CN101365486B - 使用抗egfr和抗her2抗体的联合治疗 - Google Patents

使用抗egfr和抗her2抗体的联合治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN101365486B
CN101365486B CN2006800503998A CN200680050399A CN101365486B CN 101365486 B CN101365486 B CN 101365486B CN 2006800503998 A CN2006800503998 A CN 2006800503998A CN 200680050399 A CN200680050399 A CN 200680050399A CN 101365486 B CN101365486 B CN 101365486B
Authority
CN
China
Prior art keywords
egfr
her2
antibody
cancer
mab
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2006800503998A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101365486A (zh
Inventor
S·D·吉利斯
D·阿兹里亚
C·拉尔布雷
A·佩莱格林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Health and Medical Treatment Institute
Original Assignee
National Health And Medical Treatment Institute
Regional Anticancer Center
Merck Patent GmbH
Universite de Montpellier I
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37876938&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN101365486(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by National Health And Medical Treatment Institute, Regional Anticancer Center, Merck Patent GmbH, Universite de Montpellier I filed Critical National Health And Medical Treatment Institute
Publication of CN101365486A publication Critical patent/CN101365486A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101365486B publication Critical patent/CN101365486B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific

Abstract

本发明涉及联合使用抗EGFR抗体和抗Her2抗体治疗癌症。特别适用于表达高水平的EGFR类型以及低水平HER2的癌症。特别地，本发明涉及抗HER2受体的单克隆抗体“司徒曼布”(

Description

使用抗EGFR和抗HER2抗体的联合治疗
技术领域
本发明涉及联合使用抗EGFR(ErbB1)抗体和抗Her2(ErbB2)抗体治疗癌症。本发明进一步涉及使用所述抗体治疗个体的肿瘤，其中该肿瘤细胞表达高水平的EGFR类型以及低水平或者不显著水平的HER2。特别地，本发明涉及使用抗HER2受体的单克隆抗体“司徒曼布”(trastuzumab)(
Figure S2006800503998D00011
())和抗EGF受体的单克隆抗体“matuzumab”(hmAb 425，EMD 72000)或者另一种抗EGFR抗体的联合治疗。优选地，联合治疗适合于如下罹患癌症的患者，该患者的组织不过表达HER2或者低水平表达HER2，但是却过表达EGFR。
背景技术
受体酪氨酸激酶(RTK)超家族的I亚类由ErbB受体组成，并且包括四个成员：EGFR/ErbB1，HER2/ErbB2，ErbB3和ErbB4。所有的成员具有细胞外配体结合区，单一的跨膜区和含有酪氨酸激酶的胞质域。酪氨酸激酶是一类催化腺苷三磷酸的末端磷酸基团转移至蛋白质底物中酪氨酸残基上的酶。
ErbB受体在上皮、间充质和神经来源的多种组织中表达。在正常的情况下，ErbB受体的活化通过其配体的时空表达而被调控，该配体是生长因子EGF家族的成员。配体结合ErbB受体诱导受体同二聚体和异二聚体的形成和内在激酶结构域的活化，导致在胞质尾部中的特定酪氨酸激酶残基的磷酸化。这些磷酸化残基起作为多种蛋白质的停靠位点的作用，蛋白质的募集导致细胞内信号传递途径的活化。
已知EGFR和HER2在调控细胞增殖和分化中起实质性的作用。一旦与细胞外生长因子结合，EGFR和HER2具有强烈的与其它HER受体组装为同二聚体和/或异二聚体的倾向，这导致多种形式的信号传导途径活化，致使细胞凋亡、存活或者增殖。越来越多的证据表明不仅仅是受体表达或者受体过表达，而且HER受体间的通讯在肿瘤行为中也起决定性作用(Kumagai等人，2001，PNAS 98，5526)。特别地，受体特异性配体与EGFR的胞外结构域的结合通常导致优选的异二聚化配偶体HER2的募集(例如Klapper等人，1999，PNAS 96，4995)。由于HER2是唯一的不与已知特异配体结合的HER家族成员，其作为信号转导物的主要的生物功能似乎归因于HER2参与和EGFR或者其它HER受体形成异二聚体受体复合物的行为(例如Konecny等人，2006，Cancer Res.96，1630)。
最近的研究(J.Schlessinger，2002，Cell 110，669)表明受体二聚化由受体-受体相互作用介导，其中从相邻受体突出的环介导受体的二聚化和活化。对于固有的催化活性的刺激和对于生长因子受体在酪氨酸残基上的自身磷酸化，受体的二聚化是必要的。
需要指出的是，受体蛋白质酪氨酸激酶能够进行同二聚化和异二聚化，其中同二聚化的受体组合比对应的异二聚化组合具有较小的促有丝分裂和转化作用(无或者弱的信号起始)。含有ErbB2的异二聚体是最有效的复合物(Yarden和Sliwkowski，2001，Nature Reviews，Molecular cell Biology，volume 2，127-137；Tzahar和Yarden，1998，BBA 1377，M25-M37)。
在临床上使用两个重要类型的ErbB抑制剂：抗EGFR或者ErbB2的胞外域的嵌合的、人源化的或者完全人的抗体，和在受体酪氨酸激酶结构域中与ATP竞争的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。
因此，使用以高亲和性结合ErbB(HER)家族的这两个成员(EGFR和HER2)的mAb来开发新的癌症治疗策略看来是合理的，其将具有抑制受体二聚化的可能。然而，迄今，这两个mAb每一个均各自单独地结合多种化疗剂用于治疗癌症(Slamon等人，2001，New Engl.J.Med 344，783；Baselga等人，2000，J Clin Oncol.18，904)，或者最近，与具有酪氨酸激酶受体抑制特性的不同的药物联合而用于治疗癌症(例如Normanno等人，2002，Ann Oncol 13，65)。然而，小分子酪氨酸激酶抑制剂的作用不能相比于由高分子量抗体分子的结合诱导的可能生物学活性。
还没有完全理解各抗ErbB/HER受体mAb的抗肿瘤活性的机制。在小鼠KO中针对Fc受体的一系列实验结果强有力地提示，大多数的抗肿瘤效应归因于效应NK细胞通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)机制的募集。然而，抗ErbB/HER受体mAb在肿瘤细胞上诱导的对受体磷酸化和受体内在化的抑制的证据却支持通过受体转导的凋亡或者细胞抑制信号(例如Friedman等人，2005，PNAS 102，1915)。
有一些抗HER/ErbB抗体进行了临床研究，并且已经被批准和上市，例如matuzumab、西妥昔单抗(cetuximab)，帕尼单抗(panitumumab)和司徒曼布(trastuzumab)。
抗EGF受体的人源化单克隆抗体425(也命名为matuzumab(hMAb425，US 5,558,864；EP 0531 472))和嵌合单克隆抗体225(cMAb 225)已经在临床试验中显示出其有效性。
c225抗体(西妥昔单抗，
Figure S2006800503998D00031
)被证实可以在体外抑制EGF介导的肿瘤细胞生长和在体内抑制人结肠直肠肿瘤，并且在2003年获得上市批准。该抗体以及一般地所有的抗EGFR抗体表现出可以，尤其是以协同方式与某些化疗剂(即阿霉素(doxorubicin)、羟基柔红霉素(adriamycin)、他克唑(taxol)和顺铂)一起，在异种移植小鼠模型中体内根除人肿瘤(例如EP 0667165)。而且，可以证实抗EGFR抗体c225和第二个抗EGFR抗体matuzumab的组合在体外模型中表现出协同作用，表明抗相同受体的这两个抗体结合EGFR的不同表位(WO 2004/032960)。
进一步发现抗HER2/ErbB2小鼠抗体4D5使表达ErbB2的乳腺肿瘤细胞系对TNFα的细胞毒效应敏化(US 5,677,171)。命名为huMAb4D5-8、rhuMAb HER2、司徒曼布或者
Figure S2006800503998D00032
的重组人源化抗体形式(US5,821,337)在具有ErbB2过表达的转移性乳腺癌的如下患者中是有临床作用的，该患者先前已经接受大量的抗癌治疗(Baselga等人，J.Clin.Oncol.14：737-744(1996))。
Figure S2006800503998D00041
在1998年获得治疗如下具有转移性乳腺癌的患者的市场准入，该患者的肿瘤过表达ErbB2蛋白。
尽管如上所述，司徒曼布在乳腺癌中的治疗效果被很好的证明，然而其被严格限制并且仅仅被允许用于肿瘤过表达HER2的30％乳腺癌患者。70％的乳腺癌患者对司徒曼布没有应答或者应答不够，因为他们的个体肿瘤不过表达或者不充分地表达HER2。在其它癌症和/或个体癌症中，HER2在43-69％的显著百分比病例中过表达，而EGFR通常在45-95％的病例中过表达。然而，通常原则上HER2表达的水平在大多数肿瘤中是低的。另外，EGFR和HER2受体的过表达通常由编码基因的扩增引起(Hynes等人，2005，Nat Rev Cancer 5，341)。因此，目前的共识是抗HER2 mAb在具有低HER2表达或者缺少过表达的肿瘤中是无效的，例如对于临床上的绝大多数胰腺癌而言，这是事实(例如Saxby等人，2005，J Surg Pathol29，1125)。
帕尼单抗()是完全的人抗EGFR抗体，并且最近在US获得市场准入(Schwartz等人，2002，Proc.Am Soc Clin Oncol 21，24)。
胰腺癌仍然是治疗最困难的恶性肿瘤之一。在过去的四十年里，胰腺癌的发病率稳步上升，尽管在早期诊断和治疗方面的大量的努力，其预后仍然是令人沮丧的。在诊断期间，大多数患者(80-90％)具有局部的或者转移的肿瘤。即使采取完全的外科切除，五年存活率仍然小于20％(Wagner等人，Br J Surg 2004；91：586-94)。与外科手术和放射疗法相关的常规治疗单独或者结合化学疗法都显示出在局部控制和缓解中具有一般的疗效，而且患者的生存没有实质的进展(Azria等人，Bull Cancer 2002；89：369-79，Azria等人，Pancreas 2002；25：360-5，Li等人Lancet 2004；363：1049-57.2-4)。因此，迫切需要治疗人胰腺癌的新的方法。
充分证明胰的腺癌和异常增殖症(displasias)通常过表达酪氨酸激酶受体。在胰腺癌中过表达的EGFR与表现出的晚期疾病和降低的半数存活时间有关。HER2表达/过表达在胰腺癌预后中的意义是不清楚的。事实上，已报道在人类胰腺标本中肿瘤分化程度和HER2表达水平之间无相关性(Dugan等人，Pancreas 1997；14：229-36)。通过回忆之前内容，即HER2的水平本身不介导有丝分裂以及异二聚化必须被激活，可以对此作出解释。
阻断EGFR和HER2的概念原则上是已知的，并且已经被应用于其它表达高水平EGFR和/或HER2的模型中。当使用如下联合处理时，显示出体外降低细胞增殖是加性效应而非协同效应，该联合处理或者使用嵌合抗EGFR抗体mAb c225(西妥昔单抗)和人源化的抗HER2抗体4D5(司徒曼布)在人卵巢癌细胞系OVCAR 420上进行(Ye等人1999，Oncogene18，731)，或者使用司徒曼布和mAb 225的鼠类变体在EGFR依赖的结肠癌细胞系上进行(Kuwada等人，Int.J Cancer 2004；109：291-301)。
另外，不同的研究组致力于通过将化学EGFR激酶抑制剂ZD1839(易瑞沙(Iressa))和司徒曼布结合来研究HER1和HER2的同时攻击作用，并且发现在细胞系SK-BR-3和BT-474中，这后两种化合物的组合诱导比这两个化合物分别使用时更好的抗增殖作用，特别是在诱导细胞凋亡方面(Normanno等人，Ann Oncol 2002；13：65-72)。
然而，在被特定的抗ErbB抗体靶向的、低水平表达EGFR和HER2中的至少一个的特定癌组织中，有关抗体的功效和EGFR和HER2受体的确切功能还知之甚少，所述特定癌组织例如是胰腺癌；并且至今没有临床研究评价使用合适的单克隆抗体同时靶向这些肿瘤中的这两个受体的功效。
基于在低水平表达EGFR和HER2中的至少一个受体的特定癌症中缺乏有效治疗方法，以及基于EGFR和HER2在所述癌症中的牵涉情况，产生在癌症特定模型上同时阻断EGFR和HER2的动机，所述模型优选高表达EGFR和不显著或者低水平表达(HER2)，其中所述表达模式可以通过免疫细胞化学分析或者通过使用流式细胞术分析技术进行评估。
发明概述
根据本发明，可以证实抗HER2抗体(例如司徒曼布)和抗EGFR抗体(例如matuzumab)的联合可以使得体内肿瘤消退或者至少在体内降低和/或延迟肿瘤生长，但是，优选仅仅在不显著表达或者低水平表达HER2，并且优选高水平表达EGFR的癌症和肿瘤组织中。在所述ErbB受体间的不同的表达模式可以在许多癌症中发现，例如胰腺癌。特定肿瘤组织的这种差异表达模式也可以是个体特性。换句话说，关于所述HER/ErbB受体，特定肿瘤可能在罹患所述肿瘤的不同个体/患者中发展出不同的表达模式。
令人惊讶的是，如果被治疗的癌症过表达EGFR但是不过表达HER2时，或者如果被治疗的癌症不表达或者不显著地表达HER2(低水平表达)并且以比对应的正常组织(非肿瘤)高的水平表达EGFR时，抗Her2抗体(例如司徒曼布)和合适的抗EGFR抗体(例如matuzumab)针对癌症的联合治疗具有强协同作用。
如果，此外，使用的抗HER2抗体没有或者没有显著的抑制HER2二聚化的能力，但使用的抗EGFR抗体具有显著抑制EGFR二聚化的能力时，这种联合治疗的功效也是协同地增强的。
即使考虑到如上描述的原则上已知阻断EGFR和HER2或阻断EGFR的不同表位的概念，这些发现也是新颖的和不可预见的。
当个体癌症不过表达HER2，但是过表达EGFR时，该联合的协同作用是非常不寻常的。
尽管不受任何理论或者假说的限制，但根据本发明描述的使用例如司徒曼布(赫赛汀)和matuzumab(EMD72000)对肿瘤生长的协同作用可以通过每个抗体对EGFR/HER2异二聚化的不同机理性作用来解释：根据本发明，司徒曼布和任何潜在的功能相似抗HER2抗体被认为将以不抑制二聚化，但显示出增强HER2受体的胞吞以及其从细胞膜上消失的方式结合结构域IV。与之相反，EMD72000和任何潜在的功能相似抗EGFR抗体被认为直接抑制EGFR的二聚化。Natha等人发现司徒曼布和另一个称为帕妥珠单抗(pertuzumab)的抗Her2抗体协同起作用(Cancer Res 2004；64：2343-6)。由于已知帕妥珠单抗抑制HER2二聚化，根据本发明，抗EGFR抗体matuzumab和任何其它的功能相似的抗EGFR抗体可能令人惊讶地在EGFR二聚化中发挥类似的作用。
本发明的发现表明并证实了在不同的HER/ErbB受体之间的通讯的重要性。已经表明HER2作为有利的共受体与HER家族的其它成员搭档而起作用，在多个水平上提高其二聚化配偶体的信号传导潜能。
根据本发明的结果，通过合适的单克隆抗体同时靶向EGFR和HER2的策略可以在特定的前提条件下，导致在生物系统中提供协同功效的治疗益处，该生物系统在病理条件下具有低HER2受体表达。根据本发明，合适的EGFR/HER2单克隆抗体联合的作用和功效看起来不仅依赖于它们各自的受体表达，还依赖于细胞中的同和/或异二聚化潜能。即使考虑到阻断EGFR和HER2或者阻断EGFR不同表位的已知概念，这些结果也是新颖的和不可预见的(参考上文)。
基于本发明证实的抗EGFR mAb和抗HER2 mAb对两个具有HER2中度表达的胰腺癌细胞系，以及对过表达两个HER受体的一个卵巢癌细胞系的协同治疗效果，可想到这些实验结果对胰腺癌和其它类型的癌症的治疗可能具有的影响的程度。已知在胰腺癌中，EGFR和HER2两者均在显著百分比的病例中有表达(例如Tobita等人，2003，Int J Mol Med11，305)，并且这些受体的表达已经被证实涉及该肿瘤的起始和进展。
因此，考虑到化学和放射治疗的最先进的加强治疗方案在这类癌症中的毒性和非常有限的结果(例如Czito等人，2006，J Clin Oncol 24，656)，可能期望考虑使用两个mAb，即抗EGFR和抗HER2 mAb联合治疗患有甚至低水平表达这两个HER受体中的至少一个的癌症的患者。关于抗HER2 mAb，已经充分确立了所述抗体的临床益处局限于具有显著过表达该受体的肿瘤的结论(Slamon等人，2001，Semin Oncol 28，13)，而通过本发明实验，在两个具有低至中等HER2表达水平的胰腺癌中证实了特定的抗HER2抗体和特定的抗EGFR抗体的协同作用。
已经表明在多种癌症细胞系中，使用抑制酪氨酸激酶受体的小分子(例如针对EGFR的易瑞沙(Normanno等人，2002，ann Oncol 13，65，或者针对EGFR和HER2两者的双激酶抑制剂拉帕替尼(Konecny等人，2006，Cancer Res 66，1630))可以与抗HER2 mAb治疗具有协同作用。然而，该协同作用主要表现在体外并且仅表现在过表达HER2的靶癌细胞系上。另外，具有酪氨酸激酶抑制特性的小分子的作用不能被认为与结合受体的胞外域的抗体大分子的作用相同。多年来，多个研究组提供了在肿瘤细胞悬浮液上的体外研究，表明与抗EGFR和抗HER2两种mAb的同时孵育诱导了比与单独一种mAb的孵育更有效的对受体磷酸化和/或受体的特异内化的抑制(21-24)。然而，仅仅一个研究组尝试了有限的体内研究，但是未能证实在两个mAb之间的任何协同作用(23)。
因此，在此给出的结果第一次提供了体内实验证据证实长期盼望的癌症治疗新进步通过抗EGFR mAb和抗HER2 mAb这两个抗体的协同作用可以得以实现。另外，本发明的结果表明具有中度表达HER2的乳腺癌患者，尽管不能使用抗HER2 mAb疗法治疗，但只要该肿瘤也表达EGFR，其可以从抗HER/ErbB的两种mAb的协同治疗中受益。
基于两种不同特异性的mAb的协同作用的另外三种癌症疗法目前正在研究中。第一，使用抗CD20和CD22 mAb联合治疗非霍奇金淋巴瘤的I期临床实验正在进行中(Leonard等人，2005，J Clin Oncol 23，5044)。，被这两个mAb识别的抗原非常不同，但是不具有异二聚化特性，该特性是本研究抗体的两个目标HER受体的特性。
第二个，完全处于实验阶段的研究涉及抗胰岛素样生长因子受体(IGF-IR)mAb，据报道其具有与化疗剂(长春瑞滨(vinorelbine))或者与抗EGFR mAb在乳腺癌和肺癌异种移植模型中协同抗肿瘤的作用(Goetsch等人，2005，Int J Cancer 113，316)。然而，IGF-IR不属于HER受体家族并且就可能的治疗而言，IGF-IR的应用比HER2受体具有较小的肿瘤限制。
第三个实验研究涉及在胰腺癌异种移植模型中使用抗EGFR和抗VEGFR mAb(Tonra等人，2006，Clin Cancer Res 12，2197))。这个研究中使用的两个mAb不针对相同的肿瘤靶细胞。事实上，抗VEGFRmAb结合在内皮细胞而不是胰腺癌细胞上表达的受体。因此，这两种mAb在这个研究中的作用机制似乎涉及肿瘤血管形成参数，并且不同于本发明两种mAb与位于相同靶癌症细胞上的两种HER/ErbB受体的结合(其似乎负责本发明公开的协同抗肿瘤效果)。
总之，本发明涉及下述内容：
总之，本发明涉及
●药物组合物，包含有效量的抗EGFR抗体和抗HER2(ErbB2)抗体或者其免疫学有效片段，任选地含有药学载体、稀释剂或者赋形剂，其中该抗EGFR抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 425(matuzumab，EMD7 2000)，以及抗HER2抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 4D5(司徒曼布，)，每个所述抗体优选为人源化变体。
●相应的药物组合物，其中所述抗EGFR抗体结合肿瘤细胞，其中EGF受体中度表达或者高表达或者过表达。
●相应的药物组合物，其中所述抗HER2抗体结合肿瘤细胞，其中HER2受体低表达，或者比EGFR表达低。
●相应的药物组合物，其中肿瘤细胞是胰腺肿瘤细胞。
●相应的药物组合物，还包含细胞毒性剂。
●相应的药物组合物，其中细胞毒性剂是化疗剂，优选选自顺铂，阿霉素，吉西他滨(gemcitabine)，多西他赛(docetaxel)，紫杉醇(paclitaxel)，博来霉素和依立替康(irinotecan)。
●相应的药物组合物，其中细胞毒性剂是第三种ErbB受体抑制剂、VEGF受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白质激酶A抑制剂、抗血管生成药或者细胞因子。
●相应的药物组合物，其中所述抗体的一个或者每个在其C末端融合生物学有效肽、多肽或者蛋白质，任选地，通过接头肽融合，以形成免疫缀合物，优选免疫细胞因子。
●药盒，包含(i)包含如上描述的抗EGFR抗体或者抗EGFR抗体免疫缀合物或者其免疫学有效部分的第一包装，(ii)包含如上描述的抗HER2抗体或者抗HER2抗体免疫缀合物或者其免疫学有效部分的第二包装。
●相应的药盒，包含(iii)含有如上描述的细胞毒性剂的第三包装。
●如上描述的药物组合物在制备治疗表达ErbB受体的肿瘤的药物中的用途。
●所述药物组合物的相应用途，其中所述肿瘤不过表达HER2或者仅仅以比EGFR低的量表达Her2。
●所述药物组合物的相应用途，其中所述肿瘤细胞过表达EGFR但是不过表达HER2。
●所述药物组合物的相应用途，用于治疗胰腺癌。
●如描述的所有的药物组合物在制备联合放射疗法和/或化学疗法抗癌的药物中的用途。
●药物组合物，包含在本发明的一般方面和主要方面中的任何抗EGFR抗体和任何抗HER2抗体，其中所述抗体各自单独不抑制EGFR和HER2的异二聚化，但是如果联合给予时则抑制所述异二聚化。
●相应的药物组合物，其中抗EGFR抗体结合过表达EGFR的待治疗的肿瘤细胞，并且抗HER2抗体结合不过表达HER2或者相比较于所述的EGFR过表达以低或者中等量表达HER2的待治疗的肿瘤细胞。
●相应的药物组合物，其中所述抗EGFR抗体选自鼠源、嵌合或人源化mAb 425(matuzumab)，以及所述抗HER2抗体选自鼠源、嵌合或人源化mAb 4D5(司徒曼布)。
●双特异抗体，包含结合EGFR的第一抗原结合位点(优选衍生自鼠源、嵌合或者人源化mAb 425(matuzumab))，以及结合HER2的第二抗原结合位点(优选衍生自鼠源、嵌合或人源化mAb4D5(司徒曼布))。
●包含抗HER2抗体和抗EGFR抗体的药物组合物在制备治疗个体癌症的药物中的用途，其中在所述个体中的所述癌症表达EGFR和HER2，其中HER2以低水平表达，或者以不足以显著地应答抗HER2抗体单独治疗的水平表达。
●相应的用途，其中当单独给予时所述抗HER2抗体，不抑制或者不显著地抑制HER2二聚化和/或HER2/EGFR异二聚化，并且当单独给予时所述抗EGFR抗体，显著地抑制EGFR二聚化和/或EGFR/HER2异二聚化。
●相应的用途，其中所述癌症不过表达HER2和/或不过表达EGFR。
●相应的用途，其中所述抗HER2抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 4D5(司徒曼布)。
●相应的用途，其中所述抗EGFR抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 425(matuzumab)。
●相应的用途，其中所述抗HER2抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 4D5(司徒曼布)，以及所述抗EGFR抗体是鼠源、嵌合或人源化mAb 425(matuzumab)。
●相应的用途，其中所述癌症是胰腺癌或者乳腺癌。
●相应的用途，其中所述抗体是免疫学有效片段，例如Fab′-(Fab′)2片段。
●相应的用途，其中还施用细胞毒性剂，例如化疗剂，优选选自顺铂，阿霉素，吉西他滨，多西他赛，紫杉醇，博来霉素和依立替康，或者VEGF受体抑制剂，小分子酪氨酸激酶抑制剂、抗血管生成药或者细胞因子。
●相应的用途，其中所述抗体的一者或者两者优选在其C末端融合生物学有效肽、多肽或者蛋白质，任选地通过接头肽融合，由此形成免疫缀合物。
●相应的用途，其中所述免疫缀合物是兔疫细胞因子。
●相应的用途，包含具有如上和如下描述的两种抗体的特异性的双特异抗体。
●包含抗HER2和抗EGFR抗体的药物组合物在制备用于改善使用所述抗HER2抗体治疗个体癌症的疗效的药物中的用途，其中所述个体的所述癌症以低水平或者以不足以显著地应答所述抗HER2抗体的单独治疗的水平表达HER2，并且以足够显著应答抗EGFR抗体的水平表达EGFR。
●相应的用途，其中当单独给予时所述抗HER2抗体，不抑制或者不显著地抑制HER2二聚化和/或HER2/EGFR异二聚化，并且当单独给予时所述抗EGFR抗体，显著地抑制EGFR二聚化和/或EGFR/HER2异二聚化。
●相应的用途，其中所述癌症不过表达HER2但过表达EGFR。
●相应的用途，其中所述抗HER2抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 4D5(司徒曼布)，以及所述抗EGFR抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 425(matuzumab)。
●相应的用途，其中所述癌症是胰腺癌或者乳腺癌。
●用于在个体中治疗表达HER2和EGFR的癌症的方法，其中，所述个体的所述癌症以不足以显著地应答单独给予的抗HER2抗体的水平表达HER2，该方法包括向个体给药抗HER2抗体(该抗体当被单独给予时不抑制或者不显著抑制HER2二聚化和/或HER2/EGFR异二聚化)，以及抗EGFR抗体(当其被单独给予时，其显著地抑制EGFR二聚化和/或EGFR/HER2异二聚化)。
●相应的方法，其中HER2不过表达和/或EGFR过表达。
●相应的方法，其中所述抗HER2抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 4D5(司徒曼布)。
●相应的方法，其中所述抗EGFR抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 425(matuzumab)。
●相应的方法，其中所述抗HER2抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 4D5(司徒曼布)，并且所述抗EGFR抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 425(matuzumab)。
●相应的方法，所述癌症是胰腺癌或者乳腺癌。
●用于改善使用抗HER2抗体治疗表达HER2并且优选过表达EGFR的癌症的疗效的方法，其中所述癌症不过表达HER2或者以低水平表达HER2或者以不足以显著地应答所述抗HER2抗体的单独治疗的水平表达HER2；该方法包括向个体给药抗HER2抗体(当其被单独给予时不或者不显著抑制HER2二聚化和/或HER2/EGFR异二聚化)，以及抗EGFR抗体(当其被单独给予时，显著地抑制EGFR二聚化和/或EGFR/HER2异二聚化)。
●相应的方法，其中所述抗HER2抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 4D5(司徒曼布)，和/或所述抗EGFR抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 425(matuzumab)。
●相应的方法，其中癌症是胰腺癌或者乳腺癌。
发明详述
EGFR和HER2受体的细胞表面表达：
对人胰腺癌BxPC-3细胞的免疫细胞化学分析显示高水平的EGFR(分类为+++)受体表达，但是没有可检测水平的HER2受体表达，相对地人卵巢癌细胞SK-OV-3和表皮癌参考细胞A-431使用相同的分析分别分类为HER2+++，以及EGFR+++(图1)。
针对HER2，第二个胰腺癌细胞系MiaPaCa-2也被分类为阴性，而针对EGFR，被分类为++。
相反，使用更灵敏的流式细胞术技术(Mimura等人，2005，Clin CancerRes 11，4898)，相比较于SK-OV-3细胞，可以在BxPC-3细胞和MiaPaCa-2细胞上发现中度表达的HER2。
可以确认BxPC-3细胞过表达EGFR，但是比参考A-431细胞具有稍微低的表达水平。MiaPaCa-2显示出EGFR和HER2受体两者的中度且相等表达。SK-OV-3显示出EGFR的中度表达和HER2的高表达(图1)。
基于HER2在BxPC-3肿瘤细胞上的非常低表达水平和基于生物分布结果，可以预期司徒曼布在体外和体内将获得有限的肿瘤活性。事实上，HER2过表达是已经建立的用于评估乳腺癌患者是否可进行司徒曼布治疗的诊断工具(Slamon等人，2001，Semin Oncol；28，13)，并且相应地，只有具有免疫组织化学3+HER2肿瘤表达的患者可以从此靶向治疗中受益。
很少发生的HER2/neu过表达可以解释为什么司徒曼布目前没有用于临床治疗胰腺癌。研究确认司徒曼布的单一疗法不能减缓呈现低HER2表达的肿瘤的生长。应注意的是，在这些研究中使用的司徒曼布的剂量比根据本发明的实验中使用的剂量高三至十二倍。
Matuzumab和/或司徒曼布对两种胰腺癌异种移植物和一种卵巢癌异 种移植物的抗肿瘤活性
首先在裸鼠的BxPC-3异种移植物上测试抗EGFR和抗HER2 mAb单独使用或联合使用的治疗功效。为了评估不同形式的mAb治疗对不同大小的肿瘤异种移植物的效果，分析了两个系列的代表性实验结果，第一个是关于相对小体积的肿瘤的(77+49mm3，实验S)，第二个是关于较大的肿瘤的(503±205mm3，实验L)。实验S的结果(图2)显示，相比较于使用抗体各自单独治疗的组，在联合抗体治疗的组中肿瘤生长受到显著更高的抑制(P＝0.002)，该结果在使用每种抗体各自50μg每周处理两次，持续处理四周的小鼠中(每组含有8只小鼠)获得。相同实验结果的进一步分析显示，在使用抗EGFR和抗HER2 mAb各自单独处理的小鼠中，在处理结束时肿瘤增大的倍数(4.9±2.1和6.4±4.4)显著地比联合mAb处理组(0.7±0.5)的高(表1，上半部分)。而且，仅有联合的mAb处理诱导两起完全的肿瘤消退。在另外的实验中对具有相似大小的BxPC-3异种移植物的小鼠单独或者联合给予四倍剂量(200μg)的每种mAb，实验的结果完全证实了上述结果，即相比较于联合mAb治疗，单一mAb治疗导致高非常多的肿瘤增大倍数，(表1，下半部分)。
表1.在处理结束时BxPC-3异种移植物体积的增大倍数
  mAb   处理a   增大倍数b   ％无肿瘤小鼠
  -50   CMTT+M   8.0±4.04.9±2.16.4±4.40.7±0.5   00025(2/8)
  -200   CMTT+M   21.3±7.04.3±2.85.5±2.10.8±0.3   00060(3/5)
aC：对照，M：matuzumab，T：司徒曼布，T+M：两种mAb。
b增大倍数：(在处理结束时的肿瘤体积)/(在处理开始时的肿瘤体积)
另外，在治疗结束时仅仅在联合治疗组中观察到五只小鼠中的三只有完全的肿瘤消退。比较表1中报道的使用不同抗体剂量的治疗，表明在每种抗体各50μg的联合治疗中明显地诱导了比在使用四倍剂量的单一mAb治疗的小鼠中获得的肿瘤增大(4.3和5.5)低的肿瘤增大(0.7±0.5)。在50μg和200μg处理之间没有观察到可检测的剂量效应，表明两种mAb结合两种HER2受体的协同作用比绝对的抗体量更重要。这个观察结果清楚地支持协同效应而非加性效应。来自BxPc-3肿瘤的较大的异种移植物(实验L)的结果(图3A)在适应性调整的卡普兰-迈耶存活曲线(adaptedKaplan-Meier survival curves)中显示，对于肿瘤达到1500mm3体积的半数延迟，在使用mAb联合处理的小鼠(73天)中比在仅仅使用一种mAb处理的小鼠中(抗HER2为30天，抗EGFR为34天)显著地长，P＝0.001，所述结果从使用200μg的每种抗体注射的，每组六只小鼠的四个组中获得。来自相同实验的时间肿瘤进展曲线证实与两个单一mAb处理相比，联合处理组达到三倍大的肿瘤的时间显著地更长(P＜0.001)(图3B)。有趣的是，在具有大肿瘤的六只小鼠的另一组中，仅仅使用每种mAb各50μg联合治疗，肿瘤达到1500mm3体积所需要的时间(70天)比使用每种mAb分别200μg各自处理的组中肿瘤所需要的时间(30和34天)长的多(图3A)。这证实，即使对于较大的肿瘤，两种mAb的双重特异性也比绝对的mAb剂量更有效，并且较大的抗肿瘤效果是由于两种mAb的协同效应而非两种mAb的加性效应所致。抗EGFR和抗HER2 mAb联合的肿瘤生长抑制特性进一步在来自第二个也表达低水平HER2的人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2的异种移植物上进行检测。当平均肿瘤体积达到64mm3±5时，在每组六只小鼠的组中开始单独或者联合注射50μg的每种mAb，每周两次并持续四周。当肿瘤达到2000mm3体积时，对动物进行安乐死。就肿瘤达到这个体积而言，适应性调整的存活曲线显示在第120天，在联合抗体治疗的组中没有观察到大于2000mm3的肿瘤，而在使用单一mAb处理的两个组中，六只小鼠中的四只具有达到这个体积的肿瘤(P＝0.0072)(图4A)。另外，仅仅在联合mAb治疗组中可以观察到完全的肿瘤消退。有趣的是，在一个单独的实验中，使用每种抗体各仅25μg联合处理相似大小(65±6mm3)的MiaPaCa-2异种移植物，产生有效的抗肿瘤效果，而单一mAb注射几乎没有生长抑制效果，对于该肿瘤而言也证实，通过抗不同HER受体的两种mAb造成攻击具有重要作用。为了验证在两种胰腺癌细胞系中观察到的这两种抗HER受体mAb的联合作用的治疗优势是否也可以对其它类型的癌有作用，在已知过表达EGF和HER-2受体两者的参考卵巢癌细胞系SK-OV-3上进行单一抗体注射和联合mAb注射的相同比较。当SK-OV-3异种移植物具有42±4mm3中值体积时，由200μg或者抗EGFR或者抗HER-2mAb，或者两种mAb的联合组成的治疗在每组六只小鼠的四组中(包括未处理的对照组)开始。如所预期的，考虑到在这些肿瘤细胞上两种HER受体均过表达，可以观察到每种mAb各单独治疗的活性，在注射抗EGFR或抗HER2的小鼠组中分别观察到1起和2起完全的肿瘤消退。然而，在使用两种mAb联合注射的所有小鼠中，出现明显地更好的肿瘤生长抑制，包括三起完全的肿瘤消退。针对肿瘤达到1000mm3体积而言，适应性调整的存活曲线的结果表明使用mAb联合治疗的所有六只小鼠的肿瘤在120天的观察期中均没有达到1000mm3，而对于使用抗EGFR或抗HER2治疗的小鼠组，对于50％小鼠达到这个肿瘤体积而言的延迟分别是69天和85天(P＝0.0001)(图4B)。这些结果证实两种抗HER小鼠mAb对人卵巢癌异种移植物的治疗协同作用，并且表明这两种mAb的联合注射可以用于治疗表达EGF和HER2受体的多种类型的癌。
受体自磷酸化的抑制
可以通过western印迹评估单独使用matuzumab或司徒曼布或者联合使用两者而体外抑制BxPC-3和MiaPaCa-2细胞上EGFR和HER2的酪氨酸激酶活性的能力，其中通过光密度测定法进行磷酸化蛋白质的定量并使用NIH imager 6.3进行分析(图5)。在与两种mAb或者分别或者联合孵育48h后，再使用EGF激活10min，之后比较在两种胰腺癌细胞系上的分析结果。首先应注意的是，两种细胞系都显示出EGFR和HER2受体的相对高的磷酸化基线。如所期望的，使用外源EGF进行处理可以在两种细胞系中诱导EGFR和HER2的高水平酪氨酸自身磷酸化。有趣的是，在两种细胞系中与联合mAb孵育导致比和单独的抗HER2 mAb孵育高许多的HER2磷酸化抑制。对于EGFR，通过两种mAb的联合造成的磷酸化抑制具有较小的差别；该抑制与单独使用抗EGFR mAb获得的结果相比，在MiaPaCa-2和BxPC-3细胞上分别是几乎相同或者仅仅稍微较高。这些结果以及来自文献的更广泛的体外研究(22-24)可以解释本文描述的这两种抗HER受体mAb对人癌异种移植物的引人注目的体内治疗协同作用。
尽管在胰腺癌BxPC-3细胞系中高表达EGFR，单独使用剂量为50或者200μg/注射的matuzumab(EMD72000)不能抑制肿瘤生长或者仅仅对肿瘤生长具有很小的抑制效果，证实在EGFR表达和抗EGFR抗体的治愈功效之间缺乏相关性。这可以被第二个体内胰腺癌模型(MiaPaca)说明，其中小鼠使用50μg/注射的EMD72000治疗，每周两次持续四周。然而，本发明联合的抗肿瘤活性比这些抗体作为单一组分单独使用时的可忽略的抗肿瘤活性高很多。关于肿瘤体积的减小和体外生存力研究，在BxPC-3模型中，联合抗体的效果明显地是协同效应，而不仅仅是从单一组分的功效计算的加性效应。这个效果在四周的治疗期间特别地显著，其中在联合治疗组中没有观察到肿瘤进展。可以在小和大胰腺肿瘤中观察到这个治疗的相似功效。
使用对相同或者不同受体上的抗原结构具有不同特异性的单克隆抗体进行联合治疗的原则在本文以举例方式针对治疗EGFR和HER 2阳性的胰腺肿瘤进行了描述。然而，这个原则不局限于胰腺癌，而可以被适应性调整用于显示出相同或者相似受体表达谱的任何其它癌症。如果没有相反说明，本发明中使用的术语和短语具有如下给出的含义和定义。而且，这些定义和含义更详细地描述本发明，包括优选的实施方案。
根据本发明，术语“过表达”定义为指相应受体在肿瘤细胞表面上比在正常非肿瘤细胞(优选衍生自相同组织)表面上以更高，优选地显著地更高的比率和/或量表达。
通常，取决于具体组织和样本，EGFR和HER2在许多正常组织细胞上以非常低的比率至最多为低的比率表达。在肿瘤组织内或者上，这些比率通常显著的更高，尤其是对于EGFR。例如就乳腺癌而言，HER2在至少30％的患者中显著地过表达，并且以比EGFR高的水平表达。在胰腺癌中，情况通常相反。在许多情况中，看起来情况还取决于待治疗个体的遗传性素质。因此，术语“中度表达”“显著表达”等是相对的术语，并且一定要看具体情况而言。然而，根据本发明，一般如果没有其它说明，术语“低表达”指就以上意义上的不“过表达”。如没有其它说明，术语“中度表达”或者“显著表达”指以较低/中度或者显著/较高的比率“过表达”。本文中的“显著”指与特定个体的正常非肿瘤细胞相比，相应肿瘤细胞表达的受体量可检测地更高。“受体”或者“受体分子”是包含一个或者多个如下结构域的可溶或者膜结合/相关蛋白质或者糖蛋白，配体与所述结构域结合以形成受体-配体复合物。通过结合可以是激动剂或者拮抗剂的配体，受体被激活或者失活并且可以起始或者阻断信号传导途径。
“ErbB受体”是属于如上文已经说明的ErbB受体家族的受体蛋白质酪氨酸激酶，并且包括EGFR/HER1(ErbB1)，HER2(ErbB2)，ErbB3和ErbB4受体和将来鉴定的这个家族的其它成员。ErbB受体通常包括可以结合ErbB配体的胞外域、亲脂跨膜结构域、保守的细胞内酪氨酸激酶结构域和含有几个可以被磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号结构域。ErbB受体可以是“天然序列”的ErbB受体或者其“氨基酸序列变体”。优选的ErbB受体是天然序列的人ErbB受体。本文可以互换使用表述“ErbB1”和“HER1”和“EGFR”，并指人HER1蛋白。本文可以互换使用表述“ErbB2”和“HER2”并指人HER2蛋白。根据本发明优选ErbB1受体(EGFR)。
术语“ErbB受体拮抗剂/抑制剂”指生物效应分子，其结合并阻断或者抑制ErbB受体。因此，通过阻断受体，拮抗剂防止ErbB配体(激动剂)与受体的结合以及防止激动剂/配体受体复合物的活化。ErbB拮抗剂可以靶向HER1(ErbB1，EGFR)，HER2(ErbB2)和ErbB3和ErbB4。
本发明优选的抗体是抗Her1和抗Her2抗体，优选的抗Her1抗体是MAb 425，优选人源化MAb 425(hMAb 425，matuzumab，EMD 72000，US 5,558,864；EP 0531 472)和嵌合MAb 225(西妥昔单抗，
Figure S2006800503998D00191
)。最优选的抗HER2抗体是
Figure S2006800503998D00192
由Genentech/Roche出售。
根据本发明，术语“酪氨酸激酶拮抗剂/抑制剂”指能够抑制或者阻断酪氨酸激酶(包括受体酪氨酸激酶)的天然或者合成的活性剂。因此，该术语本质上包括如上文定义的ErbB受体拮抗剂/抑制剂。除了上文和下文提及的抗ErbB受体抗体，在此定义下，更优选的酪氨酸激酶拮抗剂是在针对乳腺癌和胰腺癌的单一药物治疗中已经表现出疗效的化学化合物。本文中最有希望的抗癌剂之一是吉非替尼(gefitinib)(AstraZeneca)，据报道其在非小细胞肺癌(NSCLC)以及晚期头颈癌的患者中具有突出的治疗功效并且具有极好的耐受性。优选地，如上定义的化学酪氨酸激酶抑制剂的剂量为每天1pg/kg体重至每天1g/kg体重。更优选地，酪氨酸激酶抑制剂的剂量为每天0.01mg/kg体重至每天100mg/kg体重。
本发明不仅涉及提及的抗HER/ErbB抗体，还涉及它们的生物活性片段，以及如下文描述的免疫缀合物，尤其是免疫细胞因子。
基于抗体恒定区的氨基酸序列，完整的抗体可以被分为不同的“抗体(免疫球蛋白)类别”。完整的抗体有五个主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的某些可以进一步地分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于抗体不同类别的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。根据本发明，抗体优选的主要类别是IgG，更具体为IgG1和IgG2。
如本文使用的术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群体(即，构成该群体的各单个抗体除了可以少量存在的可能天然突变之外是相同的)获得的抗体。单克隆抗体是高度特异的，指向单一抗原位点。而且，不同于多克隆抗体制品(其包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体)，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。制备单克隆抗体的方法包括杂交瘤方法，其由Kohler和Milstein(1975，Nature 256，495)描述以及描述在“单克隆抗体技术，啮齿类和人类杂交瘤的制备和表征”“MonoclonalAntibody Technology，The Production and Characterization of Rodent andHuman Hybridomas”(1985，Burdon等人编辑，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，Volume 13，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam)，或者可以通过熟知的重组DNA方法制备(参见，例如，US 4,816,567)。也可以使用例如在Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：58，1-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。
术语“嵌合抗体”指在该抗体中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种的抗体或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或者同源，而链的剩余部分与衍生自另一个物种的抗体或者属于另一个抗体类别或者亚类的抗体中的对应序列相同或者同源；该术语也包括这些抗体的片段，只要该抗体片段表现出所需要的生物学活性即可(例如：US 4,816,567；Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci USA，81：6851-6855(1984))。制备嵌合和人源化抗体的方法也是本领域已知的。例如用于制备嵌合抗体的方法包括在Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)的专利(US 4,816,397；US4,816,567)中描述的那些。
“人源化抗体”是非人类(例如啮齿类)嵌合抗体的形式，其含有最少的来源于非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体在大部分上是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区(CDR)的残基被来自具有所期望的特异性、亲和性和能力的非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔子或非人类灵长类)(供体抗体)的高变区的残基替代。在一些实例中，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被对应的非人类残基取代。另外，人源化的抗体可以包含在受体抗体和供体抗体中均不存在的残基。进行这些修饰是为了进一步精细化抗体的性能。一般地，人源化抗体包括至少一个(并且典型地两个)可变结构域的基本上全部，其中高变环的全部或者基本上全部对应于非人类免疫球蛋白的高变环，并且FR的全部或者基本上全部是具有人免疫球蛋白序列的FR。任选地，人源化抗体也可以包括至少一部分的免疫球蛋白恒定(Fc)区，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。制备人源化抗体的方法例如被Winter(US 5,225,539)和Boss(Celltech，US 4,816,397)描述。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，该部分优选地包含抗体的抗原结合区或者可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv和Fc片段、双抗体(diabody)、线性抗体、单链抗体分子以及从抗体片段形成的多特异性抗体。“完整”抗体是包括抗原结合可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定结构域CH1，CH2和CH3的抗体。优选地，完整抗体具有一个或者多个效应子功能。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个包含单一一个抗原结合位点和一个CL区和一个CH1区)和剩余的“Fc”片段(其名称反映出该片段容易结晶的能力)。抗体的Fc区通常包含CH2，CH3和IgG1或IgG2抗体主要类别的铰链区。铰链区是一个大约15个氨基酸残基的组，其将CH1区和CH2-CH3区结合。胃蛋白酶处理产生“F(ab′)2”片段，其含有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。“Fv”是最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和抗原结合位点。该区由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域通过紧密的非共价结合形成的二聚体组成。在这种构型中每个可变结构域的三个高变区(CDR)相互作用以确定在VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。六个高变区合在一起向抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单一的可变结构域(或者仅仅包含对抗原具有特异性的三个高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力但是具有比完整的结合位点低的亲和性。
“Fab”片段也含有轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH1)，并仅仅含有一个抗原结合位点。“Fab′”片段不同于Fab片段，其在重链CH1结构域的羧基末端添加了少量残基，包括一个或者多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。F(ab′)2抗体片段最初被生成为Fab′片段对，在两个片段之间具有铰链区半胱氨酸。也已知抗体片段的其它化学偶联(参见，例如Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996；US 4,342,566)。“单链FV”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一的多肽链上。优选地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv形成所期望的用于抗原结合的结构。单链FV抗体是已知的，例如，从
Figure S2006800503998D00221
(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，Vol.113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994))，WO93/16185；US 5,571,894；US 5,587,458；Huston等人(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879)或Skerra和Plueckthun(1988，Science 240，1038)中已知。
“双特异性抗体”(BAbs)是单个的二价抗体(或其免疫治疗有效片段)，其含有两种不同特异性的抗原结合位点。根据本发明，BAbs被表征为BAb<MAb 1，MAb 2>，其中<MAb 1>和<MAb 2>指来自MAb 1和MAb 2的抗原结合位点。例如，第一抗原结合位点靶向血管发生受体(例如整联蛋白或者VEGF受体)，而第二抗原结合位点靶向ErbB受体(例如EGFR或HER2)。双特异性抗体可以通过化学技术(参见，例如，Kranz等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，5807)、通过“polydoma”技术(参见US 4,474,893)或者通过重组DNA技术制备，所有这些技术本身都已知。其它方法在WO 91/00360，WO 92/05793和WO 96/04305中描述。双特异性抗体也可以从单链抗体制备(参见例如，Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879；Skerra和Plueckthun(1988)Science 240，1038)。这些单链抗体是制备为单一多肽链的抗体可变区的类似物。为了形成双特异结合剂，可以通过本领域已知的化学或者遗传工程方法将单链抗体偶联在一起。根据本发明，也可以通过使用亮氨酸拉链序列制备双特异性抗体。使用的序列可以来自转录因子Fos和Jun的亮氨酸拉链区(Landschulz等人，1988，Science 240，1759；关于综述，参见Maniatis和Abel，1989，Nature 341，24)。亮氨酸拉链是大约20-40残基长的特定的氨基酸序列，其中亮氨酸典型地出现在每第七个残基上。这样的拉链序列形成两性α螺旋，其中亮氨酸残基排列在用于形成二聚体的疏水侧上。对应于Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链的肽优先形成异二聚体(O′Shea等人，1989，Science 245，646)。含有拉链的双特异性抗体以及制备它们的方法也在WO 92/10209和WO 93/11162中公开。
术语“免疫缀合物”指融合蛋白，意指抗体或者免疫球蛋白或者其免疫学有效片段通过共价连接融合到非免疫学有效分子上。优选地，这个融合配偶体是肽或者蛋白质，其可以被糖基化。所述非抗体分子可以被连接到抗体重链恒定区的C末端，或者连接到轻链和/或重链可变区的N末端。融合配偶体可以通过接头分子而连接，该接头分子通常是含有3-15个氨基酸残基的肽。根据本发明，免疫缀合物是融合蛋白，其由靶向ErbB受体的免疫球蛋白或者其免疫治疗有效片段和优选地细胞因子(例如TNFα，IFNγ或IL-2)或者另外的毒性剂组成。优选地，这些基于肽或者蛋白质的分子以其N末端连接到所述免疫球蛋白的C末端，即免疫球蛋白的Fc部分。术语“细胞因子”是一个上位术语，指由一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一个细胞的蛋白质。细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和常规的多肽激素。包括在细胞因子中的是生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；泌乳素；胎盘催乳激素；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGFβ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)例如TGFα和TGFβ；促红细胞生成素(EPO)；干扰素，例如IFNα、IFNβ和IFNγ；集落刺激因子例如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白细胞介素例如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12和TNF-α或TNF-β。根据本发明优选的细胞因子是干扰素，TNFα和IL-2。
术语“免疫治疗有效的或者免疫学有效的”指在哺乳动物中引起免疫应答的生物分子。更具体地，该术语指可以识别和结合抗原的分子。典型地，抗体、包含其抗原结合位点(互补决定区，CDR)的抗体片段和抗体融合蛋白质是免疫治疗有效的。
作为一个特定实施方案，本发明的治疗方法包括施用其它治疗有效剂，该治疗有效剂支持所期望的效果，例如肿瘤毒性或者抑制细胞的功效，或者减小或者防止不期望的副作用。因此，本发明包括这样的其它治疗剂与如上和如下定义和要求保护的药物组合物的组合，其中所述治疗剂一般可以是其它的ErbB受体拮抗剂、VEGF受体拮抗剂、细胞因子、细胞因子-免疫缀合物、抗血管生成药、抗激素药或者细胞毒性剂。本发明的另一个目的是将本文定义的组合物与根据已知方法的放射治疗组合。
本发明使用的术语“细胞毒性剂”具有非常宽的定义，并且指抑制或者阻止细胞的功能和/或造成细胞破坏(细胞死亡)和/或实施抗肿瘤作用/抗增殖作用，例如直接地或者间接地防止赘生肿瘤细胞的发育、成熟或者扩散的物质。该术语明确地还包括仅仅引起细胞抑制作用而不只是细胞毒性作用的活性剂。
术语“化疗剂”是术语“细胞毒性剂”的一个亚类，并且特别指起抗肿瘤作用的化学活性剂，该作用优选直接地发生在肿瘤细胞上，和较少地间接地通过例如生物应答修饰等机制起作用。根据本发明合适的化疗剂优选天然或者合成的化学化合物。可以获得大量的处于商业使用、临床评估和临床前开发中的抗肿瘤化学活性剂，其可以包括在本发明中与本发明要求保护的和公开的受体拮抗剂一起用于联合治疗肿瘤/赘生物。该术语尤其包括下文描述的活性剂，以及其它的ErbB拮抗剂(例如抗ErbB抗体)、抗血管生成药、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂、细胞因子家族的成员、放射性同位素和毒素(例如细菌、真菌、植物或者动物来源的酶活性毒素)。优选的化疗剂是阿米斯丁(amifostine)(氨磷汀(ethyol))，顺铂，达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)，放线菌素D(dactinomycin)，恩比兴(mechlorethamine)(氮芥)，链脲霉素(streptozocin)，环磷酰胺，双氯乙基亚硝脲(carrnustine)(BCNU)，罗氮芥(lomustine)(CCNU)，阿霉素(doxorubicin)(羟基柔红霉素(adriamycin))，doxorubicin lipo(doxil)，吉西他滨(gemcitabine)(吉西他宾(gemzar))，柔红霉素(daunorubicin)，daunorubicin lipo(daunoxome)，甲基苄肼(procarbazine)，丝裂霉素(mitomycin)，阿糖胞苷(cytarabine)，依托泊苷(etoposide)，氨甲喋呤(methotrexate)，5-氟尿嘧啶(5-FU)，长春碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)，博来霉素(bleomycin)，紫杉醇(paclitaxel)(他克唑(taxol))，多西他赛(docetaxel)(多西紫杉(taxotere))，阿地流津(aldesleukin)，天冬酰胺酶，白消安(busulfan)，卡铂(carboplatin)，卡拉屈滨(cladribine)，喜树碱(camptothecin)，CPT-11，10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)，吉非替尼(gefitinib)(易瑞沙(Iressa))，达卡巴嗪(dacarbazine)，氟尿苷(floxuridine)，氟达拉滨(fludarabine)，羟基脲(hydroxyurea)，异环磷酰胺(ifosfamide)，去甲柔毛霉素(idarubicin)，美司钠(mesna)，干扰素α，干扰素β，依立替康(irinotecan)，米托蒽醌(mitoxantrone)，拓扑替康(topotecan)，醋酸亮丙瑞林(leuprolide)，甲地孕酮(megestrol)，苯丙氨酸氮芥(melphalan)，巯嘌呤(mercaptopurine)，光辉霉素(plicamycin)，曼托坦(mitotane)，天门冬酰胺酶(pegaspargase)，喷托他丁(pentostatin)，哌泊溴烷(pipobroman)，普卡霉素(plicamycin)，链脲霉素(streptozocin)，他莫替芬(tamoxifen)，替尼泊苷(teniposide)，睾内酯(testolactone)，硫鸟嘌呤(thioguanine)，噻替哌(thiotepa)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)，长春瑞滨(vinorelbine)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)和其组合。
根据本发明更优选的化疗剂是顺铂，吉西他滨，阿霉素，紫杉醇(taxol)和博来霉素。
术语“癌症”和“肿瘤”指或者描述哺乳动物的生理状况，其典型特征是具有不受调控的细胞生长。通过根据本发明的药物组合物可以治疗肿瘤，例如乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾脏、肾脏、膀胱、头和颈、卵巢、前列腺、脑、胰、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏的肿瘤。可以优选使用根据本发明的抗体分子治疗的肿瘤是大量表达ErbB受体，特别是ErbB1受体，但是此外ErbB2(HER2)受体以较低量表达的实体瘤或者转移性肿瘤，例如乳腺癌、前列腺癌、头颈癌、SCLC、胰腺癌。
术语“生物/功能有效的”或者“治疗有效的”指药物/分子在体内或者体外引起生物功能或者生物功能改变，并且其以特定量治疗哺乳动物(优选人)的疾病或者紊乱时是有效的。
“放射治疗”：根据本发明，另外肿瘤可以使用辐射或者放射性药物治疗。辐射源对于接受治疗的患者而言可以是外部的或者内部的。当该来源对于患者而言是外部时，该治疗被称为体外放射治疗(EBRT)。当辐射源对于患者而言是内部的，该处理被称为近距放射治疗(BT)。一些已使用的典型的放射性原子包括镭、铯-137、铱-192、镅-241和金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘(iodide)-123、碘-131和铟-111。也可以使用放射性同位素标记根据本发明活性剂。目前，放射治疗是控制不能切除的或者不宜手术的肿瘤和/或肿瘤转移物的标准处理。当放射治疗和化学治疗结合时观察到改善的结果。
“药物治疗”：本发明的活性剂剂可以通过注射或者通过随时间逐步输注以胃非肠外方式给药。尽管待治疗的组织可以典型地通过全身性给药而在身体内接触到药物，并且因此最经常的是通过静脉施用治疗性组合物进行治疗，但当被靶向的组织可能含有靶分子的时候，则可以考虑其它组织和递送方式。因此，本发明的活性剂可以通过常位注射和输注而眼内、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经皮施用，以及也可以通过蠕动泵递送。
本发明的治疗组合物含有生理可耐受载体以及溶解或者分散在载体中的作为活性成分的如本文公开的相关活性剂。
如本文使用的，术语“药物上可接受的”指组合物、载体、稀释剂和活性剂能够施用给哺乳动物而无不良的生理反应产生，所述不良生理反应例如是恶心、眩晕、胃不适等等。含有溶解或者分散在其中的活性成分的药物组合物的制备是本领域所熟知的，并且配制上无需受到限制。典型地，这样的组合物被制备为可注射的液体溶液或者悬浮液，但是，也可以制备为适合在使用前在液体中配制为溶液或者悬浮液的固体形式。也可以将制剂乳化。活性成分可以与赋形剂混合，赋形剂是药学上可接受的并且与活性成分是相容的，以适合本文公开的治疗方法的量使用。合适的赋形剂例如是水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物以及其组合。另外，如果需要，组合物还可以含有少量的辅助物质，例如润湿剂或者乳化剂、pH缓冲剂等等，其增强活性成分的功效。本发明的治疗组合物可以包括本文公开的成分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸或者有机酸形成的酸加成盐(与多肽的自由氨基基团形成)，无机酸例如是盐酸或者磷酸，有机酸例如是乙酸、酒石酸、苯乙醇酸等等。与自由的羧基基团形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、钾、铵、钙或者铁，以及衍生自有机碱，例如是异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。生理上可耐受的载体在本领域是熟知的。液体载体的实例是无菌水溶液，其除了活性成分和水之外不包含其它物质，或者包含缓冲液，例如在生理pH值的磷酸钠、生理盐水或者两者，例如磷酸缓冲盐溶液。另外，水性载体可以含有多于一种的缓冲盐以及例如氯化钠和氯化钾的盐、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶质。，液体组合物也可以含有除了水之外的额外液相，以及可以含有排除水之外的液相。这些另外的液相的实例是甘油、植物油(例如棉籽油)和水-油乳剂。
典型地，免疫治疗剂的治疗有效量，例如对于ErbB(ErbB1，ErbB2)受体阻断性抗体或者对应的抗体缀合物，是当以生理上可耐受的组合物形式给药时，足够达到如下血浆浓度的量，所述血浆浓度是大约0.01μg/ml至大约100μg/ml，优选大约1μg/ml至大约5μg/ml，并且通常约为5μg/ml。换言之，剂量可以从大约0.1mg/kg至大约300mg/kg，优选从大约0.2mg/kg至大约200mg/kg，最优选从大约0.5mg/kg至大约20mg/kg，每日给药一个或者多个剂量，持续一天或者几天。当免疫治疗剂是单克隆抗体的片段或者缀合物时，可以基于片段/缀合物的质量与完整抗体的质量相比较而容易地调整该量。优选的血浆浓度(体积摩尔浓度)是大约2μM至大约5mM，优选，大约100μM至1mM的抗体拮抗剂。
对于优选是本发明化学细胞毒性剂或者化疗剂(既不是免疫治疗剂，也不是非免疫治疗性肽/蛋白质)的活性剂，典型剂量是10mg/kg体重/天至1000mg/kg体重/天，优选大约20mg/kg体重/天至200mg/kg体重/天，并且更优选50mg/kg体重/天至100mg/kg体重/天。
本发明的药物组合物可以包含使用能够降低或者避免与本发明联合治疗相关的副作用的活性剂对个体实施治疗(“辅助治疗”)，包括但不限于例如那些降低抗癌剂的毒性作用的活性剂，例如骨吸收抑制剂、心脏保护剂。所述辅助剂防止或者降低与化学治疗、放射治疗或者手术相关的恶心和呕吐的发生，或者降低与施用骨髓抑制性抗癌药物相关的感染的发病率。辅助剂(adjunctive agent)是本领域熟知的。根据本发明的免疫治疗剂另外可以与佐剂(象BCG)和免疫系统刺激物一同给药。另外，组合物可以包括含有细胞毒性的放射性标记同位素或者其它细胞毒性剂(例如细胞毒性肽(例如细胞因子)或者细胞毒性药物等等)的免疫治疗剂或者化疗剂。
细胞系的来源
细胞系和培养条件。人胰腺癌细胞系(BxPC-3和MiaPaCa-2)、卵巢癌细胞系(SK-OV-3)和外阴表皮样癌细胞系(vulvar epidermoidcarcinoma cell line)(A-431)从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，MD，USA)获得。BxPC-3细胞系在RPMI-1640培养基(Gibco，Paisley，UK)中培养；MiaPaCa-2，SK-OV-3和A-431细胞系在DMEM培养基(Gibco)中培养。根据ATCC的推荐，对培养基进行成分补加。
附图简述
图1.在两种胰腺癌细胞系(BxPC-3和MiaPaCa-2)和两种参考细胞系(A-431和SK-OV-3，分别用作EGFR或HER2的阳性对照)上EGFR和HER2表达的免疫细胞化学和流式细胞术分析结果。NC(阴性对照)：组织仅仅与免疫过氧化物酶缀合物孵育。在流式细胞术分析中，黑色和灰色峰分别描述使用抗EGFR或抗HER2抗体染色的细胞表面。白峰代表细胞仅仅与FITC标记的二抗孵育而获得的对照。
图2.司徒曼布和matuzumab单独或者联合对裸鼠中的小体积BxPC-3异种移植物生长的影响(实验S)。平均的预处理肿瘤体积是77±49mm3。小鼠(每组八只)接受每种mAb各50ng剂量的i.p.注射，每周注射两次共持续四周。结果表示为肿瘤进展：[(终体积)-(起始体积)]/(起始体积)。C：对照；T：司徒曼布；M：matuzumab；T+M：司徒曼布+matuzumab。
图3.司徒曼布和matuzumab单独或者联合对裸鼠中的大体积BxPC-3异种移植物生长的影响(实验L)。平均的预处理肿瘤体积是502±205mm3。小鼠(每组五只)接受每种mAb各50ng或者200ng剂量的i.p.注射，每周注射两次共持续四周。A，针对原发肿瘤达到1500mm3体积而适应性调整的以时间为函数的卡普兰-迈耶存活曲线。C：对照；T：司徒曼布(每次注射200μg)；M：matuzumab(每次注射200μg)；T+M：司徒曼布+matuzumab(每次注射50或200μg的每种mAb)。
B，以肿瘤进展曲线表述的相同实验的结果。双头箭头指示处理期。
图4.A司徒曼布和matuzumab单独或者联合对裸鼠中的MiaPaCa-2异种移植物生长的影响。平均的预处理肿瘤体积是64±5mm3(每组六只)。小鼠接受每种mAb各50μg的i.p.注射，每周注射两次，从第15天至43天持续四周。基于原发肿瘤达到2000mm3体积而适应性调整的以时间为函数的卡普兰-迈耶存活曲线。C：对照；T：司徒曼布；M：matuzumab；T+M：司徒曼布+matuzumab。
B.司徒曼布和matuzumab单独或者联合对裸鼠中的SK-OV-3异种移植物生长的作用。平均的预处理肿瘤体积是42±4mm3(每组六只)。小鼠接受每种mAb各200μg的i.p.注射，每周注射两次，从第11天至40天持续四周。针对原发性肿瘤达到1000mm3体积的卡普兰-迈耶存活曲线。C：对照；T：司徒曼布；M：matuzumab；T+M：司徒曼布+matuzumab。
图5.体外司徒曼布和matuzumab单独或者联合对BxPC-3和MiaPaCa-2细胞系上EGFR和HER2的磷酸化的影响。细胞与每种mAb各10ng/ml孵育48小时，随后与100ng/ml EGF或者无EGF孵育10分钟。上半部：western印迹分析，GAPDH＝上样对照。下半部：受体磷酸化的定量，表示为对照的百分数，并绘成柱形图，显示由所示处理条件诱导的抑制。C：对照；T：司徒曼布；M：matuzumab；T/M：司徒曼布+matuzumab。
图6.在携带人胰腺癌BxPC-3(A)或MiaPaCa-2(B)异种移植物的无胸腺NMRI小鼠中，放射性标记的matuzumab和司徒曼布抗体的肿瘤定位和生物学分布。小鼠接受125I-matuzumab和131I-司徒曼布i.v.共注射。在注射后48小时处死小鼠。称重肿瘤和所有的正常器官，并且在双通道闪烁计数器上检测差异放射性。结果表示为每克组织中存在的注射剂量的放射性的百分比(％ID/g)。
图7.体外使用司徒曼布和matuzumab单独或者联合处理，对BxPC-3细胞生长的抑制。将BxPC-3细胞以10,000细胞/孔接种于96孔板中，使其过夜贴壁。第二天，使用司徒曼布和matuzumab单独处理或者以固定的比例(1∶1)联合处理细胞。五天之后，如在材料和方法中公开的进行MTS检测。每个数值代表平均值±SEM(n＝6)。
实施例
实施例1
体内肿瘤生长抑制实验
所有的体内实验都在遵循法国实验动物研究指南(French guidelinesfor experimental animal studies)(协议号B34-172-27)的情况下进行。分别从Janvier，Le Genest(St Isle，法国)和Charles Rivers实验室(L′Arbresle，法国)购买裸鼠、6-8周龄雌性无胸腺NMRI小鼠和无胸腺BALB/c小鼠。将BxPC-3(3.5×106)，MiaPaCa-2(5×106)和SK-OV-3(5×106)细胞皮下注射(s.c.)到无胸腺NMRI(BxPC-3模型)和BALB/c(MiaPaCa-2和SK-OV-3)裸鼠的右胁腹。将MiaPaCa-2细胞悬浮在50％培养基和50％Matrigel(BD biosciences，Le Pont De claix，法国)中。当肿瘤达到在每个实验中指明的近似体积时，将携带肿瘤的小鼠随机分为不同的处理组。对于BxPC-3模型，抗体治疗的效果在小肿瘤(实验S)和大肿瘤(实验L)中进行研究。通过腹膜内注射(i.p.)0.9％NaCl，司徒曼布，matuzumab，或者比例为1∶1的两种mAb而处理小鼠。注射的每种mAb的量根据实验不同而是每次注射50ng或200ng，一周注射两次，连续进行四周。使用测径器每周两次检测肿瘤的尺寸，并且通过公式D1 x D2x D3/2计算体积。使用公式[(终体积)-(起始体积)]/(起始体积)计算肿瘤的进展。也使用肿瘤达到规定体积的时间(取决于肿瘤生长速率)，用适应性调整的卡普兰-迈耶存活曲线表述结果，其中对于SK-OV-3异种移植物，规定体积为1000mm3，对于BxPC-3异种移植物，规定体积为1500mm3，对于MiaPaCa-2异种移植物为2000mm3。半数延迟定义为50％小鼠具有规定体积的肿瘤的时间。对于在BxPC-3模型中的实验S，在处理期间的增加倍数通过用在处理开始时的肿瘤体积(第27天)除在处理结束时的肿瘤体积(第55天)而计算。
实施例2：
免疫细胞化学分析
受体的表达在石蜡包埋的AFA(乙醇甲醛乙酸)固定的细胞中进行分析。根据厂商说明，使用EGFR pharmDx试剂盒(DakoCytomation，Carpinteria，CA，USA)进行EGFR表达的分析。使用二氨基联苯胺作为色素原，并且使用苏木精轻微复染切片。用于检测HER2的一抗是兔多克隆抗体(Dakocytomation)。
实施例3.
免疫印迹分析
将106个BxPC-3和MiaPaCa-2细胞铺板在Petri盘中24小时，然后在没有生长因子的培养基(SM培养基)中饥饿两天，之后使用10Ng/ml司徒曼布、matuzumab或者固定1∶1比例的两种抗体(或者没有抗体的对照)处理细胞。48小时孵育之后，将细胞在含有100ng/ml EGF或者没有EGF的SM培养基中孵育10分钟，洗涤两次，然后使用含有100NMPMSF，100mM氟化钠(sodium fluorure)，1mM原钒酸钠(sodiumorthovanate)和一整片蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，St Louis，MO)的缓冲液(CliniSciences SA，Montrouge，法国)裂解细胞。在非还原条件下，在8％SDS-PAGE上电泳，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(MilliporeCo.，Bedford，MA)上，该膜在含有0.1％Tween 20和5％脱脂奶粉的PBS中饱和，然后与从Cell Signaling Technology(Beverly，MA)获得的抗磷酸化形式的EGFR和HER2的抗体孵育。为了确保相同上样量，也使用抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)抗体(Chemicon international，澳大利亚)探测免疫印迹。
实施例4.
细胞生存力检测
使用四唑盐(MTS)和电子偶联试剂(PMSF)检测方法评估司徒曼布和/或EMD72000对细胞生存力的影响。简而言之，以100 HI培养基中的10,000个细胞/孔的方式将BxPC-3细胞种于96孔微量滴定板上。24小时之后，使用浓度为5至10Hg/ml的抗体处理细胞。孵育96小时之后，将细胞暴露于MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)试剂，并在37℃孵育2小时。检测490nm的吸光度，并且生存力的抑制百分比计算为增殖细胞相比较于未处理培养物的百分数。所有的实验重复三次。

Claims (7)

1.抗HER2抗体与抗EGFR抗体联合在制备用于治疗个体癌症的药物中的用途，其中：(i)所述个体的所述癌症过表达EGFR，但不过表达HER2，或HER2以不足以显著地应答单独的抗HER2抗体治疗的水平表达，(ii)当单独给予时，所述抗HER2抗体不抑制或者不显著地抑制HER2二聚化和/或HER2/EGFR异二聚化，并且(iii)当单独给予时，所述抗EGFR抗体显著地抑制EGFR二聚化和/或EGFR/HER2异二聚化。
2.权利要求1的用途，其中所述抗HER2抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 4D5(司徒曼布)。
3.权利要求1的用途，其中所述抗EGFR抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 425(matuzumab)。
4.权利要求1的用途，其中所述抗HER2抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 4D5(司徒曼布)，并且所述抗EGFR抗体是鼠源、嵌合或者人源化mAb 425(matuzumab)。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述癌症是胰腺癌。
6.权利要求1-4中任一项的用途，其中还施用细胞毒性剂。
7.权利要求5的用途，其中还施用细胞毒性剂。
CN2006800503998A 2006-01-04 2006-12-15 使用抗egfr和抗her2抗体的联合治疗 Expired - Fee Related CN101365486B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06000107.0 2006-01-04
EP06000107 2006-01-04
PCT/EP2006/012133 WO2007076923A1 (en) 2006-01-04 2006-12-15 Combination therapy using anti-egfr and anti-her2 antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101365486A CN101365486A (zh) 2009-02-11
CN101365486B true CN101365486B (zh) 2012-10-31

Family

ID=37876938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800503998A Expired - Fee Related CN101365486B (zh) 2006-01-04 2006-12-15 使用抗egfr和抗her2抗体的联合治疗

Country Status (13)

Country Link
US (2) US20090214541A1 (zh)
EP (1) EP1968633B2 (zh)
JP (1) JP2009522316A (zh)
KR (1) KR20080110987A (zh)
CN (1) CN101365486B (zh)
AR (1) AR059127A1 (zh)
AU (1) AU2006332212B8 (zh)
BR (1) BRPI0620888A2 (zh)
CA (1) CA2636074A1 (zh)
EA (1) EA015173B1 (zh)
MX (1) MX2008008564A (zh)
WO (1) WO2007076923A1 (zh)
ZA (1) ZA200806723B (zh)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
EP2335728A1 (en) 2001-05-11 2011-06-22 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Specific binding proteins and uses thereof
US10118970B2 (en) 2006-08-30 2018-11-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
CN104043123B (zh) 2007-01-25 2019-08-13 达娜-法勃肿瘤研究所公司 抗egfr抗体在治疗egfr突变体介导的疾病中的用途
AU2008227123B2 (en) 2007-03-15 2014-03-27 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Treatment method using EGFR antibodies and src inhibitors and related formulations
MX2010001757A (es) 2007-08-14 2010-09-14 Ludwig Inst Cancer Res Anticuerpo monoclonal 175 que activa el receptor egf y derivados y usos del mismo.
CA2710680C (en) * 2007-12-26 2018-10-16 Vaccinex, Inc. Anti-c35 antibody combination therapies and methods
PE20110593A1 (es) 2008-09-03 2011-09-10 Genentech Inc Anticuerpos multiespecificos
EP2337800B1 (en) 2008-09-15 2013-10-02 Yeda Research and Development Co. Ltd. Antibody combinations and use of same for treating cancer
WO2010120514A2 (en) * 2009-03-31 2010-10-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antigen-binding proteins comprising recombinant protein scaffolds
EP2507381A4 (en) * 2009-12-04 2016-07-20 Hoffmann La Roche PLURISPECIFIC ANTIBODIES, ANTIBODY ANALOGUES, COMPOSITIONS AND METHODS
US8609095B2 (en) * 2010-03-04 2013-12-17 Symphogen A/S Anti-HER2 antibodies and compositions
US9155802B2 (en) 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition
EP2710038B1 (en) 2011-05-16 2018-01-17 Yeda Research and Development Co. Ltd. COMBINATIONS OF ANTI ErbB ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
EP2844675B1 (en) 2012-05-02 2019-01-02 Symphogen A/S Humanized pan-her antibody compositions
US10562974B2 (en) 2013-03-13 2020-02-18 University Of Kentucky Research Foundation Methods of administering IgG1 antibodies and methods of suppressing angiogenesis
WO2014139131A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Crown Bioscience, Inc. Use of egfr biomarkers for the treatment of gastric cancer with anti-egfr agents
DK3019533T3 (da) * 2013-07-11 2020-03-23 Scripps Research Inst Dobbeltspiraliserede immunoglobulinfusionproteiner og sammensætninger deraf
WO2015073721A1 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Zymeworks Inc. Monovalent antigen binding constructs targeting egfr and/or her2 and uses thereof
PT3186283T (pt) * 2014-08-29 2020-02-21 Hoffmann La Roche Terapêutica combinada de imunocitocinas de variante de il-2 dirigidas ao tumor e anticorpos contra pd-l1 humano
CN104991065B (zh) * 2015-07-07 2017-01-11 复旦大学附属金山医院 一种用于诊断乳腺癌的三联标志物及其应用
JP2018062980A (ja) * 2016-10-12 2018-04-19 株式会社ジェイテクト ボールネジ装置、ボールネジ装置の製造方法及びステアリング装置
MX2019007801A (es) * 2016-12-28 2019-10-30 Genentech Inc Tratamiento de cáncer avanzado con expresión de her2.
CN117915950A (zh) * 2021-08-06 2024-04-19 甘李药业股份有限公司 一种多特异性抗体及其用途
CN117430707B (zh) * 2023-10-25 2024-04-19 重庆天科雅生物科技有限公司 一种cik细胞的制备方法及其在治疗癌症中的用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6270765B1 (en) * 1995-06-07 2001-08-07 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3040121B2 (ja) * 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
CZ282603B6 (cs) * 1991-03-06 1997-08-13 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschränkter Haftun G Humanizované a chimerické monoklonální protilátky
LU91067I2 (fr) * 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US20030086924A1 (en) 1999-06-25 2003-05-08 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
SI1549344T1 (sl) 2002-10-10 2015-05-29 Merck Patent Gmbh FARMACEVTSKI SESTAVKI PROTI RECEPTORJEM ErbB1
AU2005211890B2 (en) * 2004-02-12 2011-07-28 Merck Patent Gmbh Highly concentrated liquid formulations of anti-EGFR antibodies
PE20070207A1 (es) * 2005-07-22 2007-03-09 Genentech Inc Tratamiento combinado de los tumores que expresan el her

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6270765B1 (en) * 1995-06-07 2001-08-07 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
EP1968633A1 (en) 2008-09-17
CA2636074A1 (en) 2007-07-12
EP1968633B1 (en) 2014-02-12
ZA200806723B (en) 2009-09-30
US9522956B2 (en) 2016-12-20
AU2006332212B2 (en) 2013-03-28
EA200870141A1 (ru) 2009-02-27
US20150132308A1 (en) 2015-05-14
BRPI0620888A2 (pt) 2011-11-29
EP1968633B2 (en) 2017-11-01
KR20080110987A (ko) 2008-12-22
US20090214541A1 (en) 2009-08-27
WO2007076923A1 (en) 2007-07-12
AR059127A1 (es) 2008-03-12
CN101365486A (zh) 2009-02-11
MX2008008564A (es) 2009-01-29
AU2006332212A1 (en) 2007-07-12
AU2006332212B8 (en) 2013-05-30
EA015173B1 (ru) 2011-06-30
JP2009522316A (ja) 2009-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101365486B (zh) 使用抗egfr和抗her2抗体的联合治疗
KR101088661B1 (ko) Ｅｒｂ－ｂ１ 수용체를 표적으로 하는 약학적 조성물
CA2436326C (en) Combination therapy using receptor tyrosine kinase inhibitors and angiogenesis inhibitors
CN102884084B (zh) 抗her2抗体及组合物
JP2014510047A (ja) 前立腺癌治療のための抗アルファ−ｖインテグリン抗体
Krzemieniecki et al. Targeting of solid tumors and blood malignancies by antibody-based therapies—EGFR-pathway as an example
EP2236139A1 (en) Combination therapy of erlotinib with an anti-IGF-1R antibody, which does not inhibit binding of insulin to the insulin receptor
ZA200503706B (en) Pharmaceutical compositions directed to Erb-B1 receptors

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Free format text: FORMER OWNER: UNIVERSIT MONTPELLIER 1 NATIONAL HEALTH AND MEDICAL TREATMENT INSTITUTE REGIONAL ANTICANCER CENTER

Effective date: 20130506

Owner name: NATIONAL HEALTH AND MEDICAL TREATMENT INSTITUTE

Free format text: FORMER OWNER: MERCK PATENT GMBH

Effective date: 20130506

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20130506

Address after: France

Patentee after: National Health and Medical Treatment Institute

Address before: Darmstadt

Patentee before: Merck Patent GmbH

Patentee before: Universite Montpellier 1

Patentee before: National Health and Medical Treatment Institute

Patentee before: Regional Anticancer Center

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20121031

Termination date: 20151215

EXPY Termination of patent right or utility model