TWI320715B

TWI320715B - Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine

Info

Publication number: TWI320715B
Application number: TW092112918A
Authority: TW
Inventors: Chu Hsien-Jue; Li Wumin; Zhichang Xu
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2002-05-17
Filing date: 2003-05-13
Publication date: 2010-02-21
Also published as: US20070134269A1; JP2013189438A; ES2569063T3; EP1506006B1; US20030017171A1; WO2004058142A3; AU2003303129B2; US7959927B2; NZ537014A; EP1870109B1; US20100062018A1; KR101056622B1; HRP20041068B1; HK1111103A1; MXPA04011218A; AR039545A1; TW200306854A; JP5700861B2; ZA200410153B; CN1305524C

Description

1320715 玖、發明說明：【發明所屬技術領域】本發明係關於誘發抗猪肺炎黴紫菌（Mycoplasma hyopneumoniae)之保護免疫之改良方法，具體而言，係使用足夠量之不活化豬肺炎黴漿菌菌苗，以單劑免疫接受者動物來對抗豬肺炎黴漿菌之感染。【先前技術】發明背景豬肺炎黴漿菌爲豬黴漿菌肺炎之病原，由於增重會減少以及不良飼料換肉率，此病成爲養豬業經濟損失之一種重要原因。此疾病會引起持續數週之慢性咳嗽、黯淡毛皮、延緩生長及不興旺的表徵，尤其在感染動物之腹頂葉及心葉觀察到紫色至灰色區域聯合之顯著傷害，雖然此病引起少數死亡，但受感染豬通常易於受伺機性病原之二次感染，造成死亡或壓力，僅經濟損失每年即估計有200至250 百萬美元。豬肺炎黴漿菌爲一種缺乏細胞壁之生長緩慢、挑剔的細菌，由於有一種亦位於呼吸道之常見二次病原之豬鼻炎黴獎菌（Mycoplasma hyorhinis)，故經常難以自呼吸道分離出豬肺炎黴漿菌。此病係經由咳嗽產生之飛沫及直接接觸感染或復原期的帶原豬所散佈’受感染動物與未感染動物之混合造成較快及經常的再感染。感染經常開始於帶原母豬在產仔豬時使仔豬感染，由於家畜管理技術’感染可能變得不明顯直到較後生活期，通常在斷奶後當聚集小豬時 1320715 觀察到額外的感染，一般於6週齡或更大時觀察到明顯疾病。受感染動物之生長速率及飼料換肉率顯著地減少’使用抗生素治療爲昂貴的且需要延長使用’再感染亦爲一個問題。疫苗爲目前避免感染及其後果之最有效方法。

Fort Dodge Animal Health ( FDAH )販售商品名爲 Suvaxyn®Respifend®MH之豬肺.炎黴漿菌菌苗，用來作爲疫苗以保護健康豬隻對抗由豬肺炎黴漿菌引起之臨床症狀。此疫苗含有Carbopol (聚丙烯酸交聯樹脂）作爲佐劑’ 並被推薦爲2劑疫苗於豬隻在至少1週齡時免疫，且於第一次接種疫苗後2至3週施予之第2劑，然而爲了提供對抗此病之完整保護，2劑疫苗有需要第二次處理動物之明顯缺點。因此，本發明之目標爲提供一種抗豬肺炎黴漿菌之有效疫苗，其給予單劑疫苗即可激發保護性免疫並預防此病原引起之疾病。本發明之另一目標係提供一種適合使用於豬隻以對抗由豬肺炎黴漿菌所引起之感染及疾病之疫苗組成物，且可與其它菌苗及/或類毒素合倂使用。本發明之更進一步目標係提供一種用於預防或改善此病之方法，其中傳染有機體爲豬肺炎黴漿菌，藉由利用能增進此疫苗之菌苗之免疫原性之佐劑調配物，於單劑施予後激發保護免疫。本發明之其它目標及特徵將由下文陳述之詳細說明更爲 1320715 彰顯。【發明內容】發明摘述本發明係關於一種用於免疫動物使其能對抗豬肺炎黴漿菌感染之疫苗組成物，其包含一種免疫量之不活化豬肺炎黴漿菌菌苗；一種佐劑混合物，其包含丙烯酸聚合物，及可代謝油與聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物之混合物；及醫藥上可接受載劑，此疫苗組成物，於單劑施予後，激發對豬肺炎黴漿菌之保護性免疫。在另一方面，本發明提供一種免疫動物抗豬肺炎黴漿菌感染之免疫原性組成物，包含不活化豬肺炎黴漿菌菌苗合倂上述佐劑混合物及醫藥上可接受穩定劑、載劑或稀釋劑。在此疫苗組成物中佐劑通常以約1-25% ( v/v)之最終濃度存在，且較佳約5 · 1 2 % ( v/v )，此組成物亦可包括其他疫苗成份，包括不活化菌苗或經純化的類毒素，由一或多種病原（包括一或多株、型、血淸型或此等病原菌類似物）’如副猪嗜血桿菌（出血敗血性巴斯德桿菌（mw/i/oc/c/a)、豬鏈球菌 (•Sire/Jiococcww ak)、胸膜肺炎放線桿菌（/ pleuropneumoniae )> { Bordetella bronchiseptica ) ' 豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choler aesuis )、豬丹毒桿菌（E r y s ip e I o t hr ix )、螺旋體（leptospira )，及病毒抗原如豬流 1320715 fl性感冒病毒（Swine influenza virus, SIV)、猪繁殖與呼吸道症候病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)，及豬環狀病毒（Porcine circovirus virus, PCV )，且可經由肌肉內、皮下、口服、液化氣體或鼻內途徑施予。在本發明之其它具體實施例中，其它疫苗成分將包括一或多種選自 SIV ;副豬嗜血桿菌；PRRSV及 PCV組成之群；SIV及豬丹毒桿菌組成之群；出血敗血性巴斯德桿菌及支氣管敗血性博德特氏菌組成之群。在本發明之另一具體具體實施例中，本發明之其它疫苗成分，當選自 SIV時，將包括選自 SIV-H1N1株、SIV-H1N2株及 SIV-H3N2 株。在更另一方面，本發明提供一種施予含有不活化猪肺炎黴漿菌菌苗及佐劑混合物之單劑上述疫苗，以保護動物對抗由豬肺炎黴漿菌引起之疾病。在本發明之更進一步方面，本發明提供一種免疫原性組成物或疫苗以免疫動物對抗豬肺炎黴漿菌之感染，包含一種不活化豬肺炎黴漿菌菌苗與一種佐劑或佐劑混合物合倂，個別地或以混合物，提供對此組成物或疫苗之一種細胞媒介及局部（分泌性IgA)免疫反應；其它疫苗成分包含至少一種額外的細菌及/或病毒抗原；以及一種醫藥上可接受載劑，此疫苗組成物在單劑施予後，激發對豬肺炎黴漿菌之保護性免疫。在此組成物或疫苗之其它疫苗成分中可包括不活化菌苗、經純化類毒素、由一或多種病原（包 1320715 括一或多株、型、血淸型或此等病原類似物），如副豬嗜血桿菌、出血敗血性巴斯德桿菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支氣管敗血性博德特氏菌、豬霍亂沙門氏菌、豬丹毒桿菌、螺旋體，及病毒抗原（包括一或多株、型、血淸型或此等病毒抗原類似物）如豬流行性感冒病毒（SIV)、豬繁殖與呼吸道症候病毒（PRRSV )，及豬環狀病毒（PCV)，且可經由肌肉內、皮下、口服、液化氣體或鼻內途徑施予。在本發明之更再另一方面，本發明提供一種疫苗組成物以免疫動物對抗豬肺炎黴漿菌及病毒病原之感染，此疫苗組成物包含免疫量之豬肺炎黴漿菌菌苗；至少一種選自豬流行性感冒病毒（SIV)、豬繁殖與呼吸道症候病毒 (PRRSV)及豬環狀病毒（PCV)之群之病毒抗原；及一種佐劑系統，包含丙烯酸聚合物、可代謝油及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以水包油乳劑型式；此疫苗組成物在單劑施予後，激發對豬肺炎黴漿菌之保護性免疫。在本發明之更進一步方面，本發明提供一種疫苗組成物及免疫動物對抗豬肺炎黴漿菌感染及至少一種病毒病原之方法，且可選擇額外的病毒及/或細菌病原，此等疫苗組成物及方法在單劑施予後激發對豬肺炎黴漿菌之保護性免疫。發明詳細說明本文中引用之所有專利、專利申請案及其它文獻完整倂入參考文獻，若有不一致的情形，以本揭示爲有效。 -10- 1320715 此處所使用之”菌苗”，爲一種已被不活化之細菌產物，並與特定佐劑合倂，當施予動物時，可激發保護性免疫以免於疾病或感染。 “佐劑”係指在疫苗組成物中之一種含有一或多種能增進豬肺炎黴漿菌菌苗免疫原性及效力之物質。在說明書及申請專利案爲中使用之” MHDCE”係指豬肺炎黴獎菌DNA細胞同等物（Mycoplasma Hyopneumoniae DNA cell equivalents)。 “免疫量”爲將提供面對豬肺炎黴漿菌之免疫性之菌苗量，”免疫量”將依據種別、品種、年齡、大小、健康狀態及是否動物先前已被給予抗相同有機體之疫苗而變化。本發明提供一種抗豬肺炎黴漿菌之疫苗，其適合以單劑進行免疫。本發明之疫苗包括一種能增進菌苗免疫原性之佐劑混合物，因而提供以單劑施予能激發保護性免疫。此疫苗可以此項技藝中之標準方法自新鮮經收取之培養物製備（例如可見於U.S.專利案5,3 3 8,543號或U.S.專利案5,565,205號，以及下文實例2)，即此有機體可在培養液如 PPLO (類胸膜肺炎有機體）完全培養基[Difco. Laboratories]中增殖，有機體之生長以標準技術監測如測定顏色改變單位（color changing units，CCU)’並於已達到充分高力價時收取。此原料在包含於疫苗調配物前可以習用方法進一步濃縮或冷凍乾燥’可使用如彼等描述於 Thomas，et al.，Agri-Practice, Vol· 7 No. 5，pp.26-30 之其 1320715 它方法。本發明之疫苗包含不活化豬肺炎黴漿菌菌苗與佐劑混合物合倂以及一或多種醫藥上可接受載劑，適合使用之載劑包括水溶液介質，例如食鹽水、磷酸緩衝食鹽水、最少基礎培養基（MEM )或含HEPES緩衝液之MEM。在本發明之疫苗組成物中使用之佐劑混合物會增進免疫反應且包含一種含可代謝油之混合物之丙烯酸聚合物，例如未飽和萜烴或其氫化作用產物，較佳爲鯊烷（squalane ) (2,3，10，15，19,23-六甲基四己烷）或鯊烯（”1^1“6)，及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。此等丙烯酸聚合物可爲同元聚合物或共聚合物，丙烯酸聚合物較佳爲卡波姆 (carbomer)，卡波姆以商標名Carbopol爲商業上可取得的’例如丙烯酸聚合物被描述於U.S.專利2,909,462及 3,79 0,665號，此等揭示在此被倂入參考資料中。此聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物爲界面活性劑.，較佳爲液體界面活性劑，輔助懸浮固體及液體成分，此界面活性以商標名 Pluronic®爲商業上可取得之聚合物，較佳界面活性劑爲 poloxamer 401，其以商標名Pluronic® L121爲商業上可取得的。免疫原性刺激性佐劑混合物一般以約1 %至2 5 %之v/v 量存於本發明之疫苗組成物中，較佳約2%至15%，更佳約爲5%至12%v/v。佐劑混合物量之使用及佐劑之兩種成分比可依據其它菌苗或經純化類毒素之添加而變化。佐劑混 -12- 1320715 合物一般包含可代謝性油、丙烯酸聚合物及聚氧乙烯-聚氧丙嫌嵌段共聚物被調配成於水溶液介質中之乳劑。在佐劑混合物中’可代謝性油及丙烯酸聚合物可分別以範圍約10至150ml/L及約〇·5至l〇g/L之量，在此佐劑混合物之較佳具體實施例中，可代謝性油及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物成份之混合物爲鯊烷及Pluronic® L121 (poloxamer 401)之一種混合物，其可以約50至i〇0ml/L 之量存在且羧基亞甲基聚合物爲Carbopol 9 3 4P(卡波姆 9 3 4P )，其可以約2ml/L之量存在。典型之佐劑混合物含有丙烯酸聚合物與可代謝性油/聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物混合物之比約1:25至1:50之比率。較佳丙烯酸聚合物爲彼等由 B.F Goodrich販售之 Carbopol 934 P NF及941 NF，其爲丙烯酸與聚烯丙基蔗糖交聯之聚合物，且具有化學式（CH2CHOOOH) n。此聚合物形成水溶液膠體，其適合與水溶液載劑調配。較佳聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物爲由BASF販售之Pluronic® L121、L61、L81或L101非離子性界面活性劑。本發明之疫苗組成物係指免疫量之不活化豬肺炎黴漿菌菌苗；選自細菌及/或病毒抗原之其他疫苗成份：及醫藥上可接受載劑之合劑，且於單劑施予後激發對豬肺炎黴漿菌之保護性免疫，疫苗組成物進一步包含佐劑或佐劑混合物，以單獨或合倂方式，提供細胞媒介及局部（分泌性IgA ) 免疫《此等佐劑或佐劑可進—步選自如皂素’如QUIL® A ; -13- 1320715 細胞激素’如IL-12及IL-18及局部（分泌性IgA)免疫；氫氧化鋁、可代謝性油、以水包油型式之乳劑之聚氧乙烯_ 聚氧丙烯嵌段共聚物及丙烯酸聚合物、乙烯順丁烯二酸共聚合物；含另一佐劑之丙烯基聚合物，DEAE葡聚糖、經分枝桿菌（mycobacteria )細胞壁衍生之佐劑等之佐劑^ 本發明之組成物中之其它疫苗成份可包括細菌抗原，包括不活化菌苗或經純化的類毒素，由一或多種病原（包括一或多株、型、血淸型或此等病原類似物），如副豬嗜血桿菌、出血敗血性巴斯德桿菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支氣管敗血性博德特氏菌、豬霍亂沙門氏菌、豬丹毒桿菌、螺旋體，及病毒抗原（包括一或多株、型、血淸型或此等病毒抗原類似物）如豬流行性感冒病毒（SIV)、豬繁殖與呼吸道症候病毒（PRRSV)，及豬環狀病毒（PCV)。在本發明之其它具體實施例中，其他疫苗成份將包括一或多種選自SIV ;副豬嗜血桿菌；PRRSV或PCV組成之群； SIV及豬丹毒桿菌組成之群；出血敗血性巴斯德桿菌及支氣管敗血性博德特氏菌組成之群之抗原。在本發明之再另一具體實施例中，本發明之其它疫苗成份，當選自SIV時，將包括選自SIV-H1N1株、SIV-H1N2株及SIV-H3N2株。本發明之疫苗可由肌肉內、皮下、鼻內、腹腔內或口服施予，較佳爲經由肌肉內或皮下途徑。本發明之疫苗一般包含不活化豬肺炎黴漿菌、可代謝油及水包油型式之乳劑之聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。此疫苗較佳含有丙烯酸聚合物之濃度範圍在〇·5至l〇g/L間， -14- 1320715 此疫苗較佳含有可代謝性油之濃度範圍爲2至6ml/L，此疫苗較佳含有聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物之濃度範圍爲1 至 3 ml/L 〇爲了單劑施予，此疫苗應較佳含有相當於約1X108至3 XlOuMHDCE/ml，較佳約 1X109 至 3xl09MHDCE/ml，約 1至5ml，較佳爲2ml，經由肌肉內、皮下或腹腔內可施予每一動物，1至10ml時，較佳爲2至5ml，可以口服或鼻內施予。【實施方式】下列實例意欲進一步說明本發明而不限制其範疇於此。實例1 疫苗組成物之豬肺炎黴漿菌菌苗製備菌苗原料之說明：豬肺炎黴漿菌可獲自任一可立即取得來源之成員，在一具體實施例中，可使用豬肺炎黴漿菌株P-5722-3，此培養獲自 C. Armstrong, Purdue University, West Lafayett, Indiana，收到豬肺炎黴漿菌後，將其在豬肺炎黴漿菌肉汁中繼代7次以建立母株。細胞培養：豬肺炎黴漿菌生長於含有Bacto PPOL粉末、酵母提取物、葡萄糖、L-半晄胺酸鹽酸鹽、安比希林（ampicillin)、醋酸亞鉈、酚紅、抗泡沫劑、正常無菌豬血淸及水之培養 1320715 基中，超過1 8-144小時之範圍的期間’爲了不活化，直接添加二元次乙亞胺（BEI)至發酵瓶中之生產培養物中，將pH値調整至7.4’然後依據習用步驟收取以提供豬肺炎黴發菌菌苗。疫苗組成物之製備組成物之防腐劑及使用比率：經收取之菌苗經由分別添加不超過0.01%及0.07%之鄰乙汞硫基苯酸鈉（thimerosal )及伸乙二胺鹽四醋酸四-鈉鹽（EDTA)來保存，安比希林U.S.P.以 0.2 5 0g/L存於生長培養基中，在最終產物之殘餘安比希林之濃度將依據收取液體之體積而變化，在完全產物中殘餘安比希林濃度不超過 30 // g/ml。產品之標準化：黴漿菌濃縮物以DNA螢光測量試驗定量。可代謝油之混合物包含一或多種萜烴與一種聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，例如，鯊烷/Pluronic® L121混合物，在900ml純水中溶解10g之氯化鈉、〇.25g之氯化鉀、2.72g 之二元磷酸鈉、〇.25g之一元碟酸鉀、20ml之PluoricL121 (BASF Corporation)、40ml 黨院（Kodak)、3.2ml Tween 80， q.s.至1 000ml而製備成。混合後，此成份可被高壓滅菌，然後均質化此混合物直到形成穩定乳劑，可添加福馬林至最終濃度爲 0.2%或添佳鄰乙汞硫基苯酸鈉至最終濃度爲 1 : 1 0,000。單位裝配以形成系列產品： -16- 1320715 符合要求之豬肺炎黴漿菌濃縮物與佐劑、防腐劑無菌地合併，然後稀釋至裝置攪拌器之無菌容器中並混合不少於 30分鐘。用於1，000,000劑（每劑2ml)之量：％v/v 黴漿菌濃縮物（> 1·〇 X 101° MHDCE/ml) 400,000ml 20.0 鯊院/Pluronic® L121混合物 100,000ml 5.0 Carbopol樹月旨（2% w/v於水） 200,000ml 10.0 鄰乙汞硫基苯酸鈉溶液l%w/v於水及 EDTA (四鈉鹽）7w/v% 18,000ml 0.9 無菌食鹽水 1,282,000ml 64.1 此系列之pH値被調整至7.0±0.2。 MHDCE =豬肺炎黴漿菌DNA細胞同等物塡充及密封最終容器之方法及技術：可通過無菌的200-500微米過濾膜裝置以大量過濾此產物，且特定於9 CFR 1 14.6之條件下，於經設計用來塡充操作之房間中，將其過濾至無菌最終容器。以橡膠塞子充塞玻璃或塑膠容器並以鋁封條密封定型。每一劑2.0ml將含有不少於2X1 09豬肺炎黴漿菌DNA細胞同等物。效力測試：可以下列試驗測試整體完全產物或最終容器樣品之效力。效力試驗之測試方法：使用自Harlan Sprague Dawley或其他可接受的供應商 —次託售之6至7週齡ICR雌性鼠，最少需20隻鼠用來進行個別未知物及參考菌苗之免疫，最少有5隻鼠作爲未接種對照組，個別完全混合試驗及參考菌苗，使用無菌之 -17- 1320715 可拋棄式注射筒裝配25 口徑之5/8英吋針頭，域以十分之一之宿主動物劑量（0.2ml)皮下3 將每一組鼠以個別單位留宿且使其能自由接近天，然後將每隻鼠麻醉，使經麻醉之鼠仰臥，住頭部並將一隻前腳遠離身體拉直，使用解音[ 前腿至胸部之間將皮膚切開約1/2吋長，切圖用3.0ml注射筒，不需針頭，收集聚於切口虜血液排出至已標示之試管中並使其凝集，將經於l，000 Xg下離心，以自血塊分離出血淸，名存於-2 0 °C或更冷處直到被測試。血淸學試驗：使用 ELISA步驟來測量鼠對參考及/或未矢| 反應’ ELISA步驟使用Dynatech之可拋棄式 Flat-Bottom微量滴定平盤或相似物及ELISA 來實行。 · 試驗試劑：磷酸鹽緩衝食鹽水-Tween(PBST)(以5N HC1將pH値調整爲7.2至7.4)。每公升之量

於鼠蹊部區 :射接種鼠》食物和水1 4 用一隻手抓丨刀由拉直的 f臂動脈，使 I之血液，將丨凝集之試管 r別血淸被儲 ]菌苗之抗體 Immulon II 平盤讀數機 NaOH 或 5N -18- 1320715 成分公升 NaCl 8.50g NaH2P〇4 〇.22g Na2HP04 1.19g Tween-20 〇.50g 去離子水q . s . 1,000.00ml 甘胺酸緩衝食鹽水（GBS)(以5NNaOH或5NHC1將pH 値調整爲9.5至9.7)。成分每公升之量甘胺酸〇.75g NaCl 8.50g 去離子水q . s . l5000.00ml 陽性對照組血淸：陽性對照組血淸爲自接種豬肺炎黴漿菌菌苗之鼠中所收集者。軛合物及受質：經純化之親和性抗鼠IgG經過氧化酶標定之軛合物係獲自 Kirkegaard and Perry Lavoratories，Inc.(型錄號 074- 18 02 )，用來測定軛合物之理想稀釋詳細敘述如下，過氧化酶受質溶液（ABTS ) 獲自 Kirkegaard and Perry Lavoratories, Inc. ° 轭合物之滴定：將Immulon II Flat-Bottom微量滴定平盤以每孔100/zl之每ml 20#g之豬肺炎黴漿菌全細胞抗原稀釋於10mM GBS之稀釋液來塗覆，將此平盤培育於37°C± -19- 1320715 2 °C，且不少於1小時，並轉移至2-7 °C不少於18小時且不超過1週。在使用平盤之前以PBST淸洗3次，每一孔間間隔1分鐘浸泡時間，輕拍平盤使其乾燥。製備1 :40稀釋於PBST之陽性對照組血淸，將經稀釋之陽性血淸（100 a 1/ 孔）加入平盤之孔中爲每孔之半量，另加入一半量之PBST 至孔中，此平盤在室溫下培育1小時，之後，將此平盤淸洗3次。軛合物血淸依序以PBST兩倍稀釋，開始時爲1:100 稀釋至結束於1:1〇,240稀釋。將每一軛合物稀釋之lOOyl 加入4孔之陽性血淸及4孔之PBST中，隨後在室溫中反應0.5小時，將平盤淸洗4次，然後每孔加入100 // 1之過氧化酶受質溶液（abts)，在雙重波長設定爲Τλ =4 50時讀取平盤，選擇得到之稀釋對陽性對照組血淸之讀數爲0.850 至1.0 5 0之軛合物之稀釋，當PBST對照組之數値由陽性對照組血淸之數値扣除時。試驗抗原：豬肺炎黴漿菌抗原爲全細胞製備，並由 Ford Dodgee Animal Health 供應。以如下方式執行ELISA:使用微滴盤（Dynatech Immulon II Flat-Bottom Microtiter Plates)，將一瓶經冷凍乾燥之藉肺炎黴漿菌全細胞抗原以甘胺酸緩衝食鹽水（GBS)沖泡，經沖泡黴漿菌蛋白質之濃度爲20/zg/ml，然後將100μ1(2 Ag)之經稀釋抗原加入平盤之每孔中，將此平盤培育於37 °C ±2 °C不少於1小時，並轉移至2-7 °C最少18小時且最長 -20- 1320715 爲1週》在使用平盤之前以PB ST淸洗3次，每一孔間間隔1分鐘浸泡時間，輕拍平盤使其乾燥。血淸以1 : 4 0稀釋於PBST中’陽性對照組血淸將以4份包括於每一平盤中，每孔樣品量爲1 00 " 1，連續試驗血淸樣本及參考血淸樣本將在同一平盤中試驗兩次，此平盤在室溫下培育1小時，然後將此平盤以PBST淸洗3次。將lOOyl之抗鼠IgG過氧化酶範合物（Kirkegaard and Perry)稀釋於PBST中，並加入所有孔中，隨後在室溫中反應3 0分鐘，將平盤以 PBST淸洗4次，然後每孔加入100 μ 1之過氧化酶受質溶液（ABTS )，將平盤培育直到陽性血淸對照組達到OD405 (450)爲0.850至1.050，當機器以PBST對照組孔作爲空白組時，讀取平盤，並與PBST孔作空白對照。爲成爲有效試驗，接種參考菌苗鼠之血淸必需產生最少爲0.500 之平均値，且未免疫之對照組鼠之血淸必須不超過0.100 最大平均値。或者，接種參考菌苗鼠之血淸與未免疫對照組鼠之血淸之差額必須大於或等於0.400。系列疫苗、參考疫苗及對照組之平均値被計算及估計如下：爲了被認爲符合要求’試驗菌苗必須證明平均光學密度値等於或大於參考菌苗，或使用 0ne-Tailed Student’s T-Test時，試驗菌苗必須滿意度不低於參考菌苗（P$〇.05 信賴度）。任一經計算之τ値等於或大於i·686將指出參考菌苗與試驗菌苗間之顯著差異’且將引起試驗菌苗被排除，任一經計算T値少於1·686將指出符合要求的系列， -21 - 1320715 於任何與產生效力無關之原因，任一試驗菌苗由試驗爲無滿意度時要被再次試驗，且初始試驗會被視爲無效的。實例2 試驗疫苗：依據實例1中所述詳細步驟製備試驗疫苗，使用5%之可代謝油之混合物，其包含一或多種萜烴及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物（鯊烷/Pluronic L121混合物）及0.2%丙烯酸聚合物（Carbopol )作爲佐劑，及每劑2 X 109豬肺炎黴漿菌DNA細胞同等物（MHDCE)。實例3 此硏究被設計用來證明以實例2之疫苗一劑接種於3週齡豬隻所誘導之4個月免疫期間（DOI)。使用兩組分開的動物來執行此硏究，在兩組中所有豬在免疫時爲血淸陰性的（抗體力價<1〇)，說明動物對豬肺炎黴漿菌爲具感受性的。對照組之所有豬隻在激發免疫 (challenge)前維持血淸陰性的，此說明了在經疫苗接種豬中的免疫反應是由於疫苗而非任何環境暴露所引起。在第一組試驗中，以高量之毒力的豬肺炎黴漿菌 (1·4χ106個有機體）評估實例2之疫苗與由Boehringer Ingelheim (BI)製造之商業上可取得產品Ingelvac Μ. hyo®。將22隻18-21日齡之豬以實例2之疫苗經肌肉內 (IM)注射進行免疫接種，8隻豬以Ingelvac M. hyo® [系列27 1 032]免疫接種，22隻豬作爲激發免疫對照組及10 -22- 1320715 隻作爲未激發免疫對照組。在接種疫苗後4個月，以有毒力之豬肺炎黴漿菌激發免疫接種疫苗豬隻及激發免疫對照組，以實例2之疫苗接種之豬隻有15.9%之平均肺傷害且經激發對照組豬有19.6%之平均肺傷害，在實例2疫苗接種組中之平均肺傷害少於對照組，即使對照組豬隻已以高於Iowa State UniversityClSU)所建議之劑量來激發免疫，然而，此差異並不顯著（P = 〇 .19)。同樣地，當商業產品 Ingelvac M. hyo®在相同動物組以相同劑量激發評估時，亦觀察到肺傷害之相似量（14.6%)，在以In gel vac M. hyo® 免疫組及對照組間（p = 〇.27)與Ingelvac M. hyo®免疫組與以實例2疫苗免疫組間無顯著差異。在第2列試驗中，於疫苗接種後4個月，以有毒力之豬肺炎黴漿菌在ISU 建議量（1.0M06個有機體）下激發免疫來評估實例2之疫苗，於21日齡時以一劑疫苗免疫23 隻豬，25隻豬作爲激發免疫對照組且7隻豬作爲非激發免疫對照組。以有毒力之豬肺炎黴漿菌在免疫後4個月激發經免疫豬及激發免疫對照組，對照組豬有10.4%之平均肺傷害且經免疫組有5.5%之平均肺傷害，在經免疫組與對照組間有顯著差異（ρ = 〇· 031 )。此指出實例2之疫苗再刺激保護性免疫上是有效的，其可單劑免疫3週齡豬之後至少 4個月。當將兩列試驗中與實例2之疫苗相關之資料合倂並分析，經接種組之平均肺傷害顯著低於對照組。 -23- 1320715 總之，實例2之疫苗誘發3週齡豬之以一劑疫苗接種後 4個月抗有毒力的豬肺炎黴漿菌之保護性免疫。實驗資料在此硏究中實行兩個分開試驗，在第一列試驗中，使用微軟Excel隨機化程式將67隻豬分派成4組，以依實例2 所製備之一劑疫苗肌肉注射接種18_21日齡之24隻豬。24 隻豬作爲免疫激發對照組且10隻豬作爲非免疫激發對照組，9隻豬以商業產品Ingelvac M. hyo®[系列271 032，由 Boehringer Ingelheim(BI)製造]如標籤說明經IM接種。在免疫持續期間，由於非關疫苗接種之原因，有5隻豬（2隻以實例2免疫，1隻以BI疫苗免疫及2隻對照豬）死亡，在經免疫組及免疫激發對照組所剩下之豬隻於免疫後4個月以14ml之有毒力的豬肺炎黴漿菌（1.4χ106個有機體）激發免疫，所有4組中之豬在激發免疫後30天皆被安樂死並評分試驗中每一隻豬之肺傷害。在第二列試驗中，25隻豬在2 1日齡時以一劑依據實例 2製備之疫苗經IM免苗接種，25豬作爲激發免疫對照組且10隻豬作爲無激發免疫對照組。在免疫持續期間，由於非關疫苗接種之原因，有2隻豬死亡，在疫苗接種組及激發免疫對照組所剩下之豬隻於免疫後4個月以10m丨之有毒力的豬肺炎黴漿菌（1.0X106個有機體）激發免疫，由於非關疫苗/免疫激發之原因，有2隻豬於後面的激發免疫觀察期間死亡，所有3組中剩餘之豬隻在激發免疫後30 -24- 1320715 天皆被安樂死並評分試驗中每一隻豬之肺傷害。疫苗接種：經由IM於頸部側邊而給予疫苗接種組之每一隻豬一劑 2ml之試驗疫苗。激發免疫及屍解：有毒力之豬肺炎黴獎菌激發免疫原料，來自Iowa State University ( ISU)之 Dr. Eileen Thacker 所製備之經冷凍 (-7〇 °C )之肺臟均質物，此激發免疫原料被確認爲純的且每ml含有約107個豬肺炎黴漿菌有機體，被推薦之激發免疫劑量爲l〇ml之1··100之經稀釋原料（即1·〇χ1〇δ有機體）β 在第“列試驗之經免疫豬及激發免疫對照組以1 4ml之 1:100之經稀釋原料（即1·4χ106有機體）激發免疫，在第二列試驗中被推薦之激發免疫劑量爲10ml之1:100之經稀釋原料（即l.OxlO6有機體）。在激發免疫日，在溫水中將均質物快速解凍，並使用無菌豬肺炎黴漿菌生長培養基依據ISU推薦之稀釋，給予豬隻由50mg/ml之甲苯唾嗪（Xylazine)、50mg/ml之K他命 (Ketamine)及 100mg/ml 之特拉哩（Telazole)之混合物 (Xylazine-Ketamine-TelazolTM)鎭定，麻醉劑混合物經 IM 以0.01-0.02ml/lb.體重給予。每隻豬給予單劑14ml (第一列試驗）或l〇ml (第二列試驗）之激發免疫材料，經由氣管內施予。爲確保針頭放置是正確的，在將激發免疫劑量打入前先抽取空氣至針筒中，將無免疫之無激發免疫對照 -25- 1320715 組豬維持於分開之房間且不被激發免疫。在激發免疫後（DPC) 30天，將所有豬安樂死，將肺臟移出並由不知試驗組之個人評分巨觀肺傷害。樣品收集及試驗：在免疫第〇天（〇 DPV)、免疫後1個月（1 MPV)、4 MPV/0 DPC及30 DPV收集所有豬隻之血液，藉由競爭性ELISA 套組（由DAKO Co.製作）偵測抗豬肺炎黴漿菌血淸抗體，血淸樣品在測試前被儲存於-2 (TC。資料分析：藉由變異數分析（ANOVA )比較疫苗接種組與無疫苗接種組間之肺傷害評分，肺評分被反正弦變換以改進誤差之分布。結果及討論血淸學：以商業上競爭性ELISA套組測試兩試驗之所有豬隻抗豬肺炎黴漿菌之血淸抗體，於所有測試上使用1:1〇之血淸稀釋，所有豬隻在疫苗接種時爲血淸陰性的（抗體力價< 10)，指出此等動物對於豬肺炎黴漿菌是有感受性的。對照組中之所有豬隻在激發免疫前維持血淸陰性，此說明了經免疫豬之免應反應係由於疫苗而非任何環境之暴露。在激發免疫後，所有經疫苗接種豬及大部分經激發免疫對照組（在第一列試驗之22隻豬中有18隻及第二列試驗之25 隻豬中有15隻）對豬肺炎黴漿菌血淸轉變，而所有未激 -26- 1320715 發免疫的動物仍維持血淸陰性。此暗示了此激發免疫爲豬肺炎黴漿菌專一性，測試動物之血淸學狀態摘述於表1中。在第一列試驗中之免疫原性測試：執行第一列試驗以決定是否實例2之疫苗能於疫苗接種後4個月以高於ISU建議之激發免疫量刺激保護之強免疫性，此試驗亦比較實例2之疫苗與商業上可取得之疫苗， Ingelvac M. hyo®，於免疫接種後4個月，比較其刺激保護性免疫之能力。 22隻經疫苗接種FDAH Suvaxyn MH-One之豬與8隻以經認可產品Ingelvac M.hyo®系列271，032疫苗接種之豬，以1.4X1 06個有機體之激發免疫材料（ISU建議1.0X1 〇6 個有機體，可參閱5.5部份）來激發免疫每隻豬，22隻豬作爲激發免疫對照組及1 〇隻豬作爲非激發對照組，肺傷害之百分比摘述於表2。以實例2之疫苗免疫之豬具有 15.9%之平均肺傷害，經激發免疫對照組豬具有19.6%之平均肺傷害。在以實例2之疫苗免疫組中之肺傷害少於對照組，即使當豬隻以較高劑量之豬肺炎黴漿菌激發免疫，然而，差異並不顯著（P = 〇.19)，同樣地，當商業上可取得產品Ingelvac M. hyo®在相同組之動物中以相同劑量激發免疫時被評估，相似量之肺傷害亦被獲得（14.6% )，在以 Ingelvac M. hyo®接種組與對照組間（p = 〇.27)及 Ingelvac M. hyo®接種組與接種實例2之疫苗組間（p = 〇.88)無顯著差 -¾ 〇 -27- 1320715 雖然在接受實例2之疫苗組中紀錄在傷害上無顯著的數字減少，在此試驗中所獲得之資料提出了被用於此試驗中之較高激發免疫劑量（1.4 XI 06個有機體）可能無法抵抗地，即使豬之免疫性經由商業之Ingelvac產品所刺激。此激發免疫量對於使用20-25隻之動物組之疫苗接種/激發免疫硏究評估很可能爲不適當的，雖然以較大群組很可能可証明有顯著性。於第二列試驗中之免疫原性測試：評估在第二列試驗中之疫苗接種豬及激發免疫對照組以 ISU建議之激發劑量（l.oxl 06個有機體）於疫苗接種後4 個月展示4個月 DOI。將肺傷害之百分比摘述於表3，對照組有10.4%之平均肺傷害，疫苗接種組有5.5%之平均肺傷害，疫苗接種組及對照組間有顯著差異（P = 〇. 031 )，此說明了實例2之疫苗在刺激保護性免疫上是有效的，其在單劑免疫接種3週齡豬後可持續至少4個月。兩列試驗之合倂結果之評估：儘管兩列試驗是顯著不同，而試驗在組之效果上並不顯著，組之效果之大小在兩試驗間是相似的，因此，組之效果可被評估而不需考慮試驗。雖然全模式之分析顯示組與試驗間之交互作用並不顯著，此支持了組之效果在兩試驗中皆相同之槪念，並證明兩試驗之資料合倂於單一分析中爲適當。如同當由相關於兩試驗之實例2之疫苗之資料被合倂時，且反正弦變換於肺傷害之變量被分析，以組及試 -28- 1320715 驗作爲獨立變量時（減少模式），此組爲統計上顯著的 (p = 0.0 1 3 )。表1:在對照組及疫苗接種豬中豬肺炎黴漿菌之血淸學狀態摘述第一列試驗陽性/陰性（1:10)於組別豬數 ODPV -1DPC 30DPC FDAH疫苗 22 0/22 0/22 22/22 BI疫苗 8 0/8 4/8 8/8 激發免疫對照組 22 0/22 0/22 18/22 非激發免疫對照組 10 0/10 0/10 0/10 第二列試驗陽性/陰性（1:10 )於組別豬數 ODPV -1DPC 30DPC FDAH疫苗 23 0/23 6/23 23/23 對照組 25 0/25 0/25 14/25 非激發免疫對照組 7 0/7 0/7 0/7 表2:在第一列試驗中肺傷害之百分比摘述（過量）組別豬數肺傷害之平均百分比 ρ値 Π)ΑΗ疫苗 22 15.90% 0.19" ΒΙ疫苗 8 14.60% 0.27 … -29- 1320715 對照組 22 19.60% 非激發免疫對照組 10 0% 0.881 … *每隻豬以1.4X1 06個有機體激發免疫（ISU建議劑量爲每隻豬1.ΟΧΙΟ6個有機體） # FDAH疫苗組與對照組間之比較 # # # BI疫苗組與對照組間之比較 # 1 1 BI疫苗組與FDAH疫苗組間之比較表3:在第二列試驗中肺傷害之百分比摘述（建議劑量）組別豬數肺傷害之平均百分比 P値 FDAH疫苗 23 5.5% 0.031“ 對照組 25 10.40% 非激發免疫對照組 7 0.77% -30- 1 每隻豬以ISU建議劑量激發免疫（每隻豬1.0X106個有機體） # 1 FDAH疫苗組與對照組間之比較實例4 本發明之疫苗組成物於單劑施予後6個月抗毒力激發之經誘導長期免疫性使用本質上與實例1及2所述之相同步驟且所使用之量顯示如下，以製備試驗疫苗Α。

試驗疫苗A 於1，000,000劑（每劑2ml)使用之量％vol./vol. 黴獎菌濃度（> 1 .〇x 101° MHDCE/ml) 1200,000ml 60.0 1320715 鯊垸/Pluronic L121混合物 200,000ml 10.0 Carbopol ( 2% w/v 於水中） 200,000ml 10.0 鄰乙汞硫基苯酸鈉溶液l%w/v於水中且EDTA 18,000ml 0.9 (四鈉鹽）7w/v% 無菌食鹽水 382,000ml 19.1 將此系列之pH値調整至7.0± 0.2。 MHDCE =豬肺炎黴漿菌DNA細胞同等物摘述在此評估中列入33隻21日齡豬，以肌肉內（IM)各免疫接種一劑疫苗A於20隻豬中，10隻作爲非免疫接種對照組且3隻豬作爲非激發免疫環境對照組。在免疫接種時，所有豬隻爲血淸陰性（抗體力價< 1〇)，說明了此動物係對豬肺炎黴漿菌有感受性的，對照組之所有豬隻在激發免疫前維持血淸陰性，此說明在接種疫苗組豬之免疫反應係由於疫苗而非任何環境暴露。接種疫苗後6個月，以毒力豬肺炎黴漿菌（每隻豬1.0 XI 〇6個有機體）激發免疫20隻經免疫接種豬與1〇隻非免疫接種對照豬，3隻豬作爲非激發免疫對照組豬。經免疫接種豬有3.6%之平均肺傷害且經激發免疫對照組豬有 14· 6%之平均肺傷害，此肺傷害在經免疫接種組顯著地較對照組少（P= 0.0215)。在此評估中獲得之資料說明試驗A疫苗於單劑疫苗施 -31- 1320715 予後6個月誘導抗毒力的豬肺炎黴漿菌之長期保護性免疫。實驗設計使用微軟Excel隨機程式將一窩33隻21日齡豬隨機分成3組（疫苗接種組、激發免疫對照組及非激發免疫環境對照組），20隻豬以一劑試驗疫苗A在3週齡時以肌肉內接種，1 〇隻豬作爲激發免疫對照組且3隻豬作爲非激發免疫環境對照組。於疫苗接種後6個月以l〇ml之毒力豬肺炎黴漿菌（1.0X106個有機體）培養激發免疫經接種組及激發免疫組之每隻豬，經激發免疫豬及未經激發免疫對照組在激發免疫後26天將其安樂死並評分每隻豬之肺傷害。在其頸部側邊以ΙΜ給予疫苗接種組之每隻豬2ml之單劑試驗疫苗。激發免疫與屍解有毒力之豬肺炎黴漿菌激發免疫原料，來自Iowa State University (ISU)之 Dr. Eileen Thacker 所製備之經冷凍 (S-70°C)之肺臟均質物，此激發免疫原料被確認爲純的且每ml含有約107個豬肺炎黴漿菌有機體。以10ml之1:100之經稀釋原料（即約l.OxlO6有機體）激發免疫豬隻。在激發免疫日，在溫水中將均質物快速解凍，並使用無菌豬肺炎黴漿菌生長培養基依據ISU建議而稀釋’給予由 50mg/ml之甲苯唾嗪、50mg/ml之K他命及100mg/ml之特 [S] -32- 1320715 拉哩組成之混合物（Xylazine-Ketamine-TelazolTIV 隻，此麻醉劑混合物經IM以0.01-0.02ml/lb.體每隻豬給予單劑l〇ml之激發免疫材料（1.0x1 06] 經由氣管內施予。爲確保針頭放置是正確的，在疫劑量打入前先抽取空氣至針筒中，將非接種疫發免疫對照組豬維持於分開之房間且不被激發免；在激發免疫後（DPC) 26天，將所有豬安樂死移出並如實例3所述評分巨觀肺傷害。樣品收集及試驗：在疫苗接種第〇天（0DPV)、35DPV、-1DPC 收集所有豬隻之血液樣品，藉由競爭性ELISA DAKO Co.製作）偵測抗豬肺炎黴漿菌血淸抗體，在測試前被儲存於S -20°C。資料分析：藉由單向 ANOVA比較接種疫苗組與對照組間評分，肺評分被反正弦變換以改進誤差分布。由評分之常態假定爲不可靠的，因此將肺傷害評分變換肺傷害以Wilcoxon Rank Sum測試分析，顯定爲P<0.05，爲了報告目的，使用由無參數之 Rank Sum測試之結果》結果及討論血淸學：以商業上競爭性ELISA套組測試所有豬隻抗 Ο鎭定豬重給予。隊機體），將激發免苗之非激变。，將肺臟及 26 DPC 套組（由血淸樣品之肺傷害於肺傷害及正反弦著程度設 Wilcoxon 豬肺炎黴 -33- 1320715 漿菌之血淸抗體，於所有測試上使用1:10之血淸稀釋，依一套組說明書測試結果之樣品有懷疑時在資料分析上被視爲陽性，所有豬隻在疫苗接種時爲血淸陰性的（抗體力價 < 10)，指出此等動物對於豬肺炎黴漿菌是有感受性的。對照組中之所有豬隻在激發免疫前維持血淸陰性。在疫苗接種後，20隻疫苗接種豬之15隻（15/20)至少有一次成爲對豬肺炎黴漿菌爲血淸陽性（收集自35DPV及-1DPC之樣品），此指出在疫苗接種組豬中之免疫反應係由於疫苗而非任何環境之暴露，所有接種疫苗豬及1〇隻激發免疫對照組之4隻在激發免疫後成爲對豬肺炎黴漿菌爲血淸陽性，而所有非激發免疫動物維持血淸陰性。試驗動物之血淸學狀態摘述於表4中。肺傷害評分 20隻接種試驗疫苗A及10隻未接種疫苗對照組之豬於疫苗接種後6個月以毒力豬肺炎黴漿菌（每隻豬1.0X106 個有機體）激發免疫，3隻豬作爲未激發免疫對照組。20 隻疫苗接種豬之8隻（40%)在激發免疫後不會發展肺傷害，然而在對照組中10隻豬中只有1隻（10%)沒有肺傷害。經疫苗接種豬有3.6%之平均肺傷害且激發免疫對照組有14.6%之平均肺傷害評分，在疫苗接種組中肺傷害顯著少於對照組（ρ = 0·0215)。表4:在此硏究中豬對豬肺炎黴漿菌之血淸學狀態* 陽性數（1:1〇) /總數 -34- 1320715 組別處理豬數〇DPV** 35 DPV -1DPC"* 26DPC 1 疫苗徽發免疫 20 0/20 9/20 12/20 20/20 2 對照組/激發免疫 10 0/10 0/10 0/10 4/10 3 對照組/未激發免疫 3 0/3 0/3 0/3 ‘0/3 *使用商業上套組之ELISA來測試對豬肺炎黴漿菌之血淸抗體之血淸樣品。所有樣品以血淸1:1 〇稀釋來測試，經套組之說明書解釋此結果。可疑樣品在1:1 〇下被視爲陽性。 * * DPV =疫苗接種後天數 * * DPC =激發免疫後天數表5:以豬肺炎黴漿菌激發免疫豬及未激發免疫豬對照組之肺傷害評分（％)之摘述組別 » 處理豬數肺傷害概標準誤差平均數之下平均數之 P値** 之平均％ 95%CL* 上 95%CL 1 疫苗/激發免疫 20 3.6 7.6 0.07 7.19 0.0215 2 對照組/激發免疫 10 14.6 20.0 0.33 28.94 3 對照組/未激發免疫 3 1.8 1.8 -2.67 6.27 CL =信心程度。 * P値爲第1及2組之比較。如表4及5中所示資料可見，試驗疫苗a於單劑施予3 週齡豬後6個月誘導抗有毒力的豬肺炎黴漿菌激發免疫之保護性免疫。 -35- 1320715 實例5 豬流行性感冒病毒疫苗可以此項技藝中習知方法製備，又，SIV株如H1N1及H3N2，亦爲此項技藝中所習知且可迅速取得，例如自NVSL、Ames' Iowa、USDA及其他處。此等株一般可被增殖，例如，使用於Maidin Darby犬腎臟細胞株（MDCK)，例如以Opti-Meη®生長培養基，適量補充一或多種胎牛血淸、牛血淸白蛋白、乳白蛋白、 hydrosylate ’及重碳酸鈉。在一實例中，爲了促進最佳病毒生長，用於增殖H1N1株之生長培養基將進一步補充適當量胰蛋白腺磷酸鹽肉汁、丁酸鈉及胰蛋白酶；且用於增殖H3N2株之生長培養基將進一步補充適當量之胰蛋白酶。在收取時，經收取的病毒液可以福馬林使其不活化。一種含有此等疫苗株之SIV疫苗組成物然後一般可以如下方式調配： SIVH1N1 (2 每 1Π11400ΗΑ 單位） 20,000ml SIV H3N2 ( 2每 lml 200 HA 單位） 20,000ml

Carbopol (2%溶液） 5,000ml 鄰乙汞硫基苯酸鈉（5%溶液） 50ml MEM或經平衡鹽溶液 4,950ml 總共 50,000ml 一種含有如本發明SIV之組成物一般可以如下方式製備：黴漿菌濃縮物⑵ X l〇1〇MHDCE/ml) 100,000ml SIV H1N1 ( 2每 lml 5120 HA 單位）21067 HA 單{έ/ml 75,000ml SIV H3N2 ( g每 lml 2560 HA 單位）21533 HA 單位/ml 56,000ml -36- 1320715 鯊 ^PluronicL121 混合物 200,000ml Carbopol (2%溶液） 100,000ml 鄰乙汞硫基苯酸鈉（5%溶液） 7690ml MEM或經平衡鹽溶液 611,310ml 總共 1,000,000ml 執行三種不同硏究以證明組成物中各種分率之效力，每一硏究隨機將適當年齡之豬隻分成3組：接種疫苗組、於欲測試之部分之激發免疫對照組，及環境對照組。此等硏究之結果如下：硏究摘述-豬肺炎黴漿菌部分設計此動物試驗以證明豬肺炎黴漿菌部分在豬流行性感冒疫苗H1N1及H3N2死毒豬肺炎黴漿菌菌苗（依據本發明）及SIV部分抗原阻礙物缺乏之效力。在疫苗接種時所有豬爲血淸陰性（抗體力價< 10)，說明動物對豬肺炎黴漿菌是有感受性的，對照組所有豬隻在激發免疫前維持血淸陰性，此說明在疫苗接種豬中之免疫反應係由於疫苗而非環境暴露造成。在1週齡接種SIV疫苗（疫苗A)之22隻豬在第一次接種疫苗後3週以ΜΗ/SIV疫苗（疫苗B)再次接種。22 隻作爲豬肺炎黴漿菌激發免疫對照組及3隻作爲環境對照組，第二次疫苗接種後4週，經疫苗接種豬及激發免疫組 -37- 1320715 以毒力的豬肺炎黴漿菌激發免疫，豬隻在激發免疫後28 天被安樂死並評分每隻豬之肺傷害。在對照組20隻豬之18隻豬（90% )發展的肺傷害評分大於5%，反之，在疫苗接種組21隻豬中只有8隻豬（38%) 肺傷害評分大於5%。接種疫苗組有10.2%之平均肺傷害，激發免疫對照組有16.9%之平均肺傷害，在接種疫苗組及對照組間有顯著差異（Ρ = 〇·〇2)，此指出了以SIV疫苗在1 週齡接種豬隻並以MH/S IV疫苗在3週後接種豬隻會發展出抗毒力的豬肺炎黴漿菌激發免疫之保護性免疫，此亦指出在MH/SIV組成物疫苗中SIV部分在豬肺炎黴漿菌部分上無抗原阻礙效果。硏究摘述-SIV Η1Ν1部分設計此動物試驗以證明豬流行性感冒疫苗Η1Ν1及Η3Ν2 死毒疫苗-豬肺炎黴漿菌菌苗（依據本發明）中豬流行性感冒病毒（SIV) Η1Ν1部分之效力。在疫苗接種時所有豬對SIV Η1Ν1爲血淸陰性（抗體力價<1〇)，對照組所有豬隻在激發免疫前維持對SIV Η1Ν1 爲血淸陰性，此說明在疫苗接種豬中之保護性免疫反應，以激發免疫證明，其係由於疫苗而非環境暴露造成。在1週齡接種SIV疫苗（疫苗Α)之25隻豬在第一次接種疫苗後2週以SIV-ΜΗΡ疫苗（疫苗Β)再次接種。24 隻作爲激發免疫對照組及5隻作爲環境對照組，於第二次疫苗接種後3週，豬隻被觀察所有臨床症狀並在激發免疫 -38- 1320715 前2天直到激發免疫後（D PC )5天每日記錄肛溫，在5 DP C 將豬安樂死並評分每隻豬之肺傷害。經由在〇 DP C、3DPC 及5 DPC收集之鼻拭樣及於屍解中收集肺組織樣品中企圖病毒分離。在激發免疫前（〇 DPC )自豬收集之鼻拭樣未分離出病毒，激發免疫後（3 DPC及5 DPC )由對照組24隻豬中有 14隻豬分離出病毒，與接種疫苗組比較，疫苗接種組25 隻豬中有1隻，在鼻的病毒散佈中，在接種疫苗組及對照組間有顯著差異（Ρ = 〇·〇〇11)，亦自24隻對照組豬中之Μ 隻及25隻疫苗接種豬的屍解所收集之肺臟組織樣品中分離出病毒，在接種疫苗組及對照組間有顯著差異（Ρ< 0.000 1 )。在激發免疫後自24隻對照組之19隻豬（79%) 收集分離之病毒且25隻接種疫苗組中只有2隻（8%)分離出病毒。此外，SIV Η1Ν1激發免疫亦誘導發熱反應，然而接種疫苗及對照組之間，整體發熱反應並不顯著 (ρ = 0.07 )，對照組與接種疫苗組比較，其在2 DPC有顯著較高溫度提昇（Ρ = 0.0355)。由激發免疫誘發之臨床症狀非常輕微且個別症狀之發生率很低，因而不適合使用此等資料作爲激發免疫評估。接種疫苗組有6.9%之平均肺傷害，激發免疫對照組有9.2%之平均肺傷害。總而言之，病毒在鼻腔散佈之發生率和頻率以及自肺臟組織分離出病毒之普遍性，於接種疫苗組與對照組比較上是顯著較低的，與對照組豬比較，接種疫苗豬於激發免疫 -39- 1320715 後亦經歷較少發熱反應且亦有較低肺傷害，此說明接種疫苗豬受保護可對抗SIV H1N1之激發免疫。硏究摘述-SIV H3N2部分設計此動物試驗以證明豬流行性感冒疫苗H1N1及H3N2 死毒疫苗-豬肺炎黴漿菌菌苗（依據本發明）中豬流行性感冒病毒（SIV) H3N2部分之效力。在第一次疫苗接種當曰（0 DPV1)所有豬對SIV H3N2 爲血淸陰性（抗體力價<10)或有低母體抗體，在激發免疫時彼等豬隻中之母體抗體力價會降低至血淸陰性，對照組所有豬隻在激發免疫前維持血淸陰性，此說明在疫苗接種豬中之保護性免疫反應，以激發免疫證明，其係由於疫苗而非環境暴露造成。在1週齡接種s IV疫苗（疫苗A)之22隻豬在第一次接種疫苗後3週以SIV-ΜΗΡ疫苗（疫苗B)再次接種》18 隻豬作爲激發免疫對照組及5隻作爲環境對照組，豬隻被觀察所有臨床症狀並在激發免疫前3天直到激發免疫後 (DPC) 5天每日記錄肛溫，在5DPC將豬安樂死並評分每隻豬之肺傷害。經由在〇 DPC、3 DPC及5 DPC收集之鼻 » 拭樣及肺組織樣品中企圖病毒分離。 SIV H3N2毒力株激發免疫在對照組中誘發發熱反應，然而對照組有78%發熱，接種疫苗組只有18%發熱’接種疫苗組及對照組間之發熱反應有顯著差異（Ρ = 〇 ·00〇2 )。由激發免疫誘發之臨床症狀是輕微的且個別症狀之發生率是 -40- 1320715 低的，在激發免疫對照組之6隻豬（3 3 % )有咳嗽1至2 天，反之，接種疫苗組只有2隻豬（9.1%)有咳嗽。在接種疫苗組及對照組間之其它臨床症狀則相似地無顯著差異。在對照組18隻豬中之15隻豬（83%)發展肺傷害評分大於5%，反之，在接種疫苗組22隻豬中只有5隻（23%) 經評估之肺傷害大於5%。接種疫苗組有4.9%之平均肺傷害，激發免疫對照組有23.22%之平均肺傷害，接種疫苗組及對照組間之肺傷害評分有顯著差異（P = 〇.〇〇〇3)。無病毒自激發免疫（〇 DPC )前之豬所收集的鼻拭樣中分離出，在3 DPC時收集之鼻拭樣中，對照組18隻豬中有12隻 (67% )分離出病毒，與22隻接種疫苗組之5隻（23%) 比較。在對照組18隻豬中有3隻在5 DPC收集之鼻拭樣中分離出病毒，但自任何接種疫苗組豬中未分離出病毒，在對照組18隻豬中有3隻在屍解（5 DPC )收集之肺臟組織樣品中分離出病毒，但自任何接種疫苗組豬中未分離出病毒。於激發免疫後，接種疫苗組及對照組間之自鼻拭樣分離病毒上（個別日之P = 〇.〇〇35，在合倂3 DPC及5 DPC 之病毒散佈之 p = 〇.〇〇〇8)及自肺組織有顯著差異 (ρ = 0.0 1 3 ) ° 總而言之，與對照組比較時，激發免疫後之接種疫苗豬經歷顯著較少發熱反應且亦有較低肺傷害評分，接種疫苗組與對照組間，在病毒在鼻腔散佈以自肺臟組織樣品恢復病毒上有顯著差異，此說明在1週齡接種SIV疫苗並於3 -41 - 1320715 週後以 SIV-ΜΗΡ疫苗作第二次加強之豬發展可對抗SIV Η 3 N2之激發免疫之保護性免疫。

Claims

1320715 第92 11 29 18號「改良之豬肺炎黴漿菌菌苗」專利案 (2009年8月修正）拾、申請專利範圍： 1.—種用來免疫動物對抗豬肺炎黴漿菌（ Ayc»/7/7ei//nc>y7/ae)及病毒病原感染之疫苗組成物，其包含一種免疫量之豬肺炎黴漿菌菌苗； —種免疫量之選自豬流行性感冒病毒（SIV)、豬繁殖與呼吸道症候病毒（PRRSV )，及豬環狀病毒（PCV ) 組成之群之至少一種病毒抗原：一種佐劑混合物，其包含丙烯酸聚合物及一種可代謝油與聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物；及一種醫藥上可接受載劑，此疫苗組成物於單劑施與後激發對豬肺炎黴漿菌之保護性免疫。 2 .如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中佐劑混合物由一種丙烯酸聚合物及一種可代謝油之混合物組成，此可代謝油混合物含有一或多種萜烴及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，丙烯酸聚合物與可代謝油/聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物混合物之比率爲約1:25至1:50。 3. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中此佐劑混合物包含約1-25 % v/v之疫苗組成物。 4. 如申請專利範圍第3項之疫苗組成物，其中丙稀酸聚合物以最終濃度約1%ν/ν存在且萜烴/聚氧乙烯-聚氧丙爲嵌段共聚物混合物以最終濃度約5%至1〇%ν/ν存在。 1320715 5. 如申請專利範圍第3項之疫苗組成物’其中佐劑混合物包含約2%至15 % v/v之疫苗組成物。 6. 如申請專利範圍第5項之疫苗組成物，其中佐劑混合物包含約5 %至12 % v/v之疫苗組成物。 7. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中可代謝油爲鯊烷或鯊烯。 8. 如申請專利範圍第6或7項之疫苗組成物，其中丙烯酸聚合物爲卡波姆（carbomer)。 9. 一種疫苗組成物之用途，其用於製備保護動物對抗由豬肺炎黴漿菌及至少一種病毒抗原引起之疾病之疫苗，該組成物包含一種免疫量之豬肺炎黴漿菌菌苗； —種免疫量之選自豬流行性感冒病毒（SIV)、豬繁殖與呼吸道症候病毒（PRRSV )，及豬環狀病毒（PCV ) 組成之群之至少一種病毒抗原；一種佐劑混合物，其包含丙烯酸聚合物及一種可代謝油與聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物之混合物；及一種醫藥上可接受載劑，此疫苗組成物於單劑施與後激發對豬肺炎黴漿菌之保護性免疫。 10. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該細菌之免疫量約 1 X 108 至 3 X lO^MIIDCE/ml。 11. 如申請專利範圍第 10項之用途，其中該細菌之免疫量 1320715 約 lxio9 至 3xi09MHDCE/ml» 12. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該施予步驟之施予模式爲肌肉內、皮下、腹腔內、液化氣體、口服或鼻內。 13. 如申請專利範圍第9項之用途，其中佐劑混合物係由一種丙烯酸聚合物及一種可代謝油之混合物所組成，該可代謝油包含一或多種萜烴及一種聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以約1-25 % v/v之最終濃度存在。 14. 如申請專利範圍第13項之用途，其中佐劑混合物之丙烯酸聚合物爲卡波姆。 15. 如申請專利範圍第 13項之用途，其中佐劑混合物之可代謝油爲一種選自鯊烷及鯊烯之群之萜烴。 16. —種用來免疫動物對抗豬肺炎黴漿菌及病毒病原感染之疫苗組成物，此疫苗組成物包含一種免疫量之豬肺炎黴漿菌菌苗； —種免疫量之選自豬流行性感冒病毒（SIV )、豬繁殖與呼吸道症候病毒（PRRSV )，及豬環狀病毒（PCV) 組成之群之至少一種病毒抗原；及 —種佐劑系統，爲水包油型式之乳劑，含有一種丙烯酸聚合物、一種可代謝油及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；此疫苗組成物於單劑施予後激發對豬肺炎黴漿菌之保護性免疫。