KR20160050062A - 크로마토그래피 재사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정 또는 재생하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 다중 폴리펩티드 산물의 대규모 제조에서의 재사용을 위해 크로마토그래피 칼럼을 세정 또는 재생하는데 사용될 수 있다.

Description

크로마토그래피 재사용 방법 {METHOD FOR CHROMATOGRAPHY REUSE}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2013년 9월 5일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/874,305를 우선권 주장하며, 이는 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 크로마토그래피를 위한 방법을 제공한다.

재조합 모노클로날 항체 (mAb)는 의약 및 진단법에 사용된다 (Albrecht, H., et al., Drugs Today 2009, 45:199-211; Takimoto, C. H.; Principles of Oncologic Pharmacotherapy Calvo, E. In Cancer Management:A Multidisciplinary Approach Medical, Surgical & Radiation Oncolog, 11th ed.; Pazdur, R.; Wagman, L. D.; Camphausen, K.A.; Hoskins, W.J., Eds. CMP Healthcare Media LLC: Lawrence, KS, USA, 2008). 산업적으로, 재조합 mAb는 살아있는 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생체생산된다 (Fahrner, R. L., et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18:301-327). 생산되면, 관심 mAb는 그의 생산에 사용된 세포 및 배지 성분으로부터 단리되어야 한다. 이 정제 과정은 2개의 주요 단계 (a) 1차 단리 과정에 이어지는 (b) 최종 정제 과정을 갖는다. 1차 mAb 단리 과정은 관심 mAb에 대한 세포를 수확한 후에 시작한다. mAb가 수확되면, 산물 풀은 관심 mAb 뿐만 아니라 세포 성분 (배지 성분, 단백질, DNA), 및 mAb 생산 과정 동안 존재할 수 있는 바이러스를 함유한다. 예시적인 단리 과정의 제1 크로마토그래피 단계에서, 산물 풀은 단백질 A 친화성 칼럼을 통해 실행된다 (단계 1). 단백질 A 친화성 단계의 목적은 배지 성분, 세포 파편 및 추정 바이러스를 제거하는 것이다. 단계 1 후에, mAb를 함유하는 산물 풀을 이온 교환 칼럼 (IEX, 단계 2) 상에서 추가로 정제한다. 단계 2는 추가의 오염물, 예컨대 응집체 및 DNA를 제거하는 작용을 한다. IEX 크로마토그래피 후에, 1차 단리 과정의 최종 단계는 바이러스 감소 필터를 사용하여 바이러스를 제거하는 단계 (단계 3)를 포함한다. 전형적으로 단계 3 후에, mAb의 최종 정제를 제2 이온 교환 단계 (단계 4)와 함께 수행하여, 임의의 잔류 CHO 단백질 (CHOP)을 제거한다. 최종 정제 후에, 한외여과/투석여과 (UF/DF, 단계 5)를 수행하여 소분자를 제거하고, mAb를 농축시키고, 완충제를 교환하여 정제된 mAb를 그의 최종 제제 완충제 내로 제제화한다. 벌크 여과 단계가 이어지고, 이는 mAb 풀의 멸균을 보증한다 (단계 6).

산업적 mAb 정제에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 사용은 이것이 효율적이고 확장가능하고 재생가능하기 때문에 흔한 것이다 (문헌 [Affinity Chromatography Principles and Methods, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden, 2002], 2012년 7월 13일에 접속한 www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-us/18102229; 문헌 [Fahrner, R.L. et al., Bioprocess Eng. 1999, 22:287]). 그러나, MAb 제조에서의 원료 비용의 상당 부분을 차지하는 단백질 A 수지 비용이 중요하다 (Fahrner, R. L., et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30, 121-128; Kelley, B., Biotechnol. Prog. 2007, 23:995-1008). 단일 패킹된 단백질 A 칼럼은 (파일럿 플랜트에서 및 임상적 생산 동안) 그의 잠재적 수명의 단 10%만 사용되기 때문에, 수지의 불충분한 사용으로 인한 이러한 지출은 더욱 악화된다. 이러한 비용을 감소시키기 위해 다중의 다양한 mAb 산물에 대해 단백질 A 수지를 재사용하는 것이 바람직하다. 다중 산물에 대한 단백질 A 수지 재사용은, 이전 실행으로부터 뿐만 아니라 이전에 정제된 산물로부터의 단백질 캐리오버를 초래할 수 있기 때문에 흔한 관행은 아니다. 따라서, 효율적인 세정 과정이 재사용을 가능하게 할 것이다. 이러한 과정은 단지 비용, 공간 및 시간을 절약할 뿐만 아니라, 또한 환경적으로도 우호적일 것이다. 게다가, 합성된 새로운 mAb 마다의 칼럼 재패킹을 회피하기 때문에 시간 절약이 달성된다. 소모되거나 저장되거나 수송되는 단백질 A 수지가 더 적기 때문에, 단백질 A 수지의 재사용은 또한 환경을 위한 클리너이다. 전형적 맙셀렉트™ 슈어(MabSelect™ SuRe) 수지가 최대 250회 사이클 (횟수)로 사용될 수 있다는 것을 주목한다 (문헌 [Fahrner, R. L. Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30, 121-128; Kelley, B., Biotechnol. Prog. 2007, 23:995-1008]; 맙셀렉트™ 슈어 수지; 어플리케이션 노트 28-9872096 AA; [Lifetime performance study of MabSelect™ Sure LX during repeated cleaning-in-place; GE Healthcare, Piscataway, NJ. Feb. 2011.], www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1314807262343/litdoc28987296AA_20110831222625.pdf 참조). 그러나, 전형적 임상 또는 독성학 실행을 위한 파일럿 플랜트 규모에 대하여, 단백질 A 칼럼은 단지 총 3-4회 실행 (18-30회 사이클)에 사용되고, 220-232회 사이클부터 어디에서든 소모된다 (Fahrner, R. L., et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18:301-327). 본원에 기재된 바와 같이, 다중 CHO 산물에 대한 크로마토그래피 칼럼, 예컨대 맙셀렉트™ 슈어 수지 칼럼의 재사용이 실험실 및 파일럿 규모로 가능하였고 최적화되었다. 이전의 정제로부터의 mAb 캐리오버 수준을 허용되는 수준으로 감소시키기 위해, mAb 정제 실행 사이에 사용되는 개선된 단백질 A 수지 세정 절차가 개발되고 검증되었다. 이는, (a) 이전 정제로부터의, 동일한 단백질 A 수지를 사용하는 후속 정제로의 사전-세정 단백질 캐리오버 (만약 있다면)의 양의 정량화, 및 (b) 제한된 단백질 캐리오버를 갖고 안전성 문제 없이, 동일한 단백질 A 수지 상에서 다중 산물이 정제될 수 있도록 사용 전 또는 후에 단백질 A 친화성 수지를 세정하는 방법의 확인을 다룸으로써 달성되었다.

특허 출원 및 공개를 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전문이 참조로 포함된다.

본 발명은 재사용을 위해, 크로마토그래피 물질, 예를 들어, 크로마토그래피 수지를 세정 또는 재생하는 방법을 제공한다. 크로마토그래피 물질은 동일한 산물 또는 상이한 산물에의 사용을 위해 세정 및/또는 재생될 수 있다.

일부 측면에서, 본 발명은 a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.9인 2 이상의 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 용리 완충제 중에 약 10분 내지 약 30분 범위의 시간 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 2 이상의 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; 및 d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 2 이상의 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법을 제공한다.

일부 측면에서, 본 발명은 a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.9인 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; 및 d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 4 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법을 제공한다.

일부 측면에서, 본 발명은 a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.9인 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계, b) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계, c) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계, d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 2와 1/2 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계, e) 물질을 재생 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계, 및 f) 약 2와 1/2 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법을 제공한다.

일부 측면에서, 본 발명은 a) 약 25 mM 트리스(Tris) 및 약 25 mM NaCl을 포함하고 약 pH 7.1인 약 2 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 평형 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 2 물질 부피의 평형 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; d) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.8인 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; f) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; g) 0.1 N NaOH, pH 13을 포함하는 약 2 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; h) 물질을 재생 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및 i) 약 2 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법을 제공한다.

일부 측면에서, 본 발명은 a) 약 25 mM 트리스 및 약 25 mM NaCl을 포함하고 pH 7.1인 약 4 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; 및 b) i) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.8인 약 3 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; ii) 물질을 용리 완충제 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; iii) 약 1 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; iv) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 3 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; v) 물질을 재생 완충제 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및 vi) 약 1 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는 단계의 6회 사이클을 수행하는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법을 제공한다.

일부 측면에서, 본 발명은 a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.8인 약 3 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 용리 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 1 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 3 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 재생 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계; f) 약 1 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; g) 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 2% 벤질 알콜을 포함하고 약 pH 5.0인 약 3 물질 부피의 저장 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 저장 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및 f) 약 1 물질 부피의 저장 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법을 제공한다.

상기 측면의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼에 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 친화성 물질이다. 추가 실시양태에서, 친화성 물질은 단백질 A 친화성 물질; 예를 들어 맙셀렉트 물질, 맙셀렉트 슈어 물질 또는 맙셀렉트 슈어 LX 물질이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 측면의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드의 대규모 생산에 사용된다.

일부 측면에서, 본 발명은 a) 약 40 mM 아세트산나트륨을 포함하고 약 pH 5.5인 약 3 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 약 2 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계; c) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; d) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및 f) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법을 제공한다.

상기 측면의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼에 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 이온 교환 물질이다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 물질은 양이온 교환 물질; 예를 들어 포로스(POROS) HS50 물질이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 항체의 대규모 생산에 사용된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 약 50 mM 트리스, 85 mM 아세트산나트륨을 포함하고 약 pH 8.8 및 약 8.6 mS/cm인 약 3 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 약 2 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계; c) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; d) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및 f) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법을 제공한다.

상기 측면의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼에 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 이온 교환 물질이다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 물질은 음이온 교환 물질; 예를 들면, QSFF 물질이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 항체의 대규모 생산에 사용된다.

임의의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 완충제는 물질을 통해 약 30 물질 부피/시간, 약 20 물질 부피/시간 또는 약 15 물질 부피/시간으로 통과된다. 일부 실시양태에서, 완충제는 물질을 통해 하향류 방향 또는 상향류 방향으로 통과된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질의 세정은 크로마토그래피 물질을 세정한 후 모의 용리를 실행함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, <0.25 mg/mL 총 단백질, < 1 ppm IgG 단편, < 1 ppm 침출된 단백질 A, <1 μg/mL CZE LIF, <1 ppm CHOP, 및 <1 pg/mL CHO DNA 중 하나 이상을 포함하는 모의 용리의 용리액은 다중산물 사용을 위한 물질의 유효한 세정을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 알칼리에서 안정하다.

임의의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 폴리펩티드를 정제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질을 제1 폴리펩티드의 정제 후에 세정하고, 크로마토그래피 물질을 세정 후에 제2 폴리펩티드를 정제하는데 사용한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 이뮤노어드헤신이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 모노클로날 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다. 추가 실시양태에서, 모노클로날 항체는 IgG 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, scFv, 디-scFv, 이중-scFv, 탠덤 (디, 트리)-scFv, Fv, sdAb, 삼관능성 항체, BiTE, 디아바디 또는 트리아바디이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역접합체, 시토카인 또는 인터류킨이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 제1 항체 또는 제1 이뮤노어드헤신이고, 제2 폴리펩티드는 제2 항체 또는 제2 이뮤노어드헤신이다.

도 1은 총 단백질 캐리오버 (무손상 IgG + Fc 단편)의 플롯을, 추가의 수지 세정 없이 맙셀렉트™ 슈어 칼럼 상에서의 mAbA, mAbB, 및 mAbC의 순차적 실험실 규모 정제로부터 용리 샘플 사이클 함수로서 제시한다. 범례: mAbB 용리에서의 mAbA 캐리오버 (진회색), mAbC 용리에서의 mAbB 캐리오버 (회색), 및 mAbC 용리에서의 mAbA 캐리오버 (흑색).
도 2는 초기 세정 사이클에서 보여지는 단백질 제거를, 용리 완충제 (0.15 M 아세트산) 또는 재생 완충제 (0.1 N NaOH) CV 세척의 함수로서 제시한다. 화살표는 30분 정적 유지를 표시한다. 30분 정적 유지 후 칼럼으로부터 세척되어 나온 단백질의 양은 5배 증가하고, 재생 완충제와의 정적 유지 후에는 단백질이 검출되지 않음을 주목한다. 범례: 방법 4 (표 2): 흑색; 방법 5 (표 2): 진회색.
도 3은 방법 6 (흑색 막대, 표 2) 및 방법 7 (검출되지 않음, 표 2)을 사용하는 세정 후 맙셀렉트™ 슈어 칼럼 상에서 "모의 실행"을 수행한 후에 검출된 무손상 IgG 단백질을 제시한다. 3회 "모의 실행"을 방법 7 (표 2)을 사용하여 수행하였고, 그 결과는 재현가능하였다.
도 4는 94 ng/mL 모의 용리 샘플에 대해 방법 7 세정 절차 (표 2)에 따른 맙셀렉트™ 슈어 칼럼의 세정 후에 "모의 용리"의 모세관 전기영동-소듐 도데실 술페이트 (CE-SDS) 분석을 제시하며, 완전 무손상인 mAb가 90% 초과였음을 밝히는 것으로 나타났다.
도 5는 방법 7 세정 절차 (표 2)를 사용한 Akta 크로마토그램을 제시하며, "모의 용리"의 크로마토그램은 용리 완충제 (0.15 M 아세트산)로부터 재생 완충제 (0.1 N NaOH)로의 전환이 각각의 6회 사이클 동안 만들어질 때 UV-강도의 스파이크로 입증된 바와 같이 칼럼의 효율적인 세정을 시사한다. 청색 선 = UV 280 nm, 적색 선 = pH, 마젠타색 선 = 전도성.
도 6은 최적화된 세정 절차 (항목 7, 표 2)를 "모의 실행" 전에 사용하여 단백질 캐리오버를 결정하는, mAbA의 실험실 규모 정제에 대한 결과를 제시한다. A. 용리 완충제 사이클 세척의 함수로서의 단백질 캐리오버 (ng/mg 단백질); B. 재생 완충제 사이클 세척의 함수로서의 단백질 캐리오버 (ng/mg 단백질); C. "모의 실행"에서 단계의 함수로서의 단백질 캐리오버 (ng/mg 단백질). 무손상 IgG는 흑색으로 나타내고, Fc 단편은 회색으로 나타낸다.
도 7은 총 단백질 캐리오버의 플롯을, 저장 완충제 (100 mM 아세트산나트륨 및 2% 벤질 알콜 (pH 5))를 사용하여 방법 8, 표 2에 요약된 조건에 따라 세정 사이클의 함수로서 제시한다. 범례: 용리 사이클 (진회색), 재생 사이클 (회색), 저장 완충제 사이클 (흑색).
도 8은 맙셀렉트™ 슈어 칼럼 상에서의 mAbZ의 3.23 L 파일럿 규모 정제에 이어서 최적화된 6회 사이클 세정 절차 (항목 7, 표 2)를 사용한 칼럼 세정으로부터의 샘플의 함수로서의 단백질 캐리오버의 플롯이다. 무손상 IgG는 흑색으로 나타내고, Fc 단편은 회색으로 나타낸다.
도 9는 15-분 정적 유지 시간 (A) 및 "모의 실행" (B)을 사용한 최적화된 세정 프로토콜의 개략적 개요를 제시한다. 평형 완충제는 25 mM 트리스, 25 mM NaCl (pH 7.1)이다. 용리 완충제는 0.15 M 아세트산나트륨 (pH 2.9)이다. 재생 완충제는 0.1 N NaOH (pH 13)이다.
도 10은 "모의 실행" 전에 세정 절차 (도 9)를 사용하여 단백질 캐리오버를 결정하는, mAbC의 실험실 규모 정제에 대한 결과를 제시한다. A. 용리 완충제 사이클 세척의 함수로서의 단백질 캐리오버 (ng/mg 단백질); B. 재생 완충제 사이클 세척의 함수로서의 단백질 캐리오버 (ng/mg 단백질); C. "모의 실행"에서의 단계의 함수로서의 단백질 캐리오버 (ng/mg 단백질).
도 11은 맙셀렉트™ 슈어 칼럼의 최적화된 세정 프로토콜 (도 9)의 상이한 단계에서 취한 10% 트리스-HCl 겔을 제시한다. 샘플은 mAbC 정제 후에 취하였다. 재생 샘플을 농축시키고 (25배), 레인 2, 4, 6, 8, 10 및 12는 15분 정적 유지 후의 샘플을 함유한다.
도 12는 "모의 실행" 전에 최적화된 세정 절차 (항목 7, 표 2)를 사용하여 단백질 캐리오버를 결정하는, mAbC의 파일럿 규모 칼럼 (3 L) 정제의 결과를 제시한다. A. 용리 완충제 사이클 세척의 함수로서의 단백질 캐리오버 (ng/mg 단백질); B. 재생 완충제 사이클 세척의 함수로서의 단백질 캐리오버 (ng/mg 단백질). 무손상 IgG는 흑색으로 나타내고, Fc 단편은 회색으로 나타낸다.
도 13은 양이온 교환 칼럼 (포로스) 및 음이온 교환 칼럼 (QSFF)의 모의 용리 후에 검출된 무손상 IgG 캐리오버의 결과를 제시한다. MAbA 또는 MAbB는 사전에 로딩되고, 칼럼으로부터 용리되었다.
도 14A는 제자리 세정 절차 전 및 후의 양이온 교환 칼럼 (포로스) 및 음이온 교환 칼럼 (QSFF)의 모의 용리 후에 검출된 무손상 IgG 캐리오버의 결과를 제시한다. MAbA는 사전에 로딩되고, 칼럼으로부터 용리되었다.
도 14B는 제자리 세정 절차 전 및 후의 양이온 교환 칼럼 (포로스) 및 음이온 교환 칼럼 (QSFF)의 모의 용리 후에 검출된 무손상 IgG 캐리오버의 결과를 제시한다. MAbB는 사전에 로딩되고, 칼럼으로부터 용리되었다.
도 15는 세정 프로토콜의 선택된 단계의 마지막에서 포로스 또는 QSFF 칼럼으로부터 용리시킨 무손상 IgG (MAbC)의 양을 제시한다.
도 16은 파일럿 규모 칼럼 상의 세정 프로토콜의 다양한 단계에서 MAbD 캐리오버를 제시한다.
도 17은 다양한 세척 조건의 함수로서의 무손상 인간 IgG 캐리오버의 플롯을 제시한다.
도 18은 프로셉(ProSep)®vA 칼럼 상에서 다양한 완충제 용액을 사용한 CV 세척 (수지 세정 작업)의 함수로서의 단백질 캐리오버의 플롯을 제시한다. 범례: 6 M 구아니딘 HCl: 마젠타색); 19% 에탄올: 적색; 2 M 아르기닌 HCl: 갈색; 20% 헥센 글리콜: 회색; 8 M 우레아/1 M NaCl: 오렌지색; 평형 완충제: 청색; 1% v/v 인산: 황색; 0.1 M 이미다졸/19% 에탄올: 흑색; 0.1 M 아세트산: 녹색; 2 M 인산칼륨: 청록색.
도 19는 0.1 M 아세트산 세정 용액의 5회 연속 모의 실행을 나타내는 크로마토그램이다.
도 20은 다양한 세정 용액을 사용한 연속 모의 실행 후의 캐리오버를 나타내는 차트이다.
도 21은 세정 용액 6 M 구아니딘 히드로클로라이드, 2 M 아르기닌 히드로클로라이드, 또는 20% 헥실렌 글리콜을 사용한 연속 모의 실행 후의 캐리오버를 나타내는 차트이다.
도 22는 칼럼 세정 없는 산물 용리의 크로마토그램을 제시한다 (상단 패널). 각 분획에서의 캐리오버는 하단 패널에 나타낸다.
도 23은 펄스형 세정 전체에 걸친 산물 용리를 나타낸다.
도 24는 펄스형 세정과 함께 또는 펄스형 세정이 없는 연속 모의 실행에 대한 캐리오버를 나타내는 그래프이다.
도 25는 하향류 또는 상향류 조건을 사용하는 연속 모의 실행에 대한 캐리오버를 나타내는 그래프이다.
도 26은 펄스형 세정 전체에 걸쳐 산물 용리의 크로마토그램을 제시한다. 흑색 선은 하향류 조건을 나타내고, 회색 선은 상향류 조건을 나타내고, 담회색은 pH를 나타낸다.
도 27은 30 CV/hr 및 15 CV/hr의 유량에서의 연속 모의 실행에 대한 캐리오버를 나타낸다.
도 28은 평형 완충제 또는 재생 완충제와의 단일 정적 유지를 갖는 연속 모의 실행에 대한 캐리오버를 나타낸다. 정상 펄스는 정적 유지가 없는 샘플을 나타낸다.
도 29는 평형 완충제와의 다중 정적 유지를 갖는 연속 모의 실행에 대한 캐리오버를 나타낸다. 정상 펄스는 정적 유지가 없는 샘플을 나타낸다.
도 30은 펄스형 세정 전체에 걸쳐 산물 용리를 나타내는 크로마토그램을 제시한다. 흑색 선은 30 CV/hr 조건을 나타내고, 회색 선은 15 CV/hr 조건을 나타내고, 담회색은 pH를 나타낸다.
도 31은 정적 유지를 갖는 펄스형 세정 전체에 걸쳐 산물 용리를 나타내는 그로마토그램을 제시한다. 흑색 선은 정상 펄스를 나타내고, 중간 회색 선은 평형 완충제 유지 조건을 나타내고, 암회색은 재생 완충제 유지 조건을 나타내고, 담회색 선은 pH를 나타낸다.
도 32는 단일 또는 다중 정적 유지를 갖는 펄스형 세정 전체에 걸쳐 산물 용리를 나타내는 크로마토그램을 제시한다. 흑색 선은 정상 펄스를 나타내고, 중간 회색 선은 1X 평형 완충제 유지 조건을 나타내고, 암회색은 4X 평형 완충제 유지 조건을 나타내고, 담회색 선은 pH를 나타낸다.
도 33은 펄스형 세정 조건 하의 캐리오버에 대해 감소된 사이클 지속시간 효과를 나타낸다.
도 34는 감소된 사이클 지속시간을 갖는 펄스형 세정 전체에 걸쳐 산물 용리를 나타내는 크로마토그램을 제시한다. 흑색 선은 IgG를 나타내고, 담회색 선은 pH를 나타낸다.

재사용을 위해, 크로마토그래피 물질, 예를 들어, 크로마토그래피 수지를 세정 또는 재생하는 방법이 본원에 제공된다. 크로마토그래피 재사용은 크로마토그래피 물질이 동일한 산물 또는 상이한 산물과의 사용을 위해 세정 및/또는 재생되는 것인 전환 절차이다. 본 발명의 방법은 대규모; 예를 들어 제조-규모의 크로마토그래피 물질의 재생에 사용될 수 있다. 상당한 비용 절감은 수지; 예를 들어, 단백질 A 수지가 다중 산물에 대해 재사용되는 경우에 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세정 절차는 후속적 정제 샘플내로 무손상 단백질; 예를 들어, IgG의 1 ppm 미만의 캐리오버를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 낮은 단백질 캐리오버는 안전역에 설정된 것보다 10³배 더 적은 단백질 캐리오버이고, 동일한 수지가 다중 산물을 정제하는데 사용될 수 있음을 입증한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼 내에 있다.

I. 정의

용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 이러한 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한 상기 정의에는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 특히 항체를 포함한다.

"정제된" 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신)는 폴립펩티드가 이들이 그의 천연 환경에서 존재하는 경우보다 더 순수한 형태로 존재하도록 및/또는 실험실 조건 하에 최초로 합성 및/또는 증폭되는 경우에 순도가 증가한 것을 의미한다. 순도는 상대적 용어이고, 반드시 절대 순도를 의미하지는 않는다.

관심 항원, 예를 들어 종양-연관 폴리펩티드 항원 표적에 "결합하는" 결합 폴리펩티드는 폴리펩티드가 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는 데에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도로 항원에 결합하고, 다른 폴리펩티드와 유의하게 교차 반응하지 않는 것이다. 이러한 실시양태에서, "비-표적" 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드의 결합 정도는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전법 (RIA)으로 결정할 때 그의 특정 표적 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 결합의 약 10% 미만일 것이다.

표적 분자에 대한 폴리펩티드의 결합과 관련해서, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프와의 "특이적 결합" 또는 이것과 "특이적으로 결합" 또는 이에 대해 "특이적"이라는 용어는 비-특이적 상호 작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을 일반적으로 결합 활성을 보유하지 않는 유사한 구조의 분자인 대조 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조 분자, 예를 들어 과량의 비-표지 표적과의 경쟁에 의해 측정할 수 있다. 이 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 특이적 결합이다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 용어 "이뮤노글로불린" (Ig)은 본원에서 항체와 교환가능하게 사용된다.

항체는 모두 이뮤노글로불린 폴드를 기준으로 하여 하는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자이다. 예를 들어, IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 "중"쇄 및 2개의 "경"쇄를 가져 기능적 항체를 형성한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 자체는 "불변" (C) 및 "가변" (V) 영역을 포함한다. V 영역은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, C 영역은 구조 지지체를 제공하고, 면역 이펙터와의 비-항원-특이적 상호작용에서 기능한다. 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 항원 결합 특이성은 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 능력이다.

항체의 항원 결합 특이성은 V 영역의 구조적인 특성에 의해 결정된다. 변동성이 가변 도메인의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 대신, V 영역은, 길이가 각각 9-12개 아미노산이며 변동성이 극도로 높아 "초가변 영역"이라 불리는 보다 짧은 영역에 의해 분리되어 있는, 15-30개 아미노산으로 이루어진 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 상대적으로 불변성인 스트레치로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은, 3개의 초가변 영역 ("HVR")에 의해 연결되고 주로 β-시트 형상을 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 상기 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.

각 V 영역은 전형적으로 3개의 초가변 영역, 예를 들어, 각각 "초가변 루프"를 함유하는 3개의 상보성 결정 영역 ("CDR"), 및 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 따라서, 특정한 바람직한 항원에 실질적인 친화도로 결합하는데 요구되는 최소 구조 단위인 항체 결합 부위는 전형적으로 3개의 CDR, 및 CDR을 적절한 입체형태로 유지 및 존재하게 하는 이들 사이에 배치된 적어도 3개, 바람직하게는 4개의 프레임워크 영역을 포함할 것이다. 고전적인 4쇄 항체는 협력하여 V_H 및 V_L 도메인에 의해 정의되는 항원 결합 부위를 갖는다. 특정 항체, 예컨대 낙타 및 상어 항체는 경쇄가 결여되어 있고, 오직 중쇄에 의해 형성된 결합 부위에 의존한다. 결합 부위가 V_H 및 V_L 사이의 협력없이 중쇄 또는 경쇄만으로 형성된 단일 도메인 조작된 이뮤노글로불린을 제조할 수 있다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 상이하며, 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 변동성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역이라 지칭되는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 형상을 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 상기 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.

용어 "초가변 영역"은 본원에 사용될 경우에, 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, V_L에서는 대략적으로 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 V_H에서는 대략적으로 약 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, V_L에서는 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 V_H에서는 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3)) (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함할 수 있다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

"항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디 (taDb), 선형 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]]; 1-아암 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일-쇄 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, 디-scFv, 이중-scFv, 또는 탠덤 (디,트리)-scFv를 포함하나, 이에 제한되지는 않음); 및 이중-특이적 T-세포 연관체 (BiTE)를 포함한다.

항체를 파파인으로 소화시키면, "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편이 생성되며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성한다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 긴밀, 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 배위에서 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 V_H-V_L 이량체 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정한다. 총괄적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 초가변 영역 3개만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 낮은 친화도에서도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 1개의 유리 티올 기를 보유하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 가운데에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나에 할당될 수 있다.

이들 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류로 지정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5개의 주요 무손상 항체 부류가 존재하고, 이 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 추가로 나눌 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 하는, V_H 및 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv 단편의 검토를 위해, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 상기 단편은 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 동일 폴리펩티드 쇄 (V_H - V_L) 내에 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.

용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 다중특이적 항체는 V_HV_L 유닛이 다중에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (V_H) 및 경쇄 가변 도메인 (V_L)을 포함하는 항체, 각각의 V_HV_L 유닛이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 V_L 및 V_H 도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 삼관능성 항체, 공유 또는 비-공유 연결된 항체 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. "단일특이적"은 1개의 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다. 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체는 각 에피토프에 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 결합하는 IgG 항체이다.

표현 "단일 도메인 항체" (sdAb) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 즉, 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 또 다른 가변 도메인과의 상호작용을 필요로 하지 않는다. 단일 도메인 항체의 예는 낙타류 (라마 및 낙타) 및 연골 어류 (예를 들어, 너스 상어)로부터 유래된 것, 및 인간 및 마우스 항체로부터 재조합 방법으로 유래된 것을 포함한다 (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870).

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 모노클로날 항체의 생성 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프와 결합하는 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 그의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 점에서 유익하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구한다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지 부분이 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린), 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). 본원의 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어 구세계 원숭이, 예컨대 개코원숭이, 레서스 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 5,693,780).

비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 상기 언급된 FR 치환(들)은 제외하고, 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

본원에서 목적을 위해, "무손상 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 뿐만 아니라 Fc 영역을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.

"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 디술피드 연결의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_H)을 갖고, 그 뒤에는 다수의 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L)을 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 인터페이스를 형성한다고 여겨진다.

"네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지와 같은 이종 분자에 접합되지 않은 항체 (본원에 정의된 바와 같음)이다.

일부 실시양태에서, 항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절을 포함한다.

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후에 이러한 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.

"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하며, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하며, 이는 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 달리 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것들을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 이 용어는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976); 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).

크로마토그래피에 관련하여 본원에 사용된 용어 "순차적"은 제1 크로마토그래피에 이어 제2 크로마토그래피를 갖는 것을 지칭한다. 추가의 단계가 제1 크로마토그래피와 제2 크로마토그래피 사이에 포함될 수 있다.

크로마토그래피에 관련하여 본원에 사용된 용어 "연속적"은 직접 연결되거나 또는 2가지 크로마토그래피 물질 사이의 연속적 흐름을 허용하는 일부 다른 메카니즘의 제1 크로마토그래피 물질 및 제2 크로마토그래피 물질을 갖는 것을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "단리된"은 그것이 전형적으로 자연에서 함께 발견되거나 생산되는 성분의 적어도 일부로부터 분리된 분자를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 그것이 생산된 세포의 성분의 적어도 일부로부터 분리된 경우에 "단리된" 것으로 언급된다. 폴리펩티드가 발현 후 세포에 의해 분비되는 경우, 그것을 생산하는 세포로부터 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 물리적으로 분리하는 것은 폴리펩티드를 "단리하는" 것으로 간주된다. 유사하게, 폴리펩티드는 그것이 전형적으로 자연에서 발견되는 보다 큰 폴리뉴클레오티드의 일부가 아닌 경우 (예를 들어, DNA 폴리뉴클레오티드의 경우, 게놈 DNA 또는 미토콘드리아 DNA), 또는 예를 들어 RNA 폴리뉴클레오티드의 경우에 그것이 생산된 세포의 성분의 적어도 일부로부터 분리된 경우 "단리된" 것으로 지칭된다. 따라서, 숙주 세포 내 벡터에 함유된 DNA 폴리뉴클레오티드는 "단리된" 것으로 지칭될 수 있다.

본원에 사용된 "1일 허용 노출량 (ADE)"은, 개체가 수명에 걸쳐 이 용량에 또는 보다 낮은 용량에 노출되는 경우에 유해 건강 사례 또는 바람직하지 않은 생리학적 효과를 유발할 가능성이 없는 물질-고유 용량이다 (문헌 [Teschner, W., et al., Vox Sang. 2007, 92:42-55]; [Food and Drug Administration, HHS. Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. Rockville, MD. July 2005], www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CE8QFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.fda.gov%2Fdownloads%2FDrugs%2F...%2FGuidances%2FUCM078932.pdf&ei=f4QhUJv4K9Ov6gGQ-4DgAg&usg=AFQjCNFbTE75U0nDbFpfdpxK85uWXT8frg에 2012년 8월 7일에 접근함; [European Medicines Agency. Impurities: Residual Solvents, Note for Guidance on Impurities: Residual Solvents (CPMP/ICH/283/95). London, UK Sept. 1997], www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/regulation/general/general_content_000431.jsp&mid=WC0b01ac0580029593에 2012년 8월 7일에 접근함). ADE 이외에도, IgG에 대한 "1일 추정 섭취량 (EDI)"는 용량 당 투여되는 IgG의 양을 기준으로 하여 결정된다.

"오염물"은 목적하는 폴리펩티드 산물과 상이한 물질을 지칭한다. 오염물은 비제한적으로 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 침출된 단백질 A; 핵산; 목적 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물; 세포 배양 배지 성분 등을 포함한다. 일부 예에서, 오염물은, 예를 들어 비제한적으로 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터의 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다.

본원에서 값 또는 파라미터에 대해 언급되는 "약"은 해당 값 또는 파라미터 자체에 대해 관련한 변동을 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"를 기재함을 포함한다.

본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수형은 문맥상 달리 분명하게 언급되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 본원에 기재된 본 발명의 측면 및 변경은 측면 및 변경으로 "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.

II. 칼럼 세정 방법

(A) 크로마토그래피

본 발명은 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정 또는 재생하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 대규모; 예를 들어, 제조-규모의, 폴리펩티드 산물의 생산에 사용된다.

일부 실시양태에서, 방법은 a) 약 pH 2.9의 약 0.15 M 아세트산을 포함하는 약 2 이상의 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 용리 완충제 중에 약 10분 내지 약 30분 범위의 시간 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 2 이상의 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; 및 d) pH 13인 약 0.1 N NaOH를 포함하는 약 2 이상의 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼 내에 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 대규모, 예를 들어 제조-규모의, 폴리펩티드 산물, 예컨대 항체 산물의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 단백질 A 크로마토그래피 물질이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 다중 항체 산물을 정제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세정 방법 후 캐리오버는 <0.25 mg/mL 총 단백질, < 1 ppm IgG 단편, < 1 ppm 침출된 단백질 A, <1 μg/mL CZE LIF, <1 ppm CHOP, 및 <1 pg/mL CHO DNA 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 a) 약 pH 2.9의 약 0.15 M 아세트산을 포함하는 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; 및 d) 약 pH 13의 약 0.1 N NaOH인 약 4 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼 내에 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 대규모, 예를 들어 제조-규모의, 폴리펩티드 산물, 예컨대 항체 산물의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 단백질 A 크로마토그래피 물질이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 다중 항체 산물을 정제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세정 방법 후 캐리오버는 <0.25 mg/mL 총 단백질, < 1 ppm IgG 단편, < 1 ppm 침출된 단백질 A, <1 μg/mL CZE LIF, <1 ppm CHOP, 및 <1 pg/mL CHO DNA 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 a) 약 pH 2.9의 약 0.15 M 아세트산을 포함하는 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계, b) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계, c) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계, d) 약 pH 13의 약 0.1 N NaOH인 약 2와 1/2 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계, e) 물질을 재생 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계, f) 약 2와 1/2 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼 내에 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 대규모, 예를 들어 제조-규모의, 폴리펩티드 산물, 예컨대 항체 산물의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 단백질 A 크로마토그래피 물질이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 다중 항체 산물을 정제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세정 방법 후 캐리오버는 <0.25 mg/mL 총 단백질, < 1 ppm IgG 단편, < 1 ppm 침출된 단백질 A, <1 μg/mL CZE LIF, <1 ppm CHOP, 및 <1 pg/mL CHO DNA 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 a) 약 pH 7.1의 약 25 mM 트리스, 약 25 mM NaCl을 포함하는 약 2 물질 부피의 평형 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 평형 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 2 물질 부피의 평형 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; d) 약 pH 2.8의 약 0.15 M 아세트산인 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; f) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; g) 약 pH 13의 약 0.1 N NaOH인 약 2 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; h) 물질을 재생 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; i) 약 2 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼 내에 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 대규모, 예를 들어 제조-규모의, 폴리펩티드 산물, 예컨대 항체 산물의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 단백질 A 크로마토그래피 물질이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 다중 항체 산물을 정제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세정 방법 후 캐리오버는 <0.25 mg/mL 총 단백질, < 1 ppm IgG 단편, < 1 ppm 침출된 단백질 A, <1 μg/mL CZE LIF, <1 ppm CHOP, 및 <1 pg/mL CHO DNA 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 a) 약 pH 7.1의 약 25 mM 트리스, 약 25 mM NaCl을 포함하는 약 4 물질 부피의 평형 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; b) i) pH 2.8의 약 0.15 M 아세트산인 약 3 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; ii) 물질을 용리 완충제 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; iii) 약 1 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; iv) 약 pH 13의 약 0.1 N NaOH인 약 3 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; v) 물질을 재생 완충제 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; vi) 약 1 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는 단계의 6회 사이클을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼 내에 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 대규모, 예를 들어 제조-규모의, 폴리펩티드 산물, 예컨대 항체 산물의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 단백질 A 크로마토그래피 물질이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 다중 항체 산물을 정제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세정 방법 후 캐리오버는 <0.25 mg/mL 총 단백질, < 1 ppm IgG 단편, < 1 ppm 침출된 단백질 A, <1 μg/mL CZE LIF, <1 ppm CHOP, 및 <1 pg/mL CHO DNA 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 a) 약 pH 2.8의 약 0.15 M 아세트산인 약 3 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 용리 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 1 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; d) 약 pH 13의 약 0.1 N NaOH인 약 3 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 재생 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계; f) 약 1 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; g) 약 pH 5.0의 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 2% 벤질 알콜인 약 3 물질 부피의 저장 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 저장 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계; f) 약 1 물질 부피의 저장 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계의 6회 사이클을 포함한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼 내에 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 대규모, 예를 들어 제조-규모의, 폴리펩티드 산물, 예컨대 항체 산물의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 단백질 A 크로마토그래피 물질이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 다중 항체 산물을 정제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세정 방법 후 캐리오버는 <0.25 mg/mL 총 단백질, < 1 ppm IgG 단편, < 1 ppm 침출된 단백질 A, <1 μg/mL CZE LIF, <1 ppm CHOP, 및 <1 pg/mL CHO DNA 중 하나 이상을 포함한다.

본 발명의 일부 측면에서, 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 물질이다. 친화성 크로마토그래피 물질의 예는 단백질 A 또는 단백질 G로 유도체화된 크로마토그래피 물질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 친화성 크로마토그래피 물질의 예는 프로셉-VA, 프로셉-VA 울트라 플러스, 단백질 A 세파로스 패스트 플로우, 토요퍼얼(Tyopearl) 단백질 A, 맙셀렉트™, 맙셀렉트™ 슈어 및 맙셀렉트™ 슈어 LX를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 물질이다. 상기 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 막이다. 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 물질은 단백질 G 크로마토그래피 물질이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 대규모, 예를 들어 제조-규모의, 폴리펩티드 산물, 예컨대 항체 산물의 생산에 사용된다.

일부 측면에서, 본 발명은 재사용을 위해 이온-교환 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 a) 약 pH 7.1의 약 25 mM 트리스, 약 25 mM NaCl을 포함하는 약 3 물질 부피의 평형 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 약 2 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계; c) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; d) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및 f) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 물질은 크로마토그래피 칼럼에 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 대규모, 예를 들어 제조-규모의, 폴리펩티드 산물, 예컨대 항체 산물의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 다중 항체 산물을 정제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세정 방법 후 캐리오버는 <0.25 mg/mL 총 단백질, < 1 ppm IgG 단편, < 1 ppm 침출된 단백질 A, <1 μg/mL CZE LIF, <1 ppm CHOP, 및 <1 pg/mL CHO DNA 중 하나 이상을 포함한다.

본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 이온 교환 크로마토그래피 물질; 예를 들어 음이온 교환 크로마토그래피 물질 또는 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 물질이다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 크로마토그래피 칼럼에 있다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 양으로 하전되고 고체 상 위를 지나가거나 또는 이를 통과하는 수용액 중에서 음이온과의 교환을 위한 유리 음이온을 갖는 고체 상이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 막, 모노리스, 또는 수지일 수 있다. 한 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 수지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민 또는 4급 암모늄 이온 관능기, 폴리아민 관능기, 또는 디에틸아미노에틸 관능기를 포함할 수 있다. 상기 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 상기 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 막이다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 대규모, 예를 들어 제조-규모의, 폴리펩티드 산물, 예컨대 항체 산물의 생산에 사용된다.

본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 물질이다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 크로마토그래피 칼럼에 있다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 음으로 하전되고 고체 상 위를 지나가거나 또는 이를 통과하는 수용액 중에서 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고체 상이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 막, 모노리스, 또는 수지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 수지일 수 있다. 양이온 교환 물질은 카르복실산 관능기 또는 술폰산 관능기, 예컨대 술포네이트, 카르복실산, 카르복시메틸 술폰산, 술포이소부틸, 술포에틸, 카르복실, 술포프로필, 술포닐, 술폭시에틸 또는 오르토포스페이트를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 일부 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 상기 일부 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 막이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 아니다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 대규모, 예를 들어 제조-규모의, 폴리펩티드 산물, 예컨대 항체 산물의 생산에 사용된다.

본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 이온 교환 물질은 종래의 크로마토그래피 물질 또는 전달성 크로마토그래피 물질을 활용할 수 있다. 종래의 크로마토그래피 물질은 예를 들어 살포성 물질 (예를 들어, 폴리 (스티렌-디비닐벤젠) 수지) 및 확산성 물질 (예를 들어, 가교 아가로스 수지)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리 (스티렌-디비닐벤젠) 수지는 포로스 수지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가교 아가로스 수지는 술포프로필-세파로스 패스트 플로우 ("SPSFF") 수지일 수 있다. 전달성 크로마토그래피 물질은 막 (예를 들어, 폴리에테르술폰) 또는 모노리스 물질 (예를 들어 가교 중합체)일 수 있다. 폴리에테르술폰 막은 무스탕일 수 있다. 가교 중합체 모노리스 물질은 가교 폴리(글리시딜 메타크릴레이트-코-에틸렌 디메타크릴레이트)일 수 있다.

음이온 교환 물질의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 포로스 HQ 50, 포로스 PI 50, 포로스 D, 무스탕(Mustang) Q, Q 세파로스 FF 및 DEAE 세파로스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

양이온 교환 물질의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 무스탕 S, 사토바인드 S, SO3 모노리스, S 세라믹 하이퍼D, 포로스 XS, 포로스 HS50, 포로스 HS20, SPSFF, SP-세파로스 XL (SPXL), CM 세파로스 패스트 플로우, 캅토 S, 프락토겔 Se 하이캡, 프락토겔 SO3, 또는 프락토겔 COO를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 포로스 HS50이다. 일부 실시양태에서, 포로스 HS 수지는 포로스 HS 50 μm 또는 포로스 HS 20 μm 입자일 수 있다.

본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 다음의 관능성 중 하나 이상이 가능한 관능기를 포함하는 혼합 모드 물질이다: 음이온 교환, 양이온 교환, 수소 결합 및 소수성 상호작용. 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 음이온 교환 및 소수성 상호작용을 가능하게 하는 관능기를 포함한다. 혼합 모드 물질은 리간드로서 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민, 4-메르캅토-에틸-피리딘, 헥실아민 또는 페닐프로필아민을 함유하거나 가교 폴리알릴아민을 함유할 수 있다. 혼합 모드 물질의 예는 캅토 어드히어(Capto Adhere) 수지, QMA 수지, 캅토 MMC 수지, MEP 하이퍼셀 수지, HEA 하이퍼셀 수지, PPA 하이퍼셀 수지 또는 크로마소르브 막 또는 사토바인드 STIC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 캅토 어드히어 수지이다. 상기 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 혼합 모드 크로마토그래피 물질이다. 상기 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 혼합 모드 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 혼합 모드 막이다. 일부 실시양태에서, 혼합 모드 크로마토그래피 칼럼은 대규모; 예를 들어 제조-규모의 크로마토그래피 칼럼이다.

본 발명의 일부 측면에서, 크로마토그래피 물질은 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질이다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 소수성에 따라 생체분자를 분리하는 액체 크로마토그래피 기술이다. HIC 크로마토그래피 물질의 예는 토요퍼얼 헥실 650, 토요퍼얼 부틸 650, 토요퍼얼 페닐 650, 토요퍼얼 에테르 650, 소스, 리소스, 세파로스 하이-트랩, 옥틸 세파로스, 페닐 세파로스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 일부 실시양태에서, HIC 크로마토그래피 물질은 HIC 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, HIC 크로마토그래피 물질은 HIC 크로마토그래피 막이다. 일부 실시양태에서, HUC 크로마토그래피 칼럼은 대규모; 예를 들어 제조-규모의 크로마토그래피 칼럼이다.

본 발명의 일부 측면에서, 크로마토그래피 물질은 히드록시아파타이트 (HAP) 크로마토그래피 물질이다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피 물질의 예는 HA 울트로겔 및 CHT 히드록시아파타이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 일부 실시양태에서, HAP 크로마토그래피 물질은 HAP 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, HAP 크로마토그래피 물질은 HAP 크로마토그래피 막이다. 일부 실시양태에서, HAP 크로마토그래피 칼럼은 대규모; 예를 들어 제조-규모의 크로마토그래피 칼럼이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 알칼리 안정성 크로마토그래피 물질; 예를 들어 알칼리 안정성 크로마토그래피 칼럼을 세정 또는 재생하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 완충제를 제공한다. 용리 완충제는 일반적으로 크로마토그래피 물질로부터의 물질; 예를 들어 목적 물질 또는 불필요 물질, 예컨대 오염물을 제거하는데 사용된다. 용리 완충제의 예는 약 pH 2.8-2.9의 약 0.15 M 아세트산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 재생 완충제는 일반적으로 크로마토그래피 절차 후에 칼럼을 재충전하는데 사용된다. 예를 들어, 음이온 크로마토그래피를 위한 재생 완충제는 약 pH 13의 약 0.1 N NaOH일 수 있다. 평형 완충제는 크로마토그래피 물질을 샘플과 동일한 조건 (염 농도, pH 등) 하에 놓기 위해 사용될 수 있다. 평형 완충제의 비제한적 예는 약 pH 7.1의 약 25 mM 트리스 및 약 25 mM NaCl이다. 저장 완충제는 일반적으로 사용하지 않을 때 크로마토그래피 물질을 유지하기 위해; 예를 들어, 오염을 방지하기 위한 마이크로코드와 함께 사용된다. 저장 완충제의 비제한적 예는 약 pH 5.0의 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 2% 벤질 알콜이다.

본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 유량은 약 50 물질 부피/hr, 40 물질 부피/hr, 또는 30 물질 부피/hr 미만이다. 유량은 약 5 물질 부피/hr 내지 50 물질 부피/hr, 10 물질 부피/hr 내지 40 물질 부피/hr, 또는 18 물질 부피/hr 내지 36 물질 부피/hr일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유량은 약 9 물질 부피/hr, 18 물질 부피/hr, 25 물질 부피/hr, 30 물질 부피/hr, 36 물질 부피/hr, 또는 40 물질 부피/hr이다.

일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼 내에 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 유량은 약 50 칼럼 부피 (CV)/hr, 40 CV/hr, 또는 30 CV/hr 미만이다. 유량은 약 5 CV/hr 내지 50 CV/hr, 10 CV/hr 내지 40 CV/hr, 또는 18 CV/hr 내지 36 CV/hr일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유량은 약 9 CV/hr, 18 CV/hr, 25 CV/hr, 30 CV/hr, 36 CV/hr, 또는 40 CV/hr이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 유량은 약 100 cm/hr, 75 cm/hr, 또는 50 cm/hr 미만이다. 유량은 약 25 cm/hr 내지 150 cm/hr, 25 cm/hr 내지 100 cm/hr, 50 cm/hr 내지 100 cm/hr, 또는 65 cm/hr 내지 85 cm/hr일 수 있다.

베드 높이는 사용된 크로마토그래피 물질의 높이이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 베드 높이는 약 3 cm, 10 cm, 또는 15 cm 초과이다. 베드 높이는 약 3 cm 내지 35 cm, 5 cm 내지 15 cm, 3 cm 내지 10 cm, 또는 5 cm 내지 8 cm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 베드 높이는 약 3 cm, 5 cm, 10 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm, 또는 30 cm이다. 일부 실시양태에서, 베드 높이는 로드에서의 폴리펩티드 또는 오염물의 양을 기준으로 하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 대규모; 예를 들어, 제조-규모의, 폴리펩티드 생산에 사용되는 칼럼에 있다. 일부 실시양태에서, 제조-규모 크로마토그래피 물질은 베드 높이가 약 10 cm, 15, cm, 20 cm, 25 cm 또는 30 cm이다.

베드 직경은 사용된 크로마토그래피 물질의 직경이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 베드 직경은 약 80 cm, 100 cm, 또는 120 cm 초과이다. 일부 실시양태에서, 베드 직경은 약 50 cm, 60 cm, 70 cm, 80 cm, 90 cm, 100 cm, 110 cm, 120 cm, 130 cm, 140 cm, 150 cm, 160 cm, 170 cm, 180 cm, 190, 또는 200 cm이다. 일부 실시양태에서, 베드 직경은 로드에서의 폴리펩티드 또는 오염물의 양을 기준으로 하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 대규모; 예를 들어, 제조-규모의 폴리펩티드 생산에 사용된 칼럼에 있다. 일부 실시양태에서, 제조-규모 크로마토그래피 물질은 베드 직경이 약 50 cm, 60 cm, 70 cm, 80 cm, 90 cm, 100 cm, 110 cm, 120 cm, 130 cm, 140 cm, 150 cm, 160 cm, 170 cm, 180 cm, 190, 또는 200 cm이다.

일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 약 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1 L, 2 L, 3 L, 4 L, 5 L, 6 L, 7 L, 8 L, 9 L, 10 L, 25 L, 50 L, 100 L, 200 L, 300 L, 400 L, 500 L, 600 L, 700 L, 800 L, 900 L 또는 1000 L 초과의 부피를 갖는 용기의 물질에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 용기는 14 cm의 베드 높이 및 80 cm의 베드 부피; 예를 들어, 대규모 단백질 A 칼럼을 갖는다. 일부 실시양태에서, 용기는 19 cm의 베드 높이 및 100 cm의 베드 부피, 예를 들어, 대규모 음이온 교환 칼럼을 갖는다. 일부 실시양태에서, 용기는 30 cm의 베드 높이 및 120 cm의 베드 부피, 예를 들어, 대규모 양이온 교환 칼럼을 갖는다.

본원에 사용된 로드는 크로마토그래피 물질 상에 로딩된 조성물이다. 일부 실시양태에서, 로드는 다양한 폴리펩티드를 단리하기 위해 이전에 사용되었던 크로마토그래피 물질 상에 로딩된 폴리펩티드이다. 로딩 완충제는 크로마토그래피 물질 상에 관심 산물을 포함하는 조성물을 로딩하는데 사용된 완충제이다. 크로마토그래피 물질은 정제될 조성물을 로딩하기 전에 평형 완충제로 평형화될 수 있다. 일부 예에서, 세척 완충제는 조성물을 크로마토그래피 물질 상에 로딩한 후에 고체 상으로부터 관심 폴리펩티드를 용리하기 전에 사용된다. 그러나, 관심 산물, 예를 들어 폴리펩티드 중 일부는 세척 완충제에 의해 (예를 들어 통과 모드와 유사하게) 크로마토그래피 물질로부터 제거될 수 있다.

본원에 사용된 용리는 크로마토그래피 물질로부터의 산물, 예를 들어 폴리펩티드의 제거이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 용리는, 마지막 세정 절차 후에 단백질이 로딩되지 않은 크로마토그래피 물질에 용리 절차를 적용하는 "모의 용리"이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 모의 용리 절차는 본원에 기재된 세정 절차 중 어느 하나에 이어서 크로마토그래피 물질에 적용된다. 일부 실시양태에서, 모의 용리는, 실제 생산 실행 동안 캐리오버 물질 (예를 들어, 오염물)이 존재할 수 있는지 결정하기 위한 노력에서, 물질에 적용될 단백질을 용리하는데 사용될 용리를 모방한다. 모의 용리는 세정 절차의 효능을 평가하는 수단으로서 사용될 수 있다.

용리 완충제는 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩티드 또는 다른 관심 산물을 용리하는데 사용된 완충제이다. 다수의 경우에, 용리 완충제는 로드 완충제와 상이한 물리적 특성을 갖는다. 예를 들어, 용리 완충제는 로드 완충제와 상이한 전도성 또는 로드 완충제와 상이한 pH를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 작은 전도성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 큰 전도성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 작은 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 큰 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서 용리 완충제는 로드 완충제와 상이한 전도성 및 상이한 pH를 갖는다. 용리 완충제는 보다 크거나 또는 보다 작은 전도성 및 보다 크거나 또는 보다 작은 pH의 임의의 조합을 가질 수 있다.

전도성은 2개의 전극 사이의 전류를 통하게 하는 수용액의 능력을 지칭한다. 용액 내에서는 이온 수송에 의해 전류가 흐른다. 따라서, 수용액 중에 존재하는 이온량을 증가시키면, 용액은 보다 큰 전도성을 갖게 될 것이다. 전도성의 기본 측정 단위는 지멘(Siemen) (또는 mho), mho (mS/cm)이며, 전도성 측정기, 예컨대 다양한 모델의 오리온(Orion) 전도성 측정기를 사용하여 측정할 수 있다. 전해질 전도성이란 전류를 운반할 수 있는 용액 중의 이온의 능력이기 때문에 용액의 이온 농도를 변화시킴으로써 용액의 전도성을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 바람직한 전도성을 얻기 위해 용액 중 완충제의 농도 및/또는 염 (예를 들어, 염화나트륨, 아세트산나트륨, 또는 염화칼륨)의 농도를 변화시킬 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충제의 염 농도를 변형시켜 바람직한 전도성을 달성한다.

(B) 오염물

본 발명은 대규모, 예컨대 제조-규모로 사용된 크로마토그래피 물질의 재사용을 위한 방법을 제공한다. 방법은 다중 폴리펩티드 산물에 대한 크로마토그래피 물질의 다중 사용을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여, 제1 항체를 크로마토그래피 물질 상에서 산업적 규모로 정제하고, 이후 본원에 기재된 크로마토그래피 물질의 세정/재생 방법에 적용하고, 이어서 제2 항체 산물을 산업적 규모 정제로 정제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제된 이전 산물의 "캐리오버"을 감소시키는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 캐리오버 오염물은 전체 항체, IgG 단편, Fc, 및 Fc 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 오염물은 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 침출된 단백질 A; 핵산; 변이체, 단편, 목적 폴리펩티드의 응집체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물; 세포 배양 배지 성분, 카르복시펩티다제 B, 겐타미신 등 중 어느 하나 이상이다. 일부 예에서, 오염물은, 예를 들어 비제한적으로 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터의 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다.

침출된 단백질 A는 그것이 결합된 고체 상으로부터 침출되거나 세척된 단백질 A이다. 예를 들어, 침출된 단백질 A는 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 침출될 수 있다. 단백질 A의 양은, 예를 들어 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 침출된 단백질 A의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과 감소된다. 침출된 단백질 A의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99% 또는 85% 내지 99% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 침출된 단백질 A의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 감소된다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 침출된 단백질 A의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 침출된 단백질 A의 양과 비교하여 결정된다.

숙주 세포 단백질 (HCP)은 폴리펩티드가 생산되는 세포로부터의 단백질이다. 예를 들어, CHOP는 숙주 세포로부터의 단백질, 즉 차이니즈 햄스터 난소 단백질이다. CHOP의 양은 효소-연결된 면역흡착 검정 ("ELISA") 또는 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) ("MSO")에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 용리액 중 HCP (예를 들어 CHOP)의 양은 모의 용리에서 최소로 존재한다. 일부 실시양태에서, 모의 용리로부터의 용리액 중 숙주 세포 단백질의 수준은 세정 방법과 함께 또는 없이 또는 세정 방법 전 및 후에 비교된다.

DNA, 예컨대 숙주 세포 DNA를 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 실시예 섹션에 기재되어 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, DNA의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과 감소된다. DNA의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99% 또는 85% 내지 99% 감소될 수 있다. DNA의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 DNA의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 DNA의 양과 비교하여 결정된다.

단편 폴리펩티드는 저분자량 (LMW) 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편화된 폴리펩티드는 관심 폴리펩티드의 단편이다. LMW 단백질의 예는 Fab (단편 항원 결합), Fc (단편, 결정화가능) 영역 또는 둘 다의 조합, 또는 관심 항체의 임의의 무작위적인 단편화된 부분을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 단편화된 단백질 (예를 들어, LMW 단백질)을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 실시예 섹션에 기재되어 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, LMW 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 초과 감소된다. LMW 단백질의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99% 또는 85% 내지 99% 감소될 수 있다. LMW 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 단편화된 단백질 (예를 들어, LMW 단백질)의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 단편화된 단백질 (예를 들어, LMW 단백질)의 양과 비교하여 결정된다.

응집된 폴리펩티드는 고분자량 (HMW) 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 응집된 폴리펩티드는 관심 폴리펩티드의 다량체이다. HMW 단백질은 이량체, 8x까지의 단량체 또는 보다 큰 관심 폴리펩티드일 수 있다. 응집된 단백질 (예를 들어, HMW 단백질)을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 모의 용리에서 HMW의 수준은 최소; 예를 들어, 약 5 ppm 미만, 약 4 ppm 미만, 약 3 ppm 미만, 약 2 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 응집된 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 초과 감소된다. 응집된 단백질의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99% 또는 85% 내지 99% 감소될 수 있다. 응집된 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 응집된 단백질 (예를 들어, HMW 단백질)의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 응집된 단백질 (예를 들어, HMW 단백질)의 양과 비교하여 결정된다.

세포 배양 배지 성분은 세포 배양 배지에 존재하는 성분을 지칭한다. 세포 배양 배지는 세포를 수확하는 시점에서의 세포 배양 배지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지 성분은 겐타미신이다. 겐타미신의 양은 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과 감소된다. 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99% 또는 85% 내지 99% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 감소된다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중의 세포 배양 배지 성분의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중의 세포 배양 배지 성분의 양과 비교하여 결정된다.

(C) 오염물을 검출하기 위한 방법

본 발명은 재사용가능한 크로마토그래피 물질의 세정의 유효성을 평가하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 폴리펩티드가 이전에 로딩된 바 있고 적어도 1회 용리된 바 있는 크로마토그래피 물질은 상기 기재된 본 발명의 방법 중 하나에 의해 세정된다. 이어서, 모의 용리는 세정 절차 후에 추가의 폴리펩티드가 물질 상에 전혀 로딩되어 있지 않은 물질 상에서 실행된다. 모의 용리는 물질 상에 이전에 로딩된 폴리펩티드에 대해 사용된 용리 절차에 이어질 수 있거나, 또는 용리 절차는 세정 절차 후에 정제될 폴리펩티드에 대한 용리 절차에 이어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 모의 로딩은 모의 용리 이전에 물질 상에서 실행된다. 모의 로딩은 폴리펩티드가 로딩에 포함되지 않는다는 것만을 제외하고는 물질 상에 폴리펩티드를 로딩하는 동일한 절차를 사용한다. 일부 실시양태에서, 모의 용리로부터의 용리액은 하나 이상의 분획으로 수집된다. 일부 실시양태에서, 모의 용리의 용리액은 단일 분획으로 수집된다. 일부 실시양태에서, 용리액, 또는 용리액의 샘플은 크로마토그래피 물질의 이전 로딩으로부터의 캐리오버 폴리펩티드, IgG 단편, 침출된 단백질 A, CHOP 및 CHO DNA를 비롯한 오염물에 대해 분석된다.

폴리펩티드 정량화

폴리펩티드, 예컨대 항체의 농도는 UV-가시 분광광도계 (8453 모델 G1103A; 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies); 미국 캘리포니아주 산타 클라라) 또는 나노드롭(NanoDrop) 1000 모델 ND-1000 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific); 미국 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 280 및 320nm에서의 흡광도를 통해 결정될 수 있다. 재사용가능한 크로마토그래피 물질 상에 이전에 로딩된 폴리펩티드 또는 본 발명의 방법에 의해 세정된 물질 (즉, 불순물) 상에 로딩된 폴리펩티드 이외의 종은 UV 흡광도에 대한 인지가능한 효과를 갖기에는 농도가 너무 낮을 수 있다. 필요에 따라, 샘플은 0.1-1.0 흡광도 유닛 범위의 적절한 비-간섭 희석제로 희석된다. 샘플 제조 및 UV 측정은 이중으로 수행하고, 평균 값을 기록한다. MAb 흡광 계수는 1.42 내지 1.645/mg·ml·cm 범위일 수 있다.

총 단백질은 모세관 구역 전기영동/레이저-유도 형광 검출 검정에 의해 결정될 수 있다.

IgG 검출

무손상 인간 IgG 및 인간 IgG 단편은 무손상 인간 IgG-특이적 또는 IgG 단편-특이적 ELISA를 사용하여 검출될 수 있다. 인간 Fc는 인간 Fc-특이적 ELISA를 사용하여 검출될 수 있다.

CHO 숙주 세포 단백질 (CHOP) 정량화

ELISA는 CHOP로 불리는 숙주 세포 단백질의 수준을 정량화하는데 사용될 수 있다. 항-CHOP 항체는 마이크로타이터 플레이트 웰 상에 고정화시킨다. CHOP, 표준물 및 대조군을 함유하는 샘플의 희석액은 웰에서 인큐베이션한 후에, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합된 항-CHOP 항체와 인큐베이션한다. HRP 효소적 활성은 o-페닐렌디아민으로 검출되고, CHOP는 마이크로타이터 플레이트 판독기에서 490 nm에서의 흡광도를 판독함으로써 정량화된다. 샌드위치 ELISA의 원리에 기초하여, 퍼옥시다제의 농도는 CHOP 농도에 상응한다. ELISA를 위한 검정 범위는 전형적으로 5-320 ng/ml이고, 검정내 변동성은 <10%이다. CHOP 값은 ng/ml의 단위로 보고할 수 있다. 대안적으로, CHOP 값은 MAb 농도로 나눌 수 있고, 그 결과는 PPM (백만분율; 예를 들어 CHOP의 ng/MAb의 mg)으로 보고될 수 있다. CHOP ELISA는 샘플 중 총 CHOP 수준을 정량화하는데 사용될 수 있으나, 개별 단백질의 농도를 정량화하지는 못한다.

CHO DNA 정량화

산물 샘플 중 CHO DNA는 실시간 PCR (택맨(TaqMan) PCR)를 사용하여 정량화될 수 있다. 샘플 및 대조군으로부터의 DNA는 먼저 퀴아젠(Qiagen)의 바이러스 바이오로봇(Virus Biorobot) 키트를 사용하여 추출할 수 있다. 추출된 샘플, 대조군 및 표준 DNA는 ABI의 서열 검출 시스템을 갖는 96-웰 플레이트에서 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 프라이머 및 프로브를 사용하여 택맨 실시간 PCR에 적용된다. 프라이머는 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) 게놈 중 반복 DNA 서열의 110개 염기 쌍 절편으로 정의된다. 프로브는 5' 말단에는 형광 리포터 염료로 및 3' 말단에는 켄처 염료로 표지된다. 프로브가 무손상일 때, 리포터의 방사 스펙트럼은 켄처에 의해 저해된다. 폴리머라제의 5' 뉴클레아제 활성은 프로브를 가수분해하고 리포터를 방출하여, 형광 방사를 증가시킨다. 서열 검출기는 DNA 증폭 동안 연속적으로 측정된 형광 방사의 증가에 정비례하여 증폭된 산물을 정량화한다. DNA가 역치 (CT)를 지나 증폭된 사이클의 수는 표준 곡선을 위해 계산된다. 1 pg/mL-10,000 pg/mL 범위의 표준 곡선이 생성될 수 있으며, 이는 샘플 중 DNA를 정량화하는데 사용된다.

침출된 단백질 A 정량화

단백질 A 풀 중 침출된 단백질-A의 수준은 샌드위치 단백질-A ELISA에 의해 결정될 수 있다. 닭 항-스타필로코쿠스 단백질 A 항체는 마이크로타이터 플레이트 웰 상에 고정시킨다. 샘플 처리 절차는 샘플 희석, 및 샌드위치 ELISA 상에서 샘플을 실행하기 전에 전처리 단계로서 마이크로웨이브 보조 가열을 사용하는 단백질 A/IgG 복합체의 해리를 포함할 수 있다. 단백질 A는, 샘플에 존재하는 경우에, 코팅된 항체에 결합할 수 있다. 결합된 단백질 A는 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항-단백질 항체를 사용하여 검출된다. 양고추냉이 퍼옥시다제 효소적 활성은 비색 신호를 생산하는 2 성분 TMB 기질 용액으로 정량화된다.

III. 폴리펩티드

본 발명의 방법은 다중 폴리펩티드의 정제에 사용된 크로마토그래피 물질을 세정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 대규모; 예를 들어, 재조-규모의, 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 그의 단편의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 제1 폴리펩티드, 예컨대 제1 항체의 정제에 사용되고, 이어서 물질은 본 발명의 방법에 의해 세정되고, 이어서 크로마토그래피 물질은 제2 폴리펩티드, 예컨대 제2 항체를 정제하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세정은 제2 정제된 폴리펩티드를 포함하는 제제가 제1 폴리펩티드를 본질적으로 함유하지 않도록 하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 제2 정제된 폴리펩티드 (예를 들어 제2 항체)를 포함하는 제제는 1 ppm 미만의 제1 폴리펩티드 (예를 들어 제1 항체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 정제된 폴리펩티드는 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm 또는 100 ppm 중 어느 하나 미만의 제1 폴리펩티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 치료 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 크로마토그래피 물질을 재사용하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 길항제이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 효능제이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 에피토프 태그 부착된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 길항제이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 보체 의존성 세포독성을 개시한다. 일부 실시양태에서 폴리펩티드는 항체 또는 이뮤노어드헤신이다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드는 약 5,000 달톤, 10,000 달톤, 15,000 달톤, 25,000 달톤, 50,000 달톤, 75,000 달톤, 100,000 달톤, 125,000 달톤 또는 150,000 달톤 초과의 분자량을 갖는다. 폴리펩티드는 약 50,000 달톤 내지 200,000 달톤 또는 100,000 달톤 내지 200,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 대안적으로, 본원에 사용하기 위한 폴리펩티드는 약 120,000 달톤 또는 약 25,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다.

pI는 등전점이고, 특정한 분자 또는 표면이 순수 전기적 전하(net electrical charge)를 운반하지 않는 pH이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 예를 들어 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 pI는 약 6 내지 10, 7 내지 9 또는 8 내지 9일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10의 pI를 갖는다.

본원에 기재된 방법에 의해 세정된 재사용가능한 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제된 폴리펩티드는 재조합 기술을 일반적으로 사용하여 생산된다. 재조합 단백질의 생산 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,534,615 및 4,816,567 (구체적으로 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 CHO 세포에서 생산된다 (예를 들어, WO 94/11026 참조). 재조합 기술을 이용하는 경우, 폴리펩티드는 세포내에서 또는 주변세포질 공간 내에서 생산될 수 있거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다.

본원에 기재된 방법에 의해 세정된 재사용가능한 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제된 폴리펩티드는 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 순환, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제에 의해 파괴할 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 입자형 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]은 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 폴리펩티드를 단리하는 절차를 기재하고 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 폴리펩티드가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로는 우선 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 폴리펩티드 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.

본원에 기재된 방법에 의해 세정된 재사용가능한 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제될 수 있는 폴리펩티드의 예는 이뮤노글로불린, 이뮤노어드헤신, 항체, 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역접합체, 시토카인 및 인터류킨을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리펩티드의 예는 포유동물 단백질, 예컨대 예를 들어 레닌; 호르몬; 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체화 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화시에 조절, 정상 T-세포 발현 및 분비됨); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러-억제 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 연관 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양 인자, 예컨대 골-유래의 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-b; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예를 들어 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); 시토카인; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 융합 폴리펩티드, 즉 2개 이상의 이종 폴리펩티드 또는 그의 단편 상에서 구성되고 재조합 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드; Fc-함유 폴리펩티드, 예를 들어 제2 폴리펩티드에 융합된 이뮤노글로불린 Fc를 포함하는 융합 단백질 또는 그의 단편; 면역접합체; 골 형성발생 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥시드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 예를 들어 AIDS 외피 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 연관 항원, 예컨대 CA125 (난소암 항원) 또는 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 이뮤노어드헤신; 및 상기-열거된 단백질 중 임의의 것의 단편 및/또는 변이체, 뿐만 아니라 예를 들어 상기-열거된 단백질 중 임의의 것을 포함하는 단백질에 결합하는 항체, 예를 들어 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

(A) 항체

본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 세정된 재사용가능한 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제될 수 있는 폴리펩티드, 예를 들어 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 또는 임의의 후속 폴리펩티드는 항체이다.

항체에 대한 분자 표적은 CD 단백질 및 그의 리간드, 예컨대: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79α (CD79a), 및 CD79β (CD79b); (ii) ErbB 수용체 패밀리의 구성원, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; (iii) 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린 (그의 알파 또는 베타 서브유닛 포함) (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); (iv) 성장 인자, 예컨대 VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, BR3, c-met, 조직 인자, β7 등; 및 (v) 세포 표면 및 막횡단 종양-연관 항원 (TAA), 예컨대 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

다른 예시적인 항체는 비제한적으로 항-에스트로겐 수용체 항체, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-p53 항체, 항-HER-2/neu 항체, 항-EGFR 항체, 항-카텝신 D 항체, 항-Bcl-2 항체, 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체, 항-CA15-3 항체, 항-CA19-9 항체, 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체, 항-CEA 항체, 항-망막모세포종 단백질 항체, 항-ras 종양단백질 항체, 항-루이스 X 항체, 항-Ki-67 항체, 항-PCNA 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD7 항체, 항-CD8 항체, 항-CD9/p24 항체, 항-CD10 항체, 항-CD11a 항체, 항-CD11c 항체, 항-CD13 항체, 항-CD14 항체, 항-CD15 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD23 항체, 항-CD30 항체, 항-CD31 항체, 항-CD33 항체, 항-CD34 항체, 항-CD35 항체, 항-CD38 항체, 항-CD41 항체, 항-LCA/CD45 항체, 항-CD45RO 항체, 항-CD45RA 항체, 항-CD39 항체, 항-CD100 항체, 항-CD95/Fas 항체, 항-CD99 항체, 항-CD106 항체, 항-유비퀴틴 항체, 항-CD71 항체, 항-c-myc 항체, 항-시토케라틴 항체, 항-비멘틴 항체, 항-HPV 단백질 항체, 항-카파 경쇄 항체, 항-람다 경쇄 항체, 항-멜라노솜 항체, 항-전립선 특이적 항원 항체, 항-S-100 항체, 항-타우 항원 항체, 항-피브린 항체, 항-케라틴 항체 및 항-Tn-항원 항체로부터 선택된 것을 포함한다.

(i) 폴리클로날 항체

일부 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 생성된다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 폴리펩티드, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

예를 들어 폴리펩티드 또는 접합체 100 μg 또는 5 μg (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 다중 부위에 피내로 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화한다. 1개월 후에 프로인트 완전 아주반트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10으로 다중 부위에 피하로 주사하여 동물을 부스팅한다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기에 도달할 때까지 동물을 부스팅한다. 일부 실시양태에서, 동물을 동일 항원의 접합체로 부스팅하지만, 이것은 상이한 폴리펩티드에 접합되고/되거나 상이한 가교 시약을 통해 접합된 것이다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 폴리펩티드 융합체로서 제조될 수도 있다. 또한, 응집제, 예컨대 명반이 면역 반응을 증진시키는데 적합하게 사용된다.

(ii) 모노클로날 항체

일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 세정된 재사용가능한 크로마토그래피 물질 상에서 정제된 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체 집단, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 모노클로날 항체의 생산 동안에 유발될 수 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프와 결합하는 집단으로부터 수득한다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 개별적인 또는 폴리클로날 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다.

예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수도 있고, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조할 수도 있다.

하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터는 면역화에 사용된 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 도출하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우에, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.

일부 실시양태에서, 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지지하고, 배지 예컨대 HAT 배지에 민감한 세포이다. 이들 중에서, 일부 실시양태에서, 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기재된 바 있다 (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지정된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)]의 스캐차드 분석에 의해 결정될 수 있다.

목적 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장할 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들어 폴리펩티드 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)를 사용하여 용이하게 단리 및 서열분석된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 이후에 이를 달리 이뮤노글로빈 폴리펩티드를 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 달성한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아 내 재조합 발현에 대한 검토 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) 및 Plueckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 포함한다.

추가 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편을 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 사용하는 뮤린 및 인간 항체 각각의 단리를 기재하고 있다. 후속 공개 문헌에는 쇄 셔플링에 의한 고 친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))이 기재되어 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.

DNA는 또한 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환시킴으로써 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 연결함으로써 변형시킬 수 있다.

전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 또는 이들은 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.

본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 모노클로날 항체이다.

(iii) 인간화 항체

일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 내로 도입되는 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "유입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환하는 것에 의한 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는, 실질적으로 무손상 인간 가변 도메인 이외의 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 번호 4,816,567). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체의 제조에 사용될 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적-적합" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 수용된다 (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 여러 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).

또한, 항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 방법의 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이들의 검사로 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.

(v) 인간 항체

일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 인간화에 대한 대안으로서 인간 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 면역화시, 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다고 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 챌린지 시에 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 번호 5,591,669; 5,589,369; 및 5,545,807을 참조한다.

대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))은 비면역화된 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 생산하는데 사용될 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 폴리펩티드 유전자로 프레임에 맞게 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기반으로 한 선택에 의해 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자도 선택된다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 이에 대한 검토를 위해 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합형 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 단리되었다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 배열의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.

인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수도 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).

(v) 항체 단편

일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되어 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술들이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 단편이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, scFv, Fv 및 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택된다.

(vi) 이중특이적 항체

일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 에피토프에 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 이중특이적 항체 결합 아암은 세포 방어 메카니즘을 세포에 집중시키도록 백혈구 상의 촉발 분자, 예컨대 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예컨대 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현을 기초로 하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 편성으로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10종의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 산물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

다른 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 일부 실시양태에서, 융합은 적어도 힌지의 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인에 의한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체 중 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 개별 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이는, 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 경우의 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비를 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 달성되는 경우에, 또는 비가 특정한 유의성을 갖지 않는 경우에, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.

이러한 접근법의 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터의 바람직한 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다는 것이 발견되었다. 이러한 접근법이 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 것에 관한 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)]을 참조한다.

미국 특허 번호 5,731,168에 기재된 또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 인터페이스는 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터 하나 이상의 소형 아미노산 측쇄가 보다 대형의 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 대형 아미노산 측쇄를 보다 소형의 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 대형 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "함몰부"가 제2 항체 분자의 인터페이스 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종-산물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 것은 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089)를 위해 제안되었다. 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 적합한 가교제는 관련 기술분야에서 널리 공지되어 있으며, 다수의 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229: 81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단하여 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차가 기재되어 있다. 이들 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원시켜, 이웃자리 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.

재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결되었다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후, 다시 산화되어 항체 이종이량체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 이 단편은 동일한 쇄 상의 2개의 도메인이 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인이 또 다른 단편의 상보적인 V_L 및 V_H 도메인과 쌍을 이루게 되어, 2개의 항원-결합 부위가 형성된다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)]을 참조한다.

2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)].

(vii) 다가 항체

일부 실시양태에서, 항체는 다가 항체이다. 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본원에 제공된 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체 (IgM 부류 이외의 것)일 수 있고 (예를 들어, 4가 항체), 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노-말단의 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서의 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서의 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2) n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 더 포함한다. 본원에서의 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 더 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체는 다중특이적 항체이다. 이러한 다중특이적 항체는 V_HV_L 유닛이 폴리에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (V_H) 및 경쇄 가변 도메인 (V_L)을 포함하는 항체, 각각의 V_HV_L 유닛이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 V_L 및 V_H 도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 삼관능성 항체, 공유 또는 비-공유 연결된 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 폴리에피토프 특이성; 예를 들어 동일한 또는 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일특이적이고; 예를 들어 항체는 오직 1개의 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체는 각 에피토프에 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 결합하는 IgG 항체이다.

(viii) 다른 항체 변형

본원에 제공된 항체를 예를 들어 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)이 증진되도록 이펙터 기능과 관련하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 1개 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내에 도입하여, 이 영역 내에서의 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이로써 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 항종양 활성이 증진된 동종이량체 항체는 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종이관능성 가교제를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 조작될 수 있고, 이에 의해 증진된 보체 매개 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다.

항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, US 2006/0067930 (그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 기재된 바와 같이 항체에서 아미노산 변경을 수행할 수 있다.

(B) 폴리펩티드 변이체 및 변형

본원에 기재된 항체를 비롯한 폴리펩티드의 아미노산 서열 변형(들)이 본원에 기재된 방법에 의해 세정된 재사용가능한 크로마토그래피 물질에 사용될 수 있다.

(i) 변이체 폴리펩티드

"폴리펩티드 변이체"는 폴리펩티드의 전장 천연 서열, 신호 펩티드가 없는 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 폴리펩티드, 바람직하게는 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 1개 이상의 아미노산 잔기가 전장 천연 아미노산 서열의 N 또는 C-말단에서 부가되거나 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, TAT 폴리펩티드 변이체는 전장 천연 서열 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 없는 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인에 대해 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 임의로, 변이체 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드 서열과 비교하여 1개 이하의 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 천연 폴리펩티드 서열과 비교하여 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.

변이체 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단에서 말단절단될 수 있거나, 또는 예를 들어 전장 천연 폴리펩티드와 비교하여 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정 변이체 폴리펩티드는 바람직한 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여될 수 있다. 말단절단, 결실 및 삽입을 갖는 이들 변이체 폴리펩티드는 임의의 다수의 통상의 기술에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 변이체 폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 또 다른 적합한 기술은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의한, 바람직한 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 단편의 단리 및 증폭을 포함한다. 핵산 단편의 바람직한 말단을 정의하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에서 사용된다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 본원에 개시된 천연 폴리펩티드와 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.

아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.

예를 들어, 폴리펩티드의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은 예를 들어 폴리펩티드의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실 및/또는 이들로의 삽입 및/또는 이들의 치환을 포함한다. 최종 구축물이 바람직한 특징을 갖는다는 조건 하에 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어져 최종 구축물에 도달된다. 아미노산 변화는 또한, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있는데, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.

어느 아미노산 잔기가 바람직한 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정할 때의 지침은 폴리펩티드의 서열을 공지의 상동성 폴리펩티드 분자의 서열과 비교하고, 높은 상동성 영역에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 찾아볼 수 있다.

돌연변이유발에 바람직한 위치인 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체되어 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치가, 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정밀화된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되며, 돌연변이 그 자체의 성질을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 항체 변이체를 목적 활성에 대해 스크리닝한다.

또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체에서는 항체 분자 내의 1개 이상의 아미노산 잔기가 상이한 잔기에 의해 대체된다. 치환 돌연변이유발에 대한 최대 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경 또한 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 하기 표 1에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하면, 표 1에서 "예시적인 치환"으로 명명되거나, 아미노산 부류에 대해 하기 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화를 도입하고 산물을 스크리닝할 수 있다.

<표 1> 예시적인 아미노산 치환

폴리펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선형 입체형태로서, 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는 것에 대한 효과가 현저하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]에서):

(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) 비하전된 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) 산성: Asp (D), Glu (E)

(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)

대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) )쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.

또한, 항체의 적절한 입체형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적인 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 폴리펩티드에 부가되어 그의 안정성이 개선될 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어, 인간화 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가적인 개발용으로 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 생성되는 모 항체에 비해 생물학적 특성이 개선될 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙이다. 간략하게, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7개 부위)가 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환이 생성되도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합물로서 사상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 식별하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 식별할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 표적 사이의 접촉점을 확인하기 위해서는 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 상술된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체들의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 검정에서 탁월한 특성을 갖는 항체를 추가적인 개발을 위해 선택할 수 있다.

폴리펩티드의 아미노산 변이체의 또 다른 유형은 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 폴리펩티드는 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있다. 이러한 글리코실화는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 폴리펩티드가 발현되는 동안 자연적으로 발생할 수 있거나, 인간 개입에서 비롯되는 의도적 변형일 수 있다. 변경은 폴리펩티드에서 발견되는 1개 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키는 것 및/또는 폴리펩티드에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다.

폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 나타낸다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신 또한 사용될 수 있다.

폴리펩티드에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 항체가 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 원래의 항체의 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로, 또는 글리코실화의 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성할 수 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다.

다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화, N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화를 포함한다.

(ii) 키메라 폴리펩티드

본원에 기재된 폴리펩티드는 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 분자는 항-태그 항체가 그에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이러한 에피토프-태그가 부착된 형태의 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공함으로써 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용한 친화도 정제에 의해 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있다.

대안적 실시양태에서, 키메라 분자는 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정한 영역과 폴리펩티드의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가의 형태는 "이뮤노어드헤신"으로 지칭된다.

본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이종 폴리펩티드의 결합 특이성을 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합시킨 항체-유사 분자를 지정한다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 다른 (즉, "이종") 목적하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열 및 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 내의 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.

Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 영역 대신에 가용성 (막횡단 도메인이 결실된 또는 불활성화된) 형태의 폴리펩티드를 치환한 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 융합체는 힌지, CH₂ 및 CH₃, 또는 IgG1 분자의 힌지, CH₁, CH₂ 및 CH₃ 영역을 포함한다.

(iii) 폴리펩티드 접합체

폴리펩티드 제제에 사용하기 위한 폴리펩티드는 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합될 수 있다.

이러한 접합체의 생성에 유용한 화학요법제가 사용될 수 있다. 또한, 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성핵종은 방사성접합된 폴리펩티드의 생산에 이용가능하다. 예는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y, 및 ¹⁸⁶Re를 포함한다. 폴리펩티드 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링 작용제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들어진다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 폴리펩티드에의 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다.

또한, 폴리펩티드 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체도 본원에서 고려된다.

메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다. 이후에, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 발견되었다. 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체가 또한 고려된다. 폴리펩티드-메이탄시노이드 접합체를 제조하는 것에 대한 관련 기술분야에 공지된 다수의 연결 기가 존재하며, 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020에 개시된 것을 포함한다. 이러한 연결 기는 상기-확인된 특허에 재시된 바와 같은, 디술피드 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광불안정성 기, 펩티다제 불안정성 기 또는 에스테라제 불안정성 기를 포함하며, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다.

링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상의 커플링 기술을 이용한 히드록실 기와의 반응에 의해 형성될 수 있다. 반응은 히드록실 기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.

또 다른 관심 접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 폴리펩티드를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중-가닥 DNA 절단부를 생산할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 접합체의 제조에 대해, 예를 들어 미국 특허 번호 5,712,374를 참조한다. 사용할 수 있는 칼리케아미신의 구조 유사체는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ₁ ^I를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항체가 접합될 수 있는 또 다른 항종양 약물은 항폴레이트제인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 둘 다 세포내 작용 부위를 갖고, 원형질 막을 용이하게 통과하지 않는다. 따라서, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체) 매개된 내재화를 통한 이들 작용제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 증진시킨다.

본원에 기재된 폴리펩티드에 접합될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 작용제의 패밀리 뿐만 아니라 에스페라미신을 포함한다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드와 뉴클레오티드분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이의 접합체일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (상기 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있고, 여기서 폴리펩티드 수용체 접합체는 환자에게 투여한 후에, 제거제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환계로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 전구약물 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 접합될 수 있다. 면역접합체의 효소 성분은 이를 그의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환시키도록 하는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.

유용한 효소의 예는 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 비-독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예컨대, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예컨대 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 효소적 활성을 갖는 항체 (또한, 관련 기술분야에 "아브자임"으로 공지됨)를 사용하여 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시킬 수 있다.

(iv) 기타

폴리펩티드의 또 다른 유형의 공유 변형은 폴리펩티드를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결시키는 것을 포함한다. 폴리펩티드는 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합으로 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐) 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Ed., (1990)]에 개시되어 있다.

IV. 제제 및 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드의 획득

본원에 기재된 방법에 의해 세정된 재사용가능한 크로마토그래피 물질을 사용하여 정제된 폴리펩티드는 재조합 방법을 비롯한, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 획득될 수 있다. 하기 섹션은 이러한 방법에 대한 지침을 제공한다.

(A) 폴리뉴클레오티드

"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다.

폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 mRNA를 보유하고 이를 검출가능한 수준에서 발현시키는 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 편리하게는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드-코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지의 합성 절차 (예를 들어, 자동화 핵산 합성)에 의해 얻을 수 있다.

예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 전체 이뮤노글로불린 분자 쇄, 예컨대 경쇄 또는 중쇄를 코딩할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역 (V_H) 뿐만 아니라 중쇄 불변 영역 (C_H)을 포함하고, 이는 전형적으로 3개의 불변 도메인: C_H1, C_H2 및 C_H3; 및 "힌지" 영역을 포함할 것이다. 일부 상황에서, 불변 영역의 존재는 바람직할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있는 다른 폴리펩티드는 항원-결합 항체 단편, 예컨대 단일 도메인 항체 ("dAb"), Fv, scFv, Fab' 및 F(ab')₂ 및 "미니바디"를 포함한다. 미니바디는 (전형적으로) C_H1 및 C_K 또는 C_L 도메인을 절제한 2가 항체 단편이다. 미니바디는 통상적인 항체보다 작기 때문에 이들은 임상/진단 용도에서 보다 우수한 조직 침투를 달성하여야 하지만, 2가이므로 이들은 1가 항체 단편, 예컨대 dAb보다 높은 결합 친화도를 유지하여야 한다. 따라서, 문맥상 달리 표시되지 않는다면, 본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 분자 뿐만 아니라 상기 논의된 유형의 항원-결합 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는 코딩된 폴리펩티드에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용자 프레임워크와 관련하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 것이다. 따라서, 예를 들어 프레임워크 영역은 수용자 프레임워크 영역과 관련하여 총 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

적합하게는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 단리 및/또는 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.

용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 분자가 그의 정상 또는 천연 환경에서 제거 또는 분리되거나, 또는 그것이 그의 정상 또는 천연 환경에 존재하지 않는 방식으로 생산되는 것을 나타내도록 의도된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 정제된 폴리뉴클레오티드이다. 용어 정제된은 적어도 일부 오염 분자 또는 물질이 제거된 것을 나타낸다.

적합하게는, 폴리뉴클레오티드는 관련 폴리뉴클레오티드가 조성물에 존재하는 우세한 (즉, 가장 풍부한) 폴리뉴클레오티드를 구성하도록 실질적으로 정제된다.

(B) 폴리뉴클레오티드의 발현

하기 설명은 주로 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 폴리펩티드를 생산하는 것에 관한 것이다. 물론, 폴리펩티드를 제조하기 위해 관련 기술분야에 공지되어 있는 대안적 방법을 사용할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열 또는 그의 부분은 고체-상 기술을 이용한 직접 펩티드 합성 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)] 참조)에 의해 생산될 수 있다. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 펩티드 합성기 (캘리포니아주 포스터 시티)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 달성될 수 있다. 폴리펩티드의 다양한 부분들은 개별적으로 화학적으로 합성되고, 원하는 폴리펩티드를 생성하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합될 수 있다.

본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 벡터(들)에 삽입된다. 용어 "제어 서열"은 특정한 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 제어 서열은 프로모터 (예를 들어, 천연-회합 또는 이종 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

폴리뉴클레오티드는 또 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더에 대한 핵산은 폴리펩티드가 그의 분비에 관여하는 프리단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 핵산에 작동가능하게 연결되거나, 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나, 또는 리보솜 결합 부위는 이것이 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 핵산 서열이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치하고 리딩상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어답터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.

항체의 경우, 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 핵산 절편은 이뮤노글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들)의 제어 서열에 작동가능하게 연결된다.

폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 코딩 서열 및 임의의 발현 제어 서열)를 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 원핵 세포에 대해서는 흔히 염화칼슘 형질감염이 사용되고, 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 바이오리스틱스(biolistics) 또는 바이러스-기반 형질감염을 다른 세포 숙주에 사용할 수 있다. (일반적으로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989)] 참조). 포유동물 세포의 형질전환에 사용되는 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포솜, 전기천공 및 미세주사의 사용을 포함한다. 트랜스제닉 동물의 생산을 위해, 트랜스진은 수정란 내에 미세주사될 수 있거나, 또는 배아 줄기 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있고, 상기 세포의 핵을 제핵 난모세포 내로 전달할 수 있다.

(C) 벡터

용어 "벡터"는 발현 벡터 및 형질전환 벡터 및 셔틀 벡터를 포함한다.

용어 "발현 벡터"는 생체내 또는 시험관내 발현이 가능한 구축물을 의미한다.

용어 "형질전환 벡터"는 하나의 엔티티에서 또 다른 엔티티로 전달될 수 있는 구축물을 의미하고 - 이는 해당 종의 것일 수 있거나 상이한 종의 것일 수 있다. 구축물이 하나의 종에서 다른 종으로 - 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 플라스미드에서 박테리아, 예컨대 바실루스(Bacillus) 속으로 - 전달될 수 있는 경우, 형질전환 벡터는 때때로 "셔틀 벡터"로 지칭된다. 이는 심지어 이. 콜라이 플라스미드로부터 아그로박테리움(Agrobacterium)까지 식물에 전달될 수 있는 구축물일 수 있다.

벡터는 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위해 하기 기재된 바와 같은 적합한 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 이용가능하다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열을 다양한 절차를 통해 벡터에 삽입할 수 있다. 일반적으로, 관련 기술분야 공지된 기술을 사용하여, DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 삽입한다. 이들 성분 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 통상의 기술자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.

벡터는, 복제 기점, 임의로는 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로는 프로모터의 조절제를 갖는 한, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지된 하나 이상의 선택 마커 유전자를 함유할 수 있다.

이들 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체 내에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하다.

(D) 숙주 세포

숙주 세포는 예를 들어 박테리아, 효모 또는 다른 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.

유전자 조작된 트랜스제닉 다세포 숙주 유기체는 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 유기체는 예를 들어 트랜스제닉 포유동물 유기체 (예를 들어, 트랜스제닉 염소 또는 마우스 계통)일 수 있다.

적합한 원핵생물은 유박테리움, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 이. 콜라이를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예컨대 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 공개적으로 입수가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 엔테로박테리아세아에, 예컨대 에스케리키아, 예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실루스, 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스, 예컨대 피. 아에루기노사 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적이다. 균주 W3110은 재조합 폴리뉴클레오티드 산물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주 중 하나이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이가 발생하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT kan '를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT rbs7 ilvG kan'를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4; 및 돌연변이체 주변세포질 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 대안적으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.

이러한 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용가능한 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로 임의로는 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.

진핵 미생물이 발현에 사용될 수 있다. 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 폴리펩티드-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 보다 낮은 진핵 숙주 미생물이다. 다른 것은 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대, 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris); 칸디다(Candida); 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈와니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)를 포함한다. 메탄올자화 효모가 본원에서 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다, 클로에케라(Kloeckera), 피키아, 사카로미세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어진 속으로부터 선택된, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 사카로미세스는 경우에 따라 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등이 존재하는 적합한 벡터를 갖는 바람직한 효모 숙주이다. 전형적인 프로모터로는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해 효소가 포함된다. 유도가능한 효모 프로모터는 특히 알콜 데히드로게나제, 이소시토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 사용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.

미생물 뿐만 아니라, 또한 포유동물 조직 세포 배양물을 사용하여 본원에 기재된 폴리펩티드를 발현 및 생산할 수 있고, 이는 일부 경우에 바람직하다 (문헌 [Winnacker, From Genes to Clones VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)] 참조). 일부 실시양태의 경우, 이종 폴리펩티드 (예를 들어, 무손상 이뮤노글로불린)를 분비할 수 있는 수많은 적합한 숙주 세포주가 관련 기술분야에서 개발되었기 때문에, 진핵 세포가 바람직할 수 있고, 이는 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주, 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포이다.

일부 실시양태에서, 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO 또는 CHO-DP-12 세포주); 마우스 세르톨리 세포; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.

V. 예시적 실시양태

일부 실시양태에서, 본 발명은 다음을 제공한다:

1. a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.9인 2 이상의 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 용리 완충제 중에 약 10분 내지 약 30분 범위의 시간 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 2 이상의 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; 및 d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 2 이상의 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.

2. a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.9인 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; 및 d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 4 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.

3. a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.9인 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계, b) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계, c) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계, d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 2와 1/2 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계, e) 물질을 재생 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계, 및 f) 약 2와 1/2 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.

4. a) 약 25 mM 트리스 및 약 25 mM NaCl을 포함하고 약 pH 7.1인 약 2 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 평형 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 2 물질 부피의 평형 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; d) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.8인 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; f) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; g) 0.1 N NaOH, pH 13을 포함하는 약 2 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; h) 물질을 재생 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및 i) 약 2 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.

5. a) 약 25 mM 트리스 및 약 25 mM NaCl을 포함하고 pH 7.1인 약 4 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; 및 b) i) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.8인 약 3 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; ii) 물질을 용리 완충제 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; iii) 약 1 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; iv) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 3 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; v) 물질을 재생 완충제 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및 vi) 약 1 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는 단계의 6회 사이클을 수행하는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.

6. a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.8인 약 3 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질 통해 통과시키는 단계; b) 물질을 용리 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계; c) 약 1 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 3 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 재생 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계; f) 약 1 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; g) 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 2% 벤질 알콜을 포함하고 약 pH 5.0인 약 3 물질 부피의 저장 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 저장 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및 f) 약 1 물질 부피의 저장 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계의 6회 사이클을 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.

7. 실시양태 1-6 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 물질이 크로마토그래피 칼럼에 있는 것인 방법.

8. 실시양태 1-7 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 물질이 친화성 물질인 방법.

9. 실시양태 8에 있어서, 친화성 물질이 단백질 A 친화성 물질인 방법.

10. 실시양태 9에 있어서, 단백질 A 친화성 물질이 맙셀렉트 물질, 맙셀렉트 슈어 물질 또는 맙셀렉트 슈어 LX 물질인 방법.

11. 실시양태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 물질을 폴리펩티드의 대규모 생산에 사용하는 것인 방법.

12. a) 약 40 mM 아세트산나트륨을 포함하고 약 pH 5.5인 약 3 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 약 2 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계; c) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; d) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및 f) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.

13. 실시양태 12에 있어서, 크로마토그래피 물질이 크로마토그래피 칼럼에 있는 것인 방법.

14. 실시양태 12 또는 13에 있어서, 크로마토그래피 물질이 이온 교환 물질인 방법.

15. 실시양태 14에 있어서, 이온 교환 물질이 양이온 교환 물질인 방법.

16. 실시양태 15에 있어서, 양이온 교환 물질이 포로스 HS50 물질인 방법.

17. 실시양태 12-16 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 물질을 항체의 대규모 생산에 사용하는 것인 방법.

18. a) 약 50 mM 트리스, 85 mM 아세트산나트륨을 포함하고 약 pH 8.8 및 약 8.6 mS/cm인 약 3 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; b) 약 2 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계; c) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; d) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계; e) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및 f) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.

19. 실시양태 18에 있어서, 크로마토그래피 물질이 크로마토그래피 칼럼에 있는 것인 방법.

20. 실시양태 18 또는 19에 있어서, 크로마토그래피 물질이 이온 교환 물질인 방법.

21. 실시양태 20에 있어서, 이온 교환 물질이 음이온 교환 물질인 방법.

22. 실시양태 21에 있어서, 음이온 교환 물질이 QSFF 물질인 방법.

23. 실시양태 18-22 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 물질을 항체의 대규모 생산에 사용하는 것인 방법.

24. 실시양태 1-23 중 어느 하나에 있어서, 완충제를 물질을 통해 약 30 물질 부피/시간, 약 20 물질 부피/시간 또는 약 15 물질 부피/시간으로 통과시키는 것인 방법.

25. 실시양태 1-24 중 어느 하나에 있어서, 완충제를 물질을 통해 하향류 방향 또는 상향류 방향으로 통과시키는 것인 방법.

26. 실시양태 1-25 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 물질의 세정을 크로마토그래피 물질을 세정한 후 모의 용리를 실행함으로써 측정하는 것인 방법.

27. 실시양태 26에 있어서, <0.25 mg/mL 총 단백질, < 1 ppm IgG 단편, < 1 ppm 침출된 단백질 A, <1 μg/mL CZE LIF, <1 ppm CHOP, 및 <1 pg/mL CHO DNA 중 하나 이상을 포함하는 모의 용리의 용리액이 다중산물 사용을 위한 물질의 유효한 세정을 나타내는 것인 방법.

28. 실시양태 1-27 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 물질이 알칼리에서 안정한 것인 방법.

29. 실시양태 1-28 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 물질을 폴리펩티드를 정제하는데 사용하는 것인 방법.

30. 실시양태 1-29 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 물질을 제1 폴리펩티드의 정제 후에 세정하고, 크로마토그래피 물질을 세정한 후에 제2 폴리펩티드를 정제하는데 사용하는 것인 방법.

31. 실시양태 30에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 이뮤노어드헤신인 방법.

32. 실시양태 31에 있어서, 폴리펩티드가 이뮤노어드헤신인 방법.

33. 실시양태 31에 있어서, 폴리펩티드가 항체인 방법.

34. 실시양태 33에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.

35. 실시양태 34에 있어서, 모노클로날 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 방법.

36. 실시양태 35에 있어서, 모노클로날 항체가 IgG 모노클로날 항체인 방법.

37. 실시양태 36에 있어서, 항체가 항원 결합 단편인 방법.

38. 실시양태 37에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, scFv, 디-scFv, 이중-scFv, 탠덤 (디, 트리)-scFv, Fv, sdAb, 삼관능성 항체, BiTE, 디아바디 또는 트리아바디인 방법.

39. 실시양태 38에 있어서, 폴리펩티드가 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역접합체, 시토카인 또는 인터류킨인 방법.

40. 실시양태 30에 있어서, 제1 폴리펩티드가 제1 항체 또는 제1 이뮤노어드헤신이고, 제2 폴리펩티드가 제2 항체 또는 제2 이뮤노어드헤신인 방법.

본 명세서에 개시된 모든 특성은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특성은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특성으로 대체될 수 있다. 따라서, 분명하게 달리 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특성은 단지 일련의 포괄적인 동등하거나 또는 유사한 특성의 예이다.

본 발명의 추가 상세내용은 하기의 비제한적 실시예에 의해 예시된다. 본 명세서 내의 모든 참고문헌의 개시내용은 본원에 명백히 참고로 포함된다.

실시예

하기 실시예는 순수하게 본 발명을 예시하기 위한 것이고, 따라서 본 발명을 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 하기 실시예 및 상세한 설명은 예로서 비제한적 방식으로 제공된다.

실시예 1. 단백질 캐리오버

이 실시예는, 사전-세정 시험 실행을 표준 단백질 A 친화성 물질 (0.66 x 20 cm)을 사용하여 실험실 규모로 수행하여 샘플별로 단백질 캐리오버를 정량하는 작업을 기재하고 있다. 이 실행은, 로드 사이클을 평형 완충제로 모의실험하는 것을 제외하고는 공정을 표준 정제 절차에 따라 실행하기 때문에 "모의 실행"으로 지칭되었다. 전형적 단백질 A 공정에 따라 용리 풀을 수집하고 분석하여 단백질의 존재를 결정하였다. 분석은 20-30 ppm의 단백질 캐리오버가 임의의 추가의 칼럼 세정이 없는 "모의 용리"에 존재하였음을 나타내었다. 그 결과를 제2 실행으로 확인하였다.

안전한 캐리오버 수준을 결정하기 위해, 위험 평가를 수행하여 mAb에서 허용되는 이뮤노글로불린 (IgG) 및 단백질 캐리오버 수준을 결정하였고, IgG에 대한 물질-고유의 1일 허용 노출량 (ADE)을 계산하였다. ADE 대 EDI의 비교 결과는 "최악의 경우"의 x-배 안전역이었다 (예를 들어, [OCTAGAM®; Product Approval Information Summary Basis of Approval OCTAGAM® 5%. OCTAPHARMA Pharmazeutika: Vienna, Austria. August, 2002] 참조, www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/ucm064955.pdf에 2012년 8월 7일에 접근함). "최악의 경우" 안전역은 이전 샘플로부터 허용되는 IgG 캐리오버의 최고 값이고, 이 값은 10 μg mAb A/ ml mAb B 또는 1000 ppm으로 설정되어 있다. mAb A가 캐리오버된 mAb인 경우에, mAb B는 목적하는 관심 mAb이다 (문헌 [Teschner, W., et al., Vox Sang. 2007, 92:42-55]; [Food and Drug Administration, HHS. Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. Rockville, MD. July 2005], www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CE8QFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.fda.gov%2Fdownloads%2FDrugs%2F...%2FGuidances%2FUCM078932.pdf&ei=f4QhUJv4K9Ov6gGQ-4DgAg&usg=AFQjCNFbTE75U0nDbFpfdpxK85uWXT8frg에 2012년 8월 7일에 접근함; [European Medicines Agency. Impurities: Residual Solvents, Note for Guidance on Impurities: Residual Solvents (CPMP/ICH/283/95). London, UK Sept. 1997] www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/regulation/general/general_content_000431.jsp&mid=WC0b01ac0580029593에 2012년 8월 7일에 접근함; [OCTAGAM®; Product Approval Information Summary Basis of Approval OCTAGAM® 5%. OCTAPHARMA Pharmazeutika: Vienna, Austria. August, 2002] 참조, fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/ucm064955.pdf에 2012년 8월 7일에 접근함).

물질 및 방법

장비

AKTA 익스플로러 100 시스템: 지이 헬스케어(GE Healthcare) (스웨덴 웁살라)로부터의 표준

익스플로러 100 크로마토그래피 시스템을 실험에 사용하였다. 맙셀렉트™ 슈어 (지이 헬스케어) 단백질 A 매질로 패킹된 0.66 cm 직경 x 20 cm 베드 높이 칼럼 (옴니핏(Omnifit))을 시스템 평가에 사용하였다. 시스템을 유니콘(UNICORN) 소프트웨어 (v 5.11)를 사용하여 제어하였다. 친화성 수지: 맙셀렉트™ 슈어 수지 (지이 헬스케어, 스웨덴 웁살라)가 경질, 고-유량 아가로스 매트릭스 및 알킬리-안정화된 단백질 A-유래된 리간드로 구성되기 때문에, 이를 이 프로젝트에서 선택 수지로서 사용하였다. 상기 리간드는 제자리 세정 (CIP) 프로토콜에 사용된 알칼리성 조건 하에서는 통상의 단백질 A-기재의 매질보다 더 큰 안정성을 제공하였다. 공정 경제성의 개선을 도울 수 있는 비용 효율적 시약, 예컨대 수산화나트륨으로 세정을 수행할 수 있다.

표준 정제 절차 ("모의 용리"). 단백질 A 사이클을 하기 파라미터를 사용하여 실행하였다: (a) 로드 용량이 30 g/L 수지인 맙셀렉트™ 슈어 수지, (b) 수확된 세포 배양 유체 (HCCF)를 15℃ (12-18℃) (모든 다른 단계는 실온에서)에서 0.66 x 20 cm 칼럼 상에 로딩하였고, (c) 풀 pH를 1.5 M 트리스 염기의 첨가에 의해 pH 5.0로 조정하였다. 사용된 완충제는 회분식 공정에 사용된 것과 유사하였다. 칼럼을 25 mM 트리스 및 25 mM 염화나트륨으로 평형화시키고, 0.4 M 인산칼륨으로 세척하고, 0.1 N 아세트산 (pH 2.9)으로 용리하고, 맙셀렉트™ 슈어에 대해 0.1 N 수산화나트륨으로 재생하였다 (Fahrner, R. L., et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18:301-327; Fahrner, R. L., et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30:121-128; B. Kelley, Biotechnol. Prog. 2007, 23:995-1008; Trexlar-Schmidt, M. et al., Biopharm. Intl. March 2, 2009).

완충제

하기 완충제를 사용하였다:

용리 완충제: 0.15 M 아세트산, pH 2.9

재생 완충제: 0.1 M NaOH, pH 13

평형 완충제: 25 mM 트리스, 25 mM NaCl, pH 7.1

저장 완충제: 100 mM 아세트산나트륨, 2% 벤질 알콜, pH 5.0

세정 전략.

세정 절차를 20 CV/hr 유량으로 수행하였다. 세정 절차를 2가지 인자 (a) pH 순환 및 (b) 정적 유지 시간을 기반으로 하여 개발하였다.

추가의 세정 없이 "모의 실행"에서 얻어진 사전-세정 캐리오버 결과 (20-30 ppm)는 위험 평가로 설정된 1000 ppm의 확립된 안전성 한계의 훨씬 미만이었다. 그러나, 임상 제조에 대한 한계는 1000 ppm보다 더 낮기 때문에 더 조심하기로 결정하였다. 프로젝트의 목적은 임상 제조용으로 전환될 수 있는 세정 절차를 개발하는 것이고; 따라서, 세정 절차는 캐리오버를 1 ppm 미만으로 최소화하는 것으로 확인되었다. 주의깊은 최적화 후, 최적의 세정 전략은 (a) 정적 유지 및 (b) pH 순환을 기반으로 하였다. 세정 공정에서 정적 유지 절차의 추가는 가외의 완충제를 사용하지 않고도 가외의 체류 시간을 가능하게 하였다. 증가된 체류 시간은 물질 전달을 도울 가능성이 있고, 칼럼 상에 임의의 남아있는 단백질을 완충제 내로 추출하는데 효과적으로 작용하였다. pH 순환으로 지칭되는 산성 및 염기성 완충제 간의 교대는 단백질 추출을 증대시키고, 따라서 칼럼을 효과적으로 세척하였다. 최적의 세정 조건은 용리 및 재생 완충제로서 이미 사용된 그러한 완충제를 포함하였다. '용리 완충제'는 0.15 M AcOH (pH 2.9)이고, 세정을 위한 '재생 완충제'는 0.1 N NaOH (pH 13)였다. 완충제의 선택은 이들의 각 특성을 기반으로 하였다. 예를 들어, '용리 완충제' (0.15 M AcOH, pH 2.9)를 사용하여 결합된 IgG를 단백질 A 수지로부터 세척하였다. 수산화나트륨은 단백질을 소형 단편으로 변성 및 절단함으로써 단백질 및 핵산 (생산 과정의 모든 성분)을 가용화하였다. 추가로, 수산화나트륨은 내독소를 파괴하고, 수지를 재생하였다. 이들 조건 중 어느 것도 수지와 상용성이지 않고 사내 mAb에서의 정제에 이미 사용되고 있기 때문에, 이들의 사용은 또한 경제적이었다.

수지 선택

맙셀렉트™ 슈어 단백질 A 친화성 수지는, 이것이 광범위한 작업 pH 범위 (pH 3-12)를 갖고 결합 능력의 손실 없이 염기성 조건 하에 안정하기 때문에, 최적화를 위해 선택되었다. 따라서 이는 세정을 위한 현재의 용리 (0.15 M AcOH) 및 재생 (0.1 N NaOH) 완충제와 상용성이었다.

다른 수지, 예컨대 프로셉® vA를 사전에 연구하였다. 간략하게, 몇몇 상이한 세정제를 프로셉® vA 칼럼을 세정하기 위해 연구하였다. 그러나, 대부분의 조건은 유사한 성능을 나타내었다. 다양한 완충제의 스크리닝, 이어서 연속 "모의 실행"은, 표준 정제 절차에 요약된 바와 같이, 샘플별로 감소된 단백질 캐리오버를 생성하였다. 증가된 용리 유량은 또한 칼럼을 효과적으로 세정하였다. 이 연구의 주요 소견은 정적 유지 및 pH 순환이 시험된 다른 변수와 비교하여 단백질 캐리오버의 감소에 보다 유의하게 기여하였다는 것이다. 일부 세정 절차가 프로셉® vA 상에서 단백질 캐리오버를 감소시킨다 하더라도, 그러한 감소는 파일럿 또는 보다 큰 규모에서의 그의 용법을 보증하기에는 충분하지 았았다. 그럼에도 불구하고, pH 순환 및 정적 유지 실험으로부터의 결과는 맙셀렉트™ 슈어 수지 상에서의 세정 절차를 최적화하는데 유용한 것으로 증명되었다.

분석 방법

HCCF의 항체 농도는 2.1 x 30 cm 포로스 칼럼 (어플라이드 바이오시스템즈((Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티, CA)를 애질런트(Agilent) 1100 HPLC (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 캘리포니아주 산타 클라라)을 사용하여 결정하였다. 완충제 A (100 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨, pH 6.3), 완충제 B (2% 아세트산, 100 mM 글리신) 및 완충제 C (0.1 M 인산, 20% CAN (20% 아세토니트릴))를 사용하였고, 전체 실행 시간은 4.5분이었다. 정제된 풀 중 단백질 농도는 애질런트 8453 (애질런트 테크놀로지스, 캘리포니아주 산타 클라라) 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 측정하였다. 다중-산물 효소-연결된 면역흡착 검정 방법을 CHOP 및 침출 ProA 분석에 사용하였다. 택맨(TaqMan) 폴리머라제 연쇄 반응을 CHO DNA 분석에 사용하였다. 총 단백질은 모세관 구역 전기영동/레이저-유도 형광 검출 (CZE-LIF) 검정을 사용하여 측정하였다. 무손상 항체 및 단편화된 항체 부분은 일반적 ELISA 검정을 사용하여 측정하였다. SDS/PAGE는 18% 트리스-HCl 겔 상에서 수행하였다.

세정 없이 단백질 캐리오버의 정량화

mAb 캐리오버의 결정을 위한 실험 프로토콜은 다음과 같다: 첫째로, 18회 로드 사이클의 mAb를 단백질 A 친화성 칼럼 (0.66 x 20 cm, 부피 = 6.8 mL) 상에 30 g/L로 로딩하였고, 샘플을 용리시켰다. 단백질 A 친화성 칼럼은 표 2에 요약된 칼럼 세정 절차 중 하나에 따라 후속적으로 세정하였다. 세정 후, "모의 실행"을 수행하였다. 단백질 또는 불순물 캐리오버의 수준을 결정하기 위해, 특정한 시점에서의 "모의 실행" 동안 또는 칼럼 세척 절차 동안 분석용 샘플을 또한 취하였다. 수집된 분석용 샘플을 pH 5 - 5.5 (1.5 M 트리스 염기 완충제)로 조정하고, 이어서 세제 (0.1% 폴리소르베이트, 0.05% 아지드화나트륨)로 처리하여 단백질 표면 유착 (이는 가음성 결과를 제공할 것임)을 방지하였다.

제1 실험에서 용리 풀의 캐리오버는 먼저, 간헐적 세정 없이 맙셀렉트™ 슈어 단백질 A 칼럼 상에서 순차적으로 정제되는 3종의 상이한 mAb (mAbA, mAbB 및 mAbC)에 대해 결정하였다. 3회 정제 사이클을 단백질 A 친화성 칼럼 (0.66 x 20 cm, 부피 = 6.8 mL) 상에 30 g/L로 로딩하였고, 결과는 (도 1)에 나타내었다. 데이터는 이전 실행으로부터 캐리오버된 무손상 IgG 단백질의 양 (ng 캐리오버/mg 산물)을, 용리의 함수로서 그래프화하였다. 간헐적 세정이 없는 그래프에 따르면 3회 로드 사이클에서 가장 높은 캐리오버는 30-40 ppm였다 (도 1). 상기 결과는 단백질 캐리오버를 1 ppm 미만으로 유지하기 위해, 칼럼을 재순환시키는데 있어서 추가의 세정 사이클이 필요하다는 것을 분명히 나타내었다.

맙셀렉트™ 슈어 세정 절차 (CP)의 최적화

완충제 소비 및 세정 시간을 감소시킴으로써 세정 절차를 단순화하기 위한 시도에서, 완충제 및 실행 시간의 다양한 조합이 연구되었다 (표 2, 항목 1-3). 캐리오버의 수준은 결코 한계 1 ppm의 미만이 되지 않기 때문에, 맙셀렉트™ 슈어 칼럼 상의 실험실 규모 재순환에 있어서 보다 엄격한 세정 절차가 확인될 필요가 있음이 명백하였다. 보다 엄격한 세정 조건은 정적 유지의 추가를 포함하였으며, 여기서 칼럼을 규정된 시간 기간 동안 완충제 중에 유지하였고, 0 유량으로 실행하였다 (표 2, 항목 4-5). 정적 유지는 완충제로 플러싱하는 것보다 수지로부터 더 많은 단백질을 효과적으로 세척하는 것으로 발견되었다. 정적 유지는 용리 완충제 정적 유지 후의 칼럼으로부터 세척된 무손상 IgG의 양을 5-배 효과적으로 증가시켰고, 무손상 IgG는 재생 완충제 정적 유지 후에는 검출되지 않았다 (도 2). 또한, 캐리오버의 양은 "모의 용리"에서 항목 4에 대해 10 ppm 미만의 무손상 IgG로 현저하게 감소되었고 (표 2), 항목 5에 대해 1 ppm 미만의 무손상 IgG가 캐리오버되었다 (표 2).

<표 2> 맙셀렉트™ 슈어 칼럼^a의 재사용을 위해 연구된 세정 절차

CV = 칼럼 부피. ^a0.66 x 20 cm. ^b재생 완충제 = 0.1 N NaOH (pH 13). ^c평형 완충제 = 25 mM 트리스, 25 mM NaCl (pH 7.1). ^d용리 완충제 = 0.15 M 아세트산 (pH 2.9). ^e정적 유지 = 완충제를 칼럼에서 0 mL/min 유량으로 유지함. ^f"모의 실행"에서 결정된 캐리오버. ^g저장 완충제 = 100 mM 아세트산나트륨 및 2% 벤질 알콜 (pH 5).

세정 횟수와 정적 유지 시간을 증가시키면서 항목 6-7 (표 2)로 연구하였다. 분명히, 정적 유지 시간은 추가의 세정 사이클과 함께 모든 다른 사전 연구된 조건보다 수지를 더 효과적으로 세정하였다. "모의 실행"을 수행한 후에, 항목 6에 대해 3 ppm 미만의 캐리오버 (표 2) 및 항목 7에 대해 0.3 ppm 미만의 캐리오버 (표 2)가 검출되었다 (표 2, 도 3). pH 사이클의 증가는 급격한 pH 전이 동안 더 많은 단백질을 용리하였다. 그러나, 수지 결합 능력에 해로울 수 있는 긴 정적 유지를 갖는 사이클의 수를 증가시킴으로써 0.1N NaOH를 사용한 응집 시간을 증가시켰다. 대부분의 단백질이 30-분 및 10-분 정적 유지 시간 둘 다에 대해 제1 사이클 (도 3) 동안 용리되기 때문에, 여분의 정적 유지 시간은 제한된 추가의 이익을 가졌다. 따라서, 증가된 사이클과 함께 보다 짧은 정적 유지 시간이 보다 긴 유지 시간보다 바람직하였다. ELISA 검정 이외에도, 모세관 전기영동-소듐 도데실 술페이트 분석 (CE-SDS)을 수행하여 세정 사이클을 통한 단편 클리어런스를 확실하게 하였다. 94 ng/mL "모의 용리" 샘플에 대해 항목 7 (표 2)에 요약된 절차를 사용하는 맙셀렉트™ 슈어 칼럼의 세정 후 "모의 용리"의 CE-SDS 분석은 완전 무손상인 단리된 mAb가 90% 초과였음을 밝혀내었다 (도 4).

항목 7 (표 2)의 세정 절차를 사용하는 "개념 증명"으로서 "모의 용리"의 Akta 크로마토그램 (정제 실행 동안 생성됨)은 칼럼의 효율적인 세정이 용리 완충제 (0.15 M 아세트산)로부터 재생 완충제 (0.1 N NaOH)로의 전환이 만들어졌을 때 달성되었음을 시사하였다. 이것은 각각의 6회 사이클 동안 이러한 pH 순환에 대한 UV-강도의 연속 스파이크로 입증되었다 (도 5). 종합하면, pH 순환 및 정적 유지는 이상적 세정 절차를 제공한다.

맙셀렉트™ 슈어 옴니 핏 칼럼 (0.66 x 20 cm, 부피 = 6.7 mL, HCCF의 18회 사이클, 30 g/L) 상에서의 mAbA의 정제를 위한 실험실 규모의 최적화된 세정 절차 (항목 7, 표 2)의 규모화는 단백질 캐리오버를 실제로 최소화하였다 (도 6). 그 결과는 용리 완충제 (0.15 M 아세트산)를 6회 사이클로 사용하여 칼럼을 세정한 후에, 각 사이클 후에 상당히 적은 무손상 IgG 또는 Fc 단편이 검출되므로, 사이클 6에 따라 5 ppm 미만이 검출되도록 하였음을 명백히 입증하였다 (도 6). 유사하게, 보다 적은 무손상 IgG 및 Fc 단편 (<10 ppm)이 재생 완충제 (0.1 M NaOH, 도 6)를 사용하여 각각의 6회 사이클 세척 후에 검출되었다. 추가로, "모의 용리"를 수행할 때까지 (사전-용리, 사전-재생, 및 사전-평형 후에) 1 ppm 미만의 단백질 캐리오버를 "모의 용리" 샘플에서 검출하였다 (도 6).

세정 절차 최적화의 과정 동안, 소량의 단백질은 저장 완충제 (100 mM 아세트산나트륨, 2% 벤질 알콜, pH 5.0) 중에서의 저장 기간 후에 칼럼으로부터 제거하였다. 이러한 관찰은 아마도 저장 완충제가 또한 맙셀렉트™ 슈어 수지에 대한 효율적인 세정 완충제로서 역할을 할 수 있음을 시사하였다. 그러나, 저장 완충제를 사용한 간헐적 칼럼 세정 후의 후속적 "모의 실행"은 이전에 최적화된 상태 (항목 8, 표 2; 도 7)보다 더 효율적인 칼럼 세정을 생성하지는 않았다. 또한, 공정에서 이 세정 완충제의 추가는 추가의 이익 없이 더 오랫동안 전체적인 공정을 수행할 것이다. 따라서, 기존의 최적화된 세정 절차를 계속하기로 결정하였다.

이어서, 최적화된 세정 절차 (항목 7, 표 2)는 관심 mAb에 대해 절차를 확장하기 전에 최종 시험으로서 mAbZ (14 x 20, 부피 = 3.23 L)의 정제를 위해 파일럿 규모로 구현하였다. 그 결과는 각 세정 후에 검출된 무손상 IgG 및 Fc를 감소시켜 "모의 실행"의 "모의 용리"에서 1 ppm 미만의 단백질 캐리오버가 검출될 것으로 기대되기 때문에 유망하였다. 이 특정한 파일럿 실행은 이전에 9회 정제 사이클에 사용되었던 맙셀렉트™ 슈어 칼럼 상에서 mAbZ에 대해 수행하였다 (도 8).

이 세정 절차가 매우 효과적이기 때문에, 총 5개의 파일럿 규모 칼럼을 구현 후에 세정하였다. 다른 불순물, 예컨대 침출된 단백질 A (침출된 단백질 A 검정) (Zhu-Shimoni, J., et al., J Immunol. Methods. 2009, 341:59-67), 다른 단백질 (CZE LIF- 총 단백질, 검정; 제조에서 문헌 [D. Michels]), 차이니즈 햄스터 난소 단백질 (CHOP 검정; 문헌 [Fahrner, R. L. et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30:121-128]) 및 DNA (CHO DNA 검정; CHO DNA 분석에 사용된 택맨 폴리머라제 연쇄 반응), 항체의 Fc 단편 (인간 Fc ELISA; 무손상 항체 및 단편화된 항체 부분을 일반적 사내 개발된 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하였음) 및 총 항체 (무손상 인간 IgG ELISA; 무손상 항체 및 단편화된 항체 부분을 일반적 사내 개발된 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하였음)의 양을 결정하기 위한 모든 이들 파일럿 규모 샘플의 추가 분석을 또한 수행하여 파일럿 규모로 유사하게 수행되는 공정을 검증하였다 (표 3). 기대되는 바와 같이, 모든 검출된 불순물은 허용되는 한계 미만인 것이 양호하고, 세정 절차는 mAb의 정제에 사용될 수 있다 (항목 6, 표 3).

<표 3> 최적화된 세정을 사용하는 mAbZ의 파일럿 규모 정제로부터의 모든 샘플의 분석.

결과

이전에 최적화된 확장된 세정 조건 (항목 7, 표 2)은 미래 연구를 위해 다소 변형되었고, 10분 정적 유지 시간 대신에 15분 정적 유지 시간을 포함하였다 (도 8). 수지를 세정하는 전체적인 공정은 20 칼럼 부피 (CV)/시간 유량으로 4.5시간 소요되었고, 이를 6회 사이클 (6회) 동안 실행하였다. 이러한 조건은 용리 및 재생 완충제 사이의 pH 순환, 및 칼럼을 효과적으로 세척하기 위한 정적 유지를 포함하였다. 간략하게, 절차는 도 9에 상세설명된다. 전체 공정은 총 6회 사이클을 실행하여 수지를 철저하게 세척하였다. 최종적으로, 수지는 저장 완충제 (5CV, 저장 완충제) 중에서의 저장 전에 평형 완충제 (3CV)로 세척하였다. 수지-세정을 효과적으로 모니터링하기 위해, 샘플을 15-분 유지 시간 후에 수집하여 각 사이클에서 캐리오버를 분석하고, 얼마나 많은 단백질이 각 단계 및 각 사이클에서 수지로부터 제거되었는지 결정하였다 (도 9).

수지를 세정한 후, "모의 실행"을 수행하여 단백질 캐리오버를 검증하였다 (도 9). "모의 용리"를 수집하고 검정하여 캐리오버의 양 및 다른 불순물의 존재를 결정하였다 (Zhu-Shimoni, J., et al., J Immunol. Methods. 2009, 341:59-67; Fahrner, R. L., et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30:121-128). 총 단백질을 모세관 구역 전기영동/레이저-유도 형광 검출 (CZE-LIF) 검정 (제조에서, 문헌 [D. Michaels et al.])을 사용하여 측정하였다. 택맨 폴리머라제 연쇄 반응을 CHO DNA 분석에 사용하였다. 무손상 항체 및 단편화된 항체 부분을 일반적 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하였다. 이들 다른 불순물은 숙주 세포 성분, 단백질, 바이러스 또는 DNA를 포함한다. 이들 검정은 ELISA를 사용하는 무손상 인간 이뮤노글로빈 (IgG), 또 다른 ELISA에서 인간 Fc 단편, 모세관 구역 전기영동/레이저-유도 형광 검출 검정 (CZE/LIF)을 사용하는 임의의 다른 단백질, CHOP 검정에서의 차이니즈 햄스터 난소 단백질 (Fahrner, R. L., et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30:121-128)에 대한 시험, 및 침출된 단백질 A 검정 (Zhu-Shimoni, J., et al., J Immunol. Methods. 2009, 341:59-67)을 포함한다. "무손상 인간 IgG ELISA" 및 "인간 Fc ELISA"에서, 칼럼 상의 전체 항체 또는 항체 단편의 양을 정량화하고; 여기서 전자는 단편 항원-결합 영역 (Fab) 및 결정화가능 단편 (Fc) 영역 둘 다에 결합하고, 후자는 인간 Fc 영역에만 결합한다. CZE-LIF 검정은 샘플 중 단백질의 총량을 정량화함으로써 그 결과를 확인할 수 있다. 최종적으로, 단백질 A는 실행 동안 또는 너무 강력한 세정 동안 결합 능력에 부정적으로 충격을 가하여 수지로부터 침출될 수 있는 것으로 공지되어 있으며, 따라서 침출된 단백질 A의 양을 결정하는 것이 중요하였다 (Fahrner, R. L., et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30:121-128; Kelley, B., Biotechnol. Prog. 2007, 23995-1008; D. Michaels, in preparation; Fahrner, R. L., et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18:301-327).

세정 절차의 효율을 시험하기 위해, 관심 mAb인 mAbC를 AKTA 익스플로러 100이 장착된 맙셀렉트™ 슈어 칼럼 (0.66 x 20 cm, 부피 = 6.8 mL) 상에서 실험실 규모로 정제하였다 (2.2에 기재된 바와 같음). 여러 세정 사이클 동안 및 그 후에 단백질 캐리오버를 측정하고, 그 결과는 단백질 캐리오버가 각 세정 사이클 후에 감소되었음을 입증하였다 (도 10). 후속 "모의 실행"에서 mAbC의 무손상 IgG 단백질 및 Fc 단편 캐리오버는, 용리 완충제를 사용한 제1 사이클에서는 25 ng/mg 무손상 IgG 및 35 ng/mg Fc 단편으로부터, 용리 완충제를 사용한 제6 사이클 후 둘 다에 대해 5 ng/mg 미만으로 감소하였다 (도 10). 재생 동안 및 그 후 (용리에 이어짐), 제6 사이클에 도달할 때까지 (5 ng/mg 미만의 캐리오버의 수준으로 누적 감소됨) 상당히 더 많은 무손상 IgG 및 Fc 단편이 칼럼으로부터 세척되었다. 캐리오버를 시험하기 위해 "모의 실행" (전체 세정 사이클 후 실행)을 수행하고, 추가의 IgG 및 Fc 단편을 사전-재생 시에 칼럼으로부터 세척해냈지만, "모의 용리" 공정이 시작할 때까지 (여기서 제2 mAb는 재사용 공정에서 제거될 것으로 기대될 것임) 1 ppm 미만의 IgG 및 Fc 단편이 검출되었다 (도 10). 종합하면, 이들 결과는 이들 조건이 효과적인 세정 조건이고, 이전 실행으로부터 캐리오버된 단백질의 총량은 이 세정 절차를 사용한 후 수지를 재사용하는 경우에 1 ppm 미만일 것임을 확인한다.

사이클 세척 당 어떠한 유형의 단백질 단편이 존재하는지에 대한 더 우수한 아이디어를 얻기 위해, 각 사이클로부터의 샘플을 10% 트리스-HCl 겔 (mAbC) 상에 실행하였다 (도 11) (Trexlar-Schmidt, M., et al., Biopharm. Intl. March 2 2009). 사이클 1부터 사이클 6까지 더 적은 단백질이 각 연속 사이클에서 관찰되었다 (각 레인에서 밴드 강도가 감소됨, 도 11). 추가로, 정적 유지 사이클로부터의 샘플을 갖는 레인은 사이클 1-6동안보다 더 농축되었으며, 보다 많은 단백질이 각 정적 유지 사이클 후에 제거되었다. 이들 결과는 연장된 체류 시간이 잔류 단백질을 칼럼으로부터 제거하는 것을 돕는다는 것을 입증한다.

이 최적화된 세정 공정은 맙셀렉트™ 슈어 칼럼 (13.8 x 20, 부피 = 3 L) 상의 파일럿 규모에서 mAbX의 정제로 확장되었다. 그 결과는 이전에 실험실 규모에서 보여진 결과와 유사하였다 (도 6). 실험실 규모 실행에서 보여진 것처럼, 단백질 불순물은 초기 세정 단계에서 수지로부터 제거되고, 그의 전체적인 농도는 제6 사이클에 도달할 때까지 각 용리 및 재생 사이클 후에 감소하였다 (도 12). 수지 재생 동안 칼럼으로부터 초기 세척된 단백질의 양은 제6 사이클 후보다 훨씬 더 많고, 이에 따라 제6 재생 사이클에 도달시에 1 ppm 미만의 단백질 불순물이 검출되었다 (도 12).

맙셀렉트™ 슈어 칼럼 (20 x 20, 부피 = 6.28 L) 상에서의 mAbY의 정제, 및 상기 기재된 세정 프로토콜을 사용한 후속 칼럼 세정 (도 9), 이어서 "모의 실행"은 모의 용리에서 제6 재생 사이클 후 1 ppm 미만의 침출된 단백질 A, 0.25 mg/mL (정량화 한계) 미만의 CZE-LIF, 0.5 ppm 미만의 CHOP, 및 1.0 pg/mL 미만의 CHO DNA를 생성하였다 (표 4). 모든 불순물은 기록된 데이타에 필적하고, 허용 한계 내에 있었다.

<표 4> 최소 캐리오버를 검증하기 위한, 최적화된 세정 절차 MSSCCP를 사용한 맙셀렉트™ 슈어 칼럼 상의 mAbY의 대규모 칼럼 (6.28 L) 정제로부터의 모든 샘플의 분석.^a

최적화된 세정 프로토콜 (도 9)의 견고성에 대한 최종 시험에서, 153회의 다중산물 로드 사이클을 이전에 경험한 바 있는 6.28 L 맙셀렉트™ 슈어 수지를 사용하여 관심 mAb를 정제하였다. 이전에 사용된 수지로부터 "모의 실행"으로의 캐리오버 (항목 1, 표 5)를 3종의 다른 상이한 맙셀렉트™ 슈어 수지로부터 관찰된 캐리오버와 비교하였다. 그 결과는 표 5에 요약하였다. 간략하게, 오래된 맙셀렉트™ 슈어 대규모 다중산물 수지 (항목 1, 및 2, 표 5)는 새로운 mAb 특이적 (다중산물 아님) 맙셀렉트™ 슈어 수지 (항목 3, 표 5) 및 새로운 mAb 특이적 실험실 규모 맙셀렉트™ 슈어 수지 (항목 4, 표 5)와 동등하게 거동하였다. 그 결과에 따라 모든 단백질 A 수지는 필적하는 CHOP, 응집체 백분율 및 침출된 단백질 A (ng/mg)와 함께 90% 초과 수율의 mAb를 제공하였다. 종합하면, 다중산물 수지는 산물 불순물 프로파일 또는 단계 수율에 부정적 영향을 갖지 않았다. 파일럿 규모 및 실험실 규모 결과도 또한 비슷하였다 (항목 4, 표 5).

제시된 작업 뿐만 아니라, 상기 절차를 사용하여 세정된 다중산물 수지 상에서 몇몇의 더 많은 mAb를 정제하였다. 그 결과는 모두 0.25 ppm (검정 검출 한계) 미만의 총 단백질 수준과 매우 유사하고 재현가능하였다 (표 6). 그 결과는 최적화된 세정 절차가 다중산물 맙셀렉트™ 슈어 단백질 A 수지를 세정하고 재생하고 재사용하고 재순환시키는 효율적이고 재현가능하고 견고한 방식임을 시사한다. 간헐적 단백질 A 수지 세정을 위한 MSSCCP 세정 절차의 사용은 단백질 캐리오버를 하기에 잘 확립된 안전역으로 감소시켰다.

<표 5> 최적화된 세정 절차^a를 사용한 후 다양한 맙셀렉트™ 슈어 칼럼의 mAb 산물 수율 및 불순물 프로파일의 비교.

^a특정한 검정에 대한 정보를 위해, 지원 정보를 참조함. ^b칼럼 A는 사전에 153회 로드 사이클에 사용된 오래된 맙셀렉트™ 슈어 다중산물 칼럼임. ^c칼럼 B는 보다 새로운 맙셀렉트™ 슈어 칼럼 상에서의 실험실 규모 실행임. ^d칼럼 C는 맙셀렉트™ 슈어 mAb-특이적 칼럼 (다중산물 칼럼 아님) 상에서의 파일럿 규모 정제임. ^eExchg. = 교환. ^fag. = 응집체. ^g칼럼 D는 보다 새로운 실험실 규모 mAb 특이적 맙셀렉트™ 슈어 칼럼임.

맙셀렉트™ 슈어 단백질 A 수지가 산물 순도 및 또는 수지 결합 능력의 손실에 영향을 미치지 않으면서 다중-산물 정제에 사용되도록 하는 고도로 효과적인 맙셀렉트™ 슈어 세정 방법이 개발되었다. 실험실 뿐만 아니라 파일럿 규모 실험으로부터의 데이터는 0.15 M 아세트산 (용리 완충제) 및 0.1 N 수산화나트륨 (재생 완충제) 세척 및 15분 유지 시간의 6회 사이클을 포함하는 세정 프로토콜이 이러한 제1 mAb 세정 단계에서 맙셀렉트™ 슈어 수지를 5 ppm 미만의 단백질 캐리오버까지 세정한다는 것을 시사한다. 상기 공정은 파일럿 규모의 다중-산물 단백질 A 수지 (맙셀렉트™ 슈어)에 대해 성공적으로 구현되었으며, 이는 전략의 유용성에 대한 추가 신용을 제공하였다.

<표 6> 다중산물 칼럼 상에서 최적화된 세정 절차를 사용하여 세정된 단백질 A 수지 상에서 정제된 사내 mAb의 분석.

실시예 2. 다중-산물 사용을 위한 이온 교환 칼럼의 평가

유사한 세정 공정이 이온 교환 크로마토그래피를 위해 개발될 수 있을지 결정하기 위해 연구를 수행하였다. ProA 풀로부터의 MAbA 및 MAbB를 양이온 교환 칼럼 (포로스) 또는 음이온 교환 칼럼 (QSFF) 상에 로딩하였다. 정상 용리 후에, 이어서 칼럼을 "모의 용리"에 적용하였다. 분획을 맙셀렉트슈어 검정을 사용하여 MAbA 및/또는 MabB의 존재에 대해 분획을 분석하였고, 검출 한계는 0.82 ng/mL였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 모의 용리 결과는 칼럼의 추가 세정의 필요성을 나타내었다.

하기의 제자리 세정 (CIP) 절차를 시험하였다.

I. 3 CV 평형 완충제

II. 2 CV 0.5 N NaOH

10분 정적 유지

III. 1 CV 0.5 N NaOH

10분 정적 유지

IV. 1 CV 0.5 N NaOH

V. 세정 후 모의 실행

샘플을 저농도의 세제 (0.1% 폴리소르베이트 20, 0.05% 아지드화나트륨)로 조건화하여 샘플이 용기의 벽에 유착되는 것을 방지하였다. 샘플을 칼럼 상에 로딩하기 전에 중성 pH로 조정하였다. MAbA 및 MAbB를 양이온 교환 칼럼 (포로스) 또는 음이온 교환 칼럼 (QSFF) 상에 로딩하였다. 정상 용리 후에, 칼럼을 상기 기재된 프로토콜을 사용하여 세정하였다. 제2 세트의 칼럼에 MAbA 또는 MAb B를 로딩하였지만, 용리 후에는 상기 프로토콜을 사용하여 세정하지 않았다. 이어서, 모든 칼럼을 "모의 용리"에 적용하였다. 모의 용리액을 무손상 IgG의 존재에 대해 분석하였고, ELISA에 의해 분석하였다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 세정 방법은 MAbA의 단백질 캐리오버를 포로스 칼럼에서 현저하게 감소시켰고 (패널 A), MAbB의 단백질 캐리오버를 QSFF 칼럼에서 현저하게 감소시켰다 (패널 B). MAbA 캐리오버는 심지어 CIP 단계 없이도 QSFF 칼럼으로는 거의 나타나지 않았고 (패널 A), MAbB 캐리오버는 심지어 CIP 단계 없이도 포로스 칼럼으로는 거의 나타나지 않았다 (패널 B).

제3 항체, MAbC를 포로스 및 QSFF 칼럼에 적용하였고, 세정 프로토콜의 선택된 단계의 마지막에 칼럼으로부터의 무손상 IgG 용리의 양은 CIP 사이클의 마지막까지 단백질 캐리오버의 양이 0.1 ppm 미만인 것으로 측정되었다 (도 15). 모의 용리 풀의 단백질 캐리오버는 또한 0.1 ppm 미만이었다.

세정 프로토콜이 해당 규모로의 이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 대해 효과적일지 결정하기 위해, MAbD로 사전 로딩된 파일럿 규모 칼럼 상에서 세정 프로토콜을 실행하였다. 칼럼은 7.22 L 포로스 HS50 칼럼 및 1.57 L QSFF 칼럼이었다. MAbD의 로딩 및 용리 후에, 칼럼은 세정 없이 모의 평형화시키고, 이어서 모의 용리하였다. 이어서, 칼럼을 상기 기재된 CIP 프로토콜에 따라 세정한 다음, 추가의 모의 평형화 및 모의 용리로 세정하였다. 각 단계로부터의 샘플을 제거하고, 상기 기재된 바와 같이 무손상 IgG에 대해 분석하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다. 포로스 HS50 칼럼 및 QSFF 칼럼 둘 다에 대해, 단백질 캐리오버는 약 0.1 ppm 미만이었다.

실시예 3. 다중-산물 사용을 위한 프로셉 A 칼럼의 평가

다양한 세정 용액을 소규모로 평가하여, 어느 용액이 산물 캐리오버를 감소시키는데 가장 효과적인지 평가하였다. 산, 카오트로프제, 염 및 유기 용매를 포함하는 여러 다양한 카테고리의 용액을 시험하였다. 실제 공정 조건은 사용된 특정한 산물에 따라 상이할 수 있지만, 이 연구는 표준 단백질 A 항체 공정을 따라 고안되어 일반적 공정 조건을 가장 잘 모방하였다.

흐름은 세정 사이클을 제외하고는 모든 공정에 대해 칼럼을 통한 하향류 방향으로 지정되었다. 세정 사이클 전체에 걸쳐, 흐름은 최선의 경우의 세정 시나리오를 만들려는 희망에서 칼럼을 통해 상향으로 지정되었다. 공급원료가 로딩 사이클 동안 칼럼을 통해 하향 방향으로 지정되었기 때문에, 단백질 A 칼럼 상단은 이론적으로 대부분 오염될 것이다. 세정 사이클의 흐름을 상향으로 지정함으로써, 이론은 캐리오버 및 다른 불순물이 칼럼의 상단에 조성되고, 용리 전에 전체 칼럼 길이를 통해 횡단하지 않을 것이라는 점이다. 이러한 연구 시, 상향류가 칼럼을 세정하는데 있어서 하향류보다 임의로 더 유익한 것인지는 불명확하였다. 이 섹션의 목적을 위하여, 모든 실험은 상향류를 사용하는데 있어서 일관적이었기 때문에, 이러한 발견에도 불구하고 상이한 세정 용액 사이의 비교가 이루어질 수 있다.

물질 및 방법

단백질 A 크로마토그래피 공정

단백질 A 크로마토그래피를 AKTA 익스플로러 100 크로마토그래피 시스템 (아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)) 및 유니콘 5.10 제어 소프트웨어 (지이 헬스케어)를 사용하여 수행하였다. 프로셉 A 수지를 프로셉 vA 수지 대신 사용하였다. 2종의 수지의 성능은 이전에 동등한 것으로 나타난 바 있다. 수지를 0.66 cm 직경 옴니핏 유리 칼럼에 베드 높이 14 cm로 패킹하였다. 나이브 수지를 매 실행 시 패킹하였다. 모든 실험을 실온 (20-30℃)에서 수행하였다. MAb1 및 mAb2 수확 세포 배양 유체 (HCCF)를 사용하였다. 표준 단백질 A 항체 공정을 30 CV/hr의 유량, 14g/L 수지의 로딩 용량으로 유지하였고, 280 nm에서의 UV 흡광도를 기준으로 하여 2 CV의 최종 부피에 대해 0.5 OD로부터 풀링하였다.

용리 및 재생의 사전-사이클은 평형, 항체 로드, 3회 세척, 용리/풀링, 및 재생으로 이루어진 로딩 사이클로 이어졌다. 9회 로딩 사이클을 순차적으로 실행하여 칼럼을 충분히 오염시켰다. 재생, 평형, 시험하려는 세정제 10 CV, 및 재생의 확장으로 이루어진 세정 사이클이 이어졌다. 이 세정 사이클을 상향류 방향으로 10 CV/hr의 보다 느린 유량을 사용하여 실행하였다. 1 CV 분획을 세정 용액 블록을 통해 수집하였다. 이어서, 칼럼을 일련의 모의 실행 (캐리오버 사이클)을 실행하기 전에 저장하여 산물 캐리오버를 평가하였다. 사전-사이클, 정상 로딩 사이클 및 저장으로 이루어진 완전성 체크가 모의 실행에 이어져서 단백질 수율이 감소하지 않았음을 확실하게 하였다. 각 실험을 이중으로 수행하였다.

모의 실행은 로드 단계를 제외한 각 공정 단계의 통상의 단계가 이어지는 실행으로서 정의되며, 그 동안에는 어떠한 단백질도 칼럼 상에 로딩되지 않는다. 대신, 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 칼럼 상에 로딩하여 (모의 로드) 단백질을 갖는 정상 로드 풀의 부피, pH, 및 전도성을 모방하였다. 캐리오버 샘플 풀 (모의 풀)을 정상 단백질 용리 풀이 수집된 동일한 출발 부피에서 모의 실행으로부터 수집하였다.

총괄적인 공정 흐름은 다음과 같이 요약된다:

사전-사이클

용리 3 CV

재생 3 CV

로딩 사이클 (x9)

평형 4 CV

HCCF로의 로드 14 g/L

세척 1 3 CV

세척 2 3 CV

세척 3 3 CV

용리/풀 3 CV

재생 3 CV

세정 사이클

재생 7 CV

평형 5 CV

세정제 10 CV

재생 10 CV

저장 5 CV

사전-사이클

모의 실행

로딩 사이클 (PBS 로드)

완전성 체크

로딩 사이클 (HCCF 로드)

저장

완충제 성분은 표 7에 나타내었다.

<표 7> 단백질 A 크로마토그래피 공정에 사용된 완충제의 조성.

세정제 조성은 표 8에 나타내었다.

<표 8> 세정제의 조성

단백질 A 풀의 공정-후

용리 3시간 내에, 세정 분획 및 캐리오버 풀은 폴리소르베이트 20 및 아지드화나트륨을 사용하여 0.1% 폴리소르베이트 20 및 0.05% 아지드화나트륨의 최종 농도로 조건화되었다. 폴리소르베이트 20은 낮은 수준의 단백질이 샘플 용기 벽에 유착하는 것을 방지하는 세제이고, 아지드화나트륨은 박테리아 성장을 방지하는 보존제이다. 단백질 A 풀 (단백질 및 모의 둘 다)은 pH 5.0으로 조정되었고, 세정 분획은 1.5 M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.0 - 7.0 사이로 조정하였다. 모든 샘플을 산물 (무손상 IgG)에 대한 분석시까지 4℃에서 저장하였다.

분석

단백질 풀 농도는 280 nm의 흡광도에서 UV 분광광도계 (시마즈(Shimadzu))를 사용하여 관측되었다. 세정 및 모의 풀 샘플을 이중으로 또는 삼중으로 적용하고, 무손상 인간 IgG ELISA를 사용하여 산물에 대해 분석하였다.

무손상 인간 IgG ELISA로부터의 결과는 하기 계산을 사용하여 캐리오버 값으로 변환시켰다:

최악의 경우 캐리오버를 나타내기 위해, 각 실험의 단백질 풀 샘플로부터의 최저의 산물 농도를 캐리오버 계산에 사용하였다 (표 9).

<표 9> 캐리오버 계산에 사용된 산물 농도

결과

세정 용액 스크리닝으로부터의 캐리오버 결과는 도 17에 요약된다. 비교를 위해, 2개의 실행을 수행하였으며, 여기서 모든 공정 단계는 동일하였지만, 세정 사이클은 전혀 수행되지 않았다. 세정되지 않은 칼럼과 비교하는 경우에, 세정 용액에 노출된 모든 칼럼은 캐리오버의 뚜렷한 감소를 나타내었다. 평균 캐리오버는 세정 사이클에 노출되지 않는 칼럼과 비교하는 경우에 65-93% 감소하였다.

평형 완충제는 원래, 단백질이 평형 완충제에 노출되는 경우에 단백질 A 칼럼으로부터 정상적으로는 용리되지 않기 때문에, 세정 용액에 대한 음성 대조군으로 포함되었다. 그러나, 평형 완충제는 캐리오버의 감소에 있어 다른 임의 용액과 마찬가지로 수행하였다. 이것은 칼럼을 통과한 완충제의 추가의 관통액이 실제 용액 조성에 상관 없이 캐리오버를 제거하는 것을 보조하였음을 시사하였다.

실행 사이의 높은 변동성이 상이한 세정 용액 중 다수에서 보였다. 이 변동성은 실험 전체에 걸쳐 2종의 상이한 공급원료의 사용에 부분적으로 기인할 수 있다. MAb1 HCCF는 각각 하기 샘플로부터의 2개 실행 중 하나에 대해 사용되었다: 세정 없음, 평형 완충제, 6M 구아니딘 HCl, 1% v/v 인산, 19% 에탄올, 0.1M 이미다졸/19% 에탄올; mAb2 HCCF는 다른 모든 실행에 사용되었다. 제한된 공급원료 입수가능성은 모든 실행 전체에 걸친 일관된 공급원료의 사용을 방해하였다. 그러나, 일관되지 않은 공급원료는, 2 M 인산칼륨 샘플이 양쪽 실행에 대한 mAb2 HCCF의 사용에도 불구하고 높은 변동성을 나타내었기 때문에 (56.5% RSD), 보여진 모든 변동성을 설명할 수는 없다.

추가의 로드 사이클을 각 실행의 캐리오버 사이클 후에 수행하여, 세정 후 칼럼의 성능을 평가하였다. 산물 수율은 세정제에의 노출 전에 로드 사이클 동안 획득된 수율 (결과는 나타내지 않음)과 일치하였다.

분획을 세정 사이클의 세정제 블록마다 수집하여 세정에서 나온 항체의 양을 평가하였다 (도 18). 일부 세정제는 단백질에 대한 변성 효과를 가질 수 있기 때문에, 결과는 절대량을 밝히는 것보다는 오히려 경향을 확립하는데 사용되었다. 모든 세정제는 낮은, 10 CV 내에서 우수하게 거의 일정한 수준으로 안정화된 항체 양을 방출하였다. 대조적으로, 모의 사이클 동안 용리된 캐리오버는 보다 더 높은 농도로 잔류하였다. 단백질 분해가 예상되지 않는 완충제, 예컨대 평형 완충제의 사용시에도, 세정으로부터 방출된 낮은 수준의 항체에도 불구하고 보다 높은 수준의 캐리오버가 관찰되었다. 이러한 발견은 세정 지속시간의 단순 감소 또는 연장이 이 세정 절차가 사용될 때 캐리오버 수준에 상당히 영향을 미치지는 않을 것임을 시사한다.

여러 연속 모의 실행은 시험된 각 용액에 대한 세정 사이클 후에 수행되었다. 0.1 M 아세트산 세정의 5회 연속 모의 실행으로부터의 UV280nm 신호는 도 19의 크로마토그램에서 오버레이하여 나타내었다. 수행된 모든 연속 모의 실행에 대하여, 풀링 영역의 예리한 피크는 점차 감소하였다. 각 연속 사이클에서 캐리오버의 이러한 감소는 이 특정한 칼럼에 제한되지 않았다. 도 20에 나타날 수 있는 바와 같이, 동일한 경향이 스크리닝된 거의 모든 세정 용액에서 발생하였다. 심지어 세정이 칼럼 상에서 이루어지지 않은 경우라해도, 캐리오버는 수행된 각각의 가외 모의 실행에서 유의하게 감소하였다. 도 21에서, 6M 구아니딘 HCl 샘플은 제2 캐리오버로부터의 데이터는 상실하였지만, 동일한 경향을 보였다. 20% 헥실렌 글리콜 샘플은 제5 캐리오버까지 또한 동일한 경향을 제시하였다. 제5 캐리오버의 높은 값은 샘플링에서 실제 캐리오버 결과인지 또는 인간 오류를 반영하는지는 결정되지 않았다.

각 연속 모의 실행에서의 캐리오버의 감소는 보다 특화된 세정제, 예컨대 스크리닝된 것들 대신에 표준 단백질 A 완충제를 사용하여 캐리오버를 감소시킬 수 있음을 시사하였다. 기존 완충제의 사용은, 완충제 회분화(batching)에 있어서 더 적은 제작 시간을 요구할 것이고 칼럼에 대한 화학물질의 영향에 관한 불확실성이 더 적을 것이기 때문에, 정제 파일럿 플랜트에서 이러한 세정 절차를 보다 용이하게 구현한다.

보다 중요하게는, 이러한 결과는 또한 단백질 A 칼럼을 위한 대안적 세정 절차로서 모의 실행 완충제의 펄싱을 제안하였다. 캐리오버가 0.1 M 아세트산 또는 1% v/v 인산에 대한 연속 노출로부터보다는 연속 모의 실행으로부터 더 감소되었기 때문에, 모의 실행 동안의 용리 및 재생 완충제의 낮은 pH는 개선된 세정을 완전히 설명하지는 못한다. 그 대신, 모의 실행 동안의 고-저 pH 전이가 캐리오버 감소의 원인이 될 가능성이 있다.

도 21은 2 M 아르기닌 HCl 샘플이 캐리오버 감소 경향을 따르지 않았다는 것을 보여준다. 제3 모의 실행 후에 및 가능하게는 그 동안

kta 시스템으로의 전력을 차단하여 칼럼을 완충제 중에 유지되도록 하였다. 연장된 지속기간의 완충제 노출 후에 상승된 캐리오버는 단일 캐리오버 결과로는 얼마나 많은 단백질이 칼럼에 남아있는지를 전적으로 표시하지는 못할 수 있음을 시사하였다. 심지어 초기의 결과가 칼럼이 "깨끗"한 것으로 제안한 후에 추가 캐리오버 용리의 가능성은 중요한 장애물을 제시한다.

프로셉 A로 패킹된 단백질 A 칼럼에서 캐리오버를 감소시킬 적합한 세정 전략을 확인하기 위해 10종의 다양한 세정제를 스크리닝하였다. 모든 세정 용액은 캐리오버의 감소를 보조하였으나; 변동성에 대한 문제 때문에, 대부분의 작용제는 유사한 성능을 나타내었다. 연속 모의 실행으로부터 분석한 캐리오버 풀은 수행된 각 추가의 모의 실행에 대한 감소된 캐리오버의 경향을 제시하였다.

실시예 4. 고-저 pH 완충제 펄싱

산물 캐리오버의 감소 수단으로서 모의 실행 완충제의 펄싱을 조사하기 위해 연구를 수행하였다. 일단 기본 전략이 확인되면, 보다 큰 소규모 칼럼을 사용하여 최적화를 수행하였다. 최적화 파라미터는 흐름 방향성, 유량 및 정적 침지의 분석을 포함하였다.

물질 및 방법

산물 용리의 예비 분석

단백질 A 크로마토그래피는 15℃에서 로딩된 mAb3 HCCF를 사용하여 실시예 2에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 9회 로딩 사이클에 이어서 저장, 사전-사이클, 및 2회의 모의 실행을 수행하였다. 세정은 전혀 수행하지 않았다. 1 CV 분획을 각각의 모의 실행에 걸쳐 수집하였고, 이전에 기재된 바와 같이 트리스 염기, 폴리소르베이트 20 및 아지드화나트륨으로 조건화하였다. 분획을 무손상 인간 IgG ELISA에 의해 분석하였다.

pH 펄싱 및 최적화

모든 실험은 mAb3 HCCF를 1.6 cm 직경 칼럼 상에 사용하여 실행하였다. 베드 높이는 14 cm에 남아있었다. 9회 로딩 사이클에 이어서, 3 CV의 평형 완충제 및 3 CV의 재생 완충제로 구성되는 세정 사이클을 수행하였다. 10회 세정 사이클에 이어서, 저장, 사전-사이클, 및 일련의 모의 실행을 수행하였다. 1 CV 분획을 전체 세정 공정에 걸쳐 수집하였다. 세정 분획 및 모의 풀을 이전에 기재된 바와 같이 조건화하고 분석하였다.

디폴트 세정 절차는 10회 사이클 동안 30 CV/hr의 하향류 방향으로 실행하였다. 최적화 연구는 흐름 방향 및 유량의 변경, 정적 침지 조건의 시험, 및 세정 지속시간의 감소를 포함하였다. 흐름 방향 최적화를 위해, 세정 사이클을 상향류 방향으로 실행하였다. 유량 최적화를 위해, 세정 사이클을 15 CV/hr의 유량으로 실행하였다. 칼럼을 제4 세정 사이클 동안 3시간 동안 평형 완충제 또는 재생 완충제 중에 유지함으로써 정적 침지를 검사하였다. 정적 침지의 최적화를 위해, 칼럼은 10회 세정 사이클 중 4회 동안 3시간 동안 평형 완충제 중에 유지하였다. 세정 지속시간의 최적화를 위해, 세정 사이클을 2CV의 평형 완충제 및 2CV의 재생 완충제로 감소시켰다. 추가로, 평형 완충제 중 정적 침지는 10회 세정 사이클 중 5회 동안 수행하였다. 최적화 파라미터는 표 10에 요약하였다.

<표 10> 펄스형 세정 최적화

결과

모의 실행 사이클 동안 산물이 실제로 용리되어 나오는 경우를 연구하기 위해 오염된 칼럼의 처음 2회 모의 실행 사이클에 걸쳐 분획을 수집하였다. 크로마토그램 및 캐리오버 결과는 도 22에 나타내었다. 대부분의 산물은 평형 완충제가 용리 완충제에 의해 대체된 고-저 pH 전이에서 용리되었다. 산물은 또한 재생 완충제가 용리 완충제를 대체한 후속 pH 강하에서 더 적은 정도로 용리되어 나왔다. 이러한 관찰은 제2 캐리오버 사이클로 반복되었다. 캐리오버 결과는 단지 낮은 pH에서만 칼럼을 유지하는 것이 칼럼을 효과적으로 세정하지 않을 것이라는 것을 확인하였다. 유일한 요건이 낮은 pH였다면, 제2 캐리오버 사이클 동안의 피크는 보다 작아야 하고, 보다 많은 단백질이 제1 캐리오버 사이클의 전체 용리 및 재생 블록 동안 수거되어야 한다.

pH 강하로부터의 용리 및 제2 모의 실행 동안의 추가의 용리의 조합이 고-저 pH의 펄스를 잠재적 세정 전략으로서 강하게 지지하였다. 단백질 용리가 3 CV의 용리 완충제 내에서 피크가 되기 때문에, 완충제 지속시간은 각각의 높은 및 낮은 pH 완충제에 대해 3 CV로 설정되었다. 평형 완충제 (pH 7.1)는 높은 pH 완충제로서 선택되었고, 재생 완충제 (pH 1.7)는 낮은 pH 완충제로서 선택되었다.

pH 펄싱

평형 및 재생 완충제의 10회 펄스형 사이클 전체에 걸친 산물 용리는 도 23에 나타낸다. 칼럼으로부터의 IgG 용리의 피크는 세정의 모든 고-저 pH 전이에서 존재하였다. 각 후속 사이클에 따라, 용리되는 단백질의 양이 감소하였다.

여러 연속 모의 실행을 펄스형 세정 후에 수행하였다. 5회 연속 모의 실행으로부터의 캐리오버 양은 도 24에 나타내었다. 비교를 위해, 세척되지 않은 칼럼으로부터 연속 캐리오버가 또한 제시된다. pH 펄스형 세정의 10회 사이클은 칼럼으로부터의 캐리오버의 86% 감소, 484 ng IgG/mg 산물로부터 68 ng IgG/mg 산물로의 감소를 생성하였다. 세정이 캐리오버의 뚜렷한 감소를 유발하였지만, 추가의 모의 실행은 여전히 캐리오버를 초래하였다. 캐리오버를 추가로 감소시키는데 최적화가 필요하였다.

펄스형 세정의 최적화

세정 사이클 동안 칼럼을 통한 완충제의 상향류 및 하향류를 비교하였다. 5회 연속 모의 실행에 대한 캐리오버는 도 25에 나타내었다. 하향류와 비교하는 경우에 상향류는 초기 캐리오버에서 54% 증가를 유발하였다 (105 ng IgG/mg 산물 vs. 68 ng IgG/mg 산물). 모든 후속 캐리오버는 또한 캐리오버에서의 증가를 나타내었다. 제4 모의 실행 동안의 캐리오버는 폴리소르베이트 20 및 아지드화나트륨이 실수로 샘플에 첨가되지 않았기 때문에 무효였다. 도 26은 상향류 및 하향류 칼럼 둘 다에 대한 전체 세정 지속기간 전체에 걸친 산물 용리를 나타내었다. 상향류가 추가의 모의 실행 캐리오버를 초래하는 한편, 이는 또한 칼럼을 보다 철저히 효과적으로 세정하는 10회 세정 사이클 전체에 걸쳐 칼럼으로부터 용리되는 추가의 단백질을 초래하였다. 주목할만한 양의 단백질이 마지막 세정 사이클 동안 칼럼으로부터 여전히 용리되고 있기 때문에, 상향류 실행은 틀림없이 더 많은 사이클로 확장되어 캐리오버로서 용리되어 나오는 추가의 산물을 제거할 수 있었다.

모의 실행 캐리오버 수준에 대한 세정 동안의 완충제 유량의 효과는 도 27에 나타내었다. 유량을 30 CV/hr로부터 15 CV/hr로 절반으로 감소시켜 초기 캐리오버를 거의 50% 감소시켰다 (68 ng IgG/mg 산물로부터 35 ng IgG/mg 산물로). 보다 느린 유량이 캐리오버를 절반으로 효과적으로 감소시키지만, 단점은 세정 시간을 배가시킨다는 것이다.

세정 사이클 동안 완충제 중 칼럼의 정적 침지로부터의 결과를 도 28에 나타내었다. 칼럼을 평형 완충제 또는 재생 완충제 중에 3시간 동안 유지하고, 다중 캐리오버를 평가하였다. 평형 완충제 중 컬럼의 침지는 재생 완충제 중 칼럼의 침지를 능가하였다 (19 ng IgG/mg 산물 vs. 28 ng IgG/mg 산물). 상기 정적 침지 둘 다는 칼럼의 정상 펄스형 세정으로부터의 68 ng IgG/mg 산물에 대하여 주목할만한 개선이었다. 유량 감소에 관련하여, 증가된 세정 시간의 단점은 캐리오버 감소의 장점과 비교검토될 필요가 있었다.

평형 완충제 중 단일 3시간 유지를 다중 3시간 유지와 추가로 비교함으로써 완충제 중 칼럼의 정적 침지를 평가하였다. 칼럼을 10회 펄스 사이클 중 4회 동안 정적 침지에서 유지하였고, 캐리오버에 대해 평가하였다 (도 29). 다중 정적 침지에 따라, 캐리오버는 19 ng IgG/mg 산물에서 8 ng IgG/mg 산물로 하락하였다.

각각의 최적화 실행을 위해 세정 사이클 전체에 걸쳐 수집된 분획을 산물 용리에 대해 평가하여 최적의 세정 지속시간을 결정하였다 (도 23, 26, 30-32). 대부분의 세정 사이클은 제3 CV의 평형 및 재생 완충제 둘 다 동안 산물 용리를 거의 또는 전혀 보이지 않았다. 결론적으로, 각 세정 사이클의 지속시간은 2 CV 평형 완충제 및 2 CV 재생 완충제로 감소하였다. 세정 지속시간의 이러한 감소는 더 적은 완충제 및 더 짧은 세정 시간으로 바뀌지만; 산물 캐리오버는 동일하게 남아있거나 또는 다소 증가할 것이다. 보다 적은 완충제 부피를 유지하는 한편 캐리오버를 더 감소시키기 위해, 정적 침지의 횟수를 4회에서 5회로 증가시켰다. 도 33은 이러한 변화가 7.8 ng IgG/mg 산물로부터 6.7 ng IgG/mg 산물까지 캐리오버를 다소 감소시켰음을 보여준다. 칼럼 세정 전체에 걸친 산물 용리는 도 34에 나타난다. 제10 세정 사이클의 마지막까지, 재생 완충제의 마지막 칼럼 부피를 사용하여 5.0 ng IgG/mg 산물이 용리되었다.

실시예 5. 대규모 세정 성능.

최적화 연구 동안 확인된 가장 유망한 pH 펄스형 세정 절차를 이전에 사용된 파일럿 규모 칼럼에 적용하였다. 연구를 위한 칼럼은 분자, 치수, 및 이전 단백질 접촉의 횟수를 기준으로 하여 선택되었다. 단지 파마시아 스키드(Pharmacia skid)만이 자동 휴지 지속기간을 허용하였기 때문에, 2 L/min의 스키드 유량 캡을 초과하지 않을 칼럼이 선택되었다.

물질 및 방법

이전에 사용된 mAb4 및 mAb5 단백질 A 칼럼은 파일럿 플랜트 냉장실 저장으로부터 입수하였다. mAb4 칼럼은 직경 20 cm 및 베드 높이 13.5 cm로 측정되었고, 이전에 28회 사이클 동안 사용된 바 있다. 바이오프로세스 스키드 1538 (아머샴 바이오사이언시스 파마시아(Amersham Biosciences Pharmacia))를 세정에 사용하였고, 스키드 1050 (밀리포어(Millipore))을 모의 실행에 사용하였다. mAb5 칼럼 (파마시아 인덱스(Pharmacia Index))은 직경 14 cm 및 베드 높이 15 cm로 측정되었고, 이전에 20회 사이클 동안 사용된 바 있다. 바이오프로세스 스키드 1076 (아머샴 파마시아 바이오테크)을 모든 mAb5 공정에 사용하였다.

2 CV의 평형 완충제 및 2 CV의 재생 완충제로 구성되는 10회 세정 사이클을 수행하였다. 10회 펄스형 사이클 중 5회에 대해 3시간 평형 완충제 정적 침지에서 칼럼을 유지하였다. 세정에 이어서 칼럼 저장, 스키드의 위생화, 및 모의 실행을 수행하였다. mAb5 칼럼에 대해, 칼럼이 없는 추가의 모의 실행을 위생화 직후에 수행하여 시스템 캐리오버에 대한 값을 획득하였다.

모의 실행 파라미터는 각 특정한 분자의 단백질 A 공정에 이전에 사용된 파라미터를 기반으로 하였다. mAb5 칼럼에 대해, 세척 3 단계는 전형적 mAb5 단백질 A 크로마토그래피 당 4 CV로 확장되었다. 참고로 사용된 모의 실행 파라미터 및 최초 실행의 개요는 표 11에 수록된다.

<표 11> 파일럿 플랜트 규모의 모의 실행에 사용된 파라미터

산물 캐리오버를 표 12에 나타내었다. 세정 후, aIGF1R 칼럼은 48.2 ng IgG/mg 산물의 캐리오버를 갖는 반면, 항A베타 칼럼은 8.6 ng IgG/mg 산물의 캐리오버를 가졌다. 사전 연구로 증가된 단백질 접촉으로 인해 캐리오버 값이 증가하는 것으로 나타났다. mAb4 칼럼이 mAb5 칼럼보다 8회 더 단백질 접촉 사이클에 노출되었지만, 증가된 수의 접촉 단독으로는 캐리오버 값에서의 큰 불일치를 설명하기에 상당히 충분하지 않을 수 있다.

<표 12> 파일럿 규모 캐리오버 연구로부터의 결과

최종 세정 사이클의 마지막까지, 산물은 칼럼 둘 다에 대한 세정 완충제로 여전히 용리되었다. 소규모 최적화 동안 관찰된 최종 세정 CV로부터의 5.0 ng IgG/mg 산물과 비교하여, 파일럿 규모에서의 산물 용리는 예상치보다 더 높았다 (aIGF1R 및 항A베타 칼럼에 대하여 각각 12.7 및 62.9 ng IgG/mg 산물).

시스템 캐리오버는 스키드 위생화 후 제자리에서 칼럼 없이 모의 실행을 수행함으로써 분석하였다. 시스템 캐리오버는 프로셉 A 수지보다는 스키드로 인한 캐리오버의 양을 나타낸다. 세정 절차 및 스키드의 위생화가 모든 시스템 캐리오버를 제거해야 하지만, 0.97 ng IgG/mg 산물이 mAb5 실행 동안 시스템 모의 풀에서 여전히 검출되었다. 이러한 결과는 캐리오버에 대한 시스템 기여도는 최소이지만, 절대적으로 산물이 한 실행으로부터 다음 실행으로 캐리오버되지 않도록 확실하게 하기 위해서는 스키드 자체의 추가 세정이 필요할 수 있음을 나타낸다.

소규모 최적화 동안 사용된 세정 절차를 파일럿 규모에 적용하는 것은 유의한 변동성과 함께 더 높은 캐리오버 수준을 초래하였다. 산물은 또한 이전에 소규모에서의 관찰치보다 더 높은 수준으로 세정 사이클의 마지막까지 전체에 걸쳐 계속 용리되었다. 시스템은 칼럼이 제자리에 있지 않은 경우라도 작은 수준의 캐리오버의 원인이 되는 것으로 밝혀졌다.

고-저 pH 완충제의 펄싱은 소규모에서 캐리오버를 감소시키는 효과적인 수단인 것으로 밝혀졌다. 1.6 cm 직경 칼럼을 사용하여, 캐리오버를 6.7 ng IgG/mg 산물로 감소시켰다. 그러나, 이전 파일럿 실행 동안 사용된 실제 칼럼에 세정 절차를 적용하는 것은 더 높은 캐리오버 값을 초래하였고 측정된 가장 높은 값은 48.2 ng IgG/mg 산물이었다. 캐리오버 수준은 칼럼 용법에서의 차이 때문에 칼럼 사이에서 다소 상이할 것으로 예측되지만, 최종 세정 절차는 임의의 주어진 칼럼의 특성에 상관 없이 캐리오버를 편재적으로 제거할 필요가 있을 것이다. 추가로, 추가의 파라미터, 예컨대 장기간 칼럼 성능 및 최소 캐리오버 검출 한계를 평가하는 것이 중요할 것이다.

Claims (40)

1. a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.9인 2 이상의 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계;
   b) 물질을 용리 완충제 중에 약 10분 내지 약 30분 범위의 시간 동안 정적으로 유지하는 단계;
   c) 약 2 이상의 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; 및
   d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 2 이상의 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계
   를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.
2. a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.9인 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계;
   b) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계;
   c) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계; 및
   d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 4 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계
   를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.
3. a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.9인 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계,
   b) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계,
   c) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계,
   d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 2와 1/2 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계,
   e) 물질을 재생 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계, 및
   f) 약 2와 1/2 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계
   를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.
4. a) 약 25 mM 트리스(Tris) 및 약 25 mM NaCl을 포함하고 약 pH 7.1인 약 2 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계;
   b) 물질을 평형 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계;
   c) 약 2 물질 부피의 평형 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계;
   d) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.8인 약 2 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계;
   e) 물질을 용리 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계;
   f) 약 2 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계;
   g) 0.1 N NaOH, pH 13을 포함하는 약 2 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계;
   h) 물질을 재생 완충제 중에 약 30분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및
   i) 약 2 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계
   를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.
5. a) 약 25 mM 트리스 및 약 25 mM NaCl을 포함하고 pH 7.1인 약 4 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계; 및
   b) i) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.8인 약 3 물질 부피의 용리 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계;
   ii) 물질을 용리 완충제 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계;
   iii) 약 1 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계;
   iv) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 3 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계;
   v) 물질을 재생 완충제 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및
   vi) 약 1 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계
   를 포함하는 단계의 6회 사이클을 수행하는 단계
   를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.
6. a) 약 0.15 M 아세트산을 포함하고 약 pH 2.8인 약 3 물질 부피의 용리 완충제를, 크로마토그래피 물질 통해 통과시키는 단계;
   b) 물질을 용리 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계;
   c) 약 1 물질 부피의 용리 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계;
   d) 약 0.1 N NaOH를 포함하고 약 pH 13인 약 3 물질 부피의 재생 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계;
   e) 물질을 재생 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계;
   f) 약 1 물질 부피의 재생 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계;
   g) 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 2% 벤질 알콜을 포함하고 약 pH 5.0인 약 3 물질 부피의 저장 완충제를, 물질을 통해 통과시키는 단계;
   e) 물질을 저장 완충제 중에 약 15분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및
   f) 약 1 물질 부피의 저장 완충제를 물질을 통해 통과시키는 단계
   의 6회 사이클을 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 물질이 크로마토그래피 칼럼에 있는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 물질이 친화성 물질인 방법.
9. 제8항에 있어서, 친화성 물질이 단백질 A 친화성 물질인 방법.
10. 제9항에 있어서, 단백질 A 친화성 물질이 맙셀렉트(MAbSelect) 물질, 맙셀렉트 슈어(MAbSelect SuRe) 물질 또는 맙셀렉트 슈어 LX 물질인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 물질을 폴리펩티드의 대규모 생산에 사용하는 것인 방법.
12. a) 약 40 mM 아세트산나트륨을 포함하고 약 pH 5.5인 약 3 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계;
    b) 약 2 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계;
    c) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계;
    d) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계;
    e) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및
    f) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계
    를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 크로마토그래피 물질이 크로마토그래피 칼럼에 있는 것인 방법.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 크로마토그래피 물질이 이온 교환 물질인 방법.
15. 제14항에 있어서, 이온 교환 물질이 양이온 교환 물질인 방법.
16. 제15항에 있어서, 양이온 교환 물질이 포로스(POROS) HS50 물질인 방법.
17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 물질을 항체의 대규모 생산에 사용하는 것인 방법.
18. a) 약 50 mM 트리스, 85 mM 아세트산나트륨을 포함하고 약 pH 8.8 및 약 8.6 mS/cm인 약 3 물질 부피의 평형 완충제를, 크로마토그래피 물질을 통해 통과시키는 단계;
    b) 약 2 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계;
    c) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계;
    d) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계;
    e) 물질을 약 0.5 N NaOH 중에 약 10분 동안 정적으로 유지하는 단계; 및
    f) 약 1 물질 부피의 약 0.5 N NaOH를 물질을 통해 통과시키는 단계
    를 포함하는, 재사용을 위해 크로마토그래피 물질을 세정하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 크로마토그래피 물질이 크로마토그래피 칼럼에 있는 것인 방법.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 크로마토그래피 물질이 이온 교환 물질인 방법.
21. 제20항에 있어서, 이온 교환 물질이 음이온 교환 물질인 방법.
22. 제21항에 있어서, 음이온 교환 물질이 QSFF 물질인 방법.
23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 물질을 항체의 대규모 생산에 사용하는 것인 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제를 물질을 통해 약 30 물질 부피/시간, 약 20 물질 부피/시간 또는 약 15 물질 부피/시간으로 통과시키는 것인 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제를 물질을 통해 하향류 방향 또는 상향류 방향으로 통과시키는 것인 방법.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 물질의 세정을 크로마토그래피 물질을 세정한 후 모의 용리를 실행함으로써 측정하는 것인 방법.
27. 제26항에 있어서, <0.25 mg/mL 총 단백질, < 1 ppm IgG 단편, < 1 ppm 침출된 단백질 A, <1 μg/mL CZE LIF, <1 ppm CHOP, 및 <1 pg/mL CHO DNA 중 하나 이상을 포함하는 모의 용리의 용리액이 다중산물 사용을 위한 물질의 유효한 세정을 나타내는 것인 방법.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 물질이 알칼리에서 안정한 것인 방법.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 물질을 폴리펩티드를 정제하는데 사용하는 것인 방법.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 물질을 제1 폴리펩티드의 정제 후에 세정하고, 크로마토그래피 물질을 세정한 후에 제2 폴리펩티드를 정제하는데 사용하는 것인 방법.
31. 제30항에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 이뮤노어드헤신인 방법.
32. 제31항에 있어서, 폴리펩티드가 이뮤노어드헤신인 방법.
33. 제31항에 있어서, 폴리펩티드가 항체인 방법.
34. 제33항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
35. 제34항에 있어서, 모노클로날 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 방법.
36. 제35항에 있어서, 모노클로날 항체가 IgG 모노클로날 항체인 방법.
37. 제36항에 있어서, 항체가 항원 결합 단편인 방법.
38. 제37항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, scFv, 디-scFv, 이중-scFv, 탠덤 (디, 트리)-scFv, Fv, sdAb, 삼관능성 항체, BiTE, 디아바디 또는 트리아바디인 방법.
39. 제38항에 있어서, 폴리펩티드가 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역접합체, 시토카인 또는 인터류킨인 방법.
40. 제30항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 제1 항체 또는 제1 이뮤노어드헤신이고, 제2 폴리펩티드가 제2 항체 또는 제2 이뮤노어드헤신인 방법.

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