FI82264C - Framstaellningen av noetets modifierade diarrevirusstammar. - Google Patents

Description

1 82264

Naudan muunnettujen diarreaviruskantojen valmistus ~ Framställningen av nötets modifierade diarrevirusstammar

Keksintö koskee naudan muunnettujen diarreaviruskantojen (BVD) valmistusta.

Naudan virusperäinen diarrea on yksi laajimmalle levinneistä ja taloudellisesti merkityksellisimmistä nautakarjan sairauksista. Se havaittiin ensinnä Yhdysvalloissa (Olafson et ai.,

Cornell Vet. 3_6; 205-213, 1946) , kun karjalaumoissa puhkesi äkillinen, usein kuolemaan johtanut karjaruttoa muistuttava syndrooma, johon liittyi haavaumia ruuansulatuselinten limakalvoissa sekä ripulia. Samanaikaisesti selostettiin vastaavia tapauksia, joiden vakavuusaste, kroonisuus ja esiintymistiheys vaihtelivat, ja niille annettiin nimeksi limakalvosairaus (Ramsey F.K. et ai., North Am. Vet. 3_4.:629-633, 1953). Jonkin aikaa luultiin, että esiintyi useita erilaisia tartuntoja. Ajan mittaan kuitenkin päädyttiin siihen, että kumpikin syndrooma oli saman viruksen aiheuttama, mutta tämä tapahtui vasta sitten, kun molemmat termit olivat juurtuneet kirjallisuuteen ja termi limakalvo-sairausoireryhmä oli yleisessä käytössä. Useimmiten sairautta nimitettiin naudan virusdiarreaksi.

BVD:n etiologinen synnyttäjä on RNA-virus , joka luokitellaan Togaviridae-heimoon kuuluvaksi ruttovirukseksi (Andrewes C, et ai., Viruses of the Vertebrates, 4th ed., London; Bailliere Tindall, 1978) .

Kliinisen sairauden ilmenemismuodot vaihtelevat kentällä huomattavasti. Yleensä 7-11 vrk:n itämisaikaa seuraa 1-2-vaiheinen kuumetila (39,5-41,5°C), anorexia ja diarrea. Joskus diarrea etenee siten, että ilmenee sulamattoman ruuan oksentaminen, veripaakkuja sisältävää limaa, kurkkumätäisiä alueita sekä voimakas ulostuspakko. Huolimatta samanaikaisesta polydipsiästä eläimet kärsivät nestevajausta ja menettävät nopeasti hyvän kuntonsa.

2 82264

Vaikka BVD tavallisesti aiheuttaa tartunnan ruuansulatuskanavassa, on arveltu että oireiden eteneminen alkaa tavallisesti hengitystien välityksellä: ensin nenästä valuu limaa, joka myöhemmin muuttuu märkäiseksi; ja sen lisäksi ilmenee polypnoeaa ja yskimistä (S.F. Rosner, Iowa Vet. 35.: H~14, ]964). Useat tutkijat ovat myös maininneet, että esiintyy nenästä tulevaa eritettä, joka muuttuu heramaisesta märkäiseksi limaksi.

Sairauteen liittyvät pääasialliset patologiset muutokset ovat ruuansulatuselinten limakalvon hyperaemia, verenvuoto, ödeema, sierrettyminen ja haavautuminen. Myös havaitaan hengitysteiden limakalvoissa verentungosta sekä keuhkoödeemaa. Erityisesti tartunnan alkuvaiheessa esiintyy voimakas leukopenia. Valkoisten verisolujen määrän havaittiin palautuvan normaalitasolle noin 14 vuorokauden kuluttua keinotekoisesta tartutuksesta lukien (Scott F.W. et ai., Cornell Vet. 63:536-560, 1973).

Tällä perusteella, Mills J.H.L. et ai. (Am. J.Vet.Res. 29: 1367-1375, 1968) arvelivat, että tauti leviää hengitysteiden välityksellä.

Synnynnäistä immunotoleranssia BVD-infektiolle on pidetty mahdollisena syyllisenä harvoin kuolemaan johtavalle sairaudelle, ja tiedetään, että kortikoidi-käsittelyllä aiheutettu immuno-depressio vahvistaa keinotekoisen BVD-infektion virulenssia. Eläimet, joiden vastustuskyky oli heikennetty, menehtyivät usein yleistyneeseen viraemiaan (Rohde, G, et ai., Zbl. Vet. Med. 17 B:686, 1970, ja Shope R.E. et ai.. Can.J.Comp.Med. 40:355-359, 1976).

Siinä vaiheessa, kun laumassa havaitaan selviä kliinisiä merkkejä, infektio on yleensä päässyt hyvään vauhtiin yksilöissä ja koko karjassa. Tällä hetkellä ei ole tarjolla spesifisiä terapeuttisia keinoja kliinisten tapausten hoitamiseksi. Jos sairaus on vakava, se tavallisesti aiheuttaa kuoleman, jos taas lievä, antibiooteilla voidaan nopeuttaa paranemista, sillä näin voidaan hallita sekundäärisiä infektioita.

3 82264

Tavallisissa maatilaolosuhteissa ovat yritykset pitää yllä "suljettua karjaa" osoittautuneet riittämättömiksi BVD-viruksen aiheuttaman infektion ehkäisyssä. Näin ollen ehkäisymenetelmät perustuvat suurelta osin rokotteisiin.

Inaktivoituja rokotteita on tutkittu paljon (McClurkin A.W. et ai., Pro. US Anim. Health Assoc. 79:114-123, 1975). Tähän mennessä niitä ei ole ollut kaupallisesti saatavissa. Niiden käyttöä on haitannut puute sellaisista menetelmistä, joilla voitaisiin tuottaa hyväksyttäviä annosmuotoja, joilla saataisiin annetuiksi tarvittavat antigeenimäärät taloudellisesti. Julkaisuista US-3 907 986, US-3 527 208 ja US-3 962 424 tunnetaan kemiallisella mutatointimenetelmällä aikaansaatuja lämpö-herkkiä naudan Rhinotracheitis- ja Adenoviruskantoja rokote-käyttöön. Myös US-patentissa 3 629 413 on esitetty rokote kolmelle naudan virustaudille.

Joitakin eläviä BVC-rokotteita on markkinoilla. Kuten R.M. Phillips et ai. (Am. J. Vet. Res 36:135-140, 1975) ovat selostaneet, "BVD-rokotteita kehitettiin aluksi siten, että virus heikennettiin viemällä se sarjassa kanien tai naudan maksasolu-viljelmien läpi. Nämä rokotteet osoittautuivat tehokkaiksi BVD-virusinfektioiden ehkäisemisessä nautakarjassa, mutta rokotuksen jälkeisistä komplikaatioista on ollut mainintoja". Samassa julkaisussa selostettiin myös eläviä BVD-virusrokotteita, jotka oli heikennetty sikojen solulinjassa.

Kuitenkaan tarjolla olevilla elävillä BVD-rokotteilla ei voida välttää ennestään tunnettuihin liittyviä vaaroja (Terpstra, C., Eikelenboom, J.L. and Glas, C., Proceedings of the Xllth world congress on diseases of cattle, vol. 1:177, 1982).

Useita vaikuttavia syitä, jotka ovat muita kuin rokotekannan itsensä virulenssi, on esitetty yritettäessä selittää niitä vakavia rokotuksen jälkeisiä komplikaatioita, jotka esiintyvät vaihtelevassa määrin; kuitenkin alkuperän toteaminen on vaikeata ja rokotteet on asetettu vakavasti kyseenalaisiksi.

Nyt esillä olevalla keksinnöllä vältetään nykyään tiedossa olevat eläviin BVD-rokotteisiin liittyvät vaarat tarjoamalla muunnettuja kantoja, jotka ovat BVD-viruksen lämpöherkkiä (ts) mutanttikantoja, so. kantoja, joiden lisääntymiskyky on huomat- 4 82264 tavasti rajoittunut eläimen ruumiinlämpötilassa, mutta jotka kykenevät saamaan aikaan immuniteetin naudoissa ilman vakavia sivuvaikutuksia. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisessa patenttivaatimuksessa.

Tämän keksinnön mukaiset muunnetut kannat valmistetaan aiheuttamalla mutaatioita BVD-viruskannoille, tarkemmin sanottuna käsittelemällä BVD-viruskanta kemiallisella mutageenilla, kuten käsittelemällä typpihapokkeella BVD-virus, joka on eristetty tartunnan saaneesta eläimestä, esim. villityyppiä oleva BVD-kanta, joka on eristetty ja talletettu Euroopan patenttisopimuksen (EPC) sääntöjen mukaisesti 20. heinäkuuta 1982 kokoelma-numerolla 1-198 Pasteur-instituutin, Pariisi, kokoelmiin "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes". Kanta 1-198 saadaan antamalla tyypillisen naudan diarreaviruksen kasvaa vasikan kivessoluissa.

Mutaatioiden aikaansaaminen kemiallisilla aineilla on alalla tunnettu menettelytapa ja tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi sopivia mutageenisia aineita ovat edellä mainitun typpihapokkeen lisäksi mm. N-metyyli-N-nitroso-N-nitroguanidiini, metyylimetaanisulfonaatti, etyylimetaanisul-fonaatti, 5-bromiurasiili, 2-aminopuriini, hydroksyyliamiini ja akridiiniväriaineet, kuten 5-aminoakridiini ja proflaviini. Tarkemmin sanottuna US-patenteissa 3 907 986 ja 3 962 424 selostetaan lämpöherkkien virusmutanttien valmistusta typpiha-pokekäsittelyllä ja mainittujen mutanttien käyttöä elävissä virusrokotteissa nautakarjan hengityselinsairauksien ehkäisyssä. Kuitenkaan lämpöherkkiä BVD-virusmutantteja ei tunneta ennen tätä keksintöä.

Tämän keksinnön mukaisesti, kun halutaan valmistaa rokote-kanta villityyppisestä BVD-viruskannasta, kannan annetaan reagoida kemiallisen mutageenin, esim. typpihapokkeen kanssa, toimintalolosuhteissa, jotka vähentävät alkuperäistä virus-tiitteriä 2-3 log^o^10' ja viljelemällä saatuja mutantteja 35°C:ssa ja 39,5°C:ssa vastaavasti ja lämpöherkkä (ts) mutantti eristetään sen jälkeen sen perusteella, että sen kasvukyky 39,5°C:ssa (joka on naudan sisäelinten lämpötila), on n. 3 log^Q pienempi kuin sen kasvukyky 35°C:ssa.

Lämpöherkkä mutanttikanta eristetään kloonaamalla 5 82264 mihin tahansa sellaiseen kudosviljelmään, jonka tiedetään hyväksyvän naudan diarreaviruksen kasvun (esim. joko naudan munuais-solulinja, joka on taltioitu ja rajoituksitta saatavissa American Type Culture Collection-kokoelmista kokoelmanumerolla ATCC CC144, tai naudan turbinalissolukerros, jota ovat selostaneet McClurkin A.W. et ai. julkaisussa Arch. Gesam. Virusforsch. 45^285-289, 1974) sopivana laimennuksena niin, että voidaan valita kloonit laimennuksen loppupisteessä.

Tarkemmin sanottuna villityyppisen kannan, joka on eristetty eläimestä, jolla esiintyy tyypilliset naudan virusdiarrean oireet, esim. C.N.C.M. I-198-viruskanta, annetaan lisääntyä kudosviljelmässä, jossa naudan diarreavirus kykenee kasvamaan, esim. naudan munuaissolulinja tai naudan turbinalissolulinja, kun mainittu kanta on mahdollisesti ensin mukautettu mainittuun kudosviljelmään, ja mainitun naudan diarreavirussuspension annetaan reagoida huoneen lämpötilassa kemiallisen mutageenin kanssa, esim. puskuroitu typpihapokkeen vesiliuos, kuten typpihappo etikkahappopuskurissa, jossa typpihapokkeen ja asetaatti-ionin väkevyydet ovat 4 N ja N vastaavasti, 1-15 min ajan esim.

6 (_+ 1) minuuttia, pH-alueella 5-6, esim. pH 5,7 (_+ 0,1), jonka ajanjakson jälkeen reaktio pysäytetään esim. säätämällä pH-arvoon 7,5 (_+ 0,5) lisäämällä tipoittain 1 N natriumhydroksidia. Sen jälkeen suspensio on edullista dialysoida ja laimennettujen erien annetaan kasvaa kudosviljelmässä edellä kuvatulla tavalla. Sen jälkeen positiivisia viljelmiä kasvatetaan vertaamalla toisiinsa ja titrataan 35°C:ssa ja 39,5°C:ssa ja valitaan ne kannat, joiden tiittereiden ero on n. 3 log^^ TCID^q näiden lämpötilojen välillä. Sitten tällaisen lämpöherkän mutantin annetaan lisääntyä kudosviljelmässä, jossa virus kasvaa edellä kuvatulla tavalla, ja se kloonataan vähintään yhdellä päätepis-telaimennusläpäisyllä, jotta saadaan eristetyksi lämpöherkkä mutantti, esim. C.N.C.M. I-199-viruskanta.

Kun immuunisuudeltaan heikennetyille eläimille suoritettiin laboratoriokoe rokotteella, josca oli C.N.C.M. I-199-kantaa, 6 82264 havaittiin, että tämä keksinnön mukainen rokote osoitti selviä viitteitä paremmuudesta ennestään tunnettuihin rokotteisiin verrattuna.

Se vähäinen oireiden ilmeneminen, joka havaittiin C.N.C.M. I-199-kannalla, on todella jyrkästi vastakkainen sille huonolle kliiniselle kuvalle, joka on annettu tutkimuksissa, joissa on käytetty joko virulentteja tai "heikennettyjä" BVD-kantoja immuunisuudeltaan heikennetyissä eläimissä. Tätä eläinmallia käyttämällä saatuja tutkimuksia, joissa on käytetty virulentteja kantoja, on julkaissut Shope R.E. et ai.. Can.J.Vomp.Med. 40: 355-359, 1976 ja tuloksia, joissa on käytetty "heikennettyä kantaa" ovat julkaisseet Bittle J.S. ja House J.A., J.A.V.M.A.

163:878-879, 1973. Tässä viimeksimainitussa tapauksessa Bittle käsitteli kahta vasikkaa deksametasonilla 11 vuorokauden ajan ja havaitsi, että eläimet pysyivät normaaleina "heikennetyllä viruksella (C24V)" tapahtuneeseen rokottamiseen asti ja sen jälkeen niillä ilmeni tyypillisiä limakalvosairauden merkkejä kuumeen ja leukopenian kera heti, kun immunodepressiivinen hoito lopetettiin. Toinen eläin kuoli 24 vuorokauden kuluttua rokottamisesta, kun taas toinen toipui ajan mittaan.

Kokeessa, jossa käytettiin tämän keksinnön mukaista C.N.C.M. 1-199-kantaa sisältävää rokotetta immuunisuudeltaan heikennetyissä vasikoissa, ei havaittu mitään limakalvosairaudelle tyypillisiä kliinisiä merkkejä, paitsi eriasteista diarreaa, joka poistui ilman sen kummempia seuraamuksia. Kuitenkaan BVD-virusta ei saatu uudestaan eristetyksi rokotetuista eläimistä, vaikka virus yritettiin päivittäin saada talteen sinä aikana, jona esiintyi ruuansulatushäiriöitä. Näin ollen kliiniset havainnot eivät liittyneet rokoteviruksen läsnäoloon rokotuksen saaneen ulosteessa tai silmien ja nenän eritteessä. Havaitut oireet eivät myöskään liittyneet viremiaan. On myös huomionarvoista, että ei havaittu geneettisesti muuttuneen rokoteviruksen ilmenemistä.

Lisäksi verrattuna ennestään tunnettuihin rokotteisiin, joiden vaikuttava aineosa on lämpöherkkä mutantti, ja jotka annetaan 7 82264 organismin kylmään kohtaan, eivät tämän keksinnön mukaiset rokotteet ole tarttuvia tätä kautta annettaessa, vaan ne pitää antaa klassista parenteraalista kautta, so. joko subkutaanisti tai eläimen lihakseen, ja siten, että mainittua parenteraalista antoa seuraa tehoste hieman, esim. muutamaa viikkoa, myöhemmin.

3 5

Rokotteen annosyksikkö sisältää mielellään vähintään 10 ' 4 TCID50 ja erityisesti vähintään 10 TCID^0 muunnettua virusta. Laboratoriokokeet, joissa käytettiin yhdistelmärokotetta, joka sisälsi tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saatua muunnettua BVD-virusta ja parenteraalisesti annettavaa toista elävää nautakarjan hengitystievirusta /so. naudan respiratorista synkytiaa-lista (BRS) virusrokotetta/, osoittivat, että muunnettu BVD-virus ei häiritse, so. ei vaikuta, toisen rokoteviruksen immuno-geenisyyteen ja näin ollen toisen toteutustavan mukaan tämä keksintö koskee nautakarjalle tarkoitettuja eläviä virusyhdistel-märokotteita, jotka sisältävät lämpöherkän BVD-virusmutantin, kuten edellä on selostettu, sekä toisen nautakarjalle tarkoitetun elävän virusrokotteen, joka voidaan antaa parenteraalista kautta.

Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraavilla esimerkeillä. Esimerkki 1

Mutaation aikaansaaminen ja mutantin valinta

Naudan diarreaviruskanta, joka oli saatu sellaisen vasikan nenän limakalvosta, jolla oli tyypilliset sairauden oireet, mukautettiin vasikan kivessoluviljelmään suorittamalla 10 kertaa läpäisy mainitussa kudosviljelmässä ja saatu kanta taltioitiin Euroopan patenttisopimuksen (EPC) mukaisesti 20. heinäkuuta 1982 Pariisiin Pasteur-instituutin kokoelmiin "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (C.N.C.M.), joissa sille annettiin kokoelma-numero 1-198.

Sitten viruksen määrä lisättiin suorittamalla 6 kertaa läpäisy naudan munuaissolulinjan läpi, josta seuraavassa käytetään nimitystä NLBK^-solulinja, käyttämällä kasvualustaa, jossa oli 8 82264 50:50-seos (tilavuusosina) Eaglen perusalustaa ja minimialustaa täydennettynä 0,25 %:lla (paino/tilavuus) naudan laktalbumiini-hydrolysaattia.

1,25 ml virussuspensiota, joka oli saatu 16. läpäisystä ja sisäl-4 O

si 10 ' TCID,.„/0,1 ml, sekoitettiin seokseen, jossa oli 1,25 ml

DU

IM etikkahappo-natriumasetaattipuskuria ja 1,25 ml natriumnitrii-tin 4M vesiliuosta. Seoksen lopullinen pH oli 5,7. Sitten seoksen annettiin reagoida 6 minuuttia laboratoriolämpötilassa, jonka jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä tipoittain IN natriumhydroksidiliuosta niin, että pH:ksi tuli 7,5 (+_ 0,5). pH:n säätöä seurattiin virussuspension sisältämän fenolipunaindikaat-torin värin muutoksena.

Käsiteltyä virussuspensiota dialysoitiin välittömästi 5 tuntia 5°C:ssa (+_ 1) fosfaattipuskurisuolaliuoksessa NaCl (8 g); KC1 (0,2 g); Na2HP0^ (1,15 g); KH2P0^ (0,2 g) tislattua vettä (800 ml:aan asti), sekoitettiin MgCl2·6H20-liuoksen kanssa (100 ml:ssa tislattua vettä) ja sen jälkeen CaCl2-liuoksen kanssa (0,1 g 100 ml tislattua vettä), lopullinen liuos steriloitiin suodattamalla ja lopullinen pH oli välillä 7,2-7,4. Dialysoinnin jälkeen virussuspensiota säilytettiin nestemäisessä typessä.

Infektiokyvyn titrauskokeet suoritettiin 37°C:ssa käyttämällä neljää putkea kutakin kymmenkertaista laimennusta kohti. Saadun virussuspension jäännösinfektiointikyky oli 10 ' TCID^Q/0,1 ml alunperin käytetyn C.N.C.M. I-198-viruskantasuspension infektointi-kyvystä. Virussuspensionävtteet (0,1 ml), jotka oli laimennettu 1/9 Eaglen perusalustan ja minimialustan seokseen 50/50 (tilavuusosina) , johon oli lisätty 0,25 % (paino/tilavuus) naudan laktalbumiinihydrolysaattia, siirrostettiin 80:een NLBK^-naudan munuaissolulinjaviljelmään, ja sen jälkeen inkuboitiin 5 vrk 37°C:ssa. 80 putkesta 31:ssä ilmeni viruksen lisääntymisen aiheuttama sytopatogeeninen vaikutus. Kutakin viimeksimaini-tuista kasvatettiin toisiinsa verraten ja titrattiin 35°C:ssa ja 39,5°C:ssa. Nämä inkubointilämpötilat valittiin kasvun sallivaksi ja kasvua rajoittavaksi vastaavasti, koska alkuperäinen virus (C.N.C.M. 1-198) kasvoi yhtä hyvin molemmissa lämpö- 9 82264 tiloissa ja vahingoittui 40°C:ssa. Yhdellä eristetyllä viruksella oli tiittereiden ero 3,0 1o9]_q T<-ID5o (kudosviljelmän infektoiva annos 50 %:ssa viljelmästä) välillä 35°C ja 39,5°C, joka osoitti sen lämpöherkkyyden. Se rikastettiin lisäläpäisyl-lä (19.) samoissa toimintaolosuhteissa kuin edellisissä läpäisyissä käytettiin ja sen jälkeen kylmäkuivattiin.

Sitten virusta kasvatettiin kahdella läpäisyllä naudan turbinalis-solulinjassa, josta käytetään nimitystä NLBT^, käyttämällä edellä mainittua kasvualustaa ja virusvarasto valmistettiin läpäisyssä 21.

-4 5 Tästä virusvarastosta suoritettiin vielä kloonausläpäisy 10 ' - laimennuksessa samoissa olosuhteissa käyttämällä 96 viljelmää, joista 8 oli positiivista. Yksi näistä rikastettiin lisäläpäi- syllä (21.) samoissa olosuhteissa, jolloin saatiin siemen, joka kylmäkuivattiin pienissä lasisissa lääkepulloissa, jotka kukin 3 9 sisälsivät 10 ' TCID^q virusta. Saadun kloonin näytteet on taltioitu Euroopan patenttisopimuksen (EPC) sääntöjen mukaisesti Pariisiin 20. heinäkuuta 1982 Pasteur-instituutin kokoelmiin "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (C.N.C.M.), jossa sille on annettu numero 1-199.

Esimerkki 2 Rokotevalmiste

Siemenerästä (C.N.C.M. 1-199), otettiin näyte, siihen lisättiin vettä ja se siirrostettiin NLBT^-soluviljelmiin, jotka sen jälkeen peitettiin edellä kuvatulla ylläpitoalustalla.

Soluja inkuboitiin kasvun sallivassa lämpötilassa (35 +_ 0,5°C) 5 vrk. Sitten emäliuosta siirrostettiin uudestaan toiseen vil-jelmäsarjaan. Kun sytopatogeeninen vaikutus ilmeni 50 %:ssa monokerroksista, emäliuokset otettiin talteen ja yhdistettiin ja niihin lisättiin kasitonia (6 % paino/tilavuus) ja seosta säilytettiin -70°C:ssa. Virussuspensio sulatettiin, jaettiin lasisiin lääkepulloihin ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin pulloja, 4 joista kukin sisälsi 10 TCID^q tai sen kerrannaisia.

10 82264 Välittömästi ennen antamista rokotteeseen lisättiin fysiologista suolaliuosta (0,9 % NaCl steriilissä tislatussa vedessä) käyttämällä 2,0 ml/annos. Rokote annetaan intramuskulaari-sesti ja mielellään annetaan 2 annosta esim. 3 viikon välein.

Esimerkki 3

Muunnetun kannan lämpöherkkyys

Kummallekin kannalle C.N.C.M. 1-198 ja 1-199 määritettiin täplänmuodostusteho (EOP) ilmaistuna yksikköinä log^Q PFU (plaque forming units) per 0,2 ml inkuboimalla eri lämpötiloissa. Tulokset on esitetty taulukossa 1, josta ilmenee, että villikannan C.N.C.M. 1-198 EOP on välillä 10^' ^-10^, kun taas mutantin C.N.C.M. 1-199 optimaalinen EOP on 35-37°C:ssa, joka on 1,5 log^Q pienempi 39°C:ssa ja 3,0 log pienempi 39,5°C, eikä infektoivia viruksia saada talteen siirrostetuista viljelmistä, jotka eivät ole positiivisia CPE:lle 39,5°C.

Taulukko 1

Kanta Täplänmuodostusteho (EOP) lämpötiloissa

35°C 37°C 38,5°C 39°C 39,5°C

CNCM 1-198 4,8 4,8 NT NT 4,8 CNCM 1-199 4,2 4,2 3,6 2,7 1,2

Viruksen tiitterit määritettiin myös 35°C:ssa ja 39,5°C:ssa eri läpäisyissä ja tulokset on esitetty taulukossa 2, josta ilmenee, että ero tiittereiden välillä 35°C:ssa ja 39,5°C:ssa on vakio viruksen eri läpäisyissä.

Taulukko 2

Vertailukokeet NLBT,-solulinjassa kasvun sallivassa ja kasvun estävässä^lämpötilassa

Virus Läpäisy- Kokeiden Suhde 35°/39,5°C ^ kerta määrä „ . . ..

Geometrinen Standardi- _ _keskiarvo_poikkeama CNCM 1-198 17 17 0,2 0,1 CNCM 1-199 21 6 2,4 0,3 23 2 2,1 24 15 3,0 0,4 28 16 3,2 0,4 11 82264 (X) log TCIDsq tai PFU 35°C:ssa log TCID5q tai PFU 39,5°C:ssa

Esimerkki 4

Heikentyneisyys normaaleissa vasikoissa

Rokotteen siemenerä testattiin viidessä seronegatiivisessa eläimessä. Tätä varten 10 rokoteannokseen lisättiin kuhunkin 2 ml fysiologista suolaliuosta ja siirrostettiin kuhunkin eläimeen intramuskulaarisesti. Sama rokoteannos annettiin samalla tavalla 3 viikkoa myöhemmin.

14 vuorokautena ensimmäisen annoksen antamisesta lukien suoritettiin päivittäin kliininen tutkimus, mitattiin lämpötila peräsuolesta ja suoritettiin valkoisten verisolujen laskenta.

Mitään oireita ei havaittu. Kuten taulukosta 3 ilmenee, lämpötila ei missään vaiheessa noussut 39,2°C:n yläpuolelle.

Taulukko 3

Vrk Peräsuolen lämpötila (°C) (x) _Vasikka n;o___ _ 010_012_431_432_433 - 10 38,2 38,5 38,5 38,7 38,6 - 9 38,0 38,0 38,5 38,7 38,6 - 8 38,1 37,8 38,8 38,7 39,2 - 7 38,0 38,0 39,0 38,8 38,7 - 3 38,2 38,0 38,8 39,0 38,7 - 2 38,0 38,2 39,0 38,9 38,7 - 1 38,5 38,2 38,2 38,6 38,0 0 38,3 38,0 39,0 38,9 38,7 1 38,4 38,0 38,7 38,9 38,8 5 38,3 38,3 38,9 38,6 38,6 6 38,0 38,2 38,8 38,6 38,6 7 38,2 38,2 38,5 38,8 38,4 8 38,4 38,6 39,0 38,7 38,5 11 38,2 38,4 38,8 38,5 38,5 12 38,4 38,4 38,8 38,5 38,0 13 38,4 38,2 38,4 38,4 38,4 14 38,6 38,1 38,8 39,0 38,7 i2 82264 (x) päivä O on ensimmäisen annoksen antamispäivä.

Valkoisten verisolujen lukumäärän (WBC) keskiarvo pysyi normaalina koko havainnoinnin ajan.

Vasta-aineet BVD:n suhteen osoittivat, että eläimet olivat tulleet immuuneiksi.

Esimerkki 5

Heikentyneisyys immuunisuudeltaan heikennetyissä eläimissä Yhdeksälle vasikalle, jotka olivat seronegatiivisia sekä BVD:n suhteen että naudan hengityselinten synkytiaalivirusten (BRS) suhteen, annettiin vuorokausittain deksametasonia 0,1 mg/kg kahtenatoista peräkkäisenä päivänä alken 5 vrk ennen ensimmäisen rokoteannoksen antamista.

Neljälle eläimelle (n:ot 16, 30, 82 ja 83) annettiin rokotetta siemenerästä intramuskulaarisesti päivänä 0 ja ne saivat samalla tavalla saman annoksen päivänä 21. Päivänä O annetusta rokotteesta käytetään tässä nimitystä ensimmäinen rokotus ja ensimmäisessä rokotuksessa annettiin 105 TCID^Q esimerkissä 2 saatua rokotetta.

Päivinä 0 ja 21 kolmelle eläimelle (n:ot 13, 14 ja 19) annettiin 5 7 yhdistettyä BRS/BVD-virusrokotetta, jossa oli 10 ' TCID^ 5 -*u BRS-virusta ja 10 TCID^Q BVD-virusta. Kahdelle eläimelle (n:ot 80 ja 81) annettiin päivinä O ja 21 samaa BRS-virusroko- 5 7 tetta, jossa oli 10 ' TCID^Q virusta/annos.

14 vrk:n aikana ensimmäisestä annoksesta lukien suoritettiin kliininen tutkimus, mitattiin ruumiinlämpötila ja laskettiin valkoiset verisolut. Samana aikana neljästä rokotteen saaneesta vasikasta yritettiin eristää virus silmien ja nenän eritteestä ja ulosteesta. Tulokset ja niiden tulkinta on esitetty taulukoissa 4 ja 5.

i3 82264 e? tn ό to (O <NJ r— r? lo lo r-i +J__^__t”

^ i—I

ä r3 Ci 1^ 1/1 Cl *3- LO OC O fO

UJ-nt*'*' ·'·' “ “ “ - j) m >- O O r- N O M *3-

« J2 r- ^ N r- τ- CM

— _*a__________ ! · ! i i i i lii

Ή till I I I I III

(N

\ ! 1 ! 1 till lit j£j I i I I iiii lii

o LO

^ IOOO “I 1C ~ll

Ή I *— rvl r— Oil»— CVlII

„ LO LO

h looo «iio -il r-H I LO ro rvlllr- r-J I | 'Z ™ 2 LO o

W(N IOOO “ίσο “I I

Φ Η I LO — t— I -.— ro O I I

-u -g ^

:2οϋ1 IOOO -“IOO °“| I

£8 I ’ '"O '— I'- I r- Ki Oil rJ r— .

;to P

§ Q IOOO ^ I o o °“ I I Φ.^Ή i^-loim jv-ioo o!! m M ™ « Ο Ή ϊ O lo

.* Di .3 (y, OOOO “00-0 “I I

^ ·!3 ΙΟ -ϊ Λ (O O ro O - O f^l I

3 4-> g H to rH 0) 6 ^ _ 3 W 'S OOOO “ 1 O o “IO °“ tC -H g w r^^-LOio r^iooo lo i ίο lo .: Eh C φ ^ to T— °-'oo °“io °- r} 5 LO LO K, oiolo lo , Jo ._o

Sm — LO to .—

il LO O O

:itJ vo oooo “ ο ο ο *>io ~ $ 00 LO LO to ro r>j o lo Olio lo

fLO O

LO IOIO “IOO “||

+j to ΓΜ to to LO

Μ T- τ- 'Η

Dj lo o

•Η·'* IOIO “IOO “II

w to γη cm to to lo I ^ ξ

SCO IOIO “loo “II

to ™ tM to IO LO

B ^

>CM IIIO LOIIO LO t I C

™ to “ φ

:: hiii iii ^ii S

s

Olli III II H

---1-----1---1- ]μ Φ jew few few σ> -¾ -ίΦο -*φο 32φο φ

"So O to ο ΟΛί p O ro ^ fW>o r- p·^? C

HO (O OO CO r t- r- r- ö-aoo OO & $ : 11° I_lila Ha gal , 14 82264

Taulukko 5

Kliinisten pistemäärien laskutapa Parametri Aste Pistemäärä Pistemäärä Kliininen _Yksikkö (1) painotus (2) Pistemaarä

Apatia ei lainkaan 0 summa hieman 1 10 makuuhaava 2

Anorexia ei lainkaan 0 (1) vähentynyt ruokahalu 1 20 täydellinen 2

Diarrea normaali uloste 0 kerrottu pehmeä uloste 1 vetinen uloste 2 10 moelena 3 kuolio 4 (2): 11a

Tuloksista ilmenee, että kaikissa rokotetuissa vasikoissa ilmeni eriasteista anorexiaa ja diarreaa. Kuitenkaan yhdelläkään ei ollut ylilämpöä eikä leukopeniaa eikä BVD-virusta saatu eristetyksi otetuista näytteistä. BRS:n ja BVDrn yhdistelmän aiheuttamaa kumuloituvaa patogeenisuutta tai häirintää ei havaittu.

Esimerkki 6 C.N.C.M.-kannan 1-199 tehokkuus keinotekoista ärsykettä vastaan Eläimet, jotka rokotettiin immuunisuutta heikentävän käsittelyn aikana, saivat vasta-ainetta seerumiinsa toisen annoksen antamisen jälkeen. Niille samoin kuin kahdelle verrokille (eläimet, jotka oli rokotettu vain BRSsllä) annettiin ärsykettä päivänä 35 ensimmäisen annoksen antamisesta lukien.

Ärsykkeenä käytetty BVD-virus oli Osloss-kanta (Rohde G. ja Liess B., Zbl. Vet.Med. 17 B:686, 1970). Se annettiin sierainten 6 8 • · kautta annoksena 10 ' TCID^0 per eläin.

is 82264 14 vrk:n aikana ärsytyksestä lukien tutkittiin kliiniset oireet, ruumiin lämpötila ja valkoisten verisolujen lukumäärä. Kaikkien eläinten verestä yritettiin eristää virus.

Mitään kliinisiä oireita tai ylilämpöä ei havaittu.

Eläimillä, jotka olivat saaneet 2 rokoteannosta, ei havaittu lainkaan laskua valkoisten verisolujen määrässä ärsykkeen antamisen jälkeen, kun taas verrokit (eläimet n:o 80 ja 81) olivat leukopeenisia.

6 8

Jopa niinkään suurena annoksena kuin 10 ' TCID^/eläin Osloss-kanta ei ollut patogeeninen. Eläimissä n:o 80 ja 81, jotka oli rokotettu vain BRS-viruksella , ei havaittu ylilämpöä eikä kliinisiä oireita. Kuitenkin näillä kahdella eläimellä oli alemmat valkoisten verisolujen lukumäärät kuin vasikoilla, jotka olivat saaneet kaksi BVD-rokoteannosta, ja näissä vasikoissa ilmeni viremia. Eläimet, jotka oli rokotettu yhdistetyllä BVD/BRS-rokotteella, olivat yhtä hyvin suojattuja (n:ot 19, 13 ja 14).

Tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 6.

Taulukko 6 Ärsykkeen aiheuttama viremia

Vasikka Rokote 0 2 4 5 6 7 8 9 10 13 Indeksi n:o 16 BVD -------- 30 __________ 82 _ + 83 2/68 13 BVD/BRS -----NT-- 14 V 19 80 BRS -- + + + + + - :: 81 -_- + + + + - 9/20 - IF (Immunofluoresenssikoe) negatiivinen + IF (Immunofluoresenssikoe) positiivinen NT ei tutkittu.

ie 82264 Nämä tulokset eivät ole ristiriidassa kirjallisuudessa ilmoitettujen kanssa, koska tiedetään, että villityyppiä olevan BVD:n aiheuttama koeinfektio harvoin johtaa vakaviin kliinisiin oireisiin (Saurat P. et ai., La Maladie des Muqueuses, Ed. L'Expansion Scientifique Francaise, Paris 1972, p. 76).

Indeksi (so. positiivisten näytteiden lukumäärä verrattuna testattujen näytteiden lukumäärään) oli huomattavasti suurempi (90/20) sillä eläinryhmällä, joka oli rokotettu vain BRS:llä, kuin muilla vasikoilla, joiden joukossa 2 vasikkaa oli muuttuvasti positiivisia.

Esimerkki 7 C.N.C.M. 1-199 kannan tehokkuus kentällä 103:lie vasikalle, joiden ikä oli välillä 15 vrk - 18 kk, ja joilla oli matalat (so. <8) vasta-ainetiitterit BVD:n suhteen,

4 O

annettiin intramuskulaarisesti kaksi annosta 10 ’ TCID^Q esimerkin 2 rokotetta 3 viikon välein. Mitään rokotteeseen liittyvää kliinistä reaktiota ei havaittu, mikä osoittaa rokotteen turvallisuuden kenttäolosuhteissa.

Tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 7.

Taulukko 7

Vasta-aineita kehittäneiden / eläinten yhteismäärä määrä__

Vasta-aine- tiitteri ennen <1 1-8 Yhteensä rokotusta

Ikä (+) 42 >2 yhteensä ^2 >2 Yhteensä Yhteensä

Kokonaismäärät 9/20 51/57 60/77 2/6 6/10 8/16 68/9

Prosenttia 45 90 78 30 60 50 73 (+) kuukausina π 82264

Taulukosta 7 voidaan havaita, että kaikkiaan 73 %:lla eläimistä vasta-aineiden määrä kasvoi merkittävästi rokotuksen jälkeen. Kuitenkin tarkasteltaessa vain niitä vasikoita, jotka olivat seronegatiivisia rokotushetkellä, havaittiin selvä ero (p < 0,001) seerumin vasta-aineiden ilmenemisessä 2 kk vanhemmilla eläimillä (90 %) verrattuna nuorempiin (45 %). Seropositiivisilla eläimillä ilmeni sama suuntaus. Vanhemmilla eläimillä havaittiin parempi vaste.

Yli 2 kk vanhoissa seronegatiivisissa eläimissä lämpöherkkä kanta C.N.C.M. 1-199 sai aikaan 90 % vasta-aineiden kehittymi- 4 sestä kahden 10 TCIDc._ annoksen jälkeen. Tämä havainto ei ole

bU

ristiriidassa sen 95-98 %:n määrän kanssa, joka saavutetaan optimaalisissa olosuhteissa kaupallisilla rokotteilla (Lambert G. et ai., Modern Vet. Practice s. 34, huhtikuu 1970). Sero-konversio, joka on 50 %, ja joka havaittiin alle 2 kk:n ikäisillä vasikoilla vastaa tuloksia, jotka Smith P.E. et ai. ovat saaneet (Vet. Med. Small Anim. 6J3:457, 1968), ja jotka ilmoittivat positiivisen vasteen rokotukselle 5/10 eläimessä, joiden ikä oli alle 60 vrk, ja 42/48 vanhemmissa eläimissä, joilla oli sama immunologinen tila rokotushetkellä. Nyt tehdyssä kokeessa rokotettiin 16 seropositiivista eläintä, joilla oli matalat emolta saadut vasta-ainetiitterit, ja 50 % kehitti vasta-ainetta. Vaikka luvut ovat pieniä, nämä tulokset osoittivat, että onnistunut immunisoituminen voidaan saavuttaa yli 2 kk:n ikäisissä eläimissä, joilla on matala vasta-ainetiitteri rokotushetkellä.

Claims (1)

18 82264 Patenttivaatimus Menetelmä rokotteen valmistamiseksi naudan viraalisen diar-reaviruksen aiheuttamaa tulehdusta vastaan, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää (1) naudan viraalisen diarreaviruskannan C.N.C.M. 1-198 saattamisen kosketukseen 4N typpihapon kanssa IN asetaat-ti/etikkahappopuskurissa pH:ssa 5,7 (+/- 0,1) 6 (+/- 1) minuutin ajaksi, joka käsittely aikaansaa alkuperäisen virustiitterin alentumisen 2-3 log^Q' (2) lämpöherkän mutantin eristämisen viljelemällä naudan kudosviljelmässä ja titraamalla 35eC:ssa ja 39,5°C:ssa vastaavasti, joka mutantti omaa kannan C.N.C.M. 1-199 lämpö-herkät ominaisuudet, eli tiittereiden ero on noin 3 log^Q TCID välillä 35°C ja 39,5eC; (3) mainitun eristetyn lämpöherkän mutantin kasvattamisen naudan kudosviljelmässä mutantin lisäämiseksi. Förfarande för framställning av ett vaccin mot inflammation förorsakad av nötets virala diarrevirus, kännetecknat av att förfarandet omfattar att (1) nötets virala diarrevirusstam C.N.C.M. 1-198 bringas i kontakt med 4N salpetersyra i IN acetat/ättiksyrabuffert vid pH 5,7 (+/- 0,1) för 6 (+/- 1) minuter, vilken behand-ling ästadkommer sänkning pä den ursprungliga virustitern med 2-3 log^Q» (2) den värmesensitiva mutanten isoleras genom kultivering i nötets vävnadskultur och titrering vid 35eC och 39,5°C respektive, vilken mutant har stammens C.N.C.M. 1-199 värmesensitiva egenskaper, med andra ord differens ρΔ titrar är cirka 3 log^g TCID50 mellan 35°C och 39,5°C; (3) kultivering av nämnda isolerade värmesensitiva mutant i nötets vävnadskultur för ökning av mutanten.