CN105821064B - 一种t细胞抗原受体基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种T细胞抗原受体基因，用于制备嵌合抗原受体T细胞，使得后者展现出特定的食管癌相关功能活性，针对食管癌的治疗具有重要的潜在和实际价值，为食管癌的治疗提供一个新的技术方向。

Description

一种T细胞抗原受体基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种基因工程技术领域，尤其是一种食管癌相关T细胞抗原受体基因及其应用。
背景技术
癌症一直是困扰人类的巨大难题。我国每年新发肿瘤病例约为312万例，平均每天8550人意味着每分钟就有6人就诊断为恶性肿瘤，这些数据都表明，癌症依然是威胁健康的一大杀手。多年来，癌症治疗的方法主要是手术、化疗和放疗，对肿瘤患者的临床治疗有效率仍旧很低，据统计，同一种抗肿瘤药物的有效率仅为25％。针对同一种肿瘤，用同样的药、标准剂量的治疗方法，在不同病人身上所起的疗效及毒副作用却有很大的差异。造成这种结果的主要原因在于，肿瘤是一种多病因、异质性的疾病。过去十年来，依赖于患者个体生物标志物的肿瘤个性化治疗正在逐渐取代依据传统经验的治疗模式，并展现出优越的疗效和广阔的前景。
免疫疗法是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法，被称为治疗癌症的“第五大疗法”。它是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗癌症；癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫结合点阻断治疗等。虽然有关免疫治疗的研究早在30年前就已开展，最近两年《细胞》、《科学》、《自然》等国际顶级期刊刊出多项该领域的突破研究成果，制药巨头也不断推出此类型的重磅疗法。2014年12月6号-9号在旧金山举行的美国血液学会年会(ASH)上，癌症免疫疗法可谓是赚足了眼球，其中的CAR-T疗法更是备受关注。
CART的概念是以色列ZeligEshhar博士上世纪80年代提出的，1989首次开发出嵌合抗原受体T细胞。CART疗法即嵌合抗原受体T细胞疗法，绕过了过继性细胞治疗疗法启动过继免疫应答这一难关，开创了跨越式发展的医学史新篇章。CART针对那不怎么靠谱的过继免疫，引入全新的概念与方法，成功地诱导出抗癌的过继免疫应答。首先CART解决了抗原的难题。既然在自然的状况下免疫系统找不到抗原，那就人为指定一种抗原。考察急性淋巴B细胞白血病的CART疗法。淋巴B细胞表面有一个分化抗原CD19，无论是正常B细胞还是癌变B细胞都有表达。选CD19为靶抗原可以确保没有漏网之鱼。接下来，怎样确保T细胞能找到CD19靶抗原？这也是CART的核心技术。自然的T细胞肯定不会将CD19当作靶抗原的。CD19表达于正常B细胞，T细胞对CD19耐受。CART将一个抗原受体嵌合到T细胞表面。这抗原受体本质是一种抗体，对CD19有很高的亲和性。两者碰到就会结合，不离不弃。于是，用抗体蛋白联接定位，T细胞就钉住了癌细胞。所以有一比喻，这抗原受体就像GPS，给T细胞导航，为找到目标提供了保证。抗体又是怎样插入进T细胞的？这是通过基因转染技术实现的。这里转染的并不是抗体本身而是编码抗体的基因，也就是说转染的是DNA。转染的DNA会编码抗体然后表达于T细胞表面。
仅仅嵌合了抗体的T细胞疗法是第一代CART，解决了靶抗原或第一信号的问题。但是临床效果差強人意，原因是第二信号即共刺激信号的缺失。没有共刺激信号T细胞仍然没法激活，那样就算钉住了癌细胞也没有战斗力。产生共刺激信号需要T细胞和抗原提呈细胞之间的互动。可是抗原提呈细胞也需要第一信号。这样势必还要将同样的抗体嵌合进抗原提呈细胞如DC，过于复杂了。于是，针对共刺激信号又开发出第二代CART。第二代CART在靶向CD19的基础上，加入了CD28或CD137，T细胞上的共刺激受体。T细胞的信号域包括：CD3ζ（T细胞抗原受体信号转导的组成成分）——CD28，或CD3ζ——CD137。免疫应答的贯序可表述为：CD19激活抗体，抗体激活CD28（CD137），CD28（CD137）激活CD3ζ。可以说，第二代CART同时解决了第一信号和第二信号，不再依赖不怎么靠谱的肿瘤相关抗原，不再依赖抗原提呈细胞，也不必担心MHC的低表达。第三代CART的特点是在CD28之后又加入了共刺激分子蛋白OX40或4-1BB（4-1BB就是CD137）。这两种共刺激分子蛋白可进一步活化T细胞，延长生存期。三代CART技术的演化反映了共刺激分子的重要作用。
急性淋巴B细胞白血病的CART疗法获得了惊人的90%-100%的响应率，长期有效，不少病患完全缓解也就是临床痊愈了。更何况，这些入组CART的病患都是化疗失败、骨髓移植后复发等就快走投无路重病患。CART将会成为人类历史上伟大里程碑：真正治愈癌症的方法。
推广CART疗法的主要障碍来自脱靶效应。像CD19不是肿瘤的靶点，而是B细胞本身的靶点。肿瘤细胞清除掉的同时B细胞也被清除掉了。这已不是杀敌一千，自伤八百。更不是杀敌一千，自伤八十。而是宁可错杀一千，绝不放过一个。好在患者没有B细胞照样可以生存，只要定期输入丙种免疫球蛋白即可。只要靶点不是百分百肿瘤特异性，就会有脱靶效应，这是CART副作用的主要来源。据报道，一例以HER2为靶抗原针对结肠癌的第三代CART治疗，病人输入CART十五分钟后出现呼吸窘迫，五天后死亡。检测到高水平的细胞因子并发现CART细胞浸润肺组织。一个解释是靶抗原在正常肺组织中有表达。为了提高CART治疗安全性和有效性，一个保守的剂量递增方法是在2天或以上分散T细胞输入剂量，不断监测毒性迹象，阻止可能诱发大规模反应的进一步T细胞输入。用单克隆抗体封闭靶抗原来缓解脱靶反应也是必要时的一种选择。最近还提出了引入自杀基因的方案，必要时立即启动CART自杀，目前在III期临床试验。CART疗法另一副作用是细胞因子风暴。据报道早期CART治疗时60%的病患要住ICU。现在用剂量递增方法可大大减少细胞因子风暴的产生。
综上所述，嵌合抗原受体CAR能与靶抗原高亲和性结合而不受中枢耐受的影响,这一特性使得CAR的免疫治疗能够克服以往免疫治疗的大部分缺陷。到目前为止大多数临床CART引人注目的结果都来自治疗血液疾病，针对实体瘤的CART临床也开始起步。CART疗法的风险在于抗原受体的非特异性造成的脱靶效应。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种T细胞抗原受体基因，为食管癌的治疗提供一个新的技术方向。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
一种T细胞抗原受体基因，主要由如下五部分构成：CD8-pre序列，EGFR-scFv序列，CD8铰链+跨膜序列，4-1BB或CD137序列，CD3ζ序列。
具体的，本发明的T细胞抗原受体基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
进一步的，本发明还包括含有上述基因的重组载体。
进一步的，本发明还包括含有上述基因的转化体。
进一步的，本发明还包括含有上述基因的T细胞。
进一步的，本发明还包括由上述基因经转录表达形成的抗原受体。
进一步的，本发明还包括嵌合有上述抗原受体的T细胞。
进一步的，本发明还包括上述的T细胞抗原受体基因在制备抗食管癌药物中的应用。
进一步的，本发明还包括上述的抗原受体在制备抗食管癌药物中的应用。
进一步的，本发明还包括上述的嵌合有抗原受体的T细胞在制备抗食管癌药物中的应用。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明的抗原受体及其基因是经过发明人精心设计和严格试验验证的，是本发明的核心技术点。参见下文的具体实施方式部分，利用本发明的抗原受体基因制备的“嵌合抗原受体T细胞CART-EGFR”相比“CART-对照组”展现出了特定的食管癌相关功能活性，本发明的基因针对食管癌的治疗具有重要的潜在和实际价值。
附图说明
图1为二代和三代的CAR结构示意图。
图2显示CART细胞制备流程。
图3显示CART-EGFR及CART-对照组的GFP表达结果。
图4显示CART-EGFR细胞分群。
图5显示CART-对照组细胞分群。
图6显示流式细胞仪检测细胞EGFR表达的结果。
图7显示CART-EGFR及CART-对照组细胞分泌结果。
图8显示CART-EGFR、CART-对照组对靶细胞及非靶细胞的杀伤作用。
图9显示CART-EGFR、CART-对照组GFP细胞检测结果。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
实施例1、CAR-EGFR的设计与构建
1-1、CAR的设计说明。经统计，目前临床实验中使用最多的CAR结构包括二代和三代CAR（参见附图1），在有关的临床报道中，二代CAR报道较多，其中尤其以宾夕法尼亚大学主导的CAR结构疗效显著（NCT01626495，NCT01029366），因此我们采用了此二代CAR框结构。
1-2、CAR的结构及构建。CAR-EGFR序列包括如下几个部分：CD8-pre，EGFR- scFv，CD8铰链+跨膜，4-1BB（CD137），CD3ζ。其完整序列参见SEQ ID NO：1。
1-3、CAR对照组的结构及构建。CAR-对照组序列结构包括：CD8-pre，EGFR- scFv，CD8-ΔCD3ζ。其完整序列参见SEQ ID NO：2。
实施例2、CAR-EGFR修饰的T细胞（CART-EGFR）的制备与表型验证
2-1、CART-EGFR及CART-对照组的制备。CART-EGFR及CART-对照组制备流程如附图2所示。具体包括如下内容：
2-1-1、实验试剂和实验仪器：
实验试剂包括：
Ficoll-Paque PLUS（GE，cat#17-1440-02）
完全培养基TexMACS (Miltenyi Biotechnolog，cat#170-076-309)+IL-2(Miltenyi Biotechnolog，cat#130-097-748)
PerCP5.5 anti-human CD3(BD，cat#552852)
PE anti-human CD4(BD，cat#555347)
APC anti-human CD8(BD，cat#555369)
FACS buffer：PBS+2.5%FBS
TRANS B。
实验仪器包括：
离心机：湘仪 L550
流式细胞仪：BD C6
CO2培养箱：ESCO MCO-20AIC
细胞计数仪：Cellometer Auto 1000。
2-1-2、PBMC分离：将新鲜血液转移到50 mL离心管中。用生理盐水按照1:1（体积比）进行稀释，轻轻上下吹打3-5次混匀。将 6 mL Ficoll加入到15 mL离心管中，竖直放置到水平台面上静置备用。将稀释好的血液（总体积8 mL）用移液管缓慢均匀加入到竖直放置在台面的含Ficoll溶液的离心管中。将加好血液与Ficoll的离心管轻轻转移至离心机中。在转移离心管过程尽量减少晃动，保持离心管竖直，以避免打破液面分层。室温400g离心30分钟。离心结束后，轻轻转移离心管至超净台中。用移液器吸取中间的白膜层（即淋巴细胞层）转移至新的50 mL离心管中。尽量避免吸取到下层或上层的细胞，避免造成污染。加入30mL 生理盐水至上述转移出来的淋巴细胞中，轻轻吹打混匀，60-100g 室温离心10 分钟。重复洗涤淋巴细胞，去除上清，加入一定量的完全培养基重悬细胞。计数调整密度为5*105细胞/ml，预先处理过的12孔板中每孔加入1ml。将培养板放置于37°C，5%CO2培养箱培养48小时。
2-1-3、慢病毒感染：收集上述PBMC，室温300g离心 4min，调整密度为5*105细胞/ml，新的12孔板中每孔加入1ml细胞，实验组加入7.5ul EGFR二代CAR的慢病毒（慢病毒的制备是比较常规化的技术，可以自行制备或提供本发明的基因序列交由上海吉凯基因化学技术有限公司制备），病毒滴度为2*108/mL，MOI=3；对照组加入7.5ul对照病毒，病毒滴度为2*108/mL，MOI=3，每孔加入一定的TRANS B感染试剂（TRANS B感染试剂购自上海吉凯基因化学技术有限公司；其用量依据产品说明书确定）。将细胞培养板置于37°C，5%CO2培养箱培养。第三天每孔加入1ml新鲜的培养基，继续培养。第七天计数计算扩增倍数。
本次制备，初始PBMC细胞量均为1E+6，第七天时实验组PBMC细胞量为2.50E+07，其中97.9%为CD3 +T 细胞，见图2，细胞扩增倍数约为25倍；对照组PBMC细胞量为1.77E+07，细胞扩增倍数约为17倍，见表1。
表1 CART-EGFR及CART-对照组细胞增殖
Figure 344448DEST_PATH_IMAGE002
2-2、CART-EGFR表型检测。实验目的：确定CART-EGFR及CART-对照组的感染效率。实验设计：流式细胞仪检测所制备细胞GFP的表达。计数每个细胞取出1.0 x106个，1000rpm，离心3min，加入100ul FACS buffer 重悬细胞，加入15ul APC anti-human CD8、15ul PE anti-human CD4 、15ul PerCY5.5 anti-human CD3。4℃避光孵育30min，1000rpm，离心3min，去掉上清加入FACS buffer 再洗两遍。加入150ul FACS buffer重悬细胞，FACS检测荧光。用BD Accure C6 software对数据进行处理分析。实验结果及分析：CART-EGFR及CART-对照组GFP表达结果如图3。如图3所示，CART-EGFR感染效率约为56.1%，CART-对照组感染效率约为19.3%。
2-3、CART的细胞分群检测。实验目的：确定CART-EGFR的细胞中T细胞的亚群分布特征。实验设计：流式细胞仪检测所制备细胞表面标志物，检测标的及意义如下表2所示。
表2 T细胞亚群分布
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
实验结果及分析：CART-EGFR及CART-对照组细胞分群检测结果如图4、5。由上述结果可知，所制备的CART-EGFR细胞分群如表3；所制备的CART-对照组细胞分群如表4。
表3 CART-EGFR细胞亚群分布比例
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
表4 CART-对照组细胞亚群分布比例
T淋巴细胞（CD3+）占总细胞群体的比例 99.6%
T效应淋巴细胞（CD3+CD8+）占T细胞的比例 19.8%
T辅助淋巴细胞（CD3+CD4+）占T细胞的比例 74.4%
实施例3、CART-EGFR的功能验证——靶细胞的验证
实验目的：检测靶细胞和非靶细胞上EGFR的表达。实验设计：使用EGFR的流式抗体对靶细胞（Eca109）及对照细胞（MCF7）进行检测。实验结果与分析：流式细胞仪检测Eca109及MCF7 EGFR表达结果如图6，结果显示阴性对照MCF7中EGFR表达较低，但靶细胞Eca109中EGFR高表达。
实施例4、CART-EGFR的体外功能验证——细胞因子分泌实验。
实验目的：通过检测CART-EGFR细胞与靶细胞共同孵育后，细胞因子分泌是否有上升判断CART是否有功能。实验设计：分别对比CART-EGFR、CART-对照组与靶细胞和非靶细胞共同孵育后，培养基上清中细胞因子的分泌情况。试剂包括：Human TH1/TH2 cytokine CBAkit（BD，Cat#550749）。细胞（Cell line）包括：MCF7（Medium：DMEM+10%FBS）；ECA109（Medium：DMEM+10%FBS）。仪器包括：离心机：湘仪 L550；流式细胞仪：BD C6。实验方法包括：
4-1、细胞因子分泌：收集靶细胞，用稀释缓冲液将细胞洗涤一次，1000rpm 3min离心，弃上清，以含2% FBS的1640重悬细胞，计数，最终将细胞稀释到1*106个/ml 浓度；收集CART细胞（效应细胞），用稀释缓冲液将细胞洗涤一次，1000rpm 3min 离心，弃上清，2%FBS的1640重悬细胞，计数，最终将细胞稀释到1*106个/ml浓度；将100ul靶细胞和100ulCART细胞1:1混合加入96孔板中，37℃、5%CO2共同培养20-24小时；1000rpm 5min离心，收集上清检测细胞因子。
4-2、细胞因子检测：准备15ml离心管，在瓶盖上标注1，将标准品转移至EP管内，并向其中加入标准品稀释液2ml，轻柔颠倒混匀，室温防止15min-20min平衡。取9支1.5ml EP管，并向每管中加入300ul标准品稀释液，瓶盖上标注编号2-9，在1管中取300ul至2管内混匀；在2管内取出300ul至3管内，依次类推进行2倍梯度稀释，另取一支1.5ml EP管，加入300ul标准品稀释液作为阴性对照。确定好需要检测的细胞因子及样品个数。取出待检测的细胞因子捕获珠子瓶，用力混匀。每种珠子取出（待检测样品数+标准品数+阴性对照数）*10ul的捕获珠子量。并将每种珠子进行涡轮震荡混匀。用标准品稀释液对样品进行稀释（稀释倍数可自行决定，如1：10、 1：100等）取N个1.5ml EP管（N=样品数+标准品数+对照数）向每管（标准品、样品、阴性对照）中加入50ul混合珠子；并向各管中加入相应待测试剂（标准品、样品、对照）50ul以及PE Detection Reagent 50ul，充分混合后，避光室温孵育3小时。向每管中加入1ml wash buffer，轻柔吹匀后200g离心5分钟。小心吸去上清，并向每管中加入300ul wash buffer，并重悬沉淀。将样品进行流式细胞仪检测。用BD的FCAP Array v3软件对数据进行处理分析。
4-3、实验结果与分析：本次实验分别检测了IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的分泌，其中IL-4和TNF-α分泌水平较低，变化不明显，结果如图7所示，CART-EGFR在存在靶细胞时，细胞因子的分泌高于CART-对照组，结果显示CART-EGFR具有一定的功能活性。
实施例5、CART-EGFR的体外功能验证——细胞杀伤能力检测。
实验目的：检测CART-EGFR及CART-对照组的杀伤能力。实验设计：通过LDH释放实验，判断CART细胞对靶细胞的特异杀伤。实验结果与分析：CART-EGFR和CART-对照组对靶细胞及非靶细胞的裂解效应如图8。与CART-对照组相比，CART-EGFR对靶细胞具有一定杀伤活性，在CART-EGFR：靶细胞比例为20:1共培养4hr后，靶细胞裂解率为40.42%。
实施例6、存在靶细胞时CART-EGFR的增殖实验
实验目的：检测CART-EGFR及CART-对照组在靶细胞存在时的增殖作用。实验设计：CART-EGFR及CART-对照组与靶细胞比例为2:1，共同培养48小时，流式细胞仪检测带有GFP细胞的增殖。实验结果与分析：CART-EGFR和CART-对照组细胞增殖结果如图9，在靶细胞存在条件下，CART-EGFR及CART-对照组增殖不明显。
由上述试验例可知，利用本发明的抗原受体基因制备的嵌合抗原受体T细胞CART-EGFR相比CART-对照组展现出了一定的功能活性，本发明的基因针对食管癌的治疗具有重要的潜在和实际价值。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
<110> 汪治宇
<120> 一种T细胞抗原受体基因及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ATGTACAGGA TGCAACTCCT GTCTTGCATT GCACTAAGTC TTGCACTTGT CACGAACTCG 60
GCCGAAGTGC AGCTGCAGCA GAGCGGCGCG GAACTGATGA AACCGGGCGC GAGCGTGAAA 120
ATTAGCTGCA AAGCGACCGG CTATACCTTT AGCAGCTATT GGATTGAATG GGTGAAACAG 180
CGTCCGGGCC ATGGCCTGGA ATGGATTGGC GAAATTCTGC CGGGCAGCAA GAAAACCAAC 240
TATAACGAAA AATTTAAAGG CAAAGCGACC TTTACCGCGG ATACCAGCAG CAACACCGCG 300
TATATGCAGT TTAGCAGCCT GACCAGCGAA GATAGCGCGG TGTACTATTG CGCGCGTTAT 360
TATTATCGTA ACGATGATTA TGGCATGGAT TATTGGGGCC AGGGCACCAC CGTGACCGTG 420
AGCAGCGGTG GTGGTGGTTC TGGCGGTGGT GGTAGCGGCG GTGGTGGCAG CGATATTGTG 480
ATGAGCCAGA GCCCGAAAAG CATGAGCATG AGCGTGGGCG AACGTGTGAC CCTGACCTGC 540
AAAGCGAGCG AAAACGTGGT GACCTATGTG AGCTGGTATC AGCAGAAACC GGAACAGAGC 600
CCGAAACTGC TGATTTATGG CGCGAGCAAC CGTTATACCG GCGTGCCGGA TCGTTTTACC 660
GGCAGCGGCA GCGCGACCGA TTTTACCCTG ACCATTAGCA GCGTGCAGGC GGAAGATCTG 720
GCGGATTATC ATTGCGGCCA GGGCTACAGC TATCCGTATA CCTTTGGCGG CGGCACCAAA 780
CTGGAAATTA AAACCACGAC GCCAGCGCCG CGACCACCAA CACCGGCGCC CACCATCGCG 840
TCGCAGCCCC TGTCCCTGCG CCCAGAGGCG TGCCGGCCAG CGGCGGGGGG CGCAGTGCAC 900
ACGAGGGGGC TGGACTTCGC CTGTGATATC TACATCTGGG CGCCCTTGGC CGGGACTTGT 960
GGGGTCCTTC TCCTGTCACT GGTTATCACC CTTTACTGCA AACGGGGCAG AAAGAAACTC 1020
CTGTATATAT TCAAACAACC ATTTATGAGA CCAGTACAAA CTACTCAAGA GGAAGATGGC 1080
TGTAGCTGCC GATTTCCAGA AGAAGAAGAA GGAGGATGTG AACTGAGAGT GAAGTTCAGC 1140
AGGAGCGCAG ACGCCCCCGC GTACAAGCAG GGCCAGAACC AGCTCTATAA CGAGCTCAAT 1200
CTAGGACGAA GAGAGGAGTA CGATGTTTTG GACAAGAGAC GTGGCCGGGA CCCTGAGATG 1260
GGGGGAAAGC CGAGAAGGAA GAACCCTCAG GAAGGCCTGT ACAATGAACT GCAGAAAGAT 1320
AAGATGGCGG AGGCCTACAG TGAGATTGGG ATGAAAGGCG AGCGCCGGAG GGGCAAGGGG 1380
CACGATGGCC TTTACCAGGG TCTCAGTACA GCCACCAAGG ACACCTACGA CGCCCTTCAC 1440
ATGCAGGCCC TGCCCCCTCG C 1461
<210> 2
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ATGTACAGGA TGCAACTCCT GTCTTGCATT GCACTAAGTC TTGCACTTGT CACGAACTCG 60
GCCGAAGTGC AGCTGCAGCA GAGCGGCGCG GAACTGATGA AACCGGGCGC GAGCGTGAAA 120
ATTAGCTGCA AAGCGACCGG CTATACCTTT AGCAGCTATT GGATTGAATG GGTGAAACAG 180
CGTCCGGGCC ATGGCCTGGA ATGGATTGGC GAAATTCTGC CGGGCAGCAA GAAAACCAAC 240
TATAACGAAA AATTTAAAGG CAAAGCGACC TTTACCGCGG ATACCAGCAG CAACACCGCG 300
TATATGCAGT TTAGCAGCCT GACCAGCGAA GATAGCGCGG TGTACTATTG CGCGCGTTAT 360
TATTATCGTA ACGATGATTA TGGCATGGAT TATTGGGGCC AGGGCACCAC CGTGACCGTG 420
AGCAGCGGTG GTGGTGGTTC TGGCGGTGGT GGTAGCGGCG GTGGTGGCAG CGATATTGTG 480
ATGAGCCAGA GCCCGAAAAG CATGAGCATG AGCGTGGGCG AACGTGTGAC CCTGACCTGC 540
AAAGCGAGCG AAAACGTGGT GACCTATGTG AGCTGGTATC AGCAGAAACC GGAACAGAGC 600
CCGAAACTGC TGATTTATGG CGCGAGCAAC CGTTATACCG GCGTGCCGGA TCGTTTTACC 660
GGCAGCGGCA GCGCGACCGA TTTTACCCTG ACCATTAGCA GCGTGCAGGC GGAAGATCTG 720
GCGGATTATC ATTGCGGCCA GGGCTACAGC TATCCGTATA CCTTTGGCGG CGGCACCAAA 780
CTGGAAATTA AAACCACGAC GCCAGCGCCG CGACCACCAA CACCGGCGCC CACCATCGCG 840
TCGCAGCCCC TGTCCCTGCG CCCAGAGGCG TGCCGGCCAG CGGCGGGGGG CGCAGTGCAC 900
ACGAGGGGGC TGGACTTCGC CTGTGATATC TACATCTGGG CGCCCTTGGC CGGGACTTGT 960
GGGGTCCTTC TCCTGTCACT GGTTATCACC CTTTACTGCA GAGTGAAGTT CAGCAGGAGC 1020
GCAGACGCCC CCGCGTACTA A 1041

Claims (8)

1.一种T细胞抗原受体基因在制备抗食管癌药物中的应用，其特征在于：该基因主要由如下五部分构成：CD8-pre序列，EGFR-scFv序列，CD8铰链+跨膜序列，4-1BB或CD137序列，CD3ζ序列，其具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。
2.包含权利要求1所述基因的重组载体。
3.包含权利要求1所述基因的转化体。
4.包含权利要求1所述基因的T细胞。
5.由权利要求1所述基因经转录表达形成的抗原受体。
6.嵌合有权利要求5所述抗原受体的T细胞。
7.权利要求5所述的抗原受体在制备抗食管癌药物中的应用。
8.权利要求6所述的嵌合有抗原受体的T细胞在制备抗食管癌药物中的应用。
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"CART技术及其临床应用";朱昕赟 等;《临床血液学杂志》;20151231;第28卷(第5期);第428-431页 *
"Chimeric antigen receptor-modified T cells for the immunotherapy of patients with EGFR-expressing advanced relapsed/refractory non-small cell lung cancer";Kaichao Feng 等;《Science China Life Sciences》;20160310;第59卷(第5期);第475页右栏最后一段-476页左栏第一段 *

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