CN118139891A - 抗体药物偶联物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

抗体药物偶联物及其制备方法和医药用途 Download PDF

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Abstract

提供一种抗体药物偶联物及其制备方法和医药用途,具体涉及一种抗TROP‑2抗体药物偶联物及其医药用途，所述抗体药物偶联物由抗TROP‑2抗体或其抗原结合片段和依喜替康衍生物通过接头连接而成，所述抗体药物偶联物或其可药用盐或溶剂化合物具有显著的抗肿瘤效果和良好的安全性。

Description

抗体药物偶联物及其制备方法和医药用途 技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及抗TROP-2抗体偶联物及其医药用途。
背景技术
随着对肿瘤基因组学、蛋白组学及信号传导途径研究的不断深入，人们对肿瘤细胞的癌基因和抑癌基因的相互作用以及它们对肿瘤微环境的影响已经越来越清楚，这也使得针对肿瘤的特异性分子靶点设计抗肿瘤治疗新方案成为可能。
肿瘤的分子靶向治疗是一种有异于传统手术、放疗、化疗的新治疗模式，其优点在于药物通常仅与相应的靶位结合，通过直接影响其靶位分子的功能，或所携带的物理或化学效应分子来达到杀伤或抑制目标细胞的作用。由于靶位明确，该类药物通常具有很高的选择性，既可有效杀伤或抑制靶细胞，又对正常组织细胞不产生或仅产生较小的毒副作用。因此，研制分子靶向药物成为肿瘤临床研究的热点。
人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2，TROP-2)是由TACSTD2基因编码的细胞表面糖蛋白。TROP-2由323个氨基酸构成，其中信号肽26个氨基酸，胞外区248个氨基酸，跨膜区23个氨基酸，胞质区26个氨基酸。TROP-2细胞外结构域中存在4个非均质N结合糖基化位点，添加糖链后，表观分子量增加11至13KD。TACSTD基因家族中，细胞外结构域具有特征性的甲状腺球蛋白(TY)序列，通常认为其与癌细胞的增殖、浸润、转移有关。
大量临床研究和文献报道表明TROP-2在胃癌、肺癌、大肠、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、食道癌等多种上皮源癌肿中过度表达。与此相对，TROP-2在成年人正常组织中很少表达或不表达，仅限于上皮区域的细胞有少量表达，表达水平也比癌肿中低，表明TROP-2与肿瘤形成有关。TROP-2在肿瘤组织中的过表达与患者的预后不良和癌细胞的转移密切相关，同时影响患者的总生存率。因此，TROP-2已成为肿瘤分子靶向治疗中引人注目的靶标。
已经报告了几种抗hTROP-2抗体的抗肿瘤效果的研究：
美国专利第5840854号报告了与细胞毒素结合的抗hTROP-2单克隆抗体(BR110)对人癌细胞株H3619、H2987、MCF-7、H3396及H2981的细胞毒性。
美国专利第6653104号中公开了一种抗体(RS7)，使用经放射性物质标记的抗体在体内模型中进行了试验，在裸小鼠异种移植模型中显示出抗肿瘤活性，但没有报告仅裸抗时的抗肿瘤效果。
美国专利第7420040号还报道了由人卵巢癌组织免疫小鼠而得的杂交瘤细胞株AR47A6.4.2或AR52A301.5产生的分离单克隆抗体与hTROP-2结合，并且在裸小鼠异种移植模型中显示抗肿瘤活性。
CN102827282A公开了一种人源抗TROP-2基因工程抗体IgG及其应用，体外试验结果表明该抗TROP-2抗体IgG对胰腺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用。
CN104114580A公开了一种与hTROP-2特异性反应且在体内具有抗肿瘤活性的抗体(特别是人源化抗体)，以及产生该抗体的杂交瘤、该抗体与药剂的复合物、肿瘤的诊断用或治疗用药物组合物、肿瘤的检测方法、肿瘤的检测用或诊断用试剂盒。
但是，要找到具有高度亲和性、高度特异性及强效细胞毒性或肿瘤杀伤/抑制/退行活性的单克隆抗体非常困难。因此，开发良好的疗效、安全性高且适用于人病患的Trop-2抗体及其它免疫治疗剂仍然存在迫切需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通式(I)所示的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，
其中：
L为-(CR 1R 2) m-[X 1-(CR 1R 2) n-X 2] t-(CR 1R 2) r-；
R 1或R 2各自独立地选自氢、氘、羟基、氨基、烷基、卤素、卤代烷基、氘代烷基或羟烷基，优选地，R 1或R 2为氢；
X 1或X 2各自独立地选自键、N、O或S；优选地，X 1或X 2为键或O，
m、n、r或t各自独立地选自1、2、3或4；优选地，m、n、r或t各自独立地选自1或2；
R 3或R 4各自独立地选自氢、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
或者，R 3和R 4与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
y为1～20，优选1～10，更优选2～8，进一步优选4、6或8；
mAb为抗TROP-2抗体或其抗原结合片段。
在本发明优选的实施方式中，R 1或R 2各自独立地选自氢、氘、羟基、氨基、C 1-3烷基、卤素、C 1-3卤代烷基、C 1-3氘代烷基或C 1-3羟烷基，优选地，R 1或R 2为氢；
X 1或X 2各自独立地选自键、N、O或S；优选地，X 1或X 2为键或O，
m、n或r各自独立地选自1、2、3或4；优选地，m、n或r各自独立地选自1或2；
R 3或R 4各自独立地选自氢、卤素、C 1-3卤代烷基、C 1-3氘代烷基、C 3-6环烷基、4-8元杂环基、C 5-10芳基或4-8元杂芳基，优选地R 3或R 4各自独立地选自氢或C 3-6环烷基；
或者，R 3和R 4与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基或4-8元杂环基。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:3所示的HCDR1、RIDPXDSETHYNQKFKD所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3，
X选自R、Y、Q、L、T、I、F、E或A。
在本发明优选的实施方案中，所述的TROP-2抗体或其抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:9所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:11所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:12所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:13所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:14所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:15所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:16所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:17所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、人抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区或其变体。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人IgG1、IgG2或IgG4的重链恒定区或其变体。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO:1所示的重链恒定区。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人抗体κ链、λ链的轻链恒定区或其变体。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人抗体κ链的轻链恒定区；
在本发明进一步优选的实施方案中，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO:2所示的轻链恒定区。
在本发明优选的实施方案中，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含选自以下序列所示的重链可变区，或与以下序列相比具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19的轻链可变区，或与之相比具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含：
SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
SEQ ID NO：21所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
SEQ ID NO：23所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
SEQ ID NO：24所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
SEQ ID NO：25所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
SEQ ID NO：26所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
SEQ ID NO：27所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区。
在本发明优选的实施方案中，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段含有选自如下序列所示的重链，或与以下序列相比具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37。
在本发明优选的实施方案中，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段含有选自以下序列所示的轻链，SEQ ID NO：29所示的轻链，或与之相比具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性。
在本发明优选的实施方案中，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含：
SEQ ID NO：28所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
SEQ ID NO：30所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
SEQ ID NO：31所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
SEQ ID NO：32所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
SEQ ID NO：33所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
SEQ ID NO：34所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
SEQ ID NO：35所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
SEQ ID NO：36所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
SEQ ID NO：37所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其选自如通式(II)所示的体药物偶联物或其药学上可接 受的盐或溶剂化合物，或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式：
X 1或X 2为键或O；
m为0或1；且
t为1或2。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其选自如通式(III)所示的体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
mAb选自上述的抗TROP-2抗体或其抗原结合片段，
y选自2-10，优选4-10，更优选4、6、8或10。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物选自如下结构：
其中，y如权利要求1中所定义。
本发明还提供一种制备如通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的方法，其包括以下步骤：
mAb还原后，与通式(F)偶联反应，得到通式(I)所示的化合物；
其中，L如前述内容所定义。
mAb选自上述的抗TROP-2抗体或其抗原结合片段；
y为1～20；优选4-10；更优选4、6、8或10。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的抗体－药物偶联物或所述抗体－药物偶联物药学上可接受的盐或溶剂化合物，和一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
另一方面，本发明提供一种医药用途，本发明涉及抗TROP-2抗体药物偶联物或所述抗体药物偶联物药学上可接受的盐或溶剂化合物或其药物组合物在用于治疗或预防TROP-2介导的疾病或病症的用途。
另一方面，本发明还提供了通式(I)所述的抗体－药物偶联物或所述抗体－药物偶联物药学上可接受的盐或溶剂化合物或其药物组合物在制备用于治疗与人TROP-2相关疾病的药物中的应用。
在本发明更优选的实施方案中，所述与人TROP-2相关的疾病为制备用于治疗TROP-2高表达的癌症的药物中的应用，所述的癌症选自三阴性乳腺癌、小细胞肺癌、尿路上皮癌、人脑星形胶质母细胞瘤、人咽头癌、肾上腺肿瘤、AIDS-相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀肮癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波因肉瘤、肾癌、白血病、脂肪肉瘤、恶性脂肪瘤性肿瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、 乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、嗜铭细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、肾转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、辜丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌和子宫癌。
本发明的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物能够特异性结合靶抗原，内吞效率高，体内半衰期时间长，在保证安全性的同时，显著杀伤肿瘤。
本发明的抗体药物偶联物及其可药用盐或溶剂化合物具有显著的抗肿瘤效果和良好的安全性，同是具有良好的体内代谢活性，体内药效时间长，临床应用前景广阔。
发明详述
一、术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中，所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本发明中，所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG 3、IgG 4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、 LCDR2，和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的VL区和VH区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则和Kabat或ABM定义规则(http://bioinf.org.uk/abs/)。
术语“TROP-2”包括由细胞天然表达的TROP-2的任何变体或同种型。本发明的抗体可与得自非人物种的TROP-2交叉反应。作为另一种选择，该抗体也可以是人TROP-2特异性的，可不表现出与其他物种的交叉反应性。TROP-2或其任何变体或同种型可从天然表达它们的细胞或组织中分离而得，或使用本领域通用以及本文所述的那些技术通过重组技术产生。优选地，抗TROP-2抗体靶向具有正常糖基化模式的人源TROP-2。
术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，所涉及的技术和方法在本领域中是熟知的，诸如：
1.从人免疫球蛋白基因的转基因、转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；
2.从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；
3.从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及
4.通过将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法制备、表达、创建或分离的抗体。
此类重组人抗体包含可变区和恒定区，这些区域利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但也包括随后诸如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人TROP-2的单克隆抗体。制备时用TROP-2抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源TROP-2抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括这样的抗体，即其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗体”)。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应的缺点。为避免在免疫原性下降的同时引起活性的下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗 体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后增强ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1重链恒定区。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson，2005，Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
术语“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
术语“Fc”区含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
术语“Fab’片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
术语“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
术语“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双抗体(diabodies)、双特异性双抗体和三抗体(triabodies)、己共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
术语“单链抗体”是由抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL通过一段连 接肽连接而成的单链重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段。
术语“结构域抗体片段”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个VH区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体片段。二价结构域抗体片段的两个VH区可靶向相同或不同抗原。
本术语“与TROP-2结合”，指能与人TROP-2相互作用。
术语“抗原结合位点”指本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3-15个氨基酸。确定什么表位由给定的抗体结合的方法在本领域中是熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术，例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。
术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用人TROP-2作为分析物并使用抗体作为配体，在仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10 -7M或甚至更小的平衡解离常数(K D)与预定的抗原结合，并且其与预定抗原结合的亲和力是其与预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA等)结合的亲和力的至少两倍。术语“识别抗原的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合的抗体”互换使用。
术语“交叉反应”是指本发明的抗体与来自不同物种的TROP-2结合的能力。例如，结合人TROP-2的本发明的抗体也可以结合另一物种的TROP-2。交叉反应性是通过在结合测定(例如SPR和ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性，或与生理表达TROP-2的细胞的结合或功能性相互作用来测量。确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术。
术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。配体的抑制/阻断优选地降低或改变无抑制或阻断的情况下发生配体结合时出现活性的正常水平或类型。抑制和阻断也旨在包括与抗TROP-2抗体接触时，与未与抗TROP-2抗体接触的配体相比，任何可测量的配体结合亲和力降低。
术语“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低。
术语“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可互换使用，并指免疫应答对特定抗原的剌激(即，被动或适应性的)。针对诱导CDC或ADCC的术语“诱导”是指剌激特定的直接细胞杀伤机制。
术语“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖 的细胞介导的细胞毒作用，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对IgG上Fc段的修饰，增强或降低降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人TROP-2或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。相应抗体的cDNA序列可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在FC区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
本发明的抗体指单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体(mAb)，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(如CDR-grafting)、或其它现有技术进行重组得到。
术语“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
术语“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种抗体，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要 疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患都有的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由……组成”或其变形表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显著改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。
本发明所述的应用于某个对象的术语“天然存在的”是指这样的事实，即该对象可在自然界中发现。例如存在于可从自然界来源分离得到的生物体(包括病毒)、且未经人工在实验室中有意修饰的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
术语“有效量”包含足以改善或预防医字病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
术语“外源性”指要据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。
术语“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。
术语“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述抗体或其抗原结合片段，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“可药用盐”是指本发明抗体-药物偶联物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，其具有应有的生物活性。本发明抗体-药物偶联物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，可药用盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
术语“溶剂化合物”指本发明的抗体-药物偶联物化合物与一种或多种溶剂分子形成可药用的溶剂化合物，溶剂分子的非限制性实例包括：水、乙醇、乙腈、异丙醇、乙酸乙酯。
术语“细胞毒性药物”在用于本发明时指抑制细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。
“术语微管蛋白抑制剂”是指通过抑制微管蛋白的聚合或促进微管蛋白的集合而干扰细胞有丝分裂过程，从而发挥抗肿瘤效果的一类化合物。其非限制性实例包括：美登素类、卡利奇霉素、紫杉烷类、长春新碱、秋水仙碱、尾海兔素/奥瑞他汀/单甲基奥瑞他汀E(MMAE)/单甲基奥瑞他汀F(MMAF)。
术语“接头”指包含是抗体共价附着于药物的共价键或原子链的化学模块。接头的非限制性实例包括：亚芳基、亚杂芳基、PEG、聚亚甲基氧基、琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。
术语“药物载荷”(DAR)由y表示，即通式(A)中每个抗体的平均细胞毒性药物数。本发明中的药物荷载范围可以为每个抗体1-20个细胞毒性药物(D)。通式(A)的抗体-药物偶联物为偶联有一定范围(1-20个)细胞毒性药物的抗体的集合。来自偶联反应的抗体-药物偶联物中的药物载荷(DAR)可通过常规手段表征，诸如质谱，HPLC和ELISA等。通过这些手段可以测定抗体-药物偶联物在y值上的定量分布。
本发明还包括各种氘化形式的式(I)化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式(I)化合物。在制备氘代形式的式(I)化合物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
本发明的一些实施方式中，细胞毒性药物通过连接单元偶联在配体的N端氨基和/或赖氨酸残基的ε-氨基上，在本发明的另一些实施方式中，细胞毒性药物 通过连接单元偶联在配体的巯基上。一般地，偶联反应中能与抗体偶联的药物分子数将小于理论上的最大值。
可以用以下非限制性方法控制配体细胞毒性药物偶联物的载量，包括：
(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，
(2)控制反应时间和温度，
(3)选择不同的反应试剂。
本发明的抗体药物偶联物或其可药用盐或溶剂化合物具有显著的抗肿瘤效果和良好的安全性。
附图说明
图1为化合物D的 1H-NMR图谱。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：HU6DL变体设计实验
专利WO2020228604公开的人源化抗体HU6DL重链和轻链的CDR序列如下表1所示，由于在HCDR2中具有N 54D 55S 56基序，易发生糖基化作用。
表1.人源化抗体HU6DL的重链和轻链可变区CDR序列
名称 序列 编号
HCDR1 NYWMN SEQ ID NO：3
HCDR2 RIDPNDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：4
HCDR3 SGFGSTYWFFDV SEQ ID NO：5
LCDR1 KASQDVSTAVA SEQ ID NO：6
LCDR2 SASYRYT SEQ ID NO：7
LCDR3 QQHYSTPLT SEQ ID NO：8
通过计算机辅助技术对N54进行定点突变，在不影响其与抗原结合和自身热稳定性的情况下降低潜在的糖基化风险，得到抗体HU6DL的突变体HU6DL.R54，HU6DL.Y54，HU6DL.Q54，HU6DL.L54HU6DL.T54、HU6DL.I54、HU6DL.F54、HU6DL.E54以及HU6DL.A54，其对应重链的HCDR2序列如下：
表2.HU6DL突变体的重链可变区HCDR2序列
名称 序列 编号
HU6DL.R54 RIDPRDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：9
HU6DL.Y54 RIDPYDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：10
HU6DL.Q54 RIDPQDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：11
HU6DL.L54 RIDPLDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：12
HU6DL.T54 RIDPTDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：13
HU6DL.I54 RIDPIDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：14
HU6DL.F54 RIDPFDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：15
HU6DL.E54 RIDPEDSETHYNQKFKD SEQ ID NO：16
HU6DL.A54 RIDPADSETHYNQKFKD SEQ ID NO：17
其对应重链和轻链可变区如下：
将设计的重链和轻链可变区序列分别与IgG1重链恒定区和轻链恒定区序列连接，连接的人IgG1重链恒定区序列如下：
连接的人kappa链恒定区序列如下：
连接后，得到的示例性重链和轻链序列如下：
根据以上各人源化抗体轻链和重链的氨基酸序列合成cDNA片段，利用HEK293细胞瞬时转染表达HU6DL蛋白突变体，利用分子排阻色谱技术检测抗体的纯度，其浓度和纯度如下表3所示。
表3.HU6DL突变体的浓度和纯度
名称 浓度(mg/mL) 纯度(％)
HU6DL.R54 1.99 95.8
HU6DL.Y54 1.34 96.4
HU6DL.Q54 1.73 93.1
HU6DL.L54 1.36 94.9
HU6DL.T54 2.73 96.1
HU6DL.I54 2.00 95.5
HU6DL.F54 1.68 93.5
HU6DL.E54 1.56 95.6
HU6DL.A54 1.00 95.1
实施例2：HU6DL突变体对Trop-2抗原的亲和实验
实验目的：
利用ELISA夹心法，即“抗原-抗体-HRP标记二抗”评价不同抗Trop-2突变体对Trop-2抗原的亲和水平的差别。
实验步骤：
利用pH7.4的DPBS将Trop-2，his标签蛋白(SinoBiologics,Cat：10428-H08H)稀释为1ug/mL，于100μL/孔加入高亲和力96孔板内(Corning,Cat:3590)，4℃孵育过夜，次日，甩净Trop-2抗原溶液，于200μL/孔加入含有0.05％Tween 20 PBS pH7.4(PBST)溶液，洗涤3次，于200μL/孔2％BSA(溶解于PBST)，37℃封闭1h，PBST洗涤3次，于100μL/孔加入，按10倍，8个浓度梯度(起始浓度为10nM-1x10 -6nM)稀释的候选抗体，0.5％BSA作为阴性对照，37℃封闭1h，PBST洗涤3次；于100μL/孔，加入按1：10000稀释的羊抗人IgG，Fc-HRP(abcam,cat:ab97225)二抗溶液，37℃封闭1h，PBST洗涤3次；
于100μL/孔加入TMB(CST,Cat:7004P6)底物，室温反应3min至抗体最高浓度孔溶液的颜色变为深蓝色，于50μL/孔加入终止液(CST，Cat:7002P6)，终止反应，于450nm波长读取吸光度值(OD)。
数据处理：
以候选抗体的浓度对数值作为X轴坐标，OD450吸光度值为纵坐标，利用GraphPad PRISM 8.0log(agonist)vs.response-viable slope(four parameters)公式计算每个HU6DL突变体对抗原亲和的EC 50。HU6DL突变体对人TROP-2抗原的亲和力(EC 50)如下表7所示：
表4 HU6DL突变体对人TROP-2抗原的亲和力(EC 50)
实验结论：
以上数据显示，本发明HU6DL突变体对人TROP-2抗原具有良好的亲和力。
实施例3：HU6DL突变体对肿瘤细胞的亲和实验
实验目的：
利用流式细胞术评价HU6DL突变体对表达Trop-2抗原的肿瘤细胞系的亲和水平差异。
实验试剂：
胃癌细胞NCI-N87(购自中科院细胞库，TCHu130)；
非小细胞肺癌细胞HCC827(购自中科院细胞库，TCHu153)；
膀胱癌细胞SW780(购自中科院细胞库，TCHu219)；
膀胱癌细胞RT4(购自中科院细胞库，TCHu226)；
实验步骤：
利用Accutase(Sigma,cat:A6964)消化液处理生长状态良好的肿瘤细胞，以2％FBS(DBPS,pH7.4稀释)溶液制备单细胞悬液，调整细胞密度为1x10 6细胞/mL。于100μL/孔均分至96孔V型底板，300g×5min，4℃离心，弃上清，于100μL/孔加入以10倍，10个浓度梯度(1000nM-1x10 -6nM)稀释的候选抗体溶液，4℃孵育1h；
300g×5min，4℃离心，洗涤2次，于100μL/孔加入以5μL/10 6细胞比例稀释好的小鼠抗人IgG Fc，PE标记二抗(Biolegend,cat:409304)溶液，4℃孵育1h；300g×5min，4℃离心，洗涤2次，加入70μL 2％FBS溶液重悬细胞，于ZE5流式细胞仪(Bio-Rad，ZE5)检测PE通道的平均荧光强度(MFI)。
数据处理：
以突变体抗体的浓度对数值作为X轴坐标，MFI为纵坐标，利用GraphPad PRISM 8.0log(agonist)vs.response-viable slope(four parameters)公式计算每个候选抗体对肿瘤细胞亲和的EC 50，如下表5所示：
表5.HU6DL突变体对NCI-N87、HCC827、SW780和RT4肿瘤细胞的亲和力(EC 50)
实验结论：
以上数据显示，本发明HU6DL突变体对NCI-N87、HCC827、SW780和RT4肿瘤细胞均具有良好的亲和力。
实施例4：HU6DL突变体介导的TROP2内吞实验
实验目的：
利用流式细胞术评价HU6DL突变体在Trop-2抗原表达的肿瘤细胞系上的抗体内吞活性。
实验步骤：
利用Accutase(Sigma,cat:A6964)消化液处理生长状态良好的胃癌细胞NCI-N87(购自中科院细胞库，TCHu130)，以2％FBS(DBPS,pH7.4稀释)溶液制 备单细胞悬液，调整细胞密度为1x10 7个细胞/mL。于100μL/孔均分至96孔V型底板，加入终浓度为20μg/mL的候选抗体溶液，混匀，4℃孵育1h；
300g×5min，4℃离心，于100μL/孔加入以5μL/10 6细胞比例稀释好的小鼠抗人IgG Fc，PE标记二抗(Biolegend,cat:409304)溶液，4℃孵育1h；
300g×5min，4℃离心，洗涤2次，1mL预温的完全培养基重悬细胞沉淀，分为四等份，分别设为0min组、空白组、30min组、120min组；取出0min及blank置于冰上，其余放置于37℃培养箱，分别内吞30min、120min，在相应时间点取出对应的组，置于冰上预冷5min，所有处理组离心弃上清(4℃、1500rpm×5min)，用FACS buffer洗涤一次，弃上清；除0min组外所有处理组加入250μL strip buffer，室温孵育8min，离心弃上清(4℃、1500rpm×5min)，FACS buffer洗涤两次，去上清，每组样品加入80μL2％FBS重悬细胞，于ZE5流式细胞仪(Bio-Rad，ZE5)检测待测样品荧光信号。
数据处理：
按照此公式计算每个候选抗体的内吞效率：抗体内吞百分率(％)＝(处理组MIF-blank组MFI)/(0min组MFI-blank组MFI)*100％。采用上述方法检测HU6DL突变体的内吞率如下表6所示：
表6.HU6DL突变体在NCI-N87细胞上的内吞效率
实验结论：
以上数据显示，本发明HU6DL突变体介导的TROP-2蛋白在胃癌细胞NCI-N87中的具有良好的内吞作用。
实施例5：HU6DL突变体杂质成分的检测
实验目的：利用毛细管电泳仪基于Maurice-nrCE-SDS法检测并比较突变后的抗体中杂质峰的含量及变化水平。
实验步骤
1.样品制备：
(1)样品换液浓缩：若样品蛋白浓度低于5mg/ml，或者样品缓冲液的盐浓 度较高，需进行样品换液以及浓缩处理，保证蛋白浓度在5mg/ml左右，样品中的盐浓度应小于50mM。
(2)非还原CE样品处理：向EP管中加入样品，每个样品的蛋白取用量为50μg，加入1μl的10kD内标(Protein Simple，046-144)，加入2.5μl的250mM IAM(Sigma,I1149-5G)，加入1×sample buffer(Protein Simple，046-567)至终体积为50μl。(3)振荡混匀后，70℃加热孵育10min，之后取出，于冰上孵育5min，冷却后于12000rpm离心5min。离心后取35μl上清转移至仪器匹配的96孔中，之后于1000rpm离心5min，将96孔样品板的放入Maurice(Protein Simple)中，准备上样分析。
2.上机检测
打开仪器以及软件，按照仪器操作步骤，进行仪器自检，安装毛细管卡盒，准备相应的试剂放入仪器的相应位置。根据仪器操作步骤，设置相应的参数，进行非还原CE分析。样品序列设置，根据样品名称编辑相应的序列，每个序列的样品数量不超过48个。序列编辑完成后，点击start开始序列检测。
利用如下公式计算样品主峰和杂质峰的含量。
注：公式中非还原纯度为主峰修正峰面积百分比；CA 主峰为主峰的修正峰面积；CA 总为主峰和杂质的修正峰面积之和。
表7.HU6DL突变体主峰和杂质峰的含量
样品 主峰含量(％) 杂志锋含量(％)
HU6DL T54 93.62 NA
实验结果表明，样品HU6DL T54的主峰含量达到93.62％，未检出杂质，具有很好的纯度。
实施例6化合物1的制备
第一步，将2a(2g，17.2mmol溶于75mL乙腈中，依次加入碳酸钾(9.27g，67.2mmol)、溴化苄(20mL，167.2mmol)和四丁基碘化铵(620mg，1.68mmol)。将反应液室温搅拌48小时，通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(20ml)淋洗，合并滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到产物5a(3.2g，产率：90.1％)。
第二步，将5a(181.3mg,0.879mmol)和4b(270mg，0.733mmol)加入反应瓶，加入6mL四氢呋喃，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇钾(164mg，1.46mmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌40分钟，加入15mL冰水，用乙酸乙酯(40mL×2)和氯仿(20mL×5)萃取，合并有机相并浓缩。所得残余物溶于6mL二氧六环中，加入3mL水，加入碳酸氢钠(73.8mg，0.879mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(190mg，0.734mmol)，室温搅拌2小时。加入30mL水，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到产物5b 10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸苄酯(73mg，产率：19.4％)。
MS m/z(ESI):515.0[M+1]。
第三步，将5b(30mg，0.058mmol)溶于6.75mL四氢呋喃和乙酸乙酯(V:V＝2:1)混合溶剂中，加入钯碳(18mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液浓缩，得到粗品产物5c 10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸(20 mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):424.9[M+1]。
第四步，将1b(15mg，28.2μmol)加入反应瓶，加入1.5mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品5c(20mg，47.1μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(25.4mg，86.2μmol)，冰浴搅拌反应40分钟。加入15mL水，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(20mL×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物5d(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-环丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸酯(23.7mg，产率：78.9％)。
MS m/z(ESI):842.1[M+1]。
第五步，将5d(30mg，35.7μmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入1.5mL二乙胺，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，加入1.5mL甲苯并减压浓缩，重复两次。向残余物中加入4.5mL正己烷打浆，静置后倾倒出上层清液，保留固体。将固体残余物减压浓缩，油泵拉干得到粗品产物5e 2-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-2-环丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺(23mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):638.0[M+18]。
第六步，将粗品5e(20mg，32.3μmol)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入4g(31.8mg，67.3μmol)的0.5mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(27.8mg，94.3μmol)，冰浴搅拌反应10分钟，撤去冰浴，升至室温搅拌1小时，反应生成化合物5。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH 4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到产物5-A和5-B(3.6mg，2.6mg)。
MS m/z(ESI):1074.4[M+1]。
单一构型化合物5-A(较短保留时间)：
UPLC分析:保留时间1.14分钟，纯度：85％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.60(t,1H),8.51-8.49(d,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.96(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.15(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,3H),4.74-4.62(m,2H),4.54-4.40(m,2H),3.76-3.64(m，4H),3.62-3.48(m,2H),3.20-3.07(m,2H),3.04-2.94(m,2H),2.80-2.62(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.15(m,2H),2.15-2.04(m,2H),1.93-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.87(t,3H),0.64-0.38(m,4H)。
单一构型化合物5-B(较长保留时间)：
UPLC分析:保留时间1.16分钟，纯度：89％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.68-8.60(m,1H),8.58-8.50(m,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.94(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.13(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.60-5.50(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,3H),4.78-4.68(m,1H),4.60-4.40(m,2H),3.76-3.58(m,4H),3.58-3.48(m,1H),3.20-3.10(m,2H),3.08-2.97(m,2H),2.80-2.72(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.13(m,2H),2.13-2.04(m,2H),2.03-1.94(m,2H),1.91-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.91-0.79(m,3H),0.53-0.34(m,4H)。
其他中间体的制备方法参考中间体5。
在37℃条件下，向抗体HU6DL.R54的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；7.3ml，13.8mg/ml，0.681μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.347mL，3.47μmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，稀释至14.0ml，并取出3.3ml溶液往下反应。
将化合物5-A(5.0mg，2.75μmol)溶解于0.15mL DMSO中，加入到上述3.3ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到化合物1的PBS缓冲液(1.45mg/mL，17mL)，于4℃冷冻储存。
采用紫外法测定平均值y。将装有琥珀酸钠缓冲液的比色皿分别置于参比吸 收池和样品测定吸收池中后，扣除溶剂空白后，再将装有供试品溶液的比色皿置于样品测定吸收池中，测定280nm和370nm处吸光度。
数据处理：
通过建立标准曲线，测定280nm波长下的吸收，确定抗体含量Cmab，测定370nm波长下的吸收，确定小分子含量CDrug。
药物载量平均值y＝CDrug/Cmab。
通过以上方法测定产物的药物载量，并通过UV-HPLC纯化获得化合物1(y＝4)的样品。
化合物2-化合物9的制备方法参考化合物1。
实施例7化合物10的合成
化合物a的合成
取原料a-1(4.1g，9.71mmol)、原料a-2(4.3g，8.09mmol，含4％氨基异构体杂质)置于250mL反应瓶中，氮气保护下加入DCM(54mL)，MeOH(18mL)搅拌并冷至0℃，加入DMTMM(3.6g，12.1mmol)，三乙胺(2.5g，24.2mmol)，并保持0℃搅拌反应1h，HPLC中控显原料原料a-2反应完全，减压(<25℃)蒸干反应液，加入MTBE(120mL)搅拌打浆(泥状物)，倒出溶液过滤，泥状物再次加入120mL MTBE打浆(固体)，过滤，滤饼用水(60mL×2)洗，晾干得粗品，粗品用二氯甲烷和甲醇溶解，湿法上样柱层析两次(洗脱剂DCM:MeOH＝40:1-20:1)分离得到化合物a纯品(6.2g,7.37mmol)，纯度：99.3％，收率91％。
化合物b的合成
取化合物a(5.7g,6.77mmol)置于500mL三口瓶中，氮气保护下加入干燥的THF(114mL)，搅拌溶解并冷却内温至-10℃左右，加入DBU(3.09g，20.31mmol)，滴加过程中保持内温-10至-5℃，5min加毕，滴毕后，保持内温-10至-5℃，反应2.5h，固体析出。
冷却内温至-20℃，加入MTBE(114mL)，期间保持内温-20至-10℃，产物完全析出，过滤，滤饼用MTBE(57mL×2)洗，抽干后得到化合物b粗品6g，-78℃保存待用。
化合物e的合成
将化合物c(651mg，1mmol)溶于10mL的DCM里，冰浴冷却下开启搅拌，滴入DBU(456mg,3mmol)。冰浴下反应一个小时后反应完成，依次加入化合物d(257mg,1mmol)和HATU(420mg，1.1mmol)，在冰浴下搅拌30分钟后，LCMS显示反应完成，反应液在25℃条件下浓缩，残留物用过柱机反相柱纯化(ACN in H 2O，50％出产物)得到化合物e，红棕色固体，130mg，收率19％。
MS:691.3[M+23]。
化合物f的合成
将化合物e(130mg,0.19mmol)溶于DCM，加入苯甲醚(62mg，0.57mmol)和二氯乙酸(245mg，1.9mmol)，反应在室温下搅拌过夜，共16小时，取样LC-MS中控，显示原料完全消耗，停止反应，将反应液在25℃条件下浓缩，残留物用 过柱机反相柱纯化(ACN/H 2O，30％出产物)，得化合物f，粉色固体，53mg，收率54％。
(MS:519.2[M+1]。
化合物D的合成
将化合物f(23mg,0.044mmol)和化合物b(27mg,0.044mmol)溶于DCM(3mL)和MeOH(1mL)，在氮气保护下冷却到-30℃。加入DMTMM(20mg，0.067mmol)，反应在-20℃～-10℃控温反应1小时，取样LC-MS中控，显示原料完全消耗。控制温度在-10℃，加入10mL水淬灭反应，加入30mL的DCM分层。水相用DCM/MeOH＝10/1(50mL)萃取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，在25℃条件下减压浓缩，残留物经制备纯化(ACN/H 2O/0.05％FA)，得化合物D，白色固体，5.8mg，收率12％，HPLC纯度98.87％。
MS:1120.3[M+1]。
氢谱图谱如图1所示。
在37℃条件下，向抗体HU6DL.R54的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；7.3ml，13.8mg/ml，0.681μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.239mL，1.70μmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，稀释至14.0ml，并取出3.3ml溶液往下反应。
将化合物D(3.0mg，3.72μmol)溶解于0.15mL DMSO中，加入到上述3.3ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到mAb2抗体偶联物的化合物10的PBS缓冲液(1.35mg/mL，13mL)，于4℃冷冻储液。
采用紫外法测定平均值y。将装有琥珀酸钠缓冲液的比色皿分别置于参比吸收池和样品测定吸收池中后，扣除溶剂空白后，再将装有供试品溶液的比色皿置 于样品测定吸收池中，测定280nm和370nm处吸光度。
数据处理：
通过建立标准曲线，测定280nm波长下的吸收，确定抗体含量Cmab，测定370nm波长下的吸收，确定小分子含量CDrug。
药物载量平均值y＝CDrug/Cmab。
通过以上方法测定产物的药物载量，并通过UV-HPLC纯化获得化合物10(y＝4)的样品。
化合物11-化合物18的制备方法参考化合物10。
实施例8抗体药物偶联物的细胞杀伤活性
评估本公开的抗体-药物偶联物对肿瘤细胞的杀伤作用，采用Trop-2阳性细胞株MDA-MB-468进行评估。用胰酶消化培养的MDA-MB-468单层细胞，加入培养基重悬，离心后计数，用完全培养基调整细胞密度为4×10 4个/mL，铺于底透白色96孔板(Corning，cat:3610)中间60个孔，每孔50μl，细胞数为2000细胞/孔，边缘孔加入100μl/孔培养基，细胞板放入37℃，5％CO 2培养箱培养过夜。次日，用完全培养基在96孔V型底板(Corning，cat:3894)中稀释抗体-药物偶联物工作溶液，浓度为10000nM起始，10倍稀释，9个浓度，配制完成后加入到白色96孔板中，每孔50μl，两复孔，将细胞板放入37℃，5％CO 2培养箱中继续培养6天。实验第6天，检测读数：取出细胞培养板，平衡至室温后，每孔加入50μl 细胞活力检测试剂(Promega，Cat#:G7573)，振荡混匀后放于暗处静置20分钟后用酶标仪于490nm，500毫秒/孔检测luminescence化学发光信号值。通过发光信号值计算抑制率(％)，
计算公式为：
抑制率(％)＝(1-样品孔信号值/对照孔信号平均值)×100。
样品孔为受试药物处理的细胞孔，对照孔完全培养基处理的细胞孔。
曲线拟合：根据各浓度对应的抑制率(％)，使用GraphPad Prism 6.0中的log(inhibitor)vs.response--Variable slope(four parameters)方程，以浓度对数值为X轴，以抑制率为Y轴，进行曲线拟合得到IC 50值，计算方程为：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC 50-X)*HillSlope))。实验结果如下表所示：
表8.抗体偶联药物对肿瘤细胞的杀伤作用
通过比较细胞杀伤IC 50，实验结果表明：相对于阴性对照，本发明抗体偶联药物均具有非常强的细胞杀伤作用。
实施例9抗体偶联药物的药代动力学
利用BALB/c小鼠模型评价抗Trop-2抗体药物偶联物Tro-2ADC在小鼠体内的药物代谢情况。将平均体重为18-22g，6-8周龄的BALB/c小鼠随机分为3组，每组3只动物，受试Trop-2ADC体药物偶联物均以4mpk，IV，单次的方式给药，分别在0.5、2、4、8、24、48、72、96、144、240小时采血分离血浆，冻存于-20℃冰箱，之后利用抗ADC多克隆抗体包被高亲和力96孔全透明板(Corning，cat:3590)，加入稀释的待测血浆样品，再利用羊抗人IgG1F(ab')片段F(ab')HRP标记二抗检测小鼠血浆中Trop-2ADC浓度，并利用PKSolver软件中非房室模型，血管内给药模型分析其PK参数。实验结果详见下表
表9.抗体-药物偶联物的药代动力学参数
PK参数 单位 化合物14(y＝4) 化合物5(y＝4)
t1/2 h 189.5 179.8
Tmax h 0.5 0.5
Cmax ng/ml 411.8 333.8
AUC 0-t ng/ml*h 49388.7 40735.8
MRT 0-inf_obs h 265.3 259.1
Cl_obs (mg/kg)/(ng/ml)/h 8.099E-05 9.819E-05
综合半衰期t1/2、血药浓度达峰时间Tmax、血药浓度Cmax、及清除率Cl_obs等参数的值，本发明抗体偶联药物显示出较好的代谢特性。
实施例10抗体偶联药物的体内抗肿瘤作用
为进一步研究抗体-药物偶联物对体内形成的肿瘤的抑制作用，采用Trop-2阳性肿瘤细胞人胃癌NCI-N87肿瘤细胞移植物小鼠模型评价候选分子体内抑制肿瘤增殖效果。将5x10 6个NCI-N87细胞注射到8周龄，体重18-20mg左右的 裸鼠(Balb/c Nude)皮下，10天后待瘤体积平均达160mm 3分组，开始通过静脉注射注射抗体-药物偶联物，每2周注射一次，剂量为4mg/kg。对照采用人IgG1同型对照抗体，剂量为4mg/kg。对照组或给药组每组5只小鼠。通过测量肿瘤体积计算抑瘤率。
抑瘤率＝100％-(第28天给药组肿瘤体积-第0天给药组肿瘤体积)/(第28天对照组肿瘤体积-第0天对照组肿瘤体积)。
表10.抗体-药物偶联物对肿瘤的杀伤作用
给药组 剂量 频次 抑瘤率(％)
hIgG1 iso 4mg/kg Q2W -
化合物14(y＝4) 4mg/kg Q2W 122.44
化合物5(y＝4) 4mg/kg Q2W 141.21
实验结果表明，在每2周注射一次，剂量为4mg/kg，本发明抗体偶联药物均显示出良好的抑瘤效果，此外，本发明抗体偶联药物在低剂量下也显示出较好的抑瘤率。
实施例11剂量依赖的抗体偶联药物的体内抗肿瘤作用
为进一步研究抗体-药物偶联物对体内形成的肿瘤的抑制作用，采用Trop-2阳性肿瘤细胞人胃癌NCI-N87肿瘤细胞移植物小鼠模型评价候选分子体内抑制肿瘤增殖效果。将5x10 6个NCI-N87细胞注射到6周龄，体重18-22mg左右的裸鼠(Balb/c Nude)皮下，8天后待瘤体积平均达175mm 3分组，开始通过静脉注射注射抗体-药物偶联物，每2周注射一次，剂量为2mg/kg、1mg/kg。对照采用人IgG1同型对照抗体，剂量为2mg/kg。对照组或给药组每组5只小鼠。通过测量肿瘤体积计算抑瘤率。
抑瘤率＝100％-(第28天给药组肿瘤体积-第0天给药组肿瘤体积)/(第28天对照组肿瘤体积-第0天对照组肿瘤体积)。
表11.抗体-药物偶联物对肿瘤的杀伤作用
给药组 剂量 频次 抑瘤率(％)
hIgG1 iso 2mg/kg Q2W -
化合物14(y＝4) 2mg/kg Q2W 124.25
化合物14(y＝4) 1mg/kg Q2W 85.97
DS-1062-化合物D(y＝4) 1mg/kg Q2W 78.2
实验结果表明，以每2周给药一次，在剂量为2mg/kg、1mg/kg给药28天后，本发明抗体偶联药物对人头胃癌细胞NCI-N87CDX荷瘤小鼠模型均显示出良好的抑瘤效果，并呈现出剂量依赖效果。
实施例12抗体偶联药物对头颈癌鳞癌FaDu体内药效模型研究
为进一步研究抗体-药物偶联物对体内形成的肿瘤的抑制作用，采用Trop-2阳性肿瘤细胞人头颈癌鳞癌FaDu肿瘤细胞移植物小鼠模型评价候选分子体内抑制肿瘤增殖效果。加入与matrigel基质胶等比例混合的细胞悬液，以每只动物5x10 6FaDu细胞注射到6周龄，体重18-22mg左右的裸鼠(Balb/c Nude)皮下，8天后待瘤体积平均达133mm 3分组，开始通过静脉注射注射抗体-药物偶联物，单次给药，剂量为3mg/kg、1mg/kg。对照采用人IgG1同型对照抗体，剂量为3mg/kg。对照组或给药组每组5只小鼠。通过测量肿瘤体积计算抑瘤率。
抑瘤率＝100％-(第17天给药组肿瘤体积-第0天给药组肿瘤体积)/(第17天对照组肿瘤体积-第0天对照组肿瘤体积)。
表12.抗体-药物偶联物对肿瘤的杀伤作用
给药组 剂量 频次 抑瘤率(％)
hIgG1 iso 3mg/kg 单次给药 -
化合物14 3mg/kg 单次给药 200
DS-1062(DAR4 70％) 3mg/kg 单次给药 200
化合物14 1mg/kg 单次给药 200
DS-1062 1mg/kg 单次给药 74.8
实验结果表明，在随机分组单次给药后，在剂量为3mg/kg、1mg/kg给药17天后，两个剂量3mg/kg、1mg/kg对人头颈癌鳞癌FaDu CDX荷瘤小鼠模型均显示出非常明显的抑瘤效果，其抑瘤率均达200％。
实施例13抗体偶联药物对肺癌Calu-3体内药效模型研究
为进一步研究抗体-药物偶联物对体内形成的肿瘤的抑制作用，采用Trop-2阳性肿瘤细胞人肺癌Calu-3肿瘤细胞移植物小鼠模型评价候选分子体内抑制肿瘤增殖效果。加入与matrigel基质胶等比例混合的细胞悬液，以每只动物2x10 6Calu-3细胞注射到6周龄，体重18-22mg左右的裸鼠(Balb/c Nude)皮下，8天后待瘤体积平均达148mm 3分组，开始通过静脉注射注射抗体-药物偶联物，单次以10mg/kg剂量给药，对照采用人IgG1同型对照抗体，剂量为10mg/kg。对照组或给药组每组5只小鼠。通过测量肿瘤体积计算抑瘤率。
抑瘤率＝100％-(第21天给药组肿瘤体积-第0天给药组肿瘤体积)/(第21天对照组肿瘤体积-第0天对照组肿瘤体积)。
表13.抗体-药物偶联物对肿瘤的杀伤作用
给药组 剂量 频次 抑瘤率(％)
hIgG1 iso 10mg/kg 单次给药 -
化合物14 10mg/kg 单次给药 100.35
DS-1062 10mg/kg 单次给药 85.61
实验结果表明，在随机分组单次给药后，在剂量为10mg/kg给药21天后，本发明抗体偶联药物对人肺癌Calu-3CDX荷瘤小鼠模型显示出明显的抑瘤效果，抑瘤率达100％。

Claims (16)

  1. 一种通式(I)所示的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，
    其中：
    L为-(CR 1R 2) m-[X 1-(CR 1R 2) n-X 2] t-(CR 1R 2) r-；
    R 1或R 2各自独立地选自氢、氘、羟基、氨基、烷基、卤素、卤代烷基、氘代烷基或羟烷基，优选地，R 1或R 2为氢；
    X 1或X 2各自独立地选自键、N、O或S；优选地，X 1或X 2为键或O，
    m、n、r或t各自独立地选自1、2、3或4，优选地，m、n、r或t各自独立地选自1或2；
    R 3或R 4各自独立地选自氢、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    或者，R 3和R 4与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    y为1～20，优选1～10，更优选2～8，进一步优选4、6或8；
    mAb为抗TROP-2抗体或其抗原结合片段，包含：
    SEQ ID NO:3所示的HCDR1、RIDPXDSETHYNQKFKD所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3，
    X选自R、Y、Q、L、T、I、F、E或A的氨基酸残基。
  2. 根据权利要求1所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其特征在于，TROP-2抗体或其抗原结合片段包含：
    SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:9所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
    SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2 和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
    SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:11所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
    SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:12所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
    SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:13所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
    SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:14所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
    SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:15所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
    SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:16所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3；或，
    SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:17所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3；以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3。
  3. 根据权利要求1所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其特征在于，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、人抗体或其抗原结合片段，或者人源化抗体或其抗原结合片段。
  4. 根据权利要求1所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，
    优选地，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含人IgG1、IgG2或IgG4的重链恒定区；
    更优选地，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO:48，或如SEQ ID NO:1所示的重链恒定区。
  5. 根据权利要求1所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含人抗体κ链、λ链或其变体的轻链恒定区；
    优选地，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含人抗体κ链的轻链恒定区；
    更优选地，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO:2所示的轻链恒定区。
  6. 根据权利要求1-5任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其特征在于，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含选自以下序列所示的重链可变区，或与以下序列相比具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27；
    和/或，SEQ ID NO:19的轻链可变区，或与之相比具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性。
  7. 根据权利要求6所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，其中所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含：
    SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
    SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
    SEQ ID NO：21所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
    SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
    SEQ ID NO：23所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
    SEQ ID NO：24所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
    SEQ ID NO：25所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
    SEQ ID NO：26所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区；或，
    SEQ ID NO：27所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区。
  8. 根据权利要求6所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段含有选自如下序列所示的重链，或 与以下序列相比具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37；
    和/或，SEQ ID NO：29所示的轻链，或与之相比具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性。
  9. 根据权利要求8所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗TROP-2抗体包含：
    SEQ ID NO：28所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
    SEQ ID NO：30所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
    SEQ ID NO：31所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
    SEQ ID NO：32所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
    SEQ ID NO：33所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
    SEQ ID NO：34所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
    SEQ ID NO：35所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
    SEQ ID NO：36所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链；或，
    SEQ ID NO：37所示的重链和SEQ ID NO：29所示的轻链。
  10. 根据权利要求1-9任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其选自如通式(II)所示的体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式：
    X 1或X 2为键或O；
    m为0或1；且
    t为1或2。
  11. 根据权利要求10所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其选自如通式(III)所示的体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
    其中，y为1～10，优选4、6、8或10。
  12. 根据权利要求11所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，所述抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物选自如下结构：
    其中，y如权利要求1中所定义。
  13. 一种制备如通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的方法，其包括以下步骤：
    mAb还原后，与通式(F)偶联反应，得到通式(I)所示的化合物，
    其中，L，R 3，R 4，mAb，y如权利要求1中所定义。
  14. 一种药物组合物，其包含如权利要求1-12任一项所述的抗体药物偶联物或所述抗体药物偶联物药学上可接受的盐或溶剂化合物，和一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
  15. 权利要求1-12任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物或权利要求14所述的药物组合物在用于治疗TROP-2相关疾病或病症。
  16. 如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述与人TROP-2相关的疾 病为TROP-2高表达的癌症，所述癌症选自三阴性乳腺癌、小细胞肺癌、尿路上皮癌、人脑星形胶质母细胞瘤、人咽头癌、肾上腺肿瘤、AIDS-相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀肮癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波因肉瘤、肾癌、白血病、脂肪肉瘤、恶性脂肪瘤性肿瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、嗜铭细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、肾转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、辜丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌和子宫癌。
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