BR112012021545B1 - composições cdv recombinantes e seus usos - Google Patents

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Jean Christophe Audonnet
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Abstract

COMPOSIÇÕES CDV RECOMBINANTES E SEUS USOS A presente invenção fornece vetores que contêm e expressam polipeptícleos de CDV ou antígenos in vivo ou in vitro que eliciam uma resposta imune no animal contra CDV, composições compreendendo os ditos vetores e/ou polipeptídeos de CDV, e métodos de vacinação contra CDV. A invenção fornece ainda métodos para a indução de uma resposta imunogênica ou protetora contra CDV e outros vírus caninos, bem como métodos para a prevenção ou tratamento de CDV e outro(s) vírus caninos ou estado (s) de doença causados por CDV e outros vírus caninos.

Description

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados
Este pedido reivindica o beneficio do Pedido Provisório Americano No. de Série 61/308.620, depositado no dia 26 de fevereiro de 2010.
Campo da Invenção
A presente invenção se refere às formulações para o combate do vírus da raiva canina e outras infecções virais caninas em animais. Especificamente, a presente invenção fornece vetores que contêm e expressam CDV HA in vivo ou in vitroque elicia uma resposta imune em animais contra o vírus da raiva canina, incluindo composições compreendendo os ditos vetores, métodos de vacinação contra o vírus da raiva canina e kits para uso com tais métodos e composições. A presente invenção também fornece vetores que contêm e expressam GM-CSF e CDV HA in vivo ou in vitro,que eliciam uma resposta imune em animais contra o vírus da raiva canina e outros vírus caninos, e composições compreendendo os ditos vetores.
Antecedentes da Invenção
A raiva canina (CD) é uma doença febril altamente infecciosa de cães e outros carnívoros (Fenner, et al., 1987, Veterinary Virology, Academic Press, Inc., pp 485- 5Ó3). A taxa de mortalidade é elevada, variando entre 30 e 80 por cento. Os cães sobreviventes frequentemente apresentam danos permanentes, no sistema nervoso central (Fenner, et al., 1987) . A etiologia estabelecida de CD é a infecção por um membro da família dos Paramixovírus, gênero morbilivírus conhecido como vírus CD (CDV). Em geral, os Paramixovírus são vírus envelopados contendo um genoma de RNA de fita simples de 18 a 20 Kb de polaridade negativa. O genoma codifica de 5 a 7 proteínas estruturais, incluindo uma fusão (F) e uma glicoproteina de hemaglutinina- neuraminidase (HN) ou hemaglutinina (HA) . A glicoproteina de membrana hemaglutinina (HA) é responsável pela hemaglutinação e ligação do vírus à célula hospedeira, e a glicoproteina de fusão (F) causa a fusão da membrana entre o vírus e a célula infectada, ou entre as células infectadas e as células adjacentes não infectadas (Graves et al., 1978, Virology 86:254-263). Para CDV, ambas as glicoproteínas F e HA são encontradas presentes no envelope virai e na superfície das células infectadas. Por inferência a partir de análises com outros membros de morbilivírus, as glicoproteínas CDV F e HA parecem ser importantes para a infecção por CDV e sua imunobiologia (Diallo A., 1990, Vet Micro. 23: 155-163). Vacinas CDV recombinantes baseadas em poxvirus foram desenvolvidas para proteger e tratar cães (US 5.756.102). 0 pedido de patente norte-americana USSN 09/587.964 divulgou vacinas à base de plasmideo de DNA que expressam antigenos de CDV. O fator de estimulação de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) foi descoberto pela primeira vez em 1977 (Burgess etal., 1977, J. Biol. Chem. 252: 1998-2003). GM-CSF tem muitas funções fisiológicas. Em particular, GM- CSF estimula a produção, o desenvolvimento e a formação de colônias de granulócitos, macrófagos, eosinófilos e megacariócitos. (Dy M., em "les Cytokines"Cavailon 1995 ed. Masson, Paris, França, 43-56). 0 GM-CSF induz em particular uma citotoxicidade macrofágica, estimula a atividade citotóxica dependente de anticorpo (ADCC) e o recrutamento de leucócitos ao nivel dos sítios de inflamação.
Os tamanhos das sequências de nucleotídeos que codificam as conhecidas GM-CSFs a partir de várias espécies variam de 381 a 432 nucleotídeos. As sequências de nucleotídeos de ser humano e de murino têm um grau de homologia de 69%. 0 grau de homologia é de 54% ao nível da sequência de aminoácidos (Cantrell et al-, 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 82: 6250-6254). Um GM-CSF equino foi identificado que tem um tamanho de 144 aminoácidos (US 7.250.161). Dois GM-CSF caninos foram identificados em US 5.702.919 e US 5.606.024, que possuem 127 aminoácidos e 174 aminoácidos, respectivamente.
A administração de GM-CSF heterólogo não torna possível obter um efeito adjuvante ótimo, em particular uma estimulação da atividade das células hematopoiéticas e um aumento substancial na resposta imune.
Assim, há uma necessidade geral por uma melhoria na segurança e eficácia das vacinas de CDV e por uma proteção mais eficaz em condições de campo.
A presente invenção fornece uma solução para a otimização do efeito imunológico de caGM-CSF, mantendo ao mesmo tempo alto nível de segurança para os cães vacinados.
Sumário da Invenção
Um objeto desta invenção pode ser qualquer um ou todos de fornecer vetores recombinantes ou vírus, bem como métodos para fazer tais vírus, e proporcionar composições e/ou vacinas, bem como métodos para o tratamento e profilaxia de infecções por CDV e outros vírus caninos.
A invenção fornece um vetor recombinante, tal como um vírus recombinante, que contém e expressa pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena e, a pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena pode compreender uma molécula de ácido nucleico que codifica um imünógeno ou epitopo de interesse a partir de CDV, tal como CDV HA.
A invenção fornece um vetor recombinante, tal como um poxvirus recombinante que contém um primeiro polinucleotideo que codifica um polipeptideo de CDV HA e/ou variante ou fragmento deste e um segundo polinucleotideo 5 que codifica um polipeptideo GM-CSF canino e/ou uma variante ou fragmento do mesmo.
A invenção fornece ainda composições ou vacinas compreendendo tal vetor de expressão, ou o(s) produto(s) de expressão de tal vetor de expressão.
A invenção fornece ainda métodos para a indução de uma resposta imunológica (ou imunogênica) ou protetora contra CDV e outros virus caninos, bem como métodos para prevenção ou tratamento de CDV e outros virus caninos ou estado(s) de doença causado(s) por CDV e outros virus caninos, 15 compreendendo administrar o vetor de expressão ou um produto da expressão do vetor de expressão, ou uma composição que compreende o vetor de expressão, ou uma composição compreendendo um produto de expressão do vetor de expressão.
A invenção também se refere aos produtos de expressão do virus, bem como aos anticorpos gerados a partir dos produtos de expressão ou a expressão dos mesmos in vivo e usos para tais produtos e anticorpos, por exemplo, em aplicações de diagnóstico.
Essas e Outras modalidades são divulgadas ou são óbvias a partir de e englobadas pela seguinte Descrição Detalhada.
Breve Descrição dos Desenhos
A seguinte descrição detalhada é dada a título de exemplo, mas não se destina a limitar a invenção apenas às modalidades especificas descritas, pode ser mais bem compreendida juntamente com os desenhos associados, em que:
A figura 1 fornece uma tabela que identifica a SEQ ID NO atribuída à sequência de polinucleotideo e de proteína.
A figura 2 fornece o alinhamento de sequência entre a SEQ ID NO: 2 e a SEQ ID NO: 5.
A figura 3 descreve ós mapas de plasmídeos de pCXLl557.1 e pJ,SY2218.1.
A figura 4 mostra o Southern blot de VCP2263.
A figura 5 mostra o Western blot de VCP2263.
A figura 6 mostra o ensaio de imunoplaca de VCP2263.
A figura 7 mostra o Western blot de VCP2391.
A figura 8 mostra o Western blotde vCP2392.
A figura 9 mostra o Western blot de VCP2391 e VCP2392 para GM-CSF.
A figura 10 mostra o Western blotde vCP2392 para a proteína CDV HA.
A figura 11 fornece os resultados da sorologia de vCP2392 e VCP2263 usando ura teste SN heterólogo.
A figura 12 fornece os resultados da sorologia de VCP2392 e VCP2263 usando um teste SN homólogo.
As figuras 13a e 13b fornecem o alinhamento de sequência das proteínas CDV HA e a porcentagem de identidade de sequência no nível de aminoácido.
A figura 14 fornece o alinhamento de sequências do DNA de CDV HA códon otimizado e DNA de CDV HA tipo selvagem.
As figuras 15a e 15b fornecem o alinhamento de sequência do DNA de CDV HA e a porcentagem de identidade de sequência no nível do DNA.
A figura 16 fornece o resultado da resposta imune celular.
A figura 17 fornece o resultado de ELISA de CPV2.
A figura 18 mostra o resultado do teste de SN homólogo dos anticorpos SN de CDV.
A figura 19 representa o resultado do teste de SN heterólogo dos anticorpos SN de CDV.
Descrição Detalhada da Invenção
As composições que compreendem um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CDV e fragmentos e suas variantes, que eliciam uma resposta imunogênica em um animal, são fornecidas. O vetor de expressão polinucleotideo que codifica o polipeptideo CDV ou fragmentos ou variantes pode ser formulado em vacinas ou composições farmacêuticas e utilizado para eliciar ou estimular uma resposta protetora em um animal. Em uma 5 modalidade, o polipeptideo CDV é um polipeptideo de hemaglutinina (HA) CDV ou fragmento ativo ou variante do mesmo.
As composições que compreendem um vetor de expressão compreendendo um polinucleotideo que codifica um 10 polipeptideo HA de CDV ou fragmentos ativos ou variantes dos mesmos e um polinucleotideo que codifica um polipeptideo GM-CSF ou fragmentos ativos ou variantes dos mesmos são fornecidas.
É reconhecido que os polipeptideos da invenção podem 15 ser polipeptideos de comprimento total ou fragmentos ativos ou variantes dos mesmos. Por "fragmentos ativos' ou "variantes ativas"entende-se que os fragmentos ou variantes retêm a natureza antigènica do polipeptideo. Assim, a presente invenção engloba qualquer polipeptideo 20 CDV, antigeno, epitopo ou imunógeno que elicia uma resposta imunogènica em um animal. O polipeptideo CDV, antigeno epitopo ou imunógeno pode ser qualquer polipeptideo CDV, antigeno, epitopo ou imunógeno, tal como, mas sem se limitar, a uma proteina, peptideo ou fragmento ou variante do mesmo, que elicia, induz ou estimula uma resposta em um animal.
Um polipeptídeo CDV particular de interesse é a hemaglutinina de CDV (HA) . HA CDV refere-se a um tipo de hemaglutinina encontrada na superfície do CDV. Ela é uma glicoproteina antigênica e é responsável pela ligação do vírus à célula que está sendo infectada. Existem diferentes antígenos de HA, associados com as diferentes cepas de CDV que circulam no campo, qualquer uma das quais pode ser usada na prática da invenção. No entanto, existem diferentes antígenos, tais como a glicoproteina de fusão (F) e nucleoproteína (NP) , qualquer um dos quais pode ser Utilizado na prática da invenção. Reconhece-se também que os precursores de qualquer um destes antígenos podem ser usados. Os polipeptídeos antigênicos da invenção são capazes de proteger contra CDV. Isto é, eles são capazes de estimular uma resposta imune em um animal.
O termo "antígeno" ou "imunógeno" designa uma substância que induz uma resposta imune específica em um animal hospedeiro. 0 antígeno pode compreender um organismo inteiro, morto, atenuado ou vivo; uma subunidade ou porção de um organismo; um vetor recombinante contendo uma inserção com propriedades imunogênicas; um pedaço ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune mediante a apresentação a um animal hospedeiro; um polipeptídeo, um epítopo, um hapteno ou qualquer combinação destes. Alternativamente, o imunógeno oü antígeno pode compreender uma toxina ou antitõxina.
Os termos "proteina", "peptídeo", "polipeptídeo" e "fragmento de polipeptídeo" são aqui utilizados de modo intercambiável para se referir aos polímeros de resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados ou análogos de aminoácidos, e ele pode ser interrompido por porções químicas diferentes dos aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação modificação, tal como conjugação com um componente marcador ou bioativo.
O termo "polipeptídeo ou polinucleotídeo HA de CDV"refere-se a qualquer polipeptídeo ou polinucleotídeo HA de CDV natural ou otimizado, e seus derivados e variantes.
O termo "polipeptídeo ou polinucleotídeo de GM-CSF"refere-se a qualquer polipeptídeo ou polinucleotídeo de GM- CSF natural ou otimizado, e seus derivados e variantes.
O termo "polipeptídeo imunogênico ou antigênico", tal como aqui utilizado, inclui polipeptideos que são imunologicamente ativos no sentido de que, uma vez administrados ao hospedeiro, ele é capaz de evocar uma resposta imune humoral e/ou tipo celular direcionado contra a proteina. De preferência, o fragmento de proteina é tal que tem substancialmente a mesma atividade imunológica que a proteina total. Assim, um fragmento de proteina de acordo com a invenção compreende ou consiste essencialmente de, ou consiste de pelo menos um epitopo ou determinante antigênico. Uma proteina ou polipeptideo "imunogênico", tal como aqui utilizado, inclui a sequência de comprimento total da proteina, os seus análogos ou os seus fragmentos imunogênicos. Por "fragmento imunogênico" se entende um fragmento de uma proteina que inclui um ou mais epitopos e, deste modo, elicia a resposta imunológica descrita acima. Tais fragmentos podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epitopos bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por exemplo, os epitopos lineares podem ser determinados, por exemplo, sintetizando ão mesmo tempo grandes quantidades de peptideos em suportes sólidos, os peptideos correspondendo às porções da molécula de proteina, e reagindo os peptideos com os anticorpos, enquanto que os peptídeos estão ainda ligados aos suportes. Tais técnicas sâo conhecidas na arte e estão descritas, por exemplo, na Patente Americana No. 4.708.871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. Da mesma forma, os epitopos conformacionais sâo prontamente identificados por determinação da conformação espacial dos aminoácidos tal como, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, acima.
Como aqui discutido, a invenção engloba fragmentos ativos e variantes do polipeptideo ahtigênico. Deste modo, o termo "polipeptideo imunogênico ou antigênico" contempla ainda eliminações, adições e substituições para a sequência, contanto que o polipeptideo funcione para produzir uma resposta imunológica, tal como definido na presente invenção.
O termo "variação conservative"denota a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente similar, ou a substituição de um nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico de tal modo que o resíduo de aminoácido codificado não seja alterado ou seja outro resíduo biologicamente semelhante. Sob este aspecto, substituições particularmente preferidas serão geralmente de natureza conservative, isto é, aquelas substituições que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos são geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácidos - aspartato e glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, ti.istidi.na; (3) não polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares descarregados - glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são algumas vezes classificados cómô aminoácidos aromáticos. Exemplos de variações conservatives incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por um outro resíduo hidrofóbico, ou a substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico, ou glutamina por asparagina, e similares; ou uma substituição conservative semelhante de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado que não terá um efeito importante sobre a atividade biológica. Proteínas com substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a molécula de referência, porém possuindo substituições de aminoácidos secundárias que não afetam substancialmente a imunogenicidade da proteína estão, portanto, dentro da definição do polipeptídeo de referência. Todos os polipeptídeos produzidos por estas modificações estão aqui incluídos. 0 termo "variação conservative"também inclui o uso de um aminóácido substituído no lugar de um aminoácido de origem não substituído, contanto que anticorpos criados para o 5 polipeptideo substituído também imunorreajam com o polipeptideo não substituído.
O termo "epitopo"refere-se ao sitio em um antigeno ou hapteno ao qual as células B e/ou células T especificas respondem. 0 termo é também utilizado de modo 10 intercambiável com "determinante antigênico" ou "sítio determinante antigênico". Anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo podem ser identificados em um imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antigeno alvo.
Uma "resposta imunológica" para uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo para uma composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma "resposta imunológica" inclui, mas não está limitada, a um 20 ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células T auxiliadoras e/ou células T citotóxicas, direcionadas éspecificamente para um antigeno ou antígenos incluído(s) na composição ou vacina de interesse. De preferência, o hospedeiro irá exibir uma resposta terapêutica ou protetora imunológica de tal modo que a resistência à nova infecção será aumentada e/ou a gravidade clinica da doença será reduzida. Tal proteção será demonstrada por uma redução ou falta de sintomas normalmente apresentados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou um título virai reduzido no hospedeiro infectado. Por "animal" se entende mamíferos, aves e similares. Animal ou hospedeiro, tal como aqui utilizado, incluí mamíferos e seres humanos. O animal pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em equinos (por exemplo, cavalo), caninos (por exemplo, cães, lobos, raposas, coiotes, chacais), felinos (por exemplo, leões, tigres, gatos domésticos, gatos selvagens, outros gatos grandes e outros felinos, incluindo chitas e linces), ovinos (por exemplo, ovelhas), bovinos (por exemplo, gado), suínos (por exemplo, porcos), aves (por exemplo, patos, galinhas, gansos, perus, codornas, faisões, papagaios, tentilhões, falcões, corvos, avestruzes, emas e casuares), primatas (por exemplo, prossímios, társios, macacos, gibões, bugios), furões, focas e peixes. O termo "animal" também inclui um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo os estágios embrionário e fetal.
A não ser que seja explicado de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado que aquele normalmente compreendido por uma pessoa normalmente versada na técnica a que esta divulgação pertence. Os termos singulares "uma", "uma", e "o/a" incluem os referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou"destina-se a incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário.
É observado que, nesta divulgação, e particularmente nas reivindicações e/ou parágrafos, termos tais como "compreende", "compreendido", "compreendendo" e semelhantes podem possuir o significado atribuído a eles na lei de Patentes Norte-Americana; por exemplo, eles podem significar "inclui", "incluído", "incluindo" e similares; e que termos tais como "consistindo essencialmente em" e "consiste essencialmente em" têm o significado que lhes é atribuído na lei de Patentes Norte-Americana, por exemplo, eles permitem elementos não explicitamente citados, mas excluem elementos que se encontram na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção. Composições
A presente invenção refere-se a uma vacina de CDV ou composição que pode compreender um vetor recombinante ou de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo CDV, antigeno, epitopo ou imunógeno, e um veiculo, excipiente, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. O polipeptideo, antigeno, epitopo ou imunógeno CDV pode ser qualquer polipeptideo, 5 antigeno, epitopo ou imunógeno CDV, tal como, mas sem se limitar, a uma proteína, peptídeo ou fragmento do mesmo, que elicia, induz ou estimula uma resposta em um animal.
A presente invenção refere-se a uma vacina de CDV ou composição que pode compreender um vetor recombinante ou de 10 expressão compreendendo um polinucleotideo que codifica um polipeptideo HA de CDV e um veículo, excipiente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em Uma modalidade, o vetor de expressão pode ainda compreender um polinucleotideo que codifica um polipeptideo 15 GM-CSF.
Em outra modalidade, o transportador, excipiente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma emulsão água-em-ólèo. Em ainda outra modalidade, a emulsão água-em-óleo pode ser uma emulsão 20 tripla água/óleo/água (W/O/W). Em ainda outra modalidade, o transportador, excipiente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma emulsão óleo-em-água.
Em uma modalidade, o polipeptideo, antigeno ou fragmento CDV ou variante do mesmo pode ser um polipeptideo HA de CDV ou fragmento ou variante do mesmo. Em um aspecto desta modalidade, o polipeptideo HA de CDV ou fragmento ou variante do mesmo é um polipeptideo recombinante produzido pç>r um gene HA de CDV. Em outro aspecto desta modalidade, o gene HA de CDV tem pelo menos identidade de 70% com a sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49. Em outro aspecto desta modalidade, o polipeptideo HA de CDV ou fragmento ou variante do mesmo tem pelo menos 80% de identidade com a sequência conforme estabelecida na SEQ 1D NO: 2, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34.
Em outra modalidade, o polipeptideo GM-CSF, antígeno ou fragmento ou variante é um polipeptideo recombinante produzido por um gene GM-CSF. Em outro aspecto desta modalidade, o gene GM-CSF tem pelo menos identidade de 70% com a sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto desta modalidade, o polipeptideo GM-CSF ou fragmento ou variante do mesmo tem pelo menos 80% de identidade com a sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 4.
Antígenos sintéticos também. são incluídos na flanqueadores e outros antigenos recombinantes ou sinteticamente derivados. Ver, por exemplo, Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Fragmentos imunogênicos, para os propósitos 5 da presente invenção, incluirão, normalmente, pelo menos cerca de 3 aminoácidos, pelo menos cerca de 5 aminoácidos, pelo menos cerca de 10 a 15 aminoácidos ou cerca de 15 a 25 aminoácidos ou mais aminoácidos da molécula. Não existe um limite superior critico para o comprimento do fragmento, 10 que poderia compreender quase o comprimento total da sequência de proteína, ou mesmo uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um epitopo da proteína. Deste modo, a estrutura mínima de um polinucleotídeo que expressa um epitopo é que ele compreenda ou consista 15 essencialmente de, ou consista de nucleotídeos que codificam um epitopo ou determinante antigênico ou polipeptídeo CDV. Um polinucleotídeo que codifica um fragmento de um polipeptídeo CDV pode compreender ou consistir essencialmente em, ou consistir de um mínimo de 20 15 nucleotídeos, de cerca de 30 a 45 nucleotídeos, de cerca de 45 a 75, ou de pelo menos 75, 87 ou 150 nucleotídeos consecutivos ou contíguos da sequência que codifica o polipeptídeo. Os procedimentos de determinação de epitopo, tais como a geração de bibliotecas de peptídeos sobrepostas (Hemmer et al., 1998), Pepscan (Geysen et al., 1984, Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) e algoritmos (De Groot et al., 1999; PCT/US2004/022605) podem ser usados na prática da invenção.
O termo "ácido nucleico" e "polinucleotideo" referem- se ao RNA ou DNA que ê linear ou ramificado, de fita simples oü dupla, ou um híbrido dos mesmos. O termo também engloba híbridos de RNA/DNA. Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene, éxons, introns, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotideo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nücleotídeo, uracila, outros açúcares e grupos de ligação tais como fluorribose e tiolato, e ramificações de nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos pode ser adiçionalmente modificada após a polimerização, tal como por conjugação, com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluídas nesta definição são capuzes, a substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo e a introdução de meios para ligar o polinucleotideo às proteinas, ions metálicos, componentes de marcação, outros polinucleotideos ou suporte sólido. Os polinucleotideos podem ser obtidos por sintese quimica ou derivados de um microrganismo.
O termo "gene" é utilizado amplamente para se referir a qualquer segmento de polinucleotideo associado com uma função biológica. Assim, os genes incluem introns e éxons como na sequência genômica, Ou apenas as sequências codificadoras, como em cDNAs e/ou as sequências regulatórias necessárias para a expressão destes. Por exemplo, gene também se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa mRNA ou RNA funcional, ou que codifica uma proteina especifica, e que inclui sequências regulatórias.
A invenção compreende ainda uma fita complementar a um polinucleotideo que codifica um antigeno de CDV, epitopo ou imunógeno ou a um polinucleotideo que codifica um antigeno GM-CSF, epitopo ou imunógeno. A fita complementar pode ser polimérica e de qualquer comprimento, e pode conter desoxirribonucleotideos, ribonucleotideos e análogos, em qualquer combinação.
Um componente biológico "isolado" (tal como um ácido nucleico ou proteina ou organela) refere-se a um componente que foi substancialmente separado ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente, por exemplo, outros DNAs e RNAs cromossômicos ou extracromossômicos, proteínas e organelas. Os ácidos nücleicos e proteínas que foram "isolados" incluem os ácidos nücleicos e proteínas purificados por métodos de purificação padrão. 0 termo também abrange ácidos nücleicos e proteínas preparados por tecnologia recombinants, bem como por síntese química.
O termo "purificado", como aqui utilizado, não requer pureza absoluta; mas sim, é concebido como um termo relativo. Assim, por exemplo, uma preparação de polipeptídeo parcialmente purificada é uma em que o polipeptídeo é mais enriquecido do que o polipeptídeo no seu ambiente natural. Isto é, o polipeptídeo é separado dos componentes celulares. Por "substancialmente purificado" se entende que pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% ou mais dos componentes celulares ou material foram removidos. Do mesmo modo, um polipeptídeo pode ser parcialmente purificado. Por "parcialmente purificado" se entende que menos de 60% dos componentes celulares ou material é removido. O mesmo aplica-se aos polinucleotídeos. Os polipeptídeos aqui divulgados podem ser purificados por qualquer dos meios conhecidos na técnica.
Além disso, homólogos dos polipeptideos HA de CDV e homólogos de polipeptideos GM-CSF se destinam a situar-se dentro do escopo da presente invenção. Tal como aqui utilizado, o termo "homólogos" inclui ortólogos, análogos e parálogos. O termo "anólogos"refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptideos que têm função igual ou semelhante, mas que evoluíram separadamente em organismos não relacionados. O termo "ortólogos"refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptideos de espécies diferentes, mas que evoluíram de um gene ancestral comum por especiação. Normalmente, ortólogos codificam polipeptideos com funções iguais ou semelhantes. O termo "parálogos"refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptideos que são relacionados por duplicação dentro de um genoma. Parálogos geralmente têm funções diferentes, mas essas funções podem ser relacionadas. Por exemplo, análogos, ortólogos e parálogos de um polipeptideo CDV tipo selvagem podem diferir do polipeptideo CDV tipo selvagem por modificações pós-trádução, por diferenças de sequências de aminoácidos ou por ambos. Em particular, os homólogos da invenção exibirão geralmente pelo menos, 80 a 85%, 85 a 90%, 90 a 95%, ou 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência, com a totalidade ou parte das sequências de polipeptideo ou polinucleotideo CDV tipo selvagem, e irão exibir uma função semelhante.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um vetor de expressão compreendendo um ou mais polinucleotideos que codificam um ou mais polipeptideos possuindo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptideo possuindo uma sequência tal como estabelecida na SEQ ID NO: 2, 4, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34. Em outra modalidade, a presente invenção fornece fragmentos e variantes dos polipeptideos CDV ou GM- CSF acima identificados (SEQ ID NO: 2, 4, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), que podem ser prontamente preparados por uma pessoa versada na técnica utilizando técnicas de biologia molecular bem conhecidas. As variantes sâo polipeptideos homólogos possuindo sequências de aminoácidos com pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com as sequências de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, 4, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34.
As variantes incluem variantes alélicas. 0 termo "variante alélica" refere-se a um polinucleotideo ou um polipeptídeo contendo polimorfismos que levam a alterações nas sequências de aminoácidos de uma proteína e que existem dentro de uma população natural (por exemplo, uma espécie ou variedade de vírus) . Tais variações alélicas naturais podem tipicamente resultar em 1 a 5% de variância em um polinucleotídeo óu um polipeptídeo. As variantes alélicas podem ser identificadas por sequenciamento da sequência de ácido nucleico de interesse em várias espécies diferentes, que pode ser prontamente realizado pelo uso de sondas de hibridizaçâo para identificar o mesmo locus genético do gene naquelas espécies. Qualquer e todas as tais variações de ácido nucleico e polimorfismos de ácido nucleico resultantes ou variações que são o resultado da variação alélica natural e que não alteram a atividade funcional do gene de interesse, são destinadas a estarem dentro do escopo da invenção.
Tal como utilizado aqui, o termo "derivado" ou "variante"refere-se a um polipeptídeo ou a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, que tem uma ou mais variações de aminoácidos conservativas ou outras modificações secundárias, de modo que (1) o polipeptídeo correspondente tem função substancialmente equivalente em comparação com o polipeptídeo tipo selvagem ou (2) um anticorpo criado contra o polipeptídeo é imunorreativo com o polipeptideo tipo selvagem. Estas variantes ou derivados incluem polipeptideos com modificações secundárias do polipeptideo CDV, ou sequências de aminoácidos primárias GM-CSF que podem resultar em peptideos que possuem atividade substancialmente equivalente em comparação com o polipeptideo da contrapamte não modificada. Tais modificações podem ser deliberadas, como por mutagênese direcionada a sítio, ou podem ser espontâneas. O termo "variante" contempla ainda eliminações, adições e substituições para a sequência, contanto que o polipeptideo funcione para produzir uma resposta imunológica, tal como definido no presente documento.
Um fragmento imunogênico de um polipeptideo CDV ou polipeptideo GM-CSF inclui, pelo menos, 8, 10, 13, 14, 15 ou 20 aminoácidos consecutivos, pelo menos 21 aminoácidos, pelo menos 23 aminoácidos, pelo menos 25 aminoácidos ou pelo menos 30 aminoácidos de um polipeptideo HA de CDV com uma sequência tal como estabelecida na SEQ ID NO: 2, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34 ou as suas variantes, ou de. um polipeptideo GM-CSF possuindo uma sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 4 ou variantes das mesmas.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um vetor de expressão compreendendo um polinucleotideo que codifica um polipeptideo HA de CDV, tal como um polinucleotideo que codifica um polipeptideo possuindo uma sequência tal como estabelecida na SEQ ID NO: 2, 5, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um vetor de expressão compreendendo um polinucleotideo que codifica um polipeptideo possuindo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptideo possuindo uma sequência tal como estabelecida na SEQ ID NO: 2, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34, ou uma sua variante conservative, uma variante alélica, um homólogo ou um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos de um destes polipeptideos, ou uma combinação destes polipeptideos.
Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um vetor de expressão compreendendo um polinucleotideo que codifica um polipeptideo GM-CSF, tal como um polinucleotideo que codifica um polipeptideo possuindo uma sequência tal como estabelecida na SEQ ID NO: 4. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um vetor de expressão compreendendo um polinucleotideo que codifica um polipeptideo possuindo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo possuindo uma sequência tal como estabelecida na SEQ ID NO: 4, ou uma sua variante conservative, uma variante alélica, um homólogo ou um fragmento imunogênico compreendendo, pelo menos, oito ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos de um destes polipeptídeos, ou uma combinação destes polipeptídeos.
Em uma modalidade, o polinucleotídeo da presente invenção inclui um polinucleotídeo possuindo uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 19, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49, ou uma variante da mesma. Em outra modalidade, o polinucleotídeo da presente invenção inclui um polinucleotídeo possuindo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um de um polinucleotídeo possuindo uma sequência tal como estabelecida na SEQ ID NO: 1, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 19, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49, ou uma variante da mesma.
Os polinucleotídeos da presente divulgação incluem sequências que são degeneradas como resultado do código genético, por exemplo, uso de códon otimizado para um hospedeiro específico. Como usado aqui, "otimizado"refere- se a um polinucleotideo que é geneticamente modificado para aumentar a sua expressão em uma determinada espécie. Para fornecer polinucleotídeos otimizados que codificam polipeptideos HA de CDV ou polipeptideos GM-CSF, a sequência de DNA do gene HA de CDV ou gene GM-CSF pode ser modificada para 1) compreender os códons preferidos por genes altamente expressos em uma espécie em particular, 2) compreender um conteúdo de A + T ou G + C em composição de bases de nucleotídeo com aquele substancialmente encontrado na dita espécie; 3) formar uma sequência de iniciação da dita espécie; ou 4) eliminar as sequências que causam desestabilização, poliadenilação, degradação e terminação inapropriada de RNA, ou que formam grampos de estrutura secundária ou sítios de união de RNA. A expressão aumentada da proteína HA de CDV ou da proteína GM-CSF na dita espécie pode ser alcançada através da utilização da frequência de distribuição do uso de códons em eucariotos e procariotos, ou em uma espécie particular. O termo "frequência de uso de códons preferenciais"refere-se à preferência exibida por uma célula hospedeira especifica no uso dos códons de nucleotídeo para especificar um determinado aminoácido. Existem 20 aminoácidos naturais, a maioria dos quais são especificados por mais do que um códon. Portanto, todas as sequências de nucleotideo degeneradas estão incluídas na divulgação, contanto que a sequência de aminoácidos do polipeptideo HA de CDV ou do polipeptideo GM-CSF codificada pela sequência de nucleotídeos seja funcionalmente inalterada.
A identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos pode ser estabelecida pela matriz blast e blosum62 em pares do NCBI (National Center for Biotechnology Information), usando os parâmetros padrões (ver, por exemplo, o algoritmo BLAST ou BLASTX disponível no servidor de "National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, Maryland, EUA), bem como em Altschul et al.).
A "identidade", em relação às sequências, pode referir-se ao número de posições com nucleotídeos ou aminoácidos idênticos dividido pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos na mais curta das duas sequências, em que o alinhamento das duas sequências pode ser determinado de acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur e Lipman), por exemplo, utilizando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos, e uma penalidade de intervalo de 4, e análise auxiliada por computador e interpretação dos dados da sequência incluindo utilizando programas comercialmente disponiveis (por exemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA) . Quando sequências de RNA são referidas como sendo semelhantes, ou possuem um grau de identidade de sequência ou de homologia com as sequências de DNA, timidina (T) na sequência de DNA é considerada igual à uracila (U) na sequência de RNA. Assim, sequências de RNA estão dentro do escopo da invenção, e podem ser derivadas das sequências de DNA por timidina (T) na sequência de DNA sendo considerada igual à uracila (U), nas sequências de RNA.
A identidade de sequência ou similaridade de sequência de duas sequências de aminoácidos, ou a identidade de sequências entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada usando o pacote de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).
Os documentos a seguir fornecem algoritmos para comparação da identidade ou homologia relativa de sequências, e adicionalmente ou em alternativa em relação ao precedente, ós ensinamentos nestas referências podem ser usados para determinar a homologia ou identidade porcentual: Needleman SB e Wunsch CD, Smith TF e Waterman MS; Smith TF, Waterman MS e Sadler JR; Feng DF e Dolittle RF; Higgins DG e Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG e Gibson TJ; e Devereux J, Haeberlie P e Smithies O. E, sem experimentação demasiada, o profissional versado na técnica pode consultar com muitos outros programas ou referências para determinar a homologia porcentual.
As reações de hibridização podem ser realizadas sob condições de diferentes "severidades". Condições que aumentam a severidade de uma reação de hibridização são bem conhecidas. Ver, põr exemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et al., 1989).
A invenção engloba o polinucleotideo CDV ou o polinucleotideo GM-CSF ou ambos contidos em uma molécula de vetor ou um vetor de expressão e operativamente ligados a um elemento promotor e, opcionalmente, a um intensificador.
A presente invenção engloba ainda uma vacina ou Composição canina que pode compreender um vetor recombinante anteriormente mencionado compreendendo um polipeptideo que codifica um polipeptideo HA de CDV ou antigeno e um polinucleotideo que codifica um polipeptideo GM-CSF ou antigeno, um transportador, excipiente, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, e, adicionalmente, um ou mais antigenos de canino. A presente invenção também faz referência a uma vacina canina ou composição que pode compreender um vetor recombinante ou de expressão acima mencionado, que compreende um polinucleotideo que codifica um polipeptideo GM-CSF, um transportador, excipiente, adjuvante ou veiculo farmaceüticamenté ou veterinariamente aceitável, e adicionalmente um ou mais antígenos do canino. O antígeno pode ser o antígeno canino selecionado a partir do grupo consistindo de raiva, parvovirus canino, coronavirus canino, influenza canino, raiva canina, hepatite canina infecciosa, herpesvirus canino, pseudorraiva, vírus minute canino, Leptospira, Neospora caninum, Borrelia burgdorferi, Ehrlichia canis , Rickettsia rickettsíi , Bordetella bronchi séptica, Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformáns , Mi crosporum canis, Sporothrix schenckii, Aspergillus fumigatus e P. insidiosum. O antígeno pode compreender um organismo inteiro, morto, atenuado ou vivo; uma subunidade ou parte de um organismo; um vetor recombinante contendo uma inserção com propriedades imunogênicas; uma parte ou um fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune mediante a apresentação a um animal hospedeiro; um polipeptideo, um epitopo, um hapteno ou qualquer combinação destes.
Um. "vetor"refere-se a um plasmideo de DNA ou RNA recombinante ou vírus que compreende um polinucleotideo heterólogo a ser administrado a uma célula alvo, quer in vitroou in vivo. O polinucleotideo heterólogo pode compreender uma sequência de interesse para fins de prevenção ou terapia, e pode opcionalmente estar sob a forma de um cassete de expressão. Como aqui utilizado, um vetor não precisa ser capaz de se replicar na célula-alvo ou indivíduo final. O termo inclui vetores de clonagem e vetores virais.
O termo "recombinante" significa um polinucleotideo com origem semissintética ou sintética que não ocorre na natureza ou está ligado a outro polinucleotideo em uma disposição não encontrada na natureza. "Heterólogo" significa derivado de uma entidade geneticamente distinta do restante da entidade a que ele está sendo comparado. Por exemplo, um polinucleotideo pode ser colocada por meio de técnicas de engenharia genética em um plasmideo ou vetor derivado de uma fonte diferente, e é um polinucleotideo heterólogo. Um promotor removido da sua sequência de codificação nativa e operativamente ligado a uma sequência codificadora diferente da sequência nativa é um promotor heterólogo.
Os polinucleotídeos da presente invenção podem compreender sequências adicionais, tais como sequências codificantes adicionais dentro da mesma unidade de transcrição, elementos de controle, tais como promotores, sítios de ligação de ribossomo, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, unidades de transcrição adicionais sob o controle de um promotor igual ou diferente, sequências que permitem a clonagem, expressão, recombinação homóloga e transformação de uma célula hospedeira, e qualquer tal construct© conforme possa ser desejável para fornecer modalidades desta invenção.
Elementos para a expressão de um polipeptídeo HA de CDV, antígeno, epitopo ou imunógeno ou um polipeptídeo GM- CSF estão presentes em um vetor da invenção. Na forma mínima, isto compreende um códon de iniciação (ATG), um códon de parada e um promotor, e também opcionalmente uma sequência de poliadenilação para certos vetores, tais como plasmideos e certos vetores virais, por exemplo, vetores virais diferentes de poxvirus. Quando o polinucleotídeo codifica um fragmento de polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo HA de CDV, no vetor, um ATG é colocado em 5' da estrutura de leitura e um códon de parada é colocado em 3' . Outros elementos para o controle da expressão podem estar presentes, tais como sequências intensificadoras, sequências de estabilização, tais como sequências de intron e de sinal, permitindo a secreção da proteína.
A presente invenção também se refere às composições ou vacinas que compreendem vetores. A composição ou vacina pode compreender um ou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão, tais como vetores de expressão in vivo, compreendendo e expressando um ou mais antigenos, epitopos, imunógenos ou polipeptideos HA de CDV ou GM-CSF. Em uma modalidade, o vetor contém e expressa um polinucleotideo que compreende um polinucleotideo que codifica para e/ou que expressa um antigeno HA de CDV, epitopo ou imunógeno, em um transportador, excipiente, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Deste modo, de acordo com uma modalidade da invenção, o outro vetor ou vetores na preparação compreende, consiste essencialmente em ou consiste de um polinucleotideo que codifica, e sob circunstâncias apropriadas o vetor expressa uma ou mais outras proteinas de um polipeptideo, antigeno, epitopo ou imunógeno HA dé CDV (por exemplo, hemaglutinina, neuraminidase, nucleoproteina) ou um fragmento da mesma.
De acordo com outra modalidade, o vetor ou vetores na composição ou vacina compreende, ou consiste essencialmente de, ou consistir de polinucleotideo(s) que codifica(m) uma ou mais proteinas ou fragmento(s) de um polipeptideo, antigeno, epitopo ou imunógeno HA de CDV, ou um polipeptideo, antigeno, epitopo ou imunógeno de GM-CSF, ou uma combinação destes. Em outra modalidade, a composição ou vacina compreende um, dois ou mais vetores que compreendem polinücléotideos que codificam e expressam, vantajosamente in vivo,um polipeptídeo HA de CDV, proteína de fusão ou urn epitopo do mesmo. A invenção é também direcionada para misturas de vetores que compreendem polinucleotídeos que codificam e expressam diferentes polipeptídeos, ahtígenos, 5 epítopos, proteína de fusão ou imunógenos HA de CDV, por exemplo, um polipeptídeo, antígeno, epitopo ou imunógeno HA de CDV de espécies diferentes, tais como, mas sem se limitar, a seres humanos, porcos, vacas ou gado, cães, gatos e aves.
Na presente invenção, um vetor virai recombinante é utilizado para expressar uma sequência codificadora de CDV ou fragmentos da mesma que codificam um polipeptídeo CDV ou fragmento ou variante do mesmo. Especificamente, o vetor virai pode expressar uma sequência CDV, mais especificamente um gene HA de CDV ou um fragmento da mesma que codifica um polipeptídeo antigênico. O vetor virai aqui contemplado inclui, mas não se limita, ao poxvirus [por exemplo, vírus vaccinia ou vírus vaccinia atenuado, vírus avipox ou vírus avipox atenuado (por exemplo, canarypox, 20 fowlpox, dovepox, pigeonpox, quailpox, ALVAC, TROVAC; ver, por exemplo, US 5.505.941, US 5.494.8070), vírus raccoonpox, vírus swinepox, etc.], adenovirus (por exemplo, adenovirus humano, adenovirus canino), vírus da herpes herpesvirus felino, herpesvirus bovino, herpesvirus suíno), baculovírus, retrovirus, etc. Em outra modalidade, o vetor de expressão avipox pode ser um vetor canarypox, tal como ALVAC. Em ainda outra modalidade, o vetor de expressão avipox pode ser um vetor fowlpox, tal como TROVAC. O polipeptideo, antigeno, epitopo ou imunógeno de CDV pode ser Um HA de CDV. Por exemplo, os vetores poxvirus que compreendem o HA de CDV podem ser vetores como descritos em US 5.756.102. O polipeptideo ou antigeno HA de CDV da invenção a ser expresso é inserido sób o controle de um promotor de poxvirus específico, por exemplo, o promotor vaccinia de 7,5 KDa (Cochran et al., 1985), o promotor de vacina I3L (Riviere et al. , 1992), o promotor vaccinia HA (Shida, 1986), o promotor cowpox ATI (Fünaháshi et al., 1988), o promotor vaccinia H6 (Taylor et al, 1988b; Guo et al., 1989; Perkus et al. , 1989), inter alia.
Ainda de acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, o vetor de expressão é um vetor de plasmideo, em particular um vetor de expressão in vivo. Em um exemplo especifico não limitativo, o plasmideo pVR1020 ou 1012 (Vical Inc.; Lucas et al., 1997; Hartikka et al., 1996, ver, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas Nos. 5.846.946 e 6.451.769) pode ser utilizado como um vetor para a inserção de uma sequência de polinucleotideo. O plasmideo pVRlOSO é derivado de pVR1012 e contém a sequência de sinal tPA humana. Em uma modalidade, o sinal tPA humano compreende do aminoácido M (1) até o aminoácido S (23) do número de acesso GenBank HUMTPA14. Em outro 5 exemplo especifico não limitativo, o plasmideo utilizado como um vetor para a inserção de uma sequência de polinucleotideo pode conter a sequência de peptideo de sinal de equino IGF1 do aminoácido M (24) até o aminoácido A (48), do número de acesso GenBank U28070. Informações 10 adicionais sobre ós plasmidéõs de DNA que podem ser consultados ou utilizados na prática são encontrados, por exemplo, nas Patentes Norte-Americanas Nós. 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473 e 6.221.362. As vacinas à base de 15 plasmideo de DNA expressando antigenos CDV podem ser encontradas no Pedido de Patente Norte-Americano ÜSSN 09/587.964. !>
O termo plasmideo. abrange qualquer unidade de transcrição de DNA que compreende um polinucleotideo de 20 acordo com a invenção e os elementos necessários para a sua expressão in vivo em uma célula ou células do hospedeiro ou alvo desejado; e, sob este respeito, é observado que um plasmideo superenrolado ou não superenrolado, assim como uma forma linear, destina-se a estar dentro do escopo da invenção.
Cada plasmideo compreende ou contém ou consiste essenciaImente de, além do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, antígeno, epitopo ou imunógeno HA de CDV, opcionalmente fundido com uma sequência de peptídeo heteróloga, variante, análogo ou fragmento, operativamente ligado a um promotor ou sob o controle de um promotor ou dependente de um promotor dependente. Em geral, é vantajoso utilizar um promotor funcional forte em células eucarióticas. 0 promotor forte pode ser, mas não se limita, a um promotor de citomegalovírus inicial imediato (CMV-IE) de origem humana ou murino, ou opcionalmente possuindo outra origem, como rato ou porquinho-da-índia.
Em termos mais gerais, o promotor tem origem virai ou celular. Um promotor viral forte diferente de CMV-IE, que pode ser utilmente empregado na prática da invenção, é o promotor inicial/tardio do virus SV40 ou o promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous. Um promotor celular forte que pode ser utilmente empregado na prática da invenção é o promotor de um gene do citoesqueleto, tal como, por exemplo, o promotor da desmina (Kwissa et al., 2000), ou o promotor da actina (Miyazaki et al., 1989).
Como para o sinal de poliadenilação (poli A), para os plasmídeos e vetores virais diferentes de poxvirus, pode ser feito uso do sinal poli (A) do gene do hormônio de crescimento bovino (bGH) (ver US 5.122.458), ou o sinal poli (A) do gene da β-globina de coelho ou o sinal poli (A) do virus SV40.
Dma "célula hospedeira" designa uma célula procariótiça ou eucariótica que foi geneticamente modificada, ou que é capaz de ser geneticamente alterada pela administração de um polinucleotideo exógeno, tal como um vetor ou plasmideo recombinante. Ao se referir às células geneticamente alteradas, o termo refere-se tanto à célula originalmente alterada quanto à sua progenia.
Métodos de uso e Artigo de Fabricação
A presente invenção inclui as seguintes modalidades de método. Em uma modalidade, um método de vacinação de um animal qúe compreende administrar a composição que compreende um vetor compreendendo um polinucleotideo que codifica um polipeptideo HA de CDV ou fragmento ou variante do mesmo, e um transportador, excipiente, veiculo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável a um animal é divulgado. E um aspecto desta modalidade, o animal é uma ave, um equino, um canino, um felino, um furão, uma foca ou um suino.
Em outra modalidade, um método de vacinação de um animal que compreende uma composição que compreende um vetor compreendendo um polinucleotideo que codifica um polipeptideo HA de CDV e um polinucleotideo que codifica um polipeptideo GM-CSF e um transportador, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente 5 aceitável e uma ou mais composições compreendendo antigenos caninos é divulgado.
Em ainda outra modalidade, um método de vacinação de Um animal que compreende uma composição que compreende um vetor compreendendo um polinucleotideo que codifica um 10 polipeptideo GM-CSF e um transportador, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e uma ou mais composições que compreendem antigenos caninos é divulgado.
Em uma modalidade da invenção, um regime de indução e 15 reforço pode ser utilizado, o qual é compreendido por pelo menos uma administração primária e pelo menõs uma administração de reforço usando pelo menos um polipeptideo, antigeno, epitopo ou imunógeno comum. A administração pode compreender uma, duas ou mais vacinas ou composições 20 compreendendo antigenos iguais ou diferentes. Tipicamente, a(s) composição/composições imunológica(s) ou vacina (s) utilizada(s) na administração primária tem natureza diferente daquelas utilizadas como reforço. No entanto, é observado que a(s) mesma(s) composição/composições pode(m) ser usada (s) como a administração primária e a administração de reforço. Este protocolo de administração é chamado de "indução e reforço".
Um regime de indução e reforço compreende pelo menos uma administração inicial e pelo menos uma administração de reforço usado pelo menos um polipeptídeo comum e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos. A administração inicial pode compreender uma ou mais administrações. De modo semelhante, a administração de reforço pode compreender uma ou mais administrações. A administração inicial pode compreender um ou mais antigenos e a administração de reforço pode compreender um ou mais antigenos.
Em um aspecto do protocolo ou regime de indução e reforço da invenção, um protocolo de indução e reforço pode compreender a administração de uma composição que compreende um vetor viral recombinante que Contém e expressa um polipeptídeo HA de CDV, antigeno e/ou variantes ou fragmentos do mesmo in vivo, seguido pela administração de um polipeptídeo ou antigeno HA de CDV recombinante, ou uma composição virai inativada ou vacina compreendendo o polipeptídeo HA de CDV ou antigeno, ou uma composição à base de plasmídeo de DNA ou vacina expressando o polipeptídeo HA de CDV ou antigeno. Da mesma forma, um protocolo de indução e reforço pode compreender a administração de uma composição que compreende um antígeno HA de CDV recombinante, ou uma composição virai inativada ou vacina compreendendo o polipeptideo HA de CDV ou antígeno, ou um composição à base de plasmideo de DNA ou vacina expressando o polipeptideo HA de CDV ou o antígeno seguindo pela administração de um vetor virai recombinante que contém e expressa um polipeptideo HA de CDV ou antígeno e/ou variantes ou fragmentos do mesmo in vivo. É ainda observado que as administrações primária e secundária podem compreender o vetor virai recombinante que contém e expressa um polipeptideo HA de CDV da invenção. Deste modo, o vetor virai CDV recombinante da invenção pode ser administrado em qualquer ordem com um antígeno CDV recombinante, uma composição virai inativada ou vacina que compreende o antígeno CDV, ou a composição baseada em plasmideo de DNA ou vacina que expressa o antígeno CDV, ou, alternativamente, pode ser usado sozinho como as composições tanto primária quanto secundária. volume de dose das composições para espécies alvo que são mamíferos, por exemplo, o volume de dose das composições para cães, com base em vetores virais, por exemplo, composições baseadas em vetores virais diferentes de poxvirus, é geralmente entre cerca de 0,1 até cerca de 2,0 mL, entre cerca de 0,1 até cerca de 1,0 mL, e entre cerca de 0,5 mL até cerca de 1,0 rtiL.
A eficácia das vacinas pode ser testados em cerca de 2 a 4 semanas após a última imunização pelo desafio de animais, como cães, com uma cepa virulenta de CDV. Cepas tanto homólogas quanto heterólogas são usadas para o desafio para testar a eficácia da vacina. O animal pode ser desafiado por via oral, por injeção IV ou por inoculação IC. Para cada cepa desafio diferente e cada via de administração utilizada, o vírus está em um título suficientemente elevado para induzir sintomas clínicos em animais não vacinados. O volume do vírus de desafio é de cerca de 0,5 a 2,0 ml. Os animais podem ser observados durante 21 a 42 dias após o desafio para sinais clínicos tais como conjuntivite, rinite, diarreia, vômito, depressão, desidratação, hipertermia, pneumonia, ataxia, mioclono, hiperestesia, paralisia, paresia, convulsões, sintomas oculares (tais como queratoconjuntivite, coriorretinite) e neurite ótica. Durante o desafio, pode-se retirar amostras de sangue dos animais para contagem sanguínea completa e estudos de sorologia (presença de anticorpos específicos para CDV). Além disso, PCR pode ser realizado em amostras de urina, lágrimas, saliva, fezes e sangue. antigênicos recombinantes da invenção utilizadas nos protocolos de indução e reforço estão contidas em um veiculo, adjuvante, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Òs protocolos da invenção protegem o animal de CDV e/ou previnem a progressão da doença em um animal infectado.
As várias administrações são realizadas, preferencialmente, com intervalos de 1 a 6 semanas. O intervalo de tempo preferido é de 3 a 5 semanas, e otimamente de 4 semanas. De acordo com uma modalidade, um reforço anual é também previsto. Os animais, por exemplo cachorros, podem ser de pelo menos 8 semanas de idade no momento da primeira administração.
Deve ser compreendido por uma pessoa versada na técnica que a presente divulgação é fornecida a título de exemplo e que a presente invenção não está limitada a isto. A partir da presente divulgação e do conhecimento da técnica, o profissional versado na técnica pode determinar o número de administrações, a via de administração e as doses a serem utilizadas para cada protocolo de injeção, sem qualquer experimentação excessiva.
A presente invenção contempla, pelo menos, uma administração a um animal de uma quantidade eficaz da composição terapêutica feita de acordo com a invenção. O animal pode ser macho, fêmea, fêmea grávida e recém- nascido. Esta administração pode ser através de várias vias incluindo, mas sem se limitar, às vias de injeção intramuscular (IM), intradérmica (ID) ou subcutânea (SC) de injeção ou através de administração intranasal ou oral. A composição terapêutica de acordo com a invenção também pode ser administrada por um aparelho sem agulha (como, por exemplo, com um aparelho Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, EUA), ou Vetjet Vitajet (Bioject, Oregon, EUA)). Outra abordagem para a administração de composições de plasmideo é a utilização de eletroporação (ver, por exemplo, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; Pedido PCT No. WO99/O1158). Em outra modalidade, a composição terapêutica é fornecida ao animal por pistola de gene ou bombardeamento de partículas de ouro. Em uma modalidade vantajosa, o animal é um cão, furão ou foca.
Em uma modalidade, a invenção proporciona a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação para õ fornecimento e expressão de um antígeno ou epitopo de CDV em uma célula alvo. A determinação da quantidade terapeuticamente eficaz é experimentação de rotina para uma pessoa normalmente versada na técnica. Em uma modalidade, a formulação compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que expressa um antigeno ou epitopo de CDV e um transportador, veículo, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em outra modalidade, o transportador, veículo, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável facilita a transfécção ou infecção e/ou melhora a preservação do vetor ou proteína em um hospedeiro.
Em uma modalidade, a presente invenção proporciona a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição para a distribuição e expressão de um polipeptídeo HA de CDV ou antigeno ou epitopo em uma célula alvo. A determinação da quantidade terapeuticamente eficaz é experimentação rotineira para uma pessoa normalmente versada na técnica. Em uma modalidade, a composição compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que expressa um polipeptídeo HA de CDV ou antigeno ou epitopo e um transportador, adjuvante, veículo óu excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em outra modalidade, o transportador, veiculo, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável facilita a transfécção ou infecção e/ou melhora a conservação do vetor ou da proteína.
Os transportadores ou veículos ou excipientes ou adjuvantes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos para as pessoas versadas na técnica. Por exemplo, um transportador ou veiculo ou excipiente ou 5 adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma solução de NaCl 0,9% (por exemplo, solução salina) ou um tampão fosfato. Outro transportador ou veiculo ou excipiente ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável que pode ser usado para os 10 métodos desta invenção incluem, mas não estão limitados, a poli-(L-glutamato) ou polivinilpirrolidona. O transportador ou veiculo ou excipiente ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilitam a administração do 15 vetor (ou proteína expressa a partir de um vetor da invenção in vitro); vantajosamente, o transportador, veículo ou excipiente ou adjuvante pode facilitar a transfecção e/ou melhorar a conservação do vetor (ou proteína). As doses e os volumes de dose são aqui discutidos na descrição geral e também pode ser determinados pela pessoa versada na técnica a partir desta divulgação, juntamente com o conhecimento na técnica, sem qualquer experimentação excessiva.
Os lipídeos catiônicos que contêm um sal de amónio quaternário, que são vantajosamente, mas não exclusivamente adequados para plasmídeos, são aqueles possuindo a seguinte fórmula:
Figure img0001
em que RI é um radical alifátiço de cadeia linear saturado ou insaturado com de 12 a 18 átomos de carbono, R2 ê outro radical alifátiço contendo 2 ou 3 átomos dé carbono e X é um grupo amina ou hidroxila, por exemplo, DMRIE. Em outra modalidade, o lipideo catiônico pode ser associado com um lipídeo neutro, por exemplo, DOPE.
Entre estes lipídeos catiônicos, é dada preferência ao DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3- bis(tetradécilóxi)-1-propano amónio; WO96/34109), vantajosamente associado com um lipídeo neutro, vantajosamente DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.
Quando DOPE está presente, a razão molar de DMRIE:DOPE é, vantajosamente, de cerca de 95: cerca de 5 até cerca de 5:cerca de 95, mais vantajosamente cerca de 1:cerca de 1, por exemplo, 1:1.
Em outra modalidade, o transportador, excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma emulsão água-em-óleo. Exemplos de emulsões água-em-óleo incluem emulsões de vacina água-em- óleo de base oleosa que são estáveis e fluido a 4 °C contendo: de 6 a 50% v/v de uma fase aquosa contendo antigeno, de preferência de 12 a 25% v/v, de 50 a 94% v/v de uma fase oleosa contendo, no total ou em parte, um óleo não metabolizável (por exemplo, óleo mineral, tal como óleo de parafina) e/ou óleo metabolizável (por exemplo, óleo vegetal, ou ácido graxo, poliol ou ésteres de álcool), de 0,2 a 20% p/v de tensoativos, de preferência de 3 a 8% p/v, sendo este último, no total ou em parte, ou em uma mistura de ésteres de poliglicerol, os ditos ésteres de poliglicerol sendo de preferência (poli)ricinoleatos de poliglicerol, ou óleos de polioxietileno rícino ou outros óleos de polioxietileno rícino hidrogenados. Exemplos de tensoativos que podem ser utilizados em uma emulsão água- em-óleo incluem ésteres de sorbitano etoxilados (por exemplo, monoleato de polioxietileno (20) sorbitano (Tween 80®), disponível junto à AppliChem, Inc., Cheshire, CT) e ésteres de sorbitano (por exemplo, monoleato de sorbitano (SPAN 80®), disponível junto à Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Além disso, no que diz respeito a uma emulsão água-em- óleo, ver também US 6.919.084. Em algumas modalidades, a fase aqüosa contendo antigeno compreende uma solução salina compreendendo um ou mais agentes tamponantes. Um exemplo de uma solução tampão adequado é salina tamponada com fosfato. Em uma modalidade, a emulsão água-em-óleo pode ser uma emulsão tripla água/óleo/água (W/O/W) (US 6.358.500). Exemplos de outras emulsões adequadas são descritas em US 7.371.395.
As composições imunológicas e vacinas de acordo com a invenção podem compreender ou consistir essencialmente de um ou mais transportadores, excipientes, veiculos ou adjuvantes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis. Os adjuvantes adequados para uso na prática da presente invenção são: (1) polimeros de ácido acrílico ou metacrílico, anidrido maleico e polímeros derivados de alquenila, (2) sequências imunoestimulantes (ISS), tais como sequências de oligodesoxirribonucleotídeos com uma ou mais unidades CpG não metiladas (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) uma emulsão óleo em água, tal como a emulsão SPT descrita na página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 do mesmo trabalho, (4) lipídeos catiônicos contendo um sal de amónio quaternário, por exemplo, DDA (5) citocinas, (6) hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, (7) saponina ou (8) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado por referência no presente pedido, ou (9) todas as combinações ou misturas dos mesmos.
A emulsão óleo em água (3) , que é especialmente apropriada para vetores virais, pode basear-se: óleo de parafina líquida leve (tipo farmacopeia europeia), óleo isoprenoide tal como esqualano, esqualeno, óleo resultante da oligomerização de alquenos, por exemplo, isobutenó ou deceno, ésteres de ácidos ou de álcoois que têm um grupo alquila de cadeia linear, tais como óleos vegetais, oleato de etila, propilenoglicol, di(caprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerol e dioleato de propilenoglicol, ou ésteres de ácidos ou álcoois graxos ramificados, especialmente ésteres do ácido isoesteárico. óleo é usado juntamente com emulsifiçantes para formar uma emulsão. Os emulsificantes podem ser tensoativos não iônicos, tais como: ésteres, por um lado, de sorbitano, manida (por exemplo, oleato de anidromanitol), glicerol, poliglicerol ou propilenoglicol e, por outro: lado, ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico ou hidroxiesteárico, os ditos ésteres sendo opcionalmente etoxilados, ou blocos de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, como Pluronic, por exemplo, L121.
Entre os polímeros adjuvantes tipo (1), é dada preferência aos polímeros de ácido acrílico ou metacrilico reticulado, especialmente reticulados por éteres de polialquenila de açúcares ou poliálcoõis. Estes compostos são conhecidos sob o nome de carbômero (Pharmeuropa, vol. 8, n° 2, junho de 1996). Uma pessoa versada na técnica pode também referir-se à US 2.909.462, que fornece tais polímeros acrílicos reticulados por um composto poliidroxila possuindo pelo menos três grupos hidroxila, de preferência não mais do que oito tais grupos, os átomos de hidrogênio de pelo menos três grupos hidroxila sendo substituídos por radicais insaturados, alifáticos possuindo pelo menos dois átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, grupos vinila, alila e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem também conter outros substituintes, tais como metila. Os produtos vendidos sob o nome Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EUA), são especialmente adequados. Eles são reticulados por alilsacarose ou por alilpentaeritritol. Entre estes, é feita referência ao Carbopol 974P, 934P e 971P.
Tal como para os copolímeros derivados de anidrido maleico-alquenila, é dada preferência aos EMA (Monsanto), que são copolímeros de etileno-anidrido maleico de cadeia linear ou reticulados e que são, por exemplo, reticulados por éter divinílico.
Em relação à estrutura, os polímeros do ácido acrílico ou metacrílico e EMA sâo de preferência formados por unidades básicas com. a seguinte fórmula:
Figure img0002
em que: RI e R2, que podem ser iguais ou diferentes, representam H ou CH3 - x = 0 ou 1, de preferência x = 1 - y - 1 ou 2, com x + y = 2. Para EMA, x - 0 e y = 2 e para os carbômeros, x = y - 1.
Estes polímeros são solúveis em água ou em solução salina fisiológica (20 g/L de NaClj e o pH pode ser ajustado para 7,3 a 7,4, por exemplo, por soda (NaOH), para fornecer a solução de adjuvante em que o(s) vetor (es) de expressão pode(m) ser incorporado(s). A concentração de polímero na composição imunológica ou vacina final pode variar entre cerca de 0,01 a cerca de 1,5% p/v, cerca de 0,05 a cerca de 1% p/v, e cerca de 0,1 a cerca de 0,4% p/v.
A citocina ou citocinas (5) pode(m) estar na forma de proteína na composição imunológica ou de vacina, ou pode(m) ser coexpressas no hospedeiro com o imunógeno ou imunógenos ou epitopo(s) da(s) mesma(s). Preferência é dada para a coexpressão da citocina ou citocinas, pelo mesmo vetor que aquele expressando o imunógeno ou imunógenos ou seu(s) epitopo(s), ou por um vetor separado do mesmo.
A invenção compreende a preparação de tais composições de combinação; por exemplo por mistura dos componentes ativos, vantajosamente èm conjunto e com um adjuvante, transportador, citocina e/ou diluente.
As citocinas que podem ser utilizadas na presente invenção incluem, mas não estão limitadas, ao fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito/macrófago (GM-CSF), interferon α (IFN.α), interferon β (IFN.β), interferon y (IFN.y), interleucina-lα (IL-l.α), interleucina-10β (IL- l.β), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina- 6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina-11 (IL-11), interleucina-12 (IL-12), fator de necrose tumoral α (TNFα), fator de necrose tumoral β (TNF.β) e fator de crescimento transformador β (TGF.β). Entende-se que as citocinas podem ser coadminístradas e/ou sequencialmente administradas com a composição imunológica ou vacina da presente invenção. Deste módo, por exemplo, a vacina da presente invenção também pode conter uma molécula de ácido nucleico exógena que expressa in vivo uma citocina adequada, por exemplo, uma citocina correspondente a esse hospedeiro a ser vacinado, ou em que uma resposta imunológica é para ser eliciada (por exemplo, uma citocina canino para preparações a serem administradas a cães).
A invenção será agora adicionalmente descrita por meio dos seguintes exemplos não limitantes.
EXEMPLOS
Sem elaboração adicional, acredita-se que uma pessoa versada na técnica pode, utilizando as descrições anteriores, praticar a presente invenção até a sua máxima extensão. Os exemplos detalhados a seguir devem ser interpretados como meramente ilustrativos, e não como limitações da divulgação anterior, de qualquer modo que seja. As pessoas versadas na técnica reconhecerão prontamente variações apropriadas dos procedimentos tanto quanto aos reagentes como quanto às condições e técnicas reacionais.
A construção de inserções de DNA, plasmideos e vetores virais recombinantes ou de plantas foi realizada utilizando as técnicas de biologia molecular padrão descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 5 Nova Iorque, 1989).
Exemplo 1 Construção do plasmideo contendo CDV HA - pC5 H6 CDV HA, pCXL1557.1,
O plasmideo contendo gene HA de CDV códon otimizado (SEQ ID NO: 1) (a partir da cepa CDV Danish) foi digerido 10 com EcoRV e Xhol. O fragmento com 1849 pb contendo a sequência 3' do promotor H6 de vaccinia e ó gene HA de CDV códon otimizado de comprimento total foi purificado em gel. O plasmideo pCXL148.2 (plasmideo doador de PC5, material proprietário da Merial) foi digerido com EcoRV e Xhol para 15 gerar um vetor com 4 9851 pb contendo a sequência 5' do promotor H6. A inserção de 1849 pb foi ligada ao vetor de 49851 pb para gerar o pC5 H6 CDV HA (pCXL155.7.1) . O constructo foi sequenciado para confirmar a sequência correta. A Figura 3 apresenta o mapa de plasmideo 20 pCXL1557.1.
Exemplo 2 Construção do plasmideo contendo GM-CSF - GM-CSF canino pC3 H6p, pJSY2218.1
O plasmideo contendo o gene GM-CSF canino códon- otimizado foi digerido com Nrul/Xhol. O fragmento de DNA dé
GM-CSF canino resultante foi isolado e ligado ao pJY19131.1 digerido com Nrul/Xhol (material proprietário da Merial) para criar um plasmídeo doador C3 pJSY2218.1, que contém o cassete de expressão H6p (promotor H6 de vaccinia)-GM canino-CSF em uma orientação oposta contra ramificações C3. O plasmídeo pJSY2218.1 foi sequenciado e confirmou ter a sequência correta. A figura 3 mostra o mapa pJSY2218.1 de plasmídeo.
Exemplo 3 Geração e caracterização de ALVAC recombinante contendo o gene HA CDV sintético nos locais C5 de ALVAC (vCP2263) A. Geração de vCP2263 O plasmídeo doador pCXL1557.1 contém gene HA de CDV canino códon-otimizado (SEQ ID NO: 1) . Células de fibroblasto de embriões de galinha primários (1° CEF) foram utilizadas para a recombinação in vitro. As células Io CEF foram cultivadas em FBS 10% (JRH: y-irradiado #12107-500M), DMEM (BRL/Gibco #11960-051 ou 11960-044) suplementado com glutamina 4 mM (BRL/Gibco #25030-081) e piruvato de sódio 1 mM (BRL/Gibco #11360-070) na presença de lx antibióticos/antimicóticos (P/S/A/A, BRL/Gibco #15240-062). A hibridização de placas com sonda específica de HA sintética de CDV marcado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) foi utilizada para a seleção recombinante. O IVR (recombinante in vitro}foi realizado através de transfecçâo das células IoCEF com 12 pg de plasmideo doador Not I-linearizado pCXL1557.1 utilizando o reagente Fugene-6® (Roche). As células transfectadas foram subsequentemente infectadas com ALVAC como virus de resgate em M01 (multiplicidade de infecção) de 10 (Estoque ALVAC, 6,3 x 109 pfu/mL). Após 24 horas, as células infectadas transfectadas foram coletadas, submetidas ao ultrassom e utilizadas para varredura de virus recombinante. As placas 10 recombinantes foram rastreadas com base no método de hibridização por plaque liftutilizando uma sonda HA especifica sintética com 1232 pb marcada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) de acordo com o protocolo dó fabricante (Amersham #Cat RPN3001). Após quatro aiclos 15 sequenciais de purificação em placa, os recombinantes designados como vCP2263.1.2.1.1 e VCP2263.6.1.1.1 foram gerados e confirmados por hibridização como sendo 100% positivos para a inserção de HA e 100% negativos para o sitio C5 vazio. Placas individuais foram selecionadas a 20 partir do 4o ciclo de purificação de placa, e expandidas para obter os estoques Pl (1 x frasco T25 por irmã), P2 (1 x frasco T75 por irmã) e P3 (4 garrafas cilíndricas para vCP2263.1.2.1.1.) para amplificar vCP2263. O fluido de cultura de células infectadas das garrafas cilíndricas foi coletado e concentrado para produzir o estoque de vírus. B. Análise Genõmica O DNA genômico de VCP2263.1.2.1.1 e VCP2263.6.1.1.1 foi extraído, digerido com BamHI, HindIII óu PstI e foi analisado em gel de agarose a 0,8%. Os resultados revelaram a inserção correta da sequência HA sintética de CDV. Southern blot: O gel com DNA genômico digerido com BamHI, HindIII ou PstI foi transferido para a membrana de náilon e a análise de Southern blotfoi realizada por sondagem com uma sonda específica HA de CDV sintética. Bandas simples ou. duplas de todas as três digestões foram Observadas nos tamanhos esperados: 1984 pb de BamHI, 12294 pb de HindIII e 6465 c 12119 pb de PstI (ver Figura 4), indicando a inserção correta de HA sintético de CDV nos locais C5. Iniciadores para amplificar a sonda HA de CDV sintética: 13220CXL: 5' AGGTGTCCACCTCCAACATGGAGT 3' (SEQ ID NO: 10) 13225CXL: 5' GAACTGGTCGCCCCTGGAGGCCTT 3' (SEQ ID NO: 11) • C. Análise de expressão Western blot: As células Io CEF foram infectadas com o estoque de P2 a uma MOI de 10 e incubadas a 37 °c durante 25 h. As células e os sobrenadantes de cultura foram então coletados. As proteínas de amostra foram separadas em um gel SDS-PAGE a 10%, transferidas para membrana de náilon Immobilon e testadas com anticorpo policlonal ánti-CDV de coelho (soros agrupados de coelho A151, e 152 em diluição 1 em 100). Ó antissoro anticoelho Donkey conjugado com peroxidase foi usado como anticorpo secundário e as bandas foram visualizadas usando os reagentes luminol. VCP2263.1211 apresentou uma banda única muito fraca a 73 KDa na fraçção de sobrenadante de células, mas nenhuma banda específica para CDV foi detectada na fração de pélete de células (ver figura 5). Imunoplaca: A homogeneidade da população foi de 100% para vCP2263.1.2.1.1, conforme evidenciado por um ensaio de imunoplaca, utilizando o anticorpo anti-CDV de coelho (ver figura 6). D. Análise da sequência Uma análise mais detalhada do DNA genômico estoque P3 foi realizada por amplificação por PCR e análise de sequência das ramificações flanqueadoras do locus C5 e a inserção de HA sintética de CDV. Os iniciadores 7931DC e 7932DC, localizados além dos braços do locus C5 no genoma ALVAC, foram utilizados para amplificar todo o fragmento HA-C5R sintético C5L-CDV. Os resultados mostraram que as sequências de HA e C5L e C5R sintéticos de CDV de ALVAC estão corretas. Iniciadores para amplificação por PCR: 7931DC: 5' GAATCTGTTAGTTAGTTACTTGGAT 3' (SEQ ID NO:12) 7932DC: 5' TGATTATAGCTATTATCACAGACTC 3' (SEQ ID NO:13) A sequência de DNA flanqueada pelos iniciadores 7931DC e 7932DC contendo ramificações C5, o promotor H6 e HA sintética de CDV é designada SEQ ID NO: 14. Exemplo 4 Geração e caracterização de ALVAC recombinante contendo o gene GM-CSF canino códon otimizado sintético de H6P inserido no locus C3 de ALVAC - VCP2391 A. Geração de VCP2391 O plasmideo dador pJSY2218.1 contém gene GM-CSF canino códon-otimizado (SEQ ID NO: 3). Células de fibroblasto de embrião de galinha primário (1° CEF) foram utilizadas para recombinação in vitro.A hibridização de placas com sonda especifica GM-CSF canina marcada com peroxidase de rábano silvestre (HEP) foi utilizada para a seleção recombinante. O IVR foi realizado por transfecção de células Io CEF com 10 pg de plasmideo doador Not I-linearizado pJSY2218.1 utilizando o reagente Fugene-6® (Roche). As células transfectadas foram subsequentemente infectadas com ALVAC como vírus de resgate em MOI de 10. Após 24 horas, as submetidas ao ultrassom e utilizadas para rastreamento de vírus recombinante. As placas recombinantes foram rastreadas com base no método de hibridização por plaque lift hybridization utilizando uma sonda específica para GM- CSF canino com 382 bases marcada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham #Cat RPN3001). Após dois ciclos sequenciais de purificação em placa, o recombinante designado como VCP2391.4.4 foi gerado e confirmado por hibridização como sendo 100% positivo para a inserção GM-CSF canina e 100% negativo para a ORF C3. A placa única foi selecionada a partir do 2° ciclo de purificação de placa, e expandida para obter Pl (1 x frasco T25), P2 (1 x frasco T75) e P3 (6 x garrafas cilíndricas). B. Análise Genõmica - Southern blot DNA genômico de VCP2391 foi extraído, digerido com BamHI, HindIII ou Pst I e analisado em gel de agarose a 0,8%. 0 gel com DNA genômico digerido por BamHI, HindIII ou PstI foi transferido para uma membrana de náilon e a análise de Southern blotfoi realizada por sondagem com a sonda caGM-CSF com 382 bases. Múltiplas bandas foram observadas nos tamanhos esperados, indicando a correta inserção do gene caGM-CSF no locus C3.
Figure img0003
Iniciadores para amplificação da sonda GM-CSF canina 18071BK: 5' GATGTTGAACAGGAAGTCCTTCAGGT 3' (SEQ ID NO:15) 18073BK: 5' GTTCCTGGGCACCGTGGTGTGCAGCA 3' (SEQ ID 5 NO:16) C. Análise de expressão
Western blot: Células CEF primárias foram infectadas com o estoque P3 de VCP2391.4.4 na MOI de 10 e incubadas a 37 °C durante 24 horas. Todo o sobrenadante da cultura e as células foram então coletados. Os péletes das células foram Usados com o Tampão de Lise de Ensaio de Gene Repórter fabricado por Roche (Cat. 1 897 675). Tanto o sobrenadante quanto o lisado celular foram preparados com o sistema NuPage®, com a adição de antioxidante. As proteínas foram separadas em um gel pré-mpldado NuPage® 10%, e em seguida transferidas para uma membrana PVDF. IgG de GM-CSF anticanina de cabra purificada (R&D Systems, Cat AF1546) foi utilizada como anticorpo primário. O Western blot detectou uma proteina principal de ~ 20 KDa e uma proteina menor de ~ 17 KDa secretada a partir do sobrenadante de VCP2391.4.4 (ver figuras 7 e 9) . A figura 9 mostrou boa expressão de GM-CSF no material bruto e no sobrenadante. D. Análise de sequência
Uma análise mais detalhada do DNA gènômicó estoque P3 VCP2391.4.4 foi realizada por amplificação por PCR e a análise de sequência das ramificações flanqueadoras do locus C3 e a inserção de GM-CSF canina. Os iniciadores 8103JY e 8104JY, localizados além das ramificações do locus C3 no genoma ALVAC, foram utilizados para amplificar todo o fragmento C3L-caGM-CSF-C3R. Os resultados mostraram que as sequências da inserção de GM-CSF canino e C3L e C3R de ALVAC estão corretas (SEQ ID NO: 19).
Iniciadores para a amplificação por PCR do cassete GM- CSF-C3R C3L-canino: 8103JY: 5' GAGGCATCCAACATATAAAGAAGACTAAAG 3' (SEQ ID NO:17) 8104JY: 5' TAGTTAAATACTCATAACTCATATCTG 3' (SEQ ID NO:18)
Exemplo 5 Geração e caracterização de ALVAC recombinante contendo o gene GM-CSF canino códon-otimizado contendo H6p inserido no locus C3 de VCP2263 - VCP2392 C5 H6p CDV de ALVAC (vCP2263.1.2.1.1) foi utilizado como vírus de origem. pJSY2218.1 contendo o gene GM-CSF canino códon-ptimizado foi utilizado como plasmideo doador. Células de fibroblasto de embrião de galinha primárias (Io CEF) foram utilizadas para a recombinação in vitro. A 5 hibridização em placa com sonda especifica de GM-CSF canino marcada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) foi utilizada para ã seleção recombinante. IVR foi realizado por transfecção de células Io CEF com 10 ug de plasmideo doador linearizado Not I pJSY2218.1 10 utilizando o reagente Fugene-6® (Roche). As células transíectadas foram subsequentemente infectadas com VCP2263.1.2.1.1 como vírus de resgate em MOI de 10. Após 24 horas, as células transfec.tadas-infectadas foram coletadas, submetidas ao ultrassom e utilizadas para a varredura de vírus recombinante. As placas recombinantes foram rastreádas com base no método plaque lift hybridization utilizando uma sonda específica de GM-CSF canino com 382 bases (exemplo 4) marcada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham # Cat RPN3001). Após quatro ciclos sequenciais de purificação em placa, o recombinante designado como vCP2392.5.3.1.1 foi gerada e confirmado por hibridização como 100% positivo para a inserção de GM-CSF canino e 100% negativo para a ORF C3. A placa única foi selecionada a partir do 4o ciclo de purificação de placa, e expandida para obter Pl (1 x frasco T25), P2 (1 x frasco T75) e P3 (6 x garrafas cilíndricas).
A. Análise Genômica - Southern blot 0 DNA genômico de VCP2392 foi extraído, digerido com BamHI, HindIII ou Pst I e analisado em gel de agarose a 0,8%. O gel com DNA genômico digerido com BamHI, HindiII ou PstI foi transferido pára uma membrana de náilon e a análise de Southern blotfoi realizada por sondagem com a 10 sonda GM-CSF canina com 382 bases (exemplo 4) . Múltiplas bandas foram observadas nos tamanhos esperados, indicando a inserção correta dó gene de GM-CSF canino no locus C3.
Figure img0004
B. Análise de expressão
Western blot: As células CEF primárias foram infectadas com o estoque de P3 de VCP2392.5.3.1.1 na MOI de e incubadas a 37 °C durante 24 horas. Todo o sobrenadante da cultura e as células foram então coletados.
O pélete celular foi lisado com o Tampão de Lise do Ensaio de Gene Repórter fabricado pela Roche (Cat. 1 897 675) . Tanto o sobrenadante quanto o lisato celular foram preparados com o Sistema NuPage®, com a adição de antioxidánte. As proteínas foram separadas em um gel pré- moldado Bis-Tris NuPage® a 10% e, em seguida, transferidas para uma membrana PVDF. IgG de GM-CSF anti-canino de cabra purificado (R&D Systems, Cat AF1546) foi utilizada como anticorpo primário. Western blotdetectou uma proteína principal de ~ 20 KDa e uma proteína menor de ~ 17 KDa secretada a partir do sobrenadante de VCP2392.5.3.1.1. (Ver Figuras 8 e 9) . O resultado da expressão de HA de CDV é apresentado na figura 10. O resultado apresentou boa expressão da proteína HA de CDV com VCP2392.
C. Análise de sequência
Uma análise mais detalhada do DNA genómico estoque P3 de VCP2392.5.3.1.1 foi realizada por amplificação por PCR e análise de sequência das ramificações flanqueadores do loçus Ç3 e a inserção de GM-CSF canino. Os iniciadores 8103JY e 8104JY (ver exemplo 4) , localizados além das ramificações do locus C3 no genoma ALVAC, foram utilizados para amplificar o fragmento C3L-caGM-CSF-C3R inteiro. Os resultados mostraram que as sequências de inserção GM-CSF canino e C3L e C3R de ALVAC estão corretas.
Comparação da eficácia de HA de CDV de canarypox canino recombinante e GM-CSF canino (vCP2392) e a HA de CDV de canarypox canino recombinante (vCP2263) por desafio em cães
Dezoito cachorros livres de patógeno CDV especifico foram usados. Os cães machos e fêmeas com 4 meses de idade foram agrupados em três grupos e foram vacinados e amostrados conforme mostrado na tabela 1 abaixo. Tabela 1
Figure img0005
- SN: teste de soroneutralização SLAM: sinalização de molécula de ativação de linfócito - CMI: imunidade mediada por células
Os exames clínicos foram realizados nos dias: (VI) 0, 0+4/5 h, 1, 2, (V2) 28, 28+4/5 h, 29, 30, ou até que todos os sintomas tenham desaparecido. O monitoramento clínico incluiu o monitoramento da condição geral dós cães, tal como a temperatura retal, dor ao apalpar o sítio de 10 injeção, inchaço local, calor local, prurido e perda de pelo local.
A amostragem nos tubos lisos para sorologia foi realizada nos dias: 0, 13, 27, 35, 42, 56 e 70. Dois tipos de SN foram realizados. A cepa CDV (BA5) , que é heteróloga 15 à inserção HA de CDV em VCP2392 e VCP2263 foi usada. O resultado é mostrado na figura 11. O resultado mostrou que o título no grupo A é maior do que o título no grupo B (1 log 10), p = 0,009, p = 0,019 e p = 0,03 em D35, D42 e D70, respectivamente. No grupo B em D42, havia 3 cães com título 20 < 0.8 logl0PD50. 0 segundo tipo de SN utilizando células
vero SLAM e CDV cepa 5804-GFP, que é homólogo à inserção de HA de CDV em VCP2392 e VCP2263 foi realizado. O resultado é mostrado na figura 12. 0 resultado mostrou que os títulos do grupo A são mais elevados do que os títulos do grupo B.
O resultado também mostrou que havia dois cães do grupo B que apresentavam título de 0,48 no D70, enquanto que no grupo A, todos os cães apresentaram títulos sorológicos de 0,72 ou mais.
A amostragem nos tubos heparinados para monitoramento de CM1 foi realizada nos dias: 13, 42 e 70. A produção de IFN-y foi monitorada utilizando ensaio ELIspot na reestimulação de PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) com PBMCs nucleofectados. A frequência das células- produtoras de IFNy antigeno específicas foi calculada. Os dados são mostrados na figura 16.
Em resumo: VCP2392 (CDV HA + GM-CSF canino) induz respostas de sorologia significativamente maiores em comparação com VCP2263 (HA de CDV).
Exemplo 7 Efeito de VCP2392 sobre a imunogenicidade de outros antígenos de vacina
Este estudo foi designado para investigar se VCP2392 (coexpressando HA de CDV e GM-CSF canino) tem um impacto positivo sobre a imunogenicidade de outros antígenos de vacina.
Uma vacina de parvovirus canino viva modificada foi utilizada a uma dose (2,6 logio de TCID50) , que está bem abaixo da dose comercial normal. Doze filhotes beagle (2 a 3 meses de idade) machos e fêmeas SPF (isentos de patógeno específico) foram atribuídos aleatoriamente a dois grupos e vacinados como se mostra na tabela 2 abaixo. Tabela 2
Figure img0006
* 2 ml, (VCP + MLV-CE?V2 em PBS) por vi-a SC no onibro direito (DO), em seguida, no ombro esquerdo (D28) ** Vírus vivos modificados - parvovirus canino tipo 2 (MLV-CPV2)
O monitoramento clínico incluiu a condição geral, 10 temperatura retal, dor ao apalpar o sítio de injeção inchaço local, calor local e prurido. As vacinas recebidas foram bem toleradas pelos cães em ambos os grupos A e B. VCP2392 (HA de CDV + GM-CSF) e VCP2263 (HA de CDV) juntamente com MLV-CPV2 foram considerados seguros com base no resultado do estudo clinico.
Os soros foram titulados para anticorpos contra CPV2 e CDV (usando CDV homólogo e heterólogo no teste de soroneutralização).
A figura 17 mostra o resultado de ELISA CVP2. Nenhum dos animais nos grupos A e B tinham anticorpos contra CPV2 no início do estudo. No grupo B, apenas um cachorro preparou uma resposta de anticorpo após a vacinação. Esta resposta foi detectada a partir de D28 em diante. No grupo A, 4 dos 6 cães apresentaram respostas de anticorpos elevadas e as respostas foram detectadas tão logo quanto em D7 em alguns cães. Nenhum dos cães apresentou uma resposta de reforço após a segunda injeção em D28. As análises estatísticas da incidência dos respondedores mostrou que os grupos eram significativamente diferentes (p = 0,046). O resultado indicou que a inserção de GM-CSF incluída em vCP2392 teve um efeito positivo sobre a sorologia de CPV2.
A Figura 18 mostra o resultado do teste de SN (soroneutralização). homólogo de CDV. Antes da vacinação, nenhum dos animais tinha anticorpos contra CDV. Os títulos do grupo A e B eram semelhantes em D35 e D5 6. No entanto, 5/6 cães do grupo A tinham anticorpos em D28, enquanto nenhum dos cães no grupo B tinha anticorpos em D28, Em D42, os títulos sorológicos foram significativamente maiores no grupo A. (Teste t de Student, p = 0,01).
A figura 19 mostra o resultado do teste de SN de CDV heterólogo. Antes da vacinação, nenhum dos animais tinha anticorpos contra CDV. Os títulos de anticorpos no grupo A tenderam a ser maiores do que os títulos do grupo B, nos dias 35, 42 e 56. Em D56, os títulos de anticorpos do grupo A foram significativamente maiores do que no grupo B (Wilcoxon, p = 0,016).
Os resultados do estudo mostraram que uma dose de 2,6 logic de TCID5Ó de MLV-CPV2 por câo estava sob a dose mínima que pode conferir soroconversão, como mostrado no resultado do grupo B. Interessantementé e surpreendentemente, a inclusão de GM-CSF no vetor canarypox (vCP2392) induziu uma resposta de anticorpo diferente, como mostrado no resultado do grupo A. Os resultados demonstraram que a presença de caGM-CSF no vetor canarypox pode ter um efeito sobre a imunogenicidade de um outro componente de vacina injetado no mesmo sítio. *****
Tendo assim descrito detalhadamente as modalidades preferidas da presente invenção, deve ser entendido que a invenção definida pelos parágrafos acima não é para ser limitada aos detalhes particulares estabelecidos na descrição acima, uma vez que muitas variações aparentes dos 5 mesmo são possíveis sem se afastar do espírito ou do escopo da presente invenção.
Todos os documentos citados ou referenciados nos documentos citados no pedido, e todos os documentos citados ou referenciados aqui ("documentos aqui citados"), e todos 10 os documentos citados ou referenciados nos documentos aqui citados, juntamente com quaisquer instruções, descrições, especificações de produto e folhetos de produto do fabricante para quaisquer produtos mencionados aqui ou em qualquer documento aqui incorporado por referência, são por 15 meio deste documento incorporados por referência, e podem ser utilizados na prática da invenção.

Claims (6)

1. Composição caracterizada pelo fato de compreender: a) um vetor de expressão canarypox, em que o vetor de expressão canarypox é ALVAC, em que o vetor ALVAC compreende: i. um primeiro polinucleotideo que codifica um polipeptideo HA de CDV e tendo a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 1, em que o referido primeiro polinucleotideo é inserido no locus C5 do ALVAC sob o controle do promotor vacciniaH6; e ii. um segundo polinucleotideo que codifica um polipeptideo GM-CSF e tendo a sequência definida na SEQ ID NO: 3, em que o referido segundo polinucleotideo é inserido no locus C3 do ALVAC e está operacionalmente ligado ao promotor vaccinaH6; e b) um veiculo, adjuvante, diluente, ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender ainda um ou mais antigenos adicionais, em que o antigeno é um antigeno canino, e em que o antigeno canino é selecionado do grupo que consiste de raiva, parvovirus canino, coronavirus canino, influenza canina, cinomose canina, hepatite canina infecciosa, herpesvirus canino, pseudorraiva, virus minute canino, Leptospira, Neospora caninum, Borrelia burgdorferi, Ehrlichia canis , Rickettsia rickettsii , Bordetella bronchiseptica, Blastomyces dermatitidis , Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Microsporum canis, Sporothrix schenckii, Aspergillus fumigatus, and P. insidiosum.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o antigeno adicional é um antigeno canino selecionado do grupo que consiste em raiva, parvovirus canino, coronavirus canino, Influenza canino, hepatite infecciosa canina, herpesvirus canino, pseudo- raiva, virus minuto canino, Leptospira e Neospora caninum.
4. Composição, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o segundo polinucleotideo codifica um polipeptideo GM-CSF e tendo a sequência definida na SEQ ID NO: 3.
5. Composição, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o segundo polinucleotideo compreende na SEQ ID NO: 3.
6. Vetor de expressão ALVAC caracterizado pelo fato de compreender i. um primeiro polinucleotideo que codifica um polipeptideo HA de CDV e tendo a sequência definida na SEQ ID NO: 1, em que o referido primeiro polinucleotideo é inserido no locus C5 do ALVAC sob o controle do promotor vacciniaH6; e ii. um segundo polinucleotideo que codifica um polipeptideo GM-CSF e tendo a sequência definida na SEQ ID NO: 3, em que o referido segundo polinucleotideo é inserido no locus C3 do ALVAC e está operacionalmente ligado ao promotor vacciniaH6.
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