L을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 L 리간드는 대장균(Escherichia coli)에서 재조합적으로 발현되는 단백질 L 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 L 리간드는 유전자 조작된 단백질 L을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 L 리간드는 돌연변이체 단백질 L을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 단백질 L 리간드는 절단된 단백질 L을 기반으로 한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학적 용어 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기술되어 있지만, 본원에 기술되어 있는 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 또한 본 개시내용의 실시 또는 교시에 사용될 수 있다. 상충되는 경우, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다. 일반적으로, 본원에 기술되어 있는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의학 및 제약 화학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 이들의 기법은 당업계에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 사양서에 따라 수행되거나, 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 본 명세서 및 구현예 전반에 걸쳐, 단어 "가지다" 및 "포함하다", 또는 "갖다", "가지고 있는", "포함한다", 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수군을 포함하되, 임의의 기타 정수 또는 정수군을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 여러 문헌이 본원에 인용되지만, 상기 인용은 임의의 이들 문헌이 당업계의 통상의 일반 지식을 형성한다는 것을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.
크로마토그래피 버퍼
일부 구현예에서, 본 기술은 카복실산 및 글리콜을 포함하는 크로마토그래피 버퍼 용액에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 버퍼는 크로마토그래피 매질의 표면으로부터 결합되지 않거나 느슨하게 결합된(예를 들어, 비특이적 상호작용을 통해) 단백질 및/또는 기타 오염물을 세척하는 데 사용될 수 있는 세척 버퍼이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 버퍼는 크로마토그래피 매질 표면으로부터 결합된 표적 분석물(예를 들어, 항원, 항체, 효소 등)을 제거하는 데 사용될 수 있는 용리 버퍼이다.
일부 구현예에서, 본 기술은 아세트산을 포함하는 용리 버퍼 또는 세척 버퍼에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 버퍼는 약 40~200 mM 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 버퍼는 약 40~200 mM, 약 50~190 mM, 약 60~180 mM, 약 70~170 mM, 약 80~160 mM, 약 90~150 mM, 약 100~140 mM, 또는 약 110~130 mM 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 버퍼는 약 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150(또는 이전 값 중 임의의 두 값 사이의 임의의 수) mM 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 버퍼는 약 65 mM 아세트산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술은 헥실렌 글리콜을 포함하는 용리 버퍼 또는 세척 버퍼에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 버퍼는 약 8~80% 헥실렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 버퍼는 약 10~70%, 약 12~60%, 약 14~50%, 약 16~40%, 약 18~30%, 또는 약 20~25% 헥실렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 버퍼는 약 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80% 헥실렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 버퍼는 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술은 아세트산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 용리 버퍼 또는 세척 버퍼에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 기술은 약 40~200 mM 아세트산 및 약 8~80% 헥실렌 글리콜, 약 50~190 mM 아세트산 및 약 10~70% 헥실렌 글리콜, 약 60~180 mM 아세트산 및 약 12~60% 헥실렌 글리콜, 약 70~170 mM 아세트산 및 약 14~50% 헥실렌 글리콜, 약 80~160 mM 아세트산 및 약 16~40% 헥실렌 글리콜, 약 90~150 mM 아세트산 및 약 18~30% 헥실렌 글리콜, 약 100~140 mM 아세트산 및 약 20~25% 헥실렌 글리콜, 또는 약 110~130 mM 아세트산 및 약 20~25% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용리 버퍼에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 기술은 약 40 mM 아세트산 및 약 8% 헥실렌 글리콜, 약 50 mM 아세트산 및 약 10% 헥실렌 글리콜, 약 60 mM 아세트산 및 약 12% 헥실렌 글리콜, 약 70 mM 아세트산 및 약 14% 헥실렌 글리콜, 약 80 mM 아세트산 및 약 16% 헥실렌 글리콜, 약 90 mM 아세트산 및 약 18% 헥실렌 글리콜, 약 100 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜, 약 110 mM 아세트산 및 약 25% 헥실렌 글리콜, 약 120 mM 아세트산 및 약 30% 헥실렌 글리콜, 약 130 mM 아세트산 및 약 40% 헥실렌 글리콜, 약 140 mM 아세트산 및 약 50% 헥실렌 글리콜, 약 150 mM 아세트산 및 약 60% 헥실렌 글리콜, 약 160 mM 아세트산 및 약 70% 헥실렌 글리콜, 약 170 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜, 약 180 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜, 약 190 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜, 또는 약 200 mM 아세트산 및 약 80% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용리 버퍼 또는 세척 버퍼에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 기술은 약 65 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용리 버퍼에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 기술은 pH가 약 3.5인 용리 버퍼 또는 세척 버퍼에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 버퍼는 pH가 약 3.4, 약 3.3, 약 3.2, 또는 약 3.1, 약 3.0, 또는 약 2.9이다. 일부 구현예에서, 버퍼는 pH가 약 3.0이다.
일부 구현예에서, 용리 버퍼 또는 세척 버퍼는 약 65 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하고 pH가 약 3.0이다.
실시예
본 기술이 보다 잘 이해되도록, 하기 실시예가 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 본 기술의 범주를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
실시예 1: 살균 방법이 수지 안정성에 미치는 영향을 평가하기 위한 연구
이 실시예에서는 크로마토그래피 매질의 기능성과 수명/내구성에 대한 다양한 살균 방법의 초기 및 지속적 영향을 평가하기 위한 배치 결합 연구에 대해 설명한다.
방법
화학물질 & 시약
크로마토그래피 매질은 에폭시 결합에 의해 아가로스 베이스 매트릭스에 화학적으로 가교된 친화성 리간드를 포함한다.
시간 경과 분석
시간 경과는 살균 버퍼로 처리 및 감마 방사선 노출을 포함하여, 목적하는 살균 조건 하에서 크로마토그래피 수지 소스 풀을 50% 슬러리로 버퍼 교환하여 정립하였다. 본 연구에 사용된 다양한 살균 버퍼의 조성은 아래 표 1에 기재되어 있다. 지정된 시점에, 1 mL의 수지를 소스 풀에서 제거하고, 버퍼를 평형 버퍼로 교환한 후, 알글루코시다제 알파 약물 물질과 혼합하여 15 mg/mL 수지의 목표 결합능에서의 결합을 테스트하였다. 설정된 시점에서 수지의 결합능을 T0에서의 결합능에 대해 정규화하고 시간 경과에 따라 플롯팅하였다(도 1). 감마선 조사된 수지는 T0에서만 평가하고, 조사가 2, 7 또는 25 kGy/hr 감마선 조사량에 대한 단일 노출이었기 때문에 나이브 수지와 비교하였다.
결과
이 연구에서는 감마선 조사에 노출되면 수지의 결합능이 초기에 20% 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 수산화나트륨 버퍼에 대한 친화성 리간드의 장기 노출은 노출 기간 및 수산화나트륨의 농도에 따라 결합능이 20% 이상 저하되는 결과를 가져왔다. 뜻밖에도, 친화성 리간드는 산성 버퍼(pH = 1.7)에서 훨씬 더 안정적이었고 전체 시간 경과에 걸쳐 대조군(100 mM 아세트산나트륨, pH 5.6)과 결합능이 비슷한 수준으로 유지되는 것으로 나타났다.
실시예 2: 살균 방법이 수지 수명에 미치는 영향을 평가하기 위한 연구
이 실시예에서는 크로마토그래피 매질의 수명 성능에 대한 다양한 살균 방법의 영향을 평가하기 위한 사이클링 연구를 설명한다.
방법
수지의 수명에 대한 살균 방법의 영향을 조사하기 위해 사이클링 연구를 수행하였다. 연속 작동 조건 하에, 1cm 컬럼을 감마선 조사 후 T0에서 25 kGy까지 25회 사이클링하였다. 추가로, 0.66 cm 컬럼을 T0에서 수산화나트륨 및/또는 tween을 포함하는 살균 버퍼로 처리한 후 100회 사이클링하였다.
결과
감마선 조사된 컬럼의 사이클링은 나이브 버진 수지와 비교할 때 결합능이 50% 감소한 것으로 나타났다. 감마선 조사된 수지에 대한 사이클링은 컬럼 성능의 급격한 저하로 인해 25 사이클에서 중단되었으며, 이는 수지 자체의 심각한 구조적 손상을 시사한다.
tween 처리된 수지의 사이클링은 나이브 버진 수지와 비교할 때 결합능이 23% 감소한 것으로 나타났다. 친화성 리간드의 예상 수명을 나타내기 위해 수지를 100회 사이클링하였다. 결합능이 23% 감소한 것은 부분적으로 긴 수명에 걸친 컬럼 성능 손실 때문일 가능성이 높지만 수산화물 노출 때문이기도 하다. 이 수명 연구에서는 수지 수명을 연장하기 위한 최소 수산화물 노출을 조사하였다. 수산화물 노출이 증가하면 결합능이 더욱 감소한다. 사이클링 후 컬럼의 동적 결합능(DBC)을 도 2에 나타내었다.
실시예 3: AAH 살균 버퍼가 수지 수명에 미치는 영향을 평가하기 위한 연구
이 실시예는 크로마토그래피 매질의 수명 성능에 대한 아세트산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 버퍼의 영향을 평가하기 위한 파일럿 규모 연구를 설명한다.
방법
65 mM 아세트산 및 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 버퍼(AAH 살균 버퍼)가 친화성 크로마토그래피 수지의 수명 성능에 미치는 영향을 조사하기 위해 두 가지 파일럿 규모 연구를 수행하였다. 간략히, 10 cm 컬럼의 수지 성능을 70회 사이클링 후 평가하고, 각 사이클에서 컬럼을 2CV의 살균 버퍼(약 40분/사이클)에 노출하였다.
결과
설정점 조건 하에 작동할 때 최대 46시간(70사이클의 경우) 동안 AAH 살균 버퍼에 노출된 후 회복에는 변화가 없었다. 이 연구는 AAH 살균 버퍼가 친화성 리간드의 수명 성능에 해로운 영향을 미치지 않음을 나타낸다(도 3a 및 도 3b).
이 데이터는 아세트산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 본 기술의 용액이 친화성 리간드의 기능을 손상시키지 않음을 보여준다. 따라서, 본 기술의 용액은 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 살균, 재생, 및/또는 멸균하기 위한 살균 또는 멸균 방법에 유용하다.
실시예 4: AAH 살균 용액의 살균 효능을 평가하기 위한 연구
이 실시예는 아세트산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 용액의 살균 효능을 평가하기 위한 미생물 사멸 연구를 설명한다.
방법
AAH 살균 용액과 기타 잠재적인 살균 용액을 사용하여 스크리닝 배치 사멸 연구를 수행하였다. 간략히, 미생물 스파이킹 용액(108개 세포/mL)을 제조하였다. 이러한 미생물에는 E. 콜라이(ATCC 10536, 그람 음성), S. 아우레우스(ATCC 6538, 그람 양성), O. 안트로피(하우스 단리, 그람 음성), B. 세레우스(하우스 단리, 그람 음성), 및 B. 투링겐시스(하우스 단리; 포자 형성)이 포함되었다. 다양한 살균 용액을 함유하는 다양한 튜브를 미리 정의된 시점(T20, T40, T60, 및 T24h) 후에 스파이킹하고 샘플링하였다. 이어서, 샘플의 바이오버든 농도를 분석하고 결과를 로그 값으로 변환하였다. Log10 감소는 T0 PBS 대조군을 기준으로 계산하였다.
또한, 파일럿 규모 연구를 수행하여 샘플 용리액에서 내독소의 존재를 검출하였다. 간략히, 10 cm 컬럼을 개방형 시스템으로 작업하고 73사이클에 걸쳐 매 사이클마다 2CV의 AAH 살균 용액으로 처리하였다. 작업의 일부로 4개의 컬럼 사이클마다 하나의 용리액으로 풀링하였다(일반적으로 24시간 동안). 내독소를 Charles River Endosafe nexgen-PTS 내독소 테스트 키트를 사용하여 측정하였다. 내독소에 대한 용리액 샘플링 후에, 수명 사이클이 완료된 후 수명 종료(EoL) 수지를 평형 버퍼(100 mM 아세트산나트륨, pH 5.6)으로 교환하고 실온에서 1주 동안 유지하였다. 유지 종료 후, 내독소에 대해 용출액을 테스트하였다.
결과
하기의 표 2는 수산화나트륨 및 기타 산성 살균제와 비교하여 여러 대표적인 박테리아, 포자, 및/또는 곰팡이를 사멸하는 AAH 살균 용액의 살균 효과를 보여준다. 도 4에 따르면, AAH 살균 용액은 1시간 미만 동안 테스트한 모든 종을 완전히 사멸하는 유일한 용액이었다. 0.5 M NaOH와 같은 가성 살균제는 포자 형성 미생물 오염물에 효과적이지 않았다. 1시간 미만 내의 완전한 사멸은 AAH 살균 용액이 더 가혹한 조건(pH 1.7)에서 작동하고 약간 낮은 온도에서 테스트한 포자 형성 종을 사멸하는 데 최소 10시간이 걸리는 현재의 단백질 A 산성 살균제(2% PAB, Merck-Millipore)보다 놀라울 정도로 우수함을 증명한다. 따라서 AAH 살균 용액은 훨씬 더 온화한 조건에서 놀라울 정도로 짧은 시간(1시간 미만) 내에, 테스트한 모든 미생물 종을 사멸하였다. 어떠한 테스트한 용출액 샘플에서도 내독소가 검출되지 않았다(모든 내독소 수준은 검출 한계 미만으로 나옴). 이는 본 살균 방법이 그람 음성 박테리아에 대한 제어를 달성했음을 시사한다. 이 데이터는 아세트산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 본 기술의 용액이 살균 특성이 있음을 보여준다. 따라서, 본 기술의 용액은 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법에 유용하다.
실시예 5: AAH 용액의 용리 효율을 평가하기 위한 연구
이 실시예에서는 아세트산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 용액의 용리 효율을 평가하기 위한 두 가지 연구를 설명한다.
방법
아세트산 및 글리콜(예를 들어, 헥실렌 글리콜)을 포함하는 버퍼의 용리 효율을 조사하기 위해 다양한 용리 버퍼 제형을 테스트하였다. 본 연구에 사용된 용리 버퍼의 조성, 용리액 단백질 농도, 표적 분석물의 활성 회복률은 하기의 표 3에 기재되어 있다. 본 연구에 사용된 표적 분석물은 미오자임®이었다. 또한 용리 버퍼의 용리 효율에 대한 에틸렌 글리콜과 헥실렌 글리콜의 효과를 비교하기 위해 두 번째 연구를 수행하였다. 본 연구에서는 글리콜을 포함하지 않는 용리 버퍼를 대조군으로 사용하였다.
결과
표 2에 나타낸 바와 같이, 첫 번째 연구에서 테스트한 모든 버퍼 제형은 컬럼으로부터 생성물 용리를 초래하였다. 도 5는 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용리 버퍼가 글리콜을 포함하지 않거나 20% 에틸렌 글리콜을 포함하는 용리 버퍼보다 더 나은 생성물 수율 및 피크 첨예도를 나타냄을 입증한다.
따라서, 아세트산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 용액은 또한 용리 버퍼로서 기능할 수 있다. AAH 용액을 살균 능력과 결합된 공정 단계로 통합하는 능력은 바이오프로세싱에 대한 가치를 더욱 높인다.
Claims (42)
- 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법으로서, 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 카복실산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액과 접촉시키는 단계를 포함하고, 카복실산의 농도는 약 40 mM 내지 약 200 mM인, 방법.
- 크로마토그래피 매질에 결합된 표적 분석물을 용리하는 방법으로서, 크로마토그래피 매질을 카복실산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용리 버퍼와 접촉시키는 단계를 포함하고, 카복실산의 농도는 약 40 mM 내지 약 200 mM인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 카복실산은 화학식 R1-C(=O)-OH(식에서, R1은 치환 또는 비치환 C1-C12 알킬, 알케닐, 또는 알키닐임)를 갖는, 방법.
- 제3항에 있어서, 카복실산은 아세트산인, 방법.
- 제4항에 있어서, 아세트산의 농도는 약 65 mM인, 방법.
- 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 살균 또는 멸균하는 방법으로서, 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비를 카복실산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 살균 또는 멸균 용액과 접촉시켜 이 용액의 pH가 3.5 이하가 되도록 하는 단계를 포함하고, 1시간의 용액 처리 이내에 높은 수준의 박테리아, 포자, 및/또는 곰팡이 불활성화 또는 사멸을 제공하는 방법.
- 크로마토그래피 매질에 결합된 표적 분석물을 용리하는 방법으로서, 크로마토그래피 매질을 카복실산 및 헥실렌 글리콜을 포함하는 용리 버퍼와 접촉시켜 이 버퍼의 pH가 3.5 이하가 되도록 하는 단계를 포함하고, 개선된 생성물 수율 및 피크 첨예도를 제공하는 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 카복실산은 화학식 R1-C(=O)-OH(식에서, R1은 치환 또는 비치환 C1-C12 알킬, 알케닐, 또는 알키닐임)를 갖는, 방법.
- 제8항에 있어서, 카복실산은 아세트산인, 방법.
- 제9항에 있어서, 아세트산의 농도는 약 40 mM 내지 약 200 mM인, 방법.
- 제10항에 있어서, 아세트산의 농도는 약 65 mM인, 방법.
- 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 헥실렌 글리콜의 농도는 약 8% 내지 약 80%인, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 헥실렌 글리콜의 농도는 약 20%인, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피인, 방법.
- 제14항에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 하는 친화성 리간드를 포함하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 친화성 리간드는 천연 단백질 A를 기반으로 하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 친화성 리간드는 재조합 단백질 A를 기반으로 하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 친화성 리간드는 유전자 조작된 단백질 A를 기반으로 하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 친화성 리간드는 인공 단백질 A를 기반으로 하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 G 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 하는 친화성 리간드를 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A/G 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 하는 친화성 리간드를 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 L 또는 이의 임의의 변이체를 기반으로 하는 친화성 리간드를 포함하는, 방법.
- 제1항, 제3항 내지 제6항, 및 제8항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 살균 또는 멸균 용액의 pH는 약 3.0 내지 약 3.5인, 방법.
- 제23항에 있어서, 살균 또는 멸균 용액의 pH는 약 3.1인, 방법.
- 제2항 내지 제5항 및 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 버퍼 용액의 pH는 약 3.0 내지 약 3.5인, 방법.
- 제25항에 있어서, 용리 버퍼 용액의 pH는 약 3.1인, 방법.
- 제6항 및 제8항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아, 포자, 및/또는 곰팡이 불활성화는 40분의 살균 또는 멸균 용액 처리 이내에 달성되는, 방법.
- 제1항, 제3항 내지 제6항, 제8항 내지 제24항, 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 살균 방법은 폴리펩티드의 정제에 대한 단계를 포함하는 공정에 사용되는, 방법.
- 제2항 내지 제5항, 제7항 내지 제22항, 제25항, 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 방법은 폴리펩티드의 정제에 대한 단계를 포함하는 공정에 사용되는, 방법.
- 크로마토그래피 매질의 수명을 늘리는 방법으로서, 크로마토그래피 매질을 약 65 mM 아세트산 및 약 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용액으로 살균 또는 멸균하는 단계를 포함하고, (i) 감마선 조사 또는 (ii) 수산화나트륨을 포함하는 버퍼 중 적어도 하나로 크로마토그래피 매질을 살균 또는 멸균하는 것과 비교하여, 크로마토그래피 매질의 수명을 적어도 약 10% 증가시킬 수 있는 방법.
- 제31항에 있어서, 크로마토그래피 매질은 친화성 수지, 단백질 A 또는 이의 변이체를 기반으로 하는 수지, 단백질 G 또는 이의 변이체를 기반으로 하는 수지 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 살균 또는 멸균은 폴리펩티드 정제를 위한 통합 연속 바이오제조 공정 내의 단계를 포함하는, 방법.
- 제28항, 제29항, 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 항체인, 방법.
- 제33항에 있어서, 항체는 단일클론 항체인, 방법.
- 제28항, 제29항, 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 재조합 효소인, 방법.
- 제35항에 있어서, 재조합 효소는 인간 재조합 효소인, 방법.
- 제35항에 있어서, 재조합 효소는 리소좀 글리코겐 특이적 효소인, 방법.
- 제35항에 있어서, 재조합 효소는 인간 효소 산 α-글루코시다제(GAA)인, 방법.
- 제35항에 있어서, 재조합 효소는 미오자임®인, 방법.
- 65 mM 아세트산 및 20% 헥실렌 글리콜을 포함하는 용액.
- 제40항에 있어서, 크로마토그래피 매질 및/또는 지지 장비의 살균 또는 멸균 방법에 사용하기 위한 용액.
- 제40항에 있어서, 크로마토그래피 매질에 결합된 표적 분석물을 용리하는 방법에 사용하기 위한 용액.
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