CS208289B1

CS208289B1 - Avirulent strain of virus of infectious bovine rhinotracheitis and pustular vulvovaginitis,and method of cultivating the same

Info

Publication number: CS208289B1
Application number: CS469979A
Authority: CS
Inventors: Alojz Zuffa
Original assignee: Alojz Zuffa
Priority date: 1979-07-04
Filing date: 1979-07-04
Publication date: 1981-09-15

Abstract

Vyálachtenie avirulentného kmeňa virusu IBR-IPV vhodného pre přípravu živej vakcíny určenej k očkovaniu hovadzieho dobytka.Spó— sob vyšlachtenia vakcinačného kmeňa spočívá v dlhodobom sériovom pasážovaní vybraného kmeňa virusu IBR-IPV na primárných kultúrách z telaoích obličiek, jeho adaptovaní na rast na kultury z jahňacích obličiek a následnom adaptovaní, postupným znižovaním kultivačnej teploty, na rast pri nízkých teplotách, s výhodou pri 30 °Cj z takto získaného virusu sa metodou hraničných riedeni so šesťnásobným opakováním izoluje virusový klon, ktorý sa cestou alternatívnycb pasáží adaptuje na rast na králičie obličkové kultury.Vyšlachtený kmeň poskytuje možnost přípravy živej vakcíny pěstováním virusu na dvoch druhoch tkaniv, heterolognych vo vztahu k recipientovi.Flushing the avirulent virus strain IBR-IPV suitable for the preparation of a live vaccine intended to vaccinate bovine animals. of the vaccine strain rests in long-term serial passage selected of the IBR-IPV virus strain on primary cultures from kidney calves, its adaptation for growth into lamb kidney cultures and subsequent adaptation, gradual reduction cultivation temperature, to grow at low temperatures, preferably at 30 ° C, thus of the obtained virus with the borderline dilution method with a repetition of six times it isolates the virus a clone that is via alternative cb passages adapt to growth on rabbit kidney Culture. The enriched strain provides the possibility preparing a live vaccine by growing the virus on two kinds of tissues, heterologous in relation to the recipient.

Description

Vynález sa týká avirulentného kmena virusu infekčnej bovínnej rhinotracheitídy a pustulárnej vulvovaginitídy /Sálej XBR-IPV/ schopného priemyselnej multiplikácie na viacerých druhoch homológnych a heterológnych tkaniv pre přípravu živej očkbvacej látky a spósobu jeho izolácie.The invention relates to an avirulent strain of infectious bovine rhinotracheitis virus and pustular vulvovaginitis (Salia XBR-IPV) capable of industrial multiplication on a variety of homologous and heterologous tissues for the preparation of a live vaccine and a method for its isolation.

Účast virusu IBR-IPV na vývoji ochorení dýchacích a reprodukěných orgánov hovadzieho dobytka /HD/ je dnes váeobecne známa. Infekcia týmto vírusom postihuje 5 až 20 # celosvětového stavu HD a zapříčiňuje, menovite v podmienkach vysokej koncentrácie zvierat, Velké hospodářské straty. Preto sa trvale vynakládá velké úsilie na zdokonalovanie metod špecifickej profylaxie nákazy zapříčiněnéj týmto vírusom. Doposial boli proti IBR-IPV vyvinuté a používajú sa živé aj inaktivované vakciny s rozdielnou technológiou ich výroby. Pre přípravu živých vakcín sa používajú kmene, ktorých virulencia bola oslabená dlhodobým pasážovaním na buňkových kultúrách připravených z homológnych /Schwarz’A, J.F., York Ch.J., Zirbel L.V., Estela L.A. Modification of Infectious Bovine Rhinotracheitis /iBR/ Virus in Tissue Culture and Development of a Vaccine, Proč. Soc. exp. Biol. Med., 96, 453458, 1957} Straub O.C.f Moglichkeiten zur Bekampfung der Infektiosen Bovinen Rhinotracheitis /XBR/ Deutsch. Tierarztl. Wschr., 83, 270-273, 1976/, alebo heterológnych tkaniv /Todd J.D., Volenec F.J., Paton I.M, Intranasal Vaccination Against Infectious Bovine Rhinotracheitis: Studies on Early onset of Protection and Use of the Vaccine in Pregnant Cows, J.Am.Vet.Med. Ašsoc., 159,1370— 1374, 1971/ alebo pósobením mutagenov /Zygraich N., Lobmann M., Vascoboinic E., Berge E., Huygelen C. In Vivo and in Vitro Properties of a Temperature Sensitive Mutant of infectious Bovine Rhinotracheitis Virus, Res. vet. Sci., 16, 329-335, 1974/.The involvement of IBR-IPV in the development of diseases of the respiratory and reproductive organs of bovine animals (HD) is now widely known. Infection with this virus affects 5 to 20 # of the global state of HD and causes, in particular, conditions of high animal concentration, a large economic loss. Therefore, great efforts are being made to improve methods of specific prophylaxis of the disease caused by this virus. So far, both live and inactivated vaccines with different production technologies have been developed against IBR-IPV. Strains whose virulence has been attenuated by prolonged passage on cell cultures prepared from homologous / SchwarzâA, J.F., York Ch.J., Zirbel L.V., Estela L.A. Modification of Infectious Bovine Rhinotracheitis / iBR / Virus in Tissue Culture and Development of Vaccine, Proc. Soc. exp. Biol. Med., 96, 453458, 1957} Straub O.C.f Moglichkeiten z Bekampfung der Infektiosen Bovinen Rhinotracheitis (XBR) Deutsch. Tierarztl. Wschr., 83, 270-273, 1976], or heterologous tissues (Todd JD, Volenec FJ, Paton IM, Intranasal Vaccination Against Infectious Bovine Rhinotracheitis: Studies on Early Onset Protection and Use of Vaccine in Pregnant Cows, J.Am. .Vet.Med. Ašsoc., 159, 1370-174, 1971) or by mutagenesis (Zygraich N., Lobmann M., Vascoboinic E., Berge E., Huygelen C. In Vivo and In Vitro Properties of a Temperature Sensitive Mutant of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus , Res. vet. Sci., 16, 329-335 (1974)].

Spósob výroby živých vakcín sa zakladá na pomnožení avirulentného imunogénneho kmeňa na tkanivových kulturách připravených z obličiek alebo semeníkov hovddzích plodov alebo na— rodených teliat, na diploidných buňkových líniách derivovaných z bovínnych orgánov /životnost 30—40 pasáží/, připadne na buňkových kulturách připravených z iných druhov zvierat. Ak sa máju k pomnožovaniu virusu slúžiaceho pre přípravu živej vakciny použiť stabilně buňkové linie, musia byť kontrolované na onkogenitu /Perkins P.T., Safety of Vaocines., Brit. Med. Bull.The method of production of live vaccines is based on propagation of an avirulent immunogenic strain on tissue cultures prepared from kidney or bovine testicles or on native calves, on diploid cell lines derived from bovine organs (30-40 passages lifetime), or on cell cultures prepared from other cultures. animal species. If cell lines are to be stably used to propagate the virus used to prepare a live vaccine, they must be checked for oncogenicity / Perkins P.T., Safety of Vaocines., Brit. Med. Bull.

25, 208-212, 1969., Smith H, The Search for Protective Antigens, Brit. Med, Bull,, 25, 12613θ, 1969/· Použitie primárných kultúr připravených z orgánov bovínnych plodov alebo národe— ných teliat pre výrobu živých vakcín je spojené s nebezpečím přenosu infekčných zárodkov menovite virusovéj povahy, ktoré móžu latentne infikovat tieto tkanivá /Miller R.B., Quinn P. J., Observations on Abortions in Cattle: A Comparison of Pathological, Microbiological and25, 208-212, 1969. Smith H, The Search for Protective Antigens, Brit. Honey, Bull ,, 25, 12613θ, 1969 / · The use of primary cultures prepared from bovine organs or national calves for the production of live vaccines is associated with the risk of transmitting infectious germs of a particularly viral nature which can latently infect these tissues / Miller RB, Quinn PJ, Observations on Abortions in Cattle: A Comparison of Pathological, and Microbiological

Immunological Findings in Aborted Foetuses and Foetuses Collected at Abattoirs, Can. J. Comp, Med., 39, 270-290, 1974., Hubbert N.T., Bryner J.H., Fernelius A.L., Frank G.H., Estes P.C., Viral Xnfection of the Bovine Fetus and Its Environment, Arch. ges. Virusforsch., 4l, 86-98, 1973·, Massip A., Wellemaas G., Leunen J., Charleire G,, Anticorps Antiviraux dans le sérum senguin de veux nouveaunés, Ann.Rech. vírór., 5, 397-406, 1974/. Pre vylúčenie přenosu uvedených ako aj falších nemenovaných infekci! je třeba robiif dokonalú kontrolu očkovacích látok,Immunological Findings in Aborted Foetuses and Foetuses Collected at Abattoirs, Can. J. Comp, Med., 39, 270-290 (1974), Hubbert N.T., Bryner J. H., Fernelius A. L., Frank G. H., Estes P.C., Viral Xfection of the Bovine Fetus and Its Environment, Arch. ges. Virusforsch., 4l, 86-98 (1973), Massip A., Wellemaas G., Leunen J., Charleire G., Anticorps Antiviraux dans le senguin serum de noveau, Ann.Rech. vor., 5, 397-406, 1974]. To exclude transmission of listed and other unnamed infections! perfect control of vaccines,

208 289 ktorá popři tom, že je technicky, odborné a časovo velmi náročná, nezaručuje istotu odkrytia vžetlcých latentných virusových kontaminácií. Je preto velmi žiaduce použiť pre pomnožovanie atenuovaných kmeňov virusu IBR-IPV slúžiacich pre pripravu živých vakcin také druhy tkaniv, ktoré pri produkcii virusu do vysokých titrov sú prosté virusov patogénnych pre HD alebo aspoň nebezpečie přenosu infekci! živou očkovacou látkou významné znižujú. Toto nebezpečie ne— vylučujú ani linie diploidnýoh buniek, ktoré popři obmedzenej životnosti sú velmi náročné na kvalitu živných médii a kultivačného skla· Priemyselná produkcia váčších objemov vakcíny z virusu pomnožovanóho na kulturách z králičích obličiek /Todd J.D., Volenec F.J., Paton X.M·, Intranasal Vaccination Against Infectious Bov^ne Rhinotracheitis i Studios on Early Onset of protection and Use of the Vr.ccine in Pregnant Cows. J. Am. Vet. Med. Assoc., 159 . 1370-137^, 1971/ naráže na obtiaže súvisiace s malou výťažnosťou suspenzie buniek z uvedených orgánov. Spoločnou vlastnosťou jednotlivých kmeňov slúžiacich pre pripravu živých vakcin je, že sa k výrobě používá len jeden definovaný druh tkaniva.208 289 which, while being technically, professionally and time consuming, does not guarantee certainty of latent virus contamination. It is therefore highly desirable to use tissue types that are free of HD pathogenic viruses or at least the risk of infection transmission when producing virus to high titers for the multiplication of attenuated IBR-IPV virus strains used to prepare live vaccines! the live vaccine significantly reduced. This danger is not eliminated by diploid cell lines which, despite their limited lifetime, are very demanding in quality of nutrient media and culture glass. · Industrial production of larger volumes of vaccine from rabbit multiplication virus / Todd JD, Volenec FJ, Paton XM, Intranasal Vaccination Against Infectious Bovine Rhinotracheitis and Studios on Early Onset of Protection and Use of Vr.ccine in Pregnant Cows. J. Am. Vet. Med. Assoc., 159. 1370-137 (1971) encounters difficulties associated with low cell suspension recovery from said organs. A common feature of the individual strains used to prepare live vaccines is that only one defined type of tissue is used for production.

Uvedené nedostatky sú riešené podlá vynálezu, ktorého podstata spočívá v avirulentnom kmeni virusu IBR—IPV,vykazujúcom výhodné rastové schopnosti na buňkových kultúrach připravených známým spdsobom z orgánov bovínnych plodov alebo narodených teliat, jahniat a králikovThese drawbacks are solved according to the invention, which is based on an avirulent strain of IBR-IPV, exhibiting advantageous growth capabilities on cell cultures prepared in known manner from bovine organs or born calves, lambs and rabbits.

785 s obsahom 10' až 10 ΤΚΙϋ^θ vírusu/ml v infekčných tekutinách z uvedených druhov tkaniv, s velmi dobrými imunologickými vlastnosťami a spósobe jeho izolácie.785 containing 10 ' to 10 < 6 > of virus / ml in infectious fluids from said tissue types, with very good immunological properties and a method for its isolation.

Kmeň BNZ/K 4C uložený v zbierke mikroorganizmov na Výskumnom ústave veterinárneho lekár— štva v Brně Medlánkách, Hudcova 6θ pod číslom CAPM V—Z57 bol izolovaný spósobom podlá vynálezu z virulentného kmeňa IBR - IPV zo zbierky Inst. Nat. Rach. Vet. Brussel Greosselenberg 99 Brussel 18, kde sa nachádza pod označením INRV N 3760 tak, že sa tento najprv prepasážoval 250 krát na primárných kultúrach z telacích obličiek. Následné bol tento kmeň adaptovaný na buňkové kultúry z jahňacích obličiek, pričom po páťdesiaťnásobnom prepasážovaní na uvede— nom druhu tkaniva vykazoval rovnaké rastové vlastnosti na kultúrach z jahňacích obličiek ako na bovínnych obličkových kultúrach. Tento virus bol, postupným znižovaním kultivačněj teploty a tým selekciou virusových častíc s dobrými multiplikačnými vlastnosťami pri nízkých teplotách, adaptovaný na rast pri teplotách 28 až 32 °C, s výhodou pri 3°°C. V tejto fáze selekč* ného procesu sa metodou hraničných riedení so áesťnásobným opakováním na jahňacích obličkových buňkách izoloval virusový klon predstavujúci homolognu vírusovú populáciu. Homogenita vírusovej populácie bola dokázaná zachováním si nezměněných vlastností po desaťnásobnom pre— pasážovani virusu na telacích obličkových buňkách pri 37 °C a nezmenenou virulenciou po piatich sériových i.nas. pasážach na vnímavých telatách. Takto získaný virusový klon bol adaptovaný, metodou alternatívnych pasáži na buňkových kultúrach z jahňacích a králičích obličiek, na rast na kultúrach z králičích obličiek, s raetom virusu pri 30 °C. Konťrolnými testami na telatách sa dokázalo, že virus pomnožovaný na víetkých uvedených druhoch tkaniv vykazuje rovnaké rastové a imunobiologické vlastnosti ako virus pomnožovaný na kultúrach z bovínnych orgánov.Strain BNZ / K 4C deposited in the collection of microorganisms at the Veterinary Research Institute in Brno Medlánky, Hudcova 6θ under the number CAPM V-Z57 was isolated according to the invention from the virulent strain IBR - IPV from the collection Inst. Nat. Rach. Vet. Brussel Greosselenberg 99 Brussel 18, where it is found under the designation INRV N 3760 by first passing it 250 times on primary cultures of kidney calves. Subsequently, this strain was adapted to cell cultures from lamb kidney and, after fifty fold passage on said tissue type, showed the same growth characteristics on lamb kidney cultures as on bovine kidney cultures. This virus has been adapted to grow at temperatures of 28 to 32 ° C, preferably at 3 ° C, by gradually lowering the culture temperature and thereby selecting virus particles with good multiplication properties at low temperatures. At this stage of the selection process, a viral clone representing a homologous viral population was isolated by a six-fold border dilution method on lamb kidney cells. The homogeneity of the viral population was demonstrated by retaining unchanged properties after ten-fold passage of the virus on kidney cell calves at 37 ° C and unchanged virulence for five serial i.nas. passages on sentient calves. The virus clone thus obtained was adapted, by alternative passage method on lamb and rabbit kidney cell cultures, to grow on rabbit kidney cultures, with a virus screen at 30 ° C. Control tests in calves have shown that the virus propagated on many of these tissue species exhibits the same growth and immunobiological properties as the virus propagated on bovine organ cultures.

208 289208 289

Uvedeným postupom sa získal kmeň, s označením BNZ/κ 4c, ktorý má vlastnosti virusu vhodného pre přípravu žívej vakcíny proti IBR—IPV, nakolko sa vyznačuje stratou virulencie pre hovadzi dobytok rozličného veku pri zachovaní velmi dobrých imunizačných schopností, pričom z hladiska priemyselnej produkcie je vhodný najma v tom, že ho možno pre výrobně účely pomnožovať na kultúrach z bovinnych obličiek a semeníkov, kulturách z jahňacích obličiek a semeníkov, kultúrach z králičích obličiek ako aj na líniách diploidných buniek derivovaných z bovínnych a ovínnych orgánov, čo dovoluje kedykolvek produkovat požadované množstvo virusu definovaných imunobiologických vlastnosti·This procedure yielded a strain, designated BNZ / κ 4c, which has the characteristics of a virus suitable for the preparation of a live vaccine against IBR-IPV, since it is characterized by the loss of virulence for bovine animals of different ages while maintaining very good immunization capabilities. suitable, in particular, that it can be propagated for production purposes on bovine kidney and testicle cultures, lamb kidney and testicle cultures, rabbit kidney cultures and on diploid cell lines derived from bovine and ovine organs, allowing the desired amount to be produced at any time virus-defined immunobiological properties ·

Novovyšlachtený kmeň podlá vynálezu ΒΝΖ/Κ 4C CAPM V—257 je rozlišitelný od východiskového virulentného kmeňa IBR—IPV INRV Brussel N 3760 podlá rastových vlastnosti zistovaných na buňkových kultúrach a zvieratách a imunologických vlastností zistovaných na zvieratách.The newly bred strain according to the invention ΒΝΖ / Κ 4C CAPM V-257 is distinguishable from the starting virulent IBR-IPV INRV Brussels N 3760 strain according to the growth characteristics found on cell cultures and animals and the immunological properties found on animals.

Podlá rastových vlastností na buňkových kultúrach sa novovyšlachtený kmeň odlišuje od východiskového virulentného kmeňa schopnostou množit sa na kultúrach bovinnych, jahňacích a králičích obličkových buniek s 10 až 100 násobné vyšším výťažkom virusu pri inkubácii infikovaných kultúr pri 37 °C. Intranazálna aplikácia východiskového virulentného kmeňa vnímavým *7 telatám vyvolá množenie virusu na slizniciach horných dýchadiel s obsahom až 10' TKID^^/ml nosného sekrétu a přetrváváním infekčnosti sekrétov do 10. až 14. dňa, doprevádzanó zápalom až nekrozou nosnej sliznice a poruchou celkového zdravotnóho stavu charakterizovanou horúčkou, nežravosťou, apatiou a stratou na váhej množenie virusu po intranazálnej aplikácii vyselekto— váného kmeňa je časovo'limitované do 7. až ý. dňa, nevyvolá žiadne alebo len mierne lokálně změny charakterizované začervenáním nosnej sliznice a miernym zmnožením nosného výtoku, pričom celkový zdravotný stav zvierat ostane neporušený.Depending on the growth characteristics of cell cultures, the newly bred strain differs from the virulent starting strain by the ability to multiply in bovine, lamb and rabbit kidney cell cultures with 10 to 100 times higher virus yield when incubating the infected cultures at 37 ° C. Intranasal administration of a virulent parent strain to susceptible calves will induce virus multiplication in the upper respiratory mucous membranes containing up to 10 'TKID ^ / ml nasal secretion and persistence of secretion infections until days 10-14, accompanied by inflammation to necrosis of the nasal mucosa and impaired general health a condition characterized by fever, unhealthy, apathy and loss of weight multiplication of the virus after intranasal administration of the selected strain is time-limited to 7 to 6. day, it causes no or only mild local changes characterized by redness of the nasal mucosa and a slight increase in nasal discharge, while the overall health of the animals remains intact.

Zvieratá infikované virulentným východiskovým kmeňom vytvoria v krvnom séro neutralizačně protilátky v titroch 1:16 až 1:128, kým zvieratá ošetřené vyselektovaným avirulentným kme— ňom len v titroch 1:2 až 1:32.Animals infected with the virulent parent strain produce neutralizing antibodies in the blood serum at titers of 1:16 to 1: 128, whereas animals treated with the selected avirulent strain only in titers of 1: 2 to 1:32.

Příklad prevedeniaExecution example

Virulentný kmeň virusu IBR—IPV INRV 3760 sa sériovo pasážuje na primárných kultúrach z bovinnych obličiek, s použitím bežne zaužívaných laboratornych metod. Přítomnost virusu v tkanivových tekutinách sa na rozličných úrovniach pasážovania kontroluje vývojom virus—Specifických cytopatických zmienj postup atenuovania virulencie sa kontroluje i.nas. aplikáciou 2—4 ml neriedenóho virusu jedno až štvormesačným telatám, so zisťovaním obsahu virusu v nosných sekrótoch, lokálnych zmien, termických a celkových klinických reakcií. Po zisťení významného poklesu virulepcie virusu, k čomu dochádza na úrovni 150. až 200. tkanivovej pasáže, sa virus adaptuje na kultúry z jahňacích obličiek nasledovným sposobom: jahňacie obličkové buňky narastené v skúmavkách v Earlovom médiu s 2 jí bovínneho fetálneho séra sa infikujú dávkou 0,1 ml virusu nepěstovaného na bovinnych obličkových kultúrach a inkubujú pri 37 °C do— tial, kým aspoň 50 $ buniek monolayera nevykazuje charakteristické virusSpecifické změny.A virulent strain of IBR-IPV INRV 3760 is serially passaged on bovine kidney primary cultures using conventional laboratory methods. The presence of virus in tissue fluids is controlled at various levels of passage by the development of virus. The specific cytopathic change in the attenuation of virulence is controlled by i.nas. application of 2-4 ml of undiluted virus to one to four months of calves to detect the virus content in nasal secretions, local changes, thermal and general clinical reactions. Upon detecting a significant decrease in virus virullepsy, occurring at the 150th to 200th passage level, the virus adapts to lamb kidney cultures as follows: lamb kidney cells grown in tubes in Earl medium with 2 µl of bovine fetal serum are infected with dose 0 1 ml of virus not grown on bovine kidney cultures and incubated at 37 ° C until at least 50% of the monolayer cells showed characteristic virus-specific changes.

208 289208 289

Získané infekčně tkanivové tekutiny sa použiju k očkovaniu falších skúmavkových kultúr Jahna— cích obličiek a v sériovom pasážovaní virusu na uvedenom druhu tkaniva sa rovnakým spósobom pokračuje. Tkanivové tekutiny z každej 10. pasáže na jahňacich obličkových kultúrach sa kontrolujú na obsah virusu titráciami běžným spósobom na skúmavkových kultúrach z telacích obličiek a obsahom virusu v tekutinách stanoví akumulačným výpočtom podlá formule Reeda a Muencha. Priebeh atenuovania virulencie virusu počas sériového pasážovania sa kontroluje na jedno— až Stvormesačných telatách, ktorým sa i.nas. aplikuje po 4 ml neriedených tkanivových tekutin s * , obsahom najmenej 10 TKED* virusu na ml, obsah virusu v nosných sekrétoch zistuje titračne¹5° i·» 3.» 5·, 7·» 9. a 12. deň, a zvieratá kontrolujú termometrioky a klinicky. Po dosiahnutí takého stupňa oslabenia virulencie pasážovanóho kmeňa, pri ktorom vyvolá u očkovaných zviérat len mierne zmnoženie nosných sekrétov ktoré si zachovajú serózny charakter, s pretrvávanim in fekčnosti sekrétov najdlháie do 9· dňa, ale nevyvolá poákodenie nosnej sliznice a naruSenie celkového zdravotného stavu, s maximálnym zvýSením telesnej teploty o 0,8 °C v období do 14 dní od aplikácie, sa virus adaptuje na rast pri subnormálnych teplotách. Postupuje sa přitom tak, že infekčně kultůry sa inkubujú najskór pri 35 °C a v pasážovaní virusu na skúmavkových kultúrach sa pokračuje dotial’, kým nástup a vývoj cytopatického účinku virusu až do úplného rozpadu tkaniva neprebehne najneskór do 72 hod. od infekcie. Potom sa znižuje teplota pri ktorej ea inkubujú infikované skúmavkovó kultůry vždy o 1 °C a rast virusu posudzuje podlá rovnakých kritérií ako bolo uvedené vyšSie. Následné sa uskutoční 10—20 sériových pasáží virusu pri 3θ °^G a reziduálna virulencia virusu testuje na telatách.Ak vnímavé jedno— až štvormesač— 7 8 né telatá nereagujú na podanie velkej dávky virusu /10' až 10 ΤΚΕΏ,,θ/ termicky ani klinicky, virus vykazuje¹ dobré multiplikačné vlastnosti na slizniciach dýchadiel, pričom nosné sekréty sú infekčně najviac do 9, dňa a v krvných sérach sa za dva týždne po aplikácii zistí mera— telnó množstvo neutralizačných protilátok, izoluje sa z kmeňa čistá línia plakovou technikou alebo metodou hraničných riedení, s aspoň Sesťnásobným opakováním.The infectious tissue fluids obtained were used to inoculate further tube cultures of lamb kidneys and continued in serial passage of virus on said tissue type in the same manner. Tissue fluids from each 10th passage on lamb kidney cultures are checked for virus content by titration in a conventional manner on kidney tube cultures and determined for virus content in fluids by an accumulation calculation according to the formula of Reed and Muencha. The course of virus attenuation during serial passage is checked on one to four month old calves, which are also taken. apply 4 ml of undiluted tissue fluids with *, containing at least 10 TKED * virus per ml, detect the virus in nasal secretions by titrating ¹ 5 ° i »» 3. »5 ·, 7 ·» on days 9 and 12, and animals control thermometriques and clinically. Upon reaching a degree of attenuation of the passage strain virulence, in which vaccinated animals induce only a slight multiplication of nasal secretions that remain serous in nature, with the persistence of secretion sustained for up to 9 days, but does not induce nasal mucosal damage and disturbance of the overall condition by increasing the body temperature by 0.8 ° C within 14 days of administration, the virus adapts to growth at subnormal temperatures. This is done by incubating the infectious cultures at 35 ° C for the first time and continuing the passage of the virus on the tube cultures until the onset and development of the cytopathic effect of the virus until complete disintegration of the tissue within 72 hours. from infection. Thereafter, the temperature at which the infected tube cultures are incubated by 1 [deg.] C. is lowered and the growth of the virus is assessed according to the same criteria as above. Subsequently, 10-20 serial virus passages are performed at 3 ° ^C and residual virus virulence is tested on calves. If susceptible one to four months the calves do not respond to the administration of a large dose of virus (10 'to 10 ΤΚΕΏ, θ) thermally or Clinically, the virus exhibits ¹ good multiplication properties on the respiratory mucosa, with nasal secretions being infectiously up to 9 days, and in blood sera two weeks after application, a measurable amount of neutralizing antibodies is detected, a pure line is isolated from the strain by plaque or borderline dilution, with at least 6-fold repetitions.

Tento virus sa adaptuje na buňkové kultůry z králičích obličiek a na diploidné buňkové linie derivované z bovínnych, ovínnych alebo králičích orgánov, spósobom.ako bolo uvedené pri adaptovaní virusu z bovínneho na ovínne tkanivo. Virus s dobrými rastovými vlastnostami na ovčích a králičích kultúrach sa rýchlo adaptuje a do vysokých titrov pomňožuje ňa uvedených druhoch tkaniv. Po překonaní aspoň piatich priamych pasáží na uvedených druhoch buňkových 7 0 kultur, S dosiahňutim titrov najmenej 10'* TKED /ml infekčného média, sa potvrdí identita virusu: a/ neutralizáciou infekčnosti monošpeoifickým IBR-antigérom připraveným na králikoch imunizovaných východiskovým virulentným kmeňom alebo niektorým zo zbierkovýoh kmeňxov IBR—The virus adapts to rabbit kidney cell cultures and diploid cell lines derived from bovine, ovine or rabbit organs, as described for adapting the bovine virus to ovine tissue. The virus with good growth properties on sheep and rabbit cultures adapts rapidly and assists in the above-mentioned tissue types to high titers. After crossing at least five direct passages on said cell culture types, with titers of at least 10 * TKED / ml infectious medium, the identity of the virus is confirmed by: a) neutralizing infectivity with monospeific IBR-antigen prepared in rabbits immunized with the starting virulent strain or IBR collection strains—

IPV} -b/ pomocou imunofluorescencie ofarbením buňkových kultúr infikovaných kontrolovaným kmeňom Specifickým konjugovaným IBR-imunoglobulínomj c/ intranazálnym očkovaňím vnímavých dvoj- až Stvormesačných teliat avirulentným kmeňom v dávke najmenej 10° TKED so zisťovaním 5o množenia virusu, vývoja zmien na slizniciach nosa a celkového zdravotného stavu zvieratj d/ stanovením titrov neutralizačných protilátok v krvných sérach teliat za dva, Styri a ŠestIPV} -b / by immunofluorescence staining of cell cultures infected with a controlled strain Specific conjugated IBR-immunoglobulin c / intranasal vaccination of susceptible bifurcation to four-month calves with an avirulent strain at a dose of at least 10 ° TKED animal status d / determination of neutralizing antibody titers in calf serum of two, Styri and Six

208 289 týždňov po ihtranazálnom očkovaníj e/ dókazom rezistencie intranazálne očkovaných teliat proti infekcii známým virulentným kmeňom -virusu IBR—IPV.208,289 weeks after ihtranasal vaccination with e / evidence of resistance to intranasally vaccinated calves against infection by a known virulent IBR-IPV strain.

Kmeň, ktorý u jedno až štvormesačných vnímavých teliat nevyvolá po i.nas. aplikácii v 7 množstve najmenej 10' TKID_ virusu poruchy zdravotného stavu, vykazuje dobré rastové vlast5° eA strain that does not induce i.nas in 1 to 4 months old susceptible calves. when administered in 7 amounts of at least 10 ' TKID '

nosti na slizniciach horných dýchadiel /najmenej ICr ΤΚΙΏ^θ virusu na 1 ml sekretu na 3«deň po aplikácii/ ale s vylučováním v nosných sekrétoch najdlhšie do 9· dňa, je vhodný pre přípravu žívej vakcíny proti IBR-IPV s možnošťou produkcie virusu na kultárach z bovínnych Obličiek a semeníkov, králičích obličiek a na diploidných buňkových líniach derivovaných z bovínnych a ovinnych orgánov.upper respiratory mucosa (at least ICr ΤΚΙΏ ^ θ virus per ml of secretion 3 days after application) but secreted in nasal secretions no later than 9 days, is suitable for the preparation of a live IBR-IPV vaccine with possibly virus production bovine kidney and testicle cultures, rabbit kidney and diploid cell lines derived from bovine and ovine organs.

Novovyšlachtený kmeň podlá vynálezu BNZ/K 4C CAPM V-257 je schopný množit sa na bovínnych, králičích a jahňacich· obličkových kulturách a ich subpasáž, ako aj 'definovaných diplo— idných buňkách derivovaných z bovínnych) , jahňacich a králičích orgánov. Uvedené vlastnosti kmeňa podlá vynálezu dovolujú výrobu bezpečnej a účinnej živej IBR—IPV vakcíny, s možnošťou volby viacerých druhov tkaniv pre jej produkciu.The newly bred strain according to the invention BNZ / K 4C CAPM V-257 is capable of multiplying on bovine, rabbit and lamb kidney cultures and their sub-passage as well as defined diploid cells derived from bovine, lamb and rabbit organs. Said characteristics of the strain of the invention allow the production of a safe and effective live IBR-IPV vaccine, possibly with the choice of multiple tissue types for its production.

Claims

OBJECT OF THE INVENTION

1. A method of breeding a strain of infectious bovine rhinotracheitis virus and pustular vulvaginitis characterized in that the strain of infectious bovine rhinotracheitis virus and pustular vulvovaginitis INRV 3760 is first passaged at primary temperatures of 37 ° C to 200-250 ° C. 30 ° C and then 30 to 50 times on primary lactic kidney cell cultures at a temperature of 35 ° C to 37 ° C, which is continued to gradually decrease the culture temperature by 1 ° C to 28 ° C and subsequently passaged at temperature.

30 ° C on lamb kidney or testicle primary cell cultures and on rabbit kidney primary cell cultures.

2. Avxrulentný virus strain infectious bovine rhinotracheitis and pustular vulvovaginitis BNZ / C 4 G CAPM V-257 with increased capacity rendering its own viral suspension to Units ¹ blue cheese cultures, obtained as described in point 1.