CN112010984B - 一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白多聚体纳米疫苗 - Google Patents

一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白多聚体纳米疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒S蛋白亚单位纳米疫苗。本发明以新型冠状病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)表达蛋白与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(HP_Ferritin，HPF)的N端通过SpyTag/SpyCatcher(ST‑SC)系统中分子间异肽键作用连接组成亚单位多聚体蛋白，实现抗原多聚化；或将RBD表达蛋白与七肽重复区(Heptad Repeat,HR)表达蛋白，共同与HPF蛋白以ST‑SC共价结合组成双亚单位多聚体蛋白，实现抗原多聚化。该方案可克服RBD单体免疫原性不足的缺点，所得疫苗能显著的提高宿主针对病毒的中和抗体的水平，产生的抗体具有强力阻挡病毒入侵靶细胞的能力。同时基于序列分析，本发明的方案有望研发出针对多种冠状病毒有效的疫苗。而且本发明疫苗制备方法简单、易于纯化，安全性高，疫苗可较快的应用于临床试验。

Description

一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒S蛋白多聚体 纳米疫苗
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒(SARS-CoV-2，又名2019-nCoV)S蛋白双区域亚单位纳米疫苗。
背景技术
由于目前新型冠状病毒肺炎的病毒来源、发病机制等尚不明确，并且缺乏特效抗病毒药物，为临床诊治和控制疫情带来极大困难，造成严重的社会负担和危机。
目前，人类仍缺乏有效的抗SARS-CoV-2的疫苗，在这种严峻的形势下，尽快开发安全、有效的针对SARS-CoV-2的疫苗用以保护易感人群，对于人民健康与国家安全具有重要意义。因此，目前针对冠状病毒，尤其是新型冠状病毒SARS-CoV-2，开展高免疫原性和中和效率的疫苗的研发工作迫在眉睫。
对于冠状病毒疫苗的研发，在前期的研究中，来源于MERS-CoV以及SARS-CoV的RBD单体疫苗接种动物模型后仅能引发较低的假病毒中和抗体水平。中国专利2020101440324(公开号CN111217919A)提供了一种基于火球菌铁蛋白的新型冠状病毒S蛋白双区域亚单位纳米疫苗，方案中将病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)和融合肽(Fusionpeptide,FP)共同作为双抗原，并与火球菌多聚物蛋白(Pyrococcus furiosus_Ferritin,Ferritin(PF))融合组成一个新的融合蛋白RBD-FP-PF_Ferritin后作为抗原，提高了抗原免疫原性，所制得的疫苗能显著的提高宿主针对病毒的中和抗体的水平，产生的抗体具有强力阻挡病毒入侵靶细胞的能力。
同时，我们对更多、更优的疫苗制备方案进行不断地探索研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有新型冠状病毒治疗药物以及疫苗的不足，为尽快开发安全、有效的针对SARS-CoV-2的疫苗用以保护易感人群。本发明以病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)单独或者与七肽重复序列(Heptad Repeat,HR)共同作为双抗原片段，并与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacter pylori_Ferritin,HPF)通过ST-SC共价作用实现抗原的多聚化，构建开发了抗原多聚体复合物。
此方案具体是：
以病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)加上ST标签、信号肽及纯化标签，通过质粒转染真核细胞表达系统(如293F或者CHO细胞)表达，经纯化获得His-tag-ST-RBD蛋白。
以七肽重复序列(Heptad Repeat,HR)加上ST标签、信号肽及纯化标签，通过质粒转染真核细胞表达系统(如293F或者CHO细胞)表达，经纯化获得His-tag-ST-HR蛋白。
以幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacter pylori_Ferritin,HPF)加上SC标签、信号肽及纯化标签，通过质粒转染真核细胞表达系统(如293F或者CHO细胞)表达，经纯化获得His-tag-SC-HPF蛋白。His-tag-SC-HPF蛋白可自行组装成球状二十四聚体纳米颗粒。
将自组装成二十四聚体纳米颗粒的His-tag-SC-HPF蛋白与His-tag-ST-RBD蛋白共同孵育，则通过ST-SC共价键的作用形成RBD-HPF亚单位二十四聚体蛋白。将自组装成二十四聚体纳米颗粒的His-tag-SC-HPF蛋白与His-tag-ST-RBD蛋白以及His-tag-ST-HR蛋白共同孵育，则通过ST-SC共价键作用形成RBD-HR-HPF双亚单位二十四聚体蛋白。
这种二十四聚体蛋白可将RBD蛋白单独或者RBD/HR蛋白共同展示在纳米颗粒表面，克服了RBD单体免疫原性不足的缺点，能够有效地引起更强的免疫反应，产生中和SARS-CoV-2病毒入侵靶细胞的抗体。
本发明的方案所制得的疫苗能显著的提高宿主针对SARS-CoV-2的中和抗体的水平；而且本发明疫苗制备方法简单、蛋白含有His标签易于纯化，NIH登记的临床试验中已证明了Ferritin抗原作为纳米疫苗载体的安全性，疫苗可较快的应用于临床试验。
因此，本发明第一目的是提供一种提高抗原免疫原性的方法。
本发明另一目的是提供一种基于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD亚单位或者RBD-HR双亚单位与细菌多聚物构建的二十四聚体化的亚单位的新型冠状病毒抗原。
本发明另一目的是提供所述新型冠状病毒抗原在制备新型冠状病毒疫苗及抗新型冠状病毒药物中的应用。
本发明再一目的是提供所述新型冠状病毒抗原的制备方法。
本发明再一目的是提供编码表达所述新型冠状病毒抗原的核苷酸序列、载体或转基因细胞系。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供一种提高抗原免疫原性的方法，是将冠状病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)进行表达，所得蛋白与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacter pylori_Ferritin,HPF)通过共价结合的方式组成一个新的RBD-HPF亚单位多聚体蛋白后作为抗原。
或，所述提高抗原免疫原性的方法是分别将冠状病毒的受体结合域(Receptorbinding domain,RBD)与七肽重复区(Heptad Repeat,HR)进行表达，所得蛋白再共同与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacter pylori_Ferritin,HPF)通过共价结合的方式组成一个新的RBD-HR-HPF双亚单位多聚体蛋白后作为抗原。
具体操作方案中，所述方法是将病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)和ST标签、信号肽、标签链接，经过融合后形成SP-His-tag-ST-RBD蛋白；将七肽重复序列(Heptad Repeat,HR)和ST标签、信号肽、标签链接，经过融合后形成SP-His-tag-ST-HR蛋白；将幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacter pylori_Ferritin,HPF)和SC标签、信号肽、标签链接，经过融合后形成SP-His-tag-SC-HPF蛋白。本发明提供的含有标签SC的蛋白可与含有ST标签的蛋白通过共价作用结合。
进一步优选地，所述方法构建的SP-His-tag-ST-RBD蛋白与SP-His-tag-SC-HPF蛋白共同孵育，组成一个新的RBD-HPF亚单位多聚体蛋白后作为抗原。或，所述方法构建的SP-His-tag-ST-RBD蛋白与SP-His-tag-ST-HR蛋白以一定的比例混合后再与SP-His-tag-SC-HPF蛋白共同孵育，组成一个新的RBD-HR-HPF双亚单位多聚体蛋白后作为抗原。
上述方案中，铁蛋白(Ferritin)作为一种可自组装的球形蛋白，其表面每相邻两个亚单位的氨基端间距约为4.5-7.5nm，适合在外表面负载抗原。利用HPF这样一种来源于幽门螺旋杆菌的铁蛋白能够自发形成多聚化的特性，且表面负载抗原后能诱发很强的体液免疫反应及细胞免疫反应，是非常理想的载体，可以增加单次免疫所能够承载的抗原的数量，解决RBD单体疫苗引发较弱免疫的缺点。
在以往抗原研究中，尤其是SARS的研究，仅仅关注某一个区段的免疫原性，比如RBD区域，但目前相关疫苗的研发均宣告失败，因此我们考虑采用双区段进行抗原免疫。选择RBD和HR的原因在于：①RBD是和受体结合的区域；②HR是S蛋白介导的膜融合的结构基础。“结合”和“融合”构成了病毒侵入细胞的最关键最早期的两个步骤。将两个区域构建融合蛋白进行免疫在以往单区段疫苗研究中是不曾报道的。另外我们还对抗原片段进行HPF的多聚化，将双抗原聚集在一起形成纳米颗粒，进一步增加单次免疫承载抗原的数量，因此可以更加充分而稳定的和人体内免疫细胞进行接触而刺激产生抗体。本发明的这种“双抗原+多聚体”的策略，可从质量(RBD+HR双抗原)和数量(多聚化)上达到更加有效、快速、稳定地刺激机体产生有效免疫反应的效果。
具体地，上述方案应用在新型冠状病毒疫苗制备时：
首先，新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；ST标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2可以直接连接得到融合蛋白ST-RBD。
或SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:1以铰链区Linker相连构成一个新的融合蛋白ST-RBD。作为一种可选择的优选方案，所述Linker可以为GSG。当所述Linker为GSG时，新型冠状病毒SARS-CoV-2的ST-RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。当在ST-RBD蛋白N端添加信号肽SP，C端添加His标签时，新型冠状病毒SARS-CoV-2的ST-RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
另外，新型冠状病毒SARS-CoV-2的HR的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；ST的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4可以直接连接得到融合蛋白ST-HR。
或SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4以铰链区Linker相连构成一个新的融合蛋白ST-HR。作为一种可选择的优选方案，所述Linker可以为GSG。当所述Linker为GSG时，新型冠状病毒SARS-CoV-2的ST-HR的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。当在ST-HR蛋白N端添加信号肽SP，C端添加His标签时，新型冠状病毒SARS-CoV-2的ST-HR的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
另外，所述HPF的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，SC的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:7可以直接连接得到融合蛋白SC-HPF。
或SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:7以铰链区Linker相连构成一个新的融合蛋白SC-HPF。作为一种可选择的优选方案，所述Linker可以为GSG。当所述Linker为GSG时，新型冠状病毒SARS-CoV-2的SC-HPF的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。当在ST-HR蛋白N端添加信号肽SP，C端添加His标签时，新型冠状病毒SARS-CoV-2的SC-HPF的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
然后，SEQ ID NO:9蛋白与SEQ ID NO:11蛋白通过共孵育可通过共价键连接得到新的RBD-HPF亚单位多聚体蛋白。SEQ ID NO:9蛋白与SEQ ID NO:10蛋白以不同比例混合后与SEQ ID NO:11蛋白通过共孵育可通过共价键连接得到新的RBD-HR-HPF双亚单位多聚体蛋白。
即本发明提供了一种含有信号肽及纯化标签的免疫原性提高的SARS-CoV-2抗原，所述抗原是利用幽门螺旋杆菌铁蛋白自行组装为二十四聚体化的亚单位蛋白RBD-HPF或者二十四聚体化的双亚单位蛋白RBD-HR-HPF(如图1所示)。抗原将展示在纳米颗粒表面，能够有效地引起受体更强的免疫反应，接受RBD-HPF蛋白以及RBD-HR-HPF蛋白免疫的小鼠均产生中和SARS-CoV-2入侵靶细胞的抗体。本发明的二十四聚体化的RBD-HPF蛋白以及RBD-HR-HPF蛋白可克服RBD单体免疫原性不足的缺点，显著提高受体针对SARS-CoV-2的中和抗体产生。
作为本发明可选择的一种优选实施方案，新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原(二十四聚体RBD-HPF蛋白)包含本文公开的SP-His-tag-ST-RBD蛋白与SP-His-tag-SC-HPF蛋白通共价键连接，其中所述SP-His-tag-SC-HPF蛋白能够自组装为纳米颗粒，其在表面上展示SP-His-tag-RBD-ST蛋白的免疫原性部分。经进一步动物模型安全性与有效性研究后，RBD-HPF亚单位多聚体疫苗具备保护SARS-CoV易感人群的潜力。
作为本发明可选择的另一种优选实施方案，新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原(二十四聚体RBD-HR-HPF蛋白)包含本文公开的His-tag-ST-RBD蛋白与His-tag-ST-HR蛋白以7：3的比例混合后与His-tag-SC-HPF蛋白通共价键连接，其中所述His-tag-SC-HPF蛋白能够自组装为纳米颗粒，其在表面上展示His-tag-ST-RBD蛋白以及His-tag-ST-HR蛋白的免疫原性部分。经进一步动物模型安全性与有效性研究后，RBD-HR-HPF亚单位多聚体疫苗具备保护SARS-CoV易感人群的潜力。
基于上述方案，所获得的免疫原性提高的冠状病毒抗原，具体是由上述方法构建得到的一个新的可自行组装并二十四聚体化的RBD-HPF蛋白以及RBD-HR-HPF蛋白，以及有该抗原所制备获得的冠状病毒疫苗，也均应在本发明保护范围之内。
同时，所述冠状病毒抗原在制备抗冠状病毒药物方面的应用，具体包括制备抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物的应用，也在本发明的保护范围之内。
作为一种可选择的实施方式，可以利用RBD-HPF蛋白或者RBD-HR-HPF蛋白与SAS佐剂合用制备抗SARS-CoV-2疫苗。
另外本发明还提供一种表达上述抗原(二十四聚体RBD-HPF蛋白或者二十四聚体RBD-HR-HPF蛋白)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
最后本发明还提供上述抗原的一种可选择的制备方法，具体是在SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2直接串联或铰链串联所示氨基酸对应的核苷酸序列、SEQ ID NO:2与SEQ IDNO:4直接串联或铰链串联所示氨基酸对应的核苷酸序列、SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:7直接串联或铰链串联所示氨基酸对应的核苷酸序列、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示氨基酸对应的核苷酸序列、或SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示氨基酸对应的核苷酸序列的3’端加上翻译终止密码子，克隆进真核表达载体，经酶切以及测序正确后，瞬时转染真核表达系统(如293F细胞)进行纳米抗原的表达，表达后收集细胞上清，纯化，His-tag-ST-RBD蛋白(SEQ ID NO:9)单独与His-tag-SC-HPF(SEQ ID NO:11)蛋白共孵育，通过共价作用组成RBD-HPF二十四聚体蛋白，或者将His-tag-ST-RBD蛋白与His-tag-ST-HR(SEQ ID NO:10)蛋白以一定的比例混合后再与His-tag-SC-HPF蛋白共孵育，通过共价作用组成RBD-HR-HPF二十四聚体蛋白。
作为可选择的实施方案，所述真核表达系统包括但不限于HEK293T细胞、293F细胞、CHO细胞、sf9等可用于表达真核蛋白的细胞株、细胞系。相应蛋白导入真核表达系统的方案包括但不限于各种转染、感染、定点敲入、转座方案等。
作为可选择的实施方案，所述纯化方法是将表达所述抗原的细胞上清液过滤除去细胞碎片，并通10K超滤管(Millipore)进行初步的提纯，随即通过HisTrap HP镍柱(GE)、Lectin柱(GE)进行目的蛋白(His-tag-ST-RBD蛋白、His-tag-ST-HR蛋白、His-tag-SC-HPF蛋白)的捕获，共孵育经共价键获得的RBD-HPF以及RBD-HR-HPF二十四聚体融合蛋白通过使用Superose 6Increase 10/300GL柱子(GE)进行分子筛层析进行纯化，获取高纯度的目的蛋白(如图3-6所示)。
作为可选择的实施方案，超滤洗脱的缓冲液是：pH 7.4的Tris缓冲液。
作为可选择的实施方案，镍柱洗脱的缓冲液是：pH 7.4的Tris缓冲液，含有500mMImidazole。
作为可选择的实施方案，Lectin柱(GE)的填料为：Concanavalin A(Con A)，Wheatgerm agglutinin(WGA)，柱洗脱的洗脱机是：methyl-α-D-mannopyranoside，GlcNAc。
作为可选择的实施方案，所述分子筛层析的缓冲液是：pH 7.4的Tris缓冲液。
本发明所得纳米疫苗是经纯化的二十四聚体RBD-HPF蛋白或者RBD-HR-HPF二十四聚体蛋白；所述RBD-HPF蛋白单体大小约为65kD。所述RBD-HR-HPF蛋白单体大小为65kD(RBD-HPF单体蛋白)和80kD(HR-HPF单体蛋白)。
最后，编码表达本发明上述抗原的核苷酸序列，以及含有该核苷酸序列、编码表达所述抗原的载体或转基因细胞系，也应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种提高抗原免疫原性的方法，制备了免疫原性提高的冠状病毒抗原，具体是将His-tag-ST-RBD蛋白单独与His-tag-SC-HPF蛋白共孵育，通过共价作用组成RBD-HPF二十四聚体蛋白，此RBD-HPF二十四聚体蛋白作为抗原用于制备疫苗；或者将His-tag-ST-RBD蛋白与His-tag-ST-HR蛋白以一定的比例混合后再与His-tag-SC-HPF蛋白共孵育，通过共价作用组成RBD-HR-HPF二十四聚体蛋白，此RBD-HR-HPF二十四聚体蛋白作为抗原用于制备疫苗。该方案可克服RBD单体免疫原性不足的缺点，所得疫苗能显著的提高宿主针对SARS-CoV-2的中和抗体的水平。本发明通过RBD-HPF纳米抗原以及RBD-HR-HPF纳米抗原免疫BALB/c小鼠的实验已证实产生的抗体具有可强力阻挡SARS-CoV-2假病毒入侵靶细胞的能力(如图7所示)。
而且本发明疫苗制备方法简单、蛋白含有His标签易于纯化，NIH登记的临床试验中已证明了Ferritin抗原作为纳米疫苗载体的安全性，疫苗可较快的应用于临床试验。
另外，我们通过比对多种新型冠状病毒株显示，其RBD序列高度保守(100％)；通过对来源于2003年的SARS-CoV病毒和SARS-CoV-2 SYSU-IHV病毒的序列比对发现，两种病毒株的75.9％的RBD序列，92.6％的HR1，100％的HR2序列保守。因此，本发明以RBD序列和HR序列为基础的方案，有望研发出针对多种冠状病毒有效的疫苗。
附图说明
图1为电镜复染图(左：RBD-HPF，右：RBD-HR-HPF)。
图2为结构示意图(上：SP-His-tag-ST-RBD，中：SP-His-tag-ST-HR，下：SP-His-tag-SC-HPF)。
图3为纯化后RBD-HPF二十四聚体蛋白考马斯亮蓝染色条带。
图4为纯化后RBD-HR-HPF二十四聚体蛋白考马斯亮蓝染色条带。
图5为纯化后RBD-HPF二十四聚体蛋白纯化分子筛图。
图6为纯化后RBD-HR-HPF二十四聚体蛋白纯化分子筛图。
图7为小鼠免疫RBD-HPF纳米疫苗以及RBD-HR-HPF纳米疫苗产生阻挡SARS-CoV-2入侵靶细胞的中和抗体。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1构建新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原(融合蛋白RBD-HPF以及RBD-HR-HPF)
RBD-HPF亚单位多聚体蛋白以及RBD-HR-HPF双亚单位多聚体蛋白自行组装成纳米颗粒的电镜复染图如图1。
具体地，RBD-HPF亚单位多聚体蛋白的构建制备方法如下：
1、表达His-tag-ST-RBD蛋白的制备
将SP-His-tag-ST-RBD对应的核苷酸序列3’端加上翻译终止密码子后克隆到添加Intron以及WPRE增强表达的表达载体(pcDNA3.1-Intron-WPRE)，构建表达载体。
重组质粒转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，筛选和PCR鉴定出阳性克隆。提取去内毒素的质粒，经酶切以及测序验证后用于纳米抗原蛋白的表达。将质粒通过脂质体转染的方案转染HEK293F细胞，转染3天后经离心收获细胞上清，将表达His-tag-ST-RBD的细胞上清通过0.22μm的滤膜过滤，除去细胞碎片。经10K超滤管超滤后，将过滤后的细胞上清液与HisTrap-excel于4℃结合30分钟，使用HisTrap excel镍柱进行粗纯。之后，首先使用Tris(pH 7.4)缓冲液和低浓度咪唑缓冲液(PBS，50mM Imidazole，pH 7.4)分别进行洗涤50ml，去除流穿的杂蛋白。其后，通过含高咪唑缓冲液(Tris-HCl，500mM Imidazole，pH7.4；)进行目的蛋白洗脱。随后，目的蛋白使用Con A与WGA以1：1比例填料的LectinAgarose柱(GE)进行目的蛋白的富集。
2、表达His-tag-ST-HR蛋白的制备
将SP-His-tag-ST-HR对应的核苷酸序列3’端加上翻译终止密码子后克隆到添加Intron以及WPRE增强表达的表达载体(pcDNA3.1-Intron-WPRE)，构建表达载体。
重组质粒转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，筛选和PCR鉴定出阳性克隆。提取去内毒素的质粒，经酶切以及测序验证后用于纳米抗原蛋白的表达。将质粒通过脂质体转染的方案转染HEK293F细胞，转染3天后经离心收获细胞上清，将表达His-tag-ST-HR的细胞上清通过0.22μm的滤膜过滤，除去细胞碎片。经10K超滤管超滤后，将过滤后的细胞上清液与HisTrap-excel于4℃结合30分钟，使用HisTrap excel镍柱进行粗纯。之后，首先使用Tris(pH 7.4)缓冲液和低浓度咪唑缓冲液(Tris-HCl，50mM Imidazole，pH 7.4)分别进行洗涤50ml，去除流穿的杂蛋白。其后，通过含高咪唑缓冲液(Tris-HCl，500mM Imidazole，pH7.4；)进行目的蛋白洗脱。随后，目的蛋白使用Con A与WGA以1：1比例填料的LectinAgarose柱(GE)进行目的蛋白的富集。
3、表达His-tag-SC-HPF蛋白的制备
将SP-His-tag-SC-HPF对应的核苷酸序列3’端加上翻译终止密码子后克隆到添加Intron以及WPRE增强表达的表达载体(pcDNA3.1-Intron-WPRE)，构建表达载体。重组质粒转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，筛选和PCR鉴定出阳性克隆。提取去内毒素的质粒，经酶切以及测序验证后用于纳米抗原蛋白的表达。将质粒通过脂质体转染的方案转染HEK293F细胞，转染3天后经离心收获细胞上清，将表达His-tag-SC-HPF的细胞上清通过0.22μm的滤膜过滤，除去细胞碎片。经10K超滤管超滤后，将过滤后的细胞上清液与HisTrap-excel于4℃结合30分钟，使用HisTrap excel镍柱进行粗纯。之后，首先使用Tris(pH 7.4)缓冲液和低浓度咪唑缓冲液(Tris-HCl，50mM Imidazole，pH 7.4)分别进行洗涤50ml，去除流穿的杂蛋白。其后，通过含高咪唑缓冲液(Tris-HCl，500mM Imidazole，pH7.4；)进行目的蛋白洗脱。随后，目的蛋白使用Con A与WGA以1：1比例填料的LectinAgarose柱(GE)进行目的蛋白的富集。
4、RBD-HPF纳米抗原(RBD-HPF亚单位多聚体蛋白)的制备
检测His-tag-ST-RBD蛋白与His-tag-SC-HPF蛋白的浓度，将制备的His-tag-ST-RBD蛋白与His-tag-SC-HPF蛋白以1：1的摩尔数室温共孵育12小时，使用Superose6Increase10/300GL柱子(GE)进行分子筛层析进行纯化，获得纯度大于99％的二十四聚体RBD-HPF蛋白，即RBD-HPF亚单位多聚体蛋白(如图3、5所示)，分子筛层析的缓冲液是：Tris-HCl，pH 7.4。目的蛋白浓缩后，分装成小份，用液氮迅速冷冻后于-80℃保存。
5、RBD-HR-HPF纳米抗原(RBD-HR-HPF双亚单位多聚体蛋白)的构建
检测His-tag-ST-RBD蛋白、His-tag-ST-HR蛋白、His-tag-SC-HPF蛋白的浓度，将制备的His-tag-ST-RBD蛋白与His-tag-ST-HR蛋白以7：3的摩尔比混匀后，再与等量的His-tag-SC-HPF蛋白室温共孵育12小时，使用Superose 6 Increase10/300GL柱子(GE)进行分子筛层析进行纯化，获得纯度大于99％的二十四聚体RBD-HR-HPF蛋白，即RBD-HR-HPF双亚单位多聚体蛋白(如图4、6所示)，分子筛层析的缓冲液是：Tris-HCl，pH 7.4。目的蛋白浓缩后，分装成小份，用液氮迅速冷冻后于-80℃保存。
实施例2小鼠免疫实验
将实施例1得到的RBD-HPF蛋白与RBD-HR-HPF蛋白按照表1用生理盐水稀释至100μg/ml，并与等体积佐剂SAS进行分组乳化。然后对6-8周龄的BALB/c小鼠进行分组免疫。通过腹腔注射的方式，每只小鼠分别在第0天，第3周(21天)，第14周(108天)接受3次疫苗免疫，每次200μl的接种体积(10μg)。第10、31、108天，对小鼠进行眼眶取血。小鼠血清在静置一段时间待血清析出后，通过4℃，2800rpm离心15分钟获得，立刻用于SARS-CoV-2病毒中和检测实验。
表1
抗原/对照 抗原含量 佐剂 动物数量(只)
RBD-HPF蛋白 10μg SAS 4
RBD-HR-HPF蛋白 10μg SAS 4
RBD蛋白 10μg SAS 4
实施例3假病毒中和试验
1、实验方法
第0天：
将Vero E6细胞以每孔2×104个细胞的密度接种到96孔板中。
第1天：(等待细胞生长密度达到100％。)
(1)稀释血清：血清56℃灭活30min(此灭活步骤一般在取得血清后立即操作)，根据实验需求以5倍或10倍稀释血清，此处选取2个稀释梯度即100倍和1000倍。例如要得到终浓度为10倍、100倍和100倍稀释的血清的体系，按如下表2所示稀释：
表2
Figure GDA0003132440740000111
(2)稀释病毒：每毫升DMEM培养液中6000-8000FFU，此处根据本实验室经验，按每孔加0.25ul的病毒原液。根据所需孔数，配制足量稀释好的病毒液。
(3)细胞孵育：将96孔板中的细胞培养基去除，然后每孔加入60ul病毒/血清混合物，要做复孔(因此以上过程每个血清要保证有够两份的量，此处180ul足够，注意180ul体系含0.75ul病毒原液)，并在37℃条件下孵育1小时。
(4)细胞培养：去除病毒上清，然后用排枪每孔加入125ul加热至37℃的含1.6％CMC的DMEM培养基，注意液体粘稠需要等待吸入枪头。将96孔板放置在37℃(5％CO2)下，孵育24小时。
第2天：
(1)固定：去除上清，每孔加入200ul 4％多聚甲醛，4℃固定过夜后传入P2继续实验。除去固定剂，每孔用200ul PBS洗涤3次。
(2)破膜/封闭：每孔加入100ul含有0.2％Triton X-100和1％BSA的PBS，在室温条件下反应30分钟后，每孔用200ul PBS洗涤3次。
(3)孵育一抗：稀释一抗(Anti-SARS-N；40143-T62-100)用含有1％BSA的PBS，1:1000稀释。每孔加50ul稀释后的一抗，在37℃下孵育1小时。弃去一抗，每孔用200ul PBS/T(0.1％Tween)洗涤3次。
(4)孵育二抗：稀释二抗(Goat anti-rabbit IgG HRP；SSA004-1)，用含有1％BSA的PBS溶液，1:2000稀释。每孔加50ul稀释后的二抗，在37℃下孵育1小时。弃去二抗，每孔用200ul PBS/T洗涤3次。
(5)显色：每孔加入50ul TrueBlue(KPL)，避光室温摇动孵育5分钟。
(6)干板：去除显色液，每孔用200ul ddH2O洗涤，每次3分钟，合计洗2次。并拍干，用ELISPOT计数。
2、结果分析
结果如图7。将RBD-HPF纳米抗原和RBD-HR-HPF免疫BALB/c小鼠后10天血清即检测到对SARS-CoV-2假病毒的中和活性，t检验显示实验组与对照组组间存在差异显著性。在显著性水平为0.05的情况下，双尾概率水平小于0.05。
结果表明，本发明RBD_Ferritin与SAS佐剂合用，经一次免疫后10天即可激发小鼠体液免疫，小于平行对照的二十四聚体组所激发的中和抗体效价，且差异显著。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州千扬生物医药技术有限公司
<120> 一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒S蛋白多聚体纳米疫苗
<130>
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> RBD的氨基酸序列
<400> 1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> ST的氨基酸序列
<400> 2
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 239
<212> PRT
<213> ST-RBD的氨基酸序列
<400> 3
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Ser Gly
1 5 10 15
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
20 25 30
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
35 40 45
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
50 55 60
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
65 70 75 80
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
85 90 95
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
100 105 110
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
115 120 125
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
130 135 140
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
145 150 155 160
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
165 170 175
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
180 185 190
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
195 200 205
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
210 215 220
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
225 230 235
<210> 4
<211> 304
<212> PRT
<213> HR的氨基酸序列
<400> 4
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
1 5 10 15
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
35 40 45
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
50 55 60
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
100 105 110
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
115 120 125
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
130 135 140
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
145 150 155 160
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
165 170 175
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
180 185 190
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
195 200 205
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
210 215 220
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
225 230 235 240
Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
245 250 255
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
260 265 270
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
275 280 285
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
290 295 300
<210> 5
<211> 320
<212> PRT
<213> ST-HR的氨基酸序列
<400> 5
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
20 25 30
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
50 55 60
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
65 70 75 80
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala
85 90 95
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
100 105 110
Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
115 120 125
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
130 135 140
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
145 150 155 160
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
165 170 175
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
180 185 190
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
195 200 205
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
210 215 220
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
225 230 235 240
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
245 250 255
Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
260 265 270
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
275 280 285
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
290 295 300
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
305 310 315 320
<210> 6
<211> 163
<212> PRT
<213> HPF的氨基酸序列
<400> 6
Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser
1 5 10 15
Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu
20 25 30
Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu
35 40 45
His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val
50 55 60
Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr
65 70 75 80
Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser
85 90 95
Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr
100 105 110
Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val
115 120 125
Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn
130 135 140
His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser
145 150 155 160
Arg Lys Ser
<210> 7
<211> 106
<212> PRT
<213> SC的氨基酸序列
<400> 7
Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Ser
1 5 10 15
Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu
20 25 30
Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser
35 40 45
Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly
50 55 60
Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala
65 70 75 80
Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn
85 90 95
Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile
100 105
<210> 8
<211> 278
<212> PRT
<213> 融合蛋白SC-HPF的氨基酸序列，不含SP-His-tag
<400> 8
Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Ser
1 5 10 15
Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu
20 25 30
Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser
35 40 45
Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly
50 55 60
Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala
65 70 75 80
Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn
85 90 95
Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile Gly Ser Gly Asp Ile Ile
100 105 110
Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu
115 120 125
Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala
130 135 140
Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys
145 150 155 160
Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr
165 170 175
Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe
180 185 190
Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn
195 200 205
Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe
210 215 220
Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys
225 230 235 240
Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu
245 250 255
Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 9
<211> 276
<212> PRT
<213> SP-His-tag-ST-RBD的氨基酸序列
<400> 9
Met Gly Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Pro Ala Leu Leu Ser Leu Val
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala Gly Ser Gly Ala
20 25 30
His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Ser Gly Arg
35 40 45
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
50 55 60
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
65 70 75 80
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
85 90 95
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
100 105 110
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
115 120 125
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
130 135 140
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
145 150 155 160
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
165 170 175
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
180 185 190
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
195 200 205
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
210 215 220
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
225 230 235 240
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
245 250 255
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His His
260 265 270
His His His His
275
<210> 10
<211> 357
<212> PRT
<213> SP-His-tag-ST-HR的氨基酸序列
<400> 10
Met Gly Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Pro Ala Leu Leu Ser Leu Val
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala Gly Ser Gly Ala
20 25 30
His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln
50 55 60
Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala
85 90 95
Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser
100 105 110
Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu
115 120 125
Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr
130 135 140
Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala
145 150 155 160
Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
165 170 175
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln
180 185 190
Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala
195 200 205
Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys
210 215 220
Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp
225 230 235 240
Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp
245 250 255
Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn
260 265 270
Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu
275 280 285
Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu
290 295 300
Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu
305 310 315 320
Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile
325 330 335
Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro His
340 345 350
His His His His His
355
<210> 11
<211> 309
<212> PRT
<213> SP-His-tag-SC-HPF的氨基酸序列
<400> 11
Met Gly Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Pro Ala Leu Leu Ser Leu Val
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala Gly Ser Gly Asp
20 25 30
Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Ser Ala
35 40 45
Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala
50 55 60
Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr
65 70 75 80
Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys
85 90 95
Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr
100 105 110
Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly
115 120 125
Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile Gly Ser Gly Asp Ile Ile Lys
130 135 140
Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr
145 150 155 160
Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly
165 170 175
Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys
180 185 190
Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser
195 200 205
Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln
210 215 220
Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile
225 230 235 240
Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu
245 250 255
Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp
260 265 270
Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr
275 280 285
Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser His
290 295 300
His His His His His
305

Claims (19)

1.一种提高冠状病毒抗原免疫原性的方法，其特征在于，所述方法是将新型冠状病毒SARS-CoV-2的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)进行表达，所得蛋白与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacter pylori_Ferritin,HPF)通过共价结合的方式组成一个新的RBD-HPF亚单位多聚体蛋白后作为抗原；
其中，所述新型冠状病毒的RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述幽门螺旋杆菌多聚物蛋白HPF的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，RBD先与ST标签连接后进行蛋白表达，ST的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:1直接连接，或两者以铰链区Linker相连构成一个新的融合蛋白ST-RBD。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，当所述Linker为GSG时所得融合蛋白ST-RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求1-3任一所述方法，其特征在于，分别将新型冠状病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)与七肽重复区(Heptad Repeat,HR)进行表达，所得蛋白再共同与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacter pylori_Ferritin,HPF)通过共价结合的方式组成一个新的RBD-HR-HPF双亚单位多聚体蛋白后作为抗原。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，新型冠状病毒SARS-CoV-2的HR的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，HR先与ST标签连接后进行蛋白表达，ST的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4直接连接，或两者以铰链区Linker相连构成一个新的融合蛋白ST-HR。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，当所述Linker为GSG时所得融合蛋白ST-HR的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
7.根据权利要求1-6任一所述方法，其特征在于，HPF先与SC标签连接后进行蛋白表达，SC的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:6直接连接，或两者以铰链区Linker相连构成一个新的融合蛋白SC-HPF。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，当所述Linker为GSG时所得融合蛋白SC-HPF的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
9.根据权利要求1-8任一所述方法，其特征在于，融合蛋白再加上信号肽及纯化标签His后，利用真核表达系统表达出抗原。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述信号肽为分泌型信号肽(Signalpeptide,SP)；所述纯化标签为His标签(His-tag)；
SP、His-tag、RBD与ST融合的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
SP、His-tag、HR与ST融合的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
SP、His-tag、HPF与SC融合的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
11.一种His-tag-ST-RBD蛋白，其特征在于，根据权利要求9或10所述方法表达得到，氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
12.一种His-tag-ST-HR蛋白，其特征在于，根据权利要求9或10所述方法表达得到，氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
13.一种His-tag-SC-HPF蛋白，其特征在于，根据权利要求9或10所述方法表达得到，氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
14.一种免疫原性提高的冠状病毒抗原，其特征在于，将权利要求11所述His-tag-ST-RBD蛋白与权利要求13所述His-tag-SC-HPF蛋白室温孵育，两者通过ST-SC的共价结合作用构建得到的新的RBD-HPF亚单位多聚体蛋白。
15.一种免疫原性提高的冠状病毒抗原，其特征在于，将权利要求11所述His-tag-ST-RBD蛋白、权利要求12所述His-tag-ST-HR蛋白与权利要求13所述His-tag-SC-HPF蛋白共同孵育，三者通过ST-SC的共价结合作用构建得到的新的RBD-HR-HPF双亚单位多聚体蛋白。
16.权利要求14或15所述冠状病毒抗原在制备抗冠状病毒药物方面的应用。
17.一种表达权利要求14或15所述抗原的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
18.一种冠状病毒疫苗，其特征在于，以权利要求14或15所述冠状病毒抗原为抗原制备而成。
19.编码表达权利要求14或15所述抗原的多核苷酸，或包含该多核苷酸的载体或转基因细胞系。
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