CS208289B1 - Avirulentný kmeň virusu infekčnej bovínnej rhinotracheitídy a pustulárnej vulvovaginitídy a spósob jeho vyšlechtěnia - Google Patents

Description

1 208 289

Vynález sa týká avirulentného kmena virusu infekčnej bovínnej rhinotracheitídy a pustu-lárnej vulvovaginitídy /Sálej IBR-IPV/ schopného priemyselnej multiplikácie na viacerých dru-hoch homológnych a heterológnych tkaniv pre pripravu živej očkbvacej látky a spósobu jehoizolácie. Účast virusu IBR-IPV na vývoji ochoreni dýchacích a reprodukěných orgánov hovadziehodobytka /HD/ je dnes váeobecne známa. Infekcia týmto virusom postihuje 5 až 20 celosvětové-ho stavu HD a zapříčiňuje, menovite v podmienkach vysokej koncentrácie zvierat, Velké hospo-dářské straty. Preto sa trvale vynakládá velké úsilie na zdokonalovanie metod špecifickejprofylaxie nákazy zapříčiněnéj týmto virusom. Doposial boli proti IBR-IPV vyvinuté a použí-vajú sa živé aj inaktivované vakciny s rozdielnou technológiou ich výroby. Pre pripravu ži-vých vakcín sa používajú kmene, ktorých virulencia bola oslabená dlhodobým pasážovaním nabuňkových kultúrách připravených z homológnych /Schwarz’ A.J.F., York Ch.J., Zirbel L.V.,Estela L.A. Modification of Infectious Bovine Rhinotracheitis /iBR/ Virus in Tissue Cultureand Development of a Vaccine, Proč. Soc. exp. Biol. Med., 96, 453“^58, 1957} Straub O.C.fMoglichkeiten zur Bekampfung der Infektiosen Bovinen Rhinotracheitis /IBR/ Deutsch. Tier-arztl. Wschr., 83, 270-273, 1976/, alebo heterológnych tkaniv /Todd J.D., Volenec F.J., Pa-ton I.M, Intranasal Vaccination Against Infectious Bovine Rhinotracheitis: Studies on Early onset of Protection and Use of the Vaccine in Pregnant Cows, J.Am.Vet.Med. Ašsoc., 159,1370—1374, 1971/ alebo pósobením mutagenov /Zygraich N., Lobmann M., Vascoboinic E., Berge E.,Huygelen C. In Vivo and in Vitro Properties of a Temperature Sensitive Mutant of infectiousBovine Rhinotracheitis Virus, Res. vet. Sci., 16, 329"335, 197V·

Spósob výroby živých vakcín sa zakladá na pomnožení avirulentného imunogénneho kmeňana tkanivových kulturách připravených z obličiek alebo semeníkov hovddzích plodov alebo na—rodených teliat, na diploidných buňkových líniách derivovaných z bovínnych orgánov /životnost30—40 pasáží/, připadne na buňkových kulturách připravených z iných druhov zvierat. Ak sa má-ju k pomnožovaniu virusu slúžiaceho pre pripravu živej vakciny použit stabilně buňkové linie,musia byť kontrolované na onkogenitu /Perkins P.T., Safety of Vaccines., Brit. Med. Bull. 25, 208-212, 1969., Smith H, The Search for Protective Antigens, Brit. Med, Bull,, 25, 126-130, 1969/· Použitie primárných kultúr připravených z orgánov bovínnych plodov alebo národe—ných teliat pre výrobu živých vakcín je spojené s nebezpečím přenosu infekčných zárodkov me-novite virusovéj povahy, ktoré móžu latentne infikovat tieto tkanivá /Miller R.B., Quinn P. J., Observations on Abortions in Cattle: A Comparison of Pathological, Microbiological and

Immunological Findings in Aborted Foetuses and Foetuses Collected at Abattoirs, Can. J. Comp.Med., 39, 270-290, 197^·, Hubbert Ϊ.Τ., Bryner J.H., Fernelius A.L., Frank G.H., Estes P.C.,Viral Infection of the Bovine Fetus and Its Environment, Arch. ges. Virusforsch., 4l, 86-98,1973·, Massip A., Wellemaas G., Leunen J., Charleire G,, Anticorps Ántiviraux dans le sérumsenguin de veux nouveaunés, Ann.Rech. vírór., 5, 397-406, 1974/. Pre vylúčenie přenosu uvede-ných ako aj falších nemenovaných infekcií je třeba robiif dokonalá kontrolu očkovacích látok, 208 289 ktorá popři tom, že je technicky, odborné a časovo velmi náročná, nezaručuje istotu odkrytiavžetlcých latentných virusových kontaminácií. Je preto velmi žiaduce použit pre pomnožovanieatenuovaných kmeňov virusu IBR-IFV slúžiacich pre pripravu živých vakcin také druhy tkaniv,ktoró pri produkcii virusu do vysokých titrov sú prosté virusov patogénnych pre HD alebo as-poň nebezpečie přenosu infekcii živou očkovacou látkou významné znižujú. Toto nebezpečie ne—vylučujú ani linie diploidných buniek, ktoré popři obmedzenej životnosti sú velmi náročné nakvalitu živných médii a kultivačného skla· Priemyselná produkcia vačších objemov vakcíny zvirusu pomnožovanóho na kulturách z králičích obličiek /Todd J.D., Volenec P.J., Paton X.M. ,Intranasal Vaccination Against Infectious Bov^ne Rhinotracheitis i Studios on Early Onset ofprotection and Use of the Vrccine in Pregnant Cows. J. Am. Vet. Med. Assoc., 159 . 1370-137^,1971/ naráže na obtiaže súvisiace s malou výťažnosťou suspenzie buniek z uvedených orgánov.Spoločnou vlastnosťou jednotlivých kmeňov slúžiacich pre pripravu živých vakcin je, že sa kvýrobě používá len jeden definovaný druh tkaniva.

Uvedené nedostatky sú riešené podlá vynálezu, ktorého podstata spočívá v avirulentnomkmeni virusu IBR—IPV,vykazujúcom výhodné rastové schopnosti na buňkových kultúrach připrave-ných známým spósobom z orgánov bovínnych plodov alebo narodených teliat, jahniat a králikov 785 s obsahem 10' až 10 ΤΚΙϋ^θ vírusu/ml v infekčných tekutinách z uvedených druhov tkaniv,s velmi dobrými imunologickými vlastnostem! a spósobe jeho izolácie.

Kmeň BNZ/K 4C uložený v zbierke mikroorganizmov na Výskumnom ústave veterinárneho lekán-štva v Brně Medlánkách, Hudcova 6θ pod číslom CAPM V—257 bol izolovaný spósobom podlá vyná-lezu z virulentného kmeňa IBR - IPV zo zbierky Inst. Nat. Rech. Vet. Brussel Greosselenberg99 Brussel 18, kde sa nachádza pod označením INRV N 3760 tak, že sa tento najprv prepasážo-val 250 krát na primárných kultúrach z telecích obličiek. Následné bol tento kmeň adaptovanýna buňkové kultúry z jahňacích obličiek, pričom po páťdesiatnásobnom prepasážovaní na uvede—nom druhu tkaniva vykazoval rovnaké rastové vlastnosti na kultúrach z jahňacích obličiek akona bovínnych obličkových kultúrach. Tento virus bol, postupným znižovaním kultivačněj teplotya tým selekciou virusových častíc s dobrými multiplikačnými vlastnostami pri nízkých teplo-tách, adaptovaný na rast pri teplotách 28 až 32 °C, s výhodou pri 3°°C. V tejto fáze selekč-ného procesu sa metodou hraničných riedení so šesťnásobným opakováním na jahňacích obličko-vých buňkách izoloval virusový klon predstavujúci homolognu virusová populáciu. Homogenitavírusovej populácie bola dokázaná zachováním si nezměněných vlastností po desatnásobnom pre—pasážovani virusu na telacích obličkových buňkách pri 37 °C a nezmenenou virulenciou po pia-tich sériových i.nas. pasážach na vnímavých telatách. Takto získaný virusový klon bol adap-tovaný, metodou alternatívnych pasáži na buňkových kultúrach z jahňacích a králičích obličiek,na rast na kultúrach z králičích obličiek, s rastom virusu pri 30 °C. Konťrolnými testami natelatách sa dokázalo, že virus pomnožovaný na všetkých uvedených druhoch tkaniv vykazuje rov-nakó rastové a imunobiologické vlastnosti ako virus pomnožovaný na kultúrach z bovínnych or-gánov. 3 208 289

Uvedeným postupom sa získal kmeň, s označením BNZ/κ 4c, ktorý má vlastnosti virusu vhod-ného pře přípravu živej vakcíny proti IBR—IPV, nakolko ša vyznačuje stratou virulencie prehovadzí dobytok rozličného veku pri zachovaní velmi dobrých imunizačných schopností, pričomz hladiska priemyselnej produkcie je vhodný najma v tom, že ho možno pre výrobně účely pom-nožovať na kultúrach z bovinnych obličiek a semeníkov, kulturách z jahňacích obličiek a seme·níkov, kultúrach z králičích obličiek ako aj na líniách diploidných buniek derivovaných z bo-vínnych a ovínnych orgánov, čo dovoluje kedykolvek produkovat požadované množstvo virusu de-finovaných imunobiologických vlastnosti.

Novovyšlachtený kmeň podlá vynálezu ΒΝΖ/Κ 4C CAPM V—257 je rozlišitelný od východisko-vého virulentného kmeňa IBR—IPV INRV Brussel N 3760 podlá rastových vlastnosti zistovanýchna buňkových kultúrach a zvieratách a imunologických vlastností zistovaných na zvieratách.

Podlá rastových vlastností na buňkových kultúrach sa novovyšlachtený kmeň odlišuje odvýchodiskového virulentného kmeňa schopnostou množit sa na kultúrach bovinnych, jahňacích akráličích obláčkových buniek s 10 až 100 násobné vyšším výťažkom virusu pri inkubácii infiko-vaných kultúr pri 37 °C. Intranazálna aplikácia východiskového virulentného kmeňa vnímavým *7 telatám vyvolá množenie virusu na slizniciach horných dýchadiel s obsahom až 10' TKID^^/mlnosného sekrétu a přetrváváním infekčnosti sekrétov do 10. až 14. dňa, doprevádzanó zápalomaž nekrozou nosnej sliznice a poruchou celkového zdravotnóho stavu charakterizovanou horúčkou,nežravosťou, apatiou a stratou na váhej množenie virusu po intranazálnej aplikácii vyselekto—váného kmeňa je časovo'limitované do 7. až ý. dňa, nevyvolá žiadne alebo len mierne lokálnězměny charakterizované začervenáním nosnej sliznice a miernym zmnožením nosného výtoku, pri—čom celkový zdravotný stav zvierat ostane neporušený.

Zvieratá infikované virulentným východiskovým kmeňom vytvoria v krvnom séro neutralizač-ně protilátky v titroch 1:16 až 1:128, kým zvieratá ošetřené vyselektovaným avirulentným kme—ňom len v titroch 1:2 až 1:32. Příklad prevedenia

Virulentný kmeň virusu IBR—IPV INRV 3760 sa sériovo pasážuje na primárných kultúrachz bovinnych obličiek, s použitím bežne zaužívaných laboratornych metod. Přítomnost virusu vtkanivových tekutinách sa na rozličných úrovniach pasážovania kontroluje vývojom virus—Spe-cifických cytopatických zmienj postup atenuovania virulencie sa kontroluje i.nas. aplikáciou 2—4 ml neriedenóho virusu jedno až štvormesačným telatám, so zisťovaním obsahu virusu v nos-ných sekrótoch, lokálnych zmien, termických a celkových klinických reakcií. Po zisťení výz-namného poklesu virulepcie virusu, k čomu dochádza na úrovni 150. až 200. tkanivovej pasáže,sa virus adaptuje na kultúry z jahňacích obličiek nasledovným spósobom: jahňacie obličkovébuňky narastené v skúmavkách v Earlovom médiu s 2 jí bovínneho fetálneho séra sa infikujú dáv-kou 0,1 ml virusu nepěstovaného na bovinnych obláčkových kultúrach a inkubujú pri 37 °C do—tial, kým aspoň 50 $ buniek monolayera nevykazuje charakteristické virusšpecifické změny. 4 208 289 Získané infekčně tkanivové tekutiny sa použiju k očkovaniu falších skúmavkových kultúr Jahna·»cích obličiek a v sériovom pasážovaní virusu na uvedenom druhu tkaniva sa rovnakým spósobompokračuje. Tkanivové tekutiny z každéj 10. pasáže na jahňacich obličkových kultúrach sa kon-trolujú na obsah virusu titráciami běžným spósobom na skúmavkových kultúrach z telacích obli-čiek a obsahom virusu v tekutinách stanoví akumulačným výpočtom podlá formule Reeda a Muencha.Priebeh atenuovania virulencie virusu počas sériového pasážovania sa kontroluje na jedno— ažStvormesačných telatách, ktorým sa i.nas. aplikuje po 4 ml neriedených tkanivových tekutin s 7 * , obsahom najmenej 10 TKCD* virusu na ml, obsah virusu v nosných sekrétoch zistuje titračne15° i·» 3.» 5·, 7·, 9. a 12. deň, a zvieratá kontrolujú termometricky a klinicky. Po dosiahnutítakého stupňa oslabenia virulencie pasážovanóho kmeňa, pri ktorom vyvolá u očkovaných zviératlen mierne zmnoženie nosných sekrétov ktoré si zachovajú serózny charakter, s pretrvávanim infekčnosti sekrétov najdlhSie do 9» dňa, ale nevyvolá poSkodenie nosnej sliznice a naruSeniecelkového zdravotného stavu, s maximálnym zvýSením telesnej teploty o 0,8 °C v období do 14dní od aplikácie, sa virus adaptuje na rast pri subnormálnych teplotách. Postupuje sa přitomtak, že infekčně kultúry sa inkubujú najskór pri 35 °C a v pasážovaní virusu na skúmavkovýchkultúrach sa pokračuje dotial’, kým nástup a vývoj cytopatického účinku virusu až do úplnéhorozpadu tkaniva neprebehne najneskór do 72 hod. od infekcie. Potom sa znižuje teplota pri kto·rej ea inkubujú infikované akúmavkové kultúry vždy o 1 °C a rast virusu posudzuje podlá rov-nakých kritérií ako bolo uvedené vyšSie. Následné sa uskutoční 10—20 sériových pasáží virusu pri 3θ °G a reziduálna virulencia virusu testuje na telatách.Ak vnímavé jedno— až štvormesač—7 8 né telatá nereagujú na podanie velkej dávky virusu /10' až 10 ΤΚΕβ^,θ/ termicky ani klinicky,virus vykazuje1 dobré multiplikačnó vlastnosti na slizniciach dýchadiel, priěom nosné sekrétysú infekčně najviac do 9, dňa a v krvných sérach sa za dva týždne po aplikácii zistí mera—telnó množstvo neutralizačných protilátok, izoluje sa z kmeňa čistá línia plakovou technikoualebo metodou hraničných riedení, s aspoň Sesťnásobným opakováním.

Tento virus sa adaptuje na buňkové kultúry z králičích obličiek a na diploidné buňkovélinie derivované z bovínnych, ovínnych alebo králičích orgánov, spósobom.ako bolo uvedené priadaptovaní virusu z bovínneho na ovínne tkanivo. Virus s dobrými rastovými vlastnostami naovčích a králičích kultúrach sa rýchlo adaptuje a do vysokých titrov pomhožuje na uvedených druhoch tkaniv. Po překonaní aspoň piatich priamych pasáží na uvedených druhoch buňkových7 0 kultur, S dosiahiiutim titrov najmenej 10'* TKED /ml infekčného média, sa potvrdí identita virusu: a/ neutralizáciou infekčnosti monoSpecifickým IBR-antisérom připraveným na králikoch imunizovaných východiskovým virulentným kmeňom alebo niektorým zo zbierkových kmeňxov IBR— IPVj -b/ pomocou imunofluorescencie ofarbením buňkových kultúr infikovaných kontrolovaným kmeňom Specifickým konjugovaným IBR-imunoglobulínomj c/ intranazálnym očkovahím vnímavých dvoj- až Stvormesačných teliat avirulentným kmeňom v dávke najmenej 10° TKID so zisťovaním5o množenia virusu, vývoja zmien na slizniciach nosa a celkového zdravotného stavu zvieratj d/stanovením titrov neutralizačných protilátok v křvných sérach teliat za dva, Styri a Šest

Claims (2)

1. 5 208 289 týždňov po ihtranazálnom očkovaníj e/ dókazom rezistencie intranazálne očkovaných teliat proti infekcii známým virulentným kmeňom -virusu IBR—IPV. Kmeň, ktorý u jedno až štvormesačných vnímavých teliat nevyvolá po i.nas. aplikácii v7 množstve najmenej 10' TKID_ virusu poruchy zdravotného stavu, vykazuje dobré rastové vlast»5° e nosti na slizniciach horných dýchadiel /najmenej ICr ΤΚΙΏ^θ virusu na 1 ml sekretu na 3«deňpo aplikácii/ ale s vylučováním v nosných sekrétoch najdlhšie do 9· dňa, je vhodný pre příp-ravu žívej vakcíny proti IBR-IPV s možnošťou produkcie virusu na kultárach z bovínnych Obli-čiek a semeníkov, králičích obličiek a na diploidných buňkových líniach derivovaných z bovín-nych a ovinnych orgánov. Novovyšlachtený kmeň podlá vynálezu BNZ/K 4C CAPM V-257 je schopný množit sa na bovín-nych, králičích a jahňacich· obličkových kulturách a ich subpasáž, ako aj 'definovaných diplo—idných buňkách derivovaných z bovínnych) , jahňacich a králičích orgánov. Uvedené vlastnostikmeňa podlá vynálezu dovolujú výrobu bezpečnej a účinnej živej IBR—IPV vakcíny, s možnošťouvolby viacerých druhov tkaniv pre jej produkciu. PREDMET VYNÁLEZU

   1. Spósob šlachtenia kmeňa virusu infekčněj bovínnej rhinotracheitídy a,pustulárnej vulvova—ginitídy vyznačujúci sa tým, že kmeň virusu infekčnej bovínnej rhinotracheitídy a pustulárnejvulvovaginitídy INRV 3760 sa najprv 200 až 250 krát pasážuje na primárných kultúrách telacíchobličkových buniek pri teplote 36 °C až 37 °C a potom 30 až 50 krát na primárných' buňkovýchkultúrach jahňacich obličiek pri teplote 35 °C až 37 °C, v ktorom sa pokračuje pri postupnomznižovaní kultivačnej teploty o 1 °C na hodnotu 28 °C a následné sa pasážuje pri teplotě 30 °C na primárných buňkových kultúrach jahňacich obličiek alebo semeníkov a na primárnýchbuňkových kultúrach králičích obličiek.
2. 2. Avxrulentný kmeň virusu infekčnej bovínnej rhinotracheitídy a pustulárnej vulvovaginitídyBNZ/K 4 G CAPM V-257 so zvýšenou schopnosťou reprodukcie vlastněj vírusovej substancie na tka1nivových kultúrach, získaný spósobom podlá bodu 1.