CN112661846A - 一种靶向tshr的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体、其构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种靶向TSHR的复制缺陷性重组慢病毒CAR‑T转基因载体，其构建方法和其在制备治疗分化型甲状腺癌药物中的应用。实现了TSHR成为甲状腺癌CAR‑T治疗的“肿瘤特异性抗原”，有效规避脱靶效应。

Description

一种靶向TSHR的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体、其 构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及转基因载体领域，具体的，本发明涉及一种靶向TSHR的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体，其构建方法和其在制备治疗分化型甲状腺癌药物中的应用。

背景技术

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，近30余年，全世界甲状腺癌发病率逐年上升，目前已成为我国女性第四位高发恶性肿瘤，并呈现快速增长趋势。其中，乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)，滤泡状癌(Follicular thyroid carcinoma,FTC)以及Hurthle细胞瘤(Hurthle cell thyroid carcinoma)均起源于甲状腺滤泡上皮细胞，它们被归为分化型甲状腺癌(Differentiated thyroid cancer,DTC)一类，约占甲状腺癌的95％。由于DTC具有不同于其他恶性肿瘤的生物学特征，大多数DTC病人，经过规范的治疗，包括根治性手术、放射性碘(I¹³¹)照射和口服甲状腺激素替代物，均可获得长期生存。其中，甲状腺癌术后TSH(Thyroid stimulating hormone)抑制治疗发挥着重要作用。然而已有文献报道，约10％-23％的DTC病人于初诊时出现远处转移，其中约1/3的病人在自然状态下或治疗过程中逐渐出现肿瘤的失分化，丧失摄碘能力。另有10％-15％的病人术后10年内仍然会出现复发，一旦复发，2/3的病人常伴有碘抵抗现象和多器官远处转移。复发或晚期甲状腺癌，对放射性碘治疗以及传统的化疗和放疗均不敏感，治疗效果较差；病人预期生存时间大幅缩短，平均生存期为3-5年，10年生存率仅10％。同时，肿瘤局部侵犯引发的气管食管瘘、呼吸道感染以及以骨骼、肺脏等器官为代表的多病灶远处转移，极大地降低病人的生存质量。尽管一些小分子抑制剂，如靶向BRAF^V600E突变的药物索拉菲尼和靶向VEGF/PI3K/Akt信号通路的药物阿西替尼，均已进入III期临床试验，并展示出一定的临床缓解率，但长期口服小分子抑制剂产生的严重副作用及肿瘤耐药性，极大地限制了其临床应用价值。一旦病人出现肿瘤进展和远处转移，临床医生往往束手无策，病人将面临“无药可用”的局面。因此，开发更具特异性和长效性的靶向治疗手段，减少早期肿瘤术后复发，控制晚期肿瘤进展，是分化型甲状腺癌的研究热点和难点，也具有重要的临床意义和社会效益。

近年来，嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)修饰T细胞作为过继性免疫治疗(Adoptive cell transfer therapy,ACT)的代表，在肿瘤治疗中取得了很大的进展。该技术的原理是将能识别肿瘤相关抗原(Tumor associate antigen，TAA)的单链抗体(Single chain antibody fragment，ScFv)和能促进T细胞活化的信号激活域融合，并重组表达于自体T细胞的表面，ScFv与相应的肿瘤抗原结合后能使T细胞活化，进而发挥抗肿瘤效应。不同于生理性的TCR，重组CAR蛋白与抗原的结合无需依赖于MHC的递呈，有效避免了肿瘤细胞表面MHC分子普遍下调这一免疫逃逸机制。虽然CAR-T细胞治疗在多种实体肿瘤中取得了进展和一定的疗效，如脑胶质瘤、乳腺癌、肝癌等。但在甲状腺癌领域，CAR-T细胞治疗鲜有报道。Min.等人，通过设计一种靶向细胞间黏附分子1(ICAM-1)的CAR-T细胞，治疗未分化型甲状腺癌(Anaplastic thyroid carcinoma，ATC)，并在体外和体内实验中展示出较好的抗肿瘤效应，这也成为目前为止唯一的一项甲状腺癌CAR-T治疗的研究。然而，已有文献报道，甲状腺癌病人外周血中可溶性ICAM-1蛋白的表达量较正常人明显升高，这可能会使靶向ICAM-1的CAR-T细胞进入肿瘤实质前，被中和一部分CAR分子，导致治疗效果降低。同时，ICAM-1作为一种淋巴细胞归巢因子，参与炎症反应中白细胞的渗出，在人体肺脏、淋巴器官以及肾脏都有表达。虽然Min.等人证实了其表达量低于甲状腺癌细胞，然而考虑到晚期甲状腺癌常出现多发肺转移灶，必然引起肺组织局部炎症反应加重，导致肺泡和支气管内皮细胞ICAM-1的表达量上调，从而放大CAR-T细胞的脱靶效应，引发肺组织的损伤。目前，关于分化型甲状腺癌的CAR-T治疗，国内外研究尚属空白。开发针对分化型甲状腺癌，尤其是晚期分化型甲状腺癌的CAR-T治疗方案，将拥有广泛的应用前景和临床价值。

将CAR-T技术应用于甲状腺癌相较于其他实体瘤具有明显优势。既往其他实体瘤CAR-T治疗研究过程中，在靶点筛选上会尽力规避组织特异性抗原，以免CAR-T细胞误伤正常组织，导致器官功能衰竭。目前，分化型甲状腺癌的临床主要治疗策略是：将肿瘤连同正常甲状腺组织全部手术清除，其后再通过口服甲状腺激素行替代治疗和TSH抑制治疗，即通过药物代替甲状腺原有的内分泌功能并抑制肿瘤细胞生长。基于这种治疗模式，在针对甲状腺癌的CAR-T靶点选择上，则可以选择同时表达于甲状腺正常细胞和癌细胞表面的组织特异性靶点，在杀伤肿瘤细胞的同时而不必担心误伤正常组织。同时，由于手术已经切除了绝大部分正常甲状腺腺体和肿瘤组织，后续进行CAR-T治疗过程中也避免了正常甲状腺组织被破坏而导致的甲状腺危象等不良反应。

本发明锁定了促甲状腺激素受体(Thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)作为分化型甲状腺癌CAR-T治疗的理想靶标。TSHR被认为是甲状腺特异性蛋白，表达于甲状腺滤泡细胞的基底外侧膜上，属于七次跨膜的G蛋白偶联受体，其基因定位于14q13，生理情况下TSHR与其配体TSH结合，可刺激甲状腺细胞生长、分化及甲状腺激素合成。既往文献表明，TSHR在甲状腺和甲状腺癌组织中均呈阳性表达，且表达强度无统计学差异。我们通过靶向TSHR的CAR-T细胞特异性地杀伤甲状腺癌，达到治疗目的。

发明内容

1.本发明提供了一种靶向TSHR的ScFv序列及CAR质粒序列；

2.本发明提供了一种靶向TSHR的CAR慢病毒质粒的构建方法、质粒制备、慢病毒包装的流程；

3.本发明提供了一种靶向TSHR的CAR-T细胞治疗分化型甲状腺癌的治疗方案。与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.目前分化型甲状腺癌治疗领域尚无CAR-T治疗方案，本发明弥补了该领域的空白；

2.CAR-T治疗尤其是实体瘤的CAR-T治疗，最主要的难点在于难以找到肿瘤特异性抗原(TSA)，绝大多数实体瘤选择肿瘤相关抗原(TAA)作为治疗靶点。而随之产生的脱靶效应，即所谓的“on-target/off-tumor”，是治疗失败的根本原因。而在研究甲状腺癌CAR-T的治疗中，我们选择促甲状腺激素受体(TSHR)，这一甲状腺特异性(仅在甲状腺和甲状腺癌细胞膜表面表达)蛋白，作为CAR-T攻击的靶点。巧妙利用了甲状腺可以被完全摘除，通过药物人工替代甲状腺功能的特点，实现了TSHR成为甲状腺癌CAR-T治疗的“肿瘤特异性抗原”，有效规避脱靶效应。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1：anti-TSHR CAR结构示意图；

图2：表达质粒结构图；

图3：CAR-T细胞慢病毒侵染效率检测结果(流式)；

图4：针对分化型甲状腺癌细胞系K1-TSHR-Luc的体外杀伤实验结果(Luciferase生物素发光法)；

图5：针对分化型甲状腺癌细胞系K1-TSHR-Luc的体内杀伤实验结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：TSHR特异性嵌合抗原受体修饰的人T淋巴细胞(anti-TSHR CAR-T细胞) 的制备

anti-TSHR CAR-T细胞是通过编码anti-TSHR-CAR的慢病毒载体感染人原代T淋巴细胞而获得，具体步骤如下：

1.CAR基因片段的制备

1.1.本发明按照以下编码结构的顺序设计融合基因片段：CD8信号肽(SP)，anti-TSHR重链可变区(VH)，连接片段(Linker)，anti-TSHR轻链可变区(VL)，亲合素标签(Strep-Tag II)，CD8铰链区(hinge)，CD28跨膜区(CD28TM)，CD28胞内结构域(CD28-ICD)，41-BB胞内结构域，CD3ζ胞内结构域，通过全基因合成技术直接合成该基因结构；

上述基因的核苷酸或氨基酸序列如下表所示：

1.2.将合成的基因片段构建到PLVX-EF1α-IRES-puro慢病毒载体(由武科大实验室赠送)中，构成重组质粒。其中本发明涉及三种重链和轻链可变区的组合，最终构建出三种重组质粒，分别命名为PLVX-TSHR-V1、PLVX-TSHR-V2、PLVX-TSHR-V3，所述PLVX-TSHR-V1、PLVX-TSHR-V2、PLVX-TSHR-V3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.:1、3、5所示，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:2、4、6所示。Anti-TSHR CAR分子结构图如图1所示，表达质粒结构图如图2所示。

2.Anti-TSHR-CAR慢病毒包装

2.1.取两个均装有16mlDMEM培养液的离心管，向其中一管加入960μgPEI，另一管加入320μg预混的PLVX-TSHR-V1表达质粒和包装质粒(psPAX2和pMD2.G，比例为CAR：psPAX2：pMD2.G＝4:3:1)，漩涡震荡,室温平衡10分钟；

2.2.取一个10ml的移液管将混有PEI的培养基吹起来，将混有质粒的培养基一滴一滴地加入PEI中，室温温育30分钟；

2.3.取16个T175瓶的293T包装细胞，将和PEI混合的质粒加入其中。37℃，5％CO₂培养箱培养3天，收获上清。收集的上清2000g，30min离心去除293T细胞碎片，获得慢病毒液上清；

2.4.将慢病毒液上清用0.22μm滤膜过滤后，分装到250ml的离心瓶中，于4℃，30000g离心2.5小时，离心后将离心瓶小心转移至生物安全柜，用真空泵去上清，留沉淀，加入1640培养基500μl/离心瓶，用移液器将沉淀吹散混匀，即得到含anti-TSHR-V1 CAR分子的慢病毒液，立即使用或分装后于-80℃保存。

2.5.按照2.1-2.4的相同步骤制备获得含anti-TSHR-V2CAR分子和含anti-TSHR-V3 CAR分子的慢病毒液。

3.慢病毒滴度检测

3.1.取生长状态良好的293T细胞，用无菌PBS清洗细胞一次，0.05％胰蛋白酶37℃消化细胞(T75瓶加入胰酶2ml/瓶，T25瓶加入胰酶1ml/瓶)；

3.2.待细胞变圆变亮且部分细胞脱落后，加等体积DMEM完全培养基，终止消化；

3.3.吹打混匀，计数，铺24孔板，使每个孔的细胞量为1×10⁵个；

3.4.每孔加入polybrene，使终浓度保持为6μg/ml，每组分别加入上述三种慢病毒液各1μl、0.5μl、0.1μl，即每种慢病毒液各自分为A、B、C三组，并设1个阴性对照组，每个批次病毒设4个技术重复；

3.5.前后或者左右方向晃动孔板，使细胞在孔板里分布均匀，防止中心聚集，放入37℃，5％CO₂培养箱；

3.6.三天后，收集细胞，送流式细胞检测。预热无血清DMEM培养基，Versene和无菌PBS，弃去细胞培养基，先加无菌PBS清洗细胞，抽弃PBS，6孔板内加Versene 0.2ml/孔，37℃消化，待细胞变圆变亮后，6孔板加无血清DMEM培养基0.3ml/孔，吹打混匀，使细胞分散成单个细胞，取无菌1.5ml EP管，收集细胞，做好标记，进行流式细胞检测，检测分析结果见表1；

表1：Anti-TSHR CAR病毒活性滴度检测分析结果

4.人外周血单个核细胞(PBMC)的分离

4.1.将临床采集的人外周血样品移至一个15ml无菌离心管内，旋紧盖子，调整离心机离心力至800g、离心降速设为最低，将血样室温离心20分钟。依据EasySepTM Human T-Cell Isolation Kit的操作说明，纯化得到CD3+T细胞；

4.2.离心结束后取出离心管，将上层浅黄色血清层移至一个新的无菌离心管中(56摄氏度热灭活1小时后，将血清转移至-80摄氏度冰箱备用)；然后向下层的红色外周血细胞层加入等体积的生理盐水，旋紧离心管盖，轻轻上下颠倒混匀；

4.3.向15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，然后小心将上述步骤4.2.中用生理盐水稀释后的血样沿管壁缓慢添加至淋巴细胞分离试剂的上层，避免分离试剂与血样的混合。将离心机的离心力设置为800g，转速下降速度设为最低，温度设为18摄氏度，离心20分钟；

4.4.离心结束后，取出离心管，将处于中间的白色单核细胞层吸入一个新的无菌离心管中，加入等体积的生理盐水后，800g离心5分钟，离心结束后，将上层液体全部吸出，然后加入5ml生理盐水，轻轻混匀后，取部分细胞悬液进行计数，并计算细胞总数，800g离心5分钟，得到PBMC。

5.CD3+ T淋巴细胞分选与激活

5.1.制备分选缓冲液:无菌PBS，加入0.5％BSA,2mM EDTA和0.1％叠氮化钠；

5.2.将步骤4.4.中制备的PBMC重悬于分选缓冲液中，保持细胞密度为1×10⁷细胞/ml；

5.3.按5μl/1×10⁶细胞的比例加入Biotinylated Human T LymphocyteEnrichment Cocktail(购自BD Biosciences公司)，室温孵育15分钟；

5.4.孵育完成后，加入10倍体积的分选缓冲液，于室温300g离心7分钟，小心弃掉上清液；

5.5.按5μl/1×10⁶细胞的比例加入BD-IMag^TMStreptavidin Particles Plus-DM(购自BD Biosciences公司)，充分混匀后，室温避光孵育30分钟；

5.6.将孵育完成后的PBMC细胞，加入一定体积的分选缓冲液，使PBMC细胞终浓度保持在2-8×10⁷细胞/ml，而后将PBMC细胞移入无菌圆底塑料流式细胞管中(规格为12×75mm)；

5.7.将流式管置于PBMC细胞分选磁场中6-8分钟，可见棕色标PBMC记细胞贴于磁场一侧管壁，而后将管内液体移入新的流式管内；

5.8.加入750μl分选缓冲液重悬棕色细胞成分，并置入磁场内6-8分钟，待棕色细胞成分再次完全贴于磁场一侧，将管内液体移入新的流式管；

5.9.重复步骤5.8.1-2次；

5.10.将收集液体的流式管置于磁场内5分钟，然后将管内液体移入15ml无菌试管中，用分选缓冲液补齐至10ml，计数，于18℃，500g离心6min，得PBMC细胞沉淀，即可用于培养；

5.11.用配置好的T细胞专用培养基(TexMACS+5％FBS+200IU/ml IL-2+2mM谷氨酰胺)重悬细胞沉淀后转移至培养瓶或培养板内(接种密度控制在1.0-2.0×10⁶细胞/ml)进行培养，同时加入TCell TansAct(10μl/1×10⁶细胞)(购自Miltenyi Biotec公司)激活T细胞；

6.anti-TSHR CAR-T细胞的制备

6.1.计数取激活48小时的T细胞约5×10⁶个/份T细胞两份于15ml管，分别标记为对照组和CAR-T组，均在22℃300g离心5分钟，抽弃上清。用500μl配好的T培养基重悬T细胞(确保终细胞密度约为10⁷个/ml)转移至24孔板中；

6.2.将构建好并浓缩后的三种慢病毒各自按照MOI＝2-8加入到CAR-T组中，对照组加入等体积的T细胞培养基。向以上组各加入终浓度4μg/ml的Polybrene。置于37℃，5％CO₂培养箱中转染4-6小时；

6.3. 4-6小时后，将上述各组T细胞各自取至6孔板中，补加T细胞培养基至1×10⁶细胞密度，置于37℃，5％CO₂培养箱中过夜；

6.4.每天观察T细胞状态，计数，按照1×10⁶个/ml补充T细胞培养基，调整T细胞密度。于病毒感染后第4天通过流式细胞术测定各组CAT-T细胞的阳性比例，CAR阳性率见附图3。

实施例2靶向TSHR的CAR-T细胞肿瘤细胞杀伤实验

1.通过慢病毒过表达的方法，构建稳定表达TSHR和Luciferase报告基因的甲状腺癌细胞系(K1-TSHR-Luc)；

2. 96孔板中铺1×10⁴cells/well的K1-TSHR-Luc；

3.按不同的比例(T细胞：肿瘤细胞(E:T)，0.5:1、1:1、2:1、5:1、10:1)，分别加入MOCK-T、anti-TSHR-CART和TSHR-CD3ζ-Truncated-CART细胞，具体分组如表2所示。96孔板于水平低速离心机，400g离心5分钟，然后置于37℃，5％CO₂培养箱孵育24小时；

表2.Luc杀伤实验分组情况

T细胞分组	效靶比(E:T)
		MOCK-T	0.5:1
anti-TSHR-V1	1:1
		anti-TSHR-V2	2:1
anti-TSHR-V3	5:1
		TSHR-CD3ζTruncated-CART

4.孵育24小时后，取出培养板，每孔加入100ul D-luciferin底物，孵育2分钟，通过多功能酶标仪，计算生物素发光强度，换算杀伤效率。各组杀伤效率如附图4所示。

实施例3动物模型实验

1. 6周龄NSG(NOD/scid Rag2-/-IL2rg-/-)实验鼠10只，随机分成2组，每组5只；用K1-TSHR-Luc细胞系构建小鼠甲状腺癌皮下移植瘤模型；

2.每天观察一次小鼠，记录小鼠生命体征(体重、毛发、精神状态等)；待肿瘤直径达到5mm时(约7天)，分别对上述两组接种了不同肿瘤细胞的小鼠进行CAR-T细胞或Mock-T细胞尾静脉注射治疗；

3.CAR-T细胞注射后，通过小动物成像评估CAR-T细胞体内抗肿瘤效果。每周进行一次成像，以150mg/kg的剂量腹腔注射D-Lucifer荧光素酶底物，以75mg/kg的剂量腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠，等12分钟后使用IVIS小动物成像系统收集信号。小鼠体内实验结果如图5所示，肿瘤建模成功后，注射anti-TSHR-V1 CAR-T组小鼠皮下肿瘤随着时间的延长，明显缩小；而Mock-T组小鼠的皮下肿瘤随时间延长明显增大，说明本发明设计的anti-TSHRCAR-T细胞在模式动物模型中同样对肿瘤细胞具有杀伤效应。经验证anti-TSHR-V2和anti-TSHR-V3 CAR-T细胞具有相似的技术效果。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 武汉波睿达生物科技有限公司

<120> 一种靶向TSHR的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体、其构建方法及其应用

<130> CP20623V

<141> 2020-12-25

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1656

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

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gatcccgaga tgggcggcaa gcccaggcgg aagaaccccc aggaggggct gtacaacgag 1500

ctgcagaagg ataagatggc tgaggcctac tccgagattg gaatgaaggg ggagaggcga 1560

agggggaagg gccacgatgg gctgtaccag ggcctgagca ccgccactaa ggacacatat 1620

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<210> 2

<211> 551

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Val Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

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Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Arg Gly

35 40 45

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50 55 60

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Ser Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Glu Pro Gly Tyr Ser

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atctcctgca aaggctccgg ctatagcttc accaattact ggatcggctg ggttcgccag 180

atgccgggta agggtctgga atggatgggt atcatttacc cgtatgacag cgacacgcgc 240

tatagcccgt ccttcgaagg ccaggtaacc atctctgcgg ataagtccat ccgcaccgca 300

tacctgcact ggtctagcct gaaagcctcc gatactgcga tgtactactg tgttcgcccg 360

cgtgatggta gctacccgta cgacgctttc gatatctggg gtcagggcac tatggttacc 420

gtttcttccg gggggggggg ctctggaggg ggcgggagcg gcggcggagg ctccgagatc 480

gtcctgactc aatctccggg tactctgtct ctgtctccag gtgaacgtgc cactctgtcc 540

tgtcgcgctt ctcagtccgt ctccaataac tacctggcat ggtatcagca gaaaccgggt 600

caagcgccgc gtctgctgat ttacggcgct tcttctcgcg cgaccggtat cccagaccgt 660

ttcagcggct ctggttccgg taccgacttc actctgacta ttagccgtct ggagccagaa 720

gacttcgcag tttactactg ccagcactgt ggtagctccc tgcgtgcctt cggtcaaggt 780

actaaagtcg aaatcaaacg ctggtctcac ccacagttcg agaagggtgg tggaggcagt 840

acaacaacac cagcccctag gcctcctaca ccagctccaa caatcgctag ccagccactg 900

agcctgaggc ccgaggcctg ccggcccgcc gccggcgggg ccgtgcacac caggggcctg 960

gattttgcct gcgatttctg ggtcctggtg gtggtggggg gggtgctcgc ctgttactca 1020

cttctcgtga ccgtggcctt catcatcttc tgggtgcgga gcaagcggag caggctgctg 1080

cacagcgatt acatgaacat gacccccagg cggcccggcc caacaaggaa gcactaccag 1140

ccctacgccc cccccaggga cttcgccgcc taccggtcca agagggggag gaagaagctg 1200

ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgagg cccgtgcaga ccacccagga ggaggacggg 1260

tgctcctgca ggtttcccga ggaggaggag ggcgggtgcg agctgcgggt gaagttctcc 1320

cggagcgccg atgcccctgc ctaccagcag ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac 1380

ctgggccggc gggaggagta cgacgtgctg gataagagga ggggcaggga tcccgagatg 1440

ggcggcaagc ccaggcggaa gaacccccag gaggggctgt acaacgagct gcagaaggat 1500

aagatggctg aggcctactc cgagattgga atgaaggggg agaggcgaag ggggaagggc 1560

cacgatgggc tgtaccaggg cctgagcacc gccactaagg acacatatga cgccctgcac 1620

atgcaggccc tgccccctag ataa 1644

<210> 4

<211> 547

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr

35 40 45

Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Tyr Asp Ser Asp Thr Arg

65 70 75 80

Tyr Ser Pro Ser Phe Glu Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser

85 90 95

Ile Arg Thr Ala Tyr Leu His Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr

100 105 110

Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Pro Arg Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp

115 120 125

Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile

145 150 155 160

Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg

165 170 175

Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn Tyr Leu

180 185 190

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu

225 230 235 240

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Cys Gly Ser Ser Leu Arg Ala

245 250 255

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Trp Ser His Pro Gln

260 265 270

Phe Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

275 280 285

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

290 295 300

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

305 310 315 320

Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

325 330 335

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

340 345 350

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

355 360 365

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

370 375 380

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

385 390 395 400

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

405 410 415

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

420 425 430

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

435 440 445

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

450 455 460

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

465 470 475 480

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

485 490 495

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

500 505 510

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

515 520 525

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

530 535 540

Pro Pro Arg

545

<210> 5

<211> 1641

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgcaggtac agctggttca atctggcgcc gaagtgaaaa aaccgggtca gtccctgaag 120

atctcttgca aggcctccgg ttactccctg actgataact ggatcggctg ggtacgccag 180

aaaccgggca aaggcctgga atggatgggc attatctacc cgggtgatag cgatacccgc 240

tactccccgt cctttcaagg tcaggtcact attagcgcag ataaatctat caacaccgct 300

tatctgcagt ggtcctctct gaaagctagc gataccgcta tctactactg cgttggtctg 360

gattggaatt ataaccctct gcgttattgg ggtccgggca ccctggtaac ggtttcttct 420

gggggggggg gctctggagg gggcgggagc ggcggcggag gctcccaatc tgttctgact 480

caaccgcctt ctgtaagcgc tgctccaggt cagaaggtta ccatctcctg ctctggctcc 540

agctctgaca tcggctctaa ctacgtgtcc tggtaccagc aattcccggg tactgccccg 600

aagctgctga tctacgataa taacaaacgt ccgagcgcaa tcccggaccg tttttccggt 660

agcaaaagcg gtacctctgc taccctgggc attactggcc tgcagaccgg cgacgaagca 720

gattactatt gtggtacttg ggattcccgt ctgggtattg ctgtattcgg tggtggtacc 780

caactgaccg ttctgggttg gtctcaccca cagttcgaga agggtggtgg aggcagtaca 840

acaacaccag cccctaggcc tcctacacca gctccaacaa tcgctagcca gccactgagc 900

ctgaggcccg aggcctgccg gcccgccgcc ggcggggccg tgcacaccag gggcctggat 960

tttgcctgcg atttctgggt cctggtggtg gtgggggggg tgctcgcctg ttactcactt 1020

ctcgtgaccg tggccttcat catcttctgg gtgcggagca agcggagcag gctgctgcac 1080

agcgattaca tgaacatgac ccccaggcgg cccggcccaa caaggaagca ctaccagccc 1140

tacgcccccc ccagggactt cgccgcctac cggtccaaga gggggaggaa gaagctgctg 1200

tacatcttca agcagccctt catgaggccc gtgcagacca cccaggagga ggacgggtgc 1260

tcctgcaggt ttcccgagga ggaggagggc gggtgcgagc tgcgggtgaa gttctcccgg 1320

agcgccgatg cccctgccta ccagcagggc cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg 1380

ggccggcggg aggagtacga cgtgctggat aagaggaggg gcagggatcc cgagatgggc 1440

ggcaagccca ggcggaagaa cccccaggag gggctgtaca acgagctgca gaaggataag 1500

atggctgagg cctactccga gattggaatg aagggggaga ggcgaagggg gaagggccac 1560

gatgggctgt accagggcct gagcaccgcc actaaggaca catatgacgc cctgcacatg 1620

caggccctgc cccctagata a 1641

<210> 6

<211> 546

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 6

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Gln Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ser Leu Thr Asp Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg

65 70 75 80

Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser

85 90 95

Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr

100 105 110

Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Gly Leu Asp Trp Asn Tyr Asn Pro Leu Arg

115 120 125

Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr

145 150 155 160

Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser

165 170 175

Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser Trp Tyr

180 185 190

Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn

195 200 205

Lys Arg Pro Ser Ala Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

210 215 220

Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu Gly Ile Ala Val Phe

245 250 255

Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Trp Ser His Pro Gln Phe

260 265 270

Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

275 280 285

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

290 295 300

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

305 310 315 320

Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala

325 330 335

Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

340 345 350

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

355 360 365

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

370 375 380

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

385 390 395 400

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

405 410 415

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

420 425 430

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

435 440 445

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

450 455 460

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

465 470 475 480

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

485 490 495

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

500 505 510

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

515 520 525

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

530 535 540

Pro Arg

545

<210> 7

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 8

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

gggggggggg gctctggagg gggcgggagc ggcggcggag gctcc 45

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

tggtctcacc cacagttcga gaag 24

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 12

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 13

<211> 135

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

acaacaacac cagcccctag gcctcctaca ccagctccaa caatcgctag ccagccactg 60

agcctgaggc ccgaggcctg ccggcccgcc gccggcgggg ccgtgcacac caggggcctg 120

gattttgcct gcgat 135

<210> 14

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 14

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 15

<211> 204

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

ttctgggtcc tggtggtggt ggggggggtg ctcgcctgtt actcacttct cgtgaccgtg 60

gccttcatca tcttctgggt gcggagcaag cggagcaggc tgctgcacag cgattacatg 120

aacatgaccc ccaggcggcc cggcccaaca aggaagcact accagcccta cgcccccccc 180

agggacttcg ccgcctaccg gtcc 204

<210> 16

<211> 68

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 16

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser

65

<210> 17

<211> 123

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

aagaggggga ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtgcag 60

accacccagg aggaggacgg gtgctcctgc aggtttcccg aggaggagga gggcgggtgc 120

gag 123

<210> 18

<211> 41

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 18

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

35 40

<210> 19

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

ctgcgggtga agttctcccg gagcgccgat gcccctgcct accagcaggg ccagaaccag 60

ctgtacaacg agctgaacct gggccggcgg gaggagtacg acgtgctgga taagaggagg 120

ggcagggatc ccgagatggg cggcaagccc aggcggaaga acccccagga ggggctgtac 180

aacgagctgc agaaggataa gatggctgag gcctactccg agattggaat gaagggggag 240

aggcgaaggg ggaagggcca cgatgggctg taccagggcc tgagcaccgc cactaaggac 300

acatatgacg ccctgcacat gcaggccctg ccccctaga 339

<210> 20

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 20

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

1 5 10 15

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

20 25 30

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

35 40 45

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 21

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

caggtgcagc tggtgcagag cggagctgag gtgaagaagc ctggagagag cctgaagatt 60

agctgtagag gaagcggata caggtttaca tcttactgga ttaactgggt gagacagctg 120

ccaggaaagg gactggagtg gatgggccgg atcgacccca cagatagcta cacaaactac 180

agcccctcct tcaaggggca cgtgacagtg agcgccgata agagcatcaa cacagcctac 240

ctgtggcaga gcagcctgaa ggccagcgat accgggatgt actactgcgc ccggctggag 300

cccggctaca gcagcacatg gagcgtgaac tggggccagg ggaccctggt gacagtgagc 360

agc 363

<210> 22

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Arg Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Lys Gly His Val Thr Val Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Trp Gln Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Glu Pro Gly Tyr Ser Ser Thr Trp Ser Val Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 333

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

ctgacagtgc tgacacagcc ccccagcgtg agcggggccc ccaggcagcg ggtgacaatc 60

agctgcagcg ggaacagcag caacatcggg aacaacgccg tgaactggta ccagcagctg 120

cccggcaagg cccccaagct gctgatctac tacgatgacc agctgcccag cggggtgagc 180

gataggttca gcgggagccg gagcggcacc agcgccagcc tggccatccg gggcctgcag 240

agcgaggatg aggccgacta ctactgcacc agctgggacg atagccttga tagccagttg 300

tttgggggag gaacaagact gacagtgctg gga 333

<210> 24

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 24

Leu Thr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Arg Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Arg Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asp Ser Gln Leu Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 25

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

gaagttcagc tggtggaaag cggcgctgaa gttaaaaaac cgggtgaatc tctgaaaatc 60

tcctgcaaag gctccggcta tagcttcacc aattactgga tcggctgggt tcgccagatg 120

ccgggtaagg gtctggaatg gatgggtatc atttacccgt atgacagcga cacgcgctat 180

agcccgtcct tcgaaggcca ggtaaccatc tctgcggata agtccatccg caccgcatac 240

ctgcactggt ctagcctgaa agcctccgat actgcgatgt actactgtgt tcgcccgcgt 300

gatggtagct acccgtacga cgctttcgat atctggggtc agggcactat ggttaccgtt 360

tcttcc 366

<210> 26

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Tyr Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Glu Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Pro Arg Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 327

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

gagatcgtcc tgactcaatc tccgggtact ctgtctctgt ctccaggtga acgtgccact 60

ctgtcctgtc gcgcttctca gtccgtctcc aataactacc tggcatggta tcagcagaaa 120

ccgggtcaag cgccgcgtct gctgatttac ggcgcttctt ctcgcgcgac cggtatccca 180

gaccgtttca gcggctctgg ttccggtacc gacttcactc tgactattag ccgtctggag 240

ccagaagact tcgcagttta ctactgccag cactgtggta gctccctgcg tgccttcggt 300

caaggtacta aagtcgaaat caaacgc 327

<210> 28

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 28

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Cys Gly Ser Ser Leu

85 90 95

Arg Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 29

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

caggtacagc tggttcaatc tggcgccgaa gtgaaaaaac cgggtcagtc cctgaagatc 60

tcttgcaagg cctccggtta ctccctgact gataactgga tcggctgggt acgccagaaa 120

ccgggcaaag gcctggaatg gatgggcatt atctacccgg gtgatagcga tacccgctac 180

tccccgtcct ttcaaggtca ggtcactatt agcgcagata aatctatcaa caccgcttat 240

ctgcagtggt cctctctgaa agctagcgat accgctatct actactgcgt tggtctggat 300

tggaattata accctctgcg ttattggggt ccgggcaccc tggtaacggt ttcttct 357

<210> 30

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Asp Asn

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Gly Leu Asp Trp Asn Tyr Asn Pro Leu Arg Tyr Trp Gly Pro Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 333

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 31

caatctgttc tgactcaacc gccttctgta agcgctgctc caggtcagaa ggttaccatc 60

tcctgctctg gctccagctc tgacatcggc tctaactacg tgtcctggta ccagcaattc 120

ccgggtactg ccccgaagct gctgatctac gataataaca aacgtccgag cgcaatcccg 180

gaccgttttt ccggtagcaa aagcggtacc tctgctaccc tgggcattac tggcctgcag 240

accggcgacg aagcagatta ctattgtggt acttgggatt cccgtctggg tattgctgta 300

ttcggtggtg gtacccaact gaccgttctg ggt 333

<210> 32

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 32

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Ala Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu

85 90 95

Gly Ile Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Claims (8)

1.一种靶向促甲状腺激素受体(TSHR)的ScFv序列，其特征在于，所述ScFv序列选自下述重链可变区和轻链可变区的组合：

(1)重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.:21，轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.:23；或

(2)重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.:25，轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.:27；或

(3)重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.:29，轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.:31。

2.如权利要求1所述的靶向促甲状腺激素受体的ScFv序列，其特征在于，所述ScFv序列选自下述重链可变区和轻链可变区的组合：

(1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:22，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:24；或

(2)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:26，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:28；或

(3)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:30，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:32。

3.一种靶向TSHR的重组慢病毒载体质粒，其特征在于，所述质粒含有如权利要求1或2所述的ScFv序列。

4.如权利要求3所述的重组慢病毒载体质粒，其特征在于，所述质粒的氨基酸序列选自SEQ ID NO.:2、4或6。

5.一种靶向TSHR的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞含有如权利要求4所述的重组慢病毒载体质粒。

6.一种靶向TSHR的CAR慢病毒质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)按照以下顺序设计融合基因片段：CD8信号肽(SP)，anti-TSHR重链可变区(VH)，连接片段(Linker)，anti-TSHR轻链可变区(VL)，亲合素标签(Strep-Tag II)，CD8铰链区(hinge)，CD28跨膜区(CD28TM)，CD28胞内结构域(CD28-ICD)，41-BB胞内结构域，CD3ζ胞内结构域，通过全基因合成技术直接合成该基因；

(2)将步骤(1)合成的基因构建到PLVX-EF1α-IRES-puro慢病毒载体中，构成重组CAR慢病毒质粒；

其中，所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列选自如下的组合：重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:22，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:24；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:26，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:28；或重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:30，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.:32。

7.一种如权利要求1或2所述的ScFv序列或如权利要求3或4所述的重组慢病毒载体质粒或如权利要求5所述的靶向TSHR的CAR-T细胞在用于制备治疗甲状腺癌的药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述甲状腺癌为分化型甲状腺癌。

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